Tese de Doutorado PURIFICAÇÃO DE HEMICELULASES E DE...

GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA, DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO E TURISMO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

Tese de Doutorado

PURIFICAÇÃO DE HEMICELULASES E DE UMA β-GLICOSIDASE DE CERIPORIOPSIS SUBVERMISPORA

PRODUZIDAS EM CONDIÇÕES DE BIOPOLPAÇÃO

Pérola de Oliveira e Magalhães

Lorena – SP – Brasil 2005

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL



Tese de Doutorado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Biotecnologia Industrial.

Banca Examinadora: Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres (presidente) – DEBIQ/FAENQUIL

Dra. Maria Bernadete de Medeiros – DEBIQ/FAENQUIL

Dr. André Luis Ferraz – DEBIQ/FAENQUIL

Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte - UNICAMP

Dr. Alexandre Nunes Ponezi - UNICAMP

Estudante: Pérola de Oliveira e Magalhães

Lorena - SP - Brasil 2005

AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,

PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

Ficha Catalográfica

Elaborada pela Biblioteca Universitária

Magalhães, Pérola de Oliveira e

Purificação de hemicelulases e de uma β-glicosidase de Ceriporiopsis subvermispora produzidas em condições de biopolpação / Pérola de Oliveira e Magalhães. Lorena, 2005.

133 f. : il. ; 30 cm.

Tese (Doutorado em Biotecnologia Industrial) - Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Bioteconogia, 2005

Orientadora : Adriane Maria Ferreira Milagres

1.Biotecnologia 2. Xilanases 3. Purificação 4. Mananases 5.Ceriporiopsis subvermispora 6. Hemicelulases 7. β-glicosidase 8. Biodegradação I. Milagres, Adriane Maria Ferreira, orient. II. Título.

574.6 - CDU

FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA

PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL



Este exemplar corresponde à versão final da tese de doutorado aprovada pela banca examinadora.

Dra. Adriane Maria Ferreira Milagres Orientadora e Presidente da Banca Examinadora

Lorena - SP - Brasil 2005

A DEUS

“Tu te fizeste presente em todos os momentos firmes e trêmulos. E, passo a passo, pude sentir a tua mão na minha, transmitindo-me a segurança

necessária para enfrentar meu caminho e seguir.... A tua presença é qualquer coisa como a luz e a vida, e sinto que, em

meu gesto, existe o teu gesto e em minha voz a tua voz.” (Vinícius de Moraes)

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar aos meus pais, ao meu irmão e ao Dino pelo grande incentivo e amor dedicados em todos os momentos. Especialmente agradeço a minha mãe que trabalhou comigo durante toda esta tese.

Agradeço a Dra. Adriane M. Ferreira Milagres pela orientação, pelos ensinamentos e pela confiança;

Ao Departamento de Biotecnologia e a Faculdade de Engenharia Química de Lorena pela oportunidade e apoio para a realização desta dissertação;

Aos amigos do laboratório pelos ensinamentos, companheirismo e incentivo;

Aos demais professores, colegas e técnicos do DEBIQ, por todo auxílio

e atenção; A CAPES pelo apoio financeiro.

CONTEÚDO

ABREVIATURAS ............................................................................................... 1

LISTA DE TABELAS .......................................................................................... 2

LISTA DE FIGURAS .......................................................................................... 3

RESUMO ........................................................................................................... 8

ABSTRACT........................................................................................................ 9

1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 10

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA......................................................................... 12

2.1. CONSTITUINTES DA MADEIRA.......................................................... 12

2.2. ENZIMAS ENVOLVIDAS NA DEGRADAÇÃO DOS

POLISSACARÍDEOS DA PAREDE CELULAR ..................................... 19

2.2.1. Hemicelulases.................................................................................... 20

2.2.2. Xilanases ........................................................................................... 21

2.2.3. Mananases ........................................................................................ 24

2.2.4. Celulases ........................................................................................... 26

2.3. Ceriporiopsis subvermispora................................................................. 30

3. OBJETIVO ................................................................................................... 32

4. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................. 33

4.1. SOLUÇÕES TAMPÕES ....................................................................... 33

4.2. FUNGO................................................................................................. 35

4.3. MANUTENÇÃO DA CEPA.................................................................... 35

4.4. PREPARAÇÃO DA MADEIRA.............................................................. 35

4.5. PREPARAÇÃO DO INÓCULO ............................................................. 36

4.6. INOCULAÇÃO DO BIORREATOR ....................................................... 36

4.7. EXTRAÇÃO DAS ENZIMAS HIDROLÍTICAS....................................... 37

4.8. DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS ......................... 38

4.8.1. β-D-Xilanase ...................................................................................... 38

4.8.2. β-D-Xilosidase.................................................................................... 40

4.8.3. β-D-Glicosidase ................................................................................. 41

4.8.4. β-D-Mananase ................................................................................... 41

4.8.5. Endo-glucanase ................................................................................. 42

4.9. PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA............................................................... 43

4.9.1. Purificação de duas xilanases e de uma mananase a partir do extrato

inicial ................................................................................................. 44

4.9.1.1. DEAE Sepharose CL 6B............................................................. 44

4.9.2. Purificação de uma β-glicosidase e de uma xilanase a partir do extrato

concentrado (>100 kDa).................................................................... 45

4.9.2.1. Sephacryl S-300 HR ................................................................... 45

4.9.2.2. DE 52 Cellulose .......................................................................... 46

4.9.2.3. Concanavalina A......................................................................... 46

4.9.2.4. Sephadex G-50........................................................................... 46

4.9.3. Purificação de uma mananase a partir do extrato ultrafiltrado

(<100 kDa) ........................................................................................ 47

4.9.3.1. Precipitação com sulfato de amônio ........................................... 47

4.9.3.2. Extração de fenóis com polivinilpirrolidona (PVP) ...................... 47

4.9.3.3. DEAE Sepharose CL 6B............................................................. 48

4.9.3.4. Mono Q HR................................................................................. 49

4.9.3.5. DE- 52 Cellulose......................................................................... 50

4.10. ELETROFORESE............................................................................... 50

4.10.1. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE) .. 50

4.10.2. Preparo dos géis desnaturantes (SDS-PAGE) ................................ 51

4.10.2.1. Gel concentrador ...................................................................... 51

4.10.2.2. Gel separador ........................................................................... 52

4.10.3. Preparo das amostras...................................................................... 52

4.10.4. Sephadex G-25................................................................................ 52

4.10.5. Preparo do tampão da Amostra ....................................................... 53

4.10.6. Coloração com nitrato de prata........................................................ 53

4.10.7. Coloração com Azul de Coomassie ................................................. 54

4.10.8. Detecção de atividade de xilanase no gel de eletroforese............... 54

4.10.8.1. Gel concentrador com xilana .................................................... 54

4.10.8.2. Gel separador com xilana......................................................... 55

4.10.9. Detecção de atividade de β-Glicosidase no gel de eletroforese ...... 55

4.11. DOSAGEM DE PROTEÍNAS.............................................................. 56

4.11.1. Preparo do reagente de Bradford .................................................... 56

4.12. Determinação da massa molar ........................................................... 56

4.13. Determinação dos parâmetros cinéticos............................................. 58

4.14. Efeitos de compostos na atividade ..................................................... 59

4.15. Efeito da temperatura ......................................................................... 59

4.16. Efeito do pH ........................................................................................ 59

4.17. Estabilidade Térmica .......................................................................... 60

4.18. Estabilidade ao pH.............................................................................. 60

4.19. Especificidade ao substrato ................................................................ 61

5. RESULTADOS............................................................................................. 62

5.1. ENZIMAS HIDROLÍTICAS PRODUZIDAS POR C. subvermispora...... 62

5.2. CARACTERIZAÇÃO DAS HEMICELULASES E CELULASES NO

EXTRATO INICIAL ................................................................................ 63

5.3. PURIFICAÇÃO DAS ENZIMAS HIDROLÍTICAS .................................. 70

5.3.1. Purificação de duas xilanases e uma mananase a partir do extrato

inicial ................................................................................................. 70

5.3.1.1. DEAE - Sepharose CL - 6B ........................................................ 70

5.3.2. Purificação de uma β-Glicosidase e de uma xilanase a partir do extrato

concentrado (> 100 kDa)................................................................... 74

5.3.2.1. Sephacryl S-300.......................................................................... 74

5.3.2.2. DE-52 Cellulose.......................................................................... 79

5.3.2.2.1. Concanavalina A .......................................................... 82

5.3.3. Purificação de uma mananase a partir do extrato ultrafiltrado (< 100

kDa)................................................................................................... 85

5.3.3.1. Concentração e fracionamento das proteínas ............................ 85

5.3.3.2. Extração de fenóis com PVP (polivinilpirrolidona) ...................... 86

5.3.3.2.1. DEAE - Sepharose CL - 6B.......................................... 86

5.3.3.2.2. MONO Q H/R ............................................................... 88

5.3.3.2.3. DE- 52 Cellulose III ...................................................... 89

5.4. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS PURIFICADAS .... 92

5.4.1. Caracterização bioquímica da β-glicosidase...................................... 92

5.4.1.1. Determinação dos parâmetros cinéticos para β-glicosidase....... 92

5.4.1.2. Efeito da temperatura ................................................................. 92

5.4.1.3. Efeito do pH................................................................................ 93

5.4.1.4. Efeitos de compostos sobre a atividade da β-glicosidase

purificada .................................................................................. 94

5.4.2. Caracterização bioquímica da xilanase de 79 kDa ............................ 94

5.4.2.1. Determinação dos parâmetros cinéticos para xilanase de 79 kDa

.................................................................................................. 94

5.4.2.2. Efeito da temperatura ................................................................. 95

5.4.2.3. Efeito do pH................................................................................ 96

5.4.2.4. Efeitos de compostos sobre a atividade da xilanase de 79 kDa . 96

5.4.3. Caracterização bioquímica da mananase de 156 kDa....................... 97

5.4.3.1. Determinação dos parâmetros cinéticos da mananase de 156 kDa

.................................................................................................. 97

5.4.3.2. Efeitos de compostos sobre a atividade da mananase de 156 kDa

.................................................................................................. 97

5.4.3.3. Especificidade ao substrato ........................................................ 98

6. DISCUSSÃO................................................................................................ 99

6.1. Obtenção do extrato enzimático e análise da atividade das enzimas... 99

6.2. Purificação e caracterização de hemicelulases e de uma β-glicosidase

produzidas por C. subvermispora ........................................................ 102

7. CONCLUSÕES .......................................................................................... 110

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................... 112

9. ANEXOS .................................................................................................... 130

9.1. Anexo A: Curva padrão do log da massa molar versus Kav das

proteínas padrões aplicadas na coluna Sephacryl S-300.................... 130

9.2. Anexo B: Curva padrão do log da massa molar versus Kav das

proteínas padrões aplicadas na coluna Sephadex G-50. .................... 131

1

ABREVIATURAS

DNS : Ácido 3,5-dinitrosalicílico

CMC : Carboximetilcelulose

CMCase : Endoglucanase

Da : Dalton

EX : Endo-xilanase

LiP : Lignina peroxidase

MnP : Peroxidase dependente de Manganês

PNPG : p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo

PNPX : p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo

AE : Atividade específica

Km : Constante de Michaelis-Menten

Vmáx : Velocidade máxima da reação

PAGE : Eletroforese em Gel de Poliacrilamida

2

LISTA DE TABELAS

TABELA 1 – Unidades constituintes das polioses em várias espécies de

madeiras (FENGEL e WEGENER, 1989) ................................................. 15

TABELA 2 – Constituição química do P. taeda utilizado neste trabalho ......... 35

TABELA 3 – Purificação de uma xilanase de 79 kDa através da coluna DEAE

CL 6B........................................................................................................ 71

TABELA 4 – Purificação de uma mananase de 156 kDa através da coluna

DEAE CL 6B ............................................................................................. 71

TABELA 5 – Purificação de uma β-glicosidase presente no extrato concentrado

(>100 kDa). ............................................................................................... 74

TABELA 6 – Efeitos de alguns compostos na atividade da β-glicosidase

purificada. ................................................................................................. 94

TABELA 7 – Efeitos de alguns compostos sobre a atividade da xilanase de

79 kDa....................................................................................................... 96

TABELA 8 – Efeitos de alguns compostos sobre a atividade da mananase de

156 kDa..................................................................................................... 98

TABELA 9 – Especificidade a diferentes substratos das enzimas purificadas. 98

3

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1 – Representação das camadas da parede das células de madeira

mostrando lamela média (ML), parede celular primária (P), as camadas da

parede celular secundária (S1, S2 e S3), e o lúmen (W) das células de

madeira (FENGEL e WEGENER, 1989). .................................................. 13

FIGURA 2 – Estrutura da celulose (a) unidade de celobiose; (b) extremidade

redutora e não redutora. ........................................................................... 14

FIGURA 3 – Estrutura representando as regiões cristalina e amorfa de uma

microfibrila de celulose.............................................................................. 14

FIGURA 4 – Estruturas de hemiceluloses (Adaptado de KANTELINEN, 1993)

A: glicuronoxilana de madeiras duras; B: glicuronoarabinoxilana de

coníferas; C: galactoglicomanana de coníferas ........................................ 16

FIGURA 5 – Modelo esquemático da estrutura da lignina de madeira mole de

acordo com Addler (FENGEL e WEGENER, 1989).................................. 18

FIGURA 6 – Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (I) álcool

p-cumarílico; (II) álcool coniferílico; (III) álcool sinapílico (FENGEL e

WEGENER, 1989) .................................................................................... 18

FIGURA 7 – Representação teórica da estrutura da xilana vegetal e pontos

onde as enzimas atuam. Ac, grupo acetil; Arab, L-arabinofuranose; MeGlA,

ácido 4-O-metil-glicurônico; Xil, D-xilose................................................... 21

FIGURA 8 – Mecanismo da decomposição da celulose pela ação do complexo

celulolítico. ................................................................................................ 27

FIGURA 9 – Foto do biorreator de 2 L usado nos experimentos de

biodegradação da madeira. ...................................................................... 37

FIGURA 10 – Foto do equipamento de ultrafiltração tangencial

(Minitan - Ultrafiltration System - Millipore), com membranas de

ultrafiltração (100 kDa) usado na separação do extrato enzimático. ........ 38

FIGURA 11 – Fluxograma de purificação de uma mananase e duas xilanases a

partir do extrato inicial. .............................................................................. 44

FIGURA 12 – Fluxograma de purificação de uma β-glicosidase e uma xilanase

a partir do extrato concentrado (>100 kDa). ............................................. 45

FIGURA 13 – Fluxograma de purificação de uma mananase a partir do extrato

ultrafiltrado (<100 kDa). ............................................................................ 49

4

FIGURA 14 – Distribuição das atividades enzimáticas totais nas frações:

extrato inicial ( ), > 100 kDa ( ) e < 100 kDa ( )...................................... 63

FIGURA 15 – Efeito do pH a 50 ºC na atividade da β-glicosidase, β-xilosidase,

xilanase, mananase e CMCase, presente no extrato enzimático de C.

subvermispora .......................................................................................... 65

FIGURA 16 – Efeito da temperatura na atividade da β-glicosidase e da

β-xilosidase em pH 4,8 e da xilanase, mananase e CMCase em pH 5,4,

presente no extrato enzimático de C. subvermispora. .............................. 66

FIGURA 17 – Estabilidade da β-glicosidase, β-xilosidase, xilanase, mananase e

CMCase do extrato enzimático de C. subvermispora em relação a valores

de temperatura.......................................................................................... 67


CMCase do extrato enzimático de C. subvermispora em relação a valores

de pH. ....................................................................................................... 68

FIGURA 19 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (12,5 %),

corado com nitrato de prata, do extrato inicial. 1 – marcadores de massa

molar; 2 – bandas de proteínas presentes no extrato inicial após Sephadex

G-25. ......................................................................................................... 69

FIGURA 20 – Perfil da cromatografia do extrato inicial em coluna de troca

iônica DEAE Sepharose CL 6B, eluído com tampão acetato de sódio 50

mM, pH 5,8 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM...................................... 71

FIGURA 21 – A: Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),

corado com nitrato de prata, do pico I da coluna DEAE CL 6 B. 1 –

marcadores de massa molar; 2 – xilanase com aproximadamente 79 kDa;

B: Zimograma para atividade da xilanase purificada de 79 kDa em gel de

atividade para xilanase. ............................................................................ 72

FIGURA 22 – Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),

corado com nitrato de prata, dos picos II, III e IV da coluna DEAE CL 6B.

1 – marcadores de massa molar; 2 – xilanase com aproximadamente 29

kDa. .......................................................................................................... 73


corado com nitrato de prata, do pico V da coluna DEAE CL 6B. 1 –

marcadores de massa molar; 2 – mananase com aproximadamente 156

kDa. .......................................................................................................... 73

5

FIGURA 24 – Perfil da cromatografia em coluna de permeação em gel

Sephacryl S-300 do extrato concentrado após ultrafiltração, eluído com

tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4. A: atividades de xilanase,

mananase e endoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase representadas

no cromatograma; B: atividade somente de β-glicosidase e β-xilosidase

representadas no cromatograma. ............................................................. 75


corado com nitrato de prata, do pico I da Sephacryl S-300. 1 – marcadores

de massa molar; 2 – β-glicosidase purificada. .......................................... 77

FIGURA 26 – Zimograma para atividade de β-Glicosidase em gel de

poliacrilamida com Esculina como substrato. Atividade da β-glicosidase de

110 kDa purificada. ................................................................................... 77


corado com Comassie Blue, do pico II da Sephacryl S-300. 1 –marcadores

de massa molar; 2 – pico II da Sephacryl S-300 concentrado. ................. 78


poliacrilamida com Esculina como substrato 1 – marcadores de massa

molar; 2 –Atividade da β-glicosidase de aproximadamente 53 kDa presente

no pico II da Sephacryl S-300 HR............................................................. 78

FIGURA 29 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica DE-52

Cellulose do pico II da Sephacryl S-300, eluído com tampão acetato de

sódio 50 mM, pH 5,4 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM ....................... 80


corado com prata, do pico II da DE-52 Cellulose. 1 – marcadores de massa

molar; 2 – fração 272 a 288; 3 – fração 240 a 264 e 4 – fração 192 a 232

com bandas de aproximadamente 65 kDa, 44 kDa e 31 kDa. .................. 81

FIGURA 31 – Perfil da cromatografia em coluna de afinidade Concavalina A do

pico II da Sephacryl S-300, eluído com tampão acetato de sódio 50 mM,

pH 5,4 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM.............................................. 83


Sephadex G-50 do pico I da Con A, eluído com tampão acetato de sódio

50 mM, pH 5,4. ......................................................................................... 83


corado com prata, do pico I e II do cromatograma da Concanavalina A. 1 –

6

marcadores de massa molar; 2 – Pico II bandas de aproximadamente

66 kDa e 30 kDa; 3 – Pico I, bandas de aproximadamente 66 kDa e

30 kDa....................................................................................................... 84


corado com prata, do pico I e II do cromatograma da Sephadex G 50. 1 –

marcadores de massa molar; 2 – Pico II banda de aproximadamente

21 kDa; 3 – Pico I, bandas de aproximadamente 32 kDa e 21 kDa.......... 84

FIGURA 35 – Recuperação total das atividades enzimáticas e do teor de

proteina após precipitação fracionada com 30 %, 60 % e 80 % de sulfato

de amônio. ................................................................................................ 85

FIGURA 36 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica DEAE CL 6B

da FI 60 % de sulfato de amônio, eluído com tampão acetato de sódio

50 mM, pH 6,0 e gradiente de NaCl 0 – 500 mM. A: atividades de xilanase,

mananase, endoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase; B: atividades

somente de β-glicosidase e β-xilosidase. ................................................. 87

FIGURA 37 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica Mono Q do pico

V da DEAE CL 6B, eluído com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 8,0 e

gradiente de NaCl 0 – 500 mM e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM........ 88


Cellulose do pico II da Mono Q, com tampão Tris-HCl 50 mM, pH 9,0 e

gradiente de NaCl 0 – 500 mM. ................................................................ 89


corado com prata, dos picos e proteína 1, 2 e 3 do cromatograma da DE-

52 Cellulose eluída com amostra do pico II da Mono Q HR 5/5. 1 –

marcadores de massa molar; 2 – Pico 2, banda de aproximadamente

65 kDa e 3 – Pico 3, bandas de aproximadamente 65 kDa, 21 KDa e

16 kDa....................................................................................................... 91

FIGURA 40 – Representação gráfica de Lineweaver-Burk (duplo-recíproco)

para a β-glicosidase purificada. A: efeito da concentração de pNPG na

atividade da enzima purificada; B: efeito da concentração de celobiose na

atividade da enzima purificada.................................................................. 92

FIGURA 41 – Efeito da temperatura na atividade da β-glicosidase purificada. 93

FIGURA 42 – Efeito do pH na atividade da β-glicosidase purificada. .............. 93

7


para a xilanase de 79 kDa. ....................................................................... 95

FIGURA 44 – Efeito da temperatura na atividade da xilanase de 79 kDa........ 95

FIGURA 45 – Efeito do pH na atividade da xilanase de 79 kDa. ..................... 96


para a mananase de 156 kDa................................................................... 97

8

RESUMO

Purificação de hemicelulases e de uma β-glucosidase de Ceriporiopsis subvermispora produzidas em condições de biopolpação. Pérola de Oliveira e Magalhães. Defesa de doutorado. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra Adriane M. Ferreira Milagres (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, CEP 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. André Luiz Ferraz, Dra. Maria Bernadete de Medeiros, Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte e Dr. Alexandre Nunes Ponezi.

Os estudos de fungos agindo sobre madeira em geral buscam a

eficiência em degradar a lignina, processo este utilizado na biopolpação. Ceriporiopsis subvermispora é hoje a espécie mais indicada para o processo de biopolpação de cavacos nas fábricas de papel. Apesar da importância de C. subvermispora na aplicação industrial, o sistema enzimático deste fungo ainda não está completamente esclarecido. Geralmente a produção de enzimas por fungos é estudada em meios sintéticos, muitas vezes contendo indutores enzimáticos, e portanto, os resultados nem sempre refletem os acontecimentos in situ ou in vivo. Neste trabalho foram investigadas as enzimas hidrolíticas produzidas pelo C. subvermispora em biorreatores contendo cavacos de Pinus taeda L., por 30 dias, a 27 0C. Os cavacos biodegradados foram extraídos com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4. As atividades enzimáticas de vários cultivos foram determinadas e expressas em micromoles de produto formado por minuto por quilograma de cavaco (UI/kg). A produção das enzimas variou entre os cultivos, obtendo-se xilanase (388-593 UI/kg); mananase (256-634 UI/kg); endoglucanase (24-76 UI/kg); β-glicosidase (24-72 UI/kg) e baixas atividades de β-xilosidase (0,65-6,5 UI/kg). O perfil eletroforético do extrato foi obtido em gel desnaturante de poliacrilamida revelando nove bandas protéicas com massas molares correspondentes a 110 kDa, 85 kDa, 60 kDa, 56 kDa, 52 kDa e 51 kDa, 45 kDa, 36 kDa e 21 kDa. A temperatura ótima das enzimas dos extratos enzimáticos variou entre 55 ºC e 60 oC e o valor de pH ótimo para as enzimas foi 4,0 para a β-glicosidase, 4,5 para a β-xilosidase, 5,0 para a xilanase, 4,5 para a mananase e 3,5 para a CMCase. Verificou-se também que as enzimas apresentam maior estabilidade em pH 5,0 e a 40 oC e a β-glicosidase foi a enzima de maior estabilidade.

