Biotecnología para la Yuca - COnnecting REpositories · la solución de éstos y otros problemas...

377

Biotecnología para la Yuca

CAPÍTULO 21


Martin Fregene*, Joe Tohme**, William Roca***,Paul ChavarriagaΨ, Roosevelt EscobarΨΨ y Hernán CeballosΨΨΨ

* Ph.D., Fitogenética Molecular, Líder del ProyectoGenética de Yuca, CIAT, Cali, Colombia.E-mail: [email protected]

** Ph.D., Fitogenética Molecular, Líder del Proyecto Usode la Agrobiodiversidad mediante la Biotecnología,CIAT. E-mail: [email protected]

*** Ph.D., Fisiología Vegetal, Líder del ProyectoBiodiversidad y Recursos Genéticos de Raíces yTubérculos Andinos, CIP, Lima, Perú.E-mail: [email protected]

Ψ M.Sc., Biotecnología y Botánica, Asociado deInvestigación, Unidad de Biotecnología, CIAT.E-mail: [email protected]

ΨΨ Bioquímico, Asistente de Investigación, Unidad deBiotecnología, CIAT. E-mail: [email protected]

ΨΨΨ Ph.D., Mejoramiento, Líder del Proyecto Mejoramientode Yuca, CIAT. E-mail: [email protected]

Introducción

La yuca es, probablemente, la especie vegetalmás eficiente del trópico en la producción, porunidad de área, de carbohidratos para lasnecesidades del pequeño agricultor. Su altaproductividad la convierte en una fuenteatractiva de materia prima renovable para laindustria; sin embargo, su cultivo presentaalgunos problemas de producción que puedenreducir considerablemente su rendimiento,restarle interérs y hacerlo menos rentable en elcompetitivo mercado de los carbohidratos deorigen vegetal.

Entre los probemas más serios del cultivo sepueden mencionar el ataque de variosorganismos patógenos (enfermedades), la falta desuficiente material sano y certificado para la‘siembra’, y el deterioro acelerado de las raícescosechadas. La biotecnología puede contribuir a

la solución de éstos y otros problemas parabeneficiar tanto a los productores,particularmente a los pequeños, como a losconsumidores.

Desde los años 80, el Centro Internacional deAgricultura Tropical (CIAT) ha investigado elpotencial de la biotecnología aplicada a la yuca,para entenderlo mejor y orientarlo a la soluciónde los problemas de este cultivo que escapan a laacción de los métodos convencionales demejoramiento. Tres grandes áreas se hanestudiado en el CIAT:

• Cultivo de tejidos para la limpieza ymultiplicación rápida de material sano(certificado) y para la conservación degermoplasma.

• Transformación genética para introducircaracterísticas agronómicas de interés queno existen naturalmente en la yuca, porejemplo, la resistencia a las enfermedades yel mejoramiento de la calidad del almidón.

• Marcadores moleculares, usados para hacermás eficiente el mejoramiento de la yuca ypara entender la estructura de su diversidadgenética.

El presente capítulo muestra el progresoalcanzado dentro y fuera del CIAT en estas tresáreas desde 1980. En él se describen en detallelas tecnologías de mayor aplicación o máspromisorias (p. ej., propagación ytransformación). Se exponen también, entérminos comprensibles, las necesidadestecnológicas más apremiantes que, una vezresueltas, permitirían avanzar rápidamentemediante el empleo de la biotecnología a losproblemas específicos del cultivo de la yuca.

378

La Yuca en el Tercer Milenio...

Alturade siembra

Sistema de propagación in vitro

La producción de material de ‘siembra’ (estacaspara plantar) mediante el cultivo de tejidos cobraespecial importancia para la yuca, cultivo en quese emplea el sistema convencional depropagación por estacas. Este sistema no puedesatisfacer la cuantiosa demanda de nuevosmateriales y se puede convertir, además, en unfoco de diseminación de plagas y enfermedadesque disminuyen la producción en los clones deinterés. La falta de una tecnología disponiblepara producir material de ‘siembra’ certificadoen Colombia, en cantidad suficiente, constituyeuna limitante seria para el establecimiento deeste cultivo a escala comercial.

Actualmente se conocen dos sistemas depropagación in vitro de la yuca:

- a partir de meristemas preexistentes, porejemplo, en nudos y ápices (Roca, 1984;Konan et al., 1997) o mediante el cultivo de“roseta” (Roca, 1984);

- propiciando la formación de novo deembriones somáticos, por ejemplo, inducidosa partir de hojas inmaduras o de meristemasapicales (Szabados et al., 1987).

El primer sistema de propagación (cultivo deápices y nudos) es el más común.Técnicamente, el segundo sistema (medianteembriones somáticos) sería el más eficiente,siempre y cuando se logre resolver el problemade la conversión de embrión a planta ycomprobar la estabilidad genética del materialrecuperado. Sin embargo, este sistema se usaampliamente por su eficiencia en latransformación genética y podría usarse en elfuturo para la producción de semilla sintética deyuca.

El uso de cultivos meristemáticosproporciona, en primer lugar, materiales élitelimpios, aptos para ‘siembra’, en cantidadesrazonables y con posibilidad de ser enviados aun solicitante local o internacional sin que seansometidos a restricciones cuarentenarias. SegúnRoca (1984), el sistema consiste (Figura 21-1) encolocar yemas o ápices en un medio de cultivosólido, en un ambiente estéril y bajo condicionescontroladas de cuarto de crecimiento (28 a30 °C, 12 horas de fotoperíodo y una intensidadde 1000 lux). Transcurridas 4 a 6 semanas, se

pueden obtener de tres a cuatro nuevosexplantes aptos para iniciar un nuevo ciclo depropagación.

Considerando estas tasas de propagación(1:3 a 1:4) y el tiempo que toma producir elmaterial (4 a 6 semanas por ciclo), estesistema no estaría en capacidad de producirgrandes cantidades de material de ‘siembra’para satisfacer una demanda masiva.Dentro del esquema actual, el sistemaestaría en capacidad de producir de 6 × 10³ a6 × 104 plantas por año.

En el Centro Internacional de InvestigaciónAgrícola para el Desarrollo (CIRAD, por suacrónimo en francés), Teisson y Alvard (1994)desarrollaron un sistema de multiplicaciónmasiva empleando biorreactores, denominadoRITA® (Recipiente para la Inmersión TransitoriaAutomatizada, en francés); el sistema ha sidoprobado con éxito en cultivos como café(Berthouly et al., 1995), banano (Alvard et al.,

Figura 21-1. Esquema de propagación in vitro a partir deuna planta certificada. 1 = plántula parapropagar obtenida asépticamente;2 = tallo de plántula dividido con cortes;3 = segmentos de tallo obtenidos: A, B y C;4 = segmentos en medio de propagación;5 = plántulas micropropagadas in vitro.A = base de planta, B = segmentos de tallocon un nudo, C = punta del tallo.

FUENTE: CIAT (1982).

12 3

Cortes

A B C

4

5

1 mm

45 mm

Yema axilar

Pecíolo

379


1993), caucho (Etienne et al., 1997) y caña deazúcar (Lorenzo et al., 1998). Recientemente,otros grupos de investigadores lo han probadoen los sistemas embriogénicos de Brachiaria sp.,en cultivo de anteras de arroz (Escobar et al.,2000a) y en sistemas de propagación mediantenudos en yuca (Escobar et al., 2001) y en caoba(Orellana, 1997).

Este sistema de inmersión temporal permiteaumentar notablemente la tasa de

Cuadro 21-1. Tasa de propagación de clonescomerciales de yuca mediante el sistemaRITA® (n = número inicial de explantesusados).

Clon n Tejido Explantes, Tasa derecuperado total propagación

Apices Nudos

CM 3306-4 10 50 51 101 10.1

CM 4574-7 10 40 25 65 6.5

CM 523-7 10 46 60 106 10.6

MBRA 383 10 43 25 68 6.8

MBRA 507 10 43 35 78 7.8

MCOL 2215 10 58 30 88 8.8

MCOL 1505 10 28 25 53 5.3

MCUB 74 10 31 42 73 7.3

MECU 72 10 26 42 68 6.8

MTAI 8 10 26 35 61 6.1

multiplicación en yuca (Escobar et al., 2001), sise compara con el sistema convencional in vitro(Cuadro 21-1); además, reduce los costosunitarios de propagación. Consiste en losiguiente: los tejidos reciben, en tiemposalternos, nutrientes y hormonas del medio decultivo y un flujo de oxígeno durante lainmersión, con un período programado de esperaentre ciclo y ciclo (Figura 21-2); se logra así uncrecimiento acelerado de tallos y hojas en losque brota un gran número de yemas para elsiguiente ciclo de propagación.

Este sistema presenta las siguientesventajas: disminución de la mano de obra,reducción de los problemas de asfixia ovitrificación de los tejidos, mejor nutriciónmineral de los tejidos, renovación completa delaire dentro del recipiente durante cada ciclo,mejor separación de los tejidos, y control de losprocesos morfológicos (Teisson y Alvard, 1994).

Los trabajos desarrollados en la Unidad deBiotecnología del CIAT han determinado que latasa de propagación en el sistema RITA®depende de la variedad y del manejo que se le daen medios líquidos. En el CIAT se estableció, confinanciación del Programa de BiotecnologíaAgrícola (PBA) y del DGIS Holanda, el sistemaRITA® para producir materiales destinados a lacosta norte de Colombia, empleando los clonesVenezolana (MCOL 2215) y Verdecita(MCOL 1505) como testigos (Escobar et al.,2000c; CIAT, 1999).

Figura 21-2. Detalle del funcionamiento del método RITA® (izquierda) y del material propagado masivamente con él(centro). El medio líquido asciende (flecha) por diferencia de presión, cíclicamente, a la cavidad superior,donde alimenta los explantes. A la derecha, germinación de embriones de yuca en RITA® para acelerar sucrecimiento y aumentar la eficiencia de conversión embrión-planta.

380


En el Cuadro 21-1 se observa la tasa depropagación de algunos clones desarrolladospara la costa norte y de otros de interéscomercial para Colombia (Escobar et al., 2001).Los datos preliminares señalan un incrementoen la eficiencia de propagación bajo condicionesde RITA® de 166% a 300%, respecto al sistemasólido (R. Escobar, información sin publicar).

Los costos de desarrollo de esta tecnología yde la propagación in vitro podrían limitar suaplicación en comunidades de agricultores deescasos recursos. Por esta razón, el CIAT lleva acabo un segundo proyecto que, con recursos delPrograma de los Centros GCIAI de InvestigaciónParticipativa y Análisis de Género para elDesarrollo de Tecnología y la InnovaciónInstitucional (PRGA-CIAT), ha permitido laproducción in vitro de material certificado(Figura 21-3), empleando insumos de bajo costoy de fácil consecución para los agricultores enlos mercados locales (Escobar et al., 2000b;CIAT, 1999).

Actualmente, en la Unidad de Biotecnologíadel CIAT se está diseñando un sistema debiorreactores de bajo costo, que puedadesarrollar a gran escala el proceso y transferirloa los campesinos de diferentes zonas.

Un sistema de propagación masiva de clonesde yuca de importancia económica paraColombia, bien adaptado, que asegure lacantidad y la calidad sanitaria del material de‘siembra’, y que garantice el flujo de material

para futuras plantaciones, a bajo costo,constituye la mejor solución para desarrollarcomercialmente este cultivo.

Conservación de Germoplasma

El acceso a la variabilidad genética de un cultivoy de sus especies relacionadas es partefundamental del proceso de fitomejoramiento.La yuca es un cultivo de alta heterocigocidad;por tanto, la conservación de su semilla sexualno es la más adecuada para mantener lafidelidad de un material a su fuente. Laintegridad genética del material se conserva, portanto, mediante el cultivo de partes vegetativas.

