Estratégias adaptativas da linhagem não ambiental ...
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA (Associação Ampla entre a UEPG e a UNICENTRO) LUIZ RICARDO OLCHANHESKI Estratégias adaptativas da linhagem não ambiental Escherichia coli DH5-α ao herbicida mesotrione PONTA GROSSA 2014
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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA
(Associação Ampla entre a UEPG e a UNICENTRO)
LUIZ RICARDO OLCHANHESKI
Estratégias adaptativas da linhagem não ambiental Escherichia coli
DH5-α ao herbicida mesotrione
PONTA GROSSA
2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE PONTA GROSSA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA EVOLUTIVA
(Associação Ampla entre a UEPG e a UNICENTRO)
LUIZ RICARDO OLCHANHESKI
Estratégias adaptativas da linhagem não ambiental Escherichia coli
DH5-α ao herbicida mesotrione
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Biologia
Evolutiva da Universidade Estadual de Ponta
Grossa em associação com a Universidade
Estadual do Centro-Oeste, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Biológicas (Área de concentração
em Biologia Evolutiva).
Orientador: Prof. Dr. Marcos Pileggi
Co-orientadora: Profa. Dra. Sônia Alvim Veiga
Pileggi
Ponta Grossa
2014
“A glória da amizade não é a mão estendida, nem o sorriso carinhoso, nem
mesmo a delícia da companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você
descobre que alguém acredita e confia em você.”
Ralph Waldo Emerson
Agradecimentos
- A CAPES, CNPq e Fundação Araucária pelo apoio financeiro e concessão da
bolsa;
- Ao professor Dr. Marcos Pileggi, que muito mais que um orientador foi um
amigo incomparável. Agradeço a todo ensinamento e oportunidades. Sem seu
apoio e confiança nenhuma das minhas conquistas seriam possíveis;
- A minha mãe, Cleunice Vieira de França, que sempre acreditou em mim,
independente da situação, e principalmente por toda a dedicação que teve por
mim e pelo meu irmão. Sem o sacrifício dela provavelmente não teria a cabeça
que tenho hoje, e só nós sabemos o quanto foi difícil chegar aqui;
- Ao meu irmão, Luiz Renato Olchanheski Jr, que por muitas vezes me serviu
de exemplo, mesmo que involuntariamente;
- A minha namorada, Gessica da Costa, por toda a dedicação, apoio, paciência,
e principalmente amizade e por ser um dos principais apoios da minha vida.
Sua dedicação foi muito importante, sendo a primeira pessoa a quem recorri
nos momentos de dificuldade, tristeza e também nas conquistas e alegrias;
- Ao professor Dr. Flávio Luís Beltrame, que me ensinou coisas que eu
considerava ser impossível aprender. Que eu considero como meu principal co-
orientador, e espero que esta “parceria” continue por muito tempo;
- A todos os outros professores que, de alguma forma, me ajudaram nesta
minha “caminhada científica”, que com toda a certeza foi de extrema
importância. Prof. Dr. Ricardo Antunes de Azevedo, Prof. Dr. Ivo Demiate, Prof.
Dr. Leopoldo Sussumo Matsumoto, Prof. Dra. Sônia Alvim Veiga Pileggi, Prof.
Dra. Jesiane Batista.
- Aos meus colegas de trabalho, que estiveram sempre comigo e me ajudaram
de diversas formas. Agradeço pela troca de experiências e conhecimento.
Leandro Datola Tullio, Lilian Parra Prione, Bruna Steckling, Acácio Zielinski,
Fernando Gravina, Tatiane Dobrzanski, Bruno César do Espírito Santo, Maria
Janina Pinheiro Diniz.
- Ao pessoal da ESALQ-USP que me ensinaram muitas coisas, e sempre que
preciso de alguma ajuda estão dispostos a me ajudar. Dra. Paula Fabiane
Martins, Dra. Manuella Nóbrega Dourado, MSc. Leila Priscila Peters, Dra.
Giselle de Carvalho, Prof. Dr. Fernando Piotto, Dr. Lucas dos Anjos Souza.
- A todos os professores e funcionários do PPG Biologia Evolutiva;
- A todos, que direta ou indiretamente, me ajudaram nesta conquista.
Resumo
O uso intensivo de agroquímicos tem assumido um papel relevante no
aumento da produção agrícola, mas um dos impactos gerados é a mudança na
estrutura populacional de microbiotas de solo, que precisam tolerar os
xenobióticos aplicados para sobreviver. Uma pergunta pertinente é se os
mecanismos de tolerância são selecionados pela presença de diferentes
agroquímicos em solo, ou se há mecanismos constitutivos de adaptação. O
objetivo deste trabalho foi avaliar o sistema de defesa de uma linhagem não
ambiental, a E. coli DH5-α, em relação ao herbicida mesotrione, com o qual
não houve contato prévio em solo. Resultados obtidos mostraram que esta
linhagem foi capaz de tolerar elevadas doses do herbicida, e a determinação
do herbicida por um método desenvolvido e validado por cromatografia líquida
de alta eficiência (CLAE) permitiu determinar que após 3 horas não foi possível
detectar o herbicida nas amostras avaliadas. Taxas de crescimento no
tratamento com o herbicida foram menores em relação ao controle nos tempos
anteriores ao período de degradação, mostrando o efeito tóxico sobre as
células bacterianas. Como sistemas de defesa, constataram-se a alteração na
saturação dos lipídeos de membrana, diminuindo os danos causados pelas
espécies ativas de oxigênio e possivelmente dificultando a entrada do
xenobiótico na célula, além da atuação da enzima GST no sistema antioxidante
e no processo de metabolização do herbicida. Considerando que a E. coli DH5-
α não apresentou um contato prévio com o mesotrione, o sistema de defesa
encontrado nesta linhagem pode ser considerado como geral e não específico.
Esta estratégia pode ser interessante na adaptação de linhagens bacterianas
em solos agrícolas, os quais são submetidos a regimes de trocas de herbicidas
de maneira cada vez mais intensa.
Palavras-chave: Biodegradação, Callisto, peroxidação lipídica, Glutationa-S-
Transferase, saturação de lipídeos.
Abstract
The intensive use of agrochemicals has assumed an important role in
increasing agricultural production; however, one of the impacts has been
changes in population structure of microbiota in the soil, which need to tolerate
the xenobiotics that are applied in order to survive. A pertinent question is
whether these mechanisms are selected by the presence of different
agrochemicals in soils, or if there are constitutive mechanisms of adaptation.
The aim of this study was to evaluate the defense system of an un-
environmental strain, E. coli DH5-α, in relation to the herbicide mesotrione,
which had no prior contact with the soil. The results showed that this strain was
able to tolerate higher doses of the herbicide, and that the determination of the
herbicide by a method developed and validated by high performance liquid
chromatography (HPLC), made it possible to determine the complete
disappearance of mesotrione in the sample after 3 h of exposure. Growth rates
in the treatment with the herbicide were lower than the control, prior to the
period of degradation, showing the toxic effect on the bacterial cells. As regards
defense systems, it was noted that changes in the saturation of the membrane
lipids reduced the damage caused by reactive oxygen species and possibly
hindered the entry of xenobiotics in the cell, as well as activating GST enzyme
activity in the antioxidant system and in the metabolizing process of the
herbicide. Considering that E. coli DH5-α showed no previous contact with
mesotrione, the defense system found in this strain can be considered as
general and non-specific. This strategy may be interesting in the adaptation of
bacterial strains in agricultural soils, which are subject to changing herbicides in
an ever more intense manner.
Keywords: Biodegradation, Callisto, lipid peroxidation, Glutathione-S-
Transferase, lipid saturation.
Lista de abreviaturas e siglas
AMBA - Ácido benzóico 2-amino-4-metilsulfonil
BSA- Albumina de soro bovino (Bovine serum albumin)
CAT - Catalase
DDT- Dicloro-difenil-tricloroetano
DTT - Ditiotreitol
EDTA - Ácido etileno diamino tetracético
EROs - Espécies reativas de oxigênio
FTIR – Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (Fourier Transform Infrared Spectroscopy)
GSH – Glutationa reduzida
GST- Glutationa-S-transferase
HPPD- 4-hidroxifenil-piruvato-dioxigenase
LB- Caldo Luria (Luria Broth)
MDA- Malondialdeído
MNBA - Ácido 4-metilsulfonil-2-nitrobenzóico
MM - Meio Mineral
MMC - Meio Mineral com Callisto
MMM - Meio Mineral com mesotrione
-C - Meio Mineral sem Carbono
-CM – Meio Mineral sem Carbono, com mesotrione
NBT- Nitroazul tetrazólio
PBS- Solução tampão de fosfato (Phosphate buffer solution)
PAGE-Eletroforese em gel de poliacrilamida (PoliAcrilamide Gel Electrophoresis)
PCBs – bifenis policlorinados
PVPP – Polivinilpirrolidona
RPM- Rotações por minuto
SOD - Superóxido dismutase
SDS - Dodecil sulfato de sódio (Sulfate dodecil sodium)
TBA- Ácido 2-tiobarbitúrico
TCA- Ácido tricloroacético
Sumário
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 12
1.1 Agroquímicos .......................................................................................... 12
1.2 Degradação ............................................................................................ 14
1.3 Sistema de defesa bacteriano ................................................................. 16
1.3.1 Superóxido dismutase ...................................................................... 17
1.3.2 Catalase ............................................................................................ 18
1.3.3 Glutationa S-Transferase .................................................................. 19
1.4 Proteção contra xenobióticos pela membrana bacteriana ...................... 20
1.5 Mesotrione .............................................................................................. 21
2. OBJETIVOS ................................................................................................. 23
3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 24
3.1 Substâncias químicas e reagentes ......................................................... 24
3.1.1 Herbicidas ......................................................................................... 24
3.1.2 Reagentes para cromatografia liquida em alta eficiência (CLAE) ..... 24
3.2 Condições CLAE ..................................................................................... 24
3.3 Linhagem bacteriana ............................................................................... 25
3.4 Validação do método cromatográfico por CLAE ...................................... 25
3.4.1 Seletividade ...................................................................................... 25
3.4.2 Linearidade ....................................................................................... 25
3.4.3 Precisão e exatidão .......................................................................... 25
3.4.4 Limites de detecção e quantificação ................................................. 26
3.4.5 Robustez ........................................................................................... 26
3.5 Condições de crescimento bacteriano ................................................. 26
3.6 Avaliação de degradação do herbicida por CLAE ................................... 27
3.7 Viabilidade celular ................................................................................... 27
3.8 Peroxidação lipídica ................................................................................ 27
3.9 Análise do sistema antioxidante .............................................................. 28
3.9.1 Extração de proteínas para análises de estresse oxidativo .............. 28
3.9.2 Análise protéica por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida
(PAGE) ....................................................................................................... 28
3.9.3 Atividade de CAT .............................................................................. 29
3.9.4 Atividade de GST .............................................................................. 29
3.10 Análise de saturação de lipídeos........................................................... 29
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................................... 31
4.1 Desenvolvimento e validação de método por CLAE para determinação da
cinética de degradação do mesotrione ......................................................... 31
4.1.1 Introdução ......................................................................................... 32
4.1.2 Material e métodos ........................................................................... 33
4.1.2.1 Químicos .................................................................................... 33
4.1.2.2 Químicos e condições CLAE ...................................................... 34
4.1.2.3 Validação do método cromatográfico por CLAE ................................ 34
4.1.2.4 Seletividade ................................................................................ 34
4.1.2.5 Linearidade ................................................................................. 34
4.1.2.6 Precisão e exatidão .................................................................... 35
4.1.2.7 Limites de detecção e quantificação ........................................... 35
4.1.2.8 Robustez .................................................................................... 35
4.1.3 Resultados e discussão .................................................................... 35
4.1.3.1 Otimização de condições cromatográficas ................................. 35
4.1.3.2 Metodologia de validação ........................................................... 36
4.1.3.3 Aplicabilidade do método ............................................................ 37
4.1.4 Conclusões ....................................................................................... 38
4.1.5 Referências bibliográficas ................................................................. 38
4.2 Mecanismos de tolerância e alta capacidade de degradação do herbicida
mesotrione pela linhagem E. coli DH5-α ....................................................... 41
4.2.1 Introdução ......................................................................................... 43
4.2.2 Materiais e métodos .......................................................................... 45
4.2.2.1 Linhagem Bacteriana .................................................................. 45
4.2.2.2 Herbicidas ................................................................................... 45
4.2.2.3 Condições de crescimento bacteriano ........................................ 45
4.2.2.4 Avaliação de degradação do herbicida por CLAE ...................... 46
4.2.2.5 Viabilidade celular....................................................................... 47
4.2.2.6 Peroxidação lipídica.................................................................... 47
4.2.2.7 Extração de proteínas para análises de estresse oxidativo ........ 47
4.2.2.8 Análise protéica por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida
(PAGE) ................................................................................................... 48
4.2.2.9 Atividade de CAT ........................................................................ 48
4.2.2.10 Atividade de GST ...................................................................... 48
4.2.2.11 Análise de saturação de lipídeos .............................................. 49
4.2.3 Resultados e Discussão ................................................................... 49
4.2.3.1 Capacidade de degradação do mesotrione por E. coli DH5-α .... 49
4.2.3.2 Caracterização do herbicida mesotrione como agente estressante
............................................................................................................... 52
4.2.3.3 Influência do mesotrione sobre o nível de saturação de lipídeos 54
4.2.3.4 Envolvimento de enzimas antioxidativas na defesa e degradação
do mesotrione ......................................................................................... 55
4.2.4 Conclusões ....................................................................................... 58
4.2.5 Referências bibliográficas ................................................................. 59
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................ 65
12
1. INTRODUÇÃO
1.1 Agroquímicos
O primeiro passo para o desenvolvimento do mercado de agroquímicos
em um âmbito mundial se deu na descoberta do inseticida DDT (dicloro-difenil-
tricloroetano), em 1944, muito utilizado no controle de insetos causadores de
doenças (como o vetor da malária), controlando diversas epidemias (Ruus et
al., 2010). Posteriormente houve uma corrida no desenvolvimento de novos
agroquímicos, sendo estudados seus efeitos e modos de ação, a fim de
aumentar a potencialidade destas substâncias químicas e implementação
destes no mercado (Armas et al., 2007).
