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EFEITO DA ENZIMA β-LIASE Endozym Thiol® NA

LIBERTAÇÃO DE TIÓIS VOLÁTEIS EM VINHOS DE

CASTAS PORTUGUESAS

Alex Musialowski Chaves

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Viticultura e Enologia

Orientador: Doutor Jorge Manuel Rodrigues Ricardo da Silva

Coorientador: Engenheiro Ari De Mari

Júri:

Presidente: Doutora Maria Helena Mendes da Costa Ferreira Correia de Oliveira, Professora Associada do Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa.

Vogais: Doutor Jorge Manuel Rodrigues Ricardo da Silva, Professor Catedrático do Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa.

Licenciada Olga Maria Carrasqueira Laureano, Investigadora Coordenadora do Instituto Superior de Agronomia da Universidade de Lisboa.

2014

I

AGRADECIMENTOS

Agradeço à AEB Group, representada pelo Engenheiro Ari de Mari, pela parceria na

realização desta investigação.

Ao Doutor Jorge Ricardo, pela orientação na realização desta tese.

Ao Senhor Antônio, pela vinificação dos vinhos testados neste experimento.

À Dona Julia, pelo auxilio na realização das análises laboratoriais.

Aos demais professores do ISA, pelas aulas ministradas.

Aos colegas, pelo convívio.

Em especial, aos meus pais, Miguel Angelo Chaves de Amorim e Celia Regina

Musialowski Chaves, pelo incentivo e apoio a realização deste mestrado.

A todos, obrigado!

II

RESUMO

A casta francesa Sauvignon Blanc, utilizada para a vinificação de vinhos brancos, possui

um aroma varietal muito apreciado pelos consumidores a nível mundial. Este aroma é

proveniente de seus compostos voláteis de enxofre, nominados tióis voláteis ou

mercaptanos e conferem aos vinhos aromas tropicais como buxo, toranja e maracujá.

Os tióis voláteis responsáveis por estes aromas são, principalmente: o 4-mercapto-4-

metilpentan-2-ona (4MMP), o 3-mercaptohexanol (3MH), o acetato de 3-mercaptohexilo

(A3MH) e o 4-mercapto-4-methyl-pentan-1-ol (4MMPOH), respectivamente (Darriet e

Tominaga, 1995).

Estes compostos são liberados durante a fermentação alcoólica pela ação das

leveduras que produzem a enzima β-liase que reage com os substratos não odorantes

presentes na uva, que são: os S-conjugados da cisteína, os S-conjugados da glutationa e o

E-hexen-2-al (Murat et al., 2001; Subileal et al., 2008). Estes compostos são os precursores

dos tióis.

Este experimento investiga a libertação destes tióis varietais nas castas brancas

portuguesas Viosinho, Arinto, Alvarinho e Encruzado e também nas castas tintas Touriga

Nacional e Syrah (esta última, francesa) através da utilização da enzima β-liase Endozym

Thiol® produzida pela AEB Group, com atividades secundárias específicas, que favorecem a

hidrólise dos precursores aromáticos tiolíticos da uva como o 4MMP, A3MH, 3MH e

4MMPOH.

Para a determinação das concentrações dos tióis nos vinhos estudados realizou-se a

Análise com Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (GC-

MS), utilizando-se o método descrito por Mateo-Vivaracho et al. (2008).

Para a análise da efetividade da libertação dos aromas tiolados nos vinhos que

receberam a formulação enzimática Endozym Thiol® em comparação com os vinificados

sem a adição da enzima, realizou-se um Painel de Provas, contando com 8 provadores

treinados.

Verificou-se uma tendência no aumento das concentrações globais dos tióis nos vinhos

que receberam o Endozym Thiol® na vinificação, contudo, na Análise Sensorial este caráter

tiolado de frutas tropicais e tons vegetais não se mostrou acentuado nos vinhos que

receberam a enzima.

Palavras Chave: Castas portuguesas, 3MH, 3AMH, 4MMP, Cromatografia em fase

gasosa.

III

ABSTRACT

The French variety Sauvignon Blanc, used for the vinification of white wines, has a very

appreciated varietal aroma by worldwide consumers. This aroma comes from its volatile

sulfur compounds, denominated volatile thiols or mercaptans. It gives a tropical flavors as

boxwood, grapefruit and passion fruit. The volatile thiols responsible for such flavorings are

principally: 4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP), 3-mercaptohexanol (3MH), ethyl 3-

mercaptohexilo (A3MH) and 4-mercapto-4-methyl-pentan-1-ol (4MMPOH), respectively

(Darriet and Tominaga, 1995).

These compounds are released during the fermentation by the action of yeast which

produce the β-lyase enzyme that reacts with the substrate not odorants present in grape,

namely: S-cysteine conjugates, the conjugates of S-glutathione and E-hexen 2-al (Murat et

al. 2001; Subileal et al. 2008). These compounds are the precursors of thiols.

This experiment search the release of the varietal thiols in white portuguese varieties

Viosinho, Arinto, Alvarinho and Encruzado and also in red varieties Touriga Nacional and

Syrah (the latter, French) by using the enzyme β-lyase Endozym Thiol® produced by the

AEB Group, with specific secondary activities, which promote the hydrolysis of grape

aromatic tiols precursors as 4MMP, A3MH, 3MH and 4MMPOH.

For the determination of the concentrations of thiols in wines studied Analysis was

performed with Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (CG-MS) using the

method described by Mateo-Vivaracho et al. (2008).

To analyze the effectiveness of the release of tiols aromas in wines that received the

enzyme formulation Endozym Thiol® compared with vinified without enzyme added, there

was a panel of tests , with 8 trained panelists .

As a conclusion, there was a trend in the increase of the global concentrations of thiols in

wines that received Endozym Thiol® in winemaking, however, in its thiolated character the

aroma tones of tropical fruits and vegetables was not pronounced in wines that received the

enzyme.

Keywords: Portuguese grape varieties, 3MH, 3MHA, 4MMP, Gas-chromatografy.

IV

EXTENDED ABSTRACT

The French variety Sauvignon Blanc, used for the vinification of white wines, has a very

appreciated varietal aroma by worldwide consumers. This aroma comes from its volatile

sulfur compounds, denominated volatile thiols or mercaptans. It gives a tropical flavors as

boxwood, grapefruit and passion fruit. The volatile thiols responsible for such flavorings are

principally: 4-mercapto-4-methylpentan-2-one (4MMP), 3-mercaptohexanol (3MH), ethyl 3-

mercaptohexilo (A3MH) and 4-mercapto-4-methyl-pentan-1-ol (4MMPOH), respectively

(Darriet and Tominaga, 1995).

These compounds are released during the fermentation by the action of yeast which

produce the β-lyase enzyme that reacts with the substrate not odorants present in grape,

namely: S-cysteine conjugates, the conjugates of S-glutathione and E-hexen-2-al (Murat et

al. 2001; Subileal et al. 2008). These compounds are the precursors of thiols.

This experiment search the release of the varietal thiols in white portuguese varieties

Viosinho, Arinto, Alvarinho and Encruzado and also in red varieties Touriga Nacional and

Syrah (the latter , French) by using the enzyme β-lyase Endozym Thiol® produced by the

AEB Group, with specific secondary activities, which promote the hydrolysis of grape

aromatic tiols precursors as 4MMP, A3MH, 3MH and 4MMPOH.

For the determination of the concentrations of thiols in wines studied Analysis was

performed with Gas Chromatography coupled to Mass Spectrometry (CG -MS) using the

method described by Mateo-Vivaracho et al. (2008).

To analyze the effectiveness of the release of tiols aromas in wines that received the

enzyme formulation Endozym Thiol® compared with vinified without enzyme added, there

was a panel of tests, with 8 trained panelists .

For the evaluation of the results of the sensory analysis Panel wines held the Tukey test

at 5 % variance on the following parameters: Tropical Notes, which includes the aromas of

grapefruit, passion fruit and also cat pee (aromas associated with volatile thiols); Balance

and Balance taste aromatic, related to the harmony of taste and aroma of wines and the

wine of the global Assessment, which evaluated the overall quality of wine. This analysis

was performed by comparing, within the same caste, the wines that received the enzyme

with the witnesses, who were vinified without added enzyme .

There was a trend in the increase of the global concentrations of thiols in wines that

received Endozym Thiol® in winemaking, however, in this character thiolated Sensory

Analysis of tropical fruits and vegetables tones was not pronounced in wines that received

the enzyme.

However, by analyzing the concentrations of thiols in wines, can be noted that in most

castes there was an increase in the concentration of thiols in wines enzimados regarding

V

your witness, except Viosinho where 3MH decreased their concentration; Alvarinho in the

4MMP and A3MH decreased their concentration, and Encruzado where there was a

decrease in the concentration of A3MH.

In all other cases there was an increase in the concentration of these three thiols

studied, especially in the 3MH Touriga Nacional , which increased its concentration of 293

ng/l to 410 ng/l.

Regarding the use of the enzyme β-lyase, it can be concluded that there is a trend in the

overall increase of the concentration of thiols in wines due facilitating the release of thiols

from their precursors.

Therefore, despite having obtained very similar results in sensory analysis comparing the

wines which we used the enzyme β-lyase and the control wine, chemical analysis

demonstrated the potential use of the enzyme Endozym Thiol® both in winemaking of white,

as of reds , regarding the release of volatile sulfur compounds .

Thus, the enzyme Endozym Thiol® could replace the use of yeast selected to optimize

the activity of β-lyase, since these still have a high cost.

However, this increased concentration of thiols above was not enough to increase the

thiolated tropical character and aroma of the wines studied. This may have been caused by

the fact microvinifications have been made in this experiment and using it is therefore small

amounts of the enzyme formulation. Thus, it may be that in winemaking industry there is a

greater effectiveness of the enzyme in the release of volatile sulfur compounds and also

increasing the tropical character of the wine by using larger quantities of enzyme during

vinification, even if the concentration is maintained.

Keywords: Portuguese grape varieties, 3MH, 3MHA, 4MMP, Gas-chromatografy.