Actualmente, el CIAT mantiene en custodialos recursos genéticos del género Manihot en dosformas: en el campo, mediante el cultivo in vitrocon tasas de crecimiento mínimo; sonaproximadamente 6000 accesiones querepresentan a 23 países diferentes (Bonierbale etal., 1997). El área de conservación en campoocupa, aproximadamente, 3 ha, en las quedeben hacerse periódicamente enmiendas alsuelo, riego y mantenimiento preventivo paramanejar plagas, patógenos e insectos; por tanto,los costos de conservación de esa área sonrelativamente altos (Epperson et al., 1999).

Se ha discutido, durante años, que laconservación in vitro logra, en algunos sistemasde propagación vegetativa, una reducciónsignificativa en el costo de mantenimiento y deconservación del germoplasma; de este modoconsigue mantenerlo a mediano o a largo plazo.

Crecimiento a tasas mínimas

Withers y Williams (1986) propusieron dos tiposde banco genético in vitro:

• el Banco Genético in vitro Activo (IVAG, eninglés), a corto plazo, bajo condiciones decrecimiento mínimo, y con funcionesespecíficas de propagación y distribución dematerial;

• el Banco Genético in vitro Básico (IVBG, eninglés), cuyo objetivo principal es elalmacenamiento por seguridad (black box)del germoplasma a largo plazo.

Roca (1984) estableció las condiciones parala conservación in vitro a corto plazo en un

Figura 21-3. Grupo de agricultores de Santa Ana, Cauca,recibiendo capacitación en cultivo de tejidospara establecer una pequeña instalación deproducción de material de ‘siembra’ a bajocosto en la zona.

381


medio 8S sólido con una combinación específicade reguladores hormonales y a una temperaturade 22 a 24 °C. Actualmente, en un área de40 m2, se manejan cinco tubos por clon, haciendosubcultivos cuya periodicidad va de 8 a 16 meses,según el clon (G. Mafla, comunicación personal).

Las colecciones del género Manihot máscompletas del mundo se conservan en el CIAT, enColombia, y en la Empresa Brasileira de PesquisaAgropecuária (EMBRAPA/CENARGEN, de Brasil);la colección de materiales africanos está en elInternational Institute of Tropical Agriculture(IITA), en Africa, y en el Institute of ScientificResearch for Development and Cooperation(ORSTOM, de Francia).

Cerca de 4000 plántulas de más de 1600accesiones diferentes, han sido distribuidas invitro de la colección del CIAT a los solicitantes,desde el inicio de ésta en 1979 (G. Mafla,comunicación personal). Se ha integrado, portanto, al manejo del banco, un sistema para elseguimiento (monitoría) al flujo de materiales, alestado sanitario, a los datos de pasaporte, a laestabilidad genética, y a la detección deduplicados en la colección, entre otrasactividades. La colección que se mantiene en elCIAT ha sido designada por la FAO; por tanto, lasinstituciones receptoras deben firmarpreviamente un acuerdo de transferencia degermoplasma como requisito para el envío delmaterial. En él acuerdan no establecer derechosde propiedad sobre el material vegetal,principalmente. El CIAT está implementandoactualmente un sistema de código de barras paramanejar este banco IVAG, que se halla en laUnidad de Recursos Genéticos del Centro.

Crioconservación de yuca

Se explicaron anteriormente los conceptos deIVAG y de IVBG. Ambos bancos deben constituirun sistema complementario e integral paramanejar el recurso genético de Manihot, en elcual:

- el IVAG provee continuamente materiallimpio, libre de plagas y enfermedades y conalto potencial de propagación;

- el IVBG provee una colección de largo plazo,libre de cambios genéticos y que reduce elcosto y el espacio de la colecciónconvencional.

Las técnicas de crioconservación se dividen enclásicas y nuevas. Las primeras se basan en laprotección química y en la deshidratación parcial,que ocurren durante la congelación: en ellas soncríticos el comportamiento del agua remanente enel tejido durante la congelación, la manera deremover el agua, y la descongelación. El segundogrupo de técnicas se basa en la vitrificación, quees el paso de un líquido hacia un estado amorfo(vítreo) durante la congelación, el cual evita laformación de estructuras cristalinas (Towill,1996).

Varios autores han establecido protocolosclásicos para la crioconservación de yuca, usandodiferentes explantes (semillas, ápices, meristemas,etc.), por ejemplo, Kartha (1982), Bajaj (1983),Marín et al. (1990), Benson (1992) y Escobar et al.(1997). Otros presentan protocolos nuevos, porejemplo, Benson (1992), Choronsub et al. (1999) yEscobar et al. (2000a). En trabajos desarrolladosen el CIAT se ha demostrado que la respuestaposterior a la congelación depende del genotipoempleado; por ello, no es posible extrapolarresultados partiendo de pocos genotipos, en elmanejo de un banco (Escobar et al., 1997).

En los últimos años, el CIAT ha implementadola técnica de encapsulación-deshidratación que sebasa, a su vez, en la técnica de la semillasintética; en ésta, se coloca un ápice de modo quequede cubierto por una solución de alginato desodio, y se polimeriza luego con cloruro de calcio.Esta metodología ha sido probada con éxito en95 variedades tomadas al azar de la coleccióncentral in vitro de yuca; de ellos, 25% dieron unarespuesta superior a 70% en la formación debrotes; 50% respondieron de 30% a 70% enbrotación; y 25% dieron una respuesta menor que30% en cuanto a brotes recuperados en la fasesiguiente a la congelación (Manrique, 2000).

Esta técnica favorece la manipulación de losexplantes sin dañarlos, permite tratarlos conniveles altos de azúcar, deshidratarlos luego ensílica gel y congelarlos rápidamente por inmersióndirecta en nitrógeno líquido. La recuperación sehace en un medio en que se controlen la presiónosmótica, la concentración y el tipo de reguladorhormonal que favorezcan el crecimiento de losápices congelados.

Los resultados actuales plantean laposibilidad de aumentar el número de clones quese conservarán en nitrógeno líquido, para

382


determinar los siguientes aspectos logísticos:número de tubos por variedad, repeticiones,número de explantes por tubo, porcentaje derespuesta mínimo y seguro, reproducibilidad dela técnica a través del tiempo de conservación,base de datos, recuperación in vitro, en elinvernadero y en el campo. Estos y otrosaspectos permitirían ganar experiencia en elestablecimiento y manejo de un banco básico(IVBG), tomando la yuca como modelo.

Asimismo, es necesario ajustar la técnicaactual para aplicarla a los materiales que handado una débil respuesta con el fin de lograr unarespuesta mínima y segura después de lacongelación.

Transformación Genética

La ingeniería genética se emplea para manipulargenes e introducirlos en las plantas obteniendoasí una transformación genética (transgénesis);es ésta una herramienta poderosa que puedeampliar la base genética, en cuanto a caracteresútiles, más allá del límite impuesto por lacompatibilidad entre especies.

A cultivos como la yuca, en que cadagenotipo es un mosaico heterogéneo de genes, laingeniería genética ofrece la ventaja de podertransferir uno o varios genes sin que se pierda elgenotipo; esta pérdida irreversible ocurre en elmejoramiento convencional.

- El aspecto más promisorio para latransferencia de genes en la yuca es laresistencia a las enfermedades obtenida congenes del mismo género Manihot y de otrasfuentes novedosas.

- Otras aplicaciones posibles de latransferencia de genes estarían en elmejoramiento de la calidad de la raíz en lossiguientes aspectos: incrementar su nivel deproteína y su contenido de micronutrientes,eliminar o reducir los compuestoscianogénicos (azúcares cianogénicos),mejorar su capacidad como raíz fresca paraser almacenada, acumular nuevoscompuestos (almidones cerosos) queincrementen el valor de los productosderivados de la yuca, y otros.

Métodos de transformación yregeneración

Los métodos más comunes para introducir ADNen las células de yuca son la transferencia pormedio de la bacteria Agrobacterium sp. y eldisparo de micropartículas cubiertas con losgenes de interés. Se demostró hace más de10 años que la yuca era susceptible a latransformación con Agrobacterium sp. (Calderón-Urrea, 1988), pero la eficiencia detransformación de las diferentes cepas de labacteria varía y depende del genotipo de ésta(Chavarriaga-Aguirre et al., 1993; Li et al., 1996;Puonti-Kaerlas et al., 1997). Ahora bien, elmayor problema de la transformación genética(TG) de la yuca es la eficiencia de regeneración invitro de las células transformadas para obtenerplantas completas.

Embriogénesis somática

Es el método más común para regenerarplantas de yuca. Los embriones somáticospueden ser inducidos, en un número limitado deexplantes, como cotiledones y ejes embriónicosdel embrión sexual (Stamp y Henshaw, 1982),como hojas inmaduras, meristemas apicales omeristemas axilares (Szabados et al., 1987;Mathews et al., 1993; Puonti-Kaerlas et al.,1997b; 1998; Frey, 1996), como anteras(Mukherjee, 1995), y como inflorescenciasinmaduras en medios que contienen auxina(Woodward y Puonti-Kaerlas, 2000). El origenmulticelular de los embriones somáticos de yucalos convierte en tejidos subóptimos para latransformación genética, porque es comúnobtener de ellos plantas quiméricas indeseables.

Un sistema de cultivo de tejidos adaptado ala transformación genética fue desarrollado porTaylor et al. (1996) y se denominó calloembriogénico friable (CEF). Los embrionessomáticos mantenidos en el medio MS(Murashige y Skoog, 1962) o en el GD (Gresshoffy Doy, 1974) son suplementados con la auxinaPicloram y producen CEF; éste es luegotransferido al medio líquido SH (Schenk yHildebrandt, 1972) y produce suspensionesembriogénicas que proliferan rápidamente. Losembriones son transferidos después a mediossin hormonas o con otras auxinas para inducirsu maduración y su conversión a plantascompletas.

383


A diferencia de lo que sucede con laembriogénesis primaria y la secundaria de layuca, las nuevas unidades embriogénicas delCEF se desarrollan sobre la superficie deunidades preexistentes, aparentemente comogrupos de origen unicelular; esto las convierte enblancos excelentes para la transformación(Taylor et al., 1996). El bombardeo de CEF conmicropartículas recubiertas con ADN hapermitido la regeneración de plantastransgénicas de yuca (Schopke et al., 1996;Raemakers et al., 1996; Munyikwa et al.,1998b).

Una desventaja del CEF es la pocadisponibilidad de suspensiones embriogénicaspara los genotipos comerciales de mayor interés.El desarrollo de este tipo de suspensión dependeaún del genotipo y es laboriosa. Además, laconversión del CEF de yuca a planta esrelativamente baja, comparada con otrossistemas de regeneración en cultivos comotabaco, arroz, soya y maíz. Más aún, laprobabilidad de obtener plantas anormales seincrementa rápidamente con el tiempo queduren las células en el cultivo in vitro; por tanto,es necesario renovar continuamente las líneascelulares. Estas condiciones reducen, por tanto,todavía más la eficiencia de transformación(Taylor et al., 1996; Schopke et al., 1997a).

Producción de CEF y sutransformación porAgrobacterium sp.

Es importante profundizar un poco más en latransformación de yuca por mediación de labacteria del suelo Agrobacterium tumefaciens.Esta metodología estaría más al alcance de losprogramas nacionales de investigación agrícolapor su menor costo y, desde el punto de vistatécnico, por la forma en que se insertan losgenes (copias completas). El primer reporte detransformación del CEF por medio deAgrobacterium sp. fue realizado por González etal. (1998). Sin embargo, varios informesanteriores habían descrito la transformación deestos tejidos mediante la biolística, tal como semencionó anteriormente (ver también Zhang etal., 2000; Zhang y Puonti-Kaerlas, 2000).

González et al. (1998) describieron unprotocolo para transformar el cultivar de yucaTMS60444 (MNIG 11) empleando la cepa deAgrobacterium ABI-pILTAB188. Es importante

mencionar que la frecuencia de conversión deembrión a planta en este cultivar esrelativamente alta (entre 18% y 27%), si secompara con la de otras variedades altamenteembriogénicas como MCOL 2215 (Venezolana),cuya conversión oscila entre 8% y 20% (López,2000).

