INMUNOHISTOQUIMICADpto de Anatoma PatolgicaFco Javier Alves Ferreira

Definicininmuno-. (Del lat. immnis). (De inmune).1. elem. compos. Bioqum. y Med. Indica relacin con los mecanismos inmunitarios. Inmunologa, inmunoterapia.histo-.(Del gr. , tejido).1. elem. compos. Biol. Significa 'tejido orgnico'. Histologa, histocompatibilidad.qumico, ca.(del gr. , mezcla de lquidos ). 4. f. Ciencia que estudia la estructura, propiedades y transformaciones de la materia a partir de su composicin atmica.

ESTUDIO ANATOMOPATOLOGICOIHQBMMO

DefinicinEl elemento principal en esta tcnica es:ANTICUERPO

InmunoglobulinasProtenas.IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.Dos cadenas pesadas y dos ligeras (kappa y lambda) (2:1).En ratones el 95% son kappa.En individuo la ms abundante: IgG.La primera en aparecer es la IgM (1 sem).En 2 sem predomina la IgG.

Dos tipos de IgIgG (150kD)IgM (900kD)Vida media: 3 semVida media: 4-6 das

Mtodos de visualizacin

Ac policlonalesReaccionan con varios epitopos de un antgeno.

Conejo.Cabra.Cerdo.Oveja.Caballo.Inyeccin de 10-200 g de AgIntradrmicamente o subcutneoIntraperitoneal

Ac MonoclonalesUn clon de clulas plasmticas.Ratones.Elevada homogeneidad.Sin Ac inespecficos.Fcil caracterizacin.Sin variabilidad.Especificidad: El eptopo del antgeno debe ser nico.

Afinidad del AcIntrnseca. Reside en la regin variable.A mayor especificidad mejor afinidad.Funcional.Tiempo requerido para alcanzar el equilibrio con el Ag tisular.El Ac que alcanza una meseta de mxima intensidad de tincin antes tiene ms afinidad funcional.

La unin Ag-Ac es reversible.Evitar altas concentraciones de sal, altas t y pH bajo.Evitar excesivos lavados.

Reactividad cruzadaActividad entre un Ac y dos o ms Ag o viceversa.Anti-lambda con varias Ig.CEA CEA, Ag de Grupo sanguneo y protenas tisulares.Experimental o accidentalmente se inducen cambios en uno o varios eptopos.Reaccin cruzada de Ac contra Ag humanos y de otras especies.

Titulacin del Acptima:La mayor dilucin de un anticuerpo que resulta en la mxima tincin especfica con el menor fondo.Policlonales:1:100 1:2000Monoclonales:1:10 1:1000

IntroduccinEs difcil pensar en una tcnica de mayor impacto en el campo de la AP, especialmente en el diagnstico.

Patologa quirrgica, hematopatologa, citopatologa.

Grfico1

10451996

16401997

15731998

16435556

20067445

19227620

19918116

22439660

240010880

Biopsias IHQ

Cristales

INMUNOHISTOQUIMICA

IHQ 96-05

AOBiopsias IHQCristales

19961045

19971640

19981573

199916435556

200020067445

200119227620

200219918116

200322439660

2004240010880

IHQ 96-05

&L&F&C&D &T&R&P/&N

Biopsias IHQ

Cristales

INMUNOHISTOQUIMICA

2005 mes a mes

BiopsiasCristales

Ene99420

Feb203769

Mar260887

Abr205897

May2151045

Jun156593

Jul169661

Ago1224

Sep

Oct

Nov

Dic

Total13076496

2004 mes a mes

BiopsiasCristales

Ene185983

Feb203848

Mar221882

Abr193749

May187814

Jun1101138

Jul158614

Ago840

Sep73312

Oct1050

Nov1840

Dic193810

Total152310880

Grfico-2000

2952122071831051019285796239241917141084322221111

Javier

Suarez

Nistal

Hardisson

Patron

Gutierrez

Contreras

Larrauri

Burgos

Picazo

Lopez-Barea

Viguer

Morales

Palacios

Rodriguez

Vicandi

Lopez

Pablo

Regadera

Aso

Sanchez

Cabezas

Tejerina

Bancalari

Cuevas

Isabel

Ortega

PATOLOGOS

N CASOS

INMUNO-2000 al da 19-Octubre

Grfico-1999

23918116713911010710098987346201211107655431111111111

Palacios

Nistal

Gamallo

Suarez

Gutierrez

Patron

Ferreira

Contreras

Larrauri

Burgos

Picazo

Lopez-Barea

Morales

Viguer

Lopez

Rodriguez

Vicandi

Alonso

Perez-Alonso

Tejerina

Bancalari

Arturo

Aso

Bustos

Pea

Hens

Jimenez

Martinez

Mies

Orozco

Sierra

PATOLOGOS

N CASOS

INMUNO-99

Inmuno-99-circular

167

239

5

1

1

3

73

1

98

1

100

110

1

1

98

10

20

1

1

12

181

1

107

5

46

7

1

139

4

6

11

INMUNO-99

inmuno-99-horizontal

167

239

5

1

1

3

73

1

98

1

100

110

1

1

98

10

20

1

1

12

181

1

107

5

46

7

1

139

4

6

11

DATOS INMUNO 99 Y 2000

!!!!!!!QUIZAS NO REALES!!!!!!!!

AO 1999AO 2000a 19-10-2000

PATOLOGOCASOSPATOLOGOCASOS

Gamallo167Javier2952981298

Palacios239Hardisson1834112822

Alonso5Aso21903570

Arturo1Bancalari11624648

Aso1Lopez-Barea3921851090

Bancalari3Vicandi101586948

Burgos73Burgos79547378

Bustos1Cabezas2548432

Contreras98Contreras92189162

Pea1Cuevas13010300

Ferreira100Gutierrez10161166

Gutierrez110Isabel11012120

Hens1Larrauri8561378

Jimenez1Lopez831442

Larrauri98Morales190150

Lopez10Nistal20731648

Lopez-Barea20Ortega10170

Martinez1Palacios170180

Mies1Patron1050190

Morales12Pablo4620120

Nistal181Picazo620210

Orozco1Regadera30220

Patron107Rodriguez140230

Perez-Alonso5Sanchez20240

Picazo46Suarez2120250

Rodriguez7Tejerina20260

Sierra1Viguer240270

Suarez13915710280

Tejerina40290

Vicandi60300

Viguer116122

1451

IHQ-patlogo99

IHQ-patlogo99

23918116713911010710098987346201211107655431111111111

Palacios

Nistal

Gamallo

Suarez

Gutierrez

Patron

Ferreira

Contreras

Larrauri

Burgos

Picazo

Lopez-Barea

Morales

Viguer

Lopez

Rodriguez

Vicandi

Alonso

Perez-Alonso

Tejerina

Bancalari

Arturo

Aso

Bustos

Pea

Hens

Jimenez

Martinez

Mies

Orozco

Sierra

PATOLOGOS

N CASOS

INMUNO-99

Elementos clavePatlogo.Tcnico.Mtodos y reactivos.Control de calidad.

Mtodos y reactivosAnticuerpos de calidad.Variedad de mtodos.Kits universales.Peroxidasa y diaminobencidina (DAB).No creas al fabricante hasta validar el anticuerpo en tu propio laboratorio.Se deben validar los ttulos de cada Ac en tu laboratorio.No existe: Ac prediluidos listos para su uso.

Control de calidadVariables pre-IHQComienza en la sala de tallado.2 mm de grosor.Garbage in-garbage out.Decalcificacin (CD43, Ki67, ER y PR).Formol (enmascaramiento antignico). No ms de 24 horas.

Control de calidadVariables pre-IHQDesenmascaramiento antignico.Digestin con proteasas. (tripsina, DNasa, proteinasa K, pepsina, pronasa, ficina HIER (Heat Induced Epitope Retrieval). Recuperacin antignica por calor.Shan-Rong Shi et al. 1991.J Histochem Cytochem 39:741-8.Microondas, estufas, olla a presin Por mecanismo desconocido (Ca2+).EDTA (quelante del calcio).

Control de calidadVariables pre-IHQDesenmascaramiento antignico.Tiempo.Temperatura.pH.No hay ninguna solucin ideal para todos los antgenos:0,1M buffer citrato (pH6).0,1M EDTA (pH8).0,5M Tris buffer (pH10).0,05M glicina-HCl buffer

Control de calidadVariables pre-IHQHIER con microondas.Cada microondas tiene su personalidad. (RT Miller).Cantidad de material dentro del aparato.Olla a presin:Calentamiento uniforme.No se produce ebullicin.Mayor t: 120C.Menor tiempo. (2-9 minutos).

Control de calidadVariables pre-IHQAutoclaves.Baos de agua caliente.Estufas.Ultrasonidos.Etc.

Control de calidadVariables pre-IHQSustitutos del formol.Preparados acuosos.Preparados alcohlicos.Evitar sobrefijacin en formol.Tiempo de espera en alcohol de 70%.Otros fijadores:B5. (Ganglio y MO; exelente morfologa)CD5, CD30, CD23 CD15, kappa, lambdaZenker.Bouin. (formol, acido pcrico y actico).CD5, CD10, Ciclina D1

Control de calidadVariables de inmunotincinNo existe un mtodo standard.Cada laboratorio es diferente.Mtodos de avidina-biotina son los ms usados:Cortes sobre cristales adhesivos.Desparafinar en xilol y rehidratar.Bloquear la peroxidasa endgena. Buffer.Incubar son suero Bloqueante.Buffer.Recuperacin antignica (calor o proteinasa).Buffer.Anticuerpo primario: incubar y lavar en buffer.Anticuerpo secundario: incubar y lavar en buffer.Complejo de deteccin: incubar y lavar en buffer.Reaccin con cromgeno.Contratincin, deshidratar, cubrir y ver.

Control de calidadVariables de inmunotincinAdhesin tisular:Se requiere mtodo de adhesin.Especialmente en tejidos mal fijados.Azul de Elmer, cromo-aluminio, L-lysina o silano.Secado de preparaciones:56-60C durante 1 hora (mejor toda la noche).Microondas:3-4 minutos.Desparafinizacin:Xilol.Omisin de secado y desparafinizacin: calentando las preparaciones en microondas en jarra de Coplin con buffer.

Control de calidadVariables de inmunotincinDes-Zenkerizacin:Para biopsias en B5 o Zenker.Siempre al final del proceso y antes de la contratincin (no antes de la aplicacin del anticuerpo primario).HIER o proteasa.Bloqueo de la peroxidasa endgena.Hemates o neutrfilos.0,3% H2O2 en PBS con 1% azida sdica a temperatura ambiente.Antes del anticuerpo primario. (o despus del 2)

Control de calidadVariables de inmunotincinSuero bloqueante.No en todos los laboratorios.Antes del primario o como diluyente.Suero de la misma especie que produce el Ac o casena.Bloqueo de la biotina endgena.Grnulos citoplsmicos (hgado, rin).HIER (calor) + biotina.0,05% PBS con avidina + 15 min en 0,05-0,2% de biotina en PBS.2 huevos blancos en 200 ml agua destilada.

Control de calidadVariables de inmunotincinDiluyentes de Ac.Buffer con agente estabilizante (BSA).0,05% Tris buffer con 15 mM azida sdica (Sigma S-8032).Buffer de lavado.PBS o TBS. (Tween20).Tween20 (0,2%) y agua destilada.

Control de calidadVariables de inmunotincinAnticuerpo primario.Muy importante.No existe el anticuerpo prediluido listo para su uso.Nunca creas al fabricante en las recomendaciones de dilucin del Ac primario.1:200 1:50.000Cada laboratorio debe determinar sus diluciones de trabajo antes de usarlo para diagnstico.

Control de calidadVariables de inmunotincinDilucin del anticuerpo.Es la principal razn de malos resultados.Identificar falsos positivos y negativos.Antes asegurar el mejor mtodo de recuperacin antignica.1:501:100 --1:200 -- 1:400 -- 1:800

Ej.: 1:2.000.000 para anti-lambda

Control de calidadVariables de inmunotincinDilucin del anticuerpo.Es importante asegurar que los casos negativos sean no reactivos.La mayora de laboratorios no emplean mucho trabajo en titular anticuerpos.Sandwich de tejidos (80 tumores).

Control de calidadVariables de inmunotincinPositivos verdaderos y falsos.Todo lo marrn no es real, ni con el fondo limpio.

Las clulas que contienen el antgeno son heterogneas.Fuerte tincin de membrana.Tincin del ncleo celular.

B5 o Zenker, cidos fuertes.Tincin nucleolar del CD20.Hgado o rin en sistemas avidina-biotina.

Control de calidadVariables de inmunotincinTiempos de incubacin.Temperatura.Refrigerador.37C.La ptima es 25C.Prdida de actividad.Estraptavidina-HRP.

Control de calidadVariables de inmunotincinIncubacin del secundario.Monoespecficos.Multi-link.Complejo de deteccin (ABC).Peroxidasa 4 veces ms sensible que la fosfatasa alcalina.Cromgeno.DAB.Buena tincin de color marrn.Montaje en medio estandar.No se destie con el tiempo.AEC (aminoetilcarbazol).Tincin de color rojo.Montaje en medio acuoso.

Control de calidadVariables post-inmunoSoluciones que mejoran la DAB.Sulfato de cobre.Tetrxido de osmio.Cloruro de cobalto.Contratincin.Hematoxilina (Harris, Gill).Azure B, Giemsa-Hematoxilina (melanina).

Tcnica de inmunohistoqumicaDesparafinar e hidratar en alcoholes decrecientes (100-90-80-70) hasta el agua destilada.Aadir el inhibidor de la peroxidasa endgena e incubar durante 10 minutos.Lavado en agua destilada.Las preparaciones se sumergen en EDTA (precalentado en el microondas) y se meten en la estufa a 150 grados durante 45 minutos: el EDTA se prepara con 800 ml. de agua destilada, 1,5 ml. de EDTA y 2 gotas de ClH; todo ello a pH de 8,2.Lavado en agua destilada.Lavado en buffer Tris a temperatura ambiente.Incubacin con el anticuerpo primario a la dilucin ptima (ver apartado de anticuerpos primarios) durante 30 minutos.Lavado en buffer Tris.Aplicar el anticuerpo secundario conjugado (polmero de Envision) durante 30 minutos.Lavado en buffer Tris.Aplicacin del cromgeno DAB durante 5 minutos: (1 ml. del sustrato nmero 5 del Kit y 1 gota del sustrato nmero 6 del kit).Lavado en buffer Tris.Lavado en agua destilada.Hematoxilina durante 5 minutosLavado en agua destilada.Paso por alcoholes crecientes para deshidratar (70-80-90-100).Xilol y montaje de las preparaciones

PolmerosEnvision (Dako).No usa avidina-biotina.No se necesita bloquear biotina endgena.Combina ac secundario con complejo de deteccin se ahorra un paso.Es caro.

PowerVision (Immunovision Tecnologies).

Variables post-inmunoNo basta con conocer el nombre del Ac.ENE: Enolasa Neuronal Especfica.Uno slo ve lo que conoce.Panel insuficiente. errores diagnsticos.

Control de calidadCon preparaciones multitejido.60-80 tumores diferentes.Para test de Ac nuevos.Montado en el fondo de la preparacin de un caso servira como control positivo.Vimentina como control tisular.Clulas estromales, endotelios.Dbil sobrefijacin con formol.Control negativo. (Igual recuperacin)Control positivo.

IHQ en citologaBloque celular. (lo mejor)Fijadas en alcohol.Evitar las secadas al aire.ThinPrep.(lisa los GR, lava protenas)Sin recuperacin antignica.

IHQ en citologaProblemasNo es necesaria recuperacin.Se ha visto mejorada con olla a presin.Especialmente muestras en seco.Algunas en alcohol: vimentina, CK7,RP.

Avances en IHQEnvision

Avances en IHQTechmate 500

Avances en IHQAutostainer

Murine variable regions bind specifically to CD20 on B cellsHuman kappa constant regionsHuman IgG1 Fc domain works in synergywith human effector mechanismsChimeric IgG1

Envision

INMUNOHISTOQUIMICA -IIDpto de Anatoma PatolgicaFco Javier Alves Ferreira

Paneles de IHQ

Paneles de IHQ

Paneles de IHQ

Paneles de IHQ

Paneles de IHQ

Neoplasias no hematolinfoides por patrn de crecimiento

Neoplasias no hematolinfoides por rgano o tejido de origen

Bsquedas en internet

Patrones de tincin:membrana (y Golgi)CD15

Patrones de tincin: nuclearMib-1

Patrones de tincin:ncleo y citoplasmaALK

Patrones de tincin: granularPerforina

Dos patrones de tincinCD5

Falso positivo: FondoCD20

Falso positivo: FondoIgE

Falso positivo: fondoS-100

Falso positivo: en clulas normalesEMAPlasmaticasClulas LH

Falso positivo: en clulas normalesCD15PMNClulas de Hodgkin

Falsos negativos por fijacinCD15FormolB5

Falso negativo: con control internocromogranina

Negativo verdadero:BCL-2

Artefactos en IHQEscamas crneasAE1/AE3Burbujas de aire