TESE DE MESTRADO · 2017. 8. 28. · TESE DE MESTRADO Caracterização do efeito do...

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TESE DE MESTRADO Caracterização do efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato na actividade da bomba de Na + , K + inibida pelo IFN-γ e pela ubaína. Orientador: Professor Doutor Patricio Soares da Silva (FMUP) Co-orientador: Professor Doutor Carlos Fonseca (FEUP) Aluno: Bruno Azevedo Igreja Porto, Agosto de 2005

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  • TESE DE MESTRADO

    Caracterização do efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato na

    actividade da bomba de Na+, K+ inibida pelo IFN-γ e pela ubaína.

    Orientador: Professor Doutor Patricio Soares da Silva (FMUP)

    Co-orientador: Professor Doutor Carlos Fonseca (FEUP)

    Aluno: Bruno Azevedo Igreja

    Porto,

    Agosto de 2005

  • 2

    FACULDADE DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

    Departamento de Engenharia Electrotécnica e de Computadores

    e

    FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

    Instituto de Farmacologia e Terapêutica

    Caracterização do efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato na

    actividade da bomba de Na+, K+ inibida pelo IFN-γ e pela ubaína.

    Bruno Azevedo Igreja

    Licenciado em Bioquímica pela Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

    Dissertação submetida para satisfação parcial dos

    Requisitos do grau de mestre

    em

    Engenharia Biomédica

    Dissertação realizada sob a supervisão de

    Professor Doutor Patrício Soares da Silva,

    do Instituto de Farmacologia e Terapêutica

    da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

    e

    Professor Doutor Carlos Fonseca,

    do Departamento de Engenharia Electrotécnica e de Computadores

    da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto

    Porto, Agosto de 2005

  • 3

    RESUMO

    A corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela anfotericina B, nas células

    Caco-2 em meio contendo 143mM de Na+, é uma medida da actividade da bomba de

    Na+, K+ (NKA) e foi usada para caracterizar o efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato

    na actividade desta enzima inibida pelo interferão-γ (IFN-γ) e pela ubaína. No

    presente trabalho verificou-se que o IFN-γ e a ubaína reduzem significativamente

    esta Isc, no entanto, a remoção da ubaína durante 24 horas faz com que a actividade

    da NKA volte aos valores idênticos ao da situação controlo, ao contrário do que

    acontece com o IFN-γ, que mesmo 24 horas após a sua remoção mantém inibida a

    NKA. Verificou-se ainda que nem o IFN-γ, nem a ubaína alteram significativamente

    a expressão da NKA. Por outro lado o EGCG, um inibidor do transdutor de sinal e

    activador da transcrição 1 (STAT1), não consegue reverter o efeito da ubaína, mas

    reverte o efeito do IFN-γ na actividade da NKA para o qual apresenta um EC50 = 1.43

    µM. O STAT1 está envolvido na cascata de sinalização celular desencadeada pela

    ligação do IFN-γ ao seu receptor, que vai levar à inibição da NKA. Nas células Caco-

    2, o EGCG inibiu a activação do STAT1 induzida pelo IFN-γ, apresentando um EC50

    = 1.69 µM, ao contrário do (-)-catecino, do (-)-epicatecino (EC), do (-)-catecino-3-

    galato (CG), do (-)-epicatecino-3-galato (ECG), do (-)-epigalocatecino (EGC) e do (-

    )-epigalocatecino mais ácido gálico (EGC+AG), que não inibiram a fosforilação da

    tirosina 701 do STAT1.

    A administração intraperitoneal de ratinhos NMRi com 10000 U de IFN-γ de

    ratinho resulta, no colon, num modelo idêntico ao das células Caco-2, onde se

    verifica uma diminuição da actividade da NKA sem alteração da expressão. Assim

    estudou-se o efeito do EGCG e do EGC 20 mg/Kg, administrado por via oral, neste

    modelo animal e verificou-se que apenas o EGCG reverte o efeito do IFN-γ na

    actividade da NKA das células epiteliais do colon de ratinhos NMRi.

  • 4

    ABSTRACT

    The short-circuit current (Isc) induced by the addition of amphotericin B, in

    Caco-2 cells monolayers bathed with Na+ 143 mM, is due to the transport of Na+

    across the basolateral membrane by the Na+, K+ pump (NKA) and it was used to

    characterize the effect of (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in NKA activity

    inhibited by interferon-γ (IFN-γ) and ouabain. In the present work we show that

    IFN-γ and ouabain significantly decrease this Isc, nevertheless removal of ouabain

    for 24 h returns NKA activity to values identical to controls on the contrary to IFN-γ

    that even when removed for 24 h keeps the NKA enzyme inhibited. In the present

    study we find out that IFN-γ and ouabain don’t significantly changes NKA

    expression. On the other hand, the signal transducer and activator of transcription 1

    (STAT1) inhibitor, EGCG, is unable to change the effect of ouabain in NKA activity,

    but it inhibits IFN-γ effect in enzyme activity and presents an EC50 = 1.43 µM.

    STAT1 is involved in the signal transduction pathway initiated by binding of IFN-γ

    to its receptor which leads to NKA inhibition. In Caco-2 cells EGCG inhibit STAT1

    activation induced by IFN-γ and presents an EC50 = 1.69 µM, unlike (-)-catechin, (-)-

    epicatechin (EC), (-)-catechin-3-gallate (CG), (-)-epicatechin-3-gallate (ECG), (-)-

    epigallocatechin (EGC) and (-)-epigallocatechin plus galic acid (EGC+AG), that

    didn’t inhibit tyrosine 701 phosphorylation of STAT1.

    The intraperitoneal administration of mouse IFN-γ 10000 U in NMRi mice

    results, in colon, in a model identical to Caco-2 cells, where there is a decrease in

    NKA activity without any change in NKA expression. So, we study the effect of

    EGCG and EGC 20 mg/Kg with per oral administration in these model and we

    verified that only EGCG is able to revert the effect of IFN-γ in NKA activity of colon

    epithelial cells from NMRi mice.

  • 5

    AGRADECIMENTOS

    Ao Prof. Doutor Patrício Soares da Silva quero agradecer as oportunidades

    concedidas nos projectos e equipas de investigação que lidera, o rigor colocado no

    trabalho e as valiosas sugestões que contribuiram para a realização deste trabalho.

    Ao Doutor Carlos Fonseca agradeço por ter aceite co-orientar esta tese e pela

    disponibilidade demonstrada nas várias etapas que levaram à sua elaboração.

    A todos os membros do Instituto de Farmacologia e Terapêutica da FMUP

    agradeço a disponibilidade, simpatia e apoio transmitidos.

    Ao meu pai e à minha mãe agradeço a visão de futuro para os filhos e o

    constante apoio e incentivo que sempre demonstraram.

    À Lia agradeço o seu “presente” contínuo.