Transformación del CEF

La transformación del CEF medianteAgrobacterium puede tomar entre 30 y34 semanas (8 a 9 meses) cuando se seleccionacon Paramomicina (un antibiótico de la familiade la Kanamicina). Uno de los factores queprobablemente retarda la recuperación deplantas transgénicas de yuca parece ser lasensibilidad del CEF al antibiótico y a lainfección con Agrobacterium per se (Schopke etal., 1993; Li et al., 1996; González et al., 1998).La sensibilidad a la infección causada por labacteria parece depender de la variedad; porejemplo, MCOL 2215 es más sensible queTMS60444 (Chavarriaga y Ladino, resultados nopublicados).

González et al. (1998) señalaron, comoposibles limitantes en la transformación delCEF, la baja frecuencia de callos que producenlos embriones somáticos diferenciados y la bajaconversión de embriones transformados aplantas, aunque esta última parece ser la másalta reportada para transformación de yuca. Lafrecuencia de recuperación de plantastransgénicas osciló entre 1% y 10% (dos plantasde 180 ó 20 unidades embriogénicasseleccionadas en Paramomicina). Las quimerasdisminuyeron por el probable origen unicelularde los embriones globulares en el CEF (Gonzálezet al., 1998).

Según los autores antes citados, es posibleproducir cientos de líneas transgénicas delCEF con relativa facilidad a partir de 0.5 ml deSCV1. En otros aspectos de transformación yregeneración, el CEF es similar a otrossistemas de transformación que empleenembriones somáticos o partes de ellos. Elnúmero de inserciones puede variar

1. Una unidad (en ml) de SCV (Settled Cell Volume) sedetermina dejando en reposo el CEF (en suspensión)durante 30 minutos, en un tubo graduado de 15 ml.

384


(generalmente, entre 1 y 4) y la selección sehace con antibióticos o con azúcares (como lamanosa) o las mismas construccionesgenéticas, incluyendo los promotores.

El sistema CEF ha sido desarrollado para14 variedades de yuca, de las cuales han sidoregeneradas plantas sólo en siete de ellas.Plantas transgénicas, obtenidas mediantebombardeo, han sido regeneradas en tresvariedades (TMS60444, Bonoua Rouge yMCol1505), según Taylor et al. (2000).También se desarrolló CEF de las variedadesVenezolana (MCOL2215), ICA Negrita(CM3306-4) y SM1219-9, que tienenimportancia comercial en la costa norte deColombia, y de ellas se regeneraron plantas(López, 2000; López et al., 2001a; 2001b).

La expresión transitoria del gen gus-intrónen el CEF y en cotiledones de embrionessomáticos de la variedad Venezolana indicabuenas posibilidades de transformación deesta variedad con las cepas de AgrobacteriumC58C1 y LBA4404 (Chavarriaga et al., 2000a;2000b).

Algunos investigadores de Holandautilizaron Agrobacterium (y biolística) paratransformar TMS60444, y emplearon comoagentes de selección ciertos antibióticos o laactividad del gen de la luciferasa (Raemakerset al., 2000). En general, los sistemas detransformación con mediación deAgrobacterium sp., usando el CEF, podríanaplicarse a un estrecho rango de variedades deyuca de importancia local y comercial,

especialmente en los países en desarrollo dondeel método de la biolística todavía es muy costoso.

Regeneración

La clave para obtener un gran número deplantas transgénicas está, probablemente, en laoptimización de los pasos de selección y deregeneración de plántulas. En el caso deTMS60444 es posible obtener entre 10 y50 líneas embriogénicas, que son transgénicaspor cada infección con Agrobacterium (Taylor etal., 2000). Este resultado, acoplado a la altacapacidad de TMS60444 para regenerar plantas(cerca de 100/g de CEF), representa un avancesignificativo en la transformación genética de layuca (Figura 21-4). En MCOL2215, laregeneración de plantas no supera aún el 30%.

Actualmente se investigan en el CIATtratamientos con varias combinaciones demedios, azúcares y hormonas, entre otroscomponentes, para optimizar las fases demaduración y germinación de los embrionesderivados del CEF en cuatro variedades de yuca(TMS60444, MCOL2215, CM3306-4 ySM1219-9). Se estudia también el uso de RITA®para mejorar estos procesos (ver antes, Sistemain vitro...). Los resultados preliminares indicanque la regeneración de plantas mejorasustancialmente cuando se emplea el sistemaRITA® (López et al., 2001a; 2001b).

Mejoramiento

El número de variedades adaptadas a lasnecesidades de los agricultores y a los

Figura 21-4. Planta transgénica de yuca (izquierda) de la variedad TMS60444, obtenida mediante transformación de calloembriogénico friable con Agrobacterium, y con expresión del gen marcador gus que da plantas azules (centro).El panel de la derecha confirma, mediante hibridización Southern, que el gen de resistencia a insectos(cry1Ab) ha sido insertado en el genoma de esta planta (flecha blanca). La flecha oscura muestra el gencry1Ab de la construcción genética utilizada en la transformación.

385


ecosistemas es, posiblemente, mayor que 1000.La tarea de transformar todas estas variedadescon Agrobacterium sp. parece poco práctica,aunque se tendrá que enfrentar pronto. Usarvariedades modelo, como la TMS60444, paratransformar primero y luego transferir el gen deinterés por mejoramiento clásico a otrasvariedades recalcitrantes a la transformación esuna alternativa real, aunque poco adecuada porel tiempo que requeriría (entre 6 y 10 años). Esentonces necesario desarrollar el CEF para lasvariedades de mayor interés de las zonasproductoras de yuca del mundo.

En el CIAT se trabaja, con el apoyofinanciero del Ministerio de Agricultura yDesarrollo Rural (MADR), en el establecimientodel CEF para las variedades de importancia enColombia. Hasta el momento se ha logradoinducir el CEF en las ocho variedadessiguientes: MTAI8 o Rayong 60, MCUB74 oSeñorita, MNIG 11 o TMS60444, MCOL 2215 oVenezolana, MCOL 1505 o Verdecita, CM523-7 oCatumare, CM3306-4 o ICA Negrita ySM1219-9. Se han regenerado plantas de tres deesas variedades y el resto se mantiene enproliferación.

Por último, para la conservación a largoplazo del CEF de las distintas variedades deyuca, que garantice la estabilidad genéticareduciendo así la posible variación somaclonal,se está trabajando en el CIAT en métodos decrio-conservación del CEF basados en los yapublicados para yuca (Escobar et al., 1997). Losresultados indican que es factible congelar CEFa temperaturas por debajo de –120 °C yregenerar nuevamente células después delcongelamiento (Santos et al., 2001).

Plantas transgénicas obtenidas pororganogénesis

Se reportó recientemente una alternativa deregeneración de plantas de yuca a través de laproducción directa de brotes; los autores ladenominan organogénesis (Li et al., 1995;1998a). Sin embargo, la evidencia histológica delproceso de organogénesis es débil y no permitediferenciar entre la producción de brotes porproliferación de meristemas de embrionessomáticos o por proliferación de meristemasproducidos de novo en los cotiledonesembrionarios. En el trabajo de Li et al. (1998a)se indujeron brotes en explantes cotiledonares

de embriones somáticos germinados. Estosbrotes fueron inducidos utilizando BAP e IBA(1.0 y 0.5 mg/l, respectivamente). Los embrionessomáticos provenían de embriogénesis cíclica, node embriones primarios, y estos últimos nomostraron una buena capacidad organogénica.Los brotes se elongaron en un medio con0.4 mg/l de BAP y luego se hicieron enraizar enun medio libre de hormonas.

La frecuencia de inducción de brotes varióentre 42% y 67%. La reproducibilidad delmétodo desarrollado por Li et al. (1998a) parececonfirmada por su aplicación en 10 variedadesde yuca. Este método ha sido implementado enel IITA como alternativa para la TG en yuca, hagenerado plantas transgénicas de yuca (Li et al.,1996) y ha sido utilizado para introducir nuevosgenes de interés en esta especie (Li et al., 1996;1998b).

Mejoras técnicas para la TG en yuca

Genes marcadores de selección

La frecuencia de transformación genética dela yuca es, a menudo, baja; por ello, es necesarioemplear diferentes marcadores para diferenciarlas células transgénicas de las no transgénicas ypoder seleccionarlas (Schrott, 1995). Algunos delos marcadores visuales más usados son lossiguientes:

- el gen uidA, proveniente de E. coli (Jefferson,1987; Jefferson et al., 1986);

- el gen de la luciferasa del “cocuyo” Photinuspyralis (Ow et al., 1986) o el del coral Renillareniformis (Mayerhofer et al., 1995);

- la proteína verde fluorescente conocida comoGFP (Chalfie et al., 1994).

Los genes marcadores de selecciónconvierten a la célula que los incorpora enresistente a los antibióticos, a compuestosanálogos o derivados de los metabolitos, o a losherbicidas, entre otros, y le permiten sobrevivir yproliferar en medios selectivos. De los genesmás comunes, el CIAT posee los siguientes:

- el gen nptII, que confiere resistencia aantibióticos amino-glicosídicos como laKanamicina y la Geneticina (Bevan et al.,1983; Fraley et al., 1983; Herrera-Estrella etal., 1983);

386


- el gen hpt que da resistencia al antibióticoHigromicina (van den Elzen et al., 1985);

- los genes pat y bar que dan resistencia a losherbicidas que contienen fosfinotricina(Murakami et al., 1986; De Block et al.,1987; Thompson et al., 1987; Wohllenben etal., 1988);

- los genes nptII, el hpt, el bar y el gen de laluciferasa han sido utilizados para obtenerplantas transgénicas de yuca, como seobserva en la Figura 21-5 (Schopke et al.,1996; Zhang y Puonti-Kaerlas, 2000; Sarriaet al., 2000; Raemakers et al., 1996).

La opinión pública es cada vez más reacia ala utilización de genes de resistencia aantibióticos en plantas transgénicas, actitud queha obligado a pensar en alternativas deselección. Un ejemplo son los genes deresistencia a antibióticos, cuya expresión puedeser inhibida en algunas bacterias mediante laincorporación de un intrón en la secuenciacodificadora (Wang et al., 1997).

Hay un marcador de selección, basado en elgen ipt del T-ADN de Agrobacterium tumefaciens,que está ligado a un transposón para removerlode brotes transgénicos (Ebinuma et al., 1997) oestá bajo el control de un promotor inducible(Kunkel et al., 1990), y tiene buenasperspectivas. Un derivado de la citoquinina BAP(Joersbo y Okkels, 1996), el azúcar xilosa(Haldrup et al., 1998a; 1998b) o el azúcarmanosa (Joersbo et al., 1998) son compuestos

alternos que se usan para seleccionar materialtransformado de yuca. En realidad, la selecciónde plantas transgénicas de yuca mediante latécnica selectora de la manosa ha sidoconfirmada con éxito (Zhang y Puonti-Kaerlas,2000). Sin embargo, el gen que ayuda ametabolizar la manosa aún no está disponiblepara la mayoría de los laboratorios que trabajanen transformación de yuca.

Aunque los genes marcadores de selecciónson necesarios para diferenciar las célulastransgénicas de las no-transgénicas, latendencia actual es producir plantastransgénicas que contengan sólo el gen deinterés, las llamadas “transgénicas limpias” quese obtienen mediante ingeniería genética deprecisión. Hoy en día, las entidades que regulanel uso de plantas transgénicas empiezan a exigirque éstas contengan sólo una copia del gen deinterés sin incluir genes de selección. Por tanto,será necesario aplicar tecnologías derecombinación específica y dirigida (site-specificrecombination) para eliminar los genesmarcadores de selección durante la regeneraciónde las plantas transgénicas o después de ellas.Algunos ejemplos de la utilidad de estastecnologías ya han sido publicados (Qin et al.,1994; Bayley et al., 1992; Odell et al., 1990).

Promotores específicos y propiedadintelectual

Otra técnica que se necesita para mejorar latransformación genética de yuca son los

Figura 21-5. Plantas transgénicas de yuca (variedad MPER 183) que expresan resistencia al herbicida Basta (líneas 53-5.2,137-3.1 y 207). Las pruebas moleculares confirman la presencia del transgen en la línea 53-5.2 (derecha).