A partir dos anos 60, a população mundial passou de 3 para 6,8 bilhões
de pessoas, e consequentemente aumentou a demanda de alimentos e matéria
prima (Donaldson, 2010). A fim de suprir esta necessidade, foi necessário um
aumento na produtividade na agricultura e um aumento de áreas cultiváveis, e
isto foi acompanhado pelo uso de agroquímicos e fertilizantes (Armas et al.,
2007, Sands et al., 2009). Cerca de 2,27 milhões de toneladas de agroquímicos
são lançados anualmente no ambiente (Vercreaene-Eairmal et al., 2010). Os
herbicidas correspondem a cerca de 50% do total de agroquímicos
comercializados no mundo (Sattin et al., 1995). O Brasil é enquadrado entre os
maiores consumidores mundiais desses pesticidas (Fay et al., 1997), devido a
sua posição de destaque como produtor de alimentos no cenário mundial.
Apesar da utilização de agrotóxicos na agricultura ter beneficiado a
produtividade de culturas, surgiram algumas preocupações quanto aos efeitos
adversos destes químicos (Jiang et al., 2008), uma vez que apenas 0,1%
destes atingem seus alvos específicos e, portanto, grande parte permanece no
ambiente (Lopez-Perez et al., 2006; Martins et al., 2007; Sharma et al., 2010).
Os resíduos dos pesticidas no solo podem causar injúrias a plantas sensíveis
em um sistema de rotação de culturas, serem absorvidos por culturas
subsequentes, inibir o crescimento de microrganismos benéficos ou contaminar
águas, sendo passíveis de causar efeitos prejudiciais à saúde humana (com
efeitos mutagênicos, carconogênicos, citotóxicos, genotóxicos e imunotóxicos)
13
e à fauna de habitats próximos aos campos tratados (Blanco, 1979; Yeh et al.,
2005; Giordano et al., 2007; Chen et al., 2009). Os efeitos fitotóxicos dos
agroquímicos podem atingir macrófitas aquáticas, como Lemma spp. (Aliferis et
al., 2009), Elodea canadensis, Myriophyllum spicatum, e Potamogeton lucens,
em suas taxas fotossintéticas (Knauert et al., 2010).
Van der Linden et al. (2009), consideram que os métodos atuais de
avaliação das taxas de lixiviação de herbicidas podem estar subestimando
estes valores. Pesticidas e biocidas podem ser deslocados a partir dos sítios de
aplicações por diferentes mecanismos. Estes compostos, quando encontrados
em águas superficiais, por exemplo, podem ser perigosos, atingindo
organismos que não deveriam ser seus alvos primários (Wittmer et al., 2010).
Além disto, segundo Vörösmarty et al. (2010), aproximadamente 80%
da população humana está exposta a pesticidas presentes na água. Alguns
estudos tem relatado a presença de agroquímicos em diversos alimentos,
principalmente frutas e legumes, em níveis acima dos recomendados pela
União Européia (UE), Organização mundial da saúde (OMS) e Organização
das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) (Jardim; Andrade;
Queiroz, 2009; Sharma et al., 2010).
Alguns efeitos adversos já foram comprovados em herbicidas
específicos, como na classe s-triazinas, causando problemas sexuais em
sapos, e causando vômitos, diarreias, câncer de próstata, dentre outros em
humanos (Maclennan et al., 2002; Hayes et al., 2003).
Os herbicidas são pesticidas destinados a eliminar ou impedir o
crescimento de ervas daninhas que prejudicam o crescimento de plantas de
uma lavoura, normalmente sendo utilizados para substituir a capina mecânica
ou manual. Estes agentes químicos agem bloqueando a biossíntese de
aminoácidos, carotenóides ou lipídeos, e bloqueando o fluxo de elétrons no
processo de fotossíntese (Humburg et al., 1989).
O desenvolvimento de plantas resistentes aos herbicidas tem levado os
agricultores a aumentarem a quantidade destes produtos nas lavouras. Além
disso, têm-se usado poucos tipos de substâncias químicas diferentes, como é o
14
caso do Glifosato. Este é um caminho certo para o desenvolvimento de
resistência a herbicidas (Waltz, 2010), além de levar a problemas econômicos,
considerando um gasto maior em agroquímicos.
Caracciolo et al. (2004), demonstraram que herbicidas que não são
completamente degradados na superfície do solo podem ser lixiviados e atingir
águas subterrâneas.
Mesotrione e Callisto podem induzir mudanças na composição de
microbiotas de solo, assim como seus produtos de degradação, AMBA (ácido
2-amino-4-metilsulfonil benzóico) e MNBA (ácido 4-metilsulfonil-2-
nitrobenzóico). Não se trata necessariamente de aumento de linhagens
degradadoras de mesotrione, mas também de linhagens adaptadas ao
mesotrione (Crouzet et al., 2010). Autoridades avaliam quantidades de
mesotrione, AMBA e MNBA para laudos de segurança, como da European
Commission, mas não os seus efeitos sobre a genética e fisiologia de
comunidades bacterianas, solo e águas. Um quadro dinâmico do efeito de
herbicidas em comunidades de plantas e microrganismos de solo, água,
endofíticos e epifíticos, ainda não estão bem elucidados, porém, os dados já
obtidos não são repassadas a comunidades usuárias, como os agricultores, em
que podem ser passadas informações visando maior lucro, considerando uma
diminuição na fertilidade do solo em decorrência da aplicação de herbicidas. É
possível que estes mecanismos de adaptação a herbicidas e transferência
horizontal destes genes possam estar presentes em bactérias fixadoras de
nitrogênio, fungos micorrízicos, linhagens fitopatógenas.
1.2 Degradação
O tempo que um herbicida vai permanecer no solo vai depender de
vários fatores, entre eles a velocidade de degradação destes compostos.
Assim, existe uma grande preocupação com o destino deste agente, o qual
pode migrar dos campos tratados para o ar, para campos não tratados e
diversos corpos de água (Arias-Estévez et al., 2008). A persistência de um
pesticida no solo depende de processos de dissipação, como a degradação,
que pode estar relacionados com o metabolismo microbiano (Nakagawa et al.,
2000).
15
Opções para a descontaminação ambiental envolvem diversas
tecnologias, tais como o uso de sistemas biológicos de tratamento para reduzir
ou transformar esses agentes contaminantes em produtos menos nocivos, que
podem ser integrados nos ciclos biogeoquímicos naturais. A biodegradação é a
decomposição de um material em componentes mais simples, por meio de
organismos vivos. Os microrganismos podem degradar xenobióticos de forma
aeróbica ou anaeróbica. Em alguns casos pode ocorrer a utilização destas
substâncias como fonte de nutrientes após a degradação, processo
denominado catabolismo. Porém, pode ocorrer o cometabolismo em que são
necessárias outras fontes de carbono e de nutrientes para que a ocorra
degradação (Penny et al., 2010; Zablotowics et al., 2001), não ocorrendo a
utilização do xenobiótico como fonte de nutrientes para o crescimento do
microrganismo, mas sim metabolizado em conjunto com outros substratos
(Briceño et al., 2007). A biorremediação é um processo biotecnológico que
consiste em inocular no solo, ou em outro ambiente, microrganismos capazes
de metabolizar os xenobióticos, transformando-os em produtos menos tóxicos
ao meio ambiente. A decomposição biológica dos pesticidas é a mais
importante e a melhor forma de remover esses xenobióticos do ambiente
(Dabrowska et al., 2004).
A biorremediação tem sido muito usada contra os contaminantes bifenils
policlorinados - PCBs (contaminantes oriundos de capacitores e
transformadores), inclusive pesticidas e herbicidas. Geralmente são usados
microrganismos destes ambientes, inclusive em solo contaminado por
herbicidas, para o manejo de controle destes xenobióticos (Toro et al., 2006).
Bioaumentação é um tipo de processo de biorremediação e consiste na
adição de microrganismos em uma área contaminada com determinado
xenobiótico, para aumentar a taxa de degradação do mesmo, aproveitando-se
da capacidade metabólica das linhagens adicionadas. Também pode ser
utilizada a transferência de plasmídeos contendo os genes de degradação para
comunidades naturais de microrganismos. Entretanto, estas populações
normalmente diminuem em número devido a estresses bióticos e abióticos
(Juhanson et al., 2009).
16
É relatado para alguns herbicidas genes específicos envolvidos nos
processos de degradação, como no caso da atrazina. Para a bactéria
Pseudomonas sp. ADP, a via de degradação é codificada por dois conjuntos
gênicos, determinando a necessidade de genes específicos para a degradação
da atrazina (Sene et al., 2010). Já para o herbicida mesotrione, existe a
dificuldade de isolamento de genes específicos, como citado por Durand et al.
(2006) e Pileggi et al. (2012), sendo levantada a hipótese da inexistência de
genes específicos, reportando uma possível utilização de enzimas com funções
gerais, como no caso do citocromo P-450 e glutationa S-tranferase (Nagy et al.,
1995; Guengerich, 1995).
Ding et al. (2009), demonstraram alterações na estrutura da microbiota
de solo após a aplicação de PCBs, aumentado o nível de degradação destes
compostos. Esta degradação depende da inter-relação planta-microrganismo-
solo. Resultados semelhantes foram encontrados para microbiotas bacterianas
em aquíferos contaminados com hidrocarbonetos aromáticos (BTEX) (Müller et
al., 2009). Alterações em comunidades bacterianas também foram observadas
com a utilização de bromoxinil em solo, aumentando-se o número de linhagens
degradadoras. Entretanto, com o aumento do número de aplicações deste
herbicida, observou-se uma inibição na degradação (Baxter; Cummings, 2008).
1.3 Sistema de defesa bacteriano
A exposição de microrganismos a compostos tóxicos pode levar a uma
resposta de indução ao estresse oxidativo (Konda; Pásztor, 2001). O aumento
na concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) para níveis que
excedem a capacidade de defesa celular caracteriza o estresse oxidativo
(Mahalingam; Federoff, 2003). Os produtos do metabolismo aeróbico são
altamente reativos, como radical superóxido (O2-•), peróxido de hidrogênio
(H2O2) e o radical hidroxila (OH-•). Os alvos biológicos da alta reatividade das
EROs são DNA, RNA, proteínas e lipídios (Cabiscol et al., 2000).
Para minimizar estes efeitos danosos resultantes da ação dessas
espécies, os organismos aeróbios desenvolveram mecanismos capazes de
combater a produção de EROs, denominado de sistema antioxidante de
defesa, o qual pode ser dividido em não-enzimático e enzimático. As defesas
17
não-enzimáticas incluem compostos com propriedade intrínseca antioxidante,
como o β-caroteno, α-tocoferol (vitamina E), glutationa reduzida (GSH) e ácido
ascórbico, NADPH e NADH, moléculas que ajudam a manter o ambiente
redutor. Já os mecanismos enzimáticos envolvem a superóxido dismutase,
catalase, peroxidases, glutationa redutase, entre outras enzimas (Scandalios,
2005).
