TESE DE MESTRADO

Caracterização do efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato na

actividade da bomba de Na+, K+ inibida pelo IFN-γ e pela ubaína.

Orientador: Professor Doutor Patricio Soares da Silva (FMUP)

Co-orientador: Professor Doutor Carlos Fonseca (FEUP)

Aluno: Bruno Azevedo Igreja

Porto,

Agosto de 2005

2

FACULDADE DE ENGENHARIA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Departamento de Engenharia Electrotécnica e de Computadores

e

FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

Instituto de Farmacologia e Terapêutica

Caracterização do efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato na

actividade da bomba de Na+, K+ inibida pelo IFN-γ e pela ubaína.

Bruno Azevedo Igreja

Licenciado em Bioquímica pela Faculdade de Ciências da Universidade do Porto

Dissertação submetida para satisfação parcial dos

Requisitos do grau de mestre

em

Engenharia Biomédica

Dissertação realizada sob a supervisão de

Professor Doutor Patrício Soares da Silva,

do Instituto de Farmacologia e Terapêutica

da Faculdade de Medicina da Universidade do Porto

e

Professor Doutor Carlos Fonseca,

do Departamento de Engenharia Electrotécnica e de Computadores

da Faculdade de Engenharia da Universidade do Porto

Porto, Agosto de 2005

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RESUMO

A corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela anfotericina B, nas células

Caco-2 em meio contendo 143mM de Na+, é uma medida da actividade da bomba de

Na+, K+ (NKA) e foi usada para caracterizar o efeito do (-)-epigalocatecino-3-galato

na actividade desta enzima inibida pelo interferão-γ (IFN-γ) e pela ubaína. No

presente trabalho verificou-se que o IFN-γ e a ubaína reduzem significativamente

esta Isc, no entanto, a remoção da ubaína durante 24 horas faz com que a actividade

da NKA volte aos valores idênticos ao da situação controlo, ao contrário do que

acontece com o IFN-γ, que mesmo 24 horas após a sua remoção mantém inibida a

NKA. Verificou-se ainda que nem o IFN-γ, nem a ubaína alteram significativamente

a expressão da NKA. Por outro lado o EGCG, um inibidor do transdutor de sinal e

activador da transcrição 1 (STAT1), não consegue reverter o efeito da ubaína, mas

reverte o efeito do IFN-γ na actividade da NKA para o qual apresenta um EC50 = 1.43

µM. O STAT1 está envolvido na cascata de sinalização celular desencadeada pela

ligação do IFN-γ ao seu receptor, que vai levar à inibição da NKA. Nas células Caco-

2, o EGCG inibiu a activação do STAT1 induzida pelo IFN-γ, apresentando um EC50

= 1.69 µM, ao contrário do (-)-catecino, do (-)-epicatecino (EC), do (-)-catecino-3-

galato (CG), do (-)-epicatecino-3-galato (ECG), do (-)-epigalocatecino (EGC) e do (-

)-epigalocatecino mais ácido gálico (EGC+AG), que não inibiram a fosforilação da

tirosina 701 do STAT1.

A administração intraperitoneal de ratinhos NMRi com 10000 U de IFN-γ de

ratinho resulta, no colon, num modelo idêntico ao das células Caco-2, onde se

verifica uma diminuição da actividade da NKA sem alteração da expressão. Assim

estudou-se o efeito do EGCG e do EGC 20 mg/Kg, administrado por via oral, neste

modelo animal e verificou-se que apenas o EGCG reverte o efeito do IFN-γ na

actividade da NKA das células epiteliais do colon de ratinhos NMRi.

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ABSTRACT

The short-circuit current (Isc) induced by the addition of amphotericin B, in

Caco-2 cells monolayers bathed with Na+ 143 mM, is due to the transport of Na+

across the basolateral membrane by the Na+, K+ pump (NKA) and it was used to

characterize the effect of (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) in NKA activity

inhibited by interferon-γ (IFN-γ) and ouabain. In the present work we show that

IFN-γ and ouabain significantly decrease this Isc, nevertheless removal of ouabain

for 24 h returns NKA activity to values identical to controls on the contrary to IFN-γ

that even when removed for 24 h keeps the NKA enzyme inhibited. In the present

study we find out that IFN-γ and ouabain don’t significantly changes NKA

expression. On the other hand, the signal transducer and activator of transcription 1

(STAT1) inhibitor, EGCG, is unable to change the effect of ouabain in NKA activity,

but it inhibits IFN-γ effect in enzyme activity and presents an EC50 = 1.43 µM.

STAT1 is involved in the signal transduction pathway initiated by binding of IFN-γ

to its receptor which leads to NKA inhibition. In Caco-2 cells EGCG inhibit STAT1

activation induced by IFN-γ and presents an EC50 = 1.69 µM, unlike (-)-catechin, (-)-

epicatechin (EC), (-)-catechin-3-gallate (CG), (-)-epicatechin-3-gallate (ECG), (-)-

epigallocatechin (EGC) and (-)-epigallocatechin plus galic acid (EGC+AG), that

didn’t inhibit tyrosine 701 phosphorylation of STAT1.

The intraperitoneal administration of mouse IFN-γ 10000 U in NMRi mice

results, in colon, in a model identical to Caco-2 cells, where there is a decrease in

NKA activity without any change in NKA expression. So, we study the effect of

EGCG and EGC 20 mg/Kg with per oral administration in these model and we

verified that only EGCG is able to revert the effect of IFN-γ in NKA activity of colon

epithelial cells from NMRi mice.

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AGRADECIMENTOS

Ao Prof. Doutor Patrício Soares da Silva quero agradecer as oportunidades

concedidas nos projectos e equipas de investigação que lidera, o rigor colocado no

trabalho e as valiosas sugestões que contribuiram para a realização deste trabalho.

Ao Doutor Carlos Fonseca agradeço por ter aceite co-orientar esta tese e pela

disponibilidade demonstrada nas várias etapas que levaram à sua elaboração.

A todos os membros do Instituto de Farmacologia e Terapêutica da FMUP

agradeço a disponibilidade, simpatia e apoio transmitidos.

Ao meu pai e à minha mãe agradeço a visão de futuro para os filhos e o

constante apoio e incentivo que sempre demonstraram.

À Lia agradeço o seu “presente” contínuo.

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ÍNDICE

RESUMO ....................................................................................................................3

ABSTRACT ................................................................................................................4

AGRADECIMENTOS ..............................................................................................5

LISTA DE ABREVIATURAS ..................................................................................8

1 - INTRODUÇÃO .................................................................................................. 10

1.1 - DOENÇA DE CROHN ...................................................................................... 10

1.2 - BOMBA DA NA+, K+ ...................................................................................... 12

1.3 - EPIGALOCATECINO-3-GALATO...................................................................... 15

2 - MATERIAIS E MÉTODOS.............................................................................. 19

2.1 - FÁRMACOS .................................................................................................... 19

2.2 - REAGENTES E SOLUÇÕES ............................................................................... 19

2.3 - CÉLULAS ....................................................................................................... 20

2.4 - CRESCIMENTO DE CÉLULAS........................................................................... 21

2.5 - CULTIVO DE CÉLULAS ................................................................................... 21

2.6 - ACTIVIDADE DA NKA - MÉTODO ELECTROFISIOLÓGICO .............................. 21

2.7 - EXPRESSÃO DA SUB-UNIDADE α1 DA NKA ................................................... 22

2.8 - EXPRESSÃO DO STAT1 E DO PHOSPHOSTAT1............................................. 23

2.9 - ANIMAIS........................................................................................................ 23

2.10 - ADMINISTRAÇÃO......................................................................................... 24

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2.11 - OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS.................................. 24

2.12 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA – MÉTODO DE BRADFORD 24