TABACO YUCA

387


promotores específicos de tejido o promotoresinducibles, algunos de los cuales, específicospara raíz de yuca, ya han sido aislados (Liddle etal., 1997). Estos promotores se usarán paraconcentrar y activar la expresión de los genesintroducidos en una parte de la planta (porejemplo, raíces u hojas), cuando se requierahacerlo. Por ejemplo, sería ideal limitar laexpresión de un gen que expresa una proteínamodificadora del almidón de la raíz o hacerexpresar los genes de resistencia a los insectosdañinos sólo si éstos están presentes.

Hay promotores inducibles con iones de cobreo con esteroides (Mett et al., 1993; Schema et al.,1991) que ya han sido probados en plantas. Labúsqueda de promotores inducibles o específicosde tejidos de yuca será necesaria si se quiere quela transformación genética de este cultivo semantenga actualizada, sea aceptada por losconsumidores, y sea una herramienta útil en elmejoramiento.

Los investigadores tienen que enfrentarse, amenudo, al derecho de propiedad intelectual(patentes), incluso aquellos que trabajan entransformación genética. Los que trabajan conyuca no son la excepción. Por el contrario, todaslas construcciones, genes y promotores hastaahora usados en la TG de la yuca estánregulados por patentes; por tanto, el uso que seda finalmente a los productos derivados de estasinvestigaciones estaría restringido.

Los productos derivados de la yucatransgénica que entren en los mercados europeoso americanos (p. ej., harina de yuca) estaríansujetos a las limitaciones que imponen laspatentes reconocidas en los respectivos países.Por otro lado, limitarse al uso de construccionesgenéticas sólo para investigación y no para laaplicación comercial no es práctico, pueslimitaría la liberación de plantas transgénicas alas que requieran los agricultores.

Por consiguiente, la búsqueda de genes ypromotores propios de la yuca es necesaria paraaliviar un poco la presión de la propiedadintelectual sobre las construcciones genéticasusadas actualmente en la TG de este cultivo.

TG para lograr resistencia a plagas ycalidad de la raíz

El ciclo de cultivo largo (8 a 14 meses) de la yucaexpone a este cultivo a constantes ataques deinsectos dañinos, bacterias, virus y otras plagas(Bellotti, 1979; Bellotti et al., 1999). En AméricaLatina hay insectos lepidópteros, como elbarrenador del tallo (Chilomima clarkei) y elgusano cachón (Erinnyis ello), dos de las plagasmás comunes del cultivo. El gusano cachón, porejemplo, causa pérdidas considerables derendimiento en la costa norte de América del Sury del Caribe. El barrenador del tallo no sóloreduce el rendimiento sino que deteriora elmaterial de siembra (cangres o estacas).

Barrenador del tallo

El barrenador pasa gran parte de su ciclo devida dentro del tallo, donde no pueden llegar lasaspersiones de los insecticidas. Durante losúltimos 5 a 10 años, el barrenador ha causadodaños considerables en más de 7000 ha de yucaen Colombia (Bellotti et al., 1999). Por otro lado,la bacteria del suelo Bacillus thuringiensis (Bt)lleva un grupo de genes (cry) que codifican lasíntesis de endotoxinas específicas (toxinas Bt),muy efectivas para controlar varios tipos deinsectos. Pues bien, la aspersión con solucionesde Bt fue efectiva como control biológico delgusano cachón de la yuca (Bellotti y Arias,1979).

El desarrollo de plantas transgénicas de yucaque expresen genes cry sería una manera dereforzar los métodos convencionales de controlde plagas, y de beneficiar, probablemente, almedio ambiente porque las aplicaciones deplaguicidas podrían reducirse. Varios gruposcientíficos están trabajando en esta área; uno deellos, en el CIAT, enfoca su trabajo hacia latransformación de las variedades adaptadas alas condiciones de la costa norte, de los vallesinterandinos y de los Llanos Orientales deColombia; estas variedades son muy apetecidaspor los agricultores, pero son susceptibles albarrenador del tallo, que ha causado pérdidashasta de 100% en el material de plantación en lacosta norte.

La resistencia al barrenador del tallo seríaincorporada mediante Agrobacterium sp., omediante el disparo de micropartículas,empleando un plásmido (pBIGCry) que lleva el

388


gen cry1Ab y genes de selección (gus-intrón ynptII) o el plásmido pSGManCry, que lleva el genmanA para selección con el azúcar manosa). Losresultados más recientes confirman que el gencry ha sido efectivamente transferido a unavariedad de yuca (TMS60444 o Mnig11), que seutiliza como variedad modelo para latransformación genética. Se espera igualmentela confirmación de la inserción del gen cry enotras dos variedades, de importancia comercialen Colombia, las cuales pasaron ya las primerasetapas de selección in vitro.

Raíces sin cianógenos

La yuca produce dos glucósidoscianogénicos: linamarina y lutaustralina. Lasvariedades amargas se consumen especialmenteen algunos países de Africa y en los gruposindígenas del Amazonas. Puesto que contienenconcentraciones tóxicas de los compuestoscianogénicos, estos glucósidos deben serremovidos de las raíces medianteprocesamientos laboriosos. Es necesarioprocesar cuidadosamente la yuca amarga (bittercassava) para evitar el efecto tóxico, y en algunoscasos, letal, del cianuro (Akintonwa et al., 1994;Mlingo et al., 1992; Banea-Mayambu et al.,1997; Rosling, 1988).

Las cianhidrinas residuales de la yucaprocesada son la mayor fuente de cianuro de ladieta basada en yuca (Tylleskär et al., 1992). Porotro lado, las aguas residuales, producto delprocesamiento de las raíces amargas de yuca, amenudo contienen concentraciones tóxicas decianuro. Si no son tratadas apropiadamente,estas aguas son altamente contaminantes.

Ahora bien, si se bloquea la producción de laenzima oxidasa del citocromo P-450, en lasíntesis de la linamarina, se podría reducir elnivel de los compuestos cianogénicos en la raízde yuca. Por otro lado, si se expresaabundantemente en las raíces una enzima(α-hidroxinitril-liasa) que cataliza la degradaciónde las moléculas cianogénicas, se podría lograrel mismo resultado (Arias-Garzón y Sayre 2000;Siritunga et al., 2001). En el primer caso, elbloqueo se haría mediante la tecnología del‘antisentido’. El gen que controla la oxidasa delcitocromo P-450 en la yuca ha sidorecientemente aislado y caracterizado (Andersenet al., 2000). Las construcciones antisentido quebloquean la expresión de este gen se han

insertado en la yuca y se han producido asíplantas en las que se ha reducido hasta en un80% el contenido de linamarina de las hojas(Siritunga y Sayre, 2001).

Raíces sin cianógenos y concarotenos

Una forma novedosa de mejorar las raíces deyuca es la producción de almidones cerosos, osea, que contengan 100% de amilopectina,mediante la inactivación de la enzima GBSS II(la sintetasa del almidón, unida a los gránulosde almidón); para hacerlo, se inserta el gen de laGBSS II en antisentido (Raemakers et al., 2001).

Las aplicaciones industriales de losalmidones cerosos, como la producción deespesantes, pastas y pegantes, es un mercadocon gran potencial de crecimiento. Un proyectode transformación genética se ha iniciado en elCIAT, con el apoyo financiero del MADR, paraintroducir genes en la yuca que le permitan aesta especie producir almidón ceroso.

Finalmente, otro objetivo de la ingenieríagenética de la yuca es el incremento de losβ-carotenos o precursores de la vitamina A, lacual es vital para el desarrollo normal de loshumanos. Las consecuencias de la deficiencia devitamina A en el hombre van desde la cegueraparcial hasta la débil resistencia a variasenfermedades terminales (Sommer, 1998; WestJr. et al., 1989).

Las raíces de la yuca tienen la capacidad desintetizar β-carotenos, como lo han demostradolas variedades de raíces amarillas que ya seidentificaron y que contienen carotenoides enconcentraciones hasta de 2 mg/10 g de pesofresco (Iglesias et al., 1997). Por tanto, los genesresponsables de la síntesis de β-carotenos yaestán presentes en la yuca; falta, entonces,transferir estos genes a las variedades de másaceptación entre cultivadores y consumidores,sin cambiarles las demás características.

Marcadores Moleculares

Desarrollo de un mapa de genes aescala molecular

Se elaboró un mapa de genes de la yuca a escalamolecular a partir de la segregación de

389


marcadores de RFLP, de los microsatélites (oSSR, repeticiones de secuencia simple, siglas eninglés), de RAPD y de varias isoenzimas, en uncruzamiento intraespecífico de 150 individuos deTMS30572 (una línea mejorada del IITA, Ibadán,Nigeria) y de CM2177-2 (una línea élite del CIAT,Cali, Colombia) (Fregene et al., 1997).

En total, 150 RFLP, 30 RAPD, 5microsatélites y 3 loci de isoenzimas, quesegregaban como fragmentos de restricción dedosis simple o SDRF (siglas en inglés) (Wu et al.,1992) en los gametos de la planta progenitorafemenina, definen 20 grupos de ligamientos yabarcan 950 cM2 , donde la densidad promediode marcadores equivale a 1 marcador por cada6 cM.

Con otros 120 marcadores de dosis simple deRFLP, 50 de RAPD, 4 de microsatélites y 1 deisoenzima de la planta progenitora masculina, seextrajeron 24 grupos de ligamientos que hacenuna distancia total de 1220 cM y dan unadensidad promedio de marcadores equivalente a1 marcador por cada 8 cM.

Treinta marcadores de RFLP y 2 demicrosatélites detectaron un fragmentosegregante único en cada progenitor y un alelocomún en ambos progenitores; el fragmento y elalelo se ubicaron en el mapa en posicionessimilares en el grupo de ligamiento derivado delprogenitor masculino y del femenino. Estospuentes alélicos (Ritter et al., 1991) sondecisivos para identificar los grupos deligamiento análogos en los mapas derivados delos progenitores masculino y femenino, puestoque detectan el mismo locus en amboscromosomas paternos, salvo cuando representansecuencias duplicadas. La comparación deintervalos —en los mapas derivados delprogenitor masculino y del femenino— que estánlimitados por marcadores heterocigóticos enambos progenitores, de un lado, y los puentesalélicos, de otro (Ritter et al., 1991), reveló unarecombinación meiótica significativamente

menor en los gametos de la progenitora femeninaque en los del progenitor masculino.

En los mapas derivados tanto del progenitorfemenino como del masculino hay más de300 marcadores que (se ha calculado) abarcan80% del genoma de la yuca. En consecuencia, elmapa de la yuca se acerca a la saturación.Ahora bien, la mayoría de los marcadores delmapa (o sea, los marcadores de RFLP) no seprestan fácilmente al análisis —a gran escala yde alto rendimiento— de poblaciones de plantasayudado con marcadores moleculares, que es laprincipal aplicación del mapa.

En un esfuerzo por lograr que la tecnologíade los marcadores pueda aplicarse másampliamente en la yuca, se intentó hacer unmapa de segunda generación constituido pormarcadores altamente polimórficos derivados dela reacción en cadena de la polimerasa (PCR),tales como los microsatélites y los sitiosmarcados (tagged) para indicar secuencias (STS).Se construyeron dos genotecas de ADN genómicoenriquecido con microsatélites y se seleccionaroncerca de 6000 clones para detectar la presenciade las siguientes secuencias de microsatélites:TC, GT, CAA, CAG, ACG, AAT y CAGA y GATA(Mba et al., 2000).

Se seleccionó también una genoteca deADNc, construida a partir de ARNm provenientede hojas y raíces aisladas del clon élite de yucaTMS30572, para detectar los microsatélitesmencionados anteriormente; se seleccionaronaquí más de 87,000 clones. Se obtuvieron330 marcadores de microsatélites de lasgenotecas enriquecidas, de los cuales 92 se hanincorporado actualmente al mapa existente de layuca (Mba et al., 2000; Fregene et al.,información sin publicar).