Alguns pesticidas tem a capacidade de interagir com a membrana
celular, principalmente em bactérias, inativando enzimas de extrema
importância, como por exemplo, as envolvidas na cadeia transportadora de
elétrons (Krayl et al., 2003). Porém, as linhagens tolerantes e/ou degradadoras
desenvolvem sistemas para resistir aos xenobióticos, e um deles é aumentar a
produção ou atividade de enzimas do sistema antioxidante, ou até mesmo para
a degradação do xenobiótico (Li et al., 2009).
1.3.1 Superóxido dismutase
A enzima superóxido dismutase (SOD) é uma enzima que faz parte do
grupo das metaloproteínas que catalisa a dismutação do radical superóxido
(O2), sendo considerada a primeira linha de defesa celular contra as EROs. O
radical superóxido é um dos radicais mais abundantes produzidos em sistemas
biológicos, sendo o primeiro a ser formado pela redução do oxigênio por um
único elétron. Em bactérias, ocorre uma formação de radical superóxido
proveniente principalmente da cadeia transportadora de elétrons (Imlay, 2008).
Existem diversos problemas envolvidos com a presença do radical superóxido
nas células, como inativar enzimas como a catalase e a glutationa peroxidase,
porém, pode ocorrer a reação de Fenton, em que ocorre a formação do radical
hidroxila, que é considerado um dos radicais com maior potencial oxidante,
podendo reagir com qualquer molécula orgânica (Barreiros; David; David,
2006).
(Reação de Fenton): O2 – + Fe3+ → O2 + Fe2+
H2O2 + Fe2+→OH.+ OH
A principal importância da SOD se dá por ser considerada a única
enzima cuja atividade controla a concentração de O2 e H2O2, os dois
18
substratos da reação de Haber-Weiss que origina os radicais OH e
provavelmente por isso, as SODs representam o mecanismo de defesa central
dos organismos vivos (Ryan et al., 2010). As enzimas de SOD são
classificadas de acordo com o cofator metal presente em seu sítio ativo,
podendo ser diferenciadas em manganês (Mn) ou ferro (Fe), cobre/zinco
(Cu/Zn) e níquel (Ni) (Gratão et al., 2005).
Nas linhagens de Escherichia coli, a enzima Mn-SOD apresenta síntese
induzida pela presença do oxigênio, pelo radical superóxido e por mudanças
nas fases de crescimento bacteriano (Demple, 1991), por outro lado a síntese
de Fe-SOD não é dependente das condições do crescimento bacteriano, sendo
produzida constitutivamente em uma taxa basal. Estas duas isoenzimas são
encontradas no citoplasma bacteriano e aparentam sobreposição de papéis na
detoxificação celular (Youn et al., 1996). Já a enzima Cu/Zn-SOD localiza-se na
região periplasmática da célula. Devido a sua carga negativa, o radical
superóxido é incapaz de penetrar membranas, as SOD’s periplasmáticas e
associadas à membrana tem sido propostas como prováveis defensoras da
célula contra O2- de origem exógena (Steinman, 1997). Este sistema de
detoxificação se mostra vantajoso para patógenos intracelulares, já que células
fagocitárias produzem uma gama de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio.
Diferentemente das outras isoformas de SOD citadas, a enzima Cu/Zn-SOD
não se faz necessária para o crescimento bacteriano em condições de
laboratório e aparentemente não desempenha papel na detoxificação de O2-
endógeno. A isoforma Ni-SOD é encontradas em uma fração citosólica das
bactérias do gênero Streptomyces, em actinomicetos, tais como
Micromonospora rosaria, Microtetraspora glauca, Kitasatospora griseola e em
algumas cianobactérias (Kim et al., 1996; Kanth; Oh; Sohng, 2010).
1.3.2 Catalase
A atividade da superóxido dismutase na eliminação do radical
superóxido acarreta na formação de outras espécies reativas de oxigênio,
sendo o peróxido de hidrogênio o principal (Gonzalez-Flecha; Demple, 1995).
O principal problema da presença do peróxido de hidrogênio é a capacidade de
oxidar proteínas que apresentam resíduos de metionina e cisteína, ou grupos
19
tiol muito reativos, além de conseguir reagir e transpor membranas, gerando o
radical hidroxil, considerado uma das EROs mais prejudiciais as células
(Barreiros et al., 2006).
A função mais importante da catalase é impedir a formação do radical
hidroxil, e devido a ampla distribuição e capacidade de degradar rapidamente o
peróxido de hidrogênio, foi levantada a importância desta enzima para a
sobrevivência de organismos aeróbicos (Imlay, 2008). Ela converte duas
moléculas de H2O2 em O2 e duas moléculas de água, pela transferência de
dois elétrons:
2 H2O2 → O2 + 2H2O
Porém, o modo de ação das catalases depende da concentração de
peróxido de hidrogênio, podendo ser peroxidativas e catalíticas. Em baixas
concentrações (< 1 µM) a CAT atua com ações peroxidativas, e em elevadas
concentrações, atua rapidamente de forma catalítica, formando H2O e O2
(Scandalios, 2005).
Dentre todas as enzimas com capacidade de degradar H2O2, a catalase
é a única que não necessita de componentes adicionais da célula, além de ser
a forma mais eficiente de eliminação do peróxido de hidrogênio, não ocorrendo
a saturação da enzima, independente da concentração (Scandalios, 2005).
1.3.3 Glutationa S-Transferase
A Glutationa S- Transferase (GST) é fundamental na desintoxicação
celular, estando envolvida em diversos processos, como a degradação de
xenobióticos, proteção contra estresse químico e oxidativo e resistência a
antibióticos (Allocati et al., 2009).
O modo de ação das GSTs ocorre pela conjugação do grupo tiol da
glutationa reduzida (GSH) para diversos substratos hidrofóbicos eletrolíticos
(Hayes; Jowsey, 2005) (Fig. 1)
20
Figura 1 – Enzima GST via conjugação GSH com o substrato 1-cloro-2,4
dinitrobenzeno (CDNB )
As GSTs apresentam dois sítios de ligação, o sítio G que apresenta
afinidade pela GSH (específico), e o sítio H, que apresenta afinidade para o
substrato eletrofílico adjacente. Por meio de técnicas de imunolocalização, foi
demonstrado que essa enzima é preponderantemente localizada no
compartimento periplasmático de bactérias (Allocati et al., 2009).
As GSTs são capazes de detoxificar diversas classes de pesticidas.
Estas enzimas estão envolvidas na primeira etapa da biodegradação do
herbicida atrazina com a remoção do átomo de cloro a partir da conjugação
atrazina-GSH (Labrou et al., 2005).
1.4 Proteção contra xenobióticos pela membrana bacteriana
Alterações na composição de meios de cultura, ou até mesmo a adição
de determinados químicos (como xenobióticos), necessitam de algumas
respostas específicas no metabolismo de microrganismos. Em relação a
herbicidas, além da resposta das enzimas envolvidas no sistema antioxidante,
é evidenciado um sistema de defesa pela alteração na composição dos lipídeos
de membrana, e consequente mudança na saturação e permeabilidade
seletiva, observado principalmente em bactérias Gram-negativas (Heipeiper et
al., 1994; Petersen et al., 1994).
A alteração de saturação de lipídeos foi evidenciada em Staphylococcus
haemolyticus na presença de tolueno, benzeno e ciclohexeno, acarretando um
aumento na fluidez de membrana (Nielsen et al., 2005). Em bactérias Gram-
positivas foi relatado, como Bacillus sp. ORAs2 na presença de tolueno e
Rhodococcus erythropolis DCL14 na presença de alcanos, alcenos e terpenos,
aumento na saturação de lipídeos de membranas (de Carvalho; da Fonseca,
2005; Pepi et al., 2008).
21
Segundo Balangue et al. (2001), em um estudo com Escherichia coli
HB101 em contato com o herbicida 2,4-D demonstraram a diminuição na
fluidez de membrana, e provavelmente uma diminuição nos danos na
membrana. Dados semelhantes foram obtidos por Sánchez et al. (2005), em
que a linhagem Klebsiella planticola DSZ, em contato com etanol ou o herbicida
simazine, apresentou uma diminuição na saturação de lipídeos de membrana,
alterando a taxa de permeabilidade seletiva, possivelmente como um sistema
de defesa.
A mudança de saturação dos lipídeos de membrana seria uma possível
resposta adaptativa em bactérias para suportar um ambiente estressante
induzido pelo herbicida, para evitar maiores danos celulares, já que as EROs
têm a capacidade de reagir com ácidos graxos insaturados (Lima e Abdala,
2001).
1.5 Mesotrione
O mesotrione, 2-[2-cloro-(4-metilsulfonil)benzoil]-1,3-ciclohexanediona
(Fig. 2), é um herbicida tricetônico, seletivo, pré e pós-emergente, utilizado para
o controle de algumas ervas daninhas de folhas largas em culturas de milho.
Esta substância foi sintetizada em 1977, quando cientistas observaram que
poucas plantas tinham a capacidade de crescer próximas da planta Callistemon
citrinus (Mitchell et al., 2001). Então o químico que apresentava esta função de
inibir o crescimento de ervas daninha foi isolado e modificado, a fim de
proporcionar maior resistência e potencializar seu efeito (Mitchell et al., 2001).
O Callisto é o herbicida comercial, que apresenta 48% do principio ativo
(mesotrione), e há relatos que o Callisto pode ter efeitos mais tóxicos que o
mesotrione em decorrência dos seus adjuvantes. Os únicos adjuvantes
informados pela Syngenta são benzisotiazolin-1.2-3-one, 1-octanol, poly (oxy-1,
2-etanediil) e alpha-isodecyl-omega-hydroxy-phosphate (Bonnet et al., 2008;
Crouzet et al., 2010).
O herbicida atua inibindo a ação da enzima 4-hidroxifenilpiruvato
dioxigenase (HPPD) Em plantas, esta enzima tem a função de converter
tirosina em plastoquinona e α-tecoferol, sendo assim, interfere na biossíntese
de carotenóides nos cloroplastos (Mitchell et al., 2001; Durand et al., 2006;
22
Beaudegnies et al., 2009). A inibição da síntese de carotenóides resulta na
perda da fotoproteção clorofila, o que gera decomposição da clorofila pela luz,
levando ao esbranquecimento das folhas das plantas sensíveis, com posterior
necrose e morte dos tecidos vegetais em cerca de 1 a 2 semanas (Lee, 2000;
Felix et al., 2007).
Figura 2: Estrutura do herbicida mesotrione.
A atividade ótima do mesotrione é obtida por meio da eletronegatividade
da molécula, por meio de seus grupamentos metanosulfinil e nitrogênio, nas
posições 2 e 4 na parte benzoil da molécula. Estas estruturas afetam
diretamente a estrutura da enzima HPPD, inibindo-a. Além disso, estes
grupamentos permitem uma maior facilidade na absorção e transporte pelas
plantas daninhas (Mitchell et al., 2001).
A degradação de mesotrione pode gerar dois produtos, o ácido 4-
metilsulfonil-2-nitrobenzóico (MNBA) e o ácido 2-amino-4-metilsulfonilbenzóico
(AMBA), e tem sido demonstrado que estes compostos podem ter uma
toxicidade maior que o mesotrione em si (Batisson et al., 2009; Bonnet et al.,
2008).
23
2. OBJETIVOS
Avaliar se uma linhagem laboratorial ou não ambiental (Escherichia coli
DH5-α) possui mecanismos de adaptação ao mesotrione, mesmo sem ter
ocorrido contato prévio com este herbicida, e desenvolver e validar um método
cromatográfico por CLAE para determinação da cinética de degradação do
mesotrione.
24
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Substâncias químicas e reagentes
3.1.1 Herbicidas
A formulação comercial utilizada foi o Callisto, que contém 48% de
mesotrione (ingrediente ativo) e os adjuvantes benzisotiazolin-1.2-3-one, 1-
octanol, poly (oxy-1, 2-etanediil) e alpha-isodecyl-omega-hydroxy-phosphate,
dentre outros (www.syngenta-crop.co.uk). O mesotrione (92% de pureza) foi
cedido pela Syngenta Crop Protection, Greensboro, NC (USA), e o padrão de
mesotrione da Pestanal (Sigma-Aldrich, 99% de pureza) utilizado nos ensaios
em CLAE;
3.1.2 Reagentes para cromatografia liquida em alta eficiência (CLAE)
A solução foi estocada a 4°C. A acetonitrila (J.T.Baker, Philipsburg, PA,
USA) utilizada foi grau CLAE e o ácido fosfórico (Synth, Diadema, SP, Brazil)
utilizado foi reagente P.A. A água foi purificada com sistema Millipore Milli-Q. A
coluna utilizada foi a Eclipse XDB C18 fase-reversa (150 mm × 4.6 mm, 3,5
μm). As análises foram realizadas no sistema de CLAE Waters 2695. A
detecção dos compostos foi monitorada pelo detector foto diodo (detector DAD
200-400 nm) à 254 nm.
3.2 Condições CLAE
O volume de injeção foi de 50 µL com uma fase móvel constituída de
água (acidificada com ácido fosfórico 0,1%- pH 3,2) (A) e acetonitrila (B),
iniciando em 30% B, 30% à 55% B em 15 min, 55 para 100% B em 17 min,
mantendo isocrático até 18 min, depois voltando ao gradiente inicial em 30% B
em 19 min, mantendo isocrático até 29 min (condicionamento da coluna para
nova injeção). As separações foram realizadas à 20°C e um fluxo de 1 mL/min.
A detecção dos compostos foi monitorada pelo detector foto diiodo (detector
DAD 200-400 nm) com acompanhamento em 254 nm.
25
3.3 Linhagem bacteriana
A cepa de Escherichia coli utilizada para avaliar a degradação do
herbicida mesotrione foi a DH5-α (Genótipo: F-φ80dlacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)
U169 deoR, recA1 endA1 hsdR17 (rk- mk
+) phoA supE44λ- thi-1 gyrA96 relA1).
3.4 Validação do método cromatográfico por CLAE
O método de validação foi realizado de acordo com a resolução
brasileira seguindo os parâmetros de seletividade, linearidade variação da
aplicação, precisão, exatidão, recuperação, limites de detecção (LD) e
quantificação (LQ) (RE 899/2003).
3.4.1 Seletividade
Um detector DAD UV-VIS foi utilizado para identificar o pico e avaliar a
pureza do mesotrione. O tempo de retenção do padrão do mesotrione foi
também utilizado para determinação da seletividade.
3.4.2 Linearidade
A solução padrão utilizado nas análises cromatográficas de mesotrione
foi obtida dissolvendo 100 mg do herbicida (peso molecular: 339,3) em 1,5 mL
de acetonitrila, obtendo-se uma concentração de 196,5 mM. A linearidade do
ensaio foi determinada pela realização de duas curvas de calibração (uma em
solvente e outra em meio de cultura - meio mineral Meio Mineral, contendo 10
mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,0; 3 g L-1 de NaNO3; 0,5 g L-1 de
MgSO4; 0,5 g L-1 de KCl; 0,01 g L-1 de FeSO4; 0,04 g L-1 de CaCl2; 0,001 g L-1
de MnSO4; sendo adicionado 0,4 g L-1 de glucose). As curvas de calibração
foram construídas aplicando cinco soluções padrões com concentrações
crescentes do herbicida mesotrione (0,01965 mM, 0,029475 mM, 0,0393 mM,
0,0786 mM e 0,1965 mM), em triplicatas. A curva de calibração foi montada
utilizando o pico da área do herbicida no cromatograma versus a concentração
do composto.
3.4.3 Precisão e exatidão
Para determinar a precisão (intra e inter-dia), três diferentes soluções
foram preparadas nas concentrações de 0,05895 mM, 0,09825 mM e 0,17685
mM do herbicida mesotrione. Estas soluções foram lidas no primeiro, terceiro e
26
quinto dias depois da preparação da solução, e a exatidão do método foi
avaliada pelo cálculo de retorno das concentrações encontradas
comparativamente com as concentrações teóricas.
3.4.4 Limites de detecção e quantificação
Para determinar o limite de detecção, foi avaliado a concentração de
herbicida em que a área do pico atingisse o valor de três vezes o ruído do
cromatrograma, e o limite de quantificação foi considerado a concentração em
que o valor fosse dez vezes o valor do ruído, considerando também a precisão
nos dados.
3.4.5 Robustez
A solução padrão foi preparado em triplicatas e analisados variando o pH
e a temperatura nas condição da corrida, avaliando a área do pico e o tempo
de retenção.
3.5 Condições de crescimento bacteriano
Os meios utilizados foram: Caldo Luria (LB: 10 g L-1 de triptona, 5 g L-1
de extrato de levedura e 10 g L-1 de NaCl), LB+M (LB com 0,04 mM
mesotrione: 1 × FR [Dose de campo]), LB+C (LB com Callisto, na concentração
equivalente de 0,04 mM de mesotrione), LB+M 10 × (LB com 0,4 mM de
mesotrione) LB+C 10 × (LB com Callisto, na concentração equivalente de 0,4
mM de mesotrione) e crescidos a 37 °C sob agitação de 150 rpm.
O pré-inóculo foi obtido pelo crescimento da linhagem em LB em fase
log de crescimento (5 h de incubação). As células foram centrifugadas durante
10 min. a 8.000 g e lavadas duas vezes com tampão fosfato salino (PBS: 8 g L-
1 de NaCl; 0,2 g L-1 de KCl; 1,44 g L-1 de Na2HPO4; 0,24 g L-1 de KH2PO4). O
pré-inóculo foi transferido para cada tratamento em uma D.O. (densidade
óptica) inicial de 0,05 a 600 nm, sendo diluídas as amostras sempre que as
leituras atingissem valores de aproximadamente 0,6, para minimizar os erros
nas mesmas, sendo os valores multiplicados pelos fatores de diluição
correspondentes.
27
3.6 Avaliação de degradação do herbicida por CLAE
Para determinar a capacidade de degradação do mesotrione, a linhagem
bacteriana foi crescida em 100 mL de LB em frascos de 250 mL e incubada a
37 °C e agitação de 200 rpm. As células foram coletadas após 10 h e
centrifugadas a 8.000 g durante 10 min. a 4 °C. O precipitado foi lavado duas
vezes com PBS. As células foram então ressuspendidas em 10 mL de meio
mineral (MM, contendo 10 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,0; 3 g L-1
de NaNO3; 0,5 g L-1 de MgSO4; 0,5 g L-1 de KCl; 0,01 g L-1 de FeSO4; 0,04 g L-1
de CaCl2; 0,001 g L-1 de MnSO4; sendo adicionado 0,4 g L-1 de glucose, e 0,04
mM mesotrione [Callisto]), e incubados a 37 °C em agitador orbital (200 rpm).
Alíquotas (1 mL) foram coletadas do meio de cultura em cada hora de
incubação (de 0 a 12 h) e centrifugadas a 13.000 g durante 5 min. O
sobrenadante (0,9 mL) foi congelado (-20 °C) para posterior análise em CLAE.
Antes das análises as amostras foram descongeladas e filtradas em
membranas de 0,22 µm de porosidade para injeção no cromatógrafo.
3.7 Viabilidade celular
O crescimento bacteriano se deu durante 10 h a 37 °C em 1,2 L de LB.
As células foram centrifugadas a 8.000 g durante 10 min. e lavadas duas vezes
com PBS, e divididas em frascos com 50 mL de MM (controle), MMM, -C (MM
sem fontes de carbono), e -CM (MMM com mesotrione como única fonte de
carbono). Todos os frascos foram incubados a 37 °C e retiradas alíquotas de
100 µL nos tempos de 30 min., 3 h e 6 h. As amostras foram diluídas até 10-8,
plaqueadas em LB e incubadas à 37 °C. Após 12 horas foi realizado a
contagem das unidades formadoras de colônia (UFC).
3.8 Peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica foi determinada pelos níveis de malondialdeído
(MDA), que são substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (Heath e Packer,
1968). As concentrações de MDA foram monitoradas a 535 e 600 nm e as suas
concentrações foram calculadas utilizando um coeficiente de extinção de 155
mMcm-1.
28
3.9 Análise do sistema antioxidante
3.9.1 Extração de proteínas para análises de estresse oxidativo
O crescimento bacteriano se deu durante 10 h a 37 °C em 3,6 L de LB.
As células foram centrifugadas a 8.000 g durante 10 min. e lavadas duas vezes
com PBS, e divididas em frascos com 50 mL de MM (controle), MMM, -C (MM
sem fontes de carbono), e -CM (MMM com mesotrione como única fonte de
carbono). Todos os frascos foram incubados a 37 °C e realizadas as extrações
nos tempos de 30 min., 3 h e 6 h.
Para a extração das enzimas, as culturas foram centrifugadas a 8.000 g
durante 10 min. e o precipitado foi macerado com nitrogênio líquido e
homogeneizado (10:1 m/v) em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5),
contendo 1 mM ethylene-diaminetetra-acetic acid (EDTA), 3 mM DL-
dithiothreitol, e 5 % (m/v) polyvinylpolypyrrolidone (Gomes Júnior et al., 2007),
mantidas sempre a 4°C. O homogeneizado foi centrifugado a 10.000 g durante
30 min., e o sobrenadante foi separado em alíquotas, congeladas a -80 °C para
posteriores análises enzimáticas. A concentração de proteínas foi realizada
pelo método de Bradford (1976), utilizando BSA como padrão.
3.9.2 Análise protéica por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida
(PAGE)
A eletroforese foi realizada em géis contendo 12 % de poliacrilamida
com 4% de gel de empilhamento. Para a atividade de superóxido dismutase em
PAGE (SOD-PAGE), o SDS foi eliminado. Uma corrente de 15 mA gel-1 foi
aplicada durante 3 h (gel para atividade de SOD), ou 2 h (gel para perfil
proteico), a 4 °C. Quantidades iguais de proteína (20 µg) foram aplicadas nos
ensaios enzimáticos. Para SDS-PAGE o gel foi lavado em água destilada e
incubado durante a noite em 0,05 % de Coomassie blue R-250 em solução na
proporção de 40:7:53 (v/v/v) de metanol:ácido acético:água e descorado com
sucessivas lavagens utilizando uma solução na proporção de 40:7:53 (v/v/v) de
metanol:ácido acético:água (v/v/v) (Gratão et al., 2008).
A atividade de SOD-PAGE foi realizada de acordo com Beauchamp e
Fridovich (1971) e modificado por Medici et al. (2004), no qual os géis foram
lavados em água destilada e incubados no escuro durante 30 min. em 50 mM
29
de tampão fosfato de potássio (pH 7,8) contendo 1 mM EDTA, 0,005 mM de
riboflavina, 0,1 mM de nitroblue tetrazolium e 0,03 mM de N,N,N´,N´-
tetramethylethylenediamine. Os géis foram expostos à luz branca e imersos
em água até a revelação das bandas de SOD.
3.9.3 Atividade de CAT
A atividade de CAT foi determinada de acordo com Kraus, Mckersie e
Fletcher (1995). Em uma solução contendo 1 mL de tampão fosfato de potássio
100 mM (pH 7,5) e 2,5 µL H2O2 (solução 30%) e quantificada em
espectrofotômetro a 25°C. A reação foi iniciada com a adição de 25 µL do
extrato proteico e a atividade determinada seguindo a decomposição do H2O2 a
240 nm durante 1 min.
3.9.4 Atividade de GST
A atividade de GST foi quantificada em um solução contendo 900 μL de
tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8), na qual foi adicionado 25 μL de 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) 40 mM e 50 μL de Glutationa reduzida (GSH)
0,1 M, e incubada a 30°C (Zablotowicz et al., 1995). A reação iniciou-se com a
adição de 25 μL do extrato proteico, sendo monitorada durante 2 min. a 340
nm.
3.10 Análise de saturação de lipídeos
A linhagem bacteriana foi crescida em 800 mL de LB e incubada a 37°C
sob agitação de 200 rpm. Após 12 h, as amostras foram centrifugadas a 8.000
g durante 5 min. a 4°C. O precipitado foi lavado duas vezes com tampão PBS e
dividido em frascos contendo 50 mL com os meios LB e LB+M, em triplicatas, e
as culturas foram incubadas a 37°C e agitados a 200 rpm. Após 12 h foi
realizada a extração de lipídeos como descrito por Bligh e Dyer (1959), com
modificações. Os lipídeos de membrana foram analisados por espectroscopia
de infravermelho FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) em
transmitância, nos comprimentos de onda de 400 a 4000 cm-1 ( utilizando 100
mg de KBr – Brometo de potássio) e os resultados foram avaliados por meio da
análise de componentes principais (PCA), pelo programa Pirouette v 4,0
30
(Infometrix, Bothell, WA, EUA) nos comprimentos de onda de 1400 a 3200 cm-
1.
31
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Desenvolvimento e validação de método por CLAE para determinação
da cinética de degradação do mesotrione
Development and validation of method by HPLC to determination of
kinetic mesotrione degradation
Resumo
O mesotrione é um herbicida seletivo utilizado em culturas de milho para o
controle de ervas daninhas de folhas largas. O objetivo deste trabalho foi
desenvolver um método cromatográfico rápido e eficiente por CLAE-DAD para
determinação da cinética de degradação e quantificação do mesotrione. Para
tanto, um corrida gradiente de 29 minutos foi desenvolvida e validada. O
método validado foi adequadamente aplicado para determinação da cinética de
degradação do mesotrione presente em meio de cultura contendo bactérias E.
coli DH5-α. Foi determinado que amostras de mesotrione após 3 horas de
contato com a bactéria, não eram mais detectadas no meio.
Palavras chave: E. coli DH5-α, herbicida, biodegradação.
Abstract
Mesotrione is a selective herbicide used in corn crops for the control of
broadleaf weeds. The aim of this work was develop a quickly and efficient
method chromatographic by HPLC-DAD to determination of kinetic of
degradation and quantification of mesotrione. For both, a run with gradient of 29
minutes was developed and validate. The validate method was properly applied
to determinate the kinetic of degradation of mesotrione present in culture
medium with E. coli DH5-α strain. It was determinate that samples of
mesotrione later 3 hours of contact with bacteria don’t detect in medium.
Keywords: E. coli DH5-α, herbicide, biodegradation.
32
4.1.1 Introdução
Estima-se que cerca de 2,27 milhões de toneladas de agrotóxicos são
lançados anualmente no meio ambiente. Apesar da utilização de agrotóxicos
na agricultura ter beneficiado a produtividade de diferentes culturas, surgem
algumas preocupações quanto ao efeito negativo destes compostos (Jiang et
al., 2008), como problemas na saúde em humanos e animais, contaminação de
águas subterrâneas e superficiais, além de prejudicar a microbiota do solo
devido a permanência de grande concentrações destes compostos no solo.
(Lopez-Perez et al., 2006; Sharma et al., 2010; Martins et al., 2007).
Atualmente os herbicidas correspondem a 35% dos agrotóxicos
existentes atualmente no mercado (Vercreaene Eaima et al., 2010), sendo o
mesotrione (princípio ativo do herbicida Callisto) (Fig. 1) um herbicida muito
empregado nas culturas de milho por ser seletivo e indicado para o controle pré
e pós-emergente de plantas daninhas por ser de aplicação sistêmica e
indicado para combater os principais infestantes de folhas largas (Batisson et
al., 2009). É derivado de uma fitotoxina produzida pela planta Callistemon
citrinus, e atua inibindo a enzima 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD) dos
organismos alvo, interferindo na síntese de carotenóides (Mitchell et al., 2001).
As linhagens de Bacillus sp. 3B6 e Pantoea ananatis CCT 7673 foram
avaliadas quanto a capacidade de degradação por meio de CLAE, sendo
obtidos degradações nos tempos de 24 e 18h respectivamente, e os
metabólitos caracterizados por LC-MS/MS como o ácido 4-metilsulfonil-2-
nitrobenzoico (MNBA) e ácido 2-amino-4-metilsulfonilbenzoico (AMBA) para a
linhagem de Bacillus sp. 3B6 (Alferness e Wiebe, 2002; Durand et al., 2006),
sendo que AMBA tem demonstrado ser mais tóxico que a molécula original
(Bonnet et al., 2008 e Mitchell et al., 2001). O estudo com Pantoea ananatis
CCT 7673 demonstrou a degradação do herbicida em uma rota diferente à
descrita anteriormente, apresentando provavelmente produtos metabólicos
menos tóxicos que a molécula original (Pileggi et al., 2012).
33
Figura 1: Molécula do herbicida mesotrione
Os métodos analíticos constituem-se em técnicas rápidas e eficientes
para quantificações e detecções de xenobióticos (Brondi et al., 2004). A
principal forma de análise e detecção de herbicidas no solo, água e para
caracterização da capacidade de degradação de microrganismos é pela
cromatografia liquida de alta eficiência acoplada a um detector UV (CLAE-UV)
(Fernández et al., 2013; Yan et al., 2013), considerada uma ferramenta barata e
de rápida obtenção de resultados. A validação de métodos cromatográficos
vem facilitando a utilização deste meio para quantificação de xenobióticos
(principalmente herbicidas) no ambiente (Beceiro-González et al., 2007;
Rodriguez et al., 2007).
Assim é interesse de muitos grupos de pesquisa estudar novas
metodologias cromatográficas, que permitam a quantificação dos herbicidas
presentes no solo em diferentes concentrações. O presente trabalho tem como
objetivo apresentar o desenvolvimento e validação de um método empregando
HPLC-DAD para quantificação do mesotrione e assim avaliar a cinética de
degradação deste herbicida no meio ambiente.
4.1.2 Material e métodos
4.1.2.1 Químicos
Para experimentos em CLAE foi utilizado o padrão analítico da Pestanal
(Sigma-Aldrich). A solução padrão utilizado nas análises cromatográficas de
mesotrione foi obtida dissolvendo 100 mg do herbicida (Syngenta Crop
34
Protection, Greensboro, NC (USA), 99% de pureza) em 1,5 mL de acetonitrila,
obtendo-se uma concentração de 196,5 mM. A solução foi estocada a 4°C.
4.1.2.2 Químicos e condições CLAE
A acetonitrila (J.T.Baker, Philipsburg, PA, USA) utilizada foi grau CLAE e
o ácido fosfórico (Synth, Diadema, SP, Brazil) utilizado foi reagente P.A. A água
foi purificada com sistema Millipore Milli-Q. A coluna utilizada foi a Eclipse XDB
C18 fase-reversa (150 mm × 4.6 mm, 3,5 μm). As análises foram realizadas no
sistema de CLAE Waters 2695.
Para a cromatografia liquida de alta eficiência (CLAE) o volume de
injeção foi de 50 µL com uma fase móvel constituída de água (acidificada com
ácido fosfórico 0,1%- pH 3,2) (A) e acetonitrila (B), iniciando em 30 % B, 30 % à
55 % B em 15 min, 55 para 100 % B em 17 min, mantendo isocrático até 18
min, depois voltando ao gradiente inicial em 30 % B em 19 min, mantendo
isocrático até 29 min (condicionamento da coluna para nova injeção). As
separações foram realizadas à 20 °C e um fluxo de 1 mL/min. A detecção dos
compostos foi monitorada pelo detector foto diodo (detector DAD 200-400 nm)
com acompanhamento em 254 nm.
4.1.2.3 Validação do método cromatográfico por CLAE
O método de validação foi realizado de acordo com a resolução
brasileira seguindo os parâmetros de seletividade, linearidade variação da
aplicação, precisão, exatidão, recuperação, limites de detecção (LD) e
quantificação (LQ) (RE 899/2003).
4.1.2.4 Seletividade
Um detector DAD UV-VIS foi utilizado para identificar o pico e avaliar a
pureza do mesotrione. O tempo de retenção do padrão do mesotrione foi
também utilizado para determinação da seletividade.
4.1.2.5 Linearidade
A linearidade do ensaio foi determinada pela realização de duas curvas
de calibração (uma em solvente e outra em meio de cultura). As curvas de
calibração foram construídas aplicando cinco soluções padrões com
concentrações crescentes do herbicida mesotrione (0,01965 mM, 0,029475
35
mM, 0,0393 mM, 0,0786 mM, 0,1764 e 0,1965 mM), preparadas em triplicatas.
A curva de calibração foi montada utilizando o pico da área do herbicida no
cromatograma versus a concentração do composto.
4.1.2.6 Precisão e exatidão
Para determinar a precisão (intra e inter-dia) foi aplicado três diferentes
soluções preparadas nas concentrações de 0,05895 mM, 0,09825 mM e
0,17685 mM do herbicida mesotrione. Estas soluções foram lidas no primeiro,
terceiro e quinto dias depois da preparação da solução, e a exatidão do método
foi avaliada pelo cálculo de retorno das concentrações encontradas
comparativamente com as concentrações teóricas.
4.1.2.7 Limites de detecção e quantificação
Para determinar o limite de detecção, foi avaliado a concentração de
herbicida em que a área do pico atingisse o valor de três vezes o ruído do
cromatrograma, e o limite de quantificação foi considerado a concentração em
que o valor fosse dez vezes o valor do ruído.
4.1.2.8 Robustez
A solução padrão foi preparado em triplicatas e analisados variando o pH
e a temperatura nas condição da corrida, avaliando a área do pico e o tempo
de retenção.
4.1.3 Resultados e discussão
4.1.3.1 Otimização de condições cromatográficas
A fim de determinar a capacidade de degradação do herbicida
mesotrione por microrganismos, métodos de análise por CLAE, são
empregados. Durand et al. (2006) desenvolveram uma condição
cromatográfica em CLAE, em uma corrida de 40 minutos, usando um fluxo de
0,3 mL/min. e água acidificada (ácido fosfórico, 0,1 % v/v; pH 2.6) e acetonitrila
como solventes. Gradiente: 0–5 min, 5 % B; 5–25 min, 5–95% B; 25–30 min,
95% B; 30–35 min, 95–5% B; 35–40 min, 5% B). Estes pesquisadores
determinaram a presença do herbicida presente em culturas de Bacillus sp.
3B6. Neste trabalho, o método desenvolvido apresentou um tempo otimizado
36
de análise do mesotrione quando comparado com outros trabalhos
apresentados na literatura, tendo a banda cromatográfica do herbicida em boa
resolução frente os demais componentes da matriz analisada. Com as
condições cromatográficas otimizadas, foi estipulado um protocolo de validação
do método baseado na RDC nº 899/2003 da ANVISA.
4.1.3.2 Metodologia de validação
A curva analítica foi realizada utilizando seis pontos nas concentrações
de 0,01965 mM até 0,1965 mM, incluindo a concentração de 0,0393 mM, que,
de acordo com Pileggi et al. (2012) corresponde a concentração de mesotrione
utilizada em campo. Foi observada linearidade na curva analítica no intervalo
de concentração avaliado para o mesotrione. A equação da reta foi
determinada como sendo y= 307 * x + 110496, com um coeficiente de
correlação de 0,9998 com coeficientes de variação menores que 5% para as
triplicatas dos pontos analisados (Fig. 2).
Figura 2: Curva analítica do herbicida mesotrione por HPLC.
A pureza da banda cromatográfica do mesotrione foi avaliada entre 200-
400 nm para a amostra e o padrão, empregando um detector de diodos e a
seletividade foi estabelecida. A precisão e exatidão do método foram
determinadas realizando a análise de triplicatas de três amostras de
concentrações diferentes das concentrações usadas para montagem da curva
de calibração, em dias não consecutivos. Os resultados demonstraram valores
adequados de precisão e exatidão para os controles de qualidade avaliados
y = 3E+07x + 110496
R² = 0,9998
0
1000000
2000000
3000000
4000000
5000000
6000000
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25
Áre
a d
o h
erb
icid
a m
eso
trio
ne
Concentração do herbicida mesotrione (mM)
37
(Tabela 1). Os limites de quantificação e detecção foram 9,825 µM e 0,3 µM,
respectivamente.
A quantificação de pontos abaixo de 0,0393 mM é importante em
experimentos de degradação de herbicidas, pois assim é possível
determinação a concentração do xenobiótico ainda presente no ambiente. A
determinação da estabilidade da amostra no auto-injetor foi avaliada durante 7
dias a 20º C. Observou-se que durante este período a amostra manteve-se
estável apresentando coeficientes de variação dentro dos limites estabelecidos
pela norma, indicando que amostras mantidas até sete dias sob temperatura
ambiente mantém a exatidão na quantificação do mesotrione.
A robustez do método foi avaliada por meio da variação de dois fatores,
temperatura (22 e 25 °C), e pH (3,4 e 3,6). As características e tempo de
retenção das bandas de mesotrione não sofreram variação significativa,
demonstrando que a técnica é robusta sob as condições avaliadas.
Tabela 1: Quantificação de concentrações não presentes na curva padrão.