2.13 - ACTIVIDADE DA NKA – MÉTODO BIOQUÍMICO.......................................... 25

3 - RESULTADOS................................................................................................... 26

3.1 - CÉLULAS CACO-2.......................................................................................... 26

3.2 - RATINHOS NMRI .......................................................................................... 36

4 - DISCUSSÃO ....................................................................................................... 39

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................. 43

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LISTA DE ABREVIATURAS

ATP – adenosina trifosfato

ATPases – enzimas que consomem ATP

Células Th – células T ajuda

Citocinas Th – citocinas produzidas pelas células T ajuda

CG – (-)-catecino-3-galato

ddp – diferença de potencial

DTT – ditiotreitol

EC – (-)-epicatecino

EC50 – concentração 50% eficaz

ECG – (-)-epicatecino-3-galato

EDTA – ácido etilenodiaminotetraacético

EGC – (-)-epigalocatecino

EGCG – (-)-epigalocatecino-3-galato

ERK – “extracellular signal-regulated kinase”

FBS – soro bovino fetal

GAS – sequência de activação γ

HBSS – solução de Hanks sem cálcio

IFN – interferão

IL – interleucina

Isc – corrente de curto-circuito

JAK – “Janus kinase”

MAPK – “mitogen-activated protein kinase”

MEM – meio mínimo essencial

MEK – “MAPK kinase”

mRNA – RNA mensageiro

NKA – bomba de Na+, K+

PBS – solução salina de tampão fosfato

PBST – solução salina de tampão fosfato com 0.05% de tween 20

RNA – ácido ribonucleico

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rpm – rotações por minuto

SDS – Dodecilsulfato de sódio

SEM – erro padrão da média

STAT – transductor de sinal e activador da transcrição

TNF – factor de necrose tumoral

VCAM – molécula de adesão de células vasculares

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1 - INTRODUÇÃO

O sistema imunitário constitui o nosso mecanismo de defesa natural, capaz de

distinguir entre estruturas próprias e estranhas e ainda entre antigénios estranhos

inofensivos e perigosos de modo a evitar respostas imunes desnecessárias e auto-

destrutivas. A resposta inflamatória consiste na libertação sequencial de uma série de

mediadores e o recrutamento de leucócitos circulantes que se tornam activos no local

da inflamação libertando novos mediadores. Na maioria dos casos a resposta

inflamatória desaparece, num espaço de tempo adequado, devido à libertação de

mediadores endógenos anti-inflamatórios e da acumulação intracelular de factores de

regulação negativa.

As células T CD4+ são responsáveis pela regulação de aspectos chave na

resposta imunológica. Estas células podem-se dividir em dois grupos funcionalmente

distintos, as células T-ajuda 1 (Th1) e as células T-ajuda 2 (Th2), de acordo com o

tipo de citocinas produzido. Assim, as células Th1 secretam principalmente IFN-γ e

interleucina 2 (IL-2), que têm uma acção pro-inflamatória, enquanto que as células

Th2 produzem predominantemente IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13, que têm uma acção

anti-inflamatória.

1.1 - DOENÇA DE CROHN

Em condições normais, os antigénios provenientes da comida e da flora

intetstinal, que estão continuamente em contacto com a mucosa intestinal, não

causam qualquer reacção imune, devido a um balanço adequado das citocinas

secretadas pelas células Th1 e pelas células Th2. No entanto, por vezes, pode ocorrer

um desequilíbrio no balanço citocinas Th1/Th2 e surgem, por exemplo, as doenças

inflamatórias intestinais, onde se incluem a doença de Chron e a colite ulcerativa.

Nestes casos o desequilíbrio parece resultar de uma resposta desadequada a

componetes normais da flora intestinal e dos alimentos. No entanto, existem vários

estudos que sugerem que a indução e a patogenese das doenças inflamatórias

intestinais, nomeadamente a doença de Crohn e a colite ulcerativa, são um processo

11

multifactorial, envolvendo interacções entre factores genéticos e ambientais, além

dos factores imunológicos (Adorini and Sinigaglia 1997; Sartor 1997).

Na doença de Crohn existe um desequilíbrio no balanço entre as células Th1

e Th2 em favor das Th1, enquanto que, na colite ulcerativa parece existir uma maior

actividade das células Th2 (Fuss, Neurath et al. 1996). Este conceito é suportado por

alguns estudos que revelam que pacientes com doença de Crohn apresentam um

aumento do número de células secretoras de IFN-γ e um aumento dos níveis de

mRNA para o IFN-γ (Breese, Braegger et al. 1993; Niessner and Volk 1995). A

biopsia da mucosa intestinal de pacientes com doença de Crohn revelou um aumento

da expressão de citocinas pro-inflamatórias, quimiocinas e moléculas de adesão

(Groux and Powrie 1999). Ainda de acordo com este conceito está o facto da IL-18,

uma citocina Th1 que actua sinergisticamente com a IL-12 no sentido de induzir a

síntese de IFN-γ pelas células Th1, estar sobreexpressa em pacientes com doença de

Crohn, mas não em pacientes com colite ulcerativa (Pizarro, Michie et al. 1999). Por

outro lado na colite ulcerativa verifica-se um aumento da secreção de IL-5 (Fuss,

Neurath et al. 1996) o que sugere um aumento da actividade das células Th2.

O IFN-γ é um produto dos linfócitos Th1 activados e a sua produção é

considerada o factor predominante na inflamação intestinal induzida pelas células

Th1, como é o caso da doença de Crohn, pelo facto do IFN-γ poder actuar em várias

vias que influenciam o desenrolar da inflamação, como por exemplo aumentar a

produção de mediadores pro-inflamatórios através da activação dos macrófagos,

influenciar o tráfico celular através da regulação da expressão de moléculas de

adesão e alterando a permeabilidade do epitélio intestinal (Billiau 1996). A

importância atribuída ao IFN-γ na inflamação intestinal induzida pelas células Th1

deve-se ainda ao facto da neutralização do IFN-γ através do anticorpo monoclonal

anti-IFN-γ atenuar significativamente o desenvolvimento de colite em ratinhos

(Powrie, Leach et al. 1994).

A doença de Crohn é uma doença inflamatória intestinal crónica, cujo

sintoma dominante é a diarreia. A perda de fluidos pelo intestino ocorre devido à

quebra do equilíbrio homeostático, provocado por uma desregulação no transporte de

electrólitos nas células, podendo-se tratar de um aumento da secreção do electrólito

12

Cl- ou uma diminuição da absorção do electrólito Na+. Estudos recentes sugerem que

o aparecimento de diarreia, na mucosa intestinal inflamada, se deve a uma redução

da absorção do electrólito Na+ e não a um aumento da secreção do electrólito Cl-

(Sundaram, Wisel et al. 1997). Esta observação está de acordo com o facto de a

mucosa do cólon de pacientes com doença de Crohn responderem pobremente a

secretagogos e a absorção de Na+ estar diminuida (Sandle, Higgs et al. 1990). Ainda

neste sentido apontam o facto do IFN-γ reduzir a secreção intestinal de Cl- (Colgan,

Parkos et al. 1994), o co-transporte de Na+-K+-2Cl- (Zund, Madara et al. 1996), a

actividade do trocador Na+/H+ (Rocha, Musch et al. 2001) e a actividade da NKA

(Sugi, Musch et al. 2001; Magro, Fraga et al. 2004).

A absorção de Na+ no intestino envolve a participação de várias proteínas, no

entanto, a mais importante é a NKA que se localiza na membrana basal da célula

epitelial e por isso a sua inibição parece estar directamente relacionada com o

aparecimento de diarreia em pacientes com doença de Crohn (Sugi, Musch et al.

2001; Musch, Clarke et al. 2002).

1.2 - BOMBA DE NA+, K+

A bomba de Na+, K+ é uma proteína heterodimérica transmembranar

constituída por uma subunidade α de aproximadamente 112 KDa, uma subunidade β

altamente glicosilada, que pode variar entre 40 e 60 KDa dependendo do grau de

glicosilação, que varia com o tipo de tecido e da espécie em causa e uma pequena

subunidade γ, que varia entre 8-14 KDa. A subunidade α da NKA possui os locais de

ligação para os catiões, para o ATP e para a ubaína (Lingrel, Orlowski et al. 1990) e

é responsável pelas propriedades catalítica e de transporte da enzima. A subunidade

β é essencial para a actividade da NKA e parece estar envolvida na estabilização e

correcto enrolamento da subunidade α, facilitando a sua entrega na membrana

plasmática (McDonough, Geering et al. 1990). A subunidade β parece também ser

responsável pela oclusão do K+ (Lutsenko and Kaplan 1993) e pela modulação da

afinidade da NKA para o K+ e para o Na+ (Eakle, Kabalin et al. 1994; Eakle, Lyu et

al. 1995). A função da subunidade γ ainda não é completamente clara, no entanto

alguns estudos revelam que esta subunidade consegue modificar a activação do

13

potássio dependente da voltagem (Beguin, Wang et al. 1997), enquanto que outros

sugerem que a subunidade γ é capaz de estabilizar a conformação E1 da enzima

(Therien, Goldshleger et al. 1997). A NKA está presente em todas as células de

mamíferos e converte entre 20 e 30% do ATP produzido nas células no transporte de

Na+ e K+ no intestino, rim, sistema nervoso central e noutros tecidos onde é

necessário um gradiente de Na+ e K+ para a manutenção do volume celular e do

potencial de membrana (Jorgensen and Pedersen 2001). A NKA é responsável pelo

estabelecimento e manutenção de um gradiente electroquímico (Fig. 1), característico

da maior parte das células animais, e que consiste na acumulação de carga positiva

no lado extracelular, na concentração de K+ intracelular superior à concentração

extracelular e na concentração de

Na+ intracelular inferior à

concentração extracelular.

Este gradiente electroquímico, é

conseguido através da energia

proveniente da hidrólise de uma

molécula de ATP, que vai permitir

à NKA transportar, contra o

gradiente de concentração, três iões

Na+ para o exterior e dois iões K+

para o interior da célula (Fig. 1). A

NKA, constitui por isso um dos

principais reguladores da

homeostasia celular do Na+ e do K+, assim como um dos principais responsáveis pelo

estabelecimento e manutenção dos gradientes eléctrico e químico transmembranar, à

custa de ATP. Este gradiente electroquímico transmembranar é fundamental na

manutenção do volume celular, do equilíbrio osmótico celular, na manutenção do

potencial de repouso das membranas e pelas propriedades excitáveis das células

musculares e nervosas. O gradiente transmembranar de Na+ vai ainda fornecer

energia para o co-transporte de vários iões (H+, HCO3-), substratos (glucose e

aminoácidos) e neurotransmissores através da membrana plasmática (Jorgensen

Fig. 1: Esquema representativo da bomba de Na+, K+ e do gradiente de concentração do Na+ e do K+.

14

1990; Lingrel, Orlowski et al. 1990; Jorgensen and Pedersen 2001). No intestino a

NKA desempenha um importante papel na absorção de Na+ e água, sendo por isso

fundamental na manutenção dos fluidos corporais. Assim, a inibição da NKA pelo

IFN-γ parece ser um dos principais responsáveis pela perda de fluidos pelo intestino.

A inibição da NKA pelo IFN-γ não é directa, mas envolve uma complexa cascata de

sinalização celular. A ligação do

IFN-γ ao lado extracelular do seu

receptor transmembranar leva à

activação da “Janus Kinase” (JAK)

1 e 2 e à sua associação com o

receptor do IFN-γ no lado

intracelular (Fig. 2) (Haque and

Williams 1998; Akira 1999). A

JAK vai então fosforilar o receptor

do IFN-γ em resíduos específicos

de tirosina, que servem de local de

âncora para o STAT1, através do

reconhecimento das fosfotirosinas

do receptor do IFN-γ pelo domínio

SH2 do STAT1 (Fig. 2) (Ihle,

Witthuhn et al. 1994). Em seguida

a JAK activada fosforila o STAT1

num resíduo específico de tirosina, a Tyr701, o que leva à sua separação do receptor

e posterior homodimerização (Fig. 2) (Ihle 1995). Os homodímeros STAT1 são

translocados para o núcleo para activar a transcrição através da sua interacção com

sequências GAS (locais de activação γ) existentes em muitos promotores activados

pelo IFN-γ (Akira 1999). Além da fosforilação dos resíduos de tirosina do STAT1,

necessária à sua homodimerização e posterior translocação até ao núcleo, é também

necessária a fosforilação de um resíduo de serina (Ser727) para o STAT1 se tornar

transcripcionalmente activo (Wen, Zhong et al. 1995; Zhang, Blenis et al. 1995). A

região carboxi-terminal do STAT1 possui a sequência consenso reconhecida pela

IFN-γ

IFN-γ

Fig. 2: Esquema representativo da cascata de sinalização celular iniciada pela ligação do IFN-γ ao seu receptor e consequente fosforilação da tirosina 701 do STAT1 necessária à sua homodimerização e posterior translocação até ao núcleo.

15

MAPK, que se pensa estar envolvida nesta fosforilação do resíduo de serina do

STAT1. Estudos recentes mostram que o IFN-γ também estimula a actividade da

MAPK, que é constituída pelas ERK1, ERK2 (Liu, Brownsey et al. 1994) e

p38MAPK (Verma, Deb et al. 2002). A activação das MAPKs é controlada através

de complexos de sinalização membranar e envolve uma rede que inclui as proteínas

Ras, as cínases de serinas da família das Raf e as cínases da MAPK (MEK1, MEK2,

MEK3 e MEK6) (Chen, Gibson et al. 2001; Pearson, Robinson et al. 2001; Magro,

Fraga et al. 2004).

1.3 - EPIGALOCATECINO-3-GALATO

Um número crescente de estudos epidemiológicos e experimentais sugerem

que o consumo de chá verde reduz a incidência de várias patologias, nomeadamente,

cancro, diabetes, doenças cardiovasculares e obesidade. Apesar de não serem ainda

conhecidos todos os mecanismos envolvidos, existem evidências que apontam para

as propriedades antioxidantes dos flavonóides existentes no chá verde como sendo

um factor importante para o seu efeito em patologias tão diversas. Por exemplo,

alguns estudos revelam a capacidade de compostos da família do catecino existentes

no chá verde inibirem a oxidação lipídica no plasma, a oxidação do β-caroteno e do

α-tocoferol (Lotito and Fraga 2000; Leung, Su et al. 2001). Todos os compostos da

família do catecino existentes no chá verde apresentam propriedades antioxidantes,

no entanto, ambos os estudos revelam que o ECG é o polifenol existente no chá

verde com maior poder anti-oxidante, seguido do EGCG. Apesar de todos os

compostos da família do catecino terem propriedades antioxidantes, existem

determinadas actividades que são mais específicas e estão restringidas a um menor

número de membros da família do catecino.

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O epigalocatecino-3-galato (Fig. 3) é polifenol mais abundante, mais activo e

também o mais estudado, existente no chá verde e está descrito como tendo várias

actividades fisiológicas, nomeadamente anticarcinogénica, anti-inflamatória,

antioxidante, antiangiogénica, antiaterosclerótica e antiviral. Algumas destas

propriedades do EGCG devem-se às suas características antioxidantes, enquanto que

outras parecem ser mais específicas e estão relacionadas com a capacidade do EGCG

inibir algumas enzimas relacionadas com o cancro, como por exemplo as

topoisomerases (Suzuki, Yahara et al. 2001) e também com a capacidade de inibir a

fosforilação de proteínas envolvidas na sinalização celular. O EGCG inibe várias

cascatas de sinalização celular envolvidas em diversos mecanismos celulares, sendo

a mais relevante para o presente trabalho a sinalização celular desencadeada pelas

citocinas pro-inflamatórias. Vários estudos revelam esta capacidade do EGCG

reverter o efeito de citocinas pro-inflamatórias, como por exemplo, a supressão dos

danos das células β do pâncreas induzido pela IL-1β e pelo IFN-γ (Han 2003); a

inibição do desenvolvimento da inflamação e dos danos nas cartilagens, induzido

Fig. 3: Estrutura 3D do (-)-epigalocatecino-3-galato. As barras azuis correspondem à ligação dos carbonos, as barras vermelhas correspondem à ligação dos oxigénios e as barras brancas correspondem à ligação dos hidrogénios.

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monocam

adacelular

Lado basal Lado apical

Sistema de oxigenação eaquecimento das soluçõesapical e basal

Sistema de voltage-clamp

Fig. 4: Esquema do sistema de Ussing usado para medira corrente de curto-circuito (Isc) induzida pelaanfotericina B.

pela IL-1β, em modelos animais de artrite (Singh, Ahmed et al. 2003); a redução da

expressão de VCAM-1 e adesão de monócitos às células endoteliais induzida pelo

TNF-α e IL-1β (Ludwig, Lorenz et al. 2004). A redução da actividade da NKA pelo

IFN-γ pode também ser revertida pelo EGCG, uma vez que este vai impedir a

fosforilação do STAT1 e consequentemente a sua activação (Menegazzi, Tedeschi et

al. 2001; Magro, Fraga et al. 2004).

Neste trabalho pretendeu-se estudar um pouco melhor a acção do EGCG (Fig.

3), na reversão do efeito do IFN-γ sobre a NKA. Para isso foram usadas técnicas de

biologia molecular e bioquímicas para determinar a expressão e a actividade da NKA

in vitro ex vivo e para avaliar a expressão e a actividade da NKA e do STAT1 in

vitro. Para avaliar in vitro a actividade da NKA, que se localiza no lado basal das

células do epitélio intestinal, assim como a sua resposta a uma série de compostos da

família do catecino foi usada uma técnica electrofisiológica, que consiste em medir a

corrente eléctrica necessária para anular a diferença de potencial (corrente de curto-

circuito – Isc) criada, pelo transporte de Na+, entre o lado extracelular basal e apical

(Fig. 4).

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A adição de anfotericina B, que é um ionóforo para o ião Na+, ao lado apical

da monocamada celular permite a entrada de sódio para a célula de forma a saturar a

NKA (Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-Da-Silva 2002).

Nestas condições a corrente de curto-circuito observada é uma medida da actividade

da NKA existente na membrana basal da célula e deve-se ao transporte de Na+

através da membrana basal pela NKA, que retira três iões Na+ da célula para o meio

extracelular e retira apenas dois iões K+ do meio extracelular para a célula.

Assim a actividade da NKA leva a um aumento de cargas positivas no meio

extracelular do lado basal das células epiteliais, o que levaria à criação de uma ddp

transepitelial, no entanto, o sistema utilizado (Fig. 4) mantém a ddp transepitelial

constante (voltage clamp) e igual a zero. Deste modo, a corrente fornecida pelo

sistema, para manter a ddp transepitelial igual a zero, é uma medida da actividade da

NKA.

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2 - Materiais e métodos

2.1 - FÁRMACOS

Os fármacos usados foram: interferão-γ humano e de ratinho, ubaína, (-)-

catecino, (-)-catecino-3-galato, (-)-epicatecino, (-)-epicatecino-3-galato, (-)-

epigalocatecino, (-)-epigalocatecino-3-galato, ácido gálico, anfotericina B, amilorido,

furosemida, cloreto de bário, DIDS.

2.2 - REAGENTES E SOLUÇÕES

- Meio de cultura sem soro – MEM (meio mínimo essencial) com 25mM de

HEPES, 26 mM de NaHCO3. Ajustar o pH a 7.2 com NaOH, esterilizar por filtração

e adicionar 100 U/ml de Penicilina G, 0.25 µg/ml de anfotericina B, 100 µg/ml de

estreptomicina. Guardar a 4ºC.

- Meio de cultura com soro – Meio de cultura sem soro com 20% FBS (soro

bovino fetal).

- Solução de Krebs Apical (para electrofisiologia) – 118 mM de NaCl, 4.7

mM de KCl, 1.2 mM de KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 1.2 mM de MgSO4, 2.5 mM

de CaCl2, 10 mM de Manitol. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5% CO2 durante 15

minutos e ajustar o pH a 7.4.

- Solução de Krebs Basal (para electrofisiologia) – 118 mM de NaCl, 4.7

mM de KCl, 1.2 mM de KH2PO4, 25 mM de NaHCO3, 1.2 mM de MgSO4, 2.5 mM

de CaCl2, 10 mM de D-Glucose, 1,0 mM de ácido ascórbico. Gaseificar a solução

com 95% O2 e 5% CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.

- PBS (Solução salina de tampão fosfato) – 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 5.4

mM Na2HPO4, 1.75 mM KH2PO4. Ajustar o pH a 7.4.

- PBST – PBS com 0.05% de tween 20.

- Tampão de lise (para expressão da NKA) – 50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 150

mM NaCl, 0.1% SDS, 0.5% deoxycholate de sódio, 100 µg/ml PMSF, 2 µg/ml

aprotinin.

20

- Tampão de amostra 6X concentrado (para expressão da NKA) – 375 mM

Tris-HCl, 12% SDS, 60% glicerol, 12% DTT 50mM, 0.6% azul de bromofenol.

- Tampão de amostra 1X concentrado (para expressão do STAT1) – 62.5 mM

Tris-HCl, 2% SDS, 10% glicerol, 2% DTT 50 mM, 0.1% azul de bromofenol.

- Soro fisiológico – 0.9% de NaCl em água.

- HBSS (solução de Hanks sem cálcio) – 137 mM NaCl, 5.0 mM KCl, 0.8

mM MgSO4·7H2O, 0.33 mM Na2HPO4, 0.44 mM KH2PO4, 1.0 mM MgCl 2·6H2O,

1.0 mM butirato de sódio, 10 mM Tris-HCl. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5%

CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.

- Solução de Krebs modificado (para obtenção das células epiteliais) – 118

mM NaCl, 4.0 mM KCl, 27.2 mM NaHCO3, 1.2 mM MgCl 2·6H2O, 1.25 mM

CaCl2·2H2O, 10 mM HEPES, 5 mM glicose. Gaseificar a solução com 95% O2 e 5%

CO2 durante 15 minutos e ajustar o pH a 7.4.

- Reagente de proteínas – 100 mg de azul G brilhante, 50 ml de etanol, 100

ml de ácido orto-fosfórico, completar com água bidestilada até 1000 ml.

- Solução A (para determinação da actividade de todas as ATPases) – 0.75

M Imidazole, 1.0 M NaCl, 0.1 M KCl, 0.1 M MgCl2·6H2O, 0.12 M Na AZIDE, 20

mM Na4EGTA pH=7.4, 1.0 M TRIS/HCl pH 7.4.

- Solução B (para determinação da actividade das ATPases insensíveis à

ubaína) – 0.75 M Imidazole, 0.1 M MgCl2·6H2O, 0.12 M Na AZIDE, 20 mM

Na4EGTA pH=7.4, 1.0 M TRIS/HCl pH 7.4.

- Reagente de cor (para determinação dos fosfatos livres) – 50 mg/ml

FeSO4·7H2O em 10% (v:v) de molibdato de amónio.

2.3 - CÉLULAS

Células Caco-2 (DSMZ, nº ACC 169) - Linha celular derivada de células de

adenocarcinoma de colon humano provenientes do banco Alemão (DSMZ-Deutsche

Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH).

21

2.4 - CRESCIMENTO DE CÉLULAS

As células Caco-2 são cultivadas em meio de cultura com soro e mantidas

numa atmosfera húmida com 95% H2O e 5% CO2 a 37 ºC. O meio de cultura é

mudado de 2 em 2 dias e as células atingem a confluência 5 dias após terem sido

cultivadas. As experiências são realizadas 7 dias após terem sido cultivadas e o meio

de cultura com soro é mudado para meio de cultura sem soro 24 horas antes de cada

experiência.

2.5 - CULTIVO DE CÉLULAS

As células em monocamada são dissociadas com 0,05% de tripsina-EDTA e

ressuspendidas em 3 ml de meio de cultura com soro – suspensão de células.

Para cultivar novas placas de petri de 21 cm2 são colocados 1 ml da suspensão de

células e 5 ml de meio de cultura com soro nas novas placas de petri.

Para os estudos de electrofisiologia as células são cultivadas em filtros de

policarbonato com 12 mm de diâmetro e 0.4 µm de tamanho de poro (Snapwell;

Costar) onde são colocados 100 µl da suspensão de células e 500 µl de meio de

cultura com soro na parte apical de cada filtro e 1000 µl de meio de cultura com soro

na parte basal.

Para os estudos de expressão da NKA e da STAT1 as células são cultivadas em

placas com 6 poços com 9.5 cm2 onde são colocados 500 µl da suspensão de células

e 2.5 ml de meio de cultura com soro.

2.6 - ACTIVIDADE DA NKA - MÉTODO ELECTROFISIOLÓGICO

As células Caco-2 cultivadas nos filtros de policarbonato são colocadas nas

câmaras de Ussing (1,0 cm2) equipadas com um sistema de recirculação de água a

37ºC e de gaseificação das soluções com 5% CO2 e 95% O2. Em seguida colocam-se

no lado apical e no lado basal 10 ml da solução de Krebs Apical e Basal

respectivamente (Vieira-Coelho, Serrao et al. 2000; Vieira-Coelho and Soares-da-

Silva 2000; Gomes and Soares-da-Silva 2002; Gomes, Xu et al. 2002). A resistência

transepitelial (Ωcm2) é determinada, através da lei de Ohm, aplicando uma diferença

de potencial de 3mV e medindo a corrente transepitelial. Em seguida deixam-se as

22

células estabilizar durante 20 minutos. Depois das células terem estabilizado

procede-se à permeabilização do lado apical com anfotericina B, permitindo a

entrada de sódio na célula, de modo a saturar a NKA (DuVall, Guo et al. 1998;

Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-da-Silva 2002). Nestas

condições a corrente de curto circuito observada deve-se ao transporte do ião Na+

através da membrana basal pela NKA. O sistema de manutenção da ddp e da corrente

(“voltage-current clamp”) foi ligado a um PC através de um sistema de aquisição de

dados BIOPAC MP1000 (BIOPAC Systems, Goleta, CA). A análise dos dados foi

feita através do software AcqKnowledge 2.0 (BIOPAC Systems).

2.7 - EXPRESSÃO DA SUB-UNIDADE α1 DA NKA

As células Caco-2 cultivadas nas placas de 6 poços são lavadas duas vezes

com PBS e em seguida adiciona-se 300 µl de tampão de lise frio, sonica-se duas

vezes durante 10 segundos e mantem-se as amostras no gelo durante 1 hora. Depois,

centrifuga-se durante 15 minutos, a 4ºC, a 13000 rpm, guarda-se o sobrenadante e

determina-se a sua concentração proteica pelo método de Bradford (as amostras

devem ser diluídas 1/10 em PBS para diluir a absorção do tampão de lise). A

concentração proteica das amostras é ajustada de modo a ficarem todas iguais e em

seguida adiciona-se 1:6 de tampão de amostra 6X concentrado. As amostras são

aquecidas a 37ºC durante 15 minutos e depois arrefecidas em gelo e centrifugadas a

13000 rpm durante 5 minutos. Os geis de electroforese são carregados com 15 µg de

proteínas e estas são separadas por electroforese desnaturante durante

aproximadamente 2 horas a 150V e são depois transferidas electroforeticamente para

membranas de nitrocelulose durante 1h45min. a 25V. Em seguida a membrana é

bloqueada, com uma solução 10% de leite em pó magro em PBS, durante 30

minutos, com agitação e é depois incubada com o anticorpo primário de ratinho, anti

subunidade α1 da NKA diluído 1:10000, durante a noite, a 4ºC com agitação. No dia

seguinte a membrana é lavada 3 vezes 15 minutos com PBST e depois incubada com

o anticorpo secundário de ratinho diluído 1:3000, durante 1 hora. No final lava-se 3

vezes 10 minutos com PBST e depois água. Em seguida incuba-se a membrana com

500 µl de cada um dos reagentes de detecção, durante 1 minuto, seca-se, expõe-se ao

23

filme de raio-X, durante aproximadamente 10 segundos e por fim procede-se à

revelação.

2.8 - EXPRESSÃO DO STAT1 E DO PHOSPHOSTAT1

As células Caco-2 cultivadas nas placas de 6 poços são lavadas duas vezes

com PBS e lisadas com 200 µl de tampão de amostra 1X. Em seguida as células são

removidas para um tubo de 500 µl no gelo, sonicadas duas vezes durante 10

segundos, e são depois mantidas no gelo durante 1 hora. Antes de se carregarem os

geis de electroforese as amostras são aquecidas a 95ºC durante 5 minutos, arrefecidas

em gelo e centrifugadas a 13000 rpm durante 5 minutos. Os geis de electroforese

(têm que ser preparados em duplicado, porque um é para avaliar a expressão do

STAT1 e o outro do fosfoSTAT1) são carregados com 25 µg de proteínas e estas são

separadas por electroforese desnaturante durante aproximadamente 2h30min a 125 V

e são depois transferidas electroforeticamente para membranas de nitrocelulose

durante 2h15min a 25 V. Em seguida as membranas são lavadas com PBST e

bloqueadas com uma solução 5% de leite em pó magro em PBST, durante 3 horas à

temperatura ambiente, com agitação. Depois uma membrana é incubada com o

anticorpo primário de coelho, anti-STAT1 diluído 1:1000 e a outra é incubada com o

anticorpo primário de coelho, anti-fosfoSTAT1 diluído 1:1000, durante a noite, a 4ºC

com agitação. No dia seguinte as membranas são lavadas 3 vezes 15 minutos com

PBST e depois incubadas com o anticorpo secundário anti-coelho diluído 1:2000,

durante 1 hora à temperatura ambiente. No final lava-se 3 vezes 10 minutos com

PBST e depois água. Em seguida incuba-se as membranas com 500 µl de cada um

dos reagentes de detecção diluídos em 9 ml de água, durante 1 minuto com agitação

suave, remove-se o excesso de reagente de detecção expõe-se ao filme de raio-X

durante 30 segundos e procede-se à revelação.

2.9 - ANIMAIS

Ratinhos NMRi machos (Harlan-Interfauna, Barcelona, Espanha) com peso

entre 30-35 g são mantidos com água e comida à descrição, em condições ambientais

24

controladas de temperatura (22 ± 2 ºC) e ciclo cicardiano (12h + 12h), pelo menos

uma semana antes do início das experiências.

2.10 - ADMINISTRAÇÃO

O IFN-γ de ratinho 10000 U é administrado intraperitonealmente aos ratinhos

NMRi 24 horas antes da remoção do intestino. O EGCG e o EGC são administrados

por via oral, numa concentração de 20 mg/Kg, 1 hora antes da administração do IFN-

γ de ratinho.

2.11 - OBTENÇÃO E PREPARAÇÃO DAS CÉLULAS EPITELIAIS

24 horas após a administração do IFN-γ, os animais são mortos por

estiramento da coluna cervical e dissecados de modo a permitir a remoção do jejuno,

do íleo e do cólon. Em seguida os fragmentos de intestino removidos são abertos

longitudinalmente e lavados com soro fisiológico frio, para posterior remoção das

células epiteliais. Para a remoção das gorduras, os fragmentos do intestino são

incubados numa solução HBSS com 1.5 mgml-1 de DTT durante 10 minutos à

temperatura ambiente, com 3 agitações suaves. Para a obtenção das células epiteliais,

o tecido é colocado numa solução HBSS com 1 mM de EDTA à temperatura

ambiente durante 10 minutos com 4 agitações suaves. Remove-se o tecido para outro

tubo, repete-se o último procedimento mais duas vezes e coloca-se as suspensões de

células no gelo. No final da terceira incubação na solução HBSS com 1 mM de

EDTA remove-se o tecido e centrifugam-se os três tubos a 1200 rpm durante 4

minutos a 4 ºC. Em seguida os peletes são lavados com 3 ml de solução de Krebs

modificado, juntos, lavados novamente com 5 ml de solução de Krebs modificado e

por fim ressuspendidos em 1 ml de solução de Krebs modificado de modo a obter

uma suspensão com aproximadamente 1.5 mg proteína/ml.

2.12 - DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA – MÉTODO DE BRADFORD

Para determinar a concentração proteica de uma suspensão celular primeiro é

necessário lisar as células de modo a que o conteúdo celular, nomeadamente as

proteínas fiquem expostas. Depois preparam-se em duplicado: 800 µl de água + 10

25

µl de amostra + 200 µl de reagente de proteínas, mistura-se tudo, aguarda-se 10

minutos, mistura-se novamente e lê-se a absorvância a 595 nm. Por interpolação com

uma curva de calibração de proteínas do soro bovino (BSA) determina-se a

concentração proteica da suspensão celular.

2.13 - ACTIVIDADE DA NKA – MÉTODO BIOQUÍMICO

O método bioquímico utilizado para avaliar a actividade da NKA em células

epiteliais isoladas de jejuno, ileo e colon de ratinhos, consiste na medição do fosfato

inorgânico libertado (Pi) pelas ATPases na presença e na ausência de ubaína, sendo a

actividade da NKA a diferença entre os fosfatos libertados na ausência e os fosfatos

libertados na presença de ubaína. Os fosfatos libertados são medidos por

espectrofotometria a 740 nm. Depois de determinar a concentração proteica dos

extractos celulares acerta-se a sua concentração, de modo a termos 1.2 mg de

proteína por ml e coloca-se aproximadamentre 1ml num tubo de vidro, onde as

células são incubadas durante 15 minutos a 37 ºC e depois permeabilizadas através

da congelação rápida na mistura gelo seco-acetona seguida de descongelação à

temperatura ambiente. Preparam-se em triplicado, tubos para medir a actividade de

todas as ATPases e tubos para medir a actividade das ATPases insensiveis à ubaína,

do seguinte modo: 800 µl solução A + 100 µl de água + 100 µl da suspensão de

células para avaliar a actividade de todas as ATPases e 800 µl solução B + 100 µl de

ubaína 10 mM + 100 µl da suspensão de células para avaliar a actividade das

ATPases insensiveis à ubaína. Os tubos são colocados no banho a 37 ºC durante 5

minutos e em seguida a reacção é iniciada pela adição de 4 mM de ATP, começando

o tempo de incubação a contar 20 minutos a 37ºC. No final do tempo de incubação, a

reacção é terminada pela adição de 50 µl de Ácido Tricloroacético arrefecido em

gelo. Adiciona-se 1 ml de reagente de cor a cada tubo, aguardam-se 2 minutos,

centrifuga-se a 4000 rpm durante 2 minutos e lê-se a absorvância a 740 nm. A

actividade da NKA é expressa em nanomoles de fosfato inorgânico (Pi) por

miligrama de proteína por minuto e é determinada como a diferença entre o fosfato

libertado na ausência de ubaína (ATPase total) e na presença de ubaína (ATPase

insensível à ubaína).

26

3 - RESULTADOS

3.1 - Células Caco-2

A corrente de curto circuito (Isc), induzida pela anfotericina B, nas células

Caco-2 mergulhadas em meio contendo 143 mM de Na+, em ambos os lados (apical

e basal), é dependente da concentração de anfotericina B adicionada ao lado apical

(Fig. 5). Verificou-se ainda que esta Isc só se verifica na presença de Na+ no lado

apical, como se pode observar na figura 5.

Em seguida avaliou-se o efeito da inibição de uma série de transportadores na

Isc induzida pela anfotericina B e verificou-se, que esta Isc não era influenciada pela

presença de amilorido, inibidor do trocador Na+/H+ e bloqueador de canais de Na+, 1

Fig. 5: Gráfico representativo da corrente de curto-circuito (Isc) induzida pela anfotericina B 2.5 µg/ml (a) e anfotericina B 1.0 µg/ml (b) ao lado apical de células banhadas por uma solução com 143 mM de Na+; anfotericina B 2.5 µg/ml na ausência de sódio no lado apical (c).

200 400-10

0

10

20

30

40

b

a

c

Anfo

teric

ina

b

Tempo (s)

Isc

(µA

/cm

2 )

27

mM no lado apical o que exclui a possibilidade dos canais de sódio e do trocador

Na+/H+, existentes no lado apical, estarem envolvidos na Isc induzida pela

anfotericina B. A furosemida, inibidor do co-transporte Na+,K+,2Cl-, 10 µM no lado

basal, e o cloreto de bário, bloqueador dos canais de K+, 1 mM no lado basal também

não alteram a Isc induzida pela anfotericina B, o que exclui a possibilidade de

envolvimento do co-transportador Na+,K+,2Cl- e dos canais de potássio, existentes no

lado basal, na Isc observada. Por outro lado a adição de ubaína, inibidor da bomba de

Na+,K+, 100 µM ao lado basal, reduz significativamente (p<0.05) a Isc induzida pela

anfotericina B, o que evidencia a participação da NKA na Isc induzida pela

anfotericina B. Por outro lado o DIDS, inibidor do co-transporte Na+,HCO3-, 200 µM

no lado basal aumenta significativamente a Isc induzida pela anfotericina B (Fig. 6),

o que revela uma acção contrária à da NKA na Isc.

0

50

100

150

200

*

*

a b c d e f

Isc

(% d

o co

ntro

lo)

Fig. 6: Efeito do amilorido 1 mM no lado apical (b), ubaína 100 µM no lado basal (c), DIDS 200 µM no lado basal (d), cloreto de bário 1 mM no lado basal (e), furosemida 10 µM no lado basal (f) na corrente de curto-circuito induzida pela anfotericina B, em % de controlo. Situação controlo (a). Os valores apresentados são médias de 4 experiências e as barras representam o erro padrão da média (SEM). * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).

28

Os resultados anteriormente descritos mostram que a Isc induzida pela anfotericina B

é uma medida da actividade da NKA. Assim utilizou-se esta Isc para avaliar o efeito

do IFN-γ e da ubaína na actividade da NKA e verificou-se que as células Caco-2

expostas durante 24 horas ao IFN-γ e à ubaína apresentam uma redução significativa

(p<0.05) na actividade da NKA, no entanto, embora a redução da actividade da NKA

pela ubaína seja superior à do IFN-γ, a remoção da ubaína durante 24 horas após 24

horas de exposição faz com que a actividade da NKA volte aos valores idênticos ao

da situação controlo, enquanto que a remoção do IFN-γ por 24 horas após 24 horas

de exposição mantém a NKA inibida, como se pode observar na figura 7.

Fig. 7: Efeito do IFN-γ 1000 U/ml durante 24 h (b), da remoção do IFN-γ por 24 h (c), da ubaína 100 nM, 24 h (d) e da remoção da ubaína durante 24 h (e) na actividade da NKA. Situação controlo (a). Os valores apresentados são médias de 15 experiências para (b) e (d), 4 experiências para (a) e (e) e 3 experiências para (c); as barras representam o erro padrão da média (SEM) e * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).

0

25

50

75

100

125

Act

ivid

ade

da N

KA

(% d

o co

ntro

lo)

a b c d e

29

Em seguida estudou-se o efeito do EGCG 20 µM, que é um inibidor do STAT1, na

actividade da NKA inibida pelo IFN-γ 1000 U/ml e pela ubaína 100 nM, em células

Caco-2 e verificou-se que, o EGCG reverte o efeito do IFN-γ na actividade da NKA

das células Caco-2, mas não consegue reverter o efeito da ubaína (Fig. 8), o que está

de acordo com os diferentes mecanismos de actuação da ubaína e do IFN-γ.

0

20

40

60

80

100

120

*

*

*

Act

ivid

ade

da N

KA

(% d

o co

ntro

lo)

a b c d e f

Fig. 8: Efeito do EGCG na actividade da NKA das células Caco-2 inibida pelo IFN-γ humano e pela ubaína. (a) - situação controlo, (b) - EGCG 20 µM, (c) - IFN-γ 1000 U/ml, (d) - EGCG 20 µM + IFN-γ 1000 U/ml, (e) - Ubaína 100 nM e (f) - EGCG 20 µM + Ubaína 100 nM. Os valores apresentados são médias de 12 experiências para (a), 6 experiências para (b), 15 experiências para (c) e (e), 5 experiências para (d) e 3 experiências para (f); as barras representam o erro padrão da média e * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).

30

Como a ubaína e o IFN-γ têm mecanismos de actuação distintos e como o EGCG

reverte o efeito do IFN-γ, fomos verificar se algum destes compostos actuam ao nível

da expressão da NKA e verificamos nem o IFN-γ 1000 U/ml, nem a ubaína 100 nM,

nem o EGCG 20 µM alteram significativamente a expressão da NKA, nas células

Caco-2 (Fig. 9).

Como o EGCG reverteu o efeito do IFN-γ na actividade da NKA das células Caco-2,

ao contrário da ubaína, caracterizou-se apenas o efeito deste polifenol na actividade

da NKA inibida pelo IFN-γ, através da dependência da inibição da actividade da

NKA com a concentração de EGCG. Assim obteve-se um EC50 = 1.43 µM e

verificou-se que para as concentrações de 20, 10, 5 e 2.5 µM a recuperação foi total,

ou seja são estatisticamente semelhantes à situação controlo enquanto que para as

concentrações mais baixas 1 e 0.1 µM não houve recuperação, ou seja são

0

5

10

15

20

25

Expr

essã

o da

NK

A(%

da

dens

idad

ere

lativ

a)

a b c d e f

Fig. 9: Efeito do IFN-γ humano, da ubaína e do EGCG na expressão da NKA das células Caco-2. (a) - Situação controlo, (b) - EGCG 20 µM, (c) - IFN-γ 1000 U/ml, (d) - EGCG 20 µM + IFN-γ 1000 U/ml, (e) - Ubaína 100 nM e (f) - EGCG 20 µM +Ubaína 100 nM. Os valores apresentados são médias de 2 experiências e as barras representam o erro padrão da média.

31

4 5 6 7 840

60

80

100

120

EC50 = 1.43 µM

**

-log(conc.)

Act

ivid

ade

da N

KA

(% d

o co

ntro

lo)

estatisticamente semelhantes às células tratadas apenas com IFN-γ e estatisticamente

diferentes da situação controlo (Fig. 10).

Como o EGCG reverteu o efeito do IFN-γ na actividade da NKA das células

Caco-2 e como a cascata de sinalização celular, que vai desde a ligação do IFN-γ ao

seu receptor até à inibição da NKA, envolve a STAT1, fomos verificar se esta

recuperação da actividade da NKA mediada pelo EGCG estava relacionada com a

diminuição da concentração de STAT1 ou com a inibição da sua fosforilação e

consequentemente a sua inactivação. Nesse sentido fomos estudar o efeito do EGCG

na expressão do STAT1 e do phosphoSTAT1 em células Caco-2 tratadas com IFN-γ

e verificou-se que o IFN-γ aumenta quer a expressão de STAT1 quer a expressão de

Fig. 10: Dependência da actividade da NKA com a concentração de EGCG nas células Caco-2 inibidas pelo IFN-γ humano. Os valores apresentados são médias de 3 experiências e as barras representam o erro padrão da média. * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05). .

32

phosphoSTAT1 (Fig. 11), contudo o EGCG apenas reduz a expressão de fosfo-

STAT1, ou seja inibe a activação do STAT1. No sentido de pesquisar qual a

estrutura ou parte da estrutura do EGCG relevante para a inibição do STAT1,

testaram-se outros derivados análogos do catecino, como o EGC, o EGC mais AG, o

ECG, o EC, o CG e o catecino, no entanto nenhum destes compostos preveniu o

aumento da expressão do STAT1 ou do phosphoSTAT1 induzida pelo IFN-γ (Fig.

11).

B

Con

trol

IFN

EG

CG

EG

CG

+IFN

EG

C

EG

C+I

FN

EG

C+A

G

EG

C+A

G+I

FN

0

1 0

2 0

3 0

4 0

Exp

ress

ão d

o ph

osph

o-STA

T(%

da

dens

idad

e re

lativ

a)

A

Con

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CG

EG

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C

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EG

C+A

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FN

0

1 0

2 0

3 0

4 0

Exp

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ão d

o STA

T1

(% d

a de

nsidad

e re

lativ

a)

33

D

Con

trol

IFN

EC

EC

+IFN

EC

G

EC

G+I

FN

0

10

20

30

40

50

60

phos

pho-

STA

T(%

rela

tive

dens

ity)

Con

trol

IFN

EC

EC

+IFN

EC

G

EC

G+I

FN

0

10

20

30

40

50

C

Expr

essã

o do

STA

T1(%

da

dens

idad

e re

lativ

a)E

xpre

ssão

do

phos

pho-

STA

T (%

da

dens

idad

e re

lativ

a)

34

F

Con

trol

IFN

Cat

echi

n

Cat

echi

n+IF

N

CG

CG

+IFN

0

10

20

30

40

50

Expr

essã

o do

pho

spho

-STA

T(%

da

dens

idad

e re

lativ

a)

Con

trol

IFN

Cat

echi

n

Cat

echi

n+IF

N

CG

CG

+IFN

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

EE

xpre

ssão

do

STA

T1(%

da

dens

idad

e re

lativ

a)

Fig. 11: Efeito de alguns derivados do catecino (20 µM) na expressão do STAT1 (A, C, E) e do phosphoSTAT1 (B, D, F), em células Caco-2, na presença de IFN-γ (1000U/ml). Os valores apresentados são médias de 3 experiências e as barras representam o erro padrão da média.

35

Os resultados obtidos nas células Caco-2 mostram que o EGCG é o único composto

testado, capaz de inibir a fosforilação do STAT1 e assim inibir o efeito do IFN-γ na

actividade da NKA das células Caco-2. Por isso decidiu-se caracterizar o efeito deste

composto da família do catecino na actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ e

obtivemos um EC50 = 1.69 µM (Fig.12), idêntico ao valor obtido para o efeito deste

composto na recuperação da actividade da NKA inibida pelo IFN-γ, que foi de 1.43

µM (Fig. 10).

4 5 6 7 80

200

400

600

EC50 = 1.69 µM

-log(conc.)

Act

ivid

ade

da N

KA

(% d

o co

ntro

lo)

Fig. 12: Dependência da actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ humano com a concentração de EGCG, nas células Caco-2. Os valores apresentados são médias de 2 experiências e as barras representam o erro padrão da média. * significa estatisticamente diferente da situação controlo (p<0.05).

36

3.2 - Ratinhos NMRi

Depois de caracterizar o efeito do EGCG na recuperação da actividade da NKA

inibida pelo IFN-γ e ainda na inibição da actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-

γ, nas células Caco-2, pretendia-se estudar o efeito do EGCG 20 mg/Kg num modelo

animal. Para isso começou-se por avaliar o efeito do IFN-γ 10000 U, administrado

intraperitonealmente, na actividade da NKA ao longo do intestino do ratinho e

verificou-se que o IFN-γ 10000 U reduz a actividade da NKA nas células epiteliais

do cólon do ratinho, mas não tem qualquer efeito na actividade da NKA das células

epiteliais do jejuno e do íleo do ratinho (Fig. 13).

Fig. 13: Efeito do IFN-γ (10000 U) na actividade da NKA ao longo do intestino de ratinho. * significaactividade da NKA significativamente diferente da situação controlo (P < 0.05).

Jejuno Ileo Colon70

80

90

100

110

120Veículo

IFN-γ

*

Activ

idad

e da

NKA

(% d

o co

ntro

lo)

37

Em seguida avaliou-se a expressão da NKA ao longo do intestino de ratinho tratado

com IFN-γ e verificou-se que este não altera a expressão da NKA no jejuno, no íleo e

no cólon (Fig. 14). Os resultados obtidos no cólon são idênticos aos obtidos nas

células Caco-2, onde também se verifica uma diminuição da actividade da NKA sem

haver diminuição na expressão da NKA.

Jejuno Ileo Colon0

10

20

30

40

50

60

70 VeículoIFN-γ

Exp

ress

ão d

asu

buni

dade

α1

da N

KA

(% d

a de

nsid

ade

rela

tiva)

Fig. 14: Efeito do IFN-γ (10000 U) na expressão da NKA ao longo do intestino de ratinho.

38

Como o IFN-γ 10000 U administrado intraperitonealmente apenas reduziu a

actividade da NKA no cólon de ratinho, foi neste tecido que se estudou o efeito do

EGCG e do EGC 20 mg/Kg, na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ. Como se

pode observar na figura 15, o EGCG 20 mg/Kg reverte o efeito do IFN-γ 10000 U na

actividade da NKA, enquanto que o EGC, que não teve qualquer efeito na

fosforilação do STAT1 estimulada pelo IFN-γ nas células Caco-2 (Fig. 11B),

também não reverteu a inibição da actividade NKA induzida pelo IFN-γ 10000 U no

cólon de ratinho (Fig. 15).

Controlo EGC EGCG70

80

90

100

110

120VeículoIFN-γ

**

Act

ivid

ade

da N

KA

(% d

o co

ntro

lo)

Fig. 15: Efeito do EGC e EGCG (20 mg/Kg) na actividade da NKA inibida pelo IFN- γ (10000 U), no colon de ratinho. * significa actividade da NKA significativamente diferente da situação controlo (P < 0.05).

39

4 - DISCUSSÃO

O uso do antimicótico anfotericina B, formador de poros para o Na+, no lado

apical da célula, permitiu isolar as correntes de sódio originadas pela acção da NKA

(Vieira-Coelho and Soares-da-Silva 2001; Gomes and Soares-Da-Silva 2002), como

podemos confirmar nas experiências preliminares (Fig. 5 e 6), permitindo assim,

estudar o efeito do IFN-γ e da ubaína na actividade da NKA e ainda o efeito do

EGCG na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ.

A inibição da actividade da NKA pela ubaína e pelo IFN-γ é desencadeada

através de mecanismos distintos, assim a ubaína, que é um ligando da NKA, inibe a

actividade da enzima por ligação directa (Lingrel, Orlowski et al. 1990), sendo o seu

efeito revertido 24 horas após a sua remoção (Fig. 7). Por outro lado a inibição da

NKA pelo IFN-γ não é directa, mas envolve o STAT1, numa complexa cascata de

sinalização celular (Darnell, Kerr et al. 1994; Akira 1999; Magro, Fraga et al. 2004)

e o seu efeito não é revertido 24 horas após a sua remoção (Fig. 7). Os resultados

obtidos com o EGCG, nas células Caco-2, estão de acordo com o anteriormente

descrito, uma vez que o EGCG, um inibidor do STAT1, reverteu o efeito do IFN-γ,

mas não reverteu o efeito da ubaína na actividade da NKA (Fig. 8). Apesar de terem

mecanismos de actuação distintos nenhum destes inibidores da NKA actua ao nível

da expressão desta enzima (Fig. 9).

A relevância deste trabalho advém do facto de muitos genes envolvidos em

processos inflamatórios e em respostas imunológicas dependerem da actividade do

STAT1 (Chatterjee-Kishore, van den Akker et al. 2000; Ramana, Chatterjee-Kishore

et al. 2000) e por isso, os inibidores do STAT1 podem desempenhar um importante

papel na modulação de vários processos envolvidos na inflamação. Assim procedeu-

-se à caracterização do efeito do EGCG na actividade da NKA inibida pelo IFN-γ e

na actividade do STAT1 estimulado pelo IFN-γ, através dos respectivos EC50. Os

resultados obtidos nas células Caco-2 revelam um EC50 = 1.43 µM na actividade da

NKA (Fig. 10) e um EC50 = 1.69 µM na actividade do STAT1 (Fig. 12). Em seguida

estudou-se o efeito de outros compostos estruturalmente semelhantes (Fig. 16), na

40

inactivação do STAT1, no sentido de averiguar se haveria alguma sub-estrutura do

EGCG particularmente relevante para o seu efeito.

Fig. 15: Estrutura dos compostos da família do catecino testados. a) (-)-catecino, b) (-)-catecino-3-galato, c) (-)-epicatecino, d) (-)-epicatecino-3-galato, e) (-)-epigalocatecino, f) (-)-epigalocatecino-3-galato.

OH

OOH

OH

OH

OHOOH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

a) b)

OH

O

OH

OH

OH

OH

OOH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

c) d)

OH

OH

O

OH

OH

OH

OH

OH

OOH

O

O

OH

OH

OH

OH

OH

OH

e) f)

41

Os resultados obtidos nas células Caco-2 mostram que apenas o EGCG

impede a activação do STAT1 induzida pelo IFN-γ (Fig.11), o que sugere que não

existe nenhum grupo funcional particularmente importante para a actuação do

EGCG, mas que este actua como um todo.

A inibição do efeito do IFN-γ na actividade da NKA pelo EGCG ocorre

através da inibição da fosforilação da tirosina 701 do STAT1 (Fig. 11B) que impede

a activação deste e não por inibição da expressão do STAT1 (Fig. 11A) nem por

outro processo relacionado com o seu poder antioxidante, já que nenhum dos outros

compostos da família do catecino conseguiu reverter o efeito do IFN-γ no STAT1,

apesar de também apresentarem propriedades antioxidantes (Lotito and Fraga 2000;

Leung, Su et al. 2001). Existem alguns exemplos de inibição do crescimento celular

por parte de vários compostos da família do catecino como é o caso do crescimento

das células do epitélio bronquico humano, 21BES, descrito por Yang onde não só o

EGCG, como também o EGC inibem o crescimento das referidas células (Yang, Liao

et al. 2000). Estes autores sugerem que o grupo galato é importante para a inibição

do crescimento da linha celular 21BES. Outro exemplo é o descrito por Chung para a

linha celular JB6 da epiderme de ratinho, onde todos os compostos da família do

catecino excepto o (-)-epicatecino, mostram uma forte inibição do crescimento

celular e da actividade da AP-1 (Chung, Huang et al. 1999). Os resultados obtidos,

no presente trabalho, sugerem que toda a estrutura do EGCG (Fig. 3) é importante

para a inibição do STAT1, já que nenhum dos outros compostos da família do

catecino testados e ainda o EGC juntamente com o AG conseguiram reverter o efeito

do IFN-γ (Fig. 11). Assim, em alguns casos, os efeitos atribuídos genericamente ao

chá verde, nomeadamente a sua acção antiinflamatória, podem na realidade ser da

exclusiva responsabilidade do EGCG.

Os resultados obtidos com a NKA isolada das células epiteliais do cólon de

ratinhos NMRi, mostram que o EGCG também é eficaz quando administrado por via

oral (Fig. 15), o que aumenta a importância deste composto, já que poderá ser

administrado oralmente para a supressão do efeito do IFN-γ sobre a NKA,

nomeadamente em pacientes com doença de Chron, para a diminuição de um dos

principais sintomas, que é a diarreia. Além disso como o EGCG actua sobre o

42

STAT1 poderá também ser usado para reverter outros mecanismos envolvidos na

inflamação, que utilizem uma cascata de sinalização celular que envolva este

transdutor de sinal.

43

5 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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