Os extratos foram separados em duas frações através de filtração por membrana (100 kDa). Foram purificadas duas xilanases e uma mananase presentes no extrato inicial apresentando, respectivamente, 79, 29 e 156 kDa. No extrato >100 kDa, foram purificadas uma β-glicosidase de 110 kDa e uma xilanase de 21 kDa e no extrato <100 kDa, uma mananase de 65 kDa. A xilanase de 79 kDa apresentou atividade máxima em pH 8,0 e a 50 ºC, enquanto a β-glicosidase de 110 kDa apresentou máxima atividade em pH 3,5 e temperatura ótima a 60 ºC. Estes resultados confirmam a presença de múltiplas xilanases em extratos fúngicos, juntamente com outras enzimas hidrolíticas necessárias para uma eficiente degradação da hemicelulose presente na parede celular da madeira.

9

ABSTRACT

Purification of hemicellulases and a β-glucosidase of Ceriporiopsis subvermispora produced in biopulping conditions. Pérola de Oliveira e Magalhães. Defesa do doutorado. Programa de Pós Graduação em Biotecnologia Industrial, Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra. Adriane M. Ferreira Milagres (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, CP 116, CEP 12600-000, Lorena, SP, Brasil). Banca examinadora: Dr. André Luiz Ferraz, Dra. Maria Bernadete de Medeiros, Dra. Marta Cristina Teixeira Duarte e Dr. Alexandre Nunes Ponezi.

Generally, the studies of fungi acting on wood search the best

performance in degrading the lignin, whose process is utilized in the biopulping. The white-rot fungus, Ceriporiopsis subvermispora is nowadays the main strain for the biopulping process of wood chips in the paper industry. Despite of the importance of C. subvermispora in the industry, the enzymatic system of this fungi is not completely cleared yet. Usually the production of enzymes by fungus is studied in synthetic medium, often containing enzymatic inductors, and hence, the results do not always represent the occurrences in situ or in vivo. In this work, hydrolytic enzymes produced by C. subvermispora in wood chips of Pinus taeda L. after 30 days of growing at 27 ºC were investigated. The cultures were extracted with a sodium acetate buffer solution (50mM). Xylanase activities (388 and 593 UI/kg of wood chips); mannanase (256-634 UI/kg of wood chips); carboximetylcellulase (24-76 UI/kg of wood chips); β-glucosidase (24-72 UI/kg of wood chips) and low β-xylosidase activities (0,65-6,5 UI/kg of wood chips) were detected. The electrophorectic profile of the crude extract was obtained by denaturing polyacrylamide gel (SDS-PAGE) revealing nine proteins bands with molecular weight of 110 kDa, 85 kDa, 60 kDa, 56 kDa, 52 kDa and 51 kDa, 45 kDa, 36 kDa and 21 kDa. The optimum temperature of the enzymes of the enzymatic extracts was between 55 and 60 ºC and the optimum pH value was 4.0 for the β-glucosidase, 4.5 for the β-xylosidase, 5.0 for the xylanase, 4.5 for the mananase and 3.5 for the carboxymetilcellulase. It was also observed that the enzymes presented higher stability at a pH value of 5.0 and at 40 ºC and also that β-glucosidase has the highest stability.

The obtained extracts were ultrafiltered through a membrane system with a 100 KDa cut-off point, separating the extracts in two fractions. Two xylanases and one mannanase present in the crude extract and showing respectively, 79 kDa, 29 kDa and 156 kDa were purified. In the concentrated extract a β-glucosidase of 110 kDa and a xylanase of 21 kDa were purified and in the ultrafiltered extract, one mannanase presenting 65 kDa was purified. The 79 kDa xylanase presented maximum activity at pH 8.0 and 50 ºC, while the β-glucosidase of 110 kDa presented maximum activity at pH 3.5 and optimum temperature at 60 ºC. These results confirmed the presence of multiple xylanases in fungal extracts, together with other hydrolytic enzymes necessary to an efficient degradation of the hemicellulose present in the wood cell wall.

10

1. INTRODUÇÃO

A biopolpação é definida como o tratamento dos cavacos de madeira

com fungos, antes da polpação química ou mecânica, com o intuito de remover

e/ou alterar a lignina, preservando a celulose. Os fungos causadores de

decomposição branca são os mais eficientes degradadores da lignina e são

provavelmente os mais apropriados para serem utilizados no processo de

biopolpação (AKHTAR et al., 1998; MESSNER e SREBOTNIK, 1994).

Em 1987, o “Biopulping Consortium” fundado por T. K. Kirk em Madison,

EUA, avaliou 200 espécies de fungos e dois deles exibiram diferenças que

pareceram ser muito úteis para a biopolpação. Ceriporiopsis subvermispora

vem desde então, recebendo especial atenção devido a sua habilidade de

degradar a lignina de madeiras moles e duras seletivamente (BLANCHETTE et

al., 1992; AKHTAR et al., 1998). Sua extrema agressividade para a colonização

da madeira lhe permite estabelecer-se em sistemas não estéreis

(SCOTT et al., 1998) e causar o efeito de "amolecimento" da matriz

lignocelulósica com grande eficiência. Essas características indicam que, até o

momento, essa é a espécie de fungo mais indicada para o processo de

biopolpação de cavacos para utilização na fabricação de papel.

Mesmo em períodos de biodegradação relativamente curtos (15 a

30 dias), a madeira é modificada facilitando a penetração de licores de

polpação e a subseqüente solubilização da lignina, ocasionando economia de

reagentes. O desfibramento e o refino mecânico também são facilitados,

ocasionando economia de energia. (AKHTAR et al., 1998, FERRAZ et al.,

1998, 2000).

Muitos trabalhos têm mostrado que o crescimento fúngico em substrato

sólido é diferente quando comparado ao meio líquido, e conseqüentemente, os

padrões de produção de isoenzimas são diferentes (VICUÑA et al.,

1996; MACHUCA e FERRAZ, 2001). Poucos estudos têm avaliado a ação

destas enzimas na biopolpação. Durante os estágios iniciais de colonização da

madeira por C. subvermispora, pequenas quantidades de lignina e celulose são

removidas, mas ocorrem alterações substanciais na estrutura dos

componentes da parede celular (BLANCHETTE et al., 1997; GUERRA et al.,

2003). Tais modificações são ocasionadas pela presença de enzimas e

11

compostos de baixa massa molar. Sugere-se que estes compostos são

produzidos pelos fungos decompositores de madeira e penetram na estrutura

da parede celular iniciando as reações de despolimerização da mesma (ENOKI

et al., 1999; WATANABE et al., 2002). Estudos recentes têm focado nos

radicais hidroxil (OH.) e outros radicais como peroxil (ROO.) ou hidroperoxil

(OOH.) também produzidos pelos fungos para atacar os componentes da

madeira, abrindo espaço para que as enzimas possam penetrar (HAMMEL et

al., 2002).

Durante o processo de biopolpação um grande volume de enzimas pode ser

recuperado. Manganês-peroxidase é a principal enzima oxidativa produzida por

C. subvermispora, enquanto xilanase e mananase são as principais enzimas

hidrolíticas. Tais enzimas são potencialmente importantes em

biobranqueamento de polpas celulósicas, em que a lignina é removida quase

completamente após o processo de branqueamento, porém uma parte é capaz

de permanecer na polpa interferindo na qualidade do produto final (CHRISTOV

e PRIOR, 1997). Estudos têm mostrado a aplicação de enzimas

hemicelulolíticas como a xilanase e a mananase neste processo, solubilizando

a hemicelulose e facilitando indiretamente a retirada da lignina. Porém, tem-se

descrito que a extensão da hidrólise da hemicelulose residual na polpa é

dependente entre outros fatores, das propriedades das enzimas, como a

massa molar, as cargas líquidas, o ponto isoelétrico, a estabilidade térmica e

ao pH e à interferência de inibidores da sua atividade.

Face ao exposto, o conhecimento das características das celulases e

hemicelulases produzidas por C. subvermispora durante a biodegradação de

cavacos de Pinus taeda é um ponto a contribuir, no sentido de melhor

compreender as alterações estruturais ocorridas na madeira e à possibilidade

de aplicação do extrato enzimático bruto ou das enzimas puras em outros

processos biotecnológicos.

12

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. CONSTITUINTES DA MADEIRA

O teor, a proporção e a estrutura química dos diferentes componentes

da madeira podem variar de acordo com a espécie da madeira. Em geral as

madeiras podem ser classificadas em duras (“hardwood”) ou moles

(“softwood”). As madeiras duras são provenientes de angiospermas como, por

exemplo, o eucalipto, ipê e peroba e as madeiras moles de gimnospernas,

grupo das coníferas como o pinho, cedro, cipreste (FENGEL e WEGENER,

1989; HIGUCHI, 1985). Os principais componentes da madeira são celulose,

hemicelulose e lignina. Além destes, em muitas espécies, outros componentes

químicos, coletivamente chamados de extrativos estão presentes.

A célula vegetal deposita a sua parede celular em várias camadas. A

parede celular primária é formada pelas microfibrilas de celulose e é

continuamente depositada durante o crescimento em área da célula. A madeira

desenvolve em seguida internamente uma parede celular secundária composta

principalmente de celulose e lignina. Após a divisão celular, as células recém

formadas permanecem unidas por uma substância intercelular, chamada

lamela média, constituída principalmente por lignina (FIGURA 1) (FENGEL e

WEGENER, 1989). De acordo com as orientações das microfibrilas de

celulose, a parede secundária pode ser dividida em três camadas,

denominadas S1, S2 e S3. As camadas da parede celular são constituídas de

microfibrilas de celulose e da matriz. A composição da matriz é heterogênea

variando em diferentes partes da parede, em diferentes tipos celulares e em

diferentes espécies. As hemiceluloses que compõem a matriz podem ser:

xilana, glucomanana, galactomanana, manana e xiloglucana. Além dessas

substâncias a matriz contém proteínas e compostos fenólicos tais como lignina,

ácido ferúlico, ácido cumárico (DANIEL, 2003).

13

FIGURA 1 – Representação das camadas da parede das células de madeira

mostrando lamela média (ML), parede celular primária (P), as

camadas da parede celular secundária (S1, S2 e S3), e o lúmen

(W) das células de madeira (FENGEL e WEGENER, 1989).

A celulose que constitui a parede celular é uma cadeia constituída de no

mínimo 15000 resíduos de glicose unidos por ligações ß-1,4, sem ramificações

(FENGEL e WEGENER, 1989). Quando dois anéis glicopiranosídicos se unem

através deste tipo de ligação, forma-se a celobiose. O grupo hidroxílico no

carbono 1 (C1) possui propriedades redutoras, enquanto as hidroxilas do

carbono 4 (C4) são não redutoras (FIGURA 2). Cerca de 30 a 100 moléculas de

celulose alinham-se paralelamente formando as microfibrilas. A íntima

associação entre as microfibrilas resulta em fibras rígidas, insolúveis e

cristalinas, embora a cristalinidade seja freqüentemente interrompida por

regiões menos ordenadas, denominadas amorfa ou paracristalina (FIGURA 3)

(FENGEL e WEGENER, 1989). Na parede celular da madeira a estrutura

altamente ordenada da macromolécula de celulose permite que polímeros de

celulose adjacentes se ajustem formando uma estrutura longa como uma fibra,

chamada microfibrila. As macromoléculas de celulose na microfibrila são

mantidas juntas por muitas pontes de hidrogênio intra e intermoleculares. A

estrutura altamente ordenada da celulose e as pontes de hidrogênio

intermoleculares são a base para muitas das propriedades físico-químicas da

14

celulose nas plantas, incluindo a rigidez e a sua natureza insolúvel. A rigidez e

a natureza cristalina das microfibrilas de celulose são responsáveis tanto pelo

seu papel funcional na parede celular das plantas quanto pela sua resistência à

decomposição microbiana (SINSABAUGH e LIPTAK, 1997).

FIGURA 2 – Estrutura da celulose (a) unidade de celobiose; (b) extremidade

redutora e não redutora.

FIGURA 3 – Estrutura representando as regiões cristalina e amorfa de uma

microfibrila de celulose.

As polioses ou hemiceluloses são compostas principalmente pelos

açúcares glicose, manose e galactose (hexoses), xilose e arabinose

(pentoses), podendo ainda apresentar quantidades variáveis de ácidos

urônicos e desoxi-hexoses em alguns tipos de madeira. Apresenta-se na forma

de estruturas ramificadas, de menor massa molar que a celulose e podem ser

homopolímeros ou heteropolímeros. O teor de polioses em diferentes tipos de

madeira é bastante variável, mas pode-se assumir um valor médio de cerca de

15

20 % (FENGEL e WEGENER, 1989). Em madeiras moles tem sido observada

a maior presença de manose, arabinose e galactose formando

4-O-metil-arabinoglicuronoxilanas e O-acetil-galactoglicomanana (TABELA 1).

Em madeiras duras, observou-se maior quantidade de xilose e grupos acetil

formando O-acetil-4-O-metilglicuronoxilanas (FENGEL e WEGENER; 1989).

As hemiceluloses 4-O-metilglicuronoxilana e 4-O-metilglicurono

arabinoxilanas são comumente conhecidas como xilanas. As glicuronoxilanas

consistem numa cadeia principal, formada por moléculas de xilose, unidas

entre si por ligações β-1-4 e cadeias laterais de ácido metilglicurônico, unidas

por ligações α na posição 2 (ou 3) da unidade de xilose. As glicuronoxilanas

das madeiras duras possuem alto teor de grupos acetila, sendo 1 a cada

10 unidades de xilose (FIGURA 4A). As glicuronoarabinoxilanas, ou xilanas de

coníferas assemelham-se as glicuronoxilanas, mas apresentam ainda,

unidades de arabinose, ligadas às posições 2 ou 3 dos monômeros de xilose.

Há 1 ou 2 grupos laterais de ácido glicurônico e 1 a 3 unidades de arabinose,

por 10 unidades de xilose (FIGURA 4B).

As galactoglicomananas são heteropolímeros que possuem tanto

manose como glicose, na cadeia principal, e, nas madeiras de coníferas, são

dotadas de grupos laterais de galactose ligados à posição 6 das unidades da

cadeia principal. As unidades da cadeia principal são unidas por ligações do

tipo β 1-4 e há cerca de 1 grupo lateral de galactose para cada 30 unidades da

cadeia principal, nas coníferas (FIGURA 4C).

TABELA 1 – Unidades constituintes das polioses em várias espécies de

madeiras (FENGEL e WEGENER, 1989)

Espécies Manose

%

Xilose

%

Galactose

%

Arabinose

%

Ac. urônico

%

Acetil

% Referência

Pinus sylvestris 12.4 7.6 1.9 1.5 5.0 1.6 Cote et al., 1966

Picea abies 13.6 5.6 2.8 1.2 1.8 - Fengel, 1978

Fagus grandifolia 1.8 21.7 0.8 0.9 5.6 4.3 Timell, 1969

Betula papyrifera 2.0 23.9 1.3 0.5 5.7 3.9 Timell, 1969

16

FIGURA 4 – Estruturas de hemiceluloses (Adaptado de KANTELINEN, 1993)

A: glicuronoxilana de madeiras duras; B: glicuronoarabinoxilana de

coníferas; C: galactoglicomanana de coníferas

17

A lignina é composta basicamente de unidades de fenilpropano

formando uma macromolécula tridimensional e amorfa. O primeiro modelo da

lignina foi descrito por Freudenberg em 1964, neste modelo parte da lignina foi

mostrada com 18 unidades de fenilpropano, com um total de mais de

100 unidades na molécula completa (FENGEL e WEGENER, 1989). Como

pode ser observado na FIGURA 5, uma modificação na estrutura foi introduzida

mais tarde por Addler (FENGEL e WEGENER, 1989). O acoplamento das

unidades de fenilpropano não ocorre de forma regular e repetitiva, o que é

atribuído ao mecanismo de biossíntese da lignina, que se processa por via

radicalar a partir da reação de três diferentes álcoois cinamílicos precursores,

álcool p-cumarílico, álcool coniferílico e álcool sinapílico (FIGURA 6) que geram

unidades p-hidroxibenzílicas, guaiacílicas e siringílicas, respectivamente. Os

diferentes tipos de acoplamento entre os precursores dão origem a vários tipos

de ligações entre as unidades fenilpropano. As mais abundantes são: β-O-4 e

α-O-4 (50-65 %), β-1 (9-15 %), β-5 (6-15 %), 5-5 (2-9 %), e β-β (2-5 %)

(FENGEL e WEGENER, 1989).

Existe ainda uma fração menor da madeira, formada basicamente por

compostos fenólicos e resinas, que são chamados de extrativos e

compreendem cerca de 2 a 4 % da madeira. Entre estes compostos

encontram-se os terpenos, ésteres de ácidos graxos, compostos fenólicos e

outros compostos de baixa massa molar. É interessante ressaltar que todos os

constituintes da madeira estão intimamente associados e\ou ligados

quimicamente, construindo todo o complexo celular (FENGEL e

WEGENER, 1989; HIGUCHI, 1985).

18

FIGURA 5 – Modelo esquemático da estrutura da lignina de madeira mole de

acordo com Addler (FENGEL e WEGENER, 1989)

FIGURA 6 – Estrutura dos precursores da biossíntese da lignina. (I) álcool

p-cumarílico; (II) álcool coniferílico; (III) álcool sinapílico (FENGEL

e WEGENER, 1989)

3 3

CH

CH

CH OH2 22CH OH

CH

CH

CH

CH

OCHH CO

OHOH OHOCH3

I II III

CH OH

á lcool p-cum a rílico á lcool conife rílico á lcool sina pílico

2

5 - 5

- ββ

- 1

- 5

- O - 4β

β

β

3O C H

|

γ

βα

3O C H

H C O H2

_

H C O

12O H

11

|

||

|

|

2H C

O C H

10

H O 9

2H C O H

|

|

|

|

8

__

7

_________

_O C

6______3H C O

5

|

|

| |

|

|

| |

|

____

4

_

__

_ || |

|

|

|

|

|

|

| _

_ _

_

16

______

___

___

___

C HC H

15

14

___

H C

H C

H C

H C

H C

H C

3H C O

3

13|

|

|

|

|

|

|

| |

|

|

|

|

|

|

|

|

|______

______

______H C

___

2

___

2C H OHH C = O

1

|

||

|

|

|

|

| |

|

|

|

|

|

|

H O C H H O C H

H O C H

H C O H

H C O H

H C O H

H C O H

H C O H

H C O H

H C O H

2 2

2

2

H C O H2

H C O H

2

2

H C O H

H C O H

2H C O H

H C O H

2 O C H 3

O C H 3

O C H 3

3

3H C O

H C O

3

H C O

3H C O

3

H C O

3

H C O

3

33

H C O

O HO H

H C

H C

H C

H C

H C

C H

C H

C H

C H

C H

C H

C = O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

O

OO

H C O H

2H C O H

H C

C H

______

__

H O H2 C C C = O --|

|O

H

___

19

2.2. ENZIMAS ENVOLVIDAS NA DEGRADAÇÃO DOS POLISSACARÍDEOS DA PAREDE CELULAR

Vários estudos conduzidos com fungos e bactérias têm mostrado que a

maioria destes microrganismos produz celulases e hemicelulases, porém

muitos não são capazes de degradar a parede celular das madeiras. Desde

que a produção das celulases e hemicelulases não está relacionada com a

biodegradação da madeira, acredita-se que um dos principais fatores que

controlam a biodegradação é a disponibilidade da celulose e da hemicelulose

para ser degradada por estas enzimas (DANIEL, 2003). Em paredes celulares

lignificadas sugere-se que a celulose está associada com as hemiceluloses que

por sua fez estão rodeadas por lignina formando assim, uma barreira

impermeável.

Em particular, os fungos são os principais degradadores de madeira na

natureza e empregam diferentes mecanismos para romper a barreira de

lignina. Enzimas extracelulares de ação hidrolítica e oxidativa e compostos de

baixa massa molar, produzidos por diferentes fungos decompositores, causam

diferentes formas de degradação da madeira. A degradação ocorre

necessariamente de forma extracelular, uma vez que os componentes dos

materiais lignocelulósicos devem ser inicialmente despolimerizados até

compostos menores que são susceptíveis ao transporte pela parede celular e

ao metabolismo intracelular dos fungos envolvidos (FERRAZ, 2004).

Dependendo da maneira que degradam a madeira, os fungos são então

classificados em causadores de podridão parda (Brown-rot fungi – degradam

principalmente polissacarídeos), podridão branda (Soft-rot fungi – podem

degradar lignina e polissacarídeo, porém em velocidade muito baixas) e

podridão branca (White-rot fungi – degradam todos os componentes da

madeira) (ERIKSSON et al., 1990).

Os fungos causadores de podridão branca pertencem principalmente à

classe Basidiomycetes, com algumas espécies pertencentes à classe

Ascomycetes. Esta classe de fungos pode ser distinguida em dois grupos: o

grupo dos fungos que degradam simultaneamente todos os componentes

lignocelulósicos e o grupo dos fungos que degradam primeiramente a lignina e

a hemicelulose, preservando a celulose. Entretanto, estudos em laboratório,

20

das vias de degradação utilizadas pelos fungos causadores de podridão

branca, têm mostrado que a degradação não ocorre de forma uniforme através

da madeira. O mesmo fungo pode causar deslignificação seletiva em

determinada área e a poucos milímetros dali causar a degradação simultânea

de celulose e lignina. Existem relatos que alguns fungos causadores de

podridão branca atacam tanto seletivamente quanto não seletivamente em

diferentes regiões de uma mesma porção de madeira (KUHAD et al., 1997;

AKHTAR et al., 1998). A ordem nas quais variadas quantidades de lignina,

celulose e hemicelulose são degradadas é diferente entre as espécies dos

fungos de podridão branca e pode variar com o substrato que está sendo

atacado e com o tempo de cultivo (ERIKSSON et al., 1990). Assim, um fungo

pode causar uma degradação seletiva no início do cultivo, e com o passar do

tempo tornar-se não seletivo (BLANCHETTE, 1980; HAKALA et al., 2004).

Os mecanismos distintos de degradação envolvidos em cada caso têm

sido objeto de muitos estudos e um aspecto a ser considerado é o modo de

ação das hemicelulases e celulases por estes fungos.