VI

ÍNDICE

RESUMO ........................................................................................................................................ II

ABSTRACT .................................................................................................................................... III

EXTENDED ABSTRACT ............................................................................................................. IV

ABREVIATURAS .......................................................................................................................... IX

LISTA DE QUADROS E FIGURAS ............................................................................................ X

1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 1

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................................... 2

2.1 Os Aromas dos Vinhos: ............................................................................................... 2

2.1.1 Análise Sensorial ...................................................................................................... 3

2.2 Análises Químicas........................................................................................................ 4

2.3 Aromas Varietais .......................................................................................................... 4

2.3.1 Compostos Terpênicos............................................................................................ 4

2.3.2 Norisoprenóides em C13 ........................................................................................ 5

2.3.3 Metoxipirazinas ......................................................................................................... 6

2.3.4 Compostos Voláteis de Enxofre ............................................................................. 7

2.3.4.1 Compostos de Enxofre Como Defeitos de Aroma ....................................... 7

2.3.4.2 Compostos de Enxofre Varietais ..................................................................... 8

2.3.4.3 Principais Tióis Varietais .................................................................................. 8

VII

2.3.4.4 Localização dos Precursores dos Tióis Varietais nos Bagos de Uva ....... 9

2.3.4.5 Presença de Tióis Varietais em Outras Castas .......................................... 10

2.3.4.6 Formação dos Tióis Voláteis ......................................................................... 10

2.3.4.7 Influência das Práticas Vitícolas na Obtenção dos S-Conjugados da

Cisteína nas Uvas .................................................................................................................. 11

2.3.4.8 Evolução dos Tióis Após a Vindima ............................................................. 12

2.3.4.9 Efeito das Leveduras na Libertação dos Tióis ............................................ 12

2.3.4.10 Influência da Vinificação na Libertação dos Tióis .................................... 13

2.3.4.11 Influência do Envelhecimento nos Tióis Voláteis ..................................... 13

2.4 Terroir ........................................................................................................................... 14

2.5 Castas .......................................................................................................................... 15

2.5.1 Alvarinho .................................................................................................................. 15

2.5.2 Arinto ........................................................................................................................ 15

2.5.3 Encruzado ............................................................................................................... 16

2.5.4 Sauvignon Blanc ..................................................................................................... 17

2.5.5 Viosinho ................................................................................................................... 17

2.5.6 Touriga Nacional .................................................................................................... 18

2.5.7 Syrah ........................................................................................................................ 18

3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................. 19

3.1 Fabrico dos Vinhos .................................................................................................... 19

3.1.1 Vinhos Brancos ....................................................................................................... 20

3.1.2 Vinhos Tintos .......................................................................................................... 20

VIII

3.2 Duração da Fermentação Alcoólica ........................................................................ 21

3.3 Análise Sensorial dos Vinhos ................................................................................... 22

3.3.1 Tratamento Estatístico da Análise Sensorial ..................................................... 25

3.4 Análise da Concentração dos Tióis nos Vinhos .................................................... 25

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................................... 26

4.1 Análise Sumária dos Vinhos ..................................................................................... 26

4.2 Concentração dos Tióis Voláteis ............................................................................. 28

4.3 Análise Sensorial dos Vinhos ................................................................................... 29

5 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 30

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................................ 32

ANEXO 1 ....................................................................................................................................... 36

ANEXO 2 ....................................................................................................................................... 37

IX

ABREVIATURAS

3MH: 3-mercaptohexanol.

4MMP: 4-mercapto-4-metilpentan-2-ona.

4MMPOH: 4-mercapto-4-metilpentan-2-ol.

A3MH: Acetato de 3-mercaptohexilo.

ANOVA: Análise da variância.

Cys-3MH: S-(3-hexanol)-L-cisteína.

Cys-4MMP: S-4 -(4-mercapto-2 pentanona)-L-cisteína.

DAP: Fosfato de diamónio.

GC: Cromatografia em Fase Gasosa.

GC-FPD: Cromatografia em Fase Gasosa com Detector fotométrico.

GC-MS: Cromatografia em Fase Gasosa com espectrometria de Massa.

GC-O: Cromatografia em Fase Gasosa com olfactometria.

GRP: Acido 2-S-glutathionylcaftarico.

GSH: Glutationa.

H2S: Acido sulfídrico.

HPLC: Cromatografia em fase liquida de alta eficiência.

IBMP: 2-methoxy-3-isobutylpirazyna.

INE: Instituto Nacional de Estatística.

ISA: Instituto Superior de Agronomia.

IVV: Instituto da Vinha e do Vinho.

LAAE: Laboratorio de Analisis del Aroma y Enologia.

NMR: Ressonância Magnética Nuclear.

OIV: Organização Internacional da Vinha e do Vinho.

TDN: 1,1,6-trimethyl-1,2-dihydronaphtaleno.

TLC: Cromatografia em Camada Fina.

X

LISTA DE QUADROS E FIGURAS

Quadro 1: Características dos Principais Álcoois Monoterpênicos.

Quadro 2: Características dos Norisoprenóides em C13.

Quadro 3: Características da Metoxipirazinas.

Quadro 4: Descritores Organolépticos e Limiares de Detecção dos Tióis Voláteis

Identificados nos Vinhos Sauvignon Blanc.

Quadro 5: Densidade e Temperatura Inicial e Final do Mosto na Fermentação.

Quadro 6: Ficha de Prova Sensorial dos Vinhos Brancos.

Quadro 7: Ficha de Prova Sensorial dos Vinhos Tintos.

Quadro 8: Parâmetros de Análise da qualidade dos Vinhos ao Fim da Fermentação.

Quadro 9: Antocianas e Fenóis Totais dos Vinhos Tintos.

Quadro 10: Intensidade de Cor dos Vinhos tintos Método Rápido OIV.

Quadro 11: Concentração dos Principais Tióis nos Vinhos Brancos e Tintos Com e Sem

Aplicação da Enzima Endozym Thiol®.

Quadro 12: Ensaio relacionando a concentração de tióis voláteis em vinhos Sauvignon

Blanc da mesma propriedade de Bordéus e a presença ou ausencia de tipicidade aromática

de cada safra (Tominaga et al., 1998b).

Quadro 13: Análise da Variância dos Resultados da Análise Sensorial dos Vinhos.

Figura 1: Circuitos das Substâncias Voláteis em Direção à Zona Olfativa.

Figura 2: 4MMP.

Figura 3: A3MH.

Figura 4: 3MH.

1

1 INTRODUÇÃO

A atividade vitivinícola tem grande relevância na cultura e economia portuguesa, sendo

realizada por esta nação desde tempos imemoriais e cujo consumo do seu produto, o vinho,

é bastante presente no cotidiano dos portugueses.

Portugal produziu na campanha 2010/11 o equivalente a 7,1 milhões de hectolitros

(IVV), seu consumo per capta é, segundo o INE, igual a 44,2 litros por habitante, seu

consumo interno em 2010/11 foi 4,7 milhões de hectolitros (IVV). As exportações em

2010/11 foram de 1,8 milhões de hectolitros, somando um montante de 324 milhões de

euros. O preço médio do litro de vinho foi de 1,76 euros por litro.

Os principais países importadores de vinhos portugueses são respectivamente Angola,

França, Alemanha, Reino Unido e Brasil (Anuário IVV 2010).

Buscar formas de suprir as necessidades e preferências de consumo dos países

importadores é uma forma de aumentar a demanda por estes produtos e também sua

valorização frente a estes mercados.

A casta francesa Sauvignon Blanc, utilizada para a vinificação de vinhos brancos, possui

um aroma varietal muito apreciado pelos consumidores a nível mundial. Este aroma é

proveniente de seus compostos voláteis de enxofre, nominados tióis voláteis ou

mercaptanos e conferem aos vinhos aromas tropicais como buxo, toranja e maracujá.

Os tióis voláteis responsáveis por estes aromas são, principalmente: o 4-mercapto-4-

metilpentan-2-ona (4MMP), o 3-mercaptohexanol (3MH) e o acetato de 3-mercaptohexilo

(A3MH), respectivamente (Darriet e Tominaga, 1995).

Estes compostos são libertados durante a fermentação alcoólica pela ação das

leveduras que produzem a enzima β-liase que reage com os substratos não odorantes

presentes na uva, que são: os S-conjugados da cisteína, os S-conjugados da glutationa e o

E-hexen-2-al (Murat et al., 2001; Subileal et al., 2008). Estes compostos são os precursores

dos tióis.

Estudos visando à busca destas notas tropicais e destes compostos de enxofre em

castas portuguesas já foram realizados no Instituto Superior de Agronomia, Lisboa, de

colaboração com a Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto e com a Escola

Superior de Biotecnologia da Universidade Católica do Porto, onde se estudou as castas

Antão Vaz, Arinto, Fernão Pires, Verdelho e Viosinho, tendo o Sauvignon Blanc como

2

testemunha. Neste estudo, através de cromatografia por fase gasosa, verificou-se a

presença de tióis voláteis nos vinhos oriundos destas castas, assim como o perfil tropical

em detrimento ao floral na casta Antão Vaz (Ferreira, D. 2011).

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Os Aromas dos Vinhos:

O vinho é uma bebida muito apreciada, principalmente pela sua componente aromática,

que em muitos vinhos é densa e complexa. São inúmeras as sensações olfativas que os

diferentes vinhos produzem nos consumidores, expressando tanto tons frutados, sabendo a

diferentes frutas, quanto a tons florais, lembrando diferentes flores.

Os aromas são produzidos por substância voláteis e identificados pelo homem pelo seu

receptor olfativo por duas formas: Pela via nasal, quando estas substâncias atingem a zona

olfativa penetrando diretamente pelas narinas; e pela via retro nasal, que ocorre após a

deglutição, onde, sob o efeito do aumento da temperatura, dá-se a liberação interna de

aromas que sobem pela rinofaringe até a zona olfativa.

Figura 1: Circuitos das Substâncias Voláteis em Direção à Zona Olfativa (Cardoso

2007).

3

A sensibilidade olfativa do ser humano pode detectar sensações de substâncias em

concentrações muito baixas. Contudo a concentração dessas moléculas não é o único fator

de detecção, sendo esta influenciada também pela sua volatilidade, pressão de vapor e

limiar de detecção olfativo (Meilgaard et al., 1999).

2.1.1 Análise Sensorial

Em análise sensorial distinguem-se os seguintes limites (Cardoso, 2007):

Limite de Detecção: Concentração a partir da qual se detecta uma sensação, não

necessariamente identificável, em 50% dos provadores de uma prova triangular;

Limite de Identificação: Concentração a partir da qual se consegue identificar a

substância;

Limite Diferencial: Diferença de concentração mínima susceptível de ser detectada.

Limite de Preferência: Concentração máxima de um composto odorífero a partir do qual

se julga negativamente o odor.

As componentes aromáticas do vinho podem ser divididas em 3 classes (Peynaud,

1980):

Aroma Varietal ou primário: Tem origem na própria uva e se transmite ao vinho;

Aroma de Fermentação ou secundário: Derivado da fermentação alcoólica;

Aroma de Evolução, terciário ou bouquet: Surge dos processos físico-químicos que

ocorrem durante a guarda e envelhecimento do vinho.

O Aroma Pré-fermentativo é uma classificação posteriormente introduzida por Bayonove

et al., 1998, este desenvolve-se no decurso dos tratamentos submetidos à uva durante a

vindima, o transporte, o esmagamento e a prensagem, bem como num eventual

aquecimento ou maceração pelicular e/ou carbónica. Os efeitos mecânicos destes

tratamentos vão permitir que os sistemas enzimáticos presentes nos bagos entrem em

contato com os substratos de maneira a liberar moléculas odoríferas.

O estudo e identificação das moléculas responsáveis pelos aromas, seus precursores e

mecanismos, é uma ferramenta importante no aperfeiçoamento da produção de vinho e

pode melhorar o processo de vinificação no sentido de aperfeiçoar a extração de

componentes aromáticos ou sua liberação a partir de seus precursores.

4

2.2 Análises Químicas

Além da análise sensorial, que possui a limitação do Limite de Detecção humano,

podem ser empregadas análises químicas para o estudo das componentes do vinho. Dentre

elas pode-se citar a cromatografia em fase gasosa (GC) que pode ser realizada juntamente

à espectrometria de massa (GC-MS), à cromatografia em camada fina (TLC), à

cromatografia líquida de alta performance (HPLC), à espectroscopia de infra vermelho de

Fourier (FTIR) e à ressonância magnética nuclear (NMR), as quais permitiram a

identificação e quantificação de mais de 500 compostos em diferentes tipos de vinhos.

Muitos destes compostos ocorrem nos vinhos a concentrações residuais, compreendidas

entre 10-4 e 10-9 g/L, sendo que muito deles estão muito abaixo dos limiares de percepção

humana.

O vinho é composto principalmente por água, álcool, ácidos voláteis e fixos e

substâncias fenólicas. Também possui em sua composição aldeídos, ésteres, vitaminas,

aminoácidos, sais minerais e anidrido sulfuroso.