Repro (mM) CV% Tempo de
retenção Exatidão (%)
0,05895 3,97 9,368 104,1
0,9825 2,71 9,307 102,2
0,17685 3,70 9,354 106,9
4.1.3.3 Aplicabilidade do método
Foi verificada a interferência da matriz (cultivo bacteriano em meio de
cultura) na análise do mesotrione. A solução padrão (0,0393 mM) foi utilizada
(Tabela 2), sendo encontrada boa exatidão em comparação a equação da
curva de calibração. Esta boa relação observada entre a curva feita em
solvente e os dados em cultivo bacteriano, indica que a matriz não interfere na
determinação do mesotrione.
38
O método validado foi empregado para determinação do mesotrione em
amostras contendo a bactéria E. coli DH5-α.
Algumas bactérias, como Bacillus sp. 3B6 e Pantoea ananatis CCT
7673, apresentam a capacidade de degradar completamente o herbicida em 24
e 17 horas respectivamente (Durand et al., 2006 e Pileggi et al., 2012). Porém
em determinadas condições, o processo de degradação passa a ser menor
como descrito para P.ananatis CCT 7673 cultivada em meio de cultura sem a
disponibilidade de glucose (Pileggi et al., 2012). O método cromatográfico
validado facilita a determinação da concentração do herbicida ainda presente
em meio de cultura, dados que até o momento não foram levados em
consideração em artigos que envolvem a degradação do herbicida mesotrione.
Tabela 2: Especificidade de detecção do herbicida mesotrione.
Concentração Tempo de retenção Exatidão (%)
0,0393 9,374 92,8
0,0393 9,323 98,2
0,0393 9,399 100,5
4.1.4 Conclusões
Foi realizado o processo de validação em HPLC para o herbicida
mesotrione, sendo observado uma linearidade e precisão na detecção do
herbicida nas concentrações de 0,01965 mM até 0,1965 mM, com um
coeficiente de correlação de 0.9998, e estipulados os limites de detecção e
quantificação que irão dar segurança nas análises de degradação ou presença
do herbicida mesotrione em amostras ambientais. Assim, foi proposto uma
metodologia rápida e precisa para detecção do herbicida mesotrione em
amostras ambientais.
4.1.5 Referências bibliográficas
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41
4.2 Mecanismos de tolerância e alta capacidade de degradação do
herbicida mesotrione pela linhagem E. coli DH5-α
Mechanisms of tolerance and high capacity degradation of the herbicide
mesotrione by the E. coli DH5-α strain
Resumo O uso intensivo de agroquímicos tem assumido um papel relevante no
aumento da produção agrícola, mas um dos impactos gerados é a mudança na
estrutura populacional de microbiotas de solo, que precisam tolerar os
xenobióticos aplicados para sobreviver. Uma pergunta pertinente é se estes
mecanismos são selecionados pela presença de diferentes agroquímicos em
solo, ou se há mecanismos constitutivos de adaptação. O objetivo deste
trabalho foi avaliar o sistema de defesa de uma linhagem não ambiental, a E.
coli DH5-α, em relação ao herbicida mesotrione, com o qual não houve contato
prévio em solo. Resultados obtidos mostraram que esta linhagem foi capaz de
tolerar elevadas doses do herbicida, e a determinação do herbicida por um
método desenvolvido e validado por cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE) demonstrou a não detecção do herbicida mesotrione na amostra após
3 h de exposição. Taxas de crescimento no tratamento com o herbicida foram
menores em relação ao controle nos tempos anteriores ao período de
degradação, mostrando o efeito tóxico sobre as células bacterianas. Como
sistemas de defesa, constataram-se a alteração na saturação dos lipídeos de
membrana, diminuindo os danos causados pelas espécies ativas de oxigênio e
possivelmente dificultando a entrada do xenobiótico na célula, além da atuação
da enzima GST no sistema antioxidante e no processo de metabolização do
herbicida. Considerando que a E. coli DH5-α não apresentou um contato prévio
com o mesotrione, o sistema de defesa encontrado nesta linhagem pode ser
considerado como geral e não específico. Esta estratégia pode ser interessante
na adaptação de linhagens bacterianas em solos agrícolas, os quais são
submetidos a regimes de trocas de herbicidas de maneira cada vez mais
intensa.
42
Palavras-chave: Callisto, biorremediação, biodegradação de herbicidas,
peroxidação lipídica, Glutationa-S-Transferase, saturação de lipídeos, CLAE.
Abstract
The intensive use of agrochemicals has assumed an important role in
increasing agricultural production; however, one of the impacts has been
changes in population structure of microbiota in the soil, which need to tolerate
the xenobiotics that are applied in order to survive. A pertinent question is
whether these mechanisms are selected by the presence of different
agrochemicals in soils, or if there are constitutive mechanisms of adaptation.
The aim of this study was to evaluate the defense system of an un-
environmental strain, E. coli DH5-α, in relation to the herbicide mesotrione,
which had no prior contact with the soil. The results showed that this strain was
able to tolerate higher doses of the herbicide, and that the determination of the
herbicide by a method developed and validated by high performance liquid
chromatography (HPLC), made it possible to determine the complete
disappearance of mesotrione in the sample after 3 h of exposure. Growth rates
in the treatment with the herbicide were lower than the control, prior to the
period of degradation, showing the toxic effect on the bacterial cells. As regards
defense systems, it was noted that changes in the saturation of the membrane
lipids reduced the damage caused by reactive oxygen species and possibly
hindered the entry of xenobiotics in the cell, as well as activating GST enzyme
activity in the antioxidant system and in the metabolizing process of the
herbicide. Considering that E. coli DH5-α showed no previous contact with
mesotrione, the defense system found in this strain can be considered as
general and non-specific. This strategy may be interesting in the adaptation of
bacterial strains in agricultural soils, which are subject to changing herbicides in
an ever more intense manner.
Keywords: Callisto, bioremediation, biodegradation of herbicides, lipid
peroxidation, Glutathione-S-Transferase, lipid saturation, HPLC.
43
4.2.1 Introdução
A partir dos anos 60, a população mundial passou de 3 bilhões para 6,8
bilhões de pessoas, e consequentemente aumentou a demanda de alimentos e
matéria prima (Donaldson, 2010). A fim de suprir esta necessidade, foi
necessário um aumento na produtividade da agricultura e um aumento das
áreas cultiváveis, e isto foi acompanhado pelo uso de agroquímicos e
fertilizantes (Armas et al., 2007, Sands et al., 2009). Cerca de 2,27 milhões de
toneladas de agroquímicos são lançados anualmente no meio ambiente, sendo
que 35% correspondem aos herbicidas (Vercreaene-Eairmal et al., 2010).
Apesar da utilização de agrotóxicos na agricultura ter beneficiado a
produtividade de culturas, surgiram algumas preocupações quanto aos efeitos
adversos destes químicos (Jiang et al., 2008), uma vez que apenas 0,1%
destes atingem seus alvos específicos e, portanto, grande parte permanece no
ambiente (Lopez-Perez et al., 2006; Martins et al., 2007; Sharma et al., 2010).
A utilização de microrganismos é a principal estratégia para eliminação
de xenobióticos, principalmente herbicidas, do meio ambiente, sendo alvo de
diversos estudos em biotecnologia (Silva et al., 2007; Martins et al., 2011). A
bioaumentação é uma das técnicas mais utilizadas, no entanto uma ou várias
semanas são necessárias para a eliminação de uma elevada concentração de
herbicidas para níveis mais baixos, como no caso da atrazina em que esta
técnica já é empregada (Wang et al., 2013).
As espécies reativas de oxigênio (EROs), além de fazer parte do
metabolismo aeróbico normal (Scandalios et al., 2005), podem ter sua taxa
aumentada em decorrência da exposição a substâncias tóxicas, como por
exemplo o contato de bactérias com herbicidas (Bhattacharjee, 2005). Um
aumento nas taxas de peróxido de hidrogênio (H2O2), radical superóxido (O2-) e
radical hidroxila (OH•) podem causar danos ao DNA, RNA, proteínas e lipídeos
(Cabiscol et al., 2000; Azevedo et al., 2012). Um eficiente sistema enzimático
antioxidante é a principal linha de defesa para a eliminação das EROs, como
por exemplo a ação de catalases, superóxido dismutases, peroxidases e
glutationa redutases (Gratão et al., 2005). A enzima glutationa S-transferase
(GST), além de participar do sistema da homeostase redox e resposta a EROs
(Allocati et al., 2003), catalisa a conjugação do herbicida com a glutationa,
44
podendo atuar no processo de degradação de alguns herbicidas, e é também
responsável pela resistência a antibióticos (Allocati et al., 2009).
O mesotrione, princípio ativo do herbicida Callisto, apresenta ação
seletiva e é indicado para o controle pré e pós-emergente de plantas daninhas
na cultura do milho, de aplicação sistêmica, sendo indicado para combater os
principais infestantes de folhas largas (Batisson et al., 2009). Esta molécula é
derivada de uma fitotoxina produzida pela planta Callistemon citrinus, e atua
inibindo a enzima 4-hidroxifenilpiruvato dioxigenase (HPPD), interferindo na
síntese de carotenóides (Mitchell et al., 2001).
Os produtos da degradação do mesotrione pela linhagem Bacillus sp.
foram o ácido 4-metilsulfonil-2-nitrobenzoico (MNBA) e ácido 2-amino-4-
metilsulfonilbenzoico (AMBA) (Alferness e Wiebe, 2002; Durand et al., 2010),
sendo que AMBA foi caracterizado como sendo mais tóxico que a molécula
original (Mitchell et al., 2001; Bonnet et al., 2008). Estudos em Pantoea
ananatis demonstraram a degradação do herbicida em uma rota diferente,
apresentando produtos metabólicos provavelmente menos tóxicos que a
molécula original (Pileggi et al., 2012).
Atualmente as linhagens de E. coli são utilizadas para determinar os
efeitos tóxicos de xenobióticos (Botelho et al., 2012), principalmente por ser
considerado um organismo modelo (Sondi e Salopek-Sondi, 2004) e muito
utilizada em estudos de transmissibilidade de genes em tecnologias do DNA
recombinante (Williams et al., 2009). Até o momento não foram realizados
estudos da capacidade de degradação sem uma modificação prévia da
linhagem.
Tendo em vista o efeito tóxico dos herbicidas em linhagens bacterianas,
tivemos como objetivo avaliar se uma linhagem laboratorial ou não ambiental
(Escherichia coli DH5-α) possui mecanismos de adaptação ao mesotrione,
mesmo sem ter ocorrido contato prévio com este herbicida.
45
4.2.2 Materiais e métodos
4.2.2.1 Linhagem Bacteriana
A cepa de Escherichia coli utilizada para avaliar a degradação do
herbicida mesotrione foi a DH5-α (Genótipo: F-φ80dlacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)
U169 deoR, recA1 endA1 hsdR17 (rk- mk
+) phoA supE44λ- thi-1 gyrA96 relA1).
4.2.2.2 Herbicidas
A formulação comercial utilizada neste estudo foi o Callisto, que contém
48% de mesotrione (ingrediente ativo) (Fig. 1) e os adjuvantes benzisotiazolin-
1.2-3-one, 1-octanol, poly (oxy-1, 2-etanediil) e alpha-isodecyl-omega-hydroxy-
phosphate, dentre outros (www.syngenta-crop.co.uk). O mesotrione foi cedido
pela Syngenta Crop Protection, Greensboro, NC (USA). Para experimentos em
CLAE foi utilizado o padrão analítico da Pestanal (Sigma-Aldrich).
Figura 1: Estrutura molecular do herbicida mesotrione.
4.2.2.3 Condições de crescimento bacteriano
Os meios utilizados foram: LB (Caldo Luria: 10 g L-1 de triptona, 5 g L-1
de extrato de levedura e 10 g L-1 de NaCl), LB+M (LB com 0,04 mM
mesotrione: 1 × FR [Field Rate]), LB+C (LB com Callisto, na concentração
equivalente de 0,04 mM de mesotrione), LB+M 10 × (LB com 0,4 mM de
mesotrione) LB+C 10 × (LB com Callisto, na concentração equivalente de 0,4
mM de mesotrione) e crescidos a 37°C sob agitação de 150 rpm.
46
O pré-inóculo foi obtido pelo crescimento da linhagem em LB em fase
log de crescimento (5 h de incubação). As células foram centrifugadas durante
10 min. a 8.000 g e lavadas duas vezes com tampão PBS (Tampão fosfato
salino: 8 g L-1 de NaCl; 0,2 g L-1 de KCl; 1,44 g L-1 de Na2HPO4; 0,24 g L-1 de
KH2PO4). O pré-inóculo foi transferido para cada tratamento em uma O.D.
inicial de 0,05 a 600 nm, sendo diluídas as amostras sempre que as leituras
atingissem valores de aproximadamente 0,6, para minimizar os erros nas
mesmas, sendo os valores multiplicados pelos fatores de diluição
correspondentes.
4.2.2.4 Avaliação de degradação do herbicida por CLAE
Para determinar a capacidade de degradação do mesotrione, a linhagem
foi crescida em 100 mL de LB em frascos de 250 mL e incubada a 37°C em
agitador orbital a 200 rpm. As células foram coletadas após 10 h e
centrifugadas a 8.000 g durante 10 min. a 4°C. O precipitado foi lavado duas
vezes com PBS. As células foram então ressuspendidas em 10 mL de MM
(Meio Mineral, contendo 10 mM de tampão fosfato de potássio, pH 7,0; 3 g L-1
de NaNO3; 0,5 g L-1 de MgSO4; 0,5 g L-1 de KCl; 0,01 g L-1 de FeSO4; 0,04 g L-1
de CaCl2; 0,001 g L-1 de MnSO4; 0,4 g L-1 de glucose, e 0,04 mM mesotrione
[Callisto]), e incubados a 37°C em agitador orbital (200 rpm). Alíquotas (1 mL)
foram coletadas do meio de cultura em cada hora de incubação (de 0 a 12 h) e
centrifugadas a 13.000 g durante 5 min. O sobrenadante (0,9 mL) foi congelado
para posterior análise em CLAE. As amostras foram então filtradas em filtros de
seringa 0,22 µm.As análises foram realizadas em CLAE (Waters Alliance
e2695), complementado pelo detector foto-diodo no comprimento de onda de
254 nm. Foi utilizada a coluna Eclipse XDB-C18, com dimensões de 4,6 mm X
150 a 3,5 µm , para separação, sendo submetida a uma temperatura de 20 oC.
O gradiente da fase móvel iniciou com 70% água (0,1% ácido fosfórico) (A) :
30% Acetonitrila (B); 30% B em 3 min.; 55% B em 15 min.; 100% B em 17 min.;
100% B em 18 min.; 30% B em 19 min. e 30% B em 29 min. O fluxo foi de 1 mL
min-1. O volume de injeção das amostras foi de 50 µL.
47
4.2.2.5 Viabilidade celular
A bactéria foi crescida durante 10 h a 37°C em 1,2 L de LB. As células
foram centrifugadas a 8.000 g durante 10 min. e lavadas duas vezes com PBS,
e divididas em frascos com 50 mL de MM (controle), MMM, -C (MM sem fontes
de carbono), e -CM (MMM com mesotrione como única fonte de carbono).
Todos os frascos foram incubados a 37°C e retiradas alíquotas de 100 µL nos
tempos de 30 min., 3 h e 6 h. As amostras foram diluídas até 10-8, plaqueadas
em LB e incubadas à 37°C. Após 12 horas foi realizado a contagem da UFC.
4.2.2.6 Peroxidação lipídica
A peroxidação lipídica foi determinada pelos níveis de malondialdeído
(MDA) (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) (Heath and Packer, 1968).
As concentrações de MDA foram monitoradas a 535 e 600 nm e as suas
concentrações foram calculadas utilizando um coeficiente de extinção de 155
mMcm-1.
4.2.2.7 Extração de proteínas para análises de estresse oxidativo
A bactéria foi crescida durante 10 h a 37°C em 3,6 L de LB. As células
foram centrifugadas a 8.000 g durante 10 min. e lavadas duas vezes com PBS,
e divididas em frascos com 50 mL de MM (controle), MMM, -C (MM sem fontes
de carbono), e -CM (MMM com mesotrione como única fonte de carbono).
Todos os frascos foram incubados a 37°C e realizadas as extrações nos
tempos de 30 min., 3 h e 6 h.
Para a extração das enzimas, as culturas foram centrifugadas a 8.000 g
durante 10 min. e o precipitado foi macerado com nitrogênio líquido e
homogeneizado (1:10 m/v) em 100 mM de tampão fosfato de potássio (pH 7,5),
contendo 1 mM ethylene-diaminetetra-acetic acid (EDTA), 3 mM DL-
dithiothreitol (DTT), e 5% (m/v) polyvinylpolypyrrolidone (PVPP) (Gomes Júnior
et al., 2007), mantidas sempre a 4°C. O homogeneizado foi centrifugado a
10.000 g durante 30 min., e o sobrenadante foi separado em alíquotas,
congeladas a -80°C para posteriores análises enzimáticas. A concentração de
proteínas foi realizada pelo método de Bradford (1976), utilizando BSA como
padrão.
48
4.2.2.8 Análise protéica por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida
(PAGE)
A eletroforese foi realizada em géis contendo 12% de poliacrilamida com
4% de gel de empilhamento. Para SOD-PAGE, o SDS foi eliminado. Uma
corrente de 15 mA gel-1 foi aplicada durante 3 h (gel para atividade de SOD), ou
2 h (gel para perfil proteico), a 4°C. Quantidades iguais de proteína (20 µg)
foram aplicadas nos ensaios enzimáticos. Para SDS-PAGE o gel foi lavado em
água destilada e incubado durante a noite em 0,05% de Coomassie blue R-250
em solução na proporção de 40:7:53 de metanol:ácido acético:água (v/v/v) e
descorado com sucessivas lavagens utilizando uma solução na proporção de
40:7:53 de metanol:ácido acético:água (v/v/v) (Gratão et al., 2008).
A atividade de SOD-PAGE foi realizada de acordo com Beauchamp e
Fridovich (1971) e modificado por Medici et al. (2004), no qual os géis foram
lavados em água destilada e incubados no escuro durante 30 min. em 50 mM
de tampão fosfato de potássio (pH 7,8) contendo 1 mM EDTA, 0,005 mM de
riboflavina, 0,1 mM de nitroblue tetrazolium e 0,3% de N,N,N´,N´-
tetramethylethylenediamine. Para controle da reação foi utilizado uma unidade
de SOD de fígado bovino (Sigma). Os géis foram expostos à luz branca e
imersos em água até a revelação das bandas de SOD.
4.2.2.9 Atividade de CAT
A atividade de CAT foi determinada de acordo com Kraus, Mckersie e
Fletcher (1995). Em uma solução contendo 1 mL de tampão fosfato de potássio
100 mM (pH 7,5) e 2,5 µL H2O2 (solução 30%) e quantificada em
espectrofotômetro a 25°C. A reação foi iniciada com a adição de 25 µL do
extrato proteico e a atividade determinada seguindo a decomposição do H2O2 a
240 nm durante 1 min.
4.2.2.10 Atividade de GST
A atividade de GST foi quantificada em um solução contendo 900 μL de
tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 6,8), na qual foi adicionado 25 μL de 1-
cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) 40 mM e 50 μL de Glutationa reduzida (GSH)
49
0,1 M, e incubada a 30°C (Zablotowicz et al., 1995). A reação iniciou-se com a
adição de 25 μL do extrato proteico, sendo monitorada durante 2 min. a 340
nm.
4.2.2.11 Análise de saturação de lipídeos
A linhagem bacteriana foi crescida em 800 mL de LB e incubada a 37°C
sob agitação de 200 rpm. Após 12 h, as amostras foram centrifugadas a 8.000
g durante 5 min. a 4°C. O precipitado foi lavado duas vezes com tampão PBS e
dividido em frascos contendo 50 mL com os meios LB e LB+M, em triplicatas, e
as culturas foram incubadas a 37°C e agitados a 200 rpm. Após 12 h foi
realizada a extração de lipídeos como descrito por Bligh e Dyer (1959), com
modificações. Os lipídeos de membrana foram analisados por espectroscopia
de infravermelho FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) em
transmitância, nos comprimentos de onda de 400 a 4000 cm-1 e os resultados
foram avaliados por meio da análise de componentes principais (PCA), pelo
programa Pirouette v 4,0 (Infometrix, Bothell, WA, EUA) nos comprimentos de
onda de 1400 a 3200 cm-1.
4.2.3 Resultados e Discussão
4.2.3.1 Capacidade de degradação do mesotrione por E. coli DH5-α
As linhagens de E. coli são consideradas modelo em estudos com
bactérias (Sondi e Salopek-Sondi, 2004). Trabalhos vêm utilizando a linhagem
E. coli DH5-α como receptora de material genético, sendo uma das linhagens
mais utilizadas como ferramenta da tecnologia do DNA recombinante (Williams
et al., 2009; Souza et al., 1995; Penna et al., 2004). Assim, consideramos esta
linhagem como laboratorial ou não ambiental, e sem contato prévio com
herbicidas.
O efeito do mesotrione e do Callisto sob o crescimento da linhagem E.
coli DH5-α foi avaliado nas concentrações de 0,04 mM (dose de campo) e 0,4
mM (10 × mais concentrado) (Fig. 2).
50
Figura 2: Curvas de crescimento de E. coli DH5-α no controle (LB), e nos tratamentos
LB+M, LB+C, LB+M 10 × e LB+C 10 ×, considerando O.D. de 600 nm.
Observou-se que a E. coli DH5-α não apresentou diferenças
significativas de crescimento, mesmo em concentrações de herbicida 10 × (Fig.
2). A avaliação in vitro de efeitos de toxicidade de herbicidas demonstram um
efeito negativo no crescimento de linhagens de E. coli, principalmente em
doses elevadas (Botelho et al., 2012), além de servir como modelo para
identificação dos genes e atividades enzimáticas envolvidas no sistema anti-
oxidante de forma geral (Greenberg et al. 1990; Isarankura-Na-Ayudhya et al.,
2010; Lizuka, 1989). Até o momento não foram realizados estudos envolvendo
a capacidade de metabolização de herbicidas em linhagens não ambientais,
como a E. coli DH5-α.
Segundo Batisson et al. (2009), o mesotrione em altas concentrações
pode alterar a comunidade microbiana, selecionando linhagens tolerantes ou
degradadoras do herbicida. Foram descritas as linhagens Bacillus sp. 3B6
(Durand et al., 2006) e P. ananatis CCT 7673 (Pileggi et al., 2012), com
capacidade de degradar o mesotrione em 24 h e 18 h, respectivamente. Já a E.
coli DH5-α consegue biotransformar 100% do herbicida em apenas 3 h de
exposição em MMM (Fig. 3), e 76% em -CM (dados não mostrados). P.
ananatis CCT 7673 não apresentou capacidade de metabolizar o herbicida sem
a presença de carbono. A degradação de herbicidas, inclusive em baixas
concentrações de carbono, é de interesse biotecnológico.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
D.O
.
Tempo (horas)
LB
LB+M
LB+C
LB+M 10x
LB+C 10x
51
Figura 3: Cromatogramas indicando a degradação do mesotrione por E. coli DH5-α.
Painel superior: 0 h de incubação em MMM. Painel inferior: 3 h de incubação em
MMM. Pico do mesotrione observado no tempo de retenção de 9,65 min.
Nos estudos de degradação do mesotrione em solo, foi observado que a
maior taxa de degradação ocorre com a aplicação de 10 × e 100 × a dose de
campo, tanto do mesotrione quanto do Callisto (Crouzet et al., 2010), porém P.
ananatis CCT 7673 (linhagem isolada de água) foi capaz de metabolizar
totalmente o herbicida mesotrione, mas não apresentou a capacidade de
crescer em contato com o herbicida em doses elevadas (Pileggi et al., 2012). E.
coli DH5-α foi capaz de crescer e degradar o herbicida em 10 × FR e em um
menor período de incubação. Esta capacidade de tolerância pode ser explicada
pela rápida metabolização, considerando que o processo de degradação se dá
assim que a linhagem entra em contato com o xenobiótico, diminuindo o tempo
de exposição da bactéria ao químico, iniciando a fase exponencial de
crescimento (aproximadamente 1,5 h após inóculo inicial) (Fig. 2) no momento
em que o herbicida se encontra em uma concentração mais baixa
(aproximadamente 30% da concentração inicial), como demonstrado na
cinética de degradação (Fig. 4).
52
Figura 4: Cinética de degradação de mesotrione por E. coli DH5-α.
Trabalhos desenvolvidos com o herbicida mesotrione relatam a
dificuldade de encontrar genes específicos para a degradação deste herbicida
(Durand et al., 2006; Pileggi et al., 2012). De acordo com Pileggi et al. (2012),
as linhagens E. coli DH5-α, TOP 10, e K-12 apresentaram a capacidade de
metabolizar o herbicida, e por se tratarem de linhagens desenvolvidas em
laboratório, sem contato prévio com o mesotrione, tal fato pode indicar que não
houve pressão para seleção de genes específicos para a degradação deste
herbicida.
4.2.3.2 Caracterização do herbicida mesotrione como agente estressante
A fim de verificar os danos que o mesotrione pode causar no
crescimento da E. coli DH5-α, foi avaliada a sua viabilidade celular, nas
mesmas condições de crescimento para extração de proteínas (Fig. 5).
Constatou-se que o desaparecimento do herbicida mesotrione se dá em 3 h de
exposição (Fig. 3), e que o processo de metabolização é iniciado na primeira
hora (Fig. 4), portanto a linhagem de E. coli DH5-α ainda está em contato com
o herbicida no tempo de 30 min. Neste período podemos observar que ocorre
uma diminuição de viabilidade celular nos tratamentos com a presença do
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Deg
rad
açã
o (%
)
Tempo (horas)
53
herbicida (MMM e -CM), se comparado com os controles (MM e -C) (Fig. 5),
indicando um efeito tóxico do herbicida sobre a E. coli DH5-α. Nos períodos de
3 e 6 h observou-se uma equiparação nas taxas de viabilidade em todos os
tratamentos, provavelmente devido à capacidade de suporte nutricional do
meio mineral para a linhagem de E. coli DH5-α.
Figura 5: Viabilidade celular de E. coli DH5-α em MM, e nos tratamentos MMM, -C e -
CM, nos períodos de 30 min., 3 h e 6 h.
Em um estudo realizado por Botelho et al. (2012), entre várias
formulações comerciais de herbicidas amplamente utilizadas, apenas o
herbicida paraquat diminuiu o crescimento da linhagem E. coli ATCC 25922. No
presente estudo doses de campo (1× FR) do mesotrione, que é considerado
menos tóxico que o herbicida comercial (Mitchell et al., 2001), diminuiu a
viabilidade de E. coli DH5-α no período de 30 min. nos tratamentos com a
presença do herbicida mesotrione (MM e -CM) (Fig. 5).
Balagué et al. (2000) utilizaram as doses de 2 mM, 1 mM, 0,1 mM, e
0,01 mM do herbicida 2,4-D em leituras em espectrofotômetro, verificando
inibição do crescimento de E. coli HB101 apenas na dose de 2 mM. Os dados
de crescimento (Fig. 2) não demonstraram diferenças nem mesmo em taxas de
10 × a dose de campo, tanto com o herbicida comercial, como com o seu
princípio ativo. Estes resultados indicam a importância de estudos envolvendo
viabilidade celular, pois pequenas taxas de variação no crescimento podem não
ser detectadas em espectrofotômetro.
11,2
11,3
11,4
11,5
11,6
11,7
11,8
11,9
12,0
12,1
MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM
30 min. 3 h 6 h
Lo
g U
FC
mL
-1
54
A taxa de MDA é utilizada como indicador da peroxidação lipídica em
diversos estudos que envolvem estresse oxidativo (Lima e Abdalla, 2001). Em
E. coli DH5-α, no período de 30 min., no qual o mesotrione ainda permanece
no meio de cultura, o tratamento -CM apresentou menores taxas de danos na
membrana (Fig. 6). Apesar da viabilidade celular ser afetada com a presença
de mesotrione (Fig. 5), as taxas de MDA nos três tempos analisados não
apresentaram um aumento na taxa de peroxidação lipídica nos tratamentos -
CM. Já nos tratamentos MMM, em todos os tempos ocorreu um aumento do
MDA, demonstrando efeitos tóxicos por EROs.
Figura 6: Níveis de MDA em E. coli DH5-α em MM, e nos tratamento MMM, -C e -CM,
nos períodos de 30 min, 3 h e 6 h, respectivamente.
4.2.3.3 Influência do mesotrione sobre o nível de saturação de lipídeos
Análises de espectrograma de infravermelho mostraram alterações na
estrutura dos lipídeos de membrana da linhagem de E. coli DH5-α, na presença
do herbicida mesotrione (Fig. 7). Segundo Böger et al. (2000), um aumento na
proporção de ácidos graxos insaturados na membrana celular de bactérias
tornam mais susceptíveis o ataque por EROs, induzindo taxas maiores de
MDA. Estas alterações nos lipídeos de membrana ocorrem nos herbicidas da
classe cloroacetanilidas. O estudo realizado por Balangué et al. (2000) com a
linhagem de E. coli HB101 e o 2,4-D demonstrou que a toxicidade do herbicida
pode reduzir a fluidez da membrana bacteriana, consequentemente alterarando
os resultados de MDA, como uma estratégia de defesa contra as EROs. Dados
semelhantes foram verificados por Sánchez et al. (2005), em que a linhagem
Klebsiella planticola DSZ, em contato com etanol ou o herbicida simazine,
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM
30 min. 3 h 6 h
Qu
anti
fica
ção
de
MD
A(n
mo
l/ m
ass
a f
resc
a)
55
apresentou uma diminuição na saturação de lipídeos de membrana, alterando
a taxa de permeabilidade seletiva, possivelmente como um sistema de defesa.
No presente estudo, tal alteração na constituição dos lipídeos de membrana de
E. coli DH5-α pode explicar a diminuição da taxa de MDA nos tratamentos sem
carbono com a presença do herbicida mesotrione (Fig. 6), já que os dados na
viabilidade celular (Fig. 5) mostraram que a presença do herbicida mesotrione
causam danos à bactéria no tempo de 30 min. Além da defesa contra EROs, a
alteração na permeabilidade seletiva pode estar prevenindo a entrada do
mesotrione, com o aumento da saturação dos lipídeos de membrana,
caracterizando um sistema de defesa contra xenobióticos.
Figura 7: Análise de lipídeos de E. coli DH5-α em FTIR. Pontos M2 e M5: controle sem
o mesotrione (LB), em duplicata. Pontos M1, M3 e M4: tratamento com mesotrione
(LB+M), em triplicata. Ponto B2: controle negativo, Bacillus sp. na ausência de
mesotrione.
4.2.3.4 Envolvimento de enzimas antioxidativas na defesa e degradação
do mesotrione
No gel de superóxido dismutase foram observadas alterações nas
bandas II e III nos tratamentos com carbono (MM e MMM) nos tempos de 30
min. e 3 h, se comparado com os tratamentos sem carbono (-C e -CM), porém
a presença do herbicida mesotrione não induziu uma isoforma específica de
SOD (Fig. 8). Provavelmente esta diferença de intensidade das bandas ocorreu
devido ao tempo de incubação da linhagem de E. coli DH5-α, e
56
consequentemente um aumento da quantidade do radical superóxido. No
tratamento com carbono (MM e MMM), quanto maior o tempo de crescimento,
maior foi a atividade da SOD, porém isto não ocorreu no tratamento sem
carbono (-CM).
Figura 8: Padrões de SOD-PAGE apresentados por E. coli DH5-α em MM (Linhas 1, 2
e 3), e nos tratamentos MMM (Linhas 4, 5 e 6), -C (Linhas 7, 8 e 9) e -CM (Linhas 10,
11 e 12), nos tempos de 30 min, 3 h e 6 h, respectivamente.
Houve um aumento de atividade de CAT de acordo com o tempo de
exposição nos meios de cultura com a presença de carbono (MM e MMM),
(Fig. 9), provavelmente pela adaptação e crescimento da linhagem ao meio
mineral, porém sem diferenças significativas em relação à presença do
mesotrione. Em linhagens de E. coli, de acordo com a fase de crescimento,
diferentes isoformas podem atuar, as quais apresentam vias de regulação
ativadas independentemente (Jung e Kim, 2003).
Nos meios de cultura sem carbono (-C e -CM), apesar de apresentar
uma atividade enzimática significativamente inferior nos meios com carbono, a
atividade de catalase foi maior nos meios com mesotrione, exceto no período
de 3 h de exposição (Fig. 9). No período de 30 min., no qual ainda não havia
ocorrido a completa degradação do herbicida, e por apresentar apenas o
mesotrione como fonte de carbono, a quantidade de peróxido de hidrogênio
pode ter aumentado em resposta ao próprio xenobiótico, estimulando a
atividade de CAT, comparativamente ao controle sem fonte de carbono (-C).
57
Figura 9: Atividade de CAT em E. coli DH5-α em MM, e nos tratamentos MMM, -C e -
CM, nos períodos de 30 min., 3 h e 6 h, respectivamente.
Em E. coli DH5-α a atividade de GST foi maior nos tratamentos de 30
min. de exposição na presença de mesotrione em relação aos controles sem a
presença do herbicida. Porém, no período de 3 h ocorreram diferenças
significativas apenas nas atividades entre os tratamentos e seus controles,
independente da presença do herbicida mesotrione (Fig. 10). Enzimas como a
GST já foram caracterizadas em plantas e microrganismos como ferramentas
de metabolização de herbicidas e outros produtos tóxicos em que a enzima
catalisa a conjugação da glutationa com o herbicida, marcando o composto a
ser degradado (Pickett, 1989; Oakley, 2011). Entretanto, há uma grande
diversidade nesta enzima, com várias funções ainda desconhecidas (Allocati et
al., 2008; Ma et al., 2009; Skopelitou et al., 2012). O reconhecimento de
moléculas orgânicas com caráter tóxico para microrganismos vem sendo
estudado em vários trabalhos, nos quais se pode observar que respostas aos
xenobióticos muitas vezes são realizadas por enzimas não específicas, como
nos trabalhos de Nagy et al. (1995) e Guengerich (1995), nos quais o citocromo
P-450 apresenta um envolvimento em processos de degradação dos herbicidas
EPTC (s-ethyl dipropylthiocarbamate) e atrazina.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM
30 min. 3 h 6 h
Ati
vid
ade
de
Cat
alas
e
(um
ol/
min
./m
g p
rot)
58
Figura 10: Atividade de GST de E. coli DH5-α em MM, e nos tratamentos MMM, -C, e -
CM, nos períodos de 30 min., 3 h e 6 h, respectivamente.
A linhagem de E. coli DH5-α apresenta a capacidade de transformar
100% do herbicida mesotrione em 3 h de exposição (Fig. 4). Levando em
consideração a atividade de GST no período em que a taxa de degradação é
elevada (período de 30 min.), provavelmente existe uma influência desta
enzima no processo de metabolização do herbicida, já que no período de 3 h,
quando o herbicida foi completamente degradado, a atividade da GST diminui.
Além de atuar na primeira transformação do herbicida, a enzima GST pode
estar envolvida também na eliminação das EROs e na adaptação da linhagem
ao meio de cultura (Van Eerd et al., 2003; McGuinness et al., 2007; Cummins et
al., 2011). A avaliação das enzimas catalase (Fig. 9) e superóxido dismutase
(Fig. 8) fornece evidências de que estas enzimas não apresentaram atividades
específicas para o herbicida em E. coli DH5-α. Já a GST pode estar atuando
diretamente no sistema de defesa contra as EROs e na degradação do
herbicida.
4.2.4 Conclusões
Foi observado que a linhagem de E. coli DH5-α tem um menor
crescimento em contato com o herbicida mesotrione. Os sistema de defesa
contra os efeitos deste herbicida foram a alteração na saturação em lipídeos de
membrana, a qual poderia diminuir a permeabilidade, e a atividade da enzima
GST, que além de defender contra EROs, provavelmente está envolvida no
processo de degradação. Considerando que esta linhagem não teve um
0,000
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM MM MMM -C -CM
30 min. 3 h 6 h
Ati
vid
ade
de
GST
(un
d o
f GST
/ m
g p
rote
ina/
min
.)
59
contato prévio com o herbicida, mas mesmo assim conseguiu se adaptar por
meio de mecanismos não específicos de tolerância e rápida degradação,
concluímos que E. coli DH5-α representa um modelo de plasticidade fenotípica
para adaptação a presença de moléculas tóxicas em seu ambiente. Se este
modelo também se aplicar a outras espécies bacterianas de solo e água, uma
dinâmica mais complexa e não apenas baseada em mudanças genotípicas
podem ser responsável pela adaptação a uma condição ambiental
caracterizada pela adição constante e rápida de novas substâncias químicas
tóxicas.
4.2.5 Referências bibliográficas
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