2.2.1. Hemicelulases

As enzimas que hidrolisam a hemicelulose podem ser divididas em

enzimas que degradam a cadeia principal e enzimas que degradam as cadeias

laterais (ERIKSSON et al., 1990; KUHAD et al., 1997). Assim a hidrólise das

hemiceluloses ocorre de maneira aleatória, produzindo heteroxilo-

oligossacarídeos lineares e ramificados contendo cadeias laterais de

arabinofuranose, ácido glicurônico ou ácido 4-O-metil-glicurônico. Devido à

complexa estrutura das hemiceluloses, diferentes tipos de enzimas são

requeridos para sua modificação e degradação enzimática. Um sistema

enzimático incluindo endo e exo-xilanases, mananases, β-xilosidase,

α-glicuronidase e α-arabinofuranosidase torna-se necessário para a hidrólise

completa desses heteroxilo-oligossacarídeos (BIELY, 1985). Entre estas, as

duas principais enzimas degradadoras da hemicelulose são a

endo-1-4-β-D-xilanase e a endo-1-4- β-D-mananase (BIELY, 1993). Formas

múltiplas de cada classe de enzimas podem ocorrer e essas podem cooperar

na hidrólise do substrato (WONG et al., 1988; BIELY et al., 1997) (FIGURA 7).

21

2 |1αMeGlA

O

HH

H

OOH

H OH

H

CH3

OOH

O

HOH

H

H

OHH

OH

O

O

OHO

HH

H

H

HOHO

HO

OH

HH

H

H

O

HO

OH

HH

H

H

O

HO

OH

HH

H

H

OOH

HO

HH

H

H

OHO

H

CH3CH3

O

O

O

-4 Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-4Xilβ1-2 |1αMeGlA

Arabα1 |3

2 |Ac

Ac|3

Xilβ1-4Xilβ1-

endo -1,4-β−xilanase (E.C. 3.2.1.8)

β−xilosidase (E.C. 3.2.1.37)

α−glucuronidase (E.C. 3.2.1)

α−L- arabinofuranosidase (E.C. 3.2.1.55)

acetilesterase (E.C. 3.1.1.6)

FIGURA 7 – Representação teórica da estrutura da xilana vegetal e pontos

onde as enzimas atuam. Ac, grupo acetil; Arab, L-arabinofuranose;

MeGlA, ácido 4-O-metil-glicurônico; Xil, D-xilose

2.2.2. Xilanases

A atividade das xilanases é altamente dependente da presença de

enzimas capazes de degradar as cadeias laterais. A hidrólise de diferentes

xilanas por xilanases rende variados produtos, os quais se diferem pelas

quantidades de xiloses, xilobioses e xilotrioses liberadas, assim como a

natureza dos açúcares com ácido urônico substituídos (BIELY, 1985).

A enzima principal para a despolimerização da xilana é a

endo-1-4-β-xilanase (EC 3.2.1.8). Sua ação ocorre na cadeia principal da

xilana, gerando xilo-oligossacarídeos menores substituídos ou não substituídos

que serão clivados pela exo-1-4-β-xilanase (BIELY, 1985). Os substituintes são

ao mesmo tempo liberados por esterases e glicosidases correspondentes, por

exemplo: resíduos de α-L-arabinosil por α-L-arabinofuranosidase (EC 3.2.1.55),

resíduos de 4-O-metil-D-glucuronosil ou D-glucuronosil por α-glucuronidase

(EC 3.2.1), resíduos acetil por acetilesterase (EC 3.1.1.6). Os dímeros de xilose

22

são geralmente clivados pela β-xilosidase (EC 3.2.1.37), liberando D-xilose

como único produto da hidrólise. A β-xilosidase é importante quando a hidrólise

completa da xilana é requerida (BIELY, 1985; COUGHLAN e HAZLEWOOD,

1993).

Porém, as ligações não são todas equivalentes e igualmente acessíveis

para as enzimas xilanolíticas. Além disso, a acessibilidade de algumas ligações

também muda durante o curso da hidrólise devido à retirada de substituintes e

diminuição do tamanho da cadeia (WONG et al., 1988). Assim, a produção de

um sistema xilanolítico com múltiplas enzimas de diferentes especificidades

está normalmente envolvida no processo de hidrólise para ocorrer um ataque

eficiente às ligações (THOMSON, 1993). A produção de múltiplas xilanases de

origem microbiana tem sido documentada, variando as suas especificidades e

tendo sinergismo no processo de degradação das xilanas (WONG et al., 1988;

BIELY et al., 1997; LI et al., 2000). Dois tipos de endoxilanases fúngicas foram

descritos: xilanases capazes clivar ligações glicosídicas próximas a

ramificações da cadeia principal e xilanases que clivam ligações glicosídicas

mais distantes das ramificações da cadeia principal. Sendo que muitas das

endoxilanases capazes de clivar ligações glicosídicas próximas a ramificações

da cadeia principal não são específicas, hidrolisando além das xilanas,

celulose, carboximetilcelulose, p-nitofenil-β-glucosídeo, celo-oligômeros e

laminarina (WONG e SADDLER, 1992; SARASWAT e BISARIA, 2000). Existe

evidência da ocorrência de três a cinco xilanases em certas bactérias e fungos

(WONG e SADDLER, 1992). Em Trichoderma spp, diferentes xilanases foram

detectadas e três delas purificadas e caracterizadas (DEKKER, 1983; WONG

et al., 1988). Phanerochaete chrysosporium produziu cinco xilanases além de

outras enzimas do complexo xilanolítico. (COMTAT, 1983). Múltiplas

β-xilosidases também foram caracterizadas de Trichoderma reesei e Sclerotium

rolfsii, apresentando massas molares entre 60 e 100 kDa (KUHAD et al., 1997;

ANDRADE et al., 2004).

Estudos com fungos demonstram que algumas destas múltiplas enzimas

podem ser produtos de um mesmo gene ou de genes distintos com o mesmo

objetivo de melhorar a hidrólise das xilanas. A síntese de múltiplas

endo-xilanases produzidas por um único microrganismo foi revelada com base

23

nas suas diferentes propriedades físico-químicas, como massa molar e ponto

isoelétrico.

Uma cuidadosa comparação de endo-xilanases feita por WONG et al.

(1988), indicou que com base nas similaridades da seqüência de aminoácidos

dos seus domínios catalíticos, estas enzimas podem ser divididas em dois

grupos, um contendo enzimas de alta massa molar (> 30 kDa) e com valores

baixos de ponto isoelétrico, designadas como glucanase da família 10

(antigamente família F), e um outro grupo contendo enzimas de baixa massa

molar com valores altos de ponto isoelétrico designadas como glucanase

família 11 (antigamente família G) (HENRISSAT e BAIROCH, 1993;1996)

Apesar de limitado o conhecimento sobre as diferentes propriedades catalíticas

das endo-xilanases nas duas famílias das glicosil hidrolases, está certo que as

enzimas pertencentes à família 10 possuem maior versatilidade catalítica ou

menor especificidade com o substrato do que as enzimas da família 11 (BIELY

et al., 1997). A maior versatilidade catalítica das endo-xilanases da família 10

em comparação com as da família 11 pode ser explicada por suas diferenças

na estrutura terciária, estabelecidas por cristalografia de raio X. As

endo-xilanases da família 11 são moléculas menores e bem mais compactas

(DAVIS e HENRISSAT, 1995). Além disso, o sítio de ligação ao substrato das

endo-xilanases da família 10 é aparentemente menos profundo que os da

família 11. Este fato, junto com uma possível maior flexibilidade conformacional

das enzimas maiores do que das enzimas menores pode contribuir para a

menor especificidade ao substrato das endo-xilanases da família 10 (BIELY et

al., 1997).

A maioria das endo-xilanases é muitas vezes descrita como enzimas

constituídas de um domínio catalítico (CD) (KULKARNI et al., 1999).

Entretanto, algumas endo-xilanases da família 10 e 11 possuem além do

domínio catalítico um domínio de ligação a carboidrato, normalmente um

domínio de ligação à celulose (CBD) ou um domínio de ligação a xilana (XBD),

conectado ao CD por uma haste flexível rica em glicina (TORRONEN e

ROUVINEN, 1997; CANALS et al., 2003). A presença de pelo menos um

domínio de ligação a carboidrato pode ligar a enzima a regiões específicas do

substrato aumentado efetivamente à concentração da mesma, o qual leva a um

aumento da eficiência catalítica. Endo-xilanases da família 10 têm em geral

24

massa molar próxima de 40 kDa, enquanto as endo-xilanases da família 11

apresentam massa molar ao redor de 20 kDa (HIMMEL et al., 1997; SAPAG et

al., 2002). As endo-xilanases fúngicas em geral apresentam massa molar entre

16 e 75 kDa (KIRK e CULLEN, 1998). Estudos têm mostrado que estas

enzimas apresentam pH ótimo entre 2,0 e 8,0 e uma temperatura ótima entre

45 e 70 ºC (RIZZATTI, 2004). A termoestabilidade e o pH ótimo destas

enzimas, são parâmetros de particular interesse devido principalmente ao fato

de suas possíveis aplicações biotecnológicas (COLLINS et al., 2005).

Um crescente número de aplicações biotecnológicas tem sido descrito

para xilanases, sozinhas ou em combinação com outras enzimas. Entre estas

aplicações estão: o biobranqueamento de polpa celulósica, sacarificação de

biomassa lignocelulósica, manufatura de pão, fabricação de ração animal, e

indústria de sucos de frutas (COUTRIN et al., 1999; LEE, 1997; HAKI e

RAKSHIT, 2003). Estas aplicações requerem enzimas capazes de operar sobre

condições específicas e freqüentemente não naturais. Biobranqueamento em

particular requer enzimas termoestáveis e com pH ótimo alcalino (KULKARNI

et al., 1999). Endo-xilanases da família 11 podem ser de especial interesse

devido ao seu menor tamanho, o qual pode facilitar a penetração da enzima na

fibra de celulose (SAPAG et al., 2002).

2.2.3. Mananases

As mananases estão classificadas nas famílias 5 e 26 das glicosil

hidrolases (HENRISSAT E BAIROCH, 1993). São capazes de hidrolisar as

ligações 1,4-β-D-manopiranosil das mananas e glicomananas. A enzima

1,4-β-manosidase (EC 3.2.1.25) age sinergicamente com as endo-mananases,

hidrolisando ligações 1,4-β-D-manosil das extremidades não redutoras de

mano-oligossacarídeos e de glicopeptídeos contendo manose (XU et al., 2002).

Estudos com 1,4-β-manosidases e 1,4-β-mananases fúngicas

mostraram que as enzimas foram ativas em vários substratos naturais e que

muitas vezes também exibiram atividades junto a p-nitrofenil-β-D-manosideo,

carboximetilcelulose e xilanas (FRANGOS, 1999; FERREIRA e FILHO, 2004).

A capacidade de degradar vários substratos talvez possa ser explicada pela

diferença de especificidade existente entre as enzimas, pois uma multiplicidade

25

de mananases tem sido observada em várias espécies de fungos (GÜBITZ et

al., 1996a). Mananases mais ou menos específicas foram estudadas e

mananases com domínios de ligação à manana e à celulose, foram

caracterizadas e apresentaram maior capacidade de ligarem-se a substratos

mais complexos do que as mananases que apresentaram apenas domínio

catalítico (SUNNA et al., 2001; HÄGGLUND et al., 2003). Em estudos com

T. reesei duas isoformas de mananase foram purificadas e indicaram ser

expressas por um único gene (STALBRAND et al., 1995), porém para fungos

anaeróbicos três genes homólogos para mananase foram encontrados

(MILLWARD-SADLER et al., 1994; HÄGGLUND et al., 2003).

Além da sua habilidade de hidrolisar diferentes mananas, algumas

β-D-mananases têm sido estudadas para transglicosilação de

mano-oligossacarídeos (HARJUNPÃÃ et al., 1995; BIELY, 1985). Uma endo-

mananase de S. rolfsii clivou várias mananas e mano-oligossacarídeos, mas

nenhuma manose foi formada durante a hidrólise de manotetrose, indicando

uma reação de transglicosilação (GÜBITZ et al., 2000).

A maioria das mananases fúngicas apresenta ponto isoelétrico (pI) ácido

entre 3,5 e 5,5, e pH ótimo entre 3,0 e 6,0 e somente algumas mananases têm

apresentado atividade máxima em pH alcalino acima de 9,0. (AKINO e

NAKAMURA, 1988; XU et al., 2002). A determinação da temperatura ótima de

várias mananases mostrou uma atividade máxima destas enzimas entre 50 e

92º C e uma massa molar entre 35 e 65 kDa (GÜBITZ et al., 1996b). Uma

exceção foi descrita para duas mananases de Enterococcus casseliflaus que

possuem massas molares de 137 kDa e 142 kDa (ZAKARIA e YAMAMOTO,

1998).

Mananases podem ser aplicadas na indústria alimentícia para a

diminuição da viscosidade de sucos de frutas, extrato de café, chocolate e licor

de cacau (McCLEARY, 1990; ZAKARIA e YAMAMOTO, 1998) e na indústria

farmacêutica para produzir oligossacarídeos (AKINO e NAKAMURA., 1988;

HOSSAIN et al., 1996). Mananases foram também avaliadas em combinação

com xilanases em estudos de biobranqueamento da polpa celulósica, levando

a uma redução significativa na quantidade de produtos químicos necessários

para o branqueamento (VIIKARI et al., 1994; LAHTINEN et al., 1995; BHAT,

2000).

26

2.2.4. Celulases

Devido à constituição física da molécula de celulose e ao fato de que na

natureza a celulose ocorre sempre associada à lignina e hemicelulose, a

solubilização completa da celulose requer ações coordenadas de várias

enzimas (KUBICEK, 1992).

Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação da celulose vêm

sendo particularmente bem estudados em dois fungos: T. reesei e no fungo

causador de podridão branca P. chrysosporium. A degradação da celulose

ocorre pela ação de três classes principais de enzimas que atuam

sinergicamente causando a hidrólise da celulose até glicose (KUHAD et al.,

1997). Estas classes de enzimas hidrolíticas compreendem as

endo-1,4-β-glucanases (EC 3.2.1.4), as exo-1,4-β-glucanases ou

celobiohidrolases (EC 3.2.1.91) e as 1,4-β-glicosidases (EC 3.2.1.21)

(SINSABAUGH e LIPTAK, 1997; BHAT e BHAT, 1997). Esse modelo de

biodegradação de celulose tem sido assumido como verdadeiro para a maioria

dos fungos, porém sabe-se que há fungos deficientes na produção de

exo-1,4-β-glucanases e a biodegradação completa do polímero pela via

enzimática parece limitada.

As endoglucanases clivam a cadeia de celulose aleatoriamente em

regiões menos cristalinas, criando então novas extremidades de cadeia.

Exoglucanases (celobiohidrolases) agem em seqüência em tais extremidades,

ou seja, são capazes de se ligar aos domínios cristalinos e liberar celobiose ou

glicose das extremidades. Embora celobiohidrolases são freqüentemente

categorizadas como exocelulases, medidas da atividade indicaram que elas

podem também promover um endo-ataque inicial, criando extremidades onde

iriam continuar a sua ação. A contribuição relativa e a significância da ação

“endo” da celobiohidrolase operando sob condições naturais ainda não foi

confirmada. A hidrólise completa da celulose ocorreria então pela ação das

β-glicosidases, as quais hidrolisam celobiose e outras celodextrinas solúveis

em glicose (FIGURA 8) (MUÑOZ et al., 2001).

27

FIGURA 8 – Mecanismo da decomposição da celulose pela ação do complexo

celulolítico.

Além das enzimas hidrolíticas acredita-se que, enzimas oxidativas,

também contribuem para a degradação da celulose. A celobiose desidrogenase

(CDH) (EC 1.1.9.18) oxida as extremidades de celobiose ou celodextrinas

maiores na presença de adequado aceptor de elétrons, porém a função

biológica da enzima ainda não foi totalmente esclarecida (HENRIKSSON et al.,

2000a; SIGOILLOT et al., 2002).

Uma multiplicidade das principais classes de celulases tem sido

detectada nos extratos de cultivo dos fungos e mais de uma proteína distinta de

cada classe também tem sido encontrada. Assim, foi encontrado em culturas

de Trichoderma spp., três endoglucanases, duas celobiohidrolases e duas

β-glicosidades. Tem sido geralmente aceito que essencialmente a mesma

situação é também verdadeira para outros fungos, porém com diferenças na

28

quantidade de enzimas secretadas (WOOD e GARCIA-CAMPOYO, 1990). O

sistema celulolítico do fungo causador de podridão branca P. chrysosporium

tem sido extensivamente estudado e, diferentemente do T. reesei, foram

encontradas cinco endoglucanases, uma celobiohidrolase e duas

β-glicosidades (ERIKSSON e PETTERSSON, 1975; WOOD E

GARCIA-CAMPOYO, 1990). Estudos recentes com P. chrysosporium incluíram

celobiohidrolases ao complexo celulolítico deste fungo, celobiohidrolases 58,

celobiohidrolases 62 e celobiohidrolases 50, sendo as duas primeiras

consideradas similares as celobiohidrolases I e a última a celobiohidrolases II

de T. reesei (HENRIKSSON et al., 2000b). Estas endo-glucanases de

P. chrysosporium apresentaram massas molares entre 28 e 37 kDa, sendo que

as endo-glucanases fúngicas têm apresentado massas molares entre 25 e

50 kDa (ERIKSSON et al., 1990) com um pI e um pH ótimo ácido ou levemente

alcalino.

O sistema celulolítico do basidiomiceto causador de podridão branca

Irpex lacteus, também foi caracterizado e foram descritas três

celobiohidrolases, e uma endocelulase. A análise da seqüência de aminoácidos

da celobiohidrolase 3 revelou significante homologia com as celobiohidrolases

1 e 2 do mesmo fungo e com celobiohidrolases I de P. chrysosporium e

celobiohidrolases I de T. reesei (HAMADA et al., 1999).

Através das décadas, muitos dos esforços para esclarecer a bioquímica

da decomposição da celulose ficaram direcionados para poucos gêneros de

fungos: Trichoderma, Phanerochaete, Aspergillus, Penicillium, Fusarium solani

e S. rolfsii (ERIKSSON et al., 1990). Estudos comparando os modelos para a

hidrólise da celulose de T. reesei e P. chrysosporium na década de 80 já

consideravam a existência de múltiplas enzimas nos complexos celulolíticos

destes fungos.

Nestes estudos já era evidente que a hidrólise da celulose requeria dois

tipos de endoglucanases diferindo na presença ou ausência de centros

adicionais de adsorção mais tarde chamados de Domínio de Ligação à

Celulose (CBD). Foi sugerido que endoglucanases de ligações fracas à

celulose hidrolisavam regiões amorfas deixando as partes cristalinas intactas

(RABINOVICH et al., 2002). Estas endoglucanases foram tidas como

componentes minoritários do sistema celulolítico do T. reesei e

29

P. chrysosporium. Mais tarde as enzimas destes fungos foram identificadas

como endoglucanase III e endoglucanase 28, respectivamente. Porém, o papel

central na decomposição da celulose cristalina foi dado às enzimas que

possuíam uma ligação mais forte neste sistema, representadas por

endoglucanases I e II, e celobiohidrolases I e II (RABINOVICH et al., 2002).

A multiplicidade destas enzimas tem levado a consideráveis problemas

na designação das verdadeiras especificidades aos substratos de

componentes individuais do sistema celulolítico e assim na determinação do

provável modo e seqüência de ataque para a completa solubilização da

celulose (WOOD e GARCIA-CAMPOYO, 1990). O modelo de ataque à celulose

descrito acima inclui a possibilidade de ataque preferencial, mas não explica

detalhadamente como ocorre o sinergismo.

Estudos têm mostrado que a degradação da celulose cristalina não

ocorre quando os componentes do sistema celulolítico estão presentes

individualmente no meio. No entanto, quando estão combinados agem de

maneira sinérgica tornando a celulose solúvel. Quatro tipos de sinergismos têm

sido reportados entre celulases de fungos. Incluindo: a) endo e

celobiohidrolase; b) duas celobiohidrolases imunologicamente relacionadas e

distintas; c) entre β-glicosidase e endoglucanases e d) entre β-glicosidase e

celobiohidrolase. As dificuldades para uma explicação satisfatória para as

especificidades aos substratos dos componentes do sistema celulolítico

aparentemente purificados, o seu modo de ataque e a significância da ação

sinérgica têm levado a trabalhos consideráveis de clonagem de genes, análises

de seqüências e análises estruturais para celulases fúngicas e bacterianas.

Destes estudos têm sido concluído que a maioria das celulases são

constituídas de três regiões principais: um domínio catalítico (CD), uma região

“dobradiça” altamente glicosilada rica em prolina, treonina e resíduos de serina,

e um domínio de ligação à celulose (CBD) (ARCHER e WOOD, 1994).

As celulases têm atraído bastante interesse comercial devido às suas

várias aplicações em áreas como bioconversão de materiais celulósicos,

alimentação, têxteis, farmacêuticos, detergentes, tratamento de efluentes e

processamento de frutas e vegetais. O interesse na aplicação de enzimas na

indústria e papel tem aumentado nos anos recentes, e uma das principais

aplicações tem sido a remoção de tintas de papéis reciclados. As celulases

30

também têm sido utilizadas com sucesso na indústria têxtil para o “bio-stoning”

de jeans e o “bio-polishing” de algodão e de outras fibras celulósicas (KUHAD

et al., 1997; BHAT, 2000).

2.3. Ceriporiopsis subvermispora

Apesar da importância de C. subvermispora na biopolpação, o sistema

extracelular que esse microrganismo utiliza para decompor a madeira

seletivamente ainda não está bem esclarecido, pois ainda não se consegue

explicar muito bem como as enzimas envolvidas na biodegradação penetram

na parede celular da madeira. Vários trabalhos têm demonstrado que enzimas

lignocelulolíticas não penetram na parede celular intacta (BLANCHETTE et al.,

1997; SREBOTNIK et al., 1998; KIRK e CULLEN, 1998). No entanto,

BLANCHETTE et al. (1997) demonstraram que C. subvermispora causa

alterações estruturais significativas na lignina presente na parede celular e na

lamela média, mesmo antes da parede celular vegetal ser permeável a

proteínas de 5730 Da. Dessa forma, vários trabalhos têm sugerido que alguns

compostos de baixa massa molar poderiam atuar nos estágios iniciais de

biodegradação da madeira, degradando componentes da parede celular a

ponto de permitir a penetração de enzimas oxidativas e hidrolíticas. Sem

dúvida, estas enzimas são ativas ao longo das envolturas da hifa em contato

com a parede celular da madeira. A produção e penetração da micro-hifa e de

envolturas extracelulares de fungos por alguns fungos causadores de podridão

branca na parede celular de madeiras sugerem que processos degradativos

nestas instâncias podem ser diferentes, e que proteínas com grandes massas

molares aparentam ter acesso rápido a áreas degradadas nas paredes

celulares (MESSNER et al., 2003) Considerando que os fungos causadores de

podridão branca formam um grupo de organismos tão grande e diverso, muitas

formas diferentes de ataque à parede celular são encontradas (BLANCHETTE

et al., 1997).