2.3 Aromas Varietais

Os aromas chamados varietais, têm sua origem na própria uva e se transmitem ao

vinho. É o caso dos vinhos da casta Moscatel, Sauvignon Blanc e Riesling. Estes aromas

são gerados por moléculas voláteis. As principais serão descritas a baixo, com ênfase nos

tióis voláteis.

2.3.1 Compostos Terpênicos

Existem cerca de 4.000 compostos terpênicos e estes são sintetizados por várias

espécies vegetais.

Os compostos terpênicos odoríferos são os monoterpenos, compostos por 10 átomos

de carbono e duas unidades de isopreno e os sesquiterpenos, com 15 átomos de carbono e

três unidades de isopreno.

Os monoterpenos ocorrem na forma de hidrocarbonetos (limonene, myrcene, etc.),

aldeídos (linalal, geranial, etc.), álcoois (linalol, geraniol, etc.), ácidos (linálico, gerânico, etc.)

e também ésteres (acetato de linalol, etc.).

Os álcoois terpenicos como o linalol, α-terpeniol, citronelol, nerol, geraniol e o ho-trienol,

são extremamente odoríferos e conferem bons perfis aromáticos aos vinhos. O limiar de

5

percepção olfativa destes álcoois varia de dezenas a centenas de microgramas por litro

(Quadro 1) e seu impacto olfativo é sinérgico, ou seja, há redução deste limiar para

concentrações abaixo do limite de seu composto mais odorífero.

Os aldeídos terpênicos são reduzidos a álcoois durante a fermentação. São bastante

odoríferos, porém mais agressivos que seus álcoois correspondentes (Oliveira 2000).

Existem também terpenos voláteis glicosilados. Estes estão ligados a açúcares como a

glucose, arabinose, raminose e apiose, o que os torna não odoríferos. As uvas contêm

enzimas β-glicosidases, porém, estas enzimas têm sua atividade ótima a um pH 5, assim

sua capacidade de libertar os terpenos glicosilados presentes no mosto é muito reduzida,

pois esta enzima tem sua atividade ótima a um pH 5 e os vinhos e mostos têm seu pH

variando entre 2,8 e 4,0.

Quadro 1: Características dos Principais Álcoois Monoterpênicos.

Álcool Monoterpênico Descrição Aromática Limiar de Detecção (µg/l)

Linalol Rosa 50

α-Terpeniol Lírio 400

Citronelol Citronela 18

Nerol Rosa 400

Geraniol Rosa 130

Ho-trienol Tília 110

2.3.2 Norisoprenóides em C13

Os norisoprenóides de C13 são formados através da degradação oxidativa dos

carotenoides, que são terpenos com 40 átomos de carbono (Enzel, 1985). Esta degradação

produz derivados com 9, 10, 11 ou 13 átomos de carbono, possuindo este último,

propriedades odoríferas interessantes.

Estes norisoprenóides estão divididos em duas formas: megastimanes (β-damascenona,

β-ionona, 3-oxo-α-ionol, hydroxi-β-damascona) e não-megastimanes (1,1,6-trimethyl-1,2-

dihydronaphtaleno ou TDN). O esqueleto megastigmano é caracterizado por um anel

ciclohexano substituído nos carbonos 1, 5 e 6, e uma cadeia alifática insaturada com 4

átomos de carbono ligados a C6. O esqueleto pode ser oxigenado no carbono 7 (série

damascenona) ou no carbono 9 (série ionona).

Contudo, os norisoprenóides em C13 estão presentes nas uvas em formas não

odoríferas, como carotenoides ou glicosidados, mas os precursores são susceptíveis de

6

sofrer hidrólise ácida e enzimática. As agliconas, na maioria compostos polihidroxilados não

odoríferos, podem depois sofrer rearranjos originando compostos com propriedades

olfactivas interessantes (Quadro 2).

Quadro 2: Características dos Norisoprenóides em C13.

Composto Descrição Aromática

β-damascenona Flores, Frutas Tropicais

β-ionona Violeta

3-oxo-α-ionol Tabaco

hydroxi- β-damascona Chá e Tabaco

TDN Querosene

2.3.3 Metoxipirazinas

As metoxipirazinas são compostos heterocíclicos nitrogenados produzidos através do

metabolismo dos aminoácidos. Foi identificada a pirazina 2-methoxy-3-isobutylpirazyna

(IBMP) nas uvas Cabernet Sauvignon por Bayonove et al. (1975) e relacionadas ao aroma

varietal de pimento verde à herbáceo, característico deste vinho tinto de Bordeaux.

Posteriormente as pirazinas 2-methoxy-3-isopropil, 2-methoxy-3-sec-butyl e 2-methoxy-

3-ethyl foram identificadas nas castas Sauvignon Blanc, Cabernet Franc, Merlot, Pinot Noir,

Gewürztraminer, Chardonnay, Riesling, etc.

Contudo, a concentração destes compostos esta acima do limiar de detecção (Quadro

3) somente nas castas e vinhos de Sauvignon Blanc, Cabernet Sauvignon e Cabernet

Franc, conferindo a estes vinhos aromas de pimento verde e, às vezes, herbáceos e não

tão atrativos.

Quadro 3: Características da Metoxipirazinas.

Pirazina Descrição Aromática Limiar de Detecção (ng/l)

2-methoxy-3-isobutyl Pimento Verde 2

2-methoxy-3-isopropil Pimento Verde, Terroso 2

2-methoxy-3-sec-butyl Pimento Verde 1

2-methoxy-3-ethyl Pimento Verde, Terroso 400

7

2.3.4 Compostos Voláteis de Enxofre

Tiol é um composto organossulfurado que contém um grupo -SH, designado por grupo

tiol, grupo mercaptano ou grupo sulfidrilo ou sufidrila, ligado a um átomo de carbono (–C–

SH ou R–SH, onde R representa um alcano, alceno, ou outro grupo de átomos contendo

carbono). Tióis são os análogos do enxofre de álcoois (ou seja, o enxofre toma o lugar do

oxigênio no grupo hidroxila de um álcool), e a palavra é uma amálgama de "tio" + "álcool,"

com a primeira palavra derivando do grego "thion" = "enxofre". Tióis são frequentemente

referidos como mercaptanos. O termo mercaptano é derivado do latim mercurium captans

(capturando mercúrio) porque o grupo tiolato liga-se muito fortemente com os compostos de

mercúrio.

2.3.4.1 Compostos de Enxofre Como Defeitos de Aroma

Os compostos de enxofre da família tiol (ou mercaptanos) são geralmente responsáveis

por defeitos olfativos. Muitos destes compostos conferem aromas desagradáveis aos

vinhos, como por exemplo, cheiro a ovos podres, couve, cebola e aroma a reduzido.

As condições que induzem a maior presença destes compostos de enxofre que

conferem defeitos aromáticos são as de redução intensa, presença de resíduos de

fitofármacos, fermentação alcoólica onde o mosto apresenta carência de azoto,

armazenagem das garrafas expostas à luz solar.

Os compostos de enxofre podem ser classificados em função de sua temperatura de

ebulição, fator que indica seu nível de volatilidade. Os compostos com temperatura de

ebulição menor que 90º C são altamente voláteis e denominados “leves”, os com

temperatura de ebulição maior que 90ºC, menos voláteis, são considerados “pesados”.

(Moreira 2009).

Muitos dos compostos de enxofre que conferem aromas desagradáveis, por exemplo, o

ácido sulfídrico, o metanetiol e o etanetiol, descritos como aroma a couve, alho, borracha

queimada e cebola, são compostos leves e bastante voláteis, assim, sua remoção é

facilitada, podendo-se recorrer a arejamento do vinho para a sua retirada da solução.

Já compostos como o sulfureto de dietil, disulfureto de dietilo e o disulfureto de dimetilo,

que dão origem a defeitos aromáticos como vegetais cozidos, cebola e borracha, são

considerados pesados e sua remoção é mais difícil devido ao seu maior ponto de ebulição e

também pela sua grande reatividade com cobre. Estes possuem o limite de percepção

olfativa a baixas concentrações (Mestres et al., 2000).

8

2.3.4.2 Compostos de Enxofre Varietais

No entanto, foi claramente estabelecida à relação dos tióis com aromas de certas frutas

e plantas aromáticas. Assim, tióis específicos estão envolvidos nas características

aromáticas de frutas como groselha (Rigaud et al., 1986), toranja (Demole et al., 1982),

maracujá (Engel e Tressel, 1991) e goiaba (Idstein e Schreier, 1985; Bassols e Demole,

1994). Dois mercaptanos, o etil-3-mercaptopropionato e etil-2-mercaptopropionato, foram

identificados como componentes no aroma de uvas Vitis labrusca (variedade Concord)

(Kolor, 1983; Winter et al., 1990).

Os tióis foram identificados em vinhos Sauvignon Blanc e relacionados com suas notas

aromáticas por Darriet et al. (1991). Estes vinhos são marcados com aromas

característicos, como vários herbáceos, frutado e nuances empireumáticos (termo que

descreve as notas aromáticas que advém da ação do fogo utilizado no interior das barricas

de carvalho, como por exemplo: tostados, café, chocolate, baunilha e caramelo). Suas notas

aromáticas são descritas como: pimenta verde, buxo, giesta, eucalipto, rebento de cassis,

ruibarbo, folhas de tomate, urtigas, uva, maracujá, pêssegos brancos, groselhas e caldo de

aspargos, bem como madeira de acácia e flores. Após alguns anos de envelhecimento em

garrafa, alguns vinhos vêm a desenvolver aromas de fumaça, carnes assadas, e até mesmo

trufas.

2.3.4.3 Principais Tióis Varietais

O 4-mercapto-4-metilpentan-2- ona (4MMP) (Darriet et al, 1993,. Darriet, 1993; Darriet et

al., 1995). Esta é uma mercaptopentanona extremamente odorífera, apresenta um odor

acentuado de buxo e vassoura. O limiar de percepção numa uma solução do modelo é de

0,8 ng/l. A 4MMP tem um inegável impacto organoléptico, sua concentração podem até

exceder 100 mg/l nos vinhos Sauvignon Blanc com forte caráter varietal (Bouchilloux et al.,

1996, Tominaga et al. (1998b)).

Figura 2: 4MMP

O 4-mercapto-4-metilpentan- 1-ol (4MMPOH), que tem cheiro de casca de frutas

cítricas, tem um papel organoléptico mais limitado. As concentrações no vinho raramente

estão acima do limiar de percepção (55 ng/l), mas esse valor pode ser alcançado em alguns

vinhos.

9

O acetato de 3-mercapto-hexilo (A3MH), apresenta odores que vão de buxo, raspas de

toranja até maracujá. O A3MH foi anteriormente identificado na fruta maracujá por outros

autores (Engel e Tressel, 1991). Seu limiar de percepção é 4 ng/l e em alguns vinhos

Sauvignon Blanc podem conter várias centenas de ng/l. As concentrações diminuem à

medida que o vinho envelhece e o 3-mercaptohexanol (3MH) é formado.

Figura 3: A3MH

O 3-mercaptohexan-1-ol (3MH) confere aroma a uva e maracujá, fruta onde também foi

identificado o composto. O limiar de percepção é da ordem de 60 ng/l. Está sempre

presente no Sauvignon Blanc (Quadro 4), em concentrações que variam de centenas ng/l, a

alguns µg/l.

Figura 4: 3MH

Quadro 4: Descritores Organolépticos e Limiares de Detecção dos Tióis Voláteis

Identificados nos Vinhos Sauvignon Blanc.

2.3.4.4 Localização dos Precursores dos Tióis Varietais nos Bagos de Uva

A diferença nas concentrações do 4MMP e do 3MH nos vinhos pode ser explicada pelo

conhecimento da localização dos seus precursores, os S-conjugados da cisteína, nos bagos

das uvas. A investigação de Peyrot des Gachons et al. (2002) demonstrou que o conteúdo

de S-4-(4-metil-2-pentanol) precursor de 4MMP é muito superior na polpa do que na

película, enquanto que a concentração de S-3-(3-hexan-1-ol) precursor de 3MH foi quase

dez vezes maior na película. Comparando-se a vinificação “bica aberta” com a vinificação

com maceração, observou-se que o contato da película só permitiu um ligeiro aumento na

Composto Descrição Aromática Limiar de

Detecção (ng/l)

4-mercapto-4-metilpentan-2- ona (4MMP) Buxo, Giesta 0.8

Acetato de 3-mercapto-hexilo (A3MH) Buxo, Maracujá 4

3-mercaptohexan-1-ol (3MH) Maracujá, Raspas de Toranja 60

4-mercapto-4-metilpentan- 1-ol (4MMPOH) Raspa de Citros 55

10

concentração do precursor de 4MMP, mas enriqueceu o mosto consideravelmente com

precursores de 3MH.

2.3.4.5 Presença de Tióis Varietais em Outras Castas

Estes tióis voláteis foram também identificados em vinhos brancos feitos a partir de

outras castas e contribuem aos seus aromas varietais (Tominaga et al., 2000).

Ferreira D. (2011), em sua investigação realizada no Instituto Superior de Agronomia,

Lisboa, Portugal, conclui, com alguma segurança, que há a presença dos tióis 4MMP e 3MH

nas castas portuguesas Antão Vaz, Arinto, Fernão Pires, Verdelho e Viosinho.

2.3.4.6 Formação dos Tióis Voláteis

Os tióis voláteis não estão presentes nas uvas. Sua libertação ocorre durante a

fermentação alcoólica a partir de precursores presentes nas uvas. A investigação de Peyrot

des Gachons et al. (2002) demonstra que a liberação dos tióis ocorre através da ação da

enzima β-liase, produzida pelas leveduras durante a fermentação, sobre os conjugados da

S-cisteína. Em sua investigação demonstra que o 4MMP é libertado do precursor S-4-(4-

metil-2-pentanona)-L-cisteína e o 3MH, a partir do S-3-hexanol-L-cisteína.

Dois conjugados não voláteis do 3MH foram identificados: S-3-(hexan-1-ol)-L-cisteína

(Cis-3MH) (Tominaga et al., 1998b) e S-3-(hexan-1-ol)-glutationa (GSH-3MH) (Peyrot des

Gachons et al., 2002).

Peyrot des Gachons et al. (2002) levanta a hipótese dos conjugados da S-glutationa

serem produzidos pelas uvas como forma de desintoxicação de tecidos da planta, que

ocorre através da inativação de compostos xenobióticos pela glutationa.

Os conjugados da S-cisteína são intermediários da quebra de ligações dos conjugados

da S-glutationa, através de uma degradação proteolítica (Subileau, 2008).

Maeva Subileau (2008) afirma em sua investigação que o Cis-3MH é efetivamente um

precursor do 3MH, porém, não seu principal, uma vez que de 3 a 7% da produção total de

3MH se originam deste precursor. Este autor levanta também a hipótese de o sulfeto de

hidrogênio (H2S) ser um doador de enxofre na formação dos tióis.

Além disso, uma via biogenética alternativa onde o (E)- hex-2-enal liberta 3MH foi

demonstrada (Schneider et al., 2006).

Subileau et al. (2008a) descobriu que a maioria dos 3MH e 3MHA livres detectados nos

vinhos não são derivados do (E)-hex-2-enal e do Cis-3MH.

11

Os mesmos autores descobriram que a deleção do gene OPT1 que codifica o principal

transportador de glutationa resultou em menor formação de 3MH, sugerindo que o GSH-

3MH pode ser o principal precursor de 3MH.

Em particular, enquanto a capacidade das leveduras para gerar 3MH a partir de GSH-

3MH foi recentemente demostrada (Grant-Preece et al., 2010; Roland et al., 2010), a

importância deste precursor para a formação do poderoso odorante 3MHA permanece por

ser estabelecida.

Uma comparação direta da capacidade dos dois precursores, isto é, o Cys-3MH e o

GSH-3MH, para liberar 3MH e A3MH foi realizada por Winter et al. (2011),onde houve a

confirmação que a conversão metabólica realizada pela levedura no GSH-3MH pode gerar

3MH, demonstrando também a formação de A3MH a partir do mesmo precursor.

Descobriram também que o processo de conversão do GSH-3MH é significativamente

menos eficaz do que o do Cis-3MH. No entanto, durante a fermentação do vinho, esta

relativa baixa eficiência de conversão do GSH-3MH pode ser compensada pela sua

abundância, uma vez que em alguns mostos avaliados foram até 35 vezes maiores que a

concentração de Cis-3MH (Capone et al., 2010).

Michael Harsch (2013) registra a primeira evidência experimental do H2S como um

precursor de tióis, em seu ensaio, a adição de 100mg/l de NaSH hidratado aumentou a

síntese de tiól total em 135 vezes, levando a uma quantidade sem precedentes de 3MH

(257 µg/l) e de 3MHA (35 µg/l). Vinhos Sauvignon Blanc com altos teores de tióis

apresentam concentrações de 3MH entre 7 e 18 µg/l e de A3MH de 0,6 a 2,5 µg/l. Afirma

também que os compostos insaturados de 6 carbonos, especificamente o (E)-Hexenal e o

(E)-Hexen-1-ol, exibem um grande potencial de formação de tióis no mosto de uvas, uma

vez que, em condições de vinificação em escala industrial, estes foram quase

completamente metabolizados pelas leveduras na 24 primeiras horas após a inoculação.

2.3.4.7 Influência das Práticas Vitícolas na Obtenção dos S-Conjugados da

Cisteína nas Uvas

Há influência do solo e clima, assim como das praticas vitícolas como porta-enxertos

utilizados, adubação e tratamentos fitossanitários na produção dos S conjugados da

cisteína nas uvas e consequentemente na concentração dos tióis nos vinhos (Shinkaruk et

al., 2008).

12

Tratamentos fitossanitários a base de cobre, como a pulverização da Calda Bordalesa,

podem diminuir a formação de tióis devido à reatividade do cobre com o enxofre

(Dubourdieu et al., 1996).

A adubação nitrogenada durante a fase de vingamento dos frutos aumenta o potencial

aromático das uvas e também a produção dos S-conjugados da cisteína (Chone et al.,

2006).

O stress hídrico moderado pode aumentar a acumulação dos precursores de tióis

(Peyrot des Gachons et al., 2002). Contudo, o stress hídrico severo é um fator limitante na

obtenção de uvas ricas em S-conjugados da cisteína e também negativo no rendimento e

perenidade das videiras.

2.3.4.8 Evolução dos Tióis Após a Vindima

Dimitra Capone (2012) investiga como variam as concentrações dos principais

precursores de tióis durante o armazenamento das uvas após vindima mecânica em escala

industrial. A concentração do precursor cisteína para 3MH dobrou em 8 horas e triplicou

após 30 horas de armazenamento após vindima mecânica, enquanto que os precursores de

GSH e cysteinylglycina aumentaram sua concentração em cerca de 1,5 vezes. Os níveis de

(E)-2-hexenal e GSH diminuiram como precursores de tióis, enquanto o GRP e os álcoois

C6 aumentaram durante o armazenamento. Este estudo fornece um panorama detalhado

das interações relacionadas com a formação dos precursores de tióis a uma escala

comercial e realça a capacidade de manipular as concentrações dos precursores antes do

esmagamento das uvas.

2.3.4.9 Efeito das Leveduras na Libertação dos Tióis

A estirpe da levedura influencia a concentração de tióis no mosto. A estirpe

Saccharomyces cerevisiae ssp. bayanus tem uma maior capacidade de libertar 4MMP a

partir de seus precursores que outras estirpes. A formação do A3MH ocorre através da

esterificação do 3MH pelas leveduras durante a fermentação alcoólica e também é

influenciada pela estirpe da levedura (Tominaga et al., 2006).

Dubourdieu (2000) selecionou fermentos comerciais em relação à libertação de tióis na

casta Sauvignon Blanc, encontrando diferenças significativas entre os resultados das

leveduras na libertação de 4MMP ou 3MH. Existem assim leveduras indicadas para priorizar

a libertação de um ou outro tiol.

13

Na Australia investigou-se o efeito da adição na S. cerevisiae do gene da E. coli,

responsável pela síntese da enzima triptofanase, a qual imprime maior eficiência na

atividade da β-liase, tendo como resultado um aumento de 25 vezes da libertação de 4MMP

e 3MH (King et al., 2008).

Michael Harsch (2013) estuda o efeito da deleção unitária de genes da Saccharomyces

cerevisiae na produção de tióis após a fermentação de uvas da casta Sauvignon Blanc. Dos

67 genes selecionados para o estudo, 17 mostraram-se relacionados com o metabolismo do

enxofre e do nitrogênio nas leveduras, alterando a produção de tióis ou o fornecimento de

substratos.

2.3.4.10 Influência da Vinificação na Libertação dos Tióis

O tipo de vinificação, no que tange a maceração e a temperatura de fermentação,

influencia a libertação dos tióis, assim como possibilita ao enólogo prever o perfil aromático

ao privilegiar a libertação do 4MMP ou do 3MH. Isso porque há uma maior proporção do

precursor do 3MH nas películas das uvas e do 4MMH na polpa (Peyrot des Gachons et al.,

2002). Desta maneira a maior ou menor maceração pode contribuir para notas aromáticas

mais tropicais oriundas do 3MH ou vegetais no caso de se privilegiar a concentração do

4MMH.

A utilização de enzimas pectolíticas também pode aumentar o perfil tropical do

Sauvignon Blanc, pelo aumento da disponibilidade do S-3-hexanol-L-cisteína e

consequentemente a libertação de 3MH. Porém não há prova de uma correlação direta

entre a extração de polifenóis e o S-conjugados da cisteína durante a maceração

enzimática (Howell et al., 2003).

As investigações supracitadas são de suma importância na geração de conhecimentos

no sentido de aumentar a capacidade do enólogo em prever a quantidade de tióis desejada

em sua vinificação, através do conhecimento do comportamento dos precursores dos tióis e

também das especificidades da levedura a ser utilizada, de maneira a condizerem com a

casta, às operações de vindima e o método de vinificação, para que se possam antever na

qualidade do vinho as características almejadas.

2.3.4.11 Influência do Envelhecimento nos Tióis Voláteis

O teor de 3MH vinhos tintos de Bordeaux diminui consideravelmente durante

envelhecimento, especialmente em barricas, caindo de vários µg/l no final da fermentação

alcoólica para 300-600 ng/l depois de 12 meses em barrica. As condições de oxidação

controlada durante o envelhecimento em barrica são, sem dúvida, responsáveis por esta

14

redução da concentração do 3MH, que é altamente oxidável e extremamente reativo com as

quinonas produzidas pela oxidação dos compostos fenólicos.

2.4 Terroir

As castas brancas utilizadas neste experimento estão plantadas na Vinha Nova do

Pavilhão, as tintas, na Vinha do Almotivo, ambas situam-se na Tapada da Ajuda, Lisboa,

Portugal, dentro do campus do Instituto Superior de Agronomia, plantadas com a orientação

Norte-Sul e com exposição Este.

O solo da Tapada da Ajuda enquadra-se na família dos barros castanho-avermelhados

de textura franco-argilosa. Caracterizam-se por possuir um perfil do tipo Ap(B)C. São solos

evoluídos, com apreciável percentagem de colóides minerais do grupo de montmorilonites,

o que lhes imprime características especiais, tais como elevadas plasticidade e rijeza,

estrutura anisoforme no horizonte A e prismática no B, com presença de superfícies polidas,

pronunciando fendilhamento nas épocas secas. O teor de matéria orgânica é baixo sendo a

meteorização dos minerais bastante intensa. A expansibilidade é elevada, assim como a

capacidade de campo. Têm uma alta capacidade utilizável nos primeiros 50 cm; a

porosidade da terra fina é apreciável e a permeabilidade do solo moderada a rápida.

(Azevedo, 2002).

Segundo a caracterização de Thornthwaite, o clima da Tapada da Ajuda é mesotérmico,

com nula ou pequena eficácia térmica no Verão, sub- húmido e seco, com excesso

moderado de água no Inverno e défice moderado no Verão (Reis e Gonçalves,1981).

De acordo com as Normais Climáticas da Tapada da Ajuda de 1971/2000 os valores

médios de temperatura anual foram de 16,4ºC com um valor médio de mínima de 11,8ºC

registados no Inverno e um valor médio de máximas de 21ºC obtidos nos meses de Verão.

Com base nos valores apresentados, pode-se afirmar que de acordo com a

classificação climática de Köppen a Tapada da Ajuda enquadra-se como clima temperado

com verão seco e pouco quente. Em que a proximidade às grandes massas de água, como

o rio Tejo e o Oceano Atlântico, assim como o facto de a encosta se encontrar virada para

estas, leva a que as tradicionais características climáticas sejam suavizadas.

15

2.5 Castas

2.5.1 Alvarinho

A casta Alvarinho é uma das mais notáveis castas brancas portuguesas. É uma casta

muito antiga e de baixa produção que é, sobretudo, plantada na zona de Monção e Melgaço

(região dos Vinhos Verdes). Pode adquirir duas formas distintas: cacho pequeno, pouco

compacto e bagos pequenos e dourados ou cacho médio e de bagos maiores que

permanecem esverdeados quando maduros. Esta casta é responsável pelo sucesso dos

primeiros vinhos portugueses "monovarietais" (uma só casta), pois em Portugal os vinhos

de lote (mistura de várias castas) são mais comuns. A casta Alvarinho produz vinhos

bastante aromáticos e que atingem graduações alcoólicas elevadas conservando uma

acidez muito equilibrada.

Sua superfície vitícola atual são 1.800 ha e sua utilização a nível nacional é 1,35%.

2.5.2 Arinto

16

A Arinto é uma casta muito versátil, por isso é cultivada em quase todas as regiões

vinícolas. Na região dos Vinhos Verdes é conhecida por Pedernã. Contudo, é na região de

Bucelas que esta casta ganha notoriedade, sendo considerada a casta "rainha" da região.

O cacho da casta Arinto é grande, compacto e composto por bagos pequenos ou

médios de cor amarelada. Esta casta é frequentemente utilizada na produção de vinhos de

lote (mais do que uma casta) e também de vinho espumante. Na região de Bucelas, produz

vinhos monovarietais (uma só casta) de elevada acidez, cor citrina e marcadamente florais

e frutados (quando jovens).

Superfície vitícola atual: 5.900 ha, utilização a nível nacional: 1,6%

2.5.3 Encruzado

O cultivo da casta Encruzado é praticamente exclusivo da zona do Dão, sendo

provavelmente a melhor casta branca plantada na região. É utilizada na produção da

maioria dos vinhos brancos através de vinhos de lote ou de vinhos monovarietais. A casta

Encruzado tem uma boa produção e é bastante equilibrada em açúcar e acidez. Por outro

lado, é muito sensível à podridão e a condições climatéricas desfavoráveis (chuva e vento).

Os vinhos compostos por esta casta são muito aromáticos e de sabor acentuado.

Apresentam uma longevidade fora do comum, uma vez que podem conservar-se em garrafa

durante muitos anos.

Superfície vitícola atual: 300 ha, utilização a nível nacional: menor que 0,1%.

17

2.5.4 Sauvignon Blanc

De película verde, a uva Sauvignon é originária da região de Bordeaux, em França. É

hoje plantada em muitas das regiões vinícolas mundiais, produzindo vinhos monovarietais

com notas tropicais e boa acidez. Esta casta é também muito utilizada em vinhos de

sobremesa como os Sauternes. Dependendo do clima, o sabor pode variar de um vegetal

agressivo a um tropical adocicado. Juntamente com os vinhos da casta Riesling, os vinhos

monovarietais Sauvignon Blanc foram dos primeiros vinhos serem engarrafados com o tipo

de vedação "screwcap" em quantidades comerciais, especialmente pelos produtores da

Nova Zelândia e também em Bordéus.

2.5.5 Viosinho

A casta Viosinho é apenas cultivada nas regiões do Douro e de Trás-os-Montes, onde já

é utilizada desde o século XIX. É uma casta de boa qualidade e indicada para a produção

de vinho tranquilo e de vinho do Porto, todavia apresenta baixo rendimento e por isso é

pouco cultivada. A Viosinho apresenta cachos e bagos pequenos de maturação precoce e

bastante sensíveis à podridão. Esta casta desenvolve-se melhor em solos pouco secos. A

casta produz vinhos bem estruturados, frescos e de aromas florais complexos.

Normalmente são também alcoólicos e capazes de permanecer em garrafa durante alguns

anos.

18

Superfície vitícola atual 100 ha, utilização a nível nacional abaixo de 0,2%, mas com

tendência crescente.

2.5.6 Touriga Nacional

A casta Touriga Nacional tem origem no norte de Portugal e é cultivada em todas as

regiões do país. Casta de máximo valor enológico (casta piloto), indicada para a produção

de vinho de qualidade, vinho do porto, espumante e vinho rosado. Seus tintos têm aromas a

frutos silvestres, vermelho-escuros e maduros, com alguns tons florais de predominância a

violeta, boa adstringência e aptidão a evoluir em garrafa. Superfície vitícola atual estimada

em 6.700 ha, utilização a nível nacional em 10,35%.

2.5.7 Syrah

A casta Syrah tem origem na França, produz vinhos muito corados, de um vermelho

intenso com nuances violetas durante a juventude. A intensidade corante é sempre muito

persistente. O potencial aromático é muito complexo, com compostos florais, frutados,

especiarias e animais. Origina vinhos muito ricos em taninos. Sua riqueza em taninos,

pujança e a amplitude os tornam vinhos de guarda.

19

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Fabrico dos Vinhos

Neste ensaio de vinificação para o teste da enzima Endozym Thiol®, foram utilizadas as

castas de uvas brancas Alvarinho, Arinto, Encruzado e Viosinho e as castas de uvas tintas

Syrah e Touriga Nacional, vinificadas separadamente.

A enzima Endozym Thiol® é uma preparação pectolítica líquida produzida pela AEB

Group, com atividades secundárias específicas, que favorecem a hidrólise dos precursores

aromáticos tiolíticos da uva como o 4MMP, A3MH, 3MH e 4MMPOH.

Foram utilizados também os suplementos energéticos Fermoplus Energy® e Enovit®,

ambas da AEB Group.

A utilização do Fermoplus Energy® fornece diretamente aminoácidos e vitaminas

fazendo com que as leveduras não necessitem sintetizá-los e economizando, desta forma, a

energia que será necessária para a sua multiplicação desde o início da sua reativação,

acelerando sua multiplicação e favorecendo o seu predomínio sobre as estirpes indígenas.

O uso do nutriente Enovit® visa controlar as fermentações e as refermentações de

mostos e vinhos, estimulando a ativação e a multiplicação das leveduras. Isto permite obter

uma concentração adequada em azoto amoniacal cedendo vitaminas e micro elementos

que suportam a atividade metabólica da microflora levuriforme, não só no caso de carências

nutritivas, como se verificam habitualmente no início dos processos fermentativos, mas

também devido às características das castas, uvas sobre maduras ou botritizadas ou ainda

mostos clarificados. Com a aplicação de Enovit® evita-se a formação de H2S e as leveduras

são auxiliadas no seu correto metabolismo sem desvios, sem degradar as proteínas dos

mostos para obter o azoto assimilável necessário para o seu crescimento e multiplicação.

Assim obtêm-se vinhos, potencialmente muito menos oxidáveis, com uma concentração

indicada de ácidos cetónicos e, consequentemente, com uma diminuição da necessidade

de SO2. As quantidades de Azoto Prontamente Assimilável (APA) cedidas por Enovit®

estimulam a produção de compostos voláteis aromáticos e o fornecimento de tiamina

inibindo a produção de álcoois superiores que confere rusticidade sensorial. Na

fermentação dos bagaços virgens ou semi-fermentados, este coadjuvante permite a total

transformação dos açúcares em álcool e gás carbônico.

20

3.1.1 Vinhos Brancos

No caso das castas brancas houve a vindima seguida de prensagem sem desengaço e

adição de metabissulfito de potássio (K2S2O5) na dosagem de 100 mg/kg de uva, que

equivalem à 50 mg de SO2 por quilo de uva. Na prensagem utilizou-se uma esmagadora de

rolos e o mosto resultante foi armazenado em uma cuba de inox de 50 litros, onde foi

adicionada a enzima de clarificação Endozym Muscat® na proporção de 2g/100 litros de

mosto, dissolvida em água destilada.

Inoculou-se a levedura Fermol Charmat®, enzima considerada neutra na liberação de

compostos voláteis, utilizando 20g/100 litros de mosto e na preparação do inoculo

adicionou-se o nutriente FERMOPLUS Energy®, na proporção de 25% do peso da levedura.

Também se utilizou 25g/hl do nutriente ENOVIT® á entrada do mosto e também à

densidade de 1030.

Após 24 horas na cuba de inox, onde ocorreu a decantação do mosto, recolheu-se 17

litros de mosto, acondicionando-o em garrafões de 20 litros, onde ocorreu a fermentação

alcóolica. Dois garrafões para cada casta, servindo um como testemunha e o outro

recebendo a enzima.

A aplicação da enzima Endozym Thiol® ocorreu no segundo dia a partir do começo da

fermentação alcóolica na concentração de 4 ml/100 litros de mosto. Não foi aplicada nos

garrafões Testemunha.

Acompanhou-se a fermentação alcóolica através da medição diária da temperatura e

densidade do mosto.

Ao fim da fermentação alcóolica, corrigiu-se a concentração de SO2 no mosto com o

produto Aromax®, utilizando-se 20g/100 litros de mosto, o que equivale a 54 mg de SO2 por

litro de mosto.

3.1.2 Vinhos Tintos

Na vinificação dos tintos houve a vindima seguida de desengaço, adição de

metabissulfito de potássio (K2S2O5) na dosagem de 100 mg/kg de uva, que equivalem à 50

mg de SO2 por quilo de uva. Foram alocados os mostos em cubas de inox de 50 litros.

Inoculou-se a levedura Fermol Charmat®, enzima considerada neutra na liberação de

compostos voláteis, utilizando 20g/100 litros de mosto e na preparação do inoculo

21

adicionou-se o nutriente FERMOPLUS Energy®, na proporção de 25% do peso da levedura.

Também se utilizou 25g/hl do nutriente ENOVIT® á entrada do mosto e também à

densidade de 1030.

O mosto permaneceu na cuba de inox, com contato pelicular para haver a maceração,

por 15 dias. Duas vezes por dia houve a remontagem utilizando-se o “macaco”, instrumento

com o qual se afunda a massa de películas no mosto.