Se obtuvieron otros 160 marcadores demicrosatélites de las genotecas de ADNc, de loscuales 10 han sido incorporados al mapa (Mbaet al., información sin publicar). El nivel depolimorfismo de los marcadores de microsatélitederivados de la genoteca de ADNc, en losprogenitores de la población del mapa de layuca, fue menor (40%) que el encontrado en lasgenotecas enriquecidas de ADN genómico (60%).

Otra iniciativa para saturar el mapa de layuca es la generación de marcadores desecuencias expresadas o EST. Se ha propuesto el

2. La unidad con que se mide la proximidad o la lejanía dedos marcadores (p. ej., RFLP, RAPD, microsatélites,genes) en un cromosoma se denomina cM (= centi-Morgan) y equivale, cuantitativamente, a 1% derecombinacion entre dos marcadores. Por ejemplo, si elmarcador A está a 6 cM del marcador B, quiere decirque la frecuencia con que A se recombina (o sea, semezcle o se separe si está cerca) con B es del 6%.

390


aislamiento de genes que se expresendiferencialmente en los progenitores de unapoblación que dará origen al mapa, como unamanera de desarrollar EST alrededor decaracteres específicos; de este modo se enfoca ellocus candidato y se incrementa, al final, laexactitud del mapa que contiene los caracterescuantitativos (Boventius y Weller, 1994; Suárezet al., 2000). Se aplicó la técnica ADNc/AFLP(Bachem et al., 1996) al ARNm de losprogenitores de la población que originó el mapade genes de la yuca, y se obtuvieron más de500 fragmentos derivados de la transcripción(TDF), que fueron únicos en cualquiera de losprogenitores (Suárez et al., 2000). Se clonó luegoy se elaboró la secuencia de un subconjunto de50 TDF.

La alineación de secuencias de losmarcadores de secuencia expresadas (EST)reveló, principalmente, genes de funcióndesconocida. Seis de los TDF han sido incluidoscomo marcadores de RFLP en el mapa existentede genes de la yuca a escala molecular; los TDF,así como los marcadores de RFLP, fueron máspolimorfos que los ADNc aleatorios. Seincluyeron también varios genes clonados defunción conocida en el mapa de genes de la yucaa escala molecular; entre ellos están lossiguientes:

- dos genes del citocromo p450, que conviertenlos aminoácidos L-valina y L-isoleucinadurante la biosíntesis de los glucósidoscianogénicos linamarina y lotaustralina en layuca (Andersen et al., 2000);

- la fosforilasa AGPasa;

- el gen de la sintasa del almidón ligada a losgránulos (GBSSII), que participa en labiosíntesis del almidón (Munyikwa et al.,1997).

Desarrollo del mapa de genes quecontrolan caracteres agronómicos

Los mapas de genes a escala molecular proveenun conjunto de puntos de referencia paraobtener el genoma completo; es muy probable,por ello, que se pueda detectar el ligamiento congenes de interés en biología básica o con genesde interés en los trabajos de mejoramiento. Ya sehan visto las aplicaciones prácticas de la“marcación” (‘tagging’) de genes de interés

agronómico en muchos cultivos; es,generalmente, un parámetro de selección máseficaz en el esquema de mejoramiento y permiteanalizar minuciosamente la variación genéticacuantitativa de factores mendelianos mássencillos (Tanksley et al., 1989; Lee, 1995;Mohan et al., 1997).

Los cruzamientos de clones o de variedadesseleccionados para lograr la construcción de unmapa de genes de la yuca están diseñados paraque en dichos cuzamientos se separen, osegreguen, los caracteres considerados comoprioritarios en el desarrollo de los programas demejoramiento y selección con ayuda demarcadores (Fregene et al., 1997). Entre estoscaracteres están la resistencia a la enfermedaddel mosaico de la yuca (CMD), la resistencia a labacteriosis común, el engrosamiento precoz de laraíz, los caracteres de calidad de la raíz(cianogénesis), el deterioro en poscosecha, lacalidad culinaria y el contenido de almidón.

Resistencia al mosaico de la yuca

La CMD es la enfermedad más importante dela yuca en Africa y una amenaza potencial paraeste cultivo en América Latina: no se conoce aúnen este continente, pero su vector fueencontrado en él recientemente. La resistenciade la planta hospedante es el principal métodode control; esta resistencia fue identificada porprimera vez en los derivados del tercerretrocruzamiento de un cruzamientointerespecífico entre la yuca y Manihot glaziovii.Se cree que es poligénica con un componenterecesivo. La planta progenitora femeninaTMS30572 de la población que originó el mapade la yuca posee esta fuente de resistencia.

Se identificaron hace poco varias razasnigerianas de yuca que expresan resistenciaextrema a la CMD. Se desarrollaron entoncesvarias poblaciones para el mapa que segreganrespecto a la antigua fuente de resistencia y a lanueva. Hay en ellas una población deretrocruzamiento de hermano medio, derivadadel cruzamiento de cinco progenies F1 de lapoblación del mapa con el progenitor resistente ala CMD y del cruzamiento de la F1 de las líneasnativas resistentes con variedades susceptibles.Los cruzamientos se evaluaron en dos sitios deNigeria que tenían alta presión de laenfermedad, durante 2 años, y el análisis

391


genético clásico confirmó la naturaleza poligénicade la fuente de resistencia, M. glaziovii, y lapresencia de un control del principal gendominante de la nueva fuente de resistenciaextrema (Akano et al., 2000).

Se eligió el análisis de segregación masal(BSA) para identificar rápidamente losmarcadores vinculados a ambas fuentes deresistencia. Se encontró que un marcadormicrosatélite, SSRY40, del grupo de ligamiento Ddel mapa de genes de la yuca estaba asociadocon la resistencia a la CMD; este marcadorexplica el 48% de la varianza fenotípica de laresistencia a la CMD (para P < 0.001). El gen hasido designado CMD1.

Dos marcadores de microsatélite, SSRY28 yNS158, ubicados en el grupo de ligamiento R,explican 70% y 80%, respectivamente, de lavarianza fenotípica de la nueva fuente deresistencia (Akano et al., 2000). El gendominante de resistencia a la CMD ha sidodesignado CMD2 y está rodeado por SSRY28 yNS158, a 9 y 6 cM, respectivamente. El gen CMD2y los marcadores asociados con él sonherramientas muy valiosas para el mejoramientode la resistencia a la CMD en América Latina, yaque la ausencia de la enfermedad en estecontinente hace imposible el mejoramiento porresistencia a la CMD. En Africa, donde serequiere un despliegue rápido de la resistenciaextrema en los acervos de genes de la yuca paraproteger este cultivo de los estragos de la CMD,puede ser más eficiente la selección porresistencia extrema mediante un marcadoreficiente que el mejoramiento convencional.

La selección con ayuda de marcadoresmoleculares permite al fitogenetista eliminar, enuna etapa temprana y con ventaja, los genotipossusceptibles a la CMD que llegan al 50% en laslíneas heterocigóticas nativas resistentes a esaenfermedad. Se reducen así a la mitad los costosde la evaluación de la enfermedad y seincrementa la eficiencia de la selección por lasiguiente razón: el fitogenetista puedeconcentrarse en un menor número de genotiposen la etapa de plántula y en la etapa decisiva deensayos de hileras sencillas, cuando lasprogenies se reducen hasta en 95%.

Resistencia a la bacteriosis

La bacteriosis común de la yuca (o añublobacteriano de la yuca, CBB), causada porXanthomonas axonopodis pv. manihotis (Xam), esuna enfermedad importante de la yuca en Africay en América del Sur. Se evaluó la resistencia alCBB en individuos F1 del cruzamiento, medianteinoculaciones controladas en el invernadero.Los síntomas se evaluaron visualmente a los 7,15 y 30 días después de la inoculación,empleando una escala donde 0 = ausencia deenfermedad y 5 = máxima susceptibilidad (Jorgeet al., 2000). Se usaron las siguientes cincocepas de Xam: CIO-84, CIO-1, CIO-136, CIO-295y ORST X-27.

La zona bajo la curva de progreso de laenfermedad (AUDPC) se utilizó como una medidacuantitativa de resistencia en el análisis de losQTL (loci de caracteres cuantitativos), aplicandola regresión de marcadores únicos. Partiendo delos valores de AUDPC, se encontró que 12 QTL,ubicados en los grupos de ligamiento B, C, D, G,L, N y X del mapa de referencia derivado de laprogenitora femenina, respondieron por 9% a27% de la varianza fenotípica de la respuesta alas cinco cepas de Xam. Se propuso también unesquema para confirmar la utilidad de estosmarcadores en la evaluación de poblacionessegregantes respecto a la resistencia a CBB(Jorge et al., 2000).

Engrosamiento precoz

Otro carácter evaluado en la progenie F1 delmapa es el engrosamiento precoz. En 1998 serealizó una evaluación preliminar de estecarácter mediante la cosecha de la población F1del mapa, 7 meses después de la siembra enCIAT- Palmira (Fregene et al., 2000b). Se calculóel rendimiento de materia seca en tres plantaspor genotipo. Partiendo de los resultados de estaevaluación, se seleccionaron 40 genotipos deengrosamiento precoz y 40 grupos deengrosamiento tardío. Los esquejes saludables,cuidadosamente recogidos, de los 80 genotiposseleccionados, se sembraron en un nuevoexperimento en diciembre de 1998, en CIAT-Palmira. Se usó como testigo una línea nativa deyuca de engrosamiento precoz (Mandioca, de3 meses de edad) introducida de Brasil. En elcampo se estableció un diseño de bloquestotalmente al azar, con dos repeticiones. Cadaparcela contenía 60 plantas de cada genotipo en

392


un arreglo de 6 × 10 (columna por hilera). Las32 plantas centrales, organizadas como 8 hilerasde 4 plantas, sirvieron para la cosecha ensecuencia, con un intervalo de 3 semanas; secomenzó a las 6 semanas después de plantar layuca y se terminó a las 30 semanas de laplantación. Se hicieron, en total, nueve cosechasen un lapso de 7 meses, al cabo de los cuales elexperimento se dio por terminado (julio de1999).

En cada cosecha se evaluaron cuatro plantasde una hilera dentro de la parcela, por cadagenotipo, respecto al rendimiento de raíces y aotros caracteres supuestamente relacionadoscon el engrosamiento. Estos últimos fueron lossiguientes: altura de la planta, vigor de laplanta, índice de área foliar, rendimiento deraíces frescas, follaje fresco, número de raícespor planta y diámetro de la raíz de las cincoraíces de almacenamiento más grandes.También se evaluaron el índice de cosecha(tomado como relación entre rendimiento deraíces y biomasa total cosechada), materia secade la raíz, y follaje seco.

Los análisis de regresión múltiple de loscaracteres evaluados (variable independiente) yel rendimiento de materia seca de la raíz(variable dependiente) revelaron que elengrosamiento precoz es influido,principalmente, por el índice de cosecha y por elfollaje seco. Se hizo el análisis de QTL respecto alos caracteres vinculados de manera significativacon el engrosamiento precoz, empleando elprograma QGENE (Nelson, 1997).

Se confirmó que los marcadores vinculadoscon los caracteres asociados con elengrosamiento precoz eran significativos aP < 0.005. Se encontraron tres QTL, cada unopara el peso del follaje seco, los cuales explicande 25% a 33% de la varianza fenotípica, en tantoque se encontraron cinco QTL para el índice decosecha, los cuales explican de 18% a 27% de lavarianza fenotípica (Okogbenin, en preparación).

Kawano et al. (1998) indicaron que laselección por índice de cosecha, en el esquemade mejoramiento, es un parámetro eficaz deselección indirecta respecto al rendimiento de laraíz. Partiendo del análisis de marcadores en elestudio del engrosamiento precoz, es evidenteque el engrosamiento precoz —y, por extensión,el rendimiento— puede incrementarse más

eficazmente empleando criterios de selecciónbasados en los marcadores para el follaje (o sea,la biomasa total de la planta) y para el índice decosecha.

Los siguientes proyectos de marcación degenes se encuentran en curso en el CIAT:

- resistencia a la mosca blanca de la yuca(A. socialis) y a la bacteriosis común (CBB),utilizando diferentes cruzamientos;

- pudrición de las raíces (Phytophthora spp.) ycalidad de la raíz; p. ej., deterioro enposcosecha (PHD), calidad del almidón ycalidad culinaria.