  • 6

    ÍNDICE

    RESUMO ....................................................................................................................3

    ABSTRACT ................................................................................................................4

    AGRADECIMENTOS ..............................................................................................5

    LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................8

    1 - INTRODUÇÃO .................................................................................................. 10

    1.1 - DOENÇA DE CROHN ...................................................................................... 10

    1.2 - BOMBA DA NA+, K+ ...................................................................................... 12

    1.3 - EPIGALOCATECINO-3-GALATO...................................................................... 15

    2 - MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 19

    2.1 - FÁRMACOS .................................................................................................... 19

    2.2 - REAGENTES E SOLUÇÕES ............................................................................... 19

    2.3 - CÉLULAS ....................................................................................................... 20

    2.4 - CRESCIMENTO DE CÉLULAS........................................................................... 21

    2.5 - CULTIVO DE CÉLULAS ................................................................................... 21

    2.6 - ACTIVIDADE DA NKA - MÉTODO ELECTROFISIOLÓGICO .............................. 21

    2.7 - EXPRESSÃO DA SUB-UNIDADE α1 DA NKA ................................................... 22

    2.8 - EXPRESSÃO DO STAT1 E DO PHOSPHOSTAT1............................................. 23

    2.9 - ANIMAIS........................................................................................................ 23

    2.10 - ADMINISTRAÇÃO......................................................................................... 24

  • 7

    2.11 - OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS.................................. 24

    2.12 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA – MÉTODO DE BRADFORD 24

    2.13 - ACTIVIDADE DA NKA – MÉTODO BIOQUÍMICO.......................................... 25

    3 - RESULTADOS................................................................................................... 26

    3.1 - CÉLULAS CACO-2.......................................................................................... 26

    3.2 - RATINHOS NMRI .......................................................................................... 36

    4 - DISCUSSÃO ....................................................................................................... 39

    5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 43

  • 8

    LISTA DE ABREVIATURAS

    ATP – adenosina trifosfato

    ATPases – enzimas que consomem ATP

    Células Th – células T ajuda

    Citocinas Th – citocinas produzidas pelas células T ajuda

    CG – (-)-catecino-3-galato

    ddp – diferença de potencial

    DTT – ditiotreitol

    EC – (-)-epicatecino

    EC50 – concentração 50% eficaz

    ECG – (-)-epicatecino-3-galato

    EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético

    EGC – (-)-epigalocatecino

    EGCG – (-)-epigalocatecino-3-galato

    ERK – “extracellular signal-regulated kinase”

    FBS – soro bovino fetal

    GAS – sequência de activação γ

    HBSS – solução de Hanks sem cálcio

    IFN – interferão

    IL – interleucina

    Isc – corrente de curto-circuito

    JAK – “Janus kinase”

    MAPK – “mitogen-activated protein kinase”

    MEM – meio mínimo essencial

    MEK – “MAPK kinase”

    mRNA – RNA mensageiro

    NKA – bomba de Na+, K+

    PBS – solução salina de tampão fosfato

    PBST – solução salina de tampão fosfato com 0.05% de tween 20

    RNA – ácido ribonucleico

  • 9

    rpm – rotações por minuto

    SDS – Dodecilsulfato de sódio

    SEM – erro padrão da média

    STAT – transductor de sinal e activador da transcrição

    TNF – factor de necrose tumoral

    VCAM – molécula de adesão de células vasculares

  • 10

    1 - INTRODUÇÃO

    O sistema imunitário constitui o nosso mecanismo de defesa natural, capaz de

    distinguir entre estruturas próprias e estranhas e ainda entre antigénios estranhos

    inofensivos e perigosos de modo a evitar respostas imunes desnecessárias e auto-

    destrutivas. A resposta inflamatória consiste na libertação sequencial de uma série de

    mediadores e o recrutamento de leucócitos circulantes que se tornam activos no local

    da inflamação libertando novos mediadores. Na maioria dos casos a resposta

    inflamatória desaparece, num espaço de tempo adequado, devido à libertação de

    mediadores endógenos anti-inflamatórios e da acumulação intracelular de factores de

    regulação negativa.

    As células T CD4+ são responsáveis pela regulação de aspectos chave na

    resposta imunológica. Estas células podem-se dividir em dois grupos funcionalmente

    distintos, as células T-ajuda 1 (Th1) e as células T-ajuda 2 (Th2), de acordo com o

    tipo de citocinas produzido. Assim, as células Th1 secretam principalmente IFN-γ e

    interleucina 2 (IL-2), que têm uma acção pro-inflamatória, enquanto que as células

    Th2 produzem predominantemente IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que têm uma acção

    anti-inflamatória.

    1.1 - DOENÇA DE CROHN

    Em condições normais, os antigénios provenientes da comida e da flora

    intetstinal, que estão continuamente em contacto com a mucosa intestinal, não

    causam qualquer reacção imune, devido a um balanço adequado das citocinas

    secretadas pelas células Th1 e pelas células Th2. No entanto, por vezes, pode ocorrer

    um desequilíbrio no balanço citocinas Th1/Th2 e surgem, por exemplo, as doenças

    inflamatórias intestinais, onde se incluem a doença de Chron e a colite ulcerativa.

    Nestes casos o desequilíbrio parece resultar de uma resposta desadequada a

    componetes normais da flora intestinal e dos alimentos. No entanto, existem vários

    estudos que sugerem que a indução e a patogenese das doenças inflamatórias

    intestinais, nomeadamente a doença de Crohn e a colite ulcerativa, são um processo

  • 11

    multifactorial, envolvendo interacções entre factores genéticos e ambientais, além

    dos factores imunológicos (Adorini and Sinigaglia 1997; Sartor 1997).

    Na doença de Crohn existe um desequilíbrio no balanço entre as células Th1

    e Th2 em favor das Th1, enquanto que, na colite ulcerativa parece existir uma maior

    actividade das células Th2 (Fuss, Neurath et al. 1996). Este conceito é suportado por

    alguns estudos que revelam que pacientes com doença de Crohn apresentam um

    aumento do número de células secretoras de IFN-γ e um aumento dos níveis de

    mRNA para o IFN-γ (Breese, Braegger et al. 1993; Niessner and Volk 1995). A

    biopsia da mucosa intestinal de pacientes com doença de Crohn revelou um aumento

    da expressão de citocinas pro-inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão

    (Groux and Powrie 1999). Ainda de acordo com este conceito está o facto da IL-18,

    uma citocina Th1 que actua sinergisticamente com a IL-12 no sentido de induzir a

    síntese de IFN-γ pelas células Th1, estar sobreexpressa em pacientes com doença de

    Crohn, mas não em pacientes com colite ulcerativa (Pizarro, Michie et al. 1999). Por

    outro lado na colite ulcerativa verifica-se um aumento da secreção de IL-5 (Fuss,

    Neurath et al. 1996) o que sugere um aumento da actividade das células Th2.

    O IFN-γ é um produto dos linfócitos Th1 activados e a sua produção é

    considerada o factor predominante na inflamação intestinal induzida pelas células

    Th1, como é o caso da doença de Crohn, pelo facto do IFN-γ poder actuar em várias

    vias que influenciam o desenrolar da inflamação, como por exemplo aumentar a

    produção de mediadores pro-inflamatórios através da activação dos macrófagos,

    influenciar o tráfico celular através da regulação da expressão de moléculas de

    adesão e alterando a permeabilidade do epitélio intestinal (Billiau 1996). A

    importância atribuída ao IFN-γ na inflamação intestinal induzida pelas células Th1

    deve-se ainda ao facto da neutralização do IFN-γ através do anticorpo monoclonal

    anti-IFN-γ atenuar significativamente o desenvolvimento de colite em ratinhos

    (Powrie, Leach et al. 1994).

    A doença de Crohn é uma doença inflamatória intestinal crónica, cujo

    sintoma dominante é a diarreia. A perda de fluidos pelo intestino ocorre devido à

    quebra do equilíbrio homeostático, provocado por uma desregulação no transporte de

    electrólitos nas células, podendo-se tratar de um aumento da secreção do electrólito

  • 12

    Cl- ou uma diminuição da absorção do electrólito Na+. Estudos recentes sugerem que

    o aparecimento de diarreia, na mucosa intestinal inflamada, se deve a uma redução

    da absorção do electrólito Na+ e não a um aumento da secreção do electrólito Cl-

    (Sundaram, Wisel et al. 1997). Esta observação está de acordo com o facto de a

    mucosa do cólon de pacientes com doença de Crohn responderem pobremente a

    secretagogos e a absorção de Na+ estar diminuida (Sandle, Higgs et al. 1990). Ainda

    neste sentido apontam o facto do IFN-γ reduzir a secreção intestinal de Cl- (Colgan,

    Parkos et al. 1994), o co-transporte de Na+-K+-2Cl- (Zund, Madara et al. 1996), a

    actividade do trocador Na+/H+ (Rocha, Musch et al. 2001) e a actividade da NKA

    (Sugi, Musch et al. 2001; Magro, Fraga et al. 2004).

    A absorção de Na+ no intestino envolve a participação de várias proteínas, no

    entanto, a mais importante é a NKA que se localiza na membrana basal da célula

    epitelial e por isso a sua inibição parece estar directamente relacionada com o

    aparecimento de diarreia em pacientes com doença de Crohn (Sugi, Musch et al.

    2001; Musch, Clarke et al. 2002).

    1.2 - BOMBA DE NA+, K+

    A bomba de Na+, K+ é uma proteína heterodimérica transmembranar

    constituída por uma subunidade α de aproximadamente 112 KDa, uma subunidade β

    altamente glicosilada, que pode variar entre 40 e 60 KDa dependendo do grau de

    glicosilação, que varia com o tipo de tecido e da espécie em causa e uma pequena

    subunidade γ, que varia entre 8-14 KDa. A subunidade α da NKA possui os locais de

    ligação para os catiões, para o ATP e para a ubaína (Lingrel, Orlowski et al. 1990) e

    é responsável pelas propriedades catalítica e de transporte da enzima. A subunidade

    β é essencial para a actividade da NKA e parece estar envolvida na estabilização e

    correcto enrolamento da subunidade α, facilitando a sua entrega na membrana

    plasmática (McDonough, Geering et al. 1990). A subunidade β parece também ser

    responsável pela oclusão do K+ (Lutsenko and Kaplan 1993) e pela modulação da

    afinidade da NKA para o K+ e para o Na+ (Eakle, Kabalin et al. 1994; Eakle, Lyu et

    al. 1995). A função da subunidade γ ainda não é completamente clara, no entanto

    alguns estudos revelam que esta subunidade consegue modificar a activação do

  • 13

    potássio dependente da voltagem (Beguin, Wang et al. 1997), enquanto que outros

    sugerem que a subunidade γ é capaz de estabilizar a conformação E1 da enzima

    (Therien, Goldshleger et al. 1997). A NKA está presente em todas as células de

    mamíferos e converte entre 20 e 30% do ATP produzido nas células no transporte de

    Na+ e K+ no intestino, rim, sistema nervoso central e noutros tecidos onde é

    necessário um gradiente de Na+ e K+ para a manutenção do volume celular e do

    potencial de membrana (Jorgensen and Pedersen 2001). A NKA é responsável pelo

    estabelecimento e manutenção de um gradiente electroquímico (Fig. 1), característico

    da maior parte das células animais, e que consiste na acumulação de carga positiva

    no lado extracelular, na concentração de K+ intracelular superior à concentração

    extracelular e na concentração de

    Na+ intracelular inferior à

    concentração extracelular.

    Este gradiente electroquímico, é

    conseguido através da energia

    proveniente da hidrólise de uma

    molécula de ATP, que vai permitir

    à NKA transportar, contra o

    gradiente de concentração, três iões

    Na+ para o exterior e dois iões K+

    para o interior da célula (Fig. 1). A

    NKA, constitui por isso um dos

    principais reguladores da

    homeostasia celular do Na+ e do K+, assim como um dos principais responsáveis pelo

    estabelecimento e manutenção dos gradientes eléctrico e químico transmembranar, à

    custa de ATP. Este gradiente electroquímico transmembranar é fundamental na

    manutenção do volume celular, do equilíbrio osmótico celular, na manutenção do

    potencial de repouso das membranas e pelas propriedades excitáveis das células

    musculares e nervosas. O gradiente transmembranar de Na+ vai ainda fornecer

    energia para o co-transporte de vários iões (H+, HCO3-), substratos (glucose e

    aminoácidos) e neurotransmissores através da membrana plasmática (Jorgensen

    Fig. 1: Esquema representativo da bomba de Na+, K+ e do gradiente de concentração do Na+ e do K+.

  • 14

    1990; Lingrel, Orlowski et al. 1990; Jorgensen and Pedersen 2001). No intestino a

    NKA desempenha um importante papel na absorção de Na+ e água, sendo por isso

    fundamental na manutenção dos fluidos corporais. Assim, a inibição da NKA pelo

    IFN-γ parece ser um dos principais responsáveis pela perda de fluidos pelo intestino.

    A inibição da NKA pelo IFN-γ não é directa, mas envolve uma complexa cascata de

    sinalização celular. A ligação do

    IFN-γ ao lado extracelular do seu

    receptor transmembranar leva à

    activação da “Janus Kinase” (JAK)

    1 e 2 e à sua associação com o

    receptor do IFN-γ no lado

    intracelular (Fig. 2) (Haque and

    Williams 1998; Akira 1999). A

    JAK vai então fosforilar o receptor

    do IFN-γ em resíduos específicos

    de tirosina, que servem de local de

    âncora para o STAT1, através do

    reconhecimento das fosfotirosinas

    do receptor do IFN-γ pelo domínio

    SH2 do STAT1 (Fig. 2) (Ihle,

    Witthuhn et al. 1994). Em seguida

    a JAK activada fosforila o STAT1

    num resíduo específico de tirosina, a Tyr701, o que leva à sua separação do receptor

    e posterior homodimerização (Fig. 2) (Ihle 1995). Os homodímeros STAT1 são

    translocados para o núcleo para activar a transcrição através da sua interacção com

    sequências GAS (locais de activação γ) existentes em muitos promotores activados

    pelo IFN-γ (Akira 1999). Além da fosforilação dos resíduos de tirosina do STAT1,

    necessária à sua homodimerização e posterior translocação até ao núcleo, é também

    necessária a fosforilação de um resíduo de serina (Ser727) para o STAT1 se tornar

    transcripcionalmente activo (Wen, Zhong et al. 1995; Zhang, Blenis et al. 1995). A

    região carboxi-terminal do STAT1 possui a sequência consenso reconhecida pela

    IFN-γ

    IFN-γ

    Fig. 2: Esquema representativo da cascata de sinalização celular iniciada pela ligação do IFN-γ ao seu receptor e consequente fosforilação da tirosina 701 do STAT1 necessária à sua homodimerização e posterior translocação até ao núcleo.

  • 15

    MAPK, que se pensa estar envolvida nesta fosforilação do resíduo de serina do

    STAT1. Estudos recentes mostram que o IFN-γ também estimula a actividade da

    MAPK, que é constituída pelas ERK1, ERK2 (Liu, Brownsey et al. 1994) e

    p38MAPK (Verma, Deb et al. 2002). A activação das MAPKs é controlada através

    de complexos de sinalização membranar e envolve uma rede que inclui as proteínas

    Ras, as cínases de serinas da família das Raf e as cínases da MAPK (MEK1, MEK2,

    MEK3 e MEK6) (Chen, Gibson et al. 2001; Pearson, Robinson et al. 2001; Magro,

    Fraga et al. 2004).

    1.3 - EPIGALOCATECINO-3-GALATO

    Um número crescente de estudos epidemiológicos e experimentais sugerem

    que o consumo de chá verde reduz a incidência de várias patologias, nomeadamente,

    cancro, diabetes, doenças cardiovasculares e obesidade. Apesar de não serem ainda

    conhecidos todos os mecanismos envolvidos, existem evidências que apontam para

    as propriedades antioxidantes dos flavonóides existentes no chá verde como sendo

    um factor importante para o seu efeito em patologias tão diversas. Por exemplo,

    alguns estudos revelam a capacidade de compostos da família do catecino existentes

    no chá verde inibirem a oxidação lipídica no plasma, a oxidação do β-caroteno e do

    α-tocoferol (Lotito and Fraga 2000; Leung, Su et al. 2001). Todos os compostos da

    família do catecino existentes no chá verde apresentam propriedades antioxidantes,

    no entanto, ambos os estudos revelam que o ECG é o polifenol existente no chá

    verde com maior poder anti-oxidante, seguido do EGCG. Apesar de todos os

    compostos da família do catecino terem propriedades antioxidantes, existem

    determinadas actividades que são mais específicas e estão restringidas a um menor

    número de membros da família do catecino.

  • 16

    O epigalocatecino-3-galato (Fig. 3) é polifenol mais abundante, mais activo e

    também o mais estudado, existente no chá verde e está descrito como tendo várias

    actividades fisiológicas, nomeadamente anticarcinogénica, anti-inflamatória,

    antioxidante, antiangiogénica, antiaterosclerótica e antiviral. Algumas destas

    propriedades do EGCG devem-se às suas características antioxidantes, enquanto que

    outras parecem ser mais específicas e estão relacionadas com a capacidade do EGCG

    inibir algumas enzimas relacionadas com o cancro, como por exemplo as

    topoisomerases (Suzuki, Yahara et al. 2001) e também com a capacidade de inibir a

    fosforilação de proteínas envolvidas na sinalização celular. O EGCG inibe várias

    cascatas de sinalização celular envolvidas em diversos mecanismos celulares, sendo

    a mais relevante para o presente trabalho a sinalização celular desencadeada pelas

    citocinas pro-inflamatórias. Vários estudos revelam esta capacidade do EGCG

    reverter o efeito de citocinas pro-inflamatórias, como por exemplo, a supressão dos

    danos das células β do pâncreas induzido pela IL-1β e pelo IFN-γ (Han 2003); a

    inibição do desenvolvimento da inflamação e dos danos nas cartilagens, induzido

    Fig. 3: Estrutura 3D do (-)-epigalocatecino-3-galato. As barras azuis correspondem à ligação dos carbonos, as barras vermelhas correspondem à ligação dos oxigénios e as barras brancas correspondem à ligação dos hidrogénios.

  • 17

    monocam

    adacelular

    Lado basal Lado apical

    Sistema de oxigenação eaquecimento das soluçõesapical e basal

    Sistema de voltage-clamp

    Fig. 4: Esquema do sistema de Ussing usado para medira corrente de curto-circuito (Isc) induzida pelaanfotericina B.

    pela IL-1β, em modelos animais de artrite (Singh, Ahmed et al. 2003); a redução da

    expressão de VCAM-1 e adesão de monócitos às células endoteliais induzida pelo

    TNF-α e IL-1β (Ludwig, Lorenz et al. 2004). A redução da actividade da NKA pelo

    IFN-γ pode também ser revertida pelo EGCG, uma vez que este vai impedir a

    fosforilação do STAT1 e consequentemente a sua activação (Menegazzi, Tedeschi et

    al. 2001; Magro, Fraga et al. 2004).

    Neste trabalho pretendeu-se estudar um pouco melhor a acção do EGCG (Fig.

    3), na reversão do efeito do IFN-γ sobre a NKA. Para isso foram usadas técnicas de

    biologia molecular e bioquímicas para determinar a expressão e a actividade da NKA

    in vitro ex vivo e para avaliar a expressão e a actividade da NKA e do STAT1 in

    vitro. Para avaliar in vitro a actividade da NKA, que se localiza no lado basal das

    células do epitélio intestinal, assim como a sua resposta a uma série de compostos da

    família do catecino foi usada uma técnica electrofisiológica, que consiste em medir a

    corrente eléctrica necessária para anular a diferença de potencial (corrente de curto-

    circuito – Isc) criada, pelo transporte de Na+, entre o lado extracelular basal e apical

    (Fig. 4).

  • 18

    A adição de anfotericina B, que é um ionóforo para o ião Na+, ao lado apical

    da monocamada celular permite a entrada de sódio para a célula de forma a saturar a

    NKA (Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-Da-Silva 2002).

    Nestas condições a corrente de curto-circuito observada é uma medida da actividade

    da NKA existente na membrana basal da célula e deve-se ao transporte de Na+

    através da membrana basal pela NKA, que retira três iões Na+ da célula para o meio

    extracelular e retira apenas dois iões K+ do meio extracelular para a célula.

    Assim a actividade da NKA leva a um aumento de cargas positivas no meio

    extracelular do lado basal das células epiteliais, o que levaria à criação de uma ddp

    transepitelial, no entanto, o sistema utilizado (Fig. 4) mantém a ddp transepitelial

    constante (voltage clamp) e igual a zero. Deste modo, a corrente fornecida pelo

    sistema, para manter a ddp transepitelial igual a zero, é uma medida da actividade da

    NKA.

  • 19

    2 - Materiais e métodos

    2.1 - FÁRMACOS

    Os fármacos usados foram: interferão-γ humano e de ratinho, ubaína, (-)-

    catecino, (-)-catecino-3-galato, (-)-epicatecino, (-)-epicatecino-3-galato, (-)-

    epigalocatecino, (-)-epigalocatecino-3-galato, ácido gálico, anfotericina B, amilorido,

    furosemida, cloreto de bário, DIDS.

    2.2 - REAGENTES E SOLUÇÕES

    - Meio de cultura sem soro – MEM (meio mínimo essencial) com 25mM de

    HEPES, 26 mM de NaHCO3. Ajustar o pH a 7.2 com NaOH, esterilizar por filtração

    e adicionar 100 U/ml de Penicilina G, 0.25 µg/ml de anfotericina B, 100 µg/ml de

    estreptomicina. Guardar a 4ºC.

    - Meio de cultura com soro – Meio de cultura sem soro com 20% FBS (soro

    bovino fetal).

    - Solução de Krebs Apical (para electrofisiologia) – 118 mM de NaCl, 4.7

    mM de KCl, 1.2 mM de KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 1.2 mM de MgSO4, 2.5 mM

    de CaCl2, 10 mM de Manitol. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5% CO2 durante 15

    minutos e ajustar o pH a 7.4.

    - Solução de Krebs Basal (para electrofisiologia) – 118 mM de NaCl, 4.7

    mM de KCl, 1.2 mM de KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 1.2 mM de MgSO4, 2.5 mM

    de CaCl2, 10 mM de D-Glucose, 1,0 mM de ácido ascórbico. Gaseificar a solução

    com 95% O2 e 5% CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.

    - PBS (Solução salina de tampão fosfato) – 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5.4

    mM Na2HPO4, 1.75 mM KH2PO4. Ajustar o pH a 7.4.

    - PBST – PBS com 0.05% de tween 20.

    - Tampão de lise (para expressão da NKA) – 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150

    mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate de sódio, 100 µg/ml PMSF, 2 µg/ml

    aprotinin.

  • 20

    - Tampão de amostra 6X concentrado (para expressão da NKA) – 375 mM

    Tris-HCl, 12% SDS, 60% glicerol, 12% DTT 50mM, 0.6% azul de bromofenol.

    - Tampão de amostra 1X concentrado (para expressão do STAT1) – 62.5 mM

    Tris-HCl, 2% SDS, 10% glicerol, 2% DTT 50 mM, 0.1% azul de bromofenol.

    - Soro fisiológico – 0.9% de NaCl em água.

    - HBSS (solução de Hanks sem cálcio) – 137 mM NaCl, 5.0 mM KCl, 0.8

    mM MgSO4·7H2O, 0.33 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.0 mM MgCl 2·6H2O,

    1.0 mM butirato de sódio, 10 mM Tris-HCl. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5%

    CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.

    - Solução de Krebs modificado (para obtenção das células epiteliais) – 118

    mM NaCl, 4.0 mM KCl, 27.2 mM NaHCO3, 1.2 mM MgCl 2·6H2O, 1.25 mM

    CaCl2·2H2O, 10 mM HEPES, 5 mM glicose. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5%

    CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.

    - Reagente de proteínas – 100 mg de azul G brilhante, 50 ml de etanol, 100

    ml de ácido orto-fosfórico, completar com água bidestilada até 1000 ml.

    - Solução A (para determinação da actividade de todas as ATPases) – 0.75

    M Imidazole, 1.0 M NaCl, 0.1 M KCl, 0.1 M MgCl2·6H2O, 0.12 M Na AZIDE, 20

    mM Na4EGTA pH=7.4, 1.0 M TRIS/HCl pH 7.4.

    - Solução B (para determinação da actividade das ATPases insensíveis à

    ubaína) – 0.75 M Imidazole, 0.1 M MgCl2·6H2O, 0.12 M Na AZIDE, 20 mM

    Na4EGTA pH=7.4, 1.0 M TRIS/HCl pH 7.4.