A aplicação da enzima Endozym Thiol® ocorreu no segundo dia a partir do começo da

fermentação alcóolica na concentração de 4 ml/100 quilos de uvas. Não foi aplicada cubas

de inox Testemunha.

Acompanhou-se a fermentação alcóolica através da medição diária da temperatura e

densidade do mosto. Passados 15 dias, a fermentação tumultuosa havia terminado e

transferiu-se o mosto das cubas de inox para garrafões de 20 litros, onde decorreu a

fermentação malolática.

Ao fim da fermentação malolática, corrigiu-se a concentração de SO2 no mosto com o

produto Aromax®, utilizando-se 20g/100 litros de mosto, o que equivale a 54 mg de SO2 por

litro de mosto.

3.2 Duração da Fermentação Alcoólica

Viosinho: Começo em 21 de agosto de 2012 e fim em 30 de agosto de 2012. Duração

de 10 dias para o ensaio e a testemunha.

Arinto: Começo em 7 de setembro de 2012 e fim em 17 de setembro de 2012. Duração


Alvarinho: Começo em 22 de agosto de 2012 e fim em 3 de setembro de 2012. Duração


Encruzado: Começo em 6 de setembro de 2012 e fim em 24 de setembro de 2012.

Duração de 18 dias para o ensaio e a testemunha.

Syrah: Começo em 10 de setembro de 2012 e fim em 21 de setembro de 2012. Duração


Touriga Nacional: Começo em 10 de setembro de 2012 e fim em 1 de outubro de 2012.

Duração de 21 dias para o ensaio e a testemunha.

22

As densidades iniciais e finais, assim como a temperatura de fermentação, estão

listadas no Quadro 5.

Quadro 5: Densidade e Temperatura Inicial e Final do Mosto na Fermentação.

Castas Densidade (g/l a 20°C) Temperatura (°C)

Inicial Final Inicial Final

Viosinho Testemunha 1099 992 24 24

Viosinho Enzimado 1099 992 24 24

Arinto Testemunha 1103 993 25 25

Arinto Enzimado 1103 993 25 25

Alvarinho Testemunha 1101 992 24 24

Alvarinho Enzimado 1101 992 24 24

Encruzado Testemunha 1104 992 25 25

Encruzado Enzimado 1104 992 25 25

Syrah Testemunha 1107 993 26 25

Syrah Enzimado 1107 994 26 25

Touriga Testemunha 1111 996 26 24

Touriga Enzimado 1111 996 26 24

3.3 Análise Sensorial dos Vinhos

A prova sensorial dos vinhos foi realizada na sala de provas do Instituto Superior de

Agronomia por um painel composto por 8 provadores treinados.

Os vinhos foram servidos de forma aleatória e identificados por códigos inscritos nas

taças.

Foram disponibilizadas fichas de provas aos provadores, uma para os vinhos brancos e

outra para os tintos. As fichas de prova foram divididas nos tópicos Cor, Aroma e Gosto.

Cada tópico dividido em sub-tópicos de interesse a este estudo, destacando-se em

importância a este trabalho o sub-tópico “Notas Tropicais” dentro do Aroma, onde se

agrupou os aromas Maracujá, Toranja e Xixi de gato, típicos da casta Sauvignon Blanc e

oriundo dos tióis voláteis (Quadros 6 e 7).

As notas de foram dadas em uma escala de 1 a 5, onde o 1 significa inexistente; 2,

pouco intenso; 3, medianamente intenso; 4, intenso e 5, muito intenso. Para as notas

Equilíbrio Aromático, Equilíbrio Gustativo e Apreciação Global 1 significa medíocre; 2,

satisfatório; 3, bom; 4, muito bom e 5, excelente.

23

Quadro 6: Ficha de Prova dos Vinhos Brancos

Instituto Superior

de Agronomia

Ficha de Prova de

Vinhos Brancos

Nome:

Data: 10/06/2013 Prove os vinhos em ordem aleatória e classifique os diferentes atributos utilizando as seguintes escalas:

Para Cor, Aroma e Gosto: 1. Inexistente 2. Pouco Intenso(a) 3. Medianamente Intenso(a) 4. Intenso(a) 5. Muito Intenso(a)

Para Equilíbrio (Aroma e Gosto) e Apreciação Global: 1. Medíocre 2. Satisfatório 3. Bom 4. Muito Bom 5. Excelente

Vinhos / Códigos

121 360 145 476 810 160 190 730

Côr

Limpidez

Amarelo

Verde

Aroma

Frutado

Floral

Notas Tropicais*

Vegetal

Equilíbrio

Gosto

Corpo

Amargo

Acidez

Persistência

Equilíbrio

Apreciação Global

*Notas Tropicais: Leia-se, Maracujá, Toranja, Xixi de Gato. Observações:

24

Quadro 7: Ficha de Prova dos Vinhos Tintos

Instituto Superior

de Agronomia

Ficha de Prova de

Vinhos Tintos

Nome:

Data: 10/06/2013 Prove os vinhosem ordem aleatória e classifique os diferentes atributos utilizando as seguintes escalas:

Para Cor, Aroma e Gosto: 1. Inexistente 2. Pouco Intenso(a) 3. Medianamente Intenso(a) 4. Intenso(a) 5. Muito Intenso(a)

Para Equilíbrio (Aroma e Gosto) e Apreciação Global: 1. Medíocre 2. Satisfatório 3. Bom 4. Muito Bom 5. Excelente

Vinhos / Códigos

273 220 171 589

Côr

Limpidez

Vermelho

Violeta

Aroma

Frutado

Floral

Notas Tropicais

Vegetal

Equilíbrio

Gosto

Corpo

Amargo

Adstringência

Acidez

Persistência

Equilíbrio

Apreciação Global

*Notas Tropicais: Leia-se, Maracujá, Toranja, Xixi de Gato.

Observações:

25

3.3.1 Tratamento Estatístico da Análise Sensorial

Os dados da análise sensorial foram tratados estatisticamente utilizando-se o programa

Excel 2010 com uma macro disponibilizada pela Universidade Federal de São Carlos,

Centro de Ciências Agrárias, Departamento de Tecnologia Agroindustrial e Socioeconomia

Rural. Esta macro realizou a análise de variância (ANOVA) com o teste de separação de

Tukey a 5% de significância.

3.4 Análise da Concentração dos Tióis nos Vinhos

Para a determinação das concentrações dos tióis nos vinhos estudados realizou-se a

Análise com Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massa (GC-

MS), utilizando-se o método descrito por Mateo-Vivaracho et al. (2008).

Estas análises foram realizadas pelo Laboratorio de Analisis del Aroma y Enologia

(LAAE), situado em Zaragoza, Espanha.

A Cromatografia Gasosa (CG) é uma técnica para separação e análise de misturas de

substâncias voláteis. A amostra é vaporizada e introduzida em um fluxo de um gás

adequado denominado de fase móvel (FM) ou gás de arraste – específico para cada

detector. Este fluxo de gás com a amostra vaporizada passa por um tubo contendo a fase

estacionária FE (coluna cromatográfica), onde ocorre a separação da mistura.

Em um sistema cromatografia gasosa acoplada ao espectro de massas (GC-MS) as

amostras provenientes do cromatógrafo a gás, no estado gasoso, são bombardeadas por

elétrons e são quebradas gerando íons positivos, negativos e radicais e a partir da diferença

entre massa/carga dos íons gerados irá separá-los.

Simplificadamente, o espectro de massa funciona da seguinte maneira: Um feixe de

elétrons de alta energia bombardeia a amostra, em fase gasosa, e o aparelho detecta e

registra os fragmentos gerados pelo impacto dos elétrons. A partir do valor da massa

molecular de cada um dos fragmentos, monta-se a molécula, como um “quebra-cabeça”. Os

fragmentos gerados podem ser íons, radicais ou moléculas neutras.

Num gráfico de espectro de massa aparecem picos de intensidades variáveis, cada pico

correspondendo a íons com uma razão massa/carga (m/z). A intensidade do pico sugere a

abundância relativa de cada íon molecular. Frequentemente aparecem no gráfico vários

picos, de intensidade muito baixa. A grande maioria deles não deve ser considerada na

análise do espectro, pois correspondem a fragmentos de difícil identificação. Consideram-se

picos de intensidade relativamente alta. O pico de maior massa molecular frequentemente

26

corresponde à própria molécula, porém, sem um elétron - esse pico é chamado pico base. A

intensidade do pico depende da estabilidade do íon molecular. São mais estáveis aqueles

íons que apresentarem um sistema de ressonância em sua estrutura.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1 Análise Sumária dos Vinhos

As primeiras análises laboratoriais realizadas nos vinhos foram feitas ao fim da

fermentação alcóolica para se conhecer a concentração de sulfuroso livre, sulfuroso total

acidez total, acidez volátil, pH, concentração de açúcares, e porcentagem de álcool em

volume. Através dessas análises se pode corrigir a concentração de anidrido sulfuroso livre

no vinho, neste caso foi corrigido para uma concentração de 30 mg por litro de vinho nos

tintos e 35 mg/l nos vinhos brancos. Também se certificar que a concentração de sulfuroso

total esta dentro dos limites legais.

A concentração de SO2 Total tem o limite de 150 mg/l nos vinhos tintos e 200 mg/l nos

vinhos brancos.

O pH deve variar entre 2,8 a 4,0.

A acidez total deve ser maior que 3,5 g/l expresso em ácido tartártico.

A acidez volátil tem o limite técnico estipulado em g/l expresso em ácido acético e seu

limite legal foi determinado em 1,2 g/l expresso em ácido acético.

A intensidade da cor, medida em unidade de absorvância a 420 nm (ua), deve variar

entre 5 a 24 ua nos vinhos tintos e serem menores ou iguais a 0,1 ua nos brancos.

O limite técnico da concentração dos açúcares redutores é igual ou menor a 2 g/l.

O teor alcóolico deve variar entre 9 a 15 % em volume.

27

Quadro 8: Análise Físico-química dos Vinhos.

Análises Realizadas ao Fim da Fermentação

SO2 Livre

(mg/l)

SO2 Total (mg/l)

Acidez Total

(g/l em ác. tartárico)

Acidez Volátil

(g/l em ác. acético)

pH Açúcares

(g/l) Álcool

(% em vol.)

Viosinho Testemunha

10 44 6,8 0,25 3,21 0,82 14,3

Viosinho Enzimado

10 44 6,9 0,18 3,21 1,6 14,3

Arinto Testemunha

22 86 8,2 0,21 3,02 2,0 14.2

Arinto Enzimado

19 74 8,2 0,21 3,01 2,3 14.2

Alvarinho Testemunha

20 61 8,6 0,44 3,03 1,6 14,5

Alvarinho Enzimado

20 58 9,0 0,36 3,04 2,0 14,5

Encruzado Testemunha

10 35 6,2 0,48 3,20 2,9 15,2

Encruzado Enzimado

16 45 6,2 0,47 3,20 3,6 15,2

Syrah Testemunha

19 64 6,3 0,43 3,26 1,0 14,2

Syrah Enzimado

16 51 6,8 0,40 3,23 1,4 14,7

Touriga Testemunha

16 57 5,2 0,69 3,82 1,9 16,3

Touriga Enzimado

13 45 5,2 0,67 3,82 2,0 16,0

Todos os vinhos deste ensaio estão dentro dos parâmetros legais e técnicos segundo a

OIV (Quadros 8, 9 e 10).

Quadro 9: Antocianas e Fenóis Totais dos Vinhos Tintos.

Castas Antocianas Totais (mg/l) Fenóis Totais (IPT)

Syrah Testemunha 504,6 49,0

Syrah Enzimado 482,3 53,7

Touriga Testemunha 439,2 65,0

Touriga Enzimado 433,9 70,0

28

Quadro 10: Intensidade de Cor dos Vinhos tintos Método Rápido OIV.

Castas Intensidade de Cor (ua)

Viosinho Testemunha 0,101

Viosinho Enzimado 0,104

Arinto Testemunha 0,182

Arinto Enzimado 0,188

Alvarinho Testemunha 0,160

Alvarinho Enzimado 0,169

Encruzado Testemunha 0,094

Encruzado Enzimado 0,097

Syrah Testemunha 10,9

Syrah Enzimado 13,2

Touriga Testemunha 14,7

Touriga Enzimado 15,5

4.2 Concentração dos Tióis Voláteis

Analisando-se as concentrações de tióis dos vinhos (Quadro 11), pode se notar que na

maioria das castas houve um aumento na concentração dos tióis nos vinhos enzimados em

relação a sua testemunha, exceto no Viosinho, onde o 3MH diminuiu sua concentração, no

Alvarinho o 4MMP e o A3MH diminuíram sua concentração.

Em todos os outros casos houve um aumento na concentração destes 3 tióis estudados,

com destaque para o 3MH na Touriga Nacional, que aumentou sua concentração de 293

ng/l para 410 ng/l.

Nota-se, por tanto, que o uso da β-liase nestas microvinificações tende a aumentar as

concentrações globais de tióis nos vinhos.

Contudo, comparando-se as concentrações dos tióis dos vinhos deste ensaio com as de

vinhos Sauvignon Blanc da região de Bordéus, nota-se que as concentrações do 4MMP e

do A3MH são semelhantes entre o Sauvignon Blanc e as castas estudadas (Quadro 12),

porém, as concentrações do 3MH, composto que confere aroma a maracujá e raspas de

toranja, são bem mais baixas nas castas portuguesas investigadas que no Sauvignon

Blanc.

29

Quadro 11: Concentração dos Principais Tióis nos Vinhos Brancos e Tintos Com e Sem

Aplicação da Enzima Endozym Thiol®.

Castas 4MMP (ng/l)

A3MH (ng/l)

3MH (ng/l)

Viosinho Testemunha 18,88 6,87 21,38

Viosinho Enzimado 20,99 12,24 15,96

Arinto Testemunha 23,88 6,68 55,34

Arinto Enzimado 33,62 11,32 84,22

Alvarinho Testemunha 39,99 7,30 32,14

Alvarinho Enzimado 35,17 6,97 33,66

Encruzado Testemunha 10,73 8,25 15,76

Encruzado Enzimado 10,75 6,70 35,27

Syrah Testemunha 7,94 5,25 52,67

Syrah Enzimado 18,28 6,92 68,67

Touriga Testemunha 6,50 < LD 292,64

Touriga Enzimado 13,18 3,51 409,58

Realização das Análises: LAAE- Laboratorio de Analisis del Aroma y Enologia.

Quadro 12: Ensaio relacionando a concentração de tióis voláteis em vinhos Sauvignon

Blanc da mesma propriedade de Bordéus e a presença ou ausencia de tipicidade aromática

de cada safra (Tominaga et al., 1998b).

Safra 4MMP (ng/l) A3MH (ng/l) 3MH (ng/l)

1992 7 0 871

1993* 45 0 1178

1994 10 0,4 600

1995* 44 2,8 1686

* Vinhos Sauvignon Blanc de Bordéus que apresentaram tipicidade aromática.

4.3 Análise Sensorial dos Vinhos

Para a avaliação dos resultados do Painel da análise sensorial dos vinhos realizou-se o

Teste de Tukey a 5% de variância nos seguintes parâmetros: Notas Tropicais, na qual se

incluem os aromas a toranja, maracujá e também xixi de gato (aromas associados aos tióis

voláteis); Equilíbrio Aromático e Equilíbrio Gustativo, relacionados à harmonia de gosto e

aroma dos vinhos e a Apreciação Global do vinho, onde se avaliou a qualidade global do

30

vinho. Esta análise foi realizada comparando-se, dentro da mesma casta, os vinhos que

receberam a enzima com as testemunhas, que foram vinificados sem a adição da enzima.

Em nenhum destes parâmetros houve diferença significativa dentro da mesma casta

entre os vinhos enzimados e os vinhos testemunha (Quadro 13).

Ao avaliar comparativamente as médias de todas as castas no parâmetro Notas

Tropicais, notam-se também resultados muito semelhantes.

Esta semelhança pode ser explicada pelo fato destas castas, a pesar de conterem tióis

voláteis em sua composição, não apresentarem naturalmente o caráter tropical como é

típico dos vinhos feitos da casta Sauvignon Blanc e esta casta não estar elencada nas

comparações realizadas.

Quadro 13: Análise da Variância dos Resultados da Análise Sensorial dos Vinhos.

5 CONCLUSÃO

Deste ensaio pode-se concluir que há tióis voláteis nos vinhos produzidos com as

castas estudadas, com destaque para a casta Touriga Nacional que apresentou a maior

concentração do tiol 3MH em comparação com as outras castas.

Teste De Tukey a 5% Notas Tropicais

Equilíbrio Aromático

Equilíbrio Gustativo

Apreciação Global

Viosinho Testemunha 2,38 a 2,75 a 2,75 a 2,75 a

Viosinho Enzimado 2,25 a 3,00 a 3,00 a 3,00 a

Arinto Testemunha 2,38 a 2,13 a 2,50 a 2,25 a

Arinto Enzimado 2,25 a 2,25 a 2,38 a 2,50 a

Alvarinho Testemunha 2,63 a 2,75 a 2,88 a 2,88 a

Alvarinho Enzimado 2,50 a 2,88 a 2,63 a 2,75 a

Encruzado Testemunha 2,50 a 3,38 a 2,88 a 3,00 a

Encruzado Enzimado 2,50 a 3,13 a 3,00 a 2,88 a

Syrah Testemunha 2,75 a 3,13 a 3,25 a 3,25 a

Syrah Enzimado 2,50 a 3,00 a 3,13 a 3,13 a

Touriga Testemunha 2,13 a 3,13 a 3,25 a 3,13 a

Touriga Enzimado 2,50 a 2,88 a 3,13 a 3,00 a

31

Em relação ao uso da enzima β-liase, conclui-se que há uma tendência no aumento

global da concentração dos tióis nos vinhos devido da facilitação da libertação dos tióis a

partir de seus precursores.

No perfil aromático dos vinhos nota-se uma homogeneidade no perfil tropical e tiolado

entre eles, ou seja, não houve mudança significativa do perfil aromático entre o vinho com

adição da enzima e o testemunha. Isto se deve também as relações de antagonismos e

sinergias com os outros compostos voláteis dos vinhos, também pela hipótese da haver

uma concentração menor dos precursores dos tióis voláteis nas castas estudadas se

comparadas à casta Sauvignon Blanc.

Desta forma conclui-se que este aumento da concentração dos tióis supracitado não foi

suficiente para aumentar o caráter tropical e tiolado no aroma dos vinhos vinificados com a

adição da enzima β-liase. Ou também que este resultado pode ser decorrente do fato de os

vinhos vinificados com a adição da enzima terem atingido concentrações do composto 3MH

inferiores à dos típicos Sauvignon Blanc da região de Bordéus. Fatos que não se

relacionam com a efetividade da enzima β-liase na libertação dos tióis, sim com a

concentração dos precursores dos tióis nas uvas utilizadas neste ensaio.

32

6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

Anuário IVV 2010. Instituto da Vinha e do Vinho, 259, 44-60. Azevedo, M. (2002) Influência do sistema de condução e da carga na produtividade da videira, casta ‘Syrah’, Lisboa, Portugal. Bayonove C.L., Baumes R.L., Crouzet J., Günata Y.Z. (1998) Arômes. OEnologie - Fondements Scientifiques et Technologiques, Lavoisier Tec & Doc, Paris, 163-235. Bayonove C.L., Cordonnier R.E., Dubois P. (1975). Étude d'une fraction caractéristique de l'arôme de raisin de la variété Cabernet-Sauvignon; mise en évidence de la 2-méthoxy-3- isobutylpyrazine. C. R. Acad. Sc. Paris, 281, 75-78. Böhm, J. (2010) O Grande Livro das Castas, 234. Bouchilloux P. Darriet Ph., Dubourdieu D.,(1996). Mise au point d’une méthode de dosage de la 4-Mercapto-4-Méthylpentan-2-one dans les vins de Sauvignon. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 30, 23-29. Bouchilloux, P., Darriet P., Henry, R. Lavigne-Cruegue,V. Dubourdieu, D.,(1998). Identification of volatile and powerful odorous thiols in bordeaux red wine varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44, 557-566. Capone,D. L., Black, C. A., Jeffery, D. W. (2012) Effects on 3-Mercaptohexan-1-ol Precursor Concentrations from Prolonged Storage of Sauvignon Blanc Grapes Prior to Crushing and Pressing. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 3515-3523. Cardoso, A. D. (2007) O vinho da uva à garrafa. Âncora Editora. 389-390. Choné X., Lavigne-Cruege V., Tominaga T., Van Leeuwen C., Castagnede C., Saucier C. Dubourdieu D., (2006). Effect of wine nitrogen status on grape aromatic potential: Flavor precursors (S-cysteine conjugates), gluthathione and phenolic content in Vitis vinifera L. cv. Sauvignon blanc. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin, 40,1-6. Darriet P., Tominaga T., Demole E., Dubourdieu D. (1993) Mise en évidence dans le raisin de Vitis vinífera var. Sauvignon d'un précurseur de la 4-mercapto-4-méthylpentan-2-one. C. R. Acad. Sci. Paris, 316, 1332-1335 Darriet, Ph. (1993) L’arome et les pr´ecurseurs d’arome du Sauvignon. These de Doctorat, Universit´e de Bordeaux II. Darriet, Ph., Tominaga T., Demole E. and Dubourdieu D. (1993) A New Type of Flavor Precursors in Vitis vinifera L. cv. Sauvignon Blanc: S-Cysteine ConjugatesC.R. Acad. Sci. (Paris), serie 3, 316 (11), 1332. Darriet, Ph., Tominaga T., Lavigne V., Boidron J.-N. and Dubourdieu D. (1995) Yeasts and wine flavour. Flavour Fragrance J., 10, 395. Darriet, P., Tominaga, T., Lavigne, V., Boidron, J.N., Dubourdieu, D. (1995). Identification of a powerful aromatic component of Vitis vinifera L. var. Sauvignon wines: 4-mercapto-4-methylpentan-2-one. Flavour and Fragance Journal, 10: 385-392.

33

Delanoe, D., Maillard, C., Maisondieu, D. (1997) O vinho da análise à elaboração, 160, 53-58. Dubourdieu, D., Tominaga, T., Masneuf, I., Peyrot des Gachons, C., Murat, M.L., (2000). The role of yeast in grape flavor development during fermentation : the example of Sauvignon blanc. American Journal of Enology and Viticulture, 51, 196-203. Enzell C. (1985) Biodegradation of carotenoids - an important route to aroma compounds. Pure Appl. Chem., 57 (5), 693-700 Ferreira, D. M. L. (2011) Pesquisa de compostos voláteis de enxofre varietais em vinhos brancos elementares de castas Portuguesas. Tese de Mestrado em Viticultura e Enologia. Instituto Superior de Agronomia/Universidade Técnica de Lisboa e Faculdade de Ciências/Universidade do Porto, 74. Harsch, M. J., Benkwitz,F., Frost, A., Colonna-Ceccaldi, B., Gardner, R. C. and Salmon,

J.(2013) New Precursor of 3 ‑ Mercaptohexan-1-ol in Grape Juice: Thiol-Forming

Potential and Kinetics during Early Stages of MustFermentation. Journal of Agricultural

and Food Chemistry,66, 3703−3713.

Harsch, M. J., Gardner, R. C. (2013) Yeast genes involved in sulfur and nitrogen metabolism affect the production of volatile thiols from Sauvignon Blanc musts. Applied Genetics and Molecular Biotechnology. 97: 223–235. Howell K., Bartowsky E., De Barros Lopes M., 2003. Volatile thiol formation by yeast during fermentation. AWRI technical review,143. Idstein H. and Schreier P. Volatile constituents from guava (Psidium guajava, L.) fruit (1985) Journal of Agricultural and Food Chemistry, 138, 33. King E.,Swiegers J., Travis B., Francis L., Bastian S., Pretorius I., (2008). Coinoculated Fermentation Using Saccharomyces yeasts Affects the Volatile Composition and Sensory Properties Of Vitis vinifera L. Cv Sauvignon Blanc Wines. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 56, 10829-10837. Kolor, M.G. (1983) Identification of an important new flavor compound in Concord grape: ethyl-3-mercaptopropionate. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 31 (5), 1125. Mateo-Vivaracho, L., Cacho, J. (2008) Improved solid-phase extraction procedure for the isolation and in-sorbent pentafluorobenzyl alkylation of polyfunctional mercaptans optimized procedure and analytical applications. Journal of Chromatography, 1185, 9-18. Meilgaard, M.C., Civille, G.V., Carr B.T. (1999) Sensory Evaluation Techniques. CRC Press, 3rd edition. Mestres, M., Busto, O., Gualsh, J. (2000) Analysis of organic sulfur compounds in wine aroma. Journal of Chromatography, 945, 211. Moreira, N. (2009) Heavy Sulphur compounds and other volatiles in Wine: Influence of grape must compostion and contribution of apiculate yeasts. PhD thesis. Universidade Católica Portuguesa, Escola de Biotecnologia do Porto.

34

Murat M.L., Tominaga T., Dubourdieu D., 2001. Mise en évidence de composés clefs dans l’arôme des vins rosés et clairets de Bordeaux. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin. 35, 99-105. Murat, M.L., Tominaga T. and Dubourdieu D. (2001a) Influence of fermentation temperature on volatile thiols concentrations in Sauvignon blanc winesJ. Int. Sci. Vigne Vin., 35, 99–105. Murat, M.L., Tominaga T. and Dubourdieu D. (2001b) Assessing the Aromatic Potential of Cabernet Sauvignon and Merlot Musts Used to Produce Rose Wine by Assaying the Cysteinylated Precursor of 3-Mercaptohexan-1-ol J. Agric. Food Chem., 49, 5412–5417. Oliveira e Silva, H., Guedes de Pinho, P., Machado, B., Hogg, T., Marques, J.C., Câmara, J., Albuquerque, F., Silva Ferreira, A. (2008). Impact of forced-aging process on Madeira wine flavor. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56: 11989-11996. Oliveira, J. M. M.(2000) Aromas Varietais e de Fermentação Determinantes da Tipicidade das Castas Loureiro e Alvarinho. Tese de Doutoramento, Universidade do Minho. Peynaud, E. (1980) Le Gout du vin. Dunod, Paris. Peyrot des Gachons, C., Tominaga T & Dubourdieu D (2002) Localization of S-cysteine conjugates in the berry: effect of skin contact on aromatic potential of Vitis vinifera L. Cv. Sauvignon blanc must. American Journal of Enology and Viticulture, 53: 144–146. Reis, R. M. M., Gonçalves, M. Z. (1981) O clima de Portugal. Caracterização climática da região agrícola do Ribatejo Oeste. Fascículo XXXII. Instituto Nacional de Meteorologia e Geofísica. Rigaud, J., Eti´evant, P., Henry, R. and Latrasse, A. (1986) Derivative of butane thiol found in the fragrance of black currant buds, process for its preparation and use of this derivative as a fragrance. Sciences des. Aliments, 6, 213.

Salmon, J. (2013) New Precursor of 3 ‑Mercaptohexan-1-ol in Grape Juice: Thiol-

Forming Potential and Kinetics during Early Stages of Must Fermentation. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 3703-3713. Shinkaruk S., Thibon C., Schmitter J., Babin P., Tominaga T., Degueil M., Desbat B., Jussier C., Bennetau B., Dubourdieu D., Bennetau-Pelissero C., (2008). Surprising Structural Lability of a Cysteine-S-Conjugate Precursor of 4-Methyl-4-sulfanylpentan-2- one, a Varietal Aroma in Wine of Vitis vinifera L.cv.Sauvignon Blanc. Chemistry and Biodiversity, 5, 273-809. Subileau, M., Schneider, R., Salmon, J., Degryse, E. (2008) New insights on 3-mercaptohexanol (3MH) biogenesis in Sauvignon blanc wines: cys-3MH and (E)-hexen-2-al are not the major precursors. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 56:9230-9235. Tominaga T, Darriet P, Dubourdieu D (1996) Identification of 3- mercaptohexyl acetate in Sauvignon wine a powerful aromatic compound exhibiting box tree odour. Vitis 35: 207–210

35

Tominaga T, des Peyrot GC, Dubourdieu D (1998b) A new type of flavor precursors in Vitis vinifera L. cv. Sauvignon Blanc: S-cysteine conjugates. Journal of Agricultural and Food Chemistry 46: 5215–5219 Tominaga T, Dubourdieu D (2006) A novel method for quantification of 2-methyl-3-furanthiol and 2-furanmethanethiol in wines made from Vitis vinifera grape varieties. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54: 29–33 Tominaga T, Furrer A, Henry R, Dubourdieu D (1998a) Identification of new volatile thiols in the aroma of Vitis vinifera L. var. Sauvignon Blanc wines. Journal of Agricultural and Food Chemistry 13: 159–162 Tominaga T, Masneuf I, Dubourdieu D (1995) A S-cysteine conjugate, precursor of aroma of white Sauvignon. Journal International des Sciences de la Vigne et du Vin 29:227–232 Tominaga T., Guyot R.B., Peyrot des Gachons C., Dubourdieu D. (2000) Contribution of volatile thiols to the aromas of white wines made from several Vitis vinifera grape varieties. American Journal of Enology and Viticulture, 51 (2),178-181. Tominaga, T, Blanchard, L, Darriet P. & Dubourdieu D. (2000b) A powerful aromatic volatile thiol, 2-furanmethanethiol, exhibiting roast coffee aroma in wine made from several Vitis vinifera grape varieties. Journal of Agriculture and Food Chemistry. 48: 1799–1802. Tominaga, T, Murat M & Dubourdieu D (1998b) Development of a method for analyzing the volatile thiols involved in the characteristic aroma of wines made from Vitis vinifera L. cv Sauvignon blanc. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 46: 1044–1048. Winter, G., Van Der Westhuizen, T., Higgins, V.J., Curtin, C., Ugliano, M. (2011) Contribution of cysteine and glutathione conjugates to the formation of the volatile thiols 3-mercaptohexan-1-ol (3MH) and 3-mercaptohexyl acetate (3MHA) during fermentation by Saccharomyces cerevisiae. The Australian Wine Research Institute.

36

ANEXO 1

Códigos dos Vinhos na Análise sensorial.

Castas Código

Viosinho Testemunha 121

Viosinho Enzimado 360

Arinto Testemunha 145

Arinto Enzimado 476

Alvarinho Testemunha 810

Alvarinho Enzimado 160

Encruzado Testemunha 190

Encruzado Enzimado 730

Syrah Testemunha 273

Syrah Enzimado 220

Touriga Testemunha 171

Touriga Enzimado 589

37

ANEXO 2

Quadros da Análise de Variância (ANOVA) com separação de Tukey a 5% de Significância: Anexo 4.1: Quadro do Viosinho.

Análise de variância Notas Tropicais Equilibrio Aroma Equilibrio Gosto Apreciação

Global

GL resíduo 14

14

14

14

F tratamentos 0,08

1,00

0,00

0,00

Média geral 2,31

2,88

2,75

2,63

Desvio-padrão 0,90

0,50

0,60

0,52

DMS (5%) 0,97

0,54

0,64

0,55

CV (%) 38,98 17,39 21,73 19,72

Teste de Tukey a 5%:

Viosinho Testemunha 2,38 a 2,75 a 2,75 a 2,75 a

Viosinho Enzimado 2,25 a 3,00 a 3,00 a 3,00 a

GL: graus de liberdade; DMS: diferença mínima significativa; CV: coeficiente de variação.

Anexo 4.2: Quadro do Arinto.


Global

GL resíduo 14

14

14

14

F tratamentos 0,05

0,06

0,11

0,26

Média geral 2,31

2,19

2,44

2,38

Desvio-padrão 1,18

1,01

0,75

0,98

DMS (5%) 1,26

1,09

0,80

1,05

CV (%) 50,87 46,32 30,77 41,35


Arinto Testemunha 2,38 a 2,13 a 2,50 a 2,25 a

Arinto Enzimado 2,25 a 2,25 a 2,38 a 2,50 a


Anexo 4.3: Quadro do Alvarinho.


Global

GL resíduo 14

14

14

14

F tratamentos 0,04

0,05

0,40

0,04

Média geral 2,56

2,81

2,75

2,81

Desvio-padrão 1,25

1,08

0,79

1,21

DMS (5%) 1,34

1,16

0,85

1,29

CV (%) 48,78 38,45 28,75 42,89


Avarinho Testemunha 2,63 a 2,75 a 2,88 a 2,88 a

Alvarinho Enzimado 2,50 a 2,88 a 2,63 a 2,75 a


38

Anexo 4.4: Quadro do Encruzado.


Global

GL resíduo 14

14

14

14

F tratamentos 0,00

0,74

0,30

0,18

Média geral 2,50

3,25

2,94

2,94

Desvio-padrão 1,00

0,58

0,45

0,59

DMS (5%) 1,07

0,62

0,49

0,63

CV (%) 40,00 17,92 15,43 20,09


Encruzado

Testemunha 2,50 a 3,38 a 2,88 a 3,00 a

Encruzado Enzimado 2,50 a 3,13 a 3,00 a 2,88 a


Anexo 4.5: Quadro da Syrah.


Global

GL resíduo 14

14

14

14

F tratamentos 0,18

0,18

0,37

0,00

Média geral 2,63

3,06

3,19

3,00

Desvio-padrão 1,18

0,59

0,41

0,65

DMS (5%) 1,27

0,63

0,44

0,70

CV (%) 44,96 19,27 12,92 21,82


Syrah Testemunha 2,75 a 3,13 a 3,25 a 3,25 a

Syrah Enzimado 2,50 a 3,00 a 3,13 a 3,13 a


Anexo 4.6: Quadro da Touriga Nacional.


Global

GL resíduo 14

14

14

14

F tratamentos 0,32

0,25

0,05

0,05

Média geral 2,31

3,00

3,19

3,06

Desvio-padrão 1,33

0,99

1,15

1,10

DMS (5%) 1,43

1,06

1,23

1,18

CV (%) 57,64 33,03 35,94 35,85


Touriga Testemunha 2,13 a 3,13 a 3,25 a 3,13 a

Touriga Enzimado 2,50 a 2,88 a 3,13 a 3,00 a


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