Clonación de genes de interésagronómico

La naturaleza heterocigótica de la yuca implicaque cualquier intento de introducir en sugenotipo un carácter vegetal, aun cuando estécontrolado por un gen único, trae consigo lapérdida de una variedad favorita. Por tanto, unmétodo más eficaz de introducir en la yucacaracteres controlados por un solo gen, como laresistencia a la CMD, es la transformacióngenética. Ahora bien, primero es necesarioclonar los genes que controlan este carácter.Hay diversos enfoques para la clonación de ungen de interés, conocido solamente por sufenotipo o por su posición en un mapa de genes;el primer enfoque sería entonces la clonación porposición (Martin et al., 1993; Tanksley, 1995) yla clonación de genes mediante genesheterólogos (Bothwell et al., 1990).

Clonación por posición

Tres elementos importantes se emplean eneste tipo de clonación:

- un mapa detallado (desarrollado partiendode una población grande) de la regiónapropiada del genoma;

- una genoteca de cromosomas bacterianosartificiales (CAS); y

- un protocolo eficaz de transformación para elanálisis de complementación.

Se ha construido una CAS para yuca para laclonación por posición de los genes identificadosa partir de los mapas de genes correspondientes

393


a los caracteres de interés agronómico (Fregeneet al., 2000). Se aisló el ADN de la variedad deyuca TMS30001 y se incluyó en bloques deagarosa, tal como lo describen Zhang et al.(1995).

La variedad TMS30001, desarrollada en elIITA, presenta resistencia extrema a la CMD yresistencia a algunas cepas del CBB. Gran partedel ADN genómico, contenido en un tercio de unbloque de agarosa, fue parcialmente digerido conHind III (1.5U) durante 20 minutos a 37 ºC; losfragmentos de ADN obtenidos, cuyos tamañosestaban entre 100 y 300 kb, fueronseleccionados empleando electroforesis de gelesen campo magnético pulsátil (CHEF MAPPER,Bio-Rad Corp.).

El ADN seleccionado por tamaño se ligó en elsitio de clonación Hind III de pBeloBAC11, enuna relación vector:inserción de 10:1, utilizando14U de ligasa, para un volumen final de 100 ml.Se transformaron luego 20 microlitros de célulascompetentes DH10B (GIBCO BRL) con 2 ml de lareacción de ligación, por electroforación; lascolonias blancas obtenidas se recogieron para laclasificación por tamaño de la inserción de ADN.Las colonias se cultivaron durante 14 horas enLB + 30 mg/ml de cloramfenicol y se aisló elADN del plásmido mediante el robot deaislamiento automático de plásmidos Autogen(Kurabo Inc.).

El ADN del plásmido fue digerido con 10U deNot I para liberar las inserciones, y se separó enun gel de agarosa al 1%, mediante electroforesisde geles en campo magnético pulsátil. El restode la ‘ligación’ se transformó, se colocó en placasy se recogieron 55,000 clones, cuyo tamañopromedio era de 80,000 pares de bases, con elrobot Q-bot (Genetix PLC). La genoteca tiene unacobertura de cinco veces (5X) el tamaño delgenoma de la yuca.

Descubiertos los marcadores genéticosvinculados al gen que controla la nueva fuentede resistencia a la CMD y construida unagenoteca de CAS, se fija la etapa para laclonación por posición del gen de resistencia a laCMD. El marcador más cercano al gendominante de la resistencia a la CMD está a6 cM y no es apropiado para la construcción decontigs (segmentos contiguos de CAS alineadospara representar la zona donde se encuentra elgen de interés) de CAS con los intervalos del

genoma; de hecho, no son factibles los contigscon menos de 1 cM. En consecuencia, sonnecesarios los mapas detallados, o mapasdensos, de las regiones genómicas que fueronidentificadas como portadoras del gen deresistencia.

La manera más eficaz de hacer un mapadetallado de la yuca es empleando una variantedel análisis de segregación masal y losmarcadores de AFLP (Giovanni et al., 1991). Elmétodo aprovecha la capacidad única de lastécnicas RAPD y AFLP de muestrear muchos locidifundidos en todo el genoma y su capacidadpara encontrar otros marcadores vinculados aaquellos en cualquier región, mediante laselección masal de clases genotípicas demarcadores contiguas a esa región.

Este método se aplica actualmente a unapoblación grande empleada para desarrollar unmapa de 700 genotipos, para identificar otrosmarcadores en la región del genoma de la yucaque porta el gen de resistencia CMD2. Una vezque se hayan obtenido los mapas detallados, secalculará la relación que hay entre las distanciasgenéticas y las distancias físicas en las regionespertinentes. Calculada la distancia física que serequiere para cubrir la región portadora de losgenes de resistencia, se construirá un contig deCAS, mediante digestión de los clones de CAS ysu dactiloscopia. Finalmente, los clonescandidatos a CAS serán introducidos engenotipos de yuca susceptibles a la CMDmediante una transformación genética,utilizando el sistema BIBAC (Hamilton et al.,1996).

Evaluación de la diversidad genéticamediante marcadores moleculares

Los recursos genéticos de la yuca y susparientes silvestres representan un recursodecisivo para el futuro de este cultivo. Por tanto,es comprensible que se hayan hechorecolecciones y estudios sobre las relacionesgenéticas entre las accesiones de yuca,utilizando prácticamente todos los marcadoresmoleculares disponibles.

Accesiones y parientes silvestres

Los marcadores de minisatélite, o sea,obtenidos por dactiloscopia de series repetidasen tándem altamente variables de ADN nuclear

394


(Jeffreys et al., 1985), fueron los primeros que seemplearon para estudiar las relaciones entre lasaccesiones de yuca y sus parientes silvestres(Bertram, 1993; Ocampo et al., 1994).

Las dactiloscopias fueron obtenidasmediante hibridación Southern de secuencias deADN del fago M13 con ADN genómico de yucadigerido con un panel de enzimas de restricción(Rogstad et al., 1988). Con ellas se dedujo larelación existente entre las accesiones de yuca ylas especies de Manihot de América Central, y sepudieron identificar 29 accesiones duplicadasposibles en un subconjunto de la coleccióninternacional de yuca mantenida en el CIAT.

Se aplicaron también los análisis de RFLPdel ADN cloroplástico y las secuenciasribosómicas nucleares (ADNr), empleandosondas heterólogas, para evaluar las relacionesfilogenéticas entre las especies de Manihot deAmérica del Sur y América Central y la yuca(Bertram, 1993; Fregene et al., 1994). Elanálisis molecular refutó la opinión,ampliamente sostenida y basada en caracteresmorfológicos, de que la yuca puede haberseoriginado de una especie mesoamericana deManihot, M. aesculifolia (Rogers y Appan, 1973;Rogers y Fleming, 1973); sugiere, en cambio, eseanálisis una posible domesticación de algunosparientes silvestres cercanos de Brasil, entre losque se hallan M. tristis y M. esculenta subsp.flabellifolia.

Se emplearon también los marcadores deAFLP para obtener una evaluación cuantitativade relaciones genéticas en una muestrarepresentativa de la diversidad del cultivo y deseis taxa silvestres (Roa et al., 1997). Una vezmás, este estudio demostró que la especiebrasileña de Manihot, la subespecie M. esculentasubsp. flabellifolia, M. tristis y M. peruviana sonmás similares a la yuca que su parientemexicano M. aesculifolia; señaló, además, que layuca puede tener su origen en estos parientescercanos (Roa et al., 1997).

La prueba concluyente de los orígenes de layuca provino de un estudio filogeográfico basadoen la elaboración de secuencias del gen nuclearde copia simple que codifica para ladeshidrogenasa del gliceraldehido 3-fosfato(G3pdh) (Olsen y Schaal, 1999). Estos autoresdemuestran que la yuca se originó depoblaciones naturales de M. esculenta subsp.

flabellifolia, en la frontera sur de la cuencaamazónica de Brasil. Se emplearon tambiénmarcadores para obtener una evaluacióncuantitativa de la semejanza genética de la yuca(Beeching et al., 1993; Bonierbale et al., 1995;Second et al., 1997; Elias et al., 1999) y paraestudiar la estructura genética del germoplasmaresistente a la enfermedad (Sánchez et al., 1999;Fregene et al., 2000a). Otros estudios hanprocurado determinar la estructura genética y labase de la diferenciación genética de las líneasnativas de la yuca en Africa (Mkumbira et al.,2000; Fregene et al., en preparación).

Bonierbale et al. (1995) informaron sobreuna comparación del germoplasma élite de yucamantenido en el CIAT, que está adaptado a cincocondiciones edafoclimáticas de producción.Encontraron los investigadores que elgermoplasma de ciertas zonas edafoclimáticas(ECZ) tenía una base genética más amplia que elde otras; las accesiones, por su parte, no podíanasignarse, en general, a un acervo específico deECZ partiendo de modelos moleculares, puestoque había una considerable superposición defrecuencias de alelos.

Genotipos resistentes o susceptibles

Hay otros enfoques para evaluar ladiversidad genética que se basan en el análisisde la estructura de los genotipos resistentes a laenfermedad. Uno de ellos es el análisis decorrespondencias múltiples (MCA) de los datosde AFLP (con dos combinaciones de iniciadores)de genotipos de yuca resistentes y susceptibles ados cepas del estudio sobre Xanthomonasaxonopodis, que permitió aclarar la estructuragenética del germoplasma de yuca resistente a labacteriosis común (CBB) (Sánchez et al., 1999).

Los resultados del análisis de diversidadentre genotipos resistentes y susceptibles al CBBrevelan una distribución al azar de resistencia ysusceptibilidad, lo que indica que la resistenciaal CBB ha surgido, muchas veces, conindependencia de otros aspectos delgermoplasma de la yuca. Por otra parte, laevaluación de los análisis AFLP de líneas nativasy variedades mejoradas de Africa (en número de29) que eran resistentes o susceptibles a laenfermedad devastadora del mosaico de la yuca(CMD), reveló una distribución de variedadesresistente/susceptible que no es casual (Fregeneet al., 2000a). Se encontró también que las

395


líneas nativas africanas resistentes a la CMD sediferenciaban genéticamente de las líneas éliteresistentes y de las líneas nativas susceptibles, loque indica dos cosas: la presencia de dos fuentesdiferentes de resistencia a la CMD, y laposibilidad de que la fuente encontrada en lalínea nativa haya surgido recientemente como uncaso muy especial de mutación.

En otros estudios sobre líneas nativas deyuca se había evaluado, empleando marcadoresde AFLP, la variabilidad genética de31 variedades cultivadas tradicionalmente porlos amerindios Makushi de Guyana y de unamuestra representativa de 38 variedades de unacolección mundial ex situ mantenida en el CIAT(Cali, Colombia) (Elias et al., 1999).

Polimorfismo intravarietal

El estudio dio los siguientes resultados: sehalló polimorfismo intravarietal en21 variedades, lo que indica que una variedadpodría estar constituida por más de un genotipo.La diversidad encontrada en los cultivares deyuca de un sitio único en Guyana fue igual, entérminos cuantitativos, a la encontrada en elgrupo representativo de la colección del CIAT;además, no se encontró correspondencia entre laestructura de la diversidad molecular y lavariación observada en los caracteresagronómicos que son objetivo de la selección quehacen los cultivadores. Por el contrario, se hallóque la diversidad genética se estructurabapartiendo del sabor (variedades amargas versusvariedades dulces) en un estudio sobremicrosatélites de variedades de yuca del norte deMalawi (Mkumbira et al., 2000).

Se hizo otro estudio para evaluar lasrelaciones genéticas de 96 líneas nativasrecolectadas en 10 poblaciones en el sur deTanzania; en él se emplearon 68 marcadores demicrosatélites en un análisis de componentesprincipales para conocer las diferencias genéticasentre las líneas nativas, sin basarse en el sabor oen la ubicación (Fregene et al., en preparación).