As enzimas extracelulares produzidas por este fungo compreendem as

lacases e as manganês peroxidases, o complexo xilanolítico completo e parte

do complexo celulolítico (SETHURAMAN et al., 1998; FERRAZ et al., 2003)

Estudos do sistema lignolítico do C. subvermispora revelaram que este fungo

31

não produz lignina peroxidase em culturas líquidas e sólidas, sugerindo que

diferentes estratégias devem ser usadas para degradação da lignina (SALAS et

al., 1995; ENOKI et al., 1999; LOBOS et al., 2001; HOFRICHTER, 2002;

HAKALA et al., 2004; SOUZA-CRUZ et al., 2004).

A produção de um sistema celulolítico incompleto tem sido considerada

um dos motivos para a inexpressiva degradação de celulose pois as

exocelulases são produzidas em pequenas quantidades, embora endo-

celulases e β-glicosidases são produzidas em quantidades comparáveis às

reportadas por outros basidiomicetos de decomposição branca

(SETHURAMAN et al., 1998; SOUZA-CRUZ et al., 2004). Como em vários

basidiomicetos, a expressão dessas enzimas é dependente do substrato

(SETHURAMAN et al., 1998), e quando estudada em meios sintéticos, nem

sempre reflete os acontecimentos do sistema in situ ou in vivo.

32

3. OBJETIVO

O processo de biopolpação de madeira utilizando C. subvermispora já se

encontra em vias de implementação industrial, porém poucos aspectos

químicos e bioquímicos da interação do fungo na madeira foram elucidados.

Uma das razões é que o sistema extracelular que o C. subvermispora produz

durante a biodegradação da madeira ainda não foi completamente descrito. O

presente trabalho, teve como objetivo, a purificação e a caracterização de

algumas enzimas hidrolíticas produzidas por C. subvermispora em cavacos de

P. taeda visando a melhor compreensão de sua importância e função na

biopolpação.

Para atingir esse objetivo foram desenvolvidas as seguintes etapas:

Obtenção do extrato enzimático bruto de C. subvermispora cultivado por

30 dias em um sistema de fermentação sólida;

Análise da atividade das enzimas hidrolíticas extracelulares produzidas

durante o processo de biodegradação;

Purificação das enzimas;

Caracterização das enzimas purificadas quanto as suas constantes

cinéticas, temperatura ótima, pH ótimo, inibição por metais e

especificidade aos substratos.

33

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. SOLUÇÕES TAMPÕES

Tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4

Solução de ácido acético 0,2 M 8,8 mL

Solução de acetato de sódio 0,2 M 41,2 mL

Água destilada (q.s.p.) 200 mL



Solução de acetato de sódio 0,2 M 41,2 mL

Água destilada (q.s.p.) 500,0 mL



Solução de acetato de sódio 0,2 M 30 mL


Tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0

Fosfato de sódio monobásico 0,2 M 87,7 mL

Fosfato de sódio dibásico 0,2 M 13,3 mL






34





Tris-HCI 50 mM, pH 9,0

Trisma-base 0,2 M 50 mL

HCI 0,2 M 5,0 mL


Tampão Citrato fosfato 0,05 M

Ácido cítrico (mL) Fosfato de sódio dibásico (mL) pH

44,6 5,4 2,6

39,8 10,2 3,0

33,9 16,1 3,6

30,7 19,3 4,0

26,7 23,3 4,6

24,3 25,7 5,0

21,0 29,0 5,6

17,9 32,1 6,0

13,6 36,4 6,6

6,5 43,6 7,0 * Completar o volume com água para 100 ml.

35

4.2. FUNGO

O fungo utilizado neste estudo foi o basidiomiceto de decomposição

branca C. subvermispora (Pilat) Gilbn & Ryv, pertencente à classe dos

Basidiomycetes, proveniente da micoteca da Universidad de la República,

Montevideo, UY, gentilmente cedido pela Profª. M. Speranza.

4.3. MANUTENÇÃO DA CEPA

A linhagem foi repicada e mantida em placa de Petri com meio contendo

2,0 % de extrato de malte, 0,2 % de extrato de levedura e 2 % de agar e

cultivados a 27 ± 2 ºC durante 10 dias. Todo o processo de repicagem e

inoculação foi realizado em uma câmara de fluxo laminar.

4.4. PREPARAÇÃO DA MADEIRA

A madeira utilizada como substrato nos experimentos de biodegradação

foi obtida de um exemplar de P. taeda (aproximadamente 28 anos) doado pelo

Parque Estadual de Campos do Jordão - SP. A composição desta madeira foi

determinada por MENDONÇA et al. (2002) (TABELA 2).

Os cavacos foram preparados manualmente (cerca de

2,5 x 1,8 x 0,2 cm), secos ao ar e estocados dentro de sacos de polietileno.

Previamente aos experimentos de biodegradação, os cavacos foram

imersos em água por um período de 16 horas.

TABELA 2 – Constituição química do P. taeda utilizado neste trabalho

Componentes % dos componentes na madeira

Celulose 47,8 ± 0,9

Poliose 23,1 ± 0,9

Lignina 28,6 ± 0,4

Substâncias extraíveis em etanol e diclorometano 1,5 ± 0,4 / 0,9 ± 0,8

36

O excesso de água foi então drenado e os cavacos autoclavados no

interior do biorreator a 121 ºC por 20 minutos, duas vezes consecutivas

intermediadas por um período de resfriamento de 24 h.

4.5. PREPARAÇÃO DO INÓCULO

Em 200 mL de meio de cultura líquido (2,4 % de extrato de batata e

0,7 % de extrato de levedura) previamente esterilizado a 121 ºC por 15 minutos

foram introduzidos 20 discos de 8 mm de diâmetro de agar micélio obtidos do

cultivo em meio sólido. Os frascos Erlenmeyer de 1000 mL foram incubados

por 10 dias em estufa a 27 ºC. O micélio obtido do cultivo em meio líquido foi

filtrado em funil de Büchner estéril e lavado com 300 mL de água anteriormente

esterilizada. Em um liqüidificador com copo de alumínio de 500 mL (estéril)

foram batidos 3 vezes por 15 segundos (com intervalos para evitar o

aquecimento) 100 mL de água destilada e a massa micelial obtida após a

filtração. Uma alíquota desta suspensão foi utilizada para inocular os cavacos

nos biorreatores. Para calcular a quantidade de micélio na suspensão, foi feita

a determinação da massa seca de fungo (g / mL) presente numa alíquota

dessa suspensão. Para determinar a massa micelial seca filtrou-se em papel

de filtro, previamente seco e tarado, 25 mL da suspensão. O filtrado,

juntamente com o papel, foram secos em estufa a 60 ºC até atingir peso

constante.

4.6. INOCULAÇÃO DO BIORREATOR

O biorreator consistiu de um recipiente de polipropileno de alta

densidade de 2 L (FIGURA 9). Os biorreatores foram preenchidos com cavacos

e inoculados com a suspensão de micélio na razão de 25 mg de micélio para

200 g de madeira (peso seco) (SOUZA-CRUZ, 2002). Os biorreatores foram

fechados e agitados manualmente para homogeneização e conectados ao

sistema de injeção de ar. Foram então aerados a um fluxo de 0,023 m3 / h. O ar

umidificado foi esterilizado através da passagem por uma solução de

permanganato de potássio, água (esterilizada) e membrana de 0,2 µm. Os

experimentos ficaram mantidos em sala termostatizada a 27 ± 2 ºC durante

37

30 dias, com injeção de ar permanente ao longo do tempo de biodegradação.

Sob estas condições o experimento foi repetido 20 vezes durante toda a

extensão do trabalho, para obtenção do extrato enzimático necessário aos

estudos de purificação.

FIGURA 9 – Foto do biorreator de 2 L usado nos experimentos de

biodegradação da madeira.

4.7. EXTRAÇÃO DAS ENZIMAS HIDROLÍTICAS

Ao término do período de 30 dias de incubação, o conteúdo dos

biorreatores foi transferido para Erlenmeyers de 2 L e a estes foram

adicionados 500 mL de tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4 com 0,01 % de

Tween 60, para cada extração. A extração foi conduzida sob agitação

(120 rpm) durante 4 h a 10 ± 1 ºC. Nova extração foi feita nas mesmas

condições por 12 horas. Os extratos foram reunidos e passados por filtro de

porcelana (Scott Duran 4), a frio usando banho de gelo. Após a filtração a

vácuo, os extratos foram ultrafiltrados através de um sistema de membranas

com massa molar limite (cut off) de 100 kDa (Minitan - Ultrafiltration

System - Millipore) (FIGURA 10).

38

< 100 > 100

FIGURA 10 – Foto do equipamento de ultrafiltração tangencial

(Minitan - Ultrafiltration System - Millipore), com membranas de

ultrafiltração (100 kDa) usado na separação do extrato

enzimático.

4.8. DETERMINAÇÃO DAS ATIVIDADES ENZIMÁTICAS

A caracterização do extrato foi feita através da determinação das

atividades enzimáticas descritas a seguir, utilizando o Espectrofotômetro

U-2001, (Hitachi). As unidades de enzimas foram expressas como UI/mL

(µmol / min x mL). As unidades totais do extrato foram obtidas multiplicando-se

UI/mL pelo volume extraído. Para relacionar as unidades totais produzidas com

a quantidade de cavaco de madeira utilizado em cada processo de

biodegradação, UI foi divida pela massa (kg) de cavaco utilizada e reportada

como UI/kg (µmol / min x kg de cavaco).

4.8.1. β-D-Xilanase

A atividade de xilanase foi determinada de acordo com o método de

BAILEY et al. (1992), seguido da quantificação de açúcares redutores liberados

39

a partir da xilana, pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS

- MILLER, 1959). Uma alíquota de 0,9 mL de solução de xilana 1,0 % (birchwood-Sigma

X0502) foi colocada em 3 tubos de ensaio e incubados em banho-maria a

50 ºC. A seguir foram adicionados 0,1 mL do extrato enzimático em cada tubo

e a reação foi conduzida por 5, 15 e 30 minutos. Adicionou-se então, 1,5 mL do

reagente do DNS e os tubos foram fervidos por 5 minutos. Em seguida as

amostras foram resfriadas e a absorbância foi lida a 540 nm em

espectrofotômetro. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se

substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se o reagente de

DNS antes do extrato enzimático. Nessas condições a enzima não apresenta

atividade catalítica, mas é possível dosar compostos redutores que não são

provenientes da reação enzimática.

A curva padrão foi construída com solução de xilose (Merck), a

concentrações de 2; 4; 6; 8; 10; 12; 14; 16; 18 e 20 µmol / mL. Uma unidade de

atividade de xilanase foi definida como a quantidade de enzima capaz de

catalisar a liberação de 1 µmol de açúcar redutor por minuto, expresso como

xilose.

Preparo da solução de xilana “Birch” 1,0 %

A solução de xilana foi preparada dissolvendo-se 1 g de xilana

(birchwood-Sigma X0502) em 80 mL de tampão acetato de sódio 50 mM

pH 5,4. A solução foi aquecida até ebulição em forno de microondas, e após

retornar à temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o

referido tampão. A solução permaneceu em agitação mecânica até completa

solubilização da xilana na solução.

Preparo do reagente do DNS

O reagente foi preparado dissolvendo-se 10,6 g de ácido

3,5-dinitrosalicílico, 19,8 g de hidróxido de sódio, 306,0 g de tartarato de sódio

e potássio e 8,3 g de bissulfito de sódio em 1 L de água destilada. Após

40

agitação para total dissolução dos reagentes, foram adicionados 7,6 mL de

fenol, e o volume completado para 1,4 L com água destilada (MILLER, 1959).

4.8.2. β-D-Xilosidase

A atividade de β-xilosidase foi determinada segundo TAN et al. (1987),

através da estimativa do p-nitrofenol (pNP) liberado a partir do reagente

p-nitrofenil-β-D-xilopiranosídeo (pNPX).

Uma alíquota de 0,2 mL do extrato enzimático foi adicionada a 0,8 mL de

solução de pNPX 0,1 % em três tubos de ensaio. As reações foram conduzidas

incubando os tubos durante 15, 30 e 60 minutos a 50 ºC. Após incubação, as

reações foram interrompidas pela adição de 2 mL de solução de bicarbonato de

sódio 10 % em cada tubo e a absorbância foi lida a 410 nm. Foram feitos

controles para cada amostra, adicionando-se a solução de bicarbonato de

sódio 10 % antes do extrato enzimático. Para calibração do aparelho foi feito

um controle onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de

sódio 50 mM, pH 4,8.

O pNP liberado foi determinado através de curva de calibração com

padrão de p-nitrofenol nas concentrações de 50, 75, 150, 225, e 300 µmol / mL.

Uma unidade de atividade de β-xilosidase foi definida como a quantidade de

enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de pNP por minuto.

Preparo da solução de para-nitro-fenil-β-D-xilopiranosídeo

(pNPX) 0,1 %

A solução de pNPX foi preparada dissolvendo-se 0,1 g de pNPX (Sigma)

em 90 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,8, sob agitação e o volume

foi ajustado para 100 mL com o referido tampão.

Preparo do bicarbonato de sódio 10 %

A solução de bicarbonato de sódio 10 % foi preparada dissolvendo-se

10 g de bicarbonato de sódio em 100 mL de água destilada, sob agitação e

aquecimento em agitador mecânico.

41

4.8.3. β-D-Glicosidase

A atividade de β-glicosidase foi determinada segundo TAN et al. (1987),

através da estimativa do p-nitrofenol (pNP) liberado a partir do

p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo (pNPG).


solução de pNPG 0,1 % em três tubos de ensaio. As reações foram conduzidas

incubando os tubos durante 15, 30 e 60 minutos a 50 ºC. Após incubação, as

reações foram interrompidas pela adição de 2 mL de solução de bicarbonato de

sódio 10 % em cada tubo e a absorbância foi lida a 410 nm. Foram feitos

controles para cada amostra, adicionando-se a solução de bicarbonato de

sódio 10 % antes do extrato enzimático. Para calibração do aparelho foi feito

um controle onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de

sódio 50 mM, pH 4,8.

O pNP liberado foi determinado através de curva de calibração com

padrão de p-nitrofenol nas concentrações de 50, 75, 150, 225, e 300 µmol / mL.

Uma unidade de atividade de β-glicosidase foi definida como a quantidade de

enzima capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de pNP por minuto.

Preparo da solução de para-nitro-fenil-β-D-glicopiranosídeo

(pNPG) 0,1 %

A solução de pNPG foi preparada dissolvendo-se 0,1 g de pNPG

(Sigma) em 90 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH 4,8, sob agitação e o

volume foi ajustado para 100 mL com o referido tampão.

4.8.4. β-D-Mananase

A atividade de mananase foi determinada de acordo com o método de

RATTO e POUTANEN (1988), seguido da quantificação de açúcares redutores

liberados a partir de galactomanana, pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico

(DNS - MILLER, 1959).

42

Uma alíquota de 0,9 mL de solução de galactoglucomana 0,5 % (Sigma

G0753) foi colocada em 3 tubos de ensaio e adicionados 0,1 mL do extrato

enzimático em cada tubo. A seguir, os tubos de ensaio foram incubados em

banho termostatizado à temperatura de 50 ºC por 5, 15 e 30 minutos.

Adicionou-se então, 1,5 mL do reagente do DNS e os tubos foram fervidos por

5 minutos. Em seguida as amostras foram resfriadas e a absorbância foi lida a

540 nm em espectrofotômetro. Para calibração do aparelho foi feito um controle

onde se substituiu o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM,

pH 5,4.

Foram feitos controles para cada amostra, adicionando-se o reagente de

DNS antes do extrato enzimático. Nessas condições a enzima não apresenta

atividade catalítica, mas é possível dosar compostos redutores que não são

provenientes da reação enzimática.

A curva padrão foi construída com solução de manose (Merck), a

concentrações de 1,38; 2,77; 4,16; 5,55; 6,94; 8,33; 11,11 e 13,38 µmol / mL.

Uma unidade de mananase foi definida como a quantidade de enzima capaz de

catalisar a liberação de 1 µmol açúcar redutor por minuto, expresso como

manose.

Preparo da solução de manana 0,5 %

A solução de manana foi preparada dissolvendo-se 0,5 g de

galactomanana (“locust bean gum” - Sigma G0753) em 80 mL de tampão

acetato de sódio 50 mM pH 5,4. A solução foi submetida a aquecimento até

aproximadamente 80 ºC, em forno de microondas, e após retornar à

temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o referido

tampão. A solução permaneceu em agitação mecânica até completa

solubilização da manana na solução.

4.8.5. Endo-glucanase

A atividade de endo-1,4-β-glucanase foi determinada segundo técnica

descrita por TANAKA et al. (1981) que consiste em conduzir a hidrólise de uma

43

solução de carboximetilcelulose 0,44 %. A quantidade de açúcares redutores

foi determinada pelo método do DNS (MILLER, 1959).


solução de carboximetilcelulose 0,44 % (Sigma C5013) em três tubos de

ensaio. As reações foram conduzidas incubando os tubos durante 30, 60 e 90

minutos a 50 ºC. Adicionou-se então, 1,5 mL do reagente do DNS e os tubos

foram fervidos por 5 minutos. Em seguida as amostras foram resfriadas e a

absorbância foi lida a 540 nm em espectrofotômetro. Foram feitos controles

para cada amostra, adicionando-se o reagente de DNS antes do extrato

enzimático. Para calibração do aparelho foi feito um controle onde se substituiu

o volume da enzima pelo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

A curva padrão foi construída com solução de glicose (Merck), a

concentrações de 1,38; 2,77; 4,16; 5,55; 8,33; 11,11 µmol / mL. Uma unidade

de atividade de endoglucanase foi definida como a quantidade de enzima

capaz de catalisar a liberação de 1 µmol de açúcar redutor por minuto,

expresso como glicose.

Preparo da solução de carboximetilcelulose 0,44 %

A solução de carboximetilcelulose foi preparada dissolvendo-se 0,44 g

de carboximetilcelulose (Sigma C5013 - média viscosidade) em 80 mL de

tampão acetato de sódio 50 mM pH 5,4. A solução foi submetida a

aquecimento até aproximadamente 80 ºC em forno de microondas, e após

retornar à temperatura ambiente o volume foi ajustado para 100 mL com o

referido tampão. A solução permaneceu em agitação mecânica até completa

solubilização da carboximetilcelulose na solução.

4.9. PURIFICAÇÃO ENZIMÁTICA

As purificações das enzimas hidrolíticas de interesse neste trabalho

foram, feitas por técnicas convencionais de cromatografia em colunas de troca

iônica, filtração em gel e de interação hidrofóbicas. As frações foram analisadas

para proteínas e para as atividades de xilanase, mananase,

carboximetilcelulose, β-glicosidase e β-xilosidase e frações contendo as

44

atividades foram agrupadas. Todas as colunas estavam acopladas a um

sistema FPLC da Amershan Bioscience e equilibradas com soluções tampão

previamente definidos. O perfil protéico das amostras selecionadas foi avaliado

por SDS-PAGE.

4.9.1. Purificação de duas xilanases e de uma mananase a partir do extrato inicial

4.9.1.1. DEAE Sepharose CL 6B

Um volume de 150 mL do extrato inicial foi aplicado na coluna de troca

aniônica DEAE Sepharose CL 6B (Amersham Bioscience) (40 x 1,0 cm),

previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0. O

mesmo tampão utilizado para equilibrar a coluna foi aplicado como eluente da

amostra, adicionado de gradiente de NaCl (0-0,5 M) preparado no mesmo

tampão, a partir do volume de 1500 mL, sob um fluxo de 30 mL/h. O eluato foi

monitorado a 280 nm e frações de 20 mL foram coletadas a partir da aplicação

da amostra e analisadas quanto às atividades enzimáticas de interesse. As

frações que apresentaram atividade enzimática foram selecionadas, dialisadas

em água deionizada por aproximadamente 12 horas e concentradas por

liofilização (FIGURA 11).

FIGURA 11 – Fluxograma de purificação de uma mananase e duas xilanases a

partir do extrato inicial.

Extrato Inicial

DEAE Sepharose CL 6B

Xilanase I Mananase I Xilanase II

Extrato Inicial


Xilanase I Mananase I Xilanase II

45

4.9.2. Purificação de uma β-glicosidase e de uma xilanase a partir do extrato concentrado (>100 kDa)

4.9.2.1. Sephacryl S-300 HR

Uma amostra de 200 µL do extrato concentrado foi centrifugada a

5000 g por 15 minutos e aplicada na coluna Sephacryl S-300 HR (70 x 1,6 cm).

O fluxo de 60 mL/h foi mantido durante a permeação da amostra, utilizando-se

água desionizada como eluente. Foram coletadas frações de 2 mL a partir da

aplicação da amostra na coluna. Todas as frações coletadas foram analisadas

quanto à absorbância a 280 nm e quanto às atividades enzimáticas de

interesse neste trabalho (FIGURA 12). O volume de exclusão (V0) da coluna foi

determinado com o padrão Azul Dextran (2 x 106 g/mol). O volume total (Vt) da

coluna foi determinado com a eluição de uma alíquota padrão de acetona

(57 g/ mol) e os volumes de retenção (Ve) dos padrões, ovoalbumina (45 kDa),

gliceraldeído (36 kDa) e tripsinogênio (24 kDa) foram usados para o cálculo do

Kav e subsequente construção da curva de calibração da coluna

(log PM x Kav) (ANEXO A).

Extrato > 100 KDa

Sephacryl S300

Β-glicosidase I Pico II

Concanavalina A

Pico IIPico I

DE-52 Cellulose

Pico IIPico I

Sephadex G50

Xilanase III

Pico IIPico I

Extrato > 100 KDa

Sephacryl S300

Β-glicosidase I Pico II

Concanavalina A

Pico IIPico I

DE-52 Cellulose

Pico IIPico I

Sephadex G50

Xilanase III

Pico IIPico I

FIGURA 12 – Fluxograma de purificação de uma β-glicosidase e uma xilanase

a partir do extrato concentrado (>100 kDa).

46

4.9.2.2. DE 52 Cellulose

A fração correspondente ao pico II da Sephacryl S-300 foi aplicada na

coluna de troca iônica DE-52 Cellulose (Whatman) (20 x 1,5 cm) equilibrada

com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4. O mesmo tampão de equilíbrio

foi usado como eluente com um fluxo de 30 mL/h, adicionado de um gradiente

de NaCl de 0 a 500 mM a partir do volume de 80 mL. As frações coletadas

foram de 8 mL a partir da aplicação da amostra na coluna e foram analisadas

quanto à absorbância a 280 nm. Todas as frações correspondentes aos picos

de absorbância em 280 nm foram analisadas quanto a atividades enzimáticas

de interesse (FIGURA 12).

4.9.2.3. Concanavalina A

Na tentativa de separar as proteínas presentes no pico II da Sephacryl S

300, testou-se a resina de afinidade Concanavalina A (Sepharose 4B) (10 x

0,5 cm). A coluna foi equilibrada com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

Uma amostra de 500 µL do pico II da Sephacryl S-300 foi aplicada na coluna,

utilizando como eluente o mesmo tampão de equilíbrio, com um fluxo de

60 mL/h. Foram coletadas frações de 4 mL a partir da aplicação da amostra na

coluna e foram analisadas a 280 nm e quanto a atividades enzimáticas de

interesse.

4.9.2.4. Sephadex G-50

A fração correspondente ao pico I da Concanavalina A, onde se

encontrava maior atividade enzimática e maior teor de proteína, foi eluída na

coluna de permeação em gel Sephadex G-50 (Amersham Bioscience)

(30 x 1,0 cm). Foram aplicadas alíquotas de 200 µL desta fração na coluna, e

este procedimento foi repetido 5 vezes nas mesmas condições. Utilizou-se

tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4, como eluente e manteve-se o fluxo

em 15 mL/h. Frações de 4 mL foram coletadas a partir do volume aproximado

de 4 mL (V0~10 mL) e foram analisadas quanto à absorbância a 280 nm e

quanto a atividades enzimáticas de interesse. O volume de exclusão (V0) da

coluna e o (Vt) foram determinados com os padrões, Azul Dextran

47

(2 x 106 g/mol) e acetona (57 g/mol), respectivamente. Os volumes de eluição

(Ve) dos padrões, inibidor de tripsina (20,1 kDa) e lactalbulmina (14,2 kDa)

foram usados para o cálculo do Kav e subsequente construção da curva de

calibração da coluna (log PM x Kav) (ANEXO B).

4.9.3. Purificação de uma mananase a partir do extrato ultrafiltrado (<100 kDa)

4.9.3.1. Precipitação com sulfato de amônio

Realizou-se o fracionamento a 30 % de saturação adicionando-se sulfato

de amônio sólido (164 g/L) ao extrato (massa molar < 100 kDa) que

permaneceu sob agitação lenta por 12 h. Em seguida, centrifugou-se a

6000 rpm por 30 minutos. O precipitado foi separado e coletou-se o

sobrenadante ao qual adicionou-se sulfato de amônio até 60 % de saturação

(181 g/L). Adicionado todo o sal, a solução foi deixada sob agitação lenta por

12 h. Após este período centrifugou-se novamente a solução a 6000 rpm por

30 minutos. O procedimento foi novamente repetido adicionando-se sulfato de

amônio até 80 %. Desta vez o sobrenadante foi descartado. Os precipitados

foram ressuspensos, no menor volume possível, em tampão acetato de sódio

50 mM, pH 5,4 e dialisados por aproximadamente 18 horas contra água

desionizada sob agitação, até que a condutividade ficasse abaixo de 2 mS. As

atividades enzimáticas de interesse e as concentrações protéicas foram

medidas após esta etapa nas soluções resultantes das frações insolúveis em

30 %, 60 % e 80 % de sulfato de amônio. Concomitantemente o perfil protéico

de cada fração foi analisado por eletroforese em SDS-PAGE.

4.9.3.2. Extração de fenóis com polivinilpirrolidona (PVP)

As amostras foram tratadas com 1 %, 2 % e 5 % (p/v) de PVP e

permaneceram em agitação durante 1 hora a 4º C em seguida, foram filtradas

em papel de filtro. Os filtrados foram dialisados contra água deionizada e

congelados a -20 ºC.

48

4.9.3.3. DEAE Sepharose CL 6B

A amostra precipitada com 60 % de sulfato de amônio (10 ml) foi

aplicada a uma coluna de troca aniônica DEAE sepharose CL 6B (30 x 1,0 cm)

previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 6,0. A

lavagem da coluna ocorreu com o mesmo tampão até A280 nm praticamente

igual a zero. A eluição da atividade se deu aplicando-se tampão fosfato de

sódio 50 mM, pH 6,0 como eluente e um gradiente de NaCl de 0 a 500 mM.

Foram coletadas frações de 2 ml, sob um fluxo de 30 mL/h e as frações

contendo atividade enzimática foram reunidas. Este procedimento foi repetido

seis vezes, aplicando-se no total 60 mL da FI 60 % de sulfato de amônio nesta

coluna, nas mesmas condições.

Aplicou-se também a amostra precipitada com 30 % de sulfato de

amônio (10 mL) na DEAE CL 6B equilibrada com o mesmo tampão fosfato de

sódio 50 mM, pH 6,0. Foram feitas duas aplicaçãoes, repetindo o experimento

anterior acima descrito (FIGURA 13).

As frações coletadas foram separadas em cinco picos, dialisadas contra

água desionizada por 12 horas, em seguida congeladas e concentradas por

liofilização.

49

Extrato < 100 KDa


Pico V

Mono Q HR pH 8,0

Pico II

DE-52 Cellulose

Mananase II

Pico II Pico III Pico IV

Precipitação com Sulfato de Amônio

FI 30% FI 60% FI 80%

Mono Q HR pH 7,0

Pico I Pico I

Pico I Pico II Pico III Pico IV Pico V

Pico I

Extrato < 100 KDa


Pico V

Mono Q HR pH 8,0

Pico II

DE-52 Cellulose

Mananase II

Pico II Pico III Pico IV

Precipitação com Sulfato de Amônio

FI 30% FI 60% FI 80%

Mono Q HR pH 7,0

Pico I Pico I

Pico I Pico II Pico III Pico IV Pico V

Pico I

FIGURA 13 – Fluxograma de purificação de uma mananase a partir do extrato

ultrafiltrado (<100 kDa).

4.9.3.4. Mono Q HR

O pico V do cromatograma da DEAE sepharose CL 6B, obtida da

amostra FI 60 %, foi aplicado a uma segunda coluna de troca aniônica Mono Q

HR (1,0 x 8,0 cm) previamente equilibrada com tampão fosfato de sódio

50 mM, pH 7,0. Foi aplicado 1 mL de amostra do pico V, previamente

concentrado 4 vezes por liofilização e a eluição foi realizada com o mesmo

tampão a um fluxo de 30 mL/h, adicionado de um gradiente de NaCl de 0 a

500 mM a partir do volume de 20 mL. Foram coletadas frações de 2 mL a partir

da aplicação da amostra e analisadas a 280 nm e quanto às atividades

enzimáticas de interesse.

A fração V da DEAE sepharose CL 6B foi novamente aplicada na

Mono Q, porém a coluna foi equilibrada com tampão fosfato de sódio 50 mM,

pH 8,0.

50

Foram aplicados 10 mL de amostra do pico V nas mesmas condições

anteriores em cinco aplicações de 2 mL cada, adicionados de um gradiente de

NaCl de 0 a 500 mM a partir do volume de 20 mL. Foram coletadas frações de

2 mL a partir da aplicação da amostra e analisadas a 280 nm e quanto às

atividades enzimáticas de interesse.

As frações correspondentes aos picos de absorbância em

espectrofotômetro no comprimento de onda de 280 nm foram dialisadas contra

água deionizada até a condutividade de aproximadamente 3 mS. O pico II

correspondente às proteínas que ficaram ligadas a esta resina de troca iônica

foi em seguida concentrado 2 vezes por liofilização e eluído em uma outra

coluna de troca iônica, com o objetivo de separar as enzimas presentes neste

pico.

4.9.3.5. DE- 52 Cellulose

Nesta etapa do processo de purificação a resina de troca iônica DE-52

Cellulose (Whatman) (20 x 1,5 cm) foi equilibrada com tampão tris-HCl pH 9,0,

50mM, na tentativa de separar as proteínas presentes no pico II da Mono Q HR

que ficaram ligadas à resina em pH 8,0. Foram aplicados 10 mL do pico II com

o tampão tris-HCl 50mM, pH 9,0 de equilíbrio adicionado de um gradiente de

NaCl de 0 a 500 mM a partir do volume aproximado de 60 mL sob um fluxo de

30 mL/h. As frações coletadas de 5 mL cada a partir da aplicação da amostra

foram analisadas a 280 nm e quanto às atividades enzimáticas de interesse.

As frações correspondentes aos picos de absorbância a 280 nm foram

concentradas 5 vezes por liofilização e o perfil protéico foi analisado por

eletroforese em gel desnaturante (SDS-PAGE).

4.10. ELETROFORESE

4.10.1. Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (SDS-PAGE)

As eletroforeses sob condições desnaturantes foram realizadas em gel

de poliacrilamida de duas fases de diferentes porosidades e valores de pH, na

51

presença de SDS (dodecil sulfato de sódio) (ALFENAS et al., 1991). O

aparelho utilizado foi um Hoefer / Mini VE Vertical Electrophoresis System

(Amersham Bioscience), com placas de vidro (10 x 10 cm) onde os géis foram

montados. A cuba para eletroforese foi preenchida com tampão Tris/glicina

pH 8,9, diluído 1:10 em água desionizada com 1 % de SDS antes do início de

cada corrida.

4.10.2. Preparo dos géis desnaturantes (SDS-PAGE)

Géis de poliacrilamida foram formados por copolimerização de

acrilamida e Bis-acrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônio e

tetrametiletilenodiamina (TEMED). Os componentes acrílicos foram preparados

segundo LAEMMLI, (1970) em duas fases, chamada de sistema descontínuo,

que consiste de géis, concentrador e separador.

Os géis concentradores e separadores foram preparados com os

componentes descritos a seguir:

4.10.2.1. Gel concentrador

Soluções Concentração 4,5 %

Acrilamida: Bis-acrilamida (36,5:1) 2,25 mL

Tris-HCI 0,6173M pH 6,8 1,5 mL

Água desmineralizada (q.s.p.) 11,15 mL

SDS 10 % (p/v) 0,075 mL

Persulfato de amônio 10 % (p/v) 0,05 mL

TEMED 0,01 mL

52

4.10.2.2. Gel separador

Soluções Concentração

10 % 12,5 % 15 %

Acrilamida: Bis-acrilamida (36,5:1) 10,0 mL 12,5 mL 15,0 mL

Tris-HCI 3,778 M pH 8,9 3,0 mL 3,0 mL 3,0 mL

Água destilada 16,71 mL 14,21 mL 11,71 mL

SDS 10 % (p/v) 0,150 mL 0,150 mL 0,150 mL

Persulfato de amônio 10 % (p/v) 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL

TEMED 0,04 mL 0,04 mL 0,04 mL

4.10.3. Preparo das amostras As amostras para as corridas eletroforéticas foram preparadas

colocando-as dentro de frascos “Ependorf” 30 µL de amostra e 10 µL de

tampão da amostra. Os volumes foram cuidadosamente injetados no gel de

eletroforese e após a corrida, as bandas de proteínas foram reveladas por

técnicas de coloração com nitrato de prata ou por coloração com Azul de

Coomassie (ALFENAS et al., 1991).

4.10.4. Sephadex G-25

Uma amostra de 1000 mL do extrato inicial foi concentrada 10 vezes por

liofilização até apresentar uma quantidade suficiente de proteína para a

realização da eletroforese. A amostra concentrada foi então eluída em uma

coluna Sephadex G-25 (100 x 1,6 cm) com fluxo de 1,0 mL/min de água

deionisada pH 5,6. Após a eluição os volumes contendo as atividades

enzimáticas foram recolhidos e concentrados para a realização da eletroforese.

O V0 da coluna foi determinado com a eluição de uma alíquota do padrão Azul

Dextran (2 x 106 g/mol).

53

4.10.5. Preparo do tampão da Amostra

Tris-HCI 1 M pH 6,8 2 mL

SDS 10 % (p/v) 4 mL

β-Mercaptoetanol 2 mL

Glicerol 5 mL

Azul de bromofenol 0,01 g

4.10.6. Coloração com nitrato de prata

Após a corrida eletroforética as bandas protéicas presentes no gel foram

reveladas por impregnação com nitrato de prata da seguinte forma: o gel foi

incubado por 30 minutos em uma solução contendo 100 mL de etanol (99,8 %),

25 mL de ácido acético glacial (99,7 %) e água destilada em quantidade

suficiente para completar 250 mL de solução. Em seguida o gel foi transferido e

mantido por mais 30 minutos em uma solução contendo 75 mL de etanol

(99,8 %), 1,25 mL de glutaraldeído (25 %), 10 mL de tiossulfato de sódio (5 %),

17 g de acetato de sódio e água destilada em quantidade suficiente para

completar 250 mL desta solução. O gel foi então lavado com água destilada por

3 vezes, permanecendo em contato com a água por 15 minutos no total. Após

as lavagens o gel foi incubado em outra solução contendo 25 mL de nitrato de

prata (2,5 %), 0,1 mL de formaldeído (37 %) e água destilada completando o

volume da solução para 250 mL Nesta solução o gel permaneceu ao abrigo da

luz por 20 minutos. Novamente, o gel foi lavado com água destilada e em

seguida adicionado a uma solução contendo 6,25 g de carbonato de sódio

anidro, 0,05 mL de formaldeído (37 %) e água destilada em quantidade

suficiente para 250 mL de solução, onde permaneceu até o aparecimento das

bandas de proteínas impregnadas por nitrato de prata. A reação foi então

interrompida por uma solução contendo 3,65 g de EDTA em 250 mL de água

destilada. Todas as soluções foram preparadas no momento do uso.

54

4.10.7. Coloração com Azul de Coomassie

As bandas protéicas presentes no SDS-PAGE foram visualizadas após a

sua incubação por 12 horas a 36 ºC, em 0,1 g de Azul de Coomassie dissolvido

em solução fixadora (45 mL de metanol, 10 mL de ácido acético glacial e 45 ml

de água destilada). Após este tempo de incubação na solução corante o gel foi

lavado por diversas vezes com a solução fixadora.

4.10.8. Detecção de atividade de xilanase no gel de eletroforese

Os géis de poliacrilamida utilizados para a determinação da atividade de

xilanase também foram formados por copolimerização de acrilamida e Bis-

acrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônio e tetrametiletilenodiamina

(TEMED). Porém com uma concentração final de 0,1 % de xilana de “oat-spelt”

no gel.

4.10.8.1. Gel concentrador com xilana


4,5 %

Acrilamida: Bis-acrilamida (36,5:1) 2,25 mL

Tris-HCI 0,6173M pH 6,8 1,5 mL

Água desmineralizada (q.s.p.) 9,65 mL

SDS 10 % (p/v) 0,075 mL

Persulfato de amônio 10 % (p/v) 0,05 mL

TEMED 0,01 mL

Solução de xilana “oat spelt” 1 % 1,5 mL

55

4.10.8.2. Gel separador com xilana


12,5 % 15 %

Acrilamida: Bis-acrilamida (36,5:1) 12,5 mL 15,0 mL

Tris-HCI 3,778 M pH 8,9 3,0 mL 3,0 mL

Água destilada 11,21 mL 8,71 mL

SDS 10 % (p/v) 0,150 mL 0,150 mL

Persulfato de amônio 10 % (p/v) 0,1 mL 0,1 mL

TEMED 0,04 mL 0,04 mL

Solução de xilana “oat spelt” 1 % 3,0 mL 3,0 mL

Após a corrida eletroforética o gel foi transferido para uma solução 2,5 %

de triton X-100, onde permaneceu por 1 hora. Foi então lavado 3 vezes com

água deionizada e incubado em tampão MES/NaOH pH 6,0 por 4 horas a

50 ºC. O tampão foi então removido com água deionizada e adicionou-se ao

gel uma solução de Vermelho Congo 0,1 % (Vetec Química Fina Ltda). O gel

permaneceu incubado por 20 minutos nesta solução corante e em seguida foi

lavado com NaCl 1,0 M até a visualização da banda de atividade de xilanase.

Para uma melhor visualização, trocou-se a solução de NaCl por solução de HCl

0,1 M. As bandas de atividade foram visualizadas como halos claros no gel.

4.10.9. Detecção de atividade de β-Glicosidase no gel de eletroforese

O gel de eletroforese utilizado segue o mesmo procedimento do item

4.9.2, porém sem a presença de SDS no gel, no tampão da amostra e no

tampão do tanque. Após a corrida eletroforética, o gel foi colocado em tampão

acetato de sódio 0,1 M, pH 5,0, por 10 minutos em temperatura ambiente para

ocorrer a troca do pH do sistema. O gel foi então, incubado no mesmo tampão

contendo 0,1 % de esculina (Sigma) e 0,03 % de cloreto férrico por 15 minutos

a 50 ºC. Durante a incubação, observou-se o aparecimento de bandas pretas

56

no gel correspondentes a β-glicosidase. A reação foi interrompida pela imersão

do gel em solução de glicose a 10 % (KWON et al., 1994).

4.11. DOSAGEM DE PROTEÍNAS

O teor de proteínas foi determinado como descrito por

BRADFORD, 1976. A reação foi iniciada pela adição de 0,1 ml de amostra a

1ml do reagente. Após 5 minutos foi feita a leitura a 595 nm. Como padrão

utilizou-se albumina de soro bovino (5-200 µg/ml).

4.11.1. Preparo do reagente de Bradford

O reagente foi preparado pela dissolução de 100 mg de Azul de

Comassie G-250 (CMS) em uma mistura de 100 mL de acido fosfórico a 85 %

e 50 mL de metanol a 95 %. Depois de completa dissolução do corante,

adicionou-se água até completar o volume para 1 L. Esta solução foi estável

por várias semanas quando estocada ao abrigo de luz e em temperatura

ambiente.

4.12. Determinação da massa molar

As massas molares das proteínas presentes foram estimadas por

SDS-PAGE, utilizando-se do gráfico dos logaritmos das massas molares

(log PM) das proteínas padrões pelas suas respectivas mobilidades

eletroforética (cm). Foram utilizados os padrões “LMW, Molar Weight Marker

Kit”, 14.000 – 70.000 Da, Sigma) e o “HMW, Molar Weight Marker Kit”, 205.000

– 30.000 Da, Sigma). Os marcadores foram dissolvidos em 100 µL de tampão

da amostra, fervidos por 15 min e armazenados no congelador. Em cada gel

aplicava-se em uma canaleta um volume de 7,0 µL desta solução padrão.

57

“LMW Molar Weight Marker Kit”;

66,0 kDa – Soroalbumina bovina

45,0 kDa – Ovoalbumina

36,0 kDa – Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase

29,0 kDa – Anidrase carbônica

24,0 kDa – Tripsinogênio

20,1 kDa – Inibidor de tripsina

14,3 kDa – α-Lactoalbumina

“HMW Molar Weight Marker Kit”;

205,0 kDa – Miosina

116,0 kDa – β-Galactosidase

97,4 kDa – Fosforilase b

66,0 kDa – Soroalbumina bovina

45,0 kDa – Ovoalbumina

36,0 kDa – Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase

29,0 kDa – Anidrase carbônica

As colunas de filtração em gel foram calibradas com padrões de massa

molar conhecida: Azul de Dextrana (2 x 106 g/mol), Ovalbumina (45 kDa),

Gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (36 KDa), Tripsinogênio (24 kDa),

Inibidor de Tripsina (20,1 kDa), α-Lactalbumina (14,2 kDa) e Acetona

(57 g/mol). Os volumes de eluição de cada padrão foram determinados (Ve),

estabelecendo o Vt e o V0 de cada coluna, sendo assim, foi calculado o Kav de

cada padrão. As massas molares das enzimas foram então calculadas através

do gráfico do log das massas molares contra o Kav das proteínas padrões.

V0 = volume de exclusão;

Ve = volume de retenção;

Vt = volume total da coluna;

Kav = Ve -VoVt - Vo

Kav = Ve -VoVt - Vo

58

4.13. Determinação dos parâmetros cinéticos

A constante de Michaelis-Menten (Km) e a velocidade máxima (Vmáx)

foram calculadas mediante distribuição dos dados no gráfico dos duplos

recíprocos de velocidade de reação versus concentração de substrato, de

acordo com o método de LINEWEAVER e BURK (1934) segundo o programa

Enzyplot (LEONE et al., 1995).

As propriedades cinéticas da β-glicosidase purificada foram determinadas

realizando-se ensaios de atividade da enzima com celobiose como substrato

em concentrações de 0,036 mg/mL, 0,09 mg/mL, 0,18 mg/mL, 0,27 mg/mL,

0,36 mg/mL, 1,8 mg/mL, 3,6 mg/mL e 5,4 mg/mL. 1,0 mL de solução de

celobiose nas diferentes concentrações, 0,9 mL de tampão acetato de sódio

50 mM, pH 5,4 e 0,1 mL da enzima purificada foram incubados a 50 ºC por

30 minutos. A reação foi interrompida fervendo os tubos por 5 minutos e após

resfriamento das amostras a concentração de glicose no meio foi determinada

através do aparelho Biochemistry Analyzer (YSI BIOANALYTIVAL). A

calibração do aparelho foi feita com um branco de celobiose para cada

concentração, onde se substituiu a enzima pelo tampão.

Determinou-se também as propriedades cinéticas da β-glicosidase

utilizando pNPG como substrato em concentrações de 0,01 mg/mL,

0,02 mg/mL, 0,04 mg/mL, 0,06 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL,

0,75 mg/mL 1,0 mg/mL e 2,5 mg/mL. As atividades de β-glicosidase foram

determinadas de acordo com o método de TAN et al. (1987).

Os parâmetros cinéticos da reação catalisada pela xilanase foram

determinados utilizando xilana de bétula em concentrações de 1,0 mg/mL,

1,5 mg/mL, 3,0 mg/mL, 6,0 mg/mL, 12,0 mg/mL, 18,0 mg/mL e 20,0 mg/mL

como substrato. Após 30 minutos de incubação, as atividades de xilanase

foram determinadas de acordo com o método de BAILEY et al. (1992).

Para mananase purificada utilizou-se galactomanana em concentrações

de 0,25 mg/mL, 0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL, 2,0 mg/mL, 4,0 mg/mL, 6,0 mg/mL e

8,0 mg/mL como substrato. Após 30 minutos incubação, as atividades de

mananase foram determinadas de acordo com o método de RATTO e

POUTANEN (1988).

59

4.14. Efeitos de compostos na atividade

Para se avaliar os efeitos de alguns compostos sobre as enzimas

purificadas, incubou-se 0,05 mL de cada enzima purificada com 0,02 mL de

glicose, uréia, SDS, EDTA, Cisteína, ZnSO4, MnCl2, MgCl2, (NH4)2SO4, KCl,

CuSO4, FeCl3 LiCl e AgNO3 por 10 minutos a 50 ºC (concentração final de

1 mM). Adicionou-se então, 0,03 mL de tampão acetato de sódio 50 mM,

pH 5,4 e o substrato correspondente a cada enzima. A mistura permaneceu

mais 20 minutos a 50 ºC. Após este período de incubação as atividades destas

enzimas foram avaliadas.

Ensaios controles foram realizados paralelamente, substituindo o volume de

inibidor por tampão e considerando a atividade da enzima sem os compostos

igual a 100 %.

4.15. Efeito da temperatura

A temperatura ótima das enzimas presentes no extrato inicial foi

determinada nas temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70 e 80 ºC. As atividades

enzimáticas para xilanase, mananase, endoglucanase, β-glicosidase e β-

xilosidase foram avaliadas seguindo os métodos padrões para cada enzima

anteriormente descritos.

A temperatura ótima da β-glicosidase purificada foi determinada nas

temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70 e 80 ºC por 10 minutos e após o período de

incubação a atividade da β-glicosidase foi determinada de acordo com o

método de TAN et al. (1987).

A temperatura ótima da xilanase purificada foi determinada nas

temperaturas de 30, 40, 50, 60, 70 e 80 ºC por 1 hora. Após este período de

incubação, a atividade da xilanase foi determinada pelo método de BAILEY et

al. (1992).

4.16. Efeito do pH

O pH ótimo das enzimas presentes no extrato inicial foi determinado

utilizando tampão citrato-fosfato 50 mM (pH 2,5 - 7,0) e fosfato de sódio 50 mM

60

(pH 7,0 - 8,0). As atividades enzimáticas para xilanase, mananase,

endoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase foram avaliadas seguindo os

métodos padrões para cada enzima anteriormente descritos.

O pH ótimo da β-glicosidase purificada foi determinado por incubação de

0,02 mL da enzima purificada e 0,180 mL de tampão acetato de sódio pH 4,8

em 0,8 mL de soluções de pNPG 0,1 % em tampão citrato-fosfato 50 mM

(pH 2,5 - 7,0) e fosfato de sódio 50 mM (pH 7,0 - 8,0), por 10 minutos a 50 oC.

Após o período de incubação as atividades foram determinadas de acordo com

o método de TAN et al. (1987).

O pH ótimo da xilanase purificada foi determinado por incubação de

0,1 mL da enzima por 1 hora a 50 ºC em 0,9 mL de soluções de xilana de

bétula 1 % preparadas em tampão citrato-fosfato 50 mM (pH 2,5 - 7,0) e fosfato

de sódio 50 mM (pH 7,0 - 8,0). Após este período de incubação, as atividades

das xilanases foram determinadas de acordo com o método de BAILEY et al.

(1992).

4.17. Estabilidade Térmica

A estabilidade térmica das enzimas presentes no extrato inicial foi

determinada nas temperaturas de 40, 50 e 60 oC, incubando-as nas

respectivas temperaturas por períodos de 3 até 8 horas, separadamente dos

substratos. Após estes períodos foram determinadas as atividades enzimáticas

das mesmas.

4.18. Estabilidade ao pH

A estabilidade ao pH enzimas presentes no extrato inicial foi

determinada em pH 3,5, 5,0 e 6,5 em tampão fosfato-citrato 50 mM e

incubados a 50 oC por períodos de até 6 horas, separadamente dos substratos.

Após estes períodos foram determinadas as atividades enzimáticas das

mesmas.

61

4.19. Especificidade ao substrato

O estudo da especificidade da β-glicosidase, da xilanase e da mananase

purificadas foi realizado determinando as atividades destas enzimas após

serem incubadas em diferentes substratos e foi expresso em porcentagem de

atividade em relação à máxima atividade detectada para cada enzima. Foram

utilizadas xilana de “birchwood” 1 % (p/v), xilana “oat spelt” 1 % (p/v),

galactomanana 0,5 % (p/v), carboximetilcelulose 0,44 % (p/v), pPNG

0,1 % (p/v) e pNPX 0,1 % (p/v) como substrato.

62

5. RESULTADOS

5.1. ENZIMAS HIDROLÍTICAS PRODUZIDAS POR C. subvermispora

A produção de enzimas hidrolíticas é governada por diversos fatores,

principalmente quando realizada em substratos complexos como a madeira. As

hemiceluloses variam muito entre os diferentes grupos de plantas, variando

assim a acessibilidade da enzima ao substrato e a velocidade de liberação dos

oligossacarídeos, fatores que atuam como indutores ou em alguns casos, como

inibidores da síntese de enzimas. Considerando estas variações, buscou-se

avaliar o perfil protéico das enzimas presentes nos extratos de

C. subvermispora cultivado por 30 dias em cavacos de P. taeda.

Foram realizados no total 20 cultivos em biorreatores e após 30 dias de

incubação, detectou-se atividade enzimática de xilanase entre 388-593 UI/kg;

mananase (256-634 UI/kg); endoglucanase (24-76 UI/kg); β-glicosidase

(24-72 UI/kg) e baixas atividades de β-xilosidase em torno de 0,65-6,5 UI/kg. A

quantidade de proteína no extrato ficou próxima a 0,1 mg/mL. Os níveis de

enzimas obtidos após a 1ª extração de 4 horas e na 2ª extração de 12 horas

foram próximos, possivelmente pelo maior tempo de contato da solução

tampão com os cavacos na 2ª extração.

Após a realização de duas extrações sucessivas de cada biorreator, os

extratos foram reunidos e ultrafiltrados por membranas (100 kDa). O material

retido e ultrafiltrado foram analisados. As atividades enzimáticas do complexo

xilanolítico (xilanase e mananase) foram mais expressivas que as do complexo

celulolítico (carboximetilcelulose e β-glicosidase) (FIGURA 14).

C. subvermispora produziu baixa atividade de β-xilosidase, concordando com

relatos feito por SOUZA-CRUZ, (2002).

Na fração > 100 kDa, o volume foi reduzido 60 vezes, proporcionando

um aumento na concentração de proteínas e das atividades enzimáticas,

porém não se observou um aumento proporcional das atividades enzimáticas,

exceto para a β-glicosidase.

63

FIGURA 14 – Distribuição das atividades enzimáticas totais nas frações:

extrato inicial ( ), > 100 kDa ( ) e < 100 kDa ( ).

5.2. CARACTERIZAÇÃO DAS HEMICELULASES E CELULASES NO EXTRATO INICIAL

A estabilidade térmica das enzimas e a estabilidade em diferentes

valores de pH, são características importantes para aplicação industrial e para

o sucesso dos processos de purificação. Várias técnicas para purificação de

proteínas vem sendo empregadas, porém acredita-se que a chave para o obter

sucesso no processo de purificação é a seleção de uma técnica apropriada que

maximize o rendimento, levando em consideração a estabilidade das enzimas

em diferentes temperaturas e diferentes valores de pH. Além disso,

informações importantes podem ser adquiridas com o conhecimento do pI, da

massa molar e da hidrofobicidade das enzimas de interesse, permitindo uma

eficiente escolha do processo de purificação a ser utilizado (SÁ-PEREIRA et

al., 2003).

As enzimas apresentaram pH ótimos de atividade na faixa ácida. A

xilanase apresentou uma curva de pH com um patamar entre 3,5 e 4,0 e o

pH ótimo de 5,0. A partir deste valor a atividade enzimática reduziu e em

pH 8,0 encontrava-se apenas 20 % da atividade de xilanase (FIGURA 15). A

atividade de β-xilosidase foi ótima em pH 4,5 e da mesma forma que observado

para a xilanase a atividade reduziu em valores de pH elevados alcançando um

patamar correspondente a 20 % do valor da atividade máxima. A β-glicosidase

0

100

200

300

400

500

600

xilanase mananase endoglucanase xlosidase glicosidase

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (U

I/kg)

64

apresentou atividade máxima em pH 4,0 e a mananase em pH 4,5, porém

acima de pH 7,0 não se detectava atividade enzimática. O pH ótimo da

carboximetil celulase foi o mais baixo (3,5) e acima de pH 6,0 a atividade

desapareceu completamente.

A temperatura ótima da xilanase foi 55 ºC e para as outras enzimas o

valor foi 60 ºC. A β-glicosidase, mananase e carboximetil celulase foram

inativadas a 80 ºC, enquanto que xilanase e β-xilosidase permaneceram com

parte da atividade a esta temperatura (FIGURA 16).

A estabilidade das enzimas à temperatura foi avaliada durante 6 h

resultando em maior estabilidade a 40 oC, destacando a β-glicosidase que

apresentou maior estabilidade em relação às outras enzimas (FIGURA 17).

Com relação ao pH, verificou-se que as enzimas foram mais estáveis em pH

5,0, novamente a β-glicosidase foi a enzima mais estável (FIGURA 18).

Para o acompanhamento do perfil protéico, uma amostra obtida do pré-

tratamento para remoção de cor, em sephadex G25, foi aplicada no gel de

poliacrilamida (SDS-PAGE) e pode-se identificar 9 bandas com massas

molares correspondentes a 110 kDa, 85 kDa, 60 kDa, 56 kDa, 52 kDa e

51 kDa, 45 kDa, 36 kDa e 21 kDa (FIGURA 19).

65

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8pH

Glicosidase

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8pH

Xilosidase

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8pH

Xilanase

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8pH

Mananase

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

0

20

40

60

80

100

120

2 3 4 5 6 7 8pH

Endoglucanase

FIGURA 15 – Efeito do pH a 50 ºC na atividade da β-glicosidase, β-xilosidase,

xilanase, mananase e CMCase, presente no extrato enzimático

de C. subvermispora

66

0

20

40

60

80

100

120

20 40 60 80Temperatura ºC

Glicosidase

0

20

40

60

80

100

120

20 40 60 80Temperatura ºC

Xilosidase

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

0

20

40

60

80

100

120

20 40 60 80 100Temperatura ºC

Xilanase

0

20

40

60

80

100

120

20 40 60 80 100Temperatura ºC

Mananase

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

0

20

40

60

80

100

120

20 40 60 80 100Temperatura

Endoglucanase

FIGURA 16 – Efeito da temperatura na atividade da β-glicosidase e da

β-xilosidase em pH 4,8 e da xilanase, mananase e CMCase em

pH 5,4, presente no extrato enzimático de C. subvermispora.

67

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Tempo (horas)

B-gl

icos

idas

e (%

)

40 oC 50 oC 60 oC

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Tempo (horas)

B-x

ilosi

dase

(%)

40 oC 50 oC 60 oC

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Tempo (horas)

xila

nase

(%)

40 oC 50 oC 60 oC

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Tempo (horas)

man

anas

e (%

)

40 oC 50 oC 60 oC

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9Tempo (horas)

endo

gluc

anas

e (%

)

40 oC 50 oC 60 oC


CMCase do extrato enzimático de C. subvermispora em relação

a valores de temperatura.

68

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Tempo (horas)

B-gl

icos

idas

e (%

)

pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7

Tempo (horas)

B-xi

losi

dase

(%)

pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (horas)

xila

nase

(%)

pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (horas)

man

anas

e (%

)

pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 3 4 5 6 7Tempo (horas)

endo

gluc

anas

e (%

)

pH 3,5 pH 5,0 pH 6,5


CMCase do extrato enzimático de C. subvermispora em relação

a valores de pH.

69

1 2

116 kDa

97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa


corado com nitrato de prata, do extrato inicial. 1 – marcadores de

massa molar; 2 – bandas de proteínas presentes no extrato

inicial após Sephadex G-25.

70

5.3. PURIFICAÇÃO DAS ENZIMAS HIDROLÍTICAS

Várias estratégias foram utilizadas na purificação de enzimas, uma vez

que os extratos apresentavam forte pigmentação e baixo teor de proteína, que

interferiam na purificação das enzimas. Em vista destes problemas foram

testadas diferentes colunas de troca iônica, de permeação em gel e de

afinidade, com variações de tampão, pH e força iônica. Porém, poucas colunas

foram capazes de separar as enzimas presentes nos extratos.

5.3.1. Purificação de duas xilanases e uma mananase a partir do extrato inicial

5.3.1.1. DEAE - Sepharose CL - 6B

Um volume de 150 mL do extrato inicial foi aplicado na coluna de troca

iônica DEAE-Sepharose CL 6B, tendo sido obtidos cinco picos de proteína

(FIGURA 20). O pico I apresentou atividade sobre xilana, os picos II, III e IV

apresentaram baixa atividade de endoglucanase e xilanase e o pico V

apresentou atividade sobre xilana e manana. As frações coletadas referentes

ao pico I foram reunidas e a purificação obtida nesta etapa foi de 30 vezes

(TABELA 3). Essa amostra foi submetida à eletroforese em condições

desnaturantes tendo sido verificada a presença de uma proteína (FIGURA 21).

Pela análise do zimograma em paralelo com o gel desnaturante de

poliacrilamida confirmou-se a purificação da enzima de 79 kDa coincidindo com

uma atividade xilanolítica (FIGURA 21).

Os picos II, III e IV foram concentrados separadamente e aplicados em

gel desnaturante de poliacrilamida, apresentado apenas uma banda de

proteína de 29 kDa (FIGURA 22). Nos volumes correspondentes a estes picos

encontrou-se principalmente atividade de xilanase.

O pico V foi separado em duas frações de acordo com as atividades

enzimáticas detectadas. A 1ª fração correspondente ao volume entre 2080 a

2520 mL e 2ª fração correspondente a 2560 e 2780 mL. A fração do pico V que

apresentou apenas atividade de mananase foi reunida e concentrada, em

seguida uma amostra do concentrado foi aplicada em gel desnaturante de

71

poliacrilamida. Uma purificação de 9,9 vezes foi obtida (TABELA 4) e uma

única banda de proteína de aproximadamente 156 kDa pode ser observada em

SDS-PAGE (FIGURA 23).

FIGURA 20 – Perfil da cromatografia do extrato inicial em coluna de troca

iônica DEAE Sepharose CL 6B, eluído com tampão acetato de

sódio 50 mM, pH 5,8 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM.

TABELA 3 – Purificação de uma xilanase de 79 kDa através da coluna DEAE

CL 6B

Etapas Volume (mL)

Atividade (UI)

Proteína Total (mg)

Atividade específica

(UI/mg prot)

Recuperação (%)

Fator de purificação

(vezes) Extrato inicial 150 12,3 23,7 0,518 100,0 1,0

DEAE CL 6 B pico I 10 5,5 0,3 15,950 44,6 30,8

TABELA 4 – Purificação de uma mananase de 156 kDa através da coluna

DEAE CL 6B

Etapas Volume (mL)

Atividade (UI)

Proteína Total (mg)


(UI/mg prot)

Recuperação (%)


(vezes) Extrato inicial 150 5,7 23,7 0,240 100,0 1,0

DEAE CL 6 B pico V 5 2,0 0,8 2,392 34,7 9,9

0

0,0025

0,005

0,0075

0,01

0,0125

0,015

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

volumes de eluição (mL)

Ativ

idad

es e

nzim

átic

as(U

I/mL)

.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs

orbâ

ncia

280

nm

xilanase mananase xilosidase glicosidaseendoglucanase NaCl abs 280 nm

NaC

l (%

)

100

0

72

1 2 A B

97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa

FIGURA 21 – A: Eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida (10 %),

corado com nitrato de prata, do pico I da coluna DEAE CL 6 B.

1 – marcadores de massa molar; 2 – xilanase com

aproximadamente 79 kDa; B: Zimograma para atividade da

xilanase purificada de 79 kDa em gel de atividade para xilanase.

73

2 1

116 kDa 97,4 kDa

66 kDa

45 kDa 29 kDa


corado com nitrato de prata, dos picos II, III e IV da coluna DEAE

CL 6B. 1 – marcadores de massa molar; 2 – xilanase com

aproximadamente 29 kDa.

1 2

116 kDa97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa


corado com nitrato de prata, do pico V da coluna DEAE CL 6B.

1 – marcadores de massa molar; 2 – mananase com

aproximadamente 156 kDa.

74

5.3.2. Purificação de uma β-Glicosidase e de uma xilanase a partir

do extrato concentrado (> 100 kDa)

5.3.2.1. Sephacryl S-300

Em resultados obtidos neste trabalho pode-se identificar a maior parte

da β-glicosidase na fração retida pela membrana de 100 kDa TABELA 5. Essa

fração foi então aplicada na coluna Sephacryl S-300 HR tendo sido obtido

3 picos de proteína (FIGURA 24) No pico I foi detectada somente atividade de

β-glicosidase. As atividades de xilanase, mananase, β-xilosidase e

β-glicosidase se concentraram no pico II. No pico III foi eluído grande parte da

cor presente na amostra.

As frações correspondentes aos picos de atividade foram reunidas,

concentradas por liofilização e aplicadas em SDS-PAGE, onde foi possível

identificar a presença de uma banda com massa molar de 110 kDa

(FIGURA 25).

TABELA 5 – Purificação de uma β-glicosidase presente no extrato

concentrado (>100 kDa).

Etapas Atividade (UI)

Proteína total (mgT)


(UI/mg prot)

Recuperação (%)


(vezes)

Extrato inicial 44,7 408,9 0,109 100,0 1,0

>100 kDa 34,0 82,8 0,411 76,1 3,7

75

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

volume de eluição (mL)

Ativ

idad

es e

nzim

átic

as (U

I/mL)

.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs

orbâ

ncia

280

nm

xilosidase glicosidase absorbância 280 nm

B


Sephacryl S-300 do extrato concentrado após ultrafiltração,

eluído com tampão acetato de sódio 50 mM, pH 5,4.

A: atividades de xilanase, mananase e endoglucanase,

β-glicosidase e β-xilosidase representadas no cromatograma;

B: atividade somente de β-glicosidase e β-xilosidase

representadas no cromatograma.

0

0,025

0,05

0,075

0,1

0,125

0,15

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

volume de eluição (mL)

Ativ

idad

es e

nzim

átic

as (U

I/mL)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs

orbâ

ncia

280

nm

xilosidase xilanase mananase

endoglucanase glicosidase absorbância 280 nm

A

76

O zimograma para β-glicosidase confirma a purificação desta enzima

com a formação de um halo escuro na mesma região da banda formada no gel

desnaturante de poliacrilamida (FIGURA 27).

O pico II do cromatograma, apresentou uma banda intensa e dispersa

próximo a 53 kDa e logo abaixo uma outra banda em torno de 45 kDa

(FIGURA 26). Foi realizado o zimograma para β-glicosidase do pico II, e

evidenciou-se uma banda com atividade de β-glicosidase próxima a 53 kDa

(FIGURA 28).

A concentração protéica elevada no pico II permitiu que o gel fosse

corado com azul de Comassie, diferentemente das outras amostras que só

apresentaram banda de proteína definida quando corado segundo o método de

impregnação por nitrato de prata. O pico II da Sephacryl S-300 foi então

fracionado na coluna de troca iônica DE-52 Cellulose.

77

1 2

116 kDa

97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa


corado com nitrato de prata, do pico I da Sephacryl S-300. 1 –

marcadores de massa molar; 2 – β-glicosidase purificada.


poliacrilamida com Esculina como substrato. Atividade da

β-glicosidase de 110 kDa purificada.

78

1 2

116 kDa

97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa


corado com Comassie Blue, do pico II da Sephacryl S-300. 1 –

marcadores de massa molar; 2 – pico II da Sephacryl S-300

concentrado.

2 1

66 kDa

45 kDa

29 kDa


poliacrilamida com Esculina como substrato 1 – marcadores de

massa molar; 2 –Atividade da β-glicosidase de aproximadamente

53 kDa presente no pico II da Sephacryl S-300 HR.

79

5.3.2.2. DE-52 Cellulose

O perfil cromatográfico da eluição da amostra nesta coluna de troca

iônica revela a presença de dois picos de proteína (FIGURA 29). O pico I foi

eluído antes do gradiente de NaCl e o pico II representa proteínas que ficaram

aderidas à resina e foram retiradas pelo gradiente de NaCl. Porém os

resultados da determinação das atividades enzimáticas mostram que no pico I

do cromatograma não foram encontradas atividades de nenhuma das cinco

enzimas hidrolíticas de interesse e que no pico II da DE-52 Cellulose

encontraram as atividades de xilanase, mananase, β-glicosidase e β-xilosidase,

igualmente presentes no pico II da Sephacryl S-300. Analisando o perfil das

atividades enzimáticas do pico II do cromatograma dividiu-se o mesmo em

3 frações (192 a 232 mL; 240 a 264 mL; e 272 a 288 mL). Estas frações foram

concentradas por liofilização e aplicadas em SDS-PAGE (FIGURA 30).

Analisando o gel, observa-se que apenas a fração 192 a 232 (poço 4),

apresenta bandas definidas de proteína. No entanto, não houve separação das

proteínas inicialmente eluídas na coluna. O perfil de proteína desta fração foi

semelhante ao do pico II da Sephacryl S-300 antes da eluição nesta DE-52

Cellulose. Identifica-se apenas uma melhora na definição das bandas tornando

possível estimar as massas molares de três proteínas quando comparadas

com a corrida dos marcadores molares. As massas molares das proteínas

foram estimadas em 65 kDa, 44 kDa e 31 kDa.

80


Cellulose do pico II da Sephacryl S-300, eluído com tampão

acetato de sódio 50 mM, pH 5,4 e gradiente de NaCl de 0 a

500 mM

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0,025

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300volumes de eluição (mL)

Ativ

idad

es e

nzim

átic

as (U

I/mL)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs

orbâ

ncia

280

nm

glicosidase xilosidase xilanasemananase endoglucanase NaClabs 280 nm

NaC

l (%

)

100

0

81

1 2 3 4

97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa


corado com prata, do pico II da DE-52 Cellulose. 1 – marcadores

de massa molar; 2 – fração 272 a 288; 3 – fração 240 a 264 e

4 – fração 192 a 232 com bandas de aproximadamente 65 kDa,

44 kDa e 31 kDa.

82

5.3.2.2.1. Concanavalina A

Uma vez que não foi possível separar as proteínas presentes no pico II

do cromatograma da Sephacryl S 300, através da coluna de troca iônica DE 52

Cellulose, uma amostra deste pico II foi aplicada na coluna de afinidade

Concavalina A.

O perfil cromatográfico desta coluna mostra dois picos de proteína e as

análises das atividades revelam atividades de xilanase e mananase no pico I

(FIGURA 31). As frações contendo estas atividades foram reunidas e

concentradas 4 vezes por liofilização e aplicadas em gel SDS. Pode-se

observar a presença de duas bandas de proteína com massas molares de

aproximadamente 66 kDa e 30 kDa nas duas canaletas com amostras dos dois

picos do cromatograma (FIGURA 33). Como esta coluna não foi capaz de

separar as proteínas, a fração correspondente ao pico I da Concanavalina A,

onde se encontrava maior atividade enzimática e maior teor de proteína, foi

aplicada em uma coluna de permeação em gel Sephadex G-50 obtendo-se

dois picos de proteína, com atividade de xilanase e mananase (FIGURA 32).

Entretanto, o gel apresentou uma banda inferior às encontradas até o

momento, mas que havia sido identificada no gel do extrato inicial

(FIGURA 19), com massa molar de 21 kDa (FIGURA 34). Os dois picos

apresentaram atividades muito baixas de xilanase e mananase, levando-nos a

acreditar que uma parte das enzimas ficou aderida à resina da Sephadex G-50.

Os resultados obtidos indicam que no extrato concentrado encontram-se

uma β-glicosidase de 110 kDa, uma mananase de aproximadamente 65 kDa,

duas xilanases, uma de aproximadamente 21 kDa e outra de 30 kDa.

83

FIGURA 31 – Perfil da cromatografia em coluna de afinidade Concavalina A do

pico II da Sephacryl S-300, eluído com tampão acetato de sódio

50 mM, pH 5,4 e gradiente de NaCl de 0 a 500 mM.


Sephadex G-50 do pico I da Con A, eluído com tampão acetato

de sódio 50 mM, pH 5,4.

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60volumes de eluição (mL)

Ativ

idad

es e

nzim

átic

as (U

I/mL)

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

Abs

orbâ

ncia

280

nm

xilanase mananase xilosidaseglicosidase endoglucanase NaClabs 280 nm

NaC

l (%

)

100

0

0

0,001

0,002

0,003

0,004

0,005

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

volumes de eluiçã (mL)

Ativ

idad

es e

nzim

átic

as (U

I/mL)

0,0

0,1

0,1

0,2

0,2

0,3

0,3A

bsor

bânc

ia 2

80 n

m

xilosidase xilanase mananaseglicosidase endoglucanase abs 280 nm

84

1 2 3

205 kDa

116 kDa 97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa


corado com prata, do pico I e II do cromatograma da

Concanavalina A. 1 – marcadores de massa molar; 2 – Pico II

bandas de aproximadamente 66 kDa e 30 kDa; 3 – Pico I,

bandas de aproximadamente 66 kDa e 30 kDa.

1 2 3

116 kDa

97,4 kDa

66 kDa

45 kDa

29 kDa


corado com prata, do pico I e II do cromatograma da Sephadex

G 50. 1 – marcadores de massa molar; 2 – Pico II banda de

aproximadamente 21 kDa; 3 – Pico I, bandas de

aproximadamente 32 kDa e 21 kDa.

85

5.3.3. Purificação de uma mananase a partir do extrato ultrafiltrado (< 100 kDa)

5.3.3.1. Concentração e fracionamento das proteínas

A separação de proteínas de meios aquosos por precipitação é um dos

métodos industriais mais importantes de recuperação e pré-purificação destas

moléculas (CORTEZ e PESSOA Jr, 1999). Assim, a seqüência da purificação

do extrato ultrafiltrado em membranas de 100 kDa (<100 KDa) foi dada pela

precipitação do extrato com sulfato de amônio.

A etapa de precipitação fracionada com sulfato de amônio, possibilitou a

separação do extrato ultrafiltrado, em três frações as quais foram analisadas

quanto às atividades enzimáticas e concentrações protéicas. Os resultados

mostraram que a precipitação fracionada com 30 %, 60 % e 80 % de sulfato de

amônio foi responsável por uma grande perda no valor das atividades

enzimáticas. A maior parte das proteínas (60 %) também não foi recuperada

(FIGURA 35).

FIGURA 35 – Recuperação total das atividades enzimáticas e do teor de

proteina após precipitação fracionada com 30 %, 60 % e 80 %

de sulfato de amônio.

A precipitação de xilanase com sulfato de amônio resultou em 18 % de

recuperação, enquanto 60 % da mananase foi recuperada neste processo. Foi

0102030405060708090

100

xilanase mananase endoglucanase xilosidase glicosidase proteína

Rec

uper

ação

(%)

86

possível observar que a maior recuperação ocorreu com a mananase e que a

recuperação de xilanase foi maior que a recuperação do complexo celulolítico.

Os precipitados mesmo após diálise apresentaram uma forte

pigmentação. Apesar da concentração de proteínas ser mais alta nestas

amostras, não foi possível identificar bandas nos géis de eletroforese, pois os

compostos coloridos interferiram na resolução dos géis preparados com as

amostras precipitadas.

5.3.3.2. Extração de fenóis com PVP (polivinilpirrolidona)

Visando diminuir a presença de interferentes fenólicos no extrato

ultrafiltrado, três amostras de 150 mL cada, foram tratadas com 1 %, 2 % e 5 %

de PVP separadamente, para a adsorção seletiva dos fenóis. Este tratamento

resultou em extratos com menos pigmento, porém com uma recuperação

enzimática muito baixa (menos de 10 %), não sendo aplicado na seqüência

deste trabalho. As amostras tratadas com 1 % e 2 % de PVP apresentaram

uma recuperação de 7 % da atividade xilanolitica presente no extrato. Porém

na amostra tratada com 5 % de PVP, não foi possível determinar nenhuma

atividade enzimática, pois foi detectado um aumento no teor de açúcar do

meio, interferindo na leitura das atividades.

5.3.3.2.1. DEAE - Sepharose CL - 6B

Para a purificação das frações precipitadas com 30 %, 60 % e 80 % de

sulfato de amônio, aplicou-se primeiramente na coluna DEAE-Sepharose

CL 6B um volume de 10 mL da fração insolúvel (FI) em 60 % de sulfato de

amônio. Grande parte do pigmento presente ficou retido no início da coluna,

eliminando assim interferentes das frações coletadas. A DEAE CL 6B foi então

considerada como um primeiro passo na purificação da FI 60 % (FIGURA 36).

O pico I do cromatograma após ser concentrado quatro vezes apresentou

atividade somente de xilanase. O pico V, apresentou atividades de xilanase,

mananase, endoglucanase, β-xilosidase e β-glicosidase, dando seqüência ao

processo de purificação.

87

Com a diminuição do pigmento nas frações coletadas e com a

purificação de uma xilanase, aplicou-se também 20 mL da FI 30 % na DEAE

CL 6B equilibrada com o mesmo tampão acetato de sódio 50 mM, pH 6,0.

Obtendo-se um perfil cromatográfico igual ao DEAE CL 6B eluído com

amostras da FI 60 %.

0

0,0005

0,001

0,0015

0,002

0 10 20 30 40 50 60 70


Ativ

idad

es e

nzim

átic

as (U

/mL)

.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

abso

rbân

cia

280

nm

glicosidase xilosidase NaCl abs 280 nm

NaC

l (%

)

100

0

B

FIGURA 36 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica DEAE CL 6B

da FI 60 % de sulfato de amônio, eluído com tampão acetato de

sódio 50 mM, pH 6,0 e gradiente de NaCl 0 – 500 mM.

A: atividades de xilanase, mananase, endoglucanase,

β-glicosidase e β-xilosidase; B: atividades somente de

β-glicosidase e β-xilosidase.

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0 10 20 30 40 50 60 70


Ativ

idad

e en

zim

átic

a (U

/mL)

.

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

abso

rbân

cia

280

nm

xilanase mananase endoglucanaseglicosidase xilosidase NaClabs 280 nm

NaC

l (%

)

100

0

A

88

5.3.3.2.2. MONO Q H/R

Na tentativa de separar as proteínas presentes no pico V obtido da coluna

DEAE CL 6B, amostras foram aplicadas na coluna de troca iônica Mono Q

HR 5/5 equilibrada com tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0. O

cromatograma apresentou apenas um pico de proteína e a determinação das

atividades das cinco enzimas hidrolíticas de interesse nos volumes coletados

mostrou que não houve separação das mesmas. Como alternativa, o pH do

mesmo tampão foi alterado para 8,0. Este procedimento resultou na eluição de

uma fração. Após aplicação do gradiente de NaCl outra fração protéica foi

eluída da coluna (FIGURA 37).

Observa-se nos dois picos de proteína valores próximos de atividade de

mananase e endoglucanase, porém pode ser visto uma maior atividade de

xilanase no pico II.

0

0,005

0,01

0,015

0,02

0 10 20 30 40 50 60

volumes coletatos (mL)

ativ

idad

es (U

/mL)

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

abso

rbân

cia

280

nm

xilanase mananase endoglucanaseglicosidase xilosidase NaClproteina

NaC

l (%

)

100

0

FIGURA 37 – Perfil da cromatografia em coluna de troca iônica Mono Q do pico

V da DEAE CL 6B, eluído com tampão fosfato de sódio 50 mM,

pH 8,0 e gradiente de NaCl 0 – 500 mM e gradiente de NaCl de

0 a 500 mM.

89

5.3.3.2.3. DE- 52 Cellulose III

Na seqüência da purificação, o pico II do cromatograma da Mono Q, foi

dialisado com água desionizada até 3,02 mS e concentrado por liofilização

duas vezes. Após liofilização, 10 mL da amostra foram aplicados na coluna de

troca iônica DE-52 Cellulose equilibrada com tampão tris-HCl 50 mM, pH 9,0,

na tentativa de separar as proteínas que ainda ficaram ligadas à resina em

pH 8,0.

Três picos de proteínas foram separados na coluna. O pico I foi eluído

antes do gradiente de sal e os picos II e III ficaram retidos na coluna sendo

separados posteriormente (FIGURA 38). Logo após a eluição foram

determinadas as atividades enzimáticas das cinco enzimas de interesse, porém

os picos não apresentaram nenhuma atividade. As amostras correspondentes

aos 3 picos foram então dialisadas com água desionizada por 12 horas e

concentradas por liofilização. Estas amostras foram aplicadas em gel SDS

onde se observa uma banda de proteína de massa aproximada de 65 kDa,

correspondente ao pico II da DE-52 Cellulose (FIGURA 39).

0,0

0,2

0,4

0,6

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300volumes eluidos (mL)

Abs

orba

ncia

280

nm

0

20

40

60

80

100

120%

NaC

l

absorbância 280 nm gradiente NaCl


Cellulose do pico II da Mono Q, com tampão Tris-HCl 50 mM,

pH 9,0 e gradiente de NaCl 0 – 500 mM.

90

A mesma banda encontra-se no pico III, porém com outras bandas

difusas de menor massa molar. Entretanto, as frações correspondentes a estes

picos de proteína não apresentaram atividade enzimática mesmo após serem

concentrados. Acredita-se que as enzimas perderam atividade ao permanecer

em contato com o tampão tris-HCl pH 9,0 usado na coluna.

Comparando o gel da FIGURA 39 com o gel da FIGURA 33 pode-se

perceber que ambos apresentam uma banda de aproximadamente 65 kDa,

levendo-nos a inferir que a banda da FIGURA 39 corresponde a mesma

mananase anteriormente descrita.

91

1 2 3

66 kDa

45 kDa 36 kDa

29 kDa

24 kDa

20,1 kDa

14,2 kDa


corado com prata, dos picos e proteína 1, 2 e 3 do

cromatograma da DE- 52 Cellulose eluída com amostra do pico II

da Mono Q HR 5/5. 1 – marcadores de massa molar; 2 – Pico 2,

banda de aproximadamente 65 kDa e 3 – Pico 3, bandas de

aproximadamente 65 kDa, 21 KDa e 16 kDa.

92

5.4. CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DAS ENZIMAS PURIFICADAS

5.4.1. Caracterização bioquímica da β-glicosidase

5.4.1.1. Determinação dos parâmetros cinéticos para β-glicosidase

A β-glicosidase foi incubada na presença de pNPG e celobiose em

diferentes concentrações para estimativa de Km e Vmáx. Com pNPG obteve-se

Km de 0,994 mg/mL e Vmáx de 0,113 UI/mL e para celobiose Km de

0,902 mg/mL e Vmáx de 0,103 UI/mL (FIGURA 40).

0

100

200

300

400

500

-20 0 20 40 601/S

1/V

A

0

10

20

30

40

50

-2 -1 0 1 2 3 41/S

1/V

B


para a β-glicosidase purificada. A: efeito da concentração de

pNPG na atividade da enzima purificada; B: efeito da

concentração de celobiose na atividade da enzima purificada.

5.4.1.2. Efeito da temperatura

A enzima apresentou atividade máxima em 60 ºC com uma pequena

queda até 70 ºC, porém após esta temperatura a enzima apresentou uma

diminuição acentuada da atividade enzimática (FIGURA 41).

93

0

20

40

60

80

100

20 30 40 50 60 70 80 90Temperatura (ºC)

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

FIGURA 41 – Efeito da temperatura na atividade da β-glicosidase purificada.

5.4.1.3. Efeito do pH Na FIGURA 42 observa-se que a β-glicosidase apresentou um pH ótimo

em 3,5 e que após este valor de pH ocorreu um rápido declínio na atividade

enzimática.

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0pH

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

FIGURA 42 – Efeito do pH na atividade da β-glicosidase purificada.

94

5.4.1.4. Efeitos de compostos sobre a atividade da β-glicosidase purificada

A atividade da β-glicosidase foi reduzida na presença de FeCl3 e SDS

(TABELA 6). A glicose não afetou a atividade, enquanto KCl e uréia

aumentaram consideravelmente a atividade da β-glicosidase.

Os compostos CuSO4, ZnSO4, MgCl2, (NH4)2SO4, LiCl e MnCl2 inibiram

fracamente a atividade da enzima purificada, enquanto que EDTA inibiu 70 %

da atividade enzimática.

TABELA 6 – Efeitos de alguns compostos na atividade da β-glicosidase

purificada.

5.4.2. Caracterização bioquímica da xilanase de 79 kDa

5.4.2.1. Determinação dos parâmetros cinéticos para xilanase de 79 kDa

Os valores das constantes cinéticas de Michaelis-Menten para a

xilanase de 79 kDa corresponderam a um Km de 1,648 mg/mL e uma Vmáx de

0,048 UI/mL (FIGURA 43).

Compostos Atividade residual (%)β-glucosidase pura

Controle 100ZnSO4 58Uréia 71Glicose 69SDS 65MnCl2 272MgCl2 73(NH4)2SO4 85KCl 58CuSO4 30FeCl3 144LiCl 102EDTA 94

95

0

10

20

30

40

50

60

70

-0,8 -0,3 0,2 0,7 1,21/S

1/V


para a xilanase de 79 kDa.

5.4.2.2. Efeito da temperatura

O efeito da variação da temperatura sobre a atividade da xilanase de

79 kDa foi avaliado, medindo a atividade da enzima em temperaturas variando

entre 30 e 80 ºC. A enzima apresentou atividade máxima em 50 ºC e foi

desnaturada após esta temperatura (FIGURA 44).

0

20

40

60

80

100

120

20 30 40 50 60 70 80 90Temperatura (ºC)

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

FIGURA 44 – Efeito da temperatura na atividade da xilanase de 79 kDa.

96

5.4.2.3. Efeito do pH

A xilanase de 79 kDa foi incubada em soluções de xilana com valores de

pH variando entre 3,0 e 10,0. Alcançando a máxima atividade em pH 8,0 tendo

um rápido declínio após este pH (FIGURA 45).

0

20

40

60

80

100

120

0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0pH

Ativ

idad

e en

zim

átic

a (%

)

FIGURA 45 – Efeito do pH na atividade da xilanase de 79 kDa.

5.4.2.4. Efeitos de compostos sobre a atividade da xilanase de 79 kDa

Foram analisados o efeito de alguns compostos sobre a atividade da

xilanase de 79 kDa e os resultados estão representados na TABELA 7. A

maioria dos compostos testados teve um efeito discreto na atividade da

enzima. Entretanto AgNO3 e MnCl2 ativaram consideravelmente a enzima

purificada.

TABELA 7 – Efeitos de alguns compostos sobre a atividade da xilanase de

79 kDa.

Compostos Atividade residual (%)xilanase 79 kDa

Enzima pura 100ZnSO4 85CuSO4 90(NH4)2SO4 91FeCl3 90LiCl 91MnCl2 111AgNO3 214EDTA 96

97

5.4.3. Caracterização bioquímica da mananase de 156 kDa

5.4.3.1. Determinação dos parâmetros cinéticos da mananase de 156 kDa

A mananase de 156 kDa apresentou um gráfico de duplo-recíproco

linear e os valores de Km e Vmáx de 0,498 mg/mL; 0,353 UI/mL respectivamente

(FIGURA 46).

0

2

4

6

8

10

-3 -2 -1 0 1 2 3 41/S

1/V


para a mananase de 156 kDa.

5.4.3.2. Efeitos de compostos sobre a atividade da mananase de 156 kDa

A mananase foi incubada com alguns compostos. A enzima teve sua

atividade diminuída na presença da maioria dos compostos testados (TABELA

8). Sua atividade foi totalmente inibida com o íon FeCl3 e somente na presença

do AgNO3 a enzima foi ativada. O EDTA e o SDS também diminuíram a ação

enzimática em 36 e 66 % respectivamente. O aminoácido L Cisteína também

foi responsável pela diminuição da atividade enzimática.

98

TABELA 8 – Efeitos de alguns compostos sobre a atividade da mananase de

156 kDa.

Compostos Atividade residual (%)mananase 156 kDa

Enzima pura 100FeCl3 0AgNO3 103EDTA 64SDS 34L Cisteína 33CuSO4 21(NH4)2SO4 58MnCl2 18

5.4.3.3. Especificidade ao substrato

A especificidade a diferentes substratos das enzimas acima

caracterizadas está apresentada na TABELA 9.

A mananase de 156 kDa não foi específica para manana, apresentando

atividade sobre xilana de birchwood, xilana de oat spelt e carboximetilcelulose.

A xilanase de 79 kDa apresentou resultado semelhante, não sendo específica

para xilana.

TABELA 9 – Especificidade a diferentes substratos das enzimas purificadas.

Substratos Xilanase 79 kDa (%)

Mananase 156 kDa (%)

Xilana birchwood 100 72,9

Xilana oat spelt ND* 81,8

Galactomanana 58,4 100

Carboximetilcelulose 37,8 37,6

pNPG 0 0,1

pNPX 0 0

* ND: Não determinado.

99

6. DISCUSSÃO

6.1. Obtenção do extrato enzimático e análise da atividade das enzimas

Ceriporiopsis subvermispora foi cultivado em cavacos de Pinus taeda

por 30 dias sob condições de biopolpação. O crescimento fúngico foi

homogêneo com uma rede micelial sendo facilmente visível nos cavacos de

madeira a partir do 15º dia de biotratamento, semelhante ao resultado obtido

por SOUZA-CRUZ et al. (2004).

As enzimas extracelulares produzidas durante o processo de

biodegradação foram extraídas dos cavacos e o extrato foi analisado quanto as

atividades de xilanase, mananase, endoglucanase, β-glicosidase e

β-xilosidase, apresentando valores mais baixos de atividade enzimática e

menor concentração protéica que os observados para outros fungos crescidos

sob fermentação em estado sólido de lignocelulósicos (KALOGERIS et al.,

2003).

No entanto, deve-se considerar que a recuperação de enzimas

produzidas em madeira é dificultada pela estrutura repleta de poros do

substrato e pela natureza das proteínas que podem estar agregadas nos

lúmens das células (MACHUCA e FERRAZ, 2001). Além disso, vários autores

relatam que a produção de enzimas em substrato sólido é afetada pelas

condições de cultivo, tal como umidade, pH, temperatura e tipo de biorreator, e

que durante o processo de extração a temperatura, o tipo de solvente, o tempo

de extração e a inter-relação entre outras variáveis devem ser consideradas

como fatores importantes para o processo de extração (MARTINS et al., 2002;

SILVA et al., 2005).

Alguns estudos envolvendo o número de extrações das enzimas de

C. subvermispora foram reportados por SOUZA-CRUZ et al. (2004), que

revelaram que de uma forma geral, todas as atividades enzimáticas foram

recuperadas em maior quantidade na primeira extração, exceção feita aos

casos onde as atividades eram muito baixas. Sendo assim, duas extrações

consecutivas foram realizadas neste trabalho. No entanto, acredita-se que os

níveis de enzima recuperados poderiam ser aumentados após o estudo de

100

algumas variáveis que normalmente afetam as condições de extração. Porém,

um estudo da otimização das condições de extração ainda não foi realizado.

Analisando as atividades enzimáticas determinadas neste trabalho,

verificou-se que a atividade de xilanase e mananase foi cerca de cem vezes

maior que β-xilosidase e dez vezes maior que endoglucanase e β-glicosidase.

A atividade de exoglucanase não foi detectada. Resultado semelhante foi

encontrado por SOUZA-CRUZ et al. (2004), sob as mesmas condições de

cultivo, onde os níveis de atividade de xilanase foram de 778 ± 92 UI/ kg de

cavaco de madeira, porém não foi possível quantificar a atividade de celulases

totais no meio, pelo método padrão com papel de filtro.

Quando C. subvermispora foi cultivado em cavacos de Eucalyptus

grandis, sob condições de fermentação em estado sólido com extrato de malte

como co-substrato, a atividade xilanolítica também foi a principal atividade

hidrolítica encontrada. A máxima atividade xilanolítica foi obtida após 15 dias

de biodegradação (960 UI/ cultura), sendo que com 30 dias se detectava

942 UI/ cultura. Uma menor atividade do complexo celulolítico, 26 UI/ cultura de

β-glicosidase também foi detectada após 30 dias de biodegradação e não foi

possível quantificar a atividade de celulases totais no meio (FERRAZ, et al.,

2003).

SETHURAMAN et al. (1998), entretanto, haviam relatado que a

produção destas enzimas é extremamente dependente da fonte de carbono

presente no meio, mas que em diferentes meios líquidos C. subvermispora

também apresentou maior atividade hemicelulolítica quando comparada às

atividades celulolíticas. Foi também relatado que seu sistema celulolítico é

deficitário em celobiohidrolase, podendo explicar a baixa degradação de

celulose ocasionada também por este fungo (GUERRA et al., 2003).

C. subvermispora tem sido utilizado no processo de biopolpação

(MESSNER e SREBOTNIK, 1994; AKHTAR, et al., 2000). Estudos mostram

que neste processo a seletividade na degradação de lignina é fundamental e

que a produção de um sistema celulolítico incompleto contribui para a eficiência

do processo (FERRAZ et al., 2003, GUERRA et al., 2003). Alguns autores

relatam que o biotratamento de cavacos de madeira com C. subvermispora

aumentou a extensão da remoção de lignina durante a polpação e o

branqueamento, resultando em um maior alvura da polpa dissolvida e também

101

melhorou a seletividade do processo de branqueamento, assim aumentando o

rendimento final da polpação (FERRAZ et al., 1998).

Adicionalmente, a biopolpação de cavacos com C. subvermispora é de

especial interesse econômico para a obtenção de enzimas na própria fábrica

de celulose, possibilitando a sua utilização em outras etapas da fabricação de

celulose, em especial no branqueamento e no refino das polpas. É prioritária a

obtenção de xilanases livres de celulases (CHRISTOV e PRIOR, 1998).

Resultados mostram que polpas tratadas com xilanases e mananases

são mais facilmente branqueadas e apresentam uma melhor qualidade final,

além de tornar o processo menos agressivo para o meio ambiente (VIIKARI et

al., 1994). A baixa produção de celulases e o grande volume de enzimas que

pode ser obtido após a biopolpação de cavacos com C. subvermispora

estimulam a implantação do processo de biopolpação.

Xilanases e celulases são produzidas por C. subvermispora em níveis

que podem ser aplicados no branqueamento da polpa (10 U/g de polpa)

(HEIDORNE et al, 2004). Entretanto as condições de pH e temperatura das

polpas kraft não são muito adequadas para aplicação direta das xilanases e

mananases, pois a polpa é processada em condições fortemente alcalinas e no

final do processo a temperatura é alta (90 ºC). Nestas condições a xilanase e

mananase de C. subvermispora seriam inativadas. É portanto conveniente um

ajuste do pH das polpas para 5,0 e uma redução da temperatura para 40 ºC

antes do tratamento enzimático.

A caracterização das hemicelulases e das celulases produzidas por

C. subvermispora e presentes no extrato inicial revelou que o pH ótimo da

xilanase e da endoglucanase foi de 5,0 e 3,5, respectivamente, enquanto para

as outras enzimas foi de 4,5. A β-glicosidase e a β-xilosidase apresentaram

temperatura ótima de 60 ºC e xilanase, mananase e endoglucanase de 55 ºC.

Estes resultados são semelhantes aos da literatura, onde geralmente as

enzimas hidrolíticas produzidas por fungos apresentam valores de pH entre 3,0

e 7,0 (SETHURAMAN et al.,1998). Além disso, em pH 5,0 estas enzimas foram

mais estáveis. A β-glicosidase, mostrou maior estabilidade nos valores de pH

testados. Estes resultados assemelham-se aos descritos na literatura, onde

enzimas celulolíticas produzidas por P. chrysosporium foram mais

termoestáveis que as xilanolíticas (KHALIL, 2002). Entre as enzimas

102

hemicelulolíticas, xilanase apresentou maior termoestabilidade, permanecendo

com mais de 90 % da sua atividade após 6 horas de incubação a 40 ºC e a

50 ºC e permaneceu com 50 % da atividade após 6 horas a 60 ºC. A

termoestabilidade da xilanase mostrada neste presente estudo pode ser

comparada com xilanases de outros microrganismos, como de Thermomyces

lanuginosus e Bacillus thermoalkalophilus que apresentaram uma meia vida de

108 e 150 minutos a 60 ºC, respectivamente (RAJARAM e VARMA, 1990).

Todavia, encontra-se descrito que xilanases de diferentes

microrganismos são normalmente estáveis numa faixa de pH entre 3 e 10,

apresentando um pH ótimo entre 4 e 7. A temperatura ótima para xilanase de

bactéria e fungos varia de 40 – 60 ºC. Xilanases fúngicas são menos

termoestáveis que as bacterianas. Outras enzimas hemicelulolíticas como

mananases de basidiomicetos também mostram-se especialmente estáveis em

regiões ácidas de pH, com atividade ótima entre pH 3,5 e 5,5 (GÜBITZ, 1996a)

e costumam apresentar uma atividade máxima próximo a 50 ºC. Para

β-glicosidases fungicas entretanto, valores entre 50 e 70 ºC tem sido relatados

como temperatura ótima destas enzimas (YAZDI et al., 2003).

6.2. Purificação e caracterização de hemicelulases e de uma β-glicosidase produzidas por C. subvermispora

Embora vários estudos mostrem que a produção de enzimas

hemicelulolíticas e celulolíticas seja afetada pela natureza do substrato usado

na fermentação, informações sobre estas enzimas produzidas por

basidiomicetos causadores de podridão branca ainda são escassas, sendo a

composição do sistema celulolítico e hemicelulolítico estudada em detalhes

somente em alguns basidiomicetos (BALDRIAN e GABRIEL, 2003). Pouco é

conhecido sobre as enzimas hidrolíticas produzidas por C. subvermispora.

Sabe-se que este fungo produz um sistema hemicelulolítico mais ativo que o

celulolítico, porém nenhuma caracterização destas enzimas ainda foi feita, não

estando completamente descrita a importância e a função destas enzimas na

biopolpação.

Nesta direção, a purificação das enzimas hemicelulolíticas e celulolíticas

produzidas por C. subvermispora após 30 dias de biodegradação foi iniciada

103

com a análise do perfil protéico do extrato inicial em SDS-PAGE. A eletroforese

do extrato inicial apresentou 9 bandas de proteína, sendo que estas bandas

apresentavam intensidade diferenciada, provavelmente devido às diferentes

concentrações protéicas. Não se pode descartar a existência de outras

proteínas no meio, com concentração protéica inferior a detectável pela técnica

utilizada na coloração do gel.

A presença de um conjunto de enzimas produzidas por

C. subvermispora já havia sido relatada anteriormente em trabalhos realizados

por BLANCHETTE et al. (1992) e VICUÑA et al. (1996). Porém, neste último

trabalho foram estudas enzimas lignolíticas produzidas por este fungo em meio

sólido e em meio líquido. Em meio líquido sete isoformas de MnP e quatro

isoenzimas de lacase foram reveladas por “isoelectrofocusing” (IEF). No

entanto, quando crescido em madeira de P. radiata o fungo também produziu

MnP e lacase, e a IEF mostrou que os pontos isoelétricos das lacases

produzidas foram semelhantes aos das lacases produzidas em meio líquido,

mas somente quatro isoformas de MnP foram reveladas com valores de pI

diferentes. As massas molares das MnP produzidas em meio líquido foram

próximas a 52,5 kDa, enquanto das MnP extraídas de madeira variaram de

52,5 kDa a 62,5 kDa (LOBOS et al., 1994; VICUÑA, et al., 1996). Estes

resultados adequam-se à hipótese de que a produção de enzimas por

C. subvermispora é extremamente dependente da fonte de carbono

(SETHURAMAN et al., 1998; VICUÑA et al., 1996).

Durante o processo de purificação das enzimas hemicelulolíticas e

celulolíticas produzidas pelo C. subvermispora, três xilanases, duas

mananases e uma β-glicosidase presentes no extrato enzimático foram

purificadas.

Diferentes etapas foram necessárias para a purificação destas enzimas,

possível razão pela baixa recuperação das mesmas, conforme já apontado por

SÁ-PEREIRA et al. (2003). Além disso, acredita-se que a baixa recuperação

enzimática também foi ocasionada pela presença de pigmento no extrato

enzimático. A pigmentação escura encontrada após extração é principalmente

devida à presença de polifenóis extraídos da madeira. Segundo LEATHAM et

al. (1991), um dos maiores problemas encontrados na extração de enzimas

extracelulares produzidas por fungos em madeira é a grande extração de

104

polifenóis, pois freqüentemente interferem na recuperação enzimática e no

processo de purificação.

Tradicionalmente, métodos para remover polifenóis incluem adsorção de

polifenóis com polivinilpirrolidona (PVP) ou precipitação de proteínas com

sulfato de amônio ou solventes orgânicos. Porém, neste trabalho após alguns

testes com PVP e sulfato de amônio, observou-se uma recuperação muito

baixa das atividades enzimáticas e da concentração de proteína do meio.

Alguns autores mostraram que o sulfato de amônio pode promover maior

floculação das enzimas do que precipitação, ocasionando baixos níveis de

recuperação (GEORIS et al., 2000). Outros resultados são também

encontrados na literatura, onde a precipitação de proteínas com sulfato de

amônio também resulta em baixos níveis de recuperação enzimática, em torno

de 17 % (SÀ-PEREIRA et al., 2003), corroborando com a aceitação dos

resultados agora obtidos.

As xilanases purificadas apresentaram massas molares de 21 kDa,

29 kDa e 79 kDa em SDS-PAGE. Estas massas são próximas às de outras

xilanases de basidiomicetos, tais como xilanases de 20 kDa e 26 kDa de

Sporotrichum dimorphosporum (COMTAT, 1983), de 34,6 kDa de Panus

tigrinus (NAZARETH e SAMPY, 2003), e xilanases de 62 kDa de I. lacteus

(KANDA et al., 1985).

A β-glicosidase de 110 kDa purificada também apresentou massa molar

semelhante às massas molares de β-glicosidases de outros basidiomicetos,

como uma β-glicosidase de 116 kDa de P. chrysosporium (IGARASHI et al.,

2003) e uma β-glicosidase de 107 kDa de S. rolfsii (SHEWALE e SADANA,

1981). Ao mesmo tempo, β-glicosidases com massas molares próximas a

60 kDa também estão relatadas na literatura (CAI et al., 1998), assegurando a

existência da β-glicosidase de 53 kDa parcialmente purificada neste trabalho.

Múltiplas β-glicosidases excretadas por Schisophyllum commune e Neurospora

crassa já foram descritas, apresentando massas molares de 96 e 102 kDa e

178, 106 e 43 kDa (YAZDI et al., 2003), respectivamente. Além disso, pode-se

especular que a β-glicosidase de 53 kDa purificada neste trabalho é uma

glicoproteína, pois ficou aderida à coluna de afinidade Concanavalina A, visto

que esta coluna se liga a glicoproteínas que contêm α-D-manopiranosil e / ou

α-D-glicopiranosil em suas extremidades, à semelhança do resultado

105

encontrado para quatro β-glicosidases purificadas de S. rolfsii (SHEWALE e

SADANA, 1981).

Por outro lado, quando consideramos as mananases purificadas neste

trabalho, observamos que somente a de 65 kDa possui massa molar próxima

às de outros fungos, como a mananase de 61 kDa de S. rolfsii (GÜBITZ et al.,

1996b) e mananases de T. reesei e Trametes versicolor que possuem massas

molares próximas a 46 kDa (SACHSLEHNER e HALTRICH, 1999). Mananases

com massas molares próximas a 156 kDa somente foram encontradas em

estudos feitos com bactérias. Mananases purificadas de E. casseliflavus

apresentaram massa molar de 137kDa e 142 kDa (ODA et al., 1993).

A xilanase de 29 kDa possui ponto isoelétrico maior que 5,8, enquanto o

pI da xilanase de 79 kDa é menor que 5,8. Seguindo o mesmo raciocínio, a

xilanase de 21 kDa purificada possui um ponto isoelétrico maior que 5,4.

Segundo WONG et al. (1988), xilanases com baixa massa molar que

apresentam ponto isoelétrico alcalino (8,3 – 10,0) em sua maioria pertencem à

família 11 das glicosil hidrolases, enquanto xilanases com alta massa molar

que apresentam ponto isoelétrico ácido (3,6-4,5) pertencem à família 10 das

glicosil hidrolases. Porém, várias exceções têm sido encontradas e

aproximadamente 30 % das xilanases atualmente identificadas, em particular

xilanases fúngicas, não podem ser classificadas seguindo esta sistemática

(COLLINS et al., 2005). Considera-se que estudos baseados na seqüência de

aminoácidos do domíno catalítico destas enzimas são necessários para uma

segura classificação das xilanases em famílias das glicosil hidrolases

(BEAUGRAND et al., 2004). Portanto, não se pode assegurar à quais famílias

as xilanases purificadas neste trabalho pertencem.

Observou-se também que as mananases de 156 kDa e de 65 kDa

purificadas neste trabalho apresentaram valores de pI maiores que 5,8 e 8,0,

respectivamente. Porém, esses valores de pI não são normalmente

encontrados para mananases produzidas por fungos, sendo características de

algumas mananases de Bacillus sp que apresentaram pI alcalino e alto

conteúdo de aminoácidos básicos em sua constituição (ZAKARIA et al., 1998;

XU et al., 2002).

Devido à contínua interferência do pigmento presente no extrato nos

processos de purificação e à baixa recuperação destas enzimas, fez-se

106

necessária a liofilização das amostras ocasionando uma expressiva diminuição

do volume recuperado, impedindo a realização de alguns processos de

caracterização posteriores.

Os efeitos da temperatura e do pH foram avaliados na atividade da

xilanase de 79 kDa. Os resultados mostraram que, diferentemente da maioria

das xilanases fúngicas, esta enzima apresentou um pH ótimo alcalino. Por

outro lado, estes resultados foram semelhantes aos encontrados para

xilanases de 62 e 38 kDa purificadas de I. lacteus que apresentaram atividade

máxima em pH alcalino e atividade ótima a 60 ºC (KANDA et al., 1985).

Xilanases de Lentinus edodes (MISHRA et al., 1990), P. tigrinus (NAZARETH e

SAMPY, 2003) e P. chrysosporium (KHALIL, 2002), também apresentaram

atividade ótima à 60 ºC. Xilanases de outros fungos como Aspergillus nidulans,

Streptomyces sp e Acrophialophora nainiana apresentaram atividade máxima

em pH próximo a 8,0 e atividade ótima entre 55-60 ºC (RIZZATI, 2004).

A xilanase de 79 kDa exibiu um Km de 1,648 mg/mL com uma Vmáx de

0,048 UI/ mL para xilana de birchwood. O valor de Km desta enzima foi maior

que Km de xilanases purificadas de P. tigrinus (0,63 mg/mL) (NAZARETH e

SAMPY, 2003) e L. edodes (0,66 mg/mL) (LEATHAM et al., 1991), no entanto

foi menor que o Km de xilanases de outros fungos como A. caepistosus

(2,5 mg/mL e 3,9 mg/mL) (SANDRIM et al., 2005). Esta enzima apresentou

atividade frente à manana e à carboximetilcelulose, porém não atuou sobre

pNPX e pNPG. A baixa especificidade apresentada por xilanases de alta

massa molar pertencentes à família 10 das glicosil hidrolases também já havia

sido descrita por WONG et al. (1988).

A maioria dos compostos testados teve um efeito discreto na atividade

da xilanase de 79 kDa, semelhante ao obtido para xilanase purificada de T.

lanuginosus (LIN et al., 1999) e uma ativação por AgNO3 e MnCl2 também

observada na xilanase de A. fumigatus (ANTHONY et al., 2002).

Os estudos de temperatura e pH ótimo não foram realizados para a

mananase de 156 kDa devido ao baixo volume de enzima recuperada durante

o processo de purificação. O estudo cinético desta enzima revelou um Km de

0,498 mg/mL para galactomanana, mostrando uma alta afinidade desta enzima

pelo substrato, quando comparada com mananases purificadas de T. versicolor

(SACHSLEHNER e HALTRICH, 1999; JOHNSON e ROSS, 1990) e com a

107

mananase de 36 kDa purificada de T. harzianum (FERREIRA e FILHO, 2004),

sendo esse valor comparável ao obtido para mananases de T. reesei e com as

mananases de 42 e 61 kDa purificadas de S. rolfsii (GÜBITZ, 1996b). Esta

mananase de 156 kDa, no entanto, também exibiu atividade junto a xilana de

birchwood, xilana oat spelt e carboximetilcelulose, comportamento comparável

ao de mananases de outros fungos e de uma mananase de B. subtilis

(ZAKARIA et al., 1998).

Os mesmos compostos avaliados com xilanase promoveram uma maior

inibição na mananase, revelando diferenças entre estas duas enzimas.

Mananases de Bacillus sp também foram inibidas por tais compostos (ODA,

1993), diferentemente da mananase de S. rolfsii (GÜBITZ, 1996a) e T.

harzianum (FERREIRA e FILHO, 2004).

A temperatura ótima e o pH ótimo da β-glicosidase de 110 kDa foram

avaliados apresentando valores próximos aos relatados para duas

β-glicosidases produzidas por Volvariella volvace com temperaturas ótimas de

55 ºC e 60 ºC (CAI et al., 1998) e uma β-glicosidases purificada de S. rolfsii

com atividade máxima em pH 4,2 (SHEWALE e SADANA, 1981).

As propriedades cinéticas da β-glicosidase de 110 kDa foram avaliadas

com celobiose e pNPG como substrato, onde os valores de Km obtidos para

esta enzima nos dois substratos foram muito próximos e semelhantes aos

valores obtidos para β-glicosidase purificada de P. chrysosporium e

S. termophile com celobiose como substrato (IGARASHI et al., 2003; KAWAI et

al., 2003; BHAT et al., 1993) e para S. rolfsii com pNPG (SADANA et al., 1983).

O efeito de potenciais inibidores ou ativadores das atividades destas

enzimas também foi estudado, podendo ser encontrados na literatura

resultados de inibição por metais semelhantes para β-glicosidase de

V. Volvacea (CAI et al., 1998) e de T. gibbosa (BALDRIAN, 2003).

Além disso, podemos observar que a atividade de β-glicosidase foi maior

do que a atividade de endocelulase e que a β-glicosidase aqui produzida

apresentou valores de atividade maiores do que os relatados para outros

basidiomicetos. Entretanto, é sabido que a β-glicosidase é uma enzima “chave”

para a completa degradação da celulose, fornecendo assim carbono e energia

para o fungo. Como vimos, C. subvermispora possui um sistema celulolítico

deficitário de celobiohidrolase e apresenta baixa concentração de

108

endocelulases, levando-nos a especular sobre a verdadeira função da

β-glicosidase produzida por este fungo. De acordo com a literatura, fungos

causadores de podridão branca inicialmente atacam as cadeias de celulose

gerando fragmentos com centenas de unidades de glicose. No entanto,

estudos feitos por GUERRA et al. (2003) indicam que C. subvermispora não

consome estes fragmentos na velocidade em que eles são produzidos, e que o

sistema hidrolítico excretado por este fungo não foi adequado para degradar a

celulose até monômeros utilizáveis pelo metabolismo intracelular. A falta de

atividade de celobiohidrolase pode explicar os baixos níveis de mineralização

da celulose promovida por este fungo. Endo-celulases podem ser os agentes

causadores da despolimerização da celulose, mas a baixa permeabilidade da

parede celular das madeiras a estas enzimas sugere que a despolimerização

da celulose induzida por compostos de baixa massa molar, como reportado

para os fungos causadores de podridão parda, não deve ser excluída (FERRAZ

et al., 2003). O sistema Fenton (Fe2+ e H2O2), conhecido pela capacidade de

despolimerizar celulose, pode ser gerado em culturas de fungos causadores de

podridão branca, desde que H2O2 esteja presente e Fe2+ possa ser formado

pela atividade de enzimas como celobiose desidrogenase, manganês

peroxidase e também pela atividade de redução do Fe3+ por ácidos carboxílicos

hidroxiaromáticos produzidos por fungos (TANAKA et al., 1999; HENRIKSSON

et al., 2000a; HAMMEL et al., 2002). Considerando a despolimerização da

celulose e a fomação de celooligossacarideos por este sistema, podemos

tentar explicar a produção de β-glicosidase por este fungo, as duas

β-glicosidases hidrolisariam celodexdrinas solúveis à glicose ou ácido

celobiônico à glicose e gluconolactona.

A via mais importante de degradação de celobiose é através da

β-glicosidase. Uma outra via para conversão de celobiose seria através da

celobiose desidrogenase. Esta enzima foi sugerida como sendo uma

importante enzima na biodegradação da lignina e da celulose, sendo

encontrada em culturas de basidiomicetos causadores de podridão branca

como P. chrysosporium, T. versicolor, Pycnoporus cinnabarinus e S. commune

(SIGOILLOT et al., 2002), entretanto esta enzima não foi detectada nos

extratos de C. subvermispora. Esta enzima previniria a inibição do sistema

celulolítico por celobiose.

109

Freqüentemente tem sido descrito que um mesmo microrganismo

produz múltiplas formas de enzimas extracelulares hemicelulolíticas e

celulolíticas (WONG et al., 1988; XU et al., 2002), sendo que em alguns casos

é possível que estas enzimas sejam produzidas por genes distintos e, em

outros, sejam produtos de um mesmo gene (CHRISTAKOPOULOS et al., 1996;

BIELY, 1993; DEN HAAN e VAN ZYL, 2003). A ocorrência de múltiplas

enzimas do complexo xilanolítico e celulolítico em um mesmo microrganismo

nos leva a formular hipóteses sobre a função destas enzimas. É sabido que

enzimas degradadoras de celulose e hemicelulose são necessárias para o

fornecimento de carbono e energia para o crescimento fúngico em materiais

lignocelulósicos, porém diferenças nas propriedades bioquímicas como

especificidade ao substrato, pH ótimo e temperatura ótima, são requeridas para

uma completa degradação do substrato, devido à complexidade dos mesmos.

Assim, a produção de múltiplas enzimas pode ser uma estratégia do

microrganismo que lhe confere vantagens adaptativas.

Porém, o papel das enzimas hidrolíticas durante os estágios iniciais de

degradação da celulose por fungos causadores de podridão branca ainda não

está claro. Estudos têm demonstrado que proteínas com massas molares

próximas a 40 kDa, aparentemente não permeiam através da parede celular da

madeira, sendo assim considerada a necessidade da ação de alguns

compostos de baixa massa molar.

110

7. CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho nos levam a concluir que:

- O crescimento do C. subvermispora em cavacos de Pinus taeda foi

homogêneo e visível após curto período de biodegradação, O fungo

foi hábil para produzir enzimas sob estas condições, no entanto o

extrato enzimático apresentou baixa concentração protéica e forte

pigmentação, dificultando o processo de purificação das enzimas

hemicelulolíticas e celulolíticas produzidas por C. subvermispora.

- A caracterização do extrato inicial revelou atividade de xilanase,

mananase, endoglucanase, β-glicosidase e β-xilosidase, com um

perfil eletroforético apresentando nove bandas protéicas entre 110

kDa e 21 kDa. As temperaturas ótimas destas enzimas foram

próximas com um pH ótimo, semelhante ao reportado na literatura.

No entanto, detectou-se maior atividade xilanolítica em pH 5,0, sendo

este pH menor que o indicado pelo método de BAILEY et al. (1992)

para a determinação da atividade xilanolítica.

- Verificou-se que as enzimas apresentam maior estabilidade em pH

5,0 e a 40 oC e que a β-glicosidase foi a enzima de maior

estabilidade.

- O processo de purificação destas enzimas resultou em três

xilanases, duas mananases e uma β-glicosidase purificadas. Uma

multiplicidade de uma mesma enzima foi encontrada com diferentes

características, confirmando resultados anteriormente descritos com

fungos degradadores de madeira.

- A caracterização bioquímica das enzimas purificadas foi dificultada

pela baixa recuperação das mesmas, após os processos de

purificação. Entretanto foi possível caracterizar uma β-glicosidase de

110 kDa apresentando máxima atividade em pH 3,5 e temperatura

111

ótima em 60 ºC e uma xilanase de 79 kDa apresentando atividade

máxima em pH 8,0 e temperatura ótima em 50 ºC. Diferentemente do

extrato bruto esta xilanase revelou um pH ótimo alcalino, indicando

que a mesma não é a xilanase mais ativa no extrato bruto ou que

muda seu comportamento quando purificada.

- Estes parâmetros são de grande importância para avaliar as

aplicações biotecnológicas possíveis para estas enzimas. Porém faz

se necessário dar continuidade para estes estudos, observando sua

especificidade, a presença de domínios de ligação a carboidratos e

os produtos gerados pelas mesmas.

112

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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130

9. ANEXOS

9.1. Anexo A: Curva padrão do log da massa molar versus Kav das

proteínas padrões aplicadas na coluna Sephacryl S-300.

3,5

4,5

5,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Kav

log

da m

assa

mol

ecul

ar

Azul Dextran (2 x 10 g/mol)

Ovalbumina (45 KDa)

Gliceraldeido (36 KDa)

Tripsinogênio (24 KDa)

Acetona (57 g/mol)

6

131

9.2. Anexo B: Curva padrão do log da massa molar versus Kav das

proteínas padrões aplicadas na coluna Sephadex G-50.

3

4

5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1Kav

log

da m

assa

mol

ecul

ar Azul Dextran (2 x 10 g/mol)

Inibidor de Tripsina (20,1 KDa)

Lactalbumina (14,2 KDa)

Acetona (57 g/mol)

6

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