    - Reagente de cor (para determinação dos fosfatos livres) – 50 mg/ml

    FeSO4·7H2O em 10% (v:v) de molibdato de amónio.

    2.3 - CÉLULAS

    Células Caco-2 (DSMZ, nº ACC 169) - Linha celular derivada de células de

    adenocarcinoma de colon humano provenientes do banco Alemão (DSMZ-Deutsche

    Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

  • 21

    2.4 - CRESCIMENTO DE CÉLULAS

    As células Caco-2 são cultivadas em meio de cultura com soro e mantidas

    numa atmosfera húmida com 95% H2O e 5% CO2 a 37 ºC. O meio de cultura é

    mudado de 2 em 2 dias e as células atingem a confluência 5 dias após terem sido

    cultivadas. As experiências são realizadas 7 dias após terem sido cultivadas e o meio

    de cultura com soro é mudado para meio de cultura sem soro 24 horas antes de cada

    experiência.

    2.5 - CULTIVO DE CÉLULAS

    As células em monocamada são dissociadas com 0,05% de tripsina-EDTA e

    ressuspendidas em 3 ml de meio de cultura com soro – suspensão de células.

    Para cultivar novas placas de petri de 21 cm2 são colocados 1 ml da suspensão de

    células e 5 ml de meio de cultura com soro nas novas placas de petri.

    Para os estudos de electrofisiologia as células são cultivadas em filtros de

    policarbonato com 12 mm de diâmetro e 0.4 µm de tamanho de poro (Snapwell;

    Costar) onde são colocados 100 µl da suspensão de células e 500 µl de meio de

    cultura com soro na parte apical de cada filtro e 1000 µl de meio de cultura com soro

    na parte basal.

    Para os estudos de expressão da NKA e da STAT1 as células são cultivadas em

    placas com 6 poços com 9.5 cm2 onde são colocados 500 µl da suspensão de células

    e 2.5 ml de meio de cultura com soro.

    2.6 - ACTIVIDADE DA NKA - MÉTODO ELECTROFISIOLÓGICO

    As células Caco-2 cultivadas nos filtros de policarbonato são colocadas nas

    câmaras de Ussing (1,0 cm2) equipadas com um sistema de recirculação de água a

    37ºC e de gaseificação das soluções com 5% CO2 e 95% O2. Em seguida colocam-se

    no lado apical e no lado basal 10 ml da solução de Krebs Apical e Basal

    respectivamente (Vieira-Coelho, Serrao et al. 2000; Vieira-Coelho and Soares-da-

    Silva 2000; Gomes and Soares-da-Silva 2002; Gomes, Xu et al. 2002). A resistência

    transepitelial (Ωcm2) é determinada, através da lei de Ohm, aplicando uma diferença

    de potencial de 3mV e medindo a corrente transepitelial. Em seguida deixam-se as

  • 22

    células estabilizar durante 20 minutos. Depois das células terem estabilizado

    procede-se à permeabilização do lado apical com anfotericina B, permitindo a

    entrada de sódio na célula, de modo a saturar a NKA (DuVall, Guo et al. 1998;

    Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-da-Silva 2002). Nestas

    condições a corrente de curto circuito observada deve-se ao transporte do ião Na+

    através da membrana basal pela NKA. O sistema de manutenção da ddp e da corrente

    (“voltage-current clamp”) foi ligado a um PC através de um sistema de aquisição de

    dados BIOPAC MP1000 (BIOPAC Systems, Goleta, CA). A análise dos dados foi

    feita através do software AcqKnowledge 2.0 (BIOPAC Systems).

    2.7 - EXPRESSÃO DA SUB-UNIDADE α1 DA NKA

    As células Caco-2 cultivadas nas placas de 6 poços são lavadas duas vezes

    com PBS e em seguida adiciona-se 300 µl de tampão de lise frio, sonica-se duas

    vezes durante 10 segundos e mantem-se as amostras no gelo durante 1 hora. Depois,

    centrifuga-se durante 15 minutos, a 4ºC, a 13000 rpm, guarda-se o sobrenadante e

    determina-se a sua concentração proteica pelo método de Bradford (as amostras

    devem ser diluídas 1/10 em PBS para diluir a absorção do tampão de lise). A

    concentração proteica das amostras é ajustada de modo a ficarem todas iguais e em

    seguida adiciona-se 1:6 de tampão de amostra 6X concentrado. As amostras são

    aquecidas a 37ºC durante 15 minutos e depois arrefecidas em gelo e centrifugadas a

    13000 rpm durante 5 minutos. Os geis de electroforese são carregados com 15 µg de

    proteínas e estas são separadas por electroforese desnaturante durante

    aproximadamente 2 horas a 150V e são depois transferidas electroforeticamente para

    membranas de nitrocelulose durante 1h45min. a 25V. Em seguida a membrana é

    bloqueada, com uma solução 10% de leite em pó magro em PBS, durante 30

    minutos, com agitação e é depois incubada com o anticorpo primário de ratinho, anti

    subunidade α1 da NKA diluído 1:10000, durante a noite, a 4ºC com agitação. No dia

    seguinte a membrana é lavada 3 vezes 15 minutos com PBST e depois incubada com

    o anticorpo secundário de ratinho diluído 1:3000, durante 1 hora. No final lava-se 3

    vezes 10 minutos com PBST e depois água. Em seguida incuba-se a membrana com

    500 µl de cada um dos reagentes de detecção, durante 1 minuto, seca-se, expõe-se ao

  • 23

    filme de raio-X, durante aproximadamente 10 segundos e por fim procede-se à

    revelação.

    2.8 - EXPRESSÃO DO STAT1 E DO PHOSPHOSTAT1

    As células Caco-2 cultivadas nas placas de 6 poços são lavadas duas vezes

    com PBS e lisadas com 200 µl de tampão de amostra 1X. Em seguida as células são

    removidas para um tubo de 500 µl no gelo, sonicadas duas vezes durante 10

    segundos, e são depois mantidas no gelo durante 1 hora. Antes de se carregarem os

    geis de electroforese as amostras são aquecidas a 95ºC durante 5 minutos, arrefecidas

    em gelo e centrifugadas a 13000 rpm durante 5 minutos. Os geis de electroforese

    (têm que ser preparados em duplicado, porque um é para avaliar a expressão do

    STAT1 e o outro do fosfoSTAT1) são carregados com 25 µg de proteínas e estas são

    separadas por electroforese desnaturante durante aproximadamente 2h30min a 125 V

    e são depois transferidas electroforeticamente para membranas de nitrocelulose

    durante 2h15min a 25 V. Em seguida as membranas são lavadas com PBST e

    bloqueadas com uma solução 5% de leite em pó magro em PBST, durante 3 horas à

    temperatura ambiente, com agitação. Depois uma membrana é incubada com o

    anticorpo primário de coelho, anti-STAT1 diluído 1:1000 e a outra é incubada com o

    anticorpo primário de coelho, anti-fosfoSTAT1 diluído 1:1000, durante a noite, a 4ºC

    com agitação. No dia seguinte as membranas são lavadas 3 vezes 15 minutos com

    PBST e depois incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho diluído 1:2000,

    durante 1 hora à temperatura ambiente. No final lava-se 3 vezes 10 minutos com

    PBST e depois água. Em seguida incuba-se as membranas com 500 µl de cada um

    dos reagentes de detecção diluídos em 9 ml de água, durante 1 minuto com agitação

    suave, remove-se o excesso de reagente de detecção expõe-se ao filme de raio-X

    durante 30 segundos e procede-se à revelação.

    2.9 - ANIMAIS

    Ratinhos NMRi machos (Harlan-Interfauna, Barcelona, Espanha) com peso

    entre 30-35 g são mantidos com água e comida à descrição, em condições ambientais

  • 24

    controladas de temperatura (22 ± 2 ºC) e ciclo cicardiano (12h + 12h), pelo menos

    uma semana antes do início das experiências.

    2.10 - ADMINISTRAÇÃO

    O IFN-γ de ratinho 10000 U é administrado intraperitonealmente aos ratinhos

    NMRi 24 horas antes da remoção do intestino. O EGCG e o EGC são administrados

    por via oral, numa concentração de 20 mg/Kg, 1 hora antes da administração do IFN-

    γ de ratinho.

    2.11 - OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS

    24 horas após a administração do IFN-γ, os animais são mortos por

    estiramento da coluna cervical e dissecados de modo a permitir a remoção do jejuno,

    do íleo e do cólon. Em seguida os fragmentos de intestino removidos são abertos

    longitudinalmente e lavados com soro fisiológico frio, para posterior remoção das

    células epiteliais. Para a remoção das gorduras, os fragmentos do intestino são

    incubados numa solução HBSS com 1.5 mgml-1 de DTT durante 10 minutos à

    temperatura ambiente, com 3 agitações suaves. Para a obtenção das células epiteliais,

    o tecido é colocado numa solução HBSS com 1 mM de EDTA à temperatura

    ambiente durante 10 minutos com 4 agitações suaves. Remove-se o tecido para outro

    tubo, repete-se o último procedimento mais duas vezes e coloca-se as suspensões de

    células no gelo. No final da terceira incubação na solução HBSS com 1 mM de

    EDTA remove-se o tecido e centrifugam-se os três tubos a 1200 rpm durante 4

    minutos a 4 ºC. Em seguida os peletes são lavados com 3 ml de solução de Krebs

    modificado, juntos, lavados novamente com 5 ml de solução de Krebs modificado e

    por fim ressuspendidos em 1 ml de solução de Krebs modificado de modo a obter

    uma suspensão com aproximadamente 1.5 mg proteína/ml.

    2.12 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA – MÉTODO DE BRADFORD

    Para determinar a concentração proteica de uma suspensão celular primeiro é

    necessário lisar as células de modo a que o conteúdo celular, nomeadamente as

    proteínas fiquem expostas. Depois preparam-se em duplicado: 800 µl de água + 10

  • 25

    µl de amostra + 200 µl de reagente de proteínas, mistura-se tudo, aguarda-se 10

    minutos, mistura-se novamente e lê-se a absorvância a 595 nm. Por interpolação com

    uma curva de calibração de proteínas do soro bovino (BSA) determina-se a

    concentração proteica da suspensão celular.

    2.13 - ACTIVIDADE DA NKA – MÉTODO BIOQUÍMICO

    O método bioquímico utilizado para avaliar a actividade da NKA em células

    epiteliais isoladas de jejuno, ileo e colon de ratinhos, consiste na medição do fosfato

    inorgânico libertado (Pi) pelas ATPases na presença e na ausência de ubaína, sendo a

    actividade da NKA a diferença entre os fosfatos libertados na ausência e os fosfatos

    libertados na presença de ubaína. Os fosfatos libertados são medidos por

    espectrofotometria a 740 nm. Depois de determinar a concentração proteica dos

    extractos celulares acerta-se a sua concentração, de modo a termos 1.2 mg de

    proteína por ml e coloca-se aproximadamentre 1ml num tubo de vidro, onde as

    células são incubadas durante 15 minutos a 37 ºC e depois permeabilizadas através

    da congelação rápida na mistura gelo seco-acetona seguida de descongelação à

    temperatura ambiente. Preparam-se em triplicado, tubos para medir a actividade de

    todas as ATPases e tubos para medir a actividade das ATPases insensiveis à ubaína,

    do seguinte modo: 800 µl solução A + 100 µl de água + 100 µl da suspensão de

    células para avaliar a actividade de todas as ATPases e 800 µl solução B + 100 µl de

    ubaína 10 mM + 100 µl da suspensão de células para avaliar a actividade das

    ATPases insensiveis à ubaína. Os tubos são colocados no banho a 37 ºC durante 5

    minutos e em seguida a reacção é iniciada pela adição de 4 mM de ATP, começando

    o tempo de incubação a contar 20 minutos a 37ºC. No final do tempo de incubação, a

    reacção é terminada pela adição de 50 µl de Ácido Tricloroacético arrefecido em

    gelo. Adiciona-se 1 ml de reagente de cor a cada tubo, aguardam-se 2 minutos,

    centrifuga-se a 4000 rpm durante 2 minutos e lê-se a absorvância a 740 nm. A

    actividade da NKA é expressa em nanomoles de fosfato inorgânico (Pi) por

    miligrama de proteína por minuto e é determinada como a diferença entre o fosfato

    libertado na ausência de ubaína (ATPase total) e na presença de ubaína (ATPase

    insensível à ubaína).

  • 26

    3 - RESULTADOS

    3.1 - Células Caco-2

    A corrente de curto circuito (Isc), induzida pela anfotericina B, nas células

    Caco-2 mergulhadas em meio contendo 143 mM de Na+, em ambos os lados (apical

    e basal), é dependente da concentração de anfotericina B adicionada ao lado apical

    (Fig. 5). Verificou-se ainda que esta Isc só se verifica na presença de Na+ no lado

    apical, como se pode observar na figura 5.

    Em seguida avaliou-se o efeito da inibição de uma série de transportadores na

    Isc induzida pela anfotericina B e verificou-se, que esta Isc não era influenciada pela

    presença de amilorido, inibidor do trocador Na+/H+ e bloqueador de canais de Na+, 1

    Fig. 5: Gráfico representativo da corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela anfotericina B 2.5 µg/ml (a) e anfotericina B 1.0 µg/ml (b) ao lado apical de células banhadas por uma solução com 143 mM de Na+; anfotericina B 2.5 µg/ml na ausência de sódio no lado apical (c).

    200 400-10

    0

    10

    20

    30

    40

    b

    a

    c

    Anfo

    teric

    ina

    b

    Tempo (s)

    Isc

    (µA

    /cm

    2 )

  • 27

    mM no lado apical o que exclui a possibilidade dos canais de sódio e do trocador

    Na+/H+, existentes no lado apical, estarem envolvidos na Isc induzida pela

    anfotericina B. A furosemida, inibidor do co-transporte Na+,K+,2Cl-, 10 µM no lado

    basal, e o cloreto de bário, bloqueador dos canais de K+, 1 mM no lado basal também

    não alteram a Isc induzida pela anfotericina B, o que exclui a possibilidade de

    envolvimento do co-transportador Na+,K+,2Cl- e dos canais de potássio, existentes no

    lado basal, na Isc observada. Por outro lado a adição de ubaína, inibidor da bomba de

    Na+,K+, 100 µM ao lado basal, reduz significativamente (p

  • 28

    Os resultados anteriormente descritos mostram que a Isc induzida pela anfotericina B

    é uma medida da actividade da NKA. Assim utilizou-se esta Isc para avaliar o efeito

    do IFN-γ e da ubaína na actividade da NKA e verificou-se que as células Caco-2

    expostas durante 24 horas ao IFN-γ e à ubaína apresentam uma redução significativa

    (p

  • 29

    Em seguida estudou-se o efeito do EGCG 20 µM, que é um inibidor do STAT1, na

    actividade da NKA inibida pelo IFN-γ 1000 U/ml e pela ubaína 100 nM, em células

    Caco-2 e verificou-se que, o EGCG reverte o efeito do IFN-γ na actividade da NKA

    das células Caco-2, mas não consegue reverter o efeito da ubaína (Fig. 8), o que está

    de acordo com os diferentes mecanismos de actuação da ubaína e do IFN-γ.

    0

    20

    40

    60

    80

    100

    120

    *

    *

    *

    Act

    ivid

    ade

    da N

    KA

    (% d

    o co

    ntro

    lo)

    a b c d e f

    Fig. 8: Efeito do EGCG na actividade da NKA das células Caco-2 inibida pelo IFN-γ humano e pela ubaína. (a) - situação controlo, (b) - EGCG 20 µM, (c) - IFN-γ 1000 U/ml, (d) - EGCG 20 µM + IFN-γ 1000 U/ml, (e) - Ubaína 100 nM e (f) - EGCG 20 µM + Ubaína 100 nM. Os valores apresentados são médias de 12 experiências para (a), 6 experiências para (b), 15 experiências para (c) e (e), 5 experiências para (d) e 3 experiências para (f); as barras representam o erro padrão da média e * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p

  • 30

    Como a ubaína e o IFN-γ têm mecanismos de actuação distintos e como o EGCG

    reverte o efeito do IFN-γ, fomos verificar se algum destes compostos actuam ao nível

    da expressão da NKA e verificamos nem o IFN-γ 1000 U/ml, nem a ubaína 100 nM,

    nem o EGCG 20 µM alteram significativamente a expressão da NKA, nas células

    Caco-2 (Fig. 9).

    Como o EGCG reverteu o efeito do IFN-γ na actividade da NKA das células Caco-2,

    ao contrário da ubaína, caracterizou-se apenas o efeito deste polifenol na actividade

    da NKA inibida pelo IFN-γ, através da dependência da inibição da actividade da

    NKA com a concentração de EGCG. Assim obteve-se um EC50 = 1.43 µM e

    verificou-se que para as concentrações de 20, 10, 5 e 2.5 µM a recuperação foi total,

    ou seja são estatisticamente semelhantes à situação controlo enquanto que para as

    concentrações mais baixas 1 e 0.1 µM não houve recuperação, ou seja são

    0

    5

    10

    15

    20

    25

    Expr

    essã

    o da

    NK

    A(%

    da

    dens

    idad

    ere

    lativ

    a)

    a b c d e f

    Fig. 9: Efeito do IFN-γ humano, da ubaína e do EGCG na expressão da NKA das células Caco-2. (a) - Situação controlo, (b) - EGCG 20 µM, (c) - IFN-γ 1000 U/ml, (d) - EGCG 20 µM + IFN-γ 1000 U/ml, (e) - Ubaína 100 nM e (f) - EGCG 20 µM +Ubaína 100 nM. Os valores apresentados são médias de 2 experiências e as barras representam o erro padrão da média.

  • 31

    4 5 6 7 840

    60

    80

    100

    120

    EC50 = 1.43 µM

    **

    -log(conc.)

    Act

    ivid

    ade

    da N

    KA

    (% d

    o co

    ntro

    lo)

    estatisticamente semelhantes às células tratadas apenas com IFN-γ e estatisticamente

    diferentes da situação controlo (Fig. 10).

    Como o EGCG reverteu o efeito do IFN-γ na actividade da NKA das células

    Caco-2 e como a cascata de sinalização celular, que vai desde a ligação do IFN-γ ao

    seu receptor até à inibição da NKA, envolve a STAT1, fomos verificar se esta

    recuperação da actividade da NKA mediada pelo EGCG estava relacionada com a

    diminuição da concentração de STAT1 ou com a inibição da sua fosforilação e

    consequentemente a sua inactivação. Nesse sentido fomos estudar o efeito do EGCG

    na expressão do STAT1 e do phosphoSTAT1 em células Caco-2 tratadas com IFN-γ

    e verificou-se que o IFN-γ aumenta quer a expressão de STAT1 quer a expressão de

    Fig. 10: Dependência da actividade da NKA com a concentração de EGCG nas células Caco-2 inibidas pelo IFN-γ humano. Os valores apresentados são médias de 3 experiências e as barras representam o erro padrão da média. * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p

  • 32

    phosphoSTAT1 (Fig. 11), contudo o EGCG apenas reduz a expressão de fosfo-

    STAT1, ou seja inibe a activação do STAT1. No sentido de pesquisar qual a

    estrutura ou parte da estrutura do EGCG relevante para a inibição do STAT1,

    testaram-se outros derivados análogos do catecino, como o EGC, o EGC mais AG, o

    ECG, o EC, o CG e o catecino, no entanto nenhum destes compostos preveniu o

    aumento da expressão do STAT1 ou do phosphoSTAT1 induzida pelo IFN-γ (Fig.

    11).

    B

    Con

    trol

    IFN

    EG

    CG

    EG

    CG

    +IFN

    EG

    C

    EG

    C+I

    FN

    EG

    C+A

    G

    EG

    C+A

    G+I

    FN

    0

    1 0

    2 0

    3 0

    4 0

    Exp

    ress

    ão d

    o ph

    osph

    o-STA

    T(%

    da

    dens

    idad

    e re

    lativ

    a)

    A

    Con

    trol

    IFN

    EG

    CG

    EG

    CG

    +IFN

    EG

    C

    EG

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    FN

    EG

    C+A

    G

    EG

    C+A

    G+I

    FN

    0

    1 0

    2 0

    3 0

    4 0

    Exp

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    o STA

    T1

    (% d

    a de

    nsidad

    e re

    lativ

    a)

  • 33

    D

    Con

    trol

    IFN

    EC

    EC

    +IFN

    EC

    G

    EC

    G+I

    FN

    0

    10

    20

    30

    40

    50

    60

    phos

    pho-

    STA

    T(%

    rela

    tive

    dens

    ity)

    Con

    trol

    IFN

    EC

    EC

    +IFN

    EC

    G

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    G+I

    FN

    0

    10

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    30

    40

    50

    C

    Expr

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    STA

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    da

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    idad

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    xpre

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    STA

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    da

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    lativ

    a)

  • 34

    F

    Con

    trol

    IFN

    Cat

    echi

    n

    Cat

    echi

    n+IF

    N

    CG

    CG

    +IFN

    0

    10

    20

    30

    40

    50

    Expr

    essã

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    pho

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    trol

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    N

    CG

    CG

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    1 0

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    STA

    T1(%

    da

    dens

    idad

    e re

    lativ

    a)

    Fig. 11: Efeito de alguns derivados do catecino (20 µM) na expressão do STAT1 (A, C, E) e do phosphoSTAT1 (B, D, F), em células Caco-2, na presença de IFN-γ (1000U/ml). Os valores apresentados são médias de 3 experiências e as barras representam o erro padrão da média.

  • 35

    Os resultados obtidos nas células Caco-2 mostram que o EGCG é o único composto

    testado, capaz de inibir a fosforilação do STAT1 e assim inibir o efeito do IFN-γ na

    actividade da NKA das células Caco-2. Por isso decidiu-se caracterizar o efeito deste

    composto da família do catecino na actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ e

    obtivemos um EC50 = 1.69 µM (Fig.12), idêntico ao valor obtido para o efeito deste

    composto na recuperação da actividade da NKA inibida pelo IFN-γ, que foi de 1.43

    µM (Fig. 10).

    4 5 6 7 80

    200

    400

    600

    EC50 = 1.69 µM

    -log(conc.)

    Act

    ivid

    ade

    da N

    KA

    (% d

    o co

    ntro

    lo)

    Fig. 12: Dependência da actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ humano com a concentração de EGCG, nas células Caco-2. Os valores apresentados são médias de 2 experiências e as barras representam o erro padrão da média. * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p

  • 36

    3.2 - Ratinhos NMRi

    Depois de caracterizar o efeito do EGCG na recuperação da actividade da NKA

    inibida pelo IFN-γ e ainda na inibição da actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-

    γ, nas células Caco-2, pretendia-se estudar o efeito do EGCG 20 mg/Kg num modelo

    animal. Para isso começou-se por avaliar o efeito do IFN-γ 10000 U, administrado

    intraperitonealmente, na actividade da NKA ao longo do intestino do ratinho e

    verificou-se que o IFN-γ 10000 U reduz a actividade da NKA nas células epiteliais

    do cólon do ratinho, mas não tem qualquer efeito na actividade da NKA das células

    epiteliais do jejuno e do íleo do ratinho (Fig. 13).

    Fig. 13: Efeito do IFN-γ (10000 U) na actividade da NKA ao longo do intestino de ratinho. * significaactividade da NKA significativamente diferente da situação controlo (P < 0.05).

    Jejuno Ileo Colon70

    80

    90

    100

    110

    120Veículo

    IFN-γ

    *

    Activ

    idad

    e da

    NKA

    (% d

    o co

    ntro

    lo)

  • 37

    Em seguida avaliou-se a expressão da NKA ao longo do intestino de ratinho tratado

    com IFN-γ e verificou-se que este não altera a expressão da NKA no jejuno, no íleo e

    no cólon (Fig. 14). Os resultados obtidos no cólon são idênticos aos obtidos nas

    células Caco-2, onde também se verifica uma diminuição da actividade da NKA sem

    haver diminuição na expressão da NKA.

    Jejuno Ileo Colon0

    10

    20

    30

    40

    50

    60

    70 VeículoIFN-γ

    Exp

    ress

    ão d

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    buni

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    α1

    da N

    KA

    (% d

    a de

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    ade

    rela

    tiva)

    Fig. 14: Efeito do IFN-γ (10000 U) na expressão da NKA ao longo do intestino de ratinho.

  • 38

    Como o IFN-γ 10000 U administrado intraperitonealmente apenas reduziu a

    actividade da NKA no cólon de ratinho, foi neste tecido que se estudou o efeito do

    EGCG e do EGC 20 mg/Kg, na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ. Como se

    pode observar na figura 15, o EGCG 20 mg/Kg reverte o efeito do IFN-γ 10000 U na

    actividade da NKA, enquanto que o EGC, que não teve qualquer efeito na

    fosforilação do STAT1 estimulada pelo IFN-γ nas células Caco-2 (Fig. 11B),

    também não reverteu a inibição da actividade NKA induzida pelo IFN-γ 10000 U no

    cólon de ratinho (Fig. 15).

    Controlo EGC EGCG70

    80

    90

    100

    110

    120VeículoIFN-γ

    **

    Act

    ivid

    ade

    da N

    KA

    (% d

    o co

    ntro

    lo)

    Fig. 15: Efeito do EGC e EGCG (20 mg/Kg) na actividade da NKA inibida pelo IFN- γ (10000 U), no colon de ratinho. * significa actividade da NKA significativamente diferente da situação controlo (P < 0.05).

  • 39

    4 - DISCUSSÃO

    O uso do antimicótico anfotericina B, formador de poros para o Na+, no lado

    apical da célula, permitiu isolar as correntes de sódio originadas pela acção da NKA

    (Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-Da-Silva 2002), como

    podemos confirmar nas experiências preliminares (Fig. 5 e 6), permitindo assim,

    estudar o efeito do IFN-γ e da ubaína na actividade da NKA e ainda o efeito do

    EGCG na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ.

    A inibição da actividade da NKA pela ubaína e pelo IFN-γ é desencadeada

    através de mecanismos distintos, assim a ubaína, que é um ligando da NKA, inibe a

    actividade da enzima por ligação directa (Lingrel, Orlowski et al. 1990), sendo o seu

    efeito revertido 24 horas após a sua remoção (Fig. 7). Por outro lado a inibição da

    NKA pelo IFN-γ não é directa, mas envolve o STAT1, numa complexa cascata de

    sinalização celular (Darnell, Kerr et al. 1994; Akira 1999; Magro, Fraga et al. 2004)

    e o seu efeito não é revertido 24 horas após a sua remoção (Fig. 7). Os resultados

    obtidos com o EGCG, nas células Caco-2, estão de acordo com o anteriormente

    descrito, uma vez que o EGCG, um inibidor do STAT1, reverteu o efeito do IFN-γ,

    mas não reverteu o efeito da ubaína na actividade da NKA (Fig. 8). Apesar de terem

    mecanismos de actuação distintos nenhum destes inibidores da NKA actua ao nível

    da expressão desta enzima (Fig. 9).

    A relevância deste trabalho advém do facto de muitos genes envolvidos em

    processos inflamatórios e em respostas imunológicas dependerem da actividade do

    STAT1 (Chatterjee-Kishore, van den Akker et al. 2000; Ramana, Chatterjee-Kishore

    et al. 2000) e por isso, os inibidores do STAT1 podem desempenhar um importante

    papel na modulação de vários processos envolvidos na inflamação. Assim procedeu-

    -se à caracterização do efeito do EGCG na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ e

    na actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ, através dos respectivos EC50. Os

    resultados obtidos nas células Caco-2 revelam um EC50 = 1.43 µM na actividade da

    NKA (Fig. 10) e um EC50 = 1.69 µM na actividade do STAT1 (Fig. 12). Em seguida

    estudou-se o efeito de outros compostos estruturalmente semelhantes (Fig. 16), na

  • 40

    inactivação do STAT1, no sentido de averiguar se haveria alguma sub-estrutura do

    EGCG particularmente relevante para o seu efeito.

    Fig. 15: Estrutura dos compostos da família do catecino testados. a) (-)-catecino, b) (-)-catecino-3-galato, c) (-)-epicatecino, d) (-)-epicatecino-3-galato, e) (-)-epigalocatecino, f) (-)-epigalocatecino-3-galato.

    OH

    OOH

    OH

    OH

    OHOOH

    O

    O

    OH

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    a) b)

    OH

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    c) d)

    OH

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    O

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    OH

    OH

    OH

    OH

    OH

    e) f)

  • 41

    Os resultados obtidos nas células Caco-2 mostram que apenas o EGCG

    impede a activação do STAT1 induzida pelo IFN-γ (Fig.11), o que sugere que não

    existe nenhum grupo funcional particularmente importante para a actuação do

    EGCG, mas que este actua como um todo.

    A inibição do efeito do IFN-γ na actividade da NKA pelo EGCG ocorre

    através da inibição da fosforilação da tirosina 701 do STAT1 (Fig. 11B) que impede

    a activação deste e não por inibição da expressão do STAT1 (Fig. 11A) nem por

    outro processo relacionado com o seu poder antioxidante, já que nenhum dos outros

    compostos da família do catecino conseguiu reverter o efeito do IFN-γ no STAT1,

    apesar de também apresentarem propriedades antioxidantes (Lotito and Fraga 2000;

    Leung, Su et al. 2001). Existem alguns exemplos de inibição do crescimento celular

    por parte de vários compostos da família do catecino como é o caso do crescimento

    das células do epitélio bronquico humano, 21BES, descrito por Yang onde não só o

    EGCG, como também o EGC inibem o crescimento das referidas células (Yang, Liao

    et al. 2000). Estes autores sugerem que o grupo galato é importante para a inibição

    do crescimento da linha celular 21BES. Outro exemplo é o descrito por Chung para a

    linha celular JB6 da epiderme de ratinho, onde todos os compostos da família do

    catecino excepto o (-)-epicatecino, mostram uma forte inibição do crescimento

    celular e da actividade da AP-1 (Chung, Huang et al. 1999). Os resultados obtidos,

    no presente trabalho, sugerem que toda a estrutura do EGCG (Fig. 3) é importante

    para a inibição do STAT1, já que nenhum dos outros compostos da família do

    catecino testados e ainda o EGC juntamente com o AG conseguiram reverter o efeito

    do IFN-γ (Fig. 11). Assim, em alguns casos, os efeitos atribuídos genericamente ao

    chá verde, nomeadamente a sua acção antiinflamatória, podem na realidade ser da

    exclusiva responsabilidade do EGCG.

    Os resultados obtidos com a NKA isolada das células epiteliais do cólon de

    ratinhos NMRi, mostram que o EGCG também é eficaz quando administrado por via

    oral (Fig. 15), o que aumenta a importância deste composto, já que poderá ser

    administrado oralmente para a supressão do efeito do IFN-γ sobre a NKA,

    nomeadamente em pacientes com doença de Chron, para a diminuição de um dos

    principais sintomas, que é a diarreia. Além disso como o EGCG actua sobre o

  • 42

    STAT1 poderá também ser usado para reverter outros mecanismos envolvidos na

    inflamação, que utilizem uma cascata de sinalização celular que envolva este

    transdutor de sinal.

  • 43

    5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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    CapaResumoAgradecimentosÍndiceLista de abreviaturas1. Introdução2. Materiais e métodos3. Resultados4. Discussão5. Referências bibliográficas