Aunque no está muy clara la base de laconglomeración, se cree que representadiferentes sucesos de introducción. Parece que layuca, como ocurre con el maíz, tiene acervos degenes altamente diferenciados y un alto

porcentaje de loci de genes dominantes/recesivos activos; estas dos características sonmuy importantes en la heterosis. Una vez que sehayan analizado los numerosos datos y se hayanprobado los cruzamientos entre conglomerados,es probable que se empleen marcadoresmoleculares para predecir la heterosis. Losmarcadores de microsatélites se han empleadotambién para buscar duplicados en la coleccióncentral del CIAT (Chavarriaga et al., 1999) y paraanalizar el germoplasma de dos regiones: ellitoral y la Amazonia de Brasil (Mueller et al., enpreparación).

Conclusión

La biotecnología de la yuca puede hacercontribuciones notables a la modernización delcultivo y crear opciones para que los pequeñosagricultores obtengan ingresos adicionales.Integrada con el fitomejoramiento y laagronomía, principalmente, podrá realizar elpotencial de este cultivo y hacer accesibles losresultados de ese trabajo.

Agradecimientos

Los autores agradecen al Programa Colombianode Biotecnología Agrícola (PBA), financiado porCEGA-DGIS, de Holanda; al ParticipatoryResearch and Gender Analysis Program (PRGA);al Department for International Development(DfID), del Reino Unido, y al Ministerio deAgricultura y Desarrollo Rural de Colombia(MADR); estas entidades hicieron valiososaportes a la financiación de los proyectos deinvestigación mencionados en este capítulo.

Referencias

Akano A; Barrera E; Dixon AG O; Fregene M. 2000.Molecular genetic mapping of resistance to theAfrican cassava mosaic disease. Theoreticaland Applied Genetics. (En impresión.)

Akintonwa AO; Tunwashe N; Onifade A. 1994.Fatal and non-fatal acute poisoning attributedto cassava-based meal. Acta Horticulturae375:285-288.

396


Alvard D; Cote F; Teisson C. 1993. Comparison ofmethods of liquid medium culture for bananamicropropagation: Effects of temporaryimmersion of explants. Plant Cell Tissue andOrgan Culture 32:55-60.

Andersen MD; Busk PK; Svendsen I; Moller BL.2000. Cytochromes P-450 from cassava(Manihot esculenta Crantz) catalyzing the firststeps in the biosynthesis of the cyanogenicglucosides Linamarin and Lotaustralin;I. Cloning, functional expression in Pichiapastoris, and substrate specificity of theisolated recombinant enzymes. Journal ofBiological Chemistry 275:1966-1975.

Arias-Garzón DI; Sayre RT. 2000. Geneticengineering approaches to reducing thecyanide toxicity in cassava (Manihot esculenta,Crantz). En: Carvalho LJCB; Thro AM;Vilarinhos AD (eds.). Proceedings of the IVInternational Scientific Meeting of the CassavaBiotechnology Network, 1998. Brasilia, Brasil.p. 213-221.

Bachem CWB; van der Hoeven RS; de Brujin SM;Vreugdenhill D; Zabeau M; Visser RGF. 1996.Visualization of differential gene expressionusing a novel method of RNA fingerprintingbased on AFLP: Analysis of gene expressionduring potato tuber development. PlantJournal 9(5):745-753.

Bajaj TPS. 1983. Cassava plant from meristemcultures freeze-preserved from three years.Field Crops Research 7:161-167

Banea-Mayambu JP; Tylleskär T; Gitebon N;Matadi N; Gebre-Medhin M; Rosling H. 1997.Geographical and seasonal association betweenlinamarin and cyanide exposure from cassavaand the upper motor neurone disease konzo informer Zaire. Tropical Medicine & InternationalHealth 2:1143-1151.

Bayley CC; Morgan M; Dale EC; Ow DW. 1992.Exchange of gene activity in transgenic plantscatalyzed by the Cre-lox site-specificrecombination system. Plant Molecular Biology18:353-361.

Beeching JR; Marmey P; Gavalda MC; Noirot M;Haysom HR; Hughes MA; Charrier A. 1993. Anassessment of genetic diversity within acollection of cassava (Manihot esculenta Crantz)germplasm using molecular markers. Annals ofBotany (United Kingdom) 72 (6):515-520.

Bellotti AC. 1979. An overview on cassavaentomology. En: Brekelbaum T; Bellotti A;Lozano J (eds.). Cassava Protection Workshop.Memorias. Centro Internacional de AgriculturaTropical (CIAT), Cali, Colombia. p. 17-28.

Bellotti AC; Arias B. 1979. Biology, ecology andbiological control of cassava hornworm Erinnyisello. En: Brekelbaum T; Bellotti A; Lozano J(eds). Cassava Protection Workshop. Memorias.Centro Internacional de Agricultura Tropical(CIAT), Cali, Colombia. p. 227-232.

Bellotti AC; Smith L; Lapointe SL. 1999. Recentadvances in cassava pest management. AnnualReview of Entomology (USA) 44:343-370.

Benson E; Chabrillange N; Engelmann F. 1992.Mise au point de méthods de cryopreservationde meristems pour la conservation a long termedes resources du manioc. ORSTOM(Montpellier).

Berthouly M; Dufour M; Alvard D; Carrasco C;Alemanno L; Teisson C. 1995. Coffemicropropagation in liquid medium usingtemporary immersion technique. ASIC, Kyoto.2:514-519C.

Bertram RB. 1993. Application of moleculartechniques resources of cassava (Manihotesculenta Crantz, Euphorbiaceae): Interspecificevolutionary relationships and intraspecificcharacterization. Cambridge University Press.p. 1-20.

Bonierbale MW; Maya MM; Claros JL; Iglesias C.1995. Application of molecular markers todescribing the genetic structure of cassavagene pools. En: Proceedings of the SecondInternational Scientific Meeting of the CassavaBiotechnology Network, Bogor, Indonesia,1994. Working Document no. 150. CentroInternacional de Agricultura Tropical (CIAT),Cali, Colombia. p. 106-122.

397


Bonierbale MW; Guevara C; Dixon AGO; Ng NQ;Asiedu R; Ng SYC. 1997. Cassava. En: FuccilloDA; Sears L; Stapleton P (eds.). Biodiversity intrust: Conservation and use of plant geneticresources in CGIAR centres. CambridgeUniversity Press, Cambridge, Reino Unido.p. 1-20.

Bothwell AL; Yancopoulis GD; Alt FW. 1990.Methods for cloning and analysis of eukaryoticgenes. Jones and Bartlett, Boston, MA, E.U.p. 8-19.

Boventius H; Weller JI. 1994. Mapping andanalysis of diary cattle quantitative trait loci bymaximum likelihood methodology using milkprotein genes as genetic markers. Genetics137:267-280.

Calderón-Urrea A. 1988. Transformation of Manihotesculenta (cassava) using Agrobacteriumtumefaciens and expression of the introducedforeign genes in transformed cell lines. Tesis(M.Sc.). Vrije Univ. Bruselas, Bélgica.

Chalfie M; Tu Y; Euskirchen G; Ward WW; PrasherDC. 1994. Green fluorescent protein as amarker for gene expression. Science263:802-805.

Charoensub R; Phansiri S; Sakai A;Yongmanitchai W. 1999. Cryopreservation ofcassava in vitro-grown shoot tips cooled to–196 °C by vitrification. Cryo-Letters 20:89-94.

Chavarriaga P; Schöpke C; Sangare A; FauquetCM; Beachy RN. 1993. Transformation ofcassava (Manihot esculenta Crantz)embryogenic tissues using Agrobacteriumtumefaciens. En: Roca WM; Thro AM (eds.).Proceedings of the First International ScientificMeeting of the Cassava Biotechnology Network,Cartagena, Colombia, 1992. WorkingDocument no. 123. Centro Internacional deAgricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.p. 222-228.

Chavarriaga P; Mancilla L; Ladino JJ; Ramírez C;López D; Herrera CJ; Roca WM. 2000a.Towards genetic transformation of cassava forinsect resistance. En: Poster at the symposium“From germplasm bank to farmer fields, role ofCIAT biotechnology in research and training inLatin America”, Cali, Colombia, diciembre2000. Centro Internacional de AgriculturaTropical (CIAT), Cali, Colombia.

Chavarriaga P; Mancilla LI; Ladino YJ; Segovia V;Roca WM. 2000b. Developing transgenicstrategies against cassava stem borers. En:Carvalho LJCB; Thro AM; Vilarinhos AD (eds.).Proceedings of the IV International ScientificMeeting of the Cassava Biotechnology Network,1998. Brasilia, Brasil. p. 244-249.

Chavarriaga P; Maya MM; Tohme J; Duque MC;Iglesias C; Bonierbale MW; Kresovich S;Kochert G. 1999. Using microsatellites,isozymes and AFLPs to evaluate geneticdiversity and redundancy in the cassava corecollection and to assess the usefulness of ofDNA-based markers to maintain germplasmcollections. Molecular Breeding 5:263-273.

CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical).1999. Assessing and utilizing agrobiodoversitythrough biotechnology. En: CIAT Annual Report1999; Project SB-02. Cali, Colombia. p. 34-36;84-88.

De Block M; Botterman J; Vandewiele M; Dockx J;Thoen C; Gossele V; Movva NR; Thompson C;van Montagu M; Leemans J. 1987. Engineeringherbicide resistance in plants by expression ofa detoxifying enzyme. EMBO Journal6:2513-2518.

Ebinuma H; Sugita K; Matsunaga E; Yamakado.1997. Selection of marker free transgenicplants using the isopentenyl transferase gene.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America94:2117-2121.

Elias M; Panaud O; Robert N. 1999. Assessment ofgenetic variability in a traditional cassava(Manihot esculenta Crantz) farming system,using AFLP markers. Heredity 85(3):219-230.

Epperson JE; Pachico D; Guevara C. 1997. Costanalysis of maintaining cassava plant geneticresources. Crop Science 37(5):1641-1649.

398


Escobar RH; Mafla G; Roca WM. 1997. Amethodology for recovering cassava plants fromshoot tips maintained in liquid nitrogen. PlantCell Reports 16:474-478.

Escobar RH; Debouck D; Roca WM. 2000a.Development of cassava cryopreservation. En:Engelmann F; Takagi H (eds.).Cryopreservation of tropical plant germplasm:current research progress and application,Tsukuba, Japan/IPGRI, Rome. JIRCAS, Tokio.p. 222-226.

Escobar R; Restrepo JM; Ospina GI; Hernández C;Tohme J; Roca WM. 2000b. Participatoryresearch to develop low cost in vitro cassavapropagation methods. En: Poster at the IIIInternational Seminar and Small GrantsWorkshop “Uniting science and participation inresearch”, noviembre 2000, Nairobi, Kenya.Centro Internacional de Agricultura Tropical(CIAT), Cali, Colombia.

Escobar RH; Florez CP; Tabares E; Lentini Z; RocaWM. 2000c. Implementación del sistema RITA®en algunos cultivos del CIAT. En: Poster at thesymposium “From germplasm bank to farmerfields: Role of CIAT biotechnology in researchand training in Latin America”, Cali, Colombia,diciembre 2000. Centro Internacional deAgricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.

Escobar RH; Muñoz L; Roca WM. 2000d. Cassavamicropropagation for rapid ‘seed’ productionusing temporary immersion bioreactors. En:Poster at the symposium “From germplasmbank to farmer fields: Role of CIATbiotechnology in research and training in LatinAmerica”, diciembre 2000. Centro Internacionalde Agricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.

Escobar RH; Muñoz L; Tohme J; Roca WM. 2001.Estado actual de la micropropagación de layuca. Trabajo presentado en el SeminarioInternacional, Programa Colombiano deBiotecnología Agrícola (PBA), Cartagena,Colombia. Centro Internacional de AgriculturaTropical (CIAT), Cali, Colombia. (Multicopiado.)

Etienne H; Lartaud M; Michaux-Ferrière N; CarronMP; Berthouly M; Teisson C. 1997.Improvement of somatic embryogenesis inHevea brasiliensis (Müll. Arg) using thetemporary immersion technique. In VitroCellular & Development Biology Plant33:81-87.

Fraley RT; Rogers SG; Horsch RB; Sanders PR;Flick JS; Adams SP; Bittner ML; Brand LA;Fink CL; Fry JS; Galluppi GR; Goldberg SB;Hoffman NL; Woo SC. 1983. Expression ofbacterial genes in plant cells. Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 80:4803-4807.

Fregene MA; Vargas J; Ikea J; Angel F; Tohme J;Asiedu RA; Akorada MO; Roca WM. 1994.Variability of chloroplast DNA and nuclearribosomal DNA in cassava (Manihot esculentaCrantz) and its wild relatives. Theoretical andApplied Genetics 89(6):719-727.

Fregene M; Angel F; Gómez R; Rodríguez F;Chavarriaga P; Roca W; Tohme J; BonierbaleM. 1997. A molecular genetic map of cassava(Manihot esculenta Crantz). Theoretical andApplied Genetics 95:431-441.

Fregene M; Bernal A; Duque M; Dixon A; Tohme J.2000a. AFLP analysis of African cassava(Manihot esculenta Crantz) germplasm resistantto the cassava mosaic disease (CMD).Theoretical and Applied Genetics 100(5):678-685.

Fregene M; Okogbenin E; Mba C; Angel F; SuárezMC; Gutiérrez J; Chavarriaga P; Roca W;Bonierbale M; Tohme J. 2000b. Genomemapping in cassava improvement: Challenges,achievements and opportunities. Euphytica(En impresión.)

Frey P. 1996. Towards regeneration andtransformation of cassava meristems. Tesis(M.Sc.). Swiss Federal Institut of Technology,Zurich, Suiza.

Giovannoni JJ; Wing RA; Ganal MW; Tanksley SD.1991. Isolation of molecular markers fromspecific chromosomal intervals using DNApools from existing mapping populations.Nucleic Acids Research 19(23):6553-6558.

399


González AE; Schöpke C; Taylor NJ; Beachy RN;Fauquet CM. 1998. Regeneration of transgeniccassava plants (Manihot esculenta Crantz)through Agrobacterium-mediatedtransformation of embryogenic suspensioncultures. Plant Cell Reports 17:827-831.

Gresshoff P; Doy C. 1974. Derivation of a haploidcell line from Vitis vinifera and the importanceof the stage of meiotic development of theanthers for haploid culture of this and othergenera. Zeitschrift fuer Pflanzenphysiol.73:132-141.

Haldrup A; Petersen SG; Okkels FT. 1998a.Positive selection: A plant selection principlebased on xylose isomerase, an enzyme used inthe food industry. Plant Cell Reports 18:76-81.

Haldrup A; Petersen SG; Okkels FT. 1998b. Thexylose isomerase gene fromThermoanaerobacterium thermosulfurogenesallows effective selection of transgenic plantcells using D-xylose as the selection agent.Plant Molecular Biology 37:287-296.

Hamilton CM; Frary A; Lewis C; Tanksley SD.1996. Stable transfer of intact hihg molecularweight DNA into plant chromosomes.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America93:9975-9979.

Herrera-Estrella L; De Block M; Messens E;Hernalsteens JP; Van Montagu M; Schell J.1983. Chimaeric genes as dominant selectablemarkers in plants. EMBO Journal 2:987-995.

Iglesias C; Mayer J; Chávez L; Calle F. 1997.Genetic potential and stability of carotenecontent in cassava roots. Euphytica94:367-373.

Jefferson RA. 1987. Assaying chimeric genes inplants: The GUS gene fusion system. PlantMolecular Biology 5:387-405.

Jefferson RA; Burgess SM; Hirsh D. 1986.b-Glucuronidase from Escherichia coli as agene-fusion marker. Proceedings of theNational Academy of Sciences of the UnitedStates of America 83:8447-8451.

Jeffreys A; Wilson JV; Thein L. 1985. Hypervariable “minisatellite” regions in human DNA.Nature 314:67-73.

Joersbo M; Okkels FT. 1996. A novel principle forselection of transgenic plant cells: Positiveselection. Plant Cell Reports 16:219-221.

Joersbo M; Donaldson I; Kreiberg K; Guldager P S;Brunstedt J; Okkels FT. 1998. Analysis ofmannose selection used for transformation ofsugar beet. Molecular Breeding 4:111-117.

Jorge V; Fregene MA; Duque MC; Bonierbale MW;Tohme J; Verdier V. 2000. Genetic mapping ofresistance to bacterial blight disease in cassava(Manihot esculenta Crantz). Theoretical andApplied Genetics 101(5/6):865-872.

Kartha KK; Leung NL; Mroginski LA. 1982. In vitrogrowth responses and plant regeneration fromcryopreserved meristems of cassava. Zeitschriftfuer Pflanzenphysiol. 107(2):133-140.

Kawano K; Narintaraporn K; Narintaraporn P;Sarakarn S; Limsila A; Limsila J; Suparhan D;Sarawat V; Watananonta W. 1998. Yieldimprovement in a multistage breeding programfor cassava. Crop Science 38(2):325-332.

Konan NK; Sangwan RS; Sangwan-Norreel BS.1994a. Efficient in vitro shoot-regenerationsystems in cassava (Manihot esculenta Crantz).Plant Breeding 113:227-236.

Kunkel T; Niu Q W; Chan Y S; Chua N H. 1999.Inducible isopentenyl transferase as a high-efficiency marker for plant transformation.Nature Biotechnology 17:916-919.

Lee M. 1995. DNA markers and plant breedingprograms. Advances in Agronomy 55:265-344.

Lefèvre F; Charrier A. 1993a. Heredity of seventeenisozyme loci in cassava (Manihot esculentaCrantz). Euphytica 66:171-178.

Li H-Q; Sautter C; Potrykus I; Puonti-Kaerlas J.1996. Genetic transformation of cassava(Manihot esculenta Crantz). NatureBiotechnology 14:736-740.

400


Li H-Q; Guo JY; Huang Y-W; Liang CY; Liu HX;Potrykus I; Puonti-Kaerlas J. 1998a.Regeneration of cassava plants via shootorganogenesis. Plant Cell Reports 17:410-414.

Li, H-Q; Potrykus I; Puonti-Kaerlas J. 1998b.Engineering leaf life length in cassava. En:Pires de Matos A; Vilarinhos A. (eds.). IVInternational Scientific Meeting of the CassavaBiotechnology Network. Resúmenes. RevistaBrasileira de Mandioca (Suplemento) 17:31.

Li H-Q; Huang Y-W; Liang C-Y; Guo Y. 1995.Improvement of plant regeneration fromsecondary somatic embryos of cassava. En:Proceedings of the Second InternationalScientific Meeting of the Cassava BiotechnologyNetwork, Bogor, Indonesia, 1994. WorkingDocument no. 150. Centro Internacional deAgricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.v. 1, p. 289-302.

Liddle S; Hughes J; Hughes MA. 1997. Analysis ofa cassava root α-glycosidase promoter. AfricanJournal of Root and Tuber Crops 2:158-162.

Litt M; Lutty JA. 1989. A hypervariablemicrosatellite revealed by in vitro amplificationof dinucleotide repeat within the cardiacmuscle actin gene. American Journal ofHuman Genetics 44:397-401.

López D. 2000. Inducción de callo embriogénicofriable (CEF) y regeneración de plantas de lavariedad de yuca (Manihot esculenta Crantz)MCol 2215. Tesis. Universidad Nacional deColombia, Facultad de Ciencias Agropecuarias,Palmira, Colombia. 85 p.

López D; Chavarriaga P; Tohme J; Roca WM.2001a. Induction of friable embryogenic callus(FEC) in commercial cassava cultivars. En:CIAT Annual Report 2001; Project SB-02:Assessing and utilizing agrobiodoversitythrough biotechnology. Centro Internacional deAgricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.p. 224-229.

López D; Montoya JE; Escobar R; Chavarriaga P;Tohme J; Roca WM. 2001b. Regeneration ofcassava plants from friable embryogenic callus(FEC) by combining conventional solid mediaand temporary immersion using RITA®. En:CIAT Annual Report 2001; Project SB-02:Assessing and utilizing agrobiodoversitythrough biotechnology. Centro Internacional deAgricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.p. 224-227.

Lorenzo JC; González BL; Escalona M; Teisson C;Espinosa P; Borroto C. 1998. Sugarcane shootformation in an improved temporary immersionsystem. Plant Cell Tissue and Organ Culture52:197-200.

Manrique NC. 2000. Respuesta varietal de95 genotipos de la colección núcleo de yuca ala crioconservación usando la técnica deencapsulación-deshidratación. Tesis.Universidad Nacional de Colombia, Facultad deCiencias Agropecuarias, Palmira, Colombia.88 p.

Marín ML; Mafla G; Roca WM; Withers LA. 1990.Cryopreservation of cassava zygotic embriosand whole seeds in liquid nitrogen. Cryo-Letters 11:257-264.

Martin GB; Brommonschenkel SH; Chunwongse J;Frary A; Ganal MW; Spivey R; Wu T; Earle ED;Tanksley SD. 1993. Map-based cloning of aprotein kinase gene conferring diseaseresistance in tomato. Science 262(5138):1432-1436.

Mathews H; Schöpke C; Carcamo R; ChavarriagaP; Fauquet C; Beachy RN. 1993. Improvementof somatic embryogenesis and plant recovery incassava. Plant Cell Reports 12:328-333.

Mayerhofer R; Langridge WHR; Cormier MJ; SzalayAA. 1995. Expression of recombinant Renillaluciferase in transgenic plants results in highlevels of light emission. Plant Journal7:1031-1038.

Mba REC; Stephenson P; Edwards K; Melzer S;Nkumbira J; Gullberg U; Apel K; Gale M;Tohme J; Fregene M. 2000. Simple SequenceRepeat (SSR) markers survey of the cassava(Manihot esculenta Crantz) genome: Towards aSSR-based molecular genetic map of cassava.Theoretical and Applied Genetics 102:21-31.

401


Mett VL; Lochhead LP; Reynalds PH. 1993.Copper-controllable gene expression system forwhole plants. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States ofAmerica 90:4567-4571.

Mkumbira J; Lagercrantz U; Mahungu N M;Chiwona-Karltun L; Saka J; Mhone A; BokangaM; Brimer L; Gullberg U; Rosling H. 2000.Genetic variability within and between localcultivars in Nortehrn Malawi. Euphytica. (Enimpresión.)

Mlingi, N; Poulter NH; Rosling H. 1992. Anoutbreak of acute intoxications fromconsumption of insufficiently processedcassava in Tanzania. Nutrition Research12:677-687.

Mohan M; Nair S; Bhagwat A; Krishna T; Yano M;Bhatia C; Sasaki T. 1997. Genome mapping,molecular markers and marker-assistedselection in crop plants. Molecular Breeding3:87-103.

Mukherjee A. 1995. Embryogenesis andregeneration from cassava calli of anther andleaf. En: Proceedings of the SecondInternational Scientific Meeting of the CassavaBiotechnology Network, Bogor, Indonesia,1994. Working Document no. 150. CentroInternacional de Agricultura Tropical (CIAT),Cali, Colombia. v. 1, p. 375-381.

Munyikwa TRI; Chipangura B; SalehuzzamanSNIM; Jacobsen E; Visser RFG. 1995. Isolationand characterization of starch biosynthesisfrom cassava (Manihot esculenta Crantz). Tesis(Ph.D.). University of Wageningen, Holanda.119 p.

Munyikwa TRI; Raemakers CJM; Schreuder R; KokM; Schippers E; Jacobsen E; Visser RGF.1998a. Pinpointing towards improvedtransformation and regeneration of cassava(Manihot esculenta Crantz). Plant Science135:87-101.

Munyikwa TRI; Raemakers CCJM; Schreuder M;Kreuze J; Suurs L; Kok R; Rozeboom M;Jacobsen E; Visser RGF. 1998b. Introductionand expression of antisense ADPG-pyrophosphorylase of cassava leads todecreased levels of starch and increased levelsof sugars. En: Pires de Matos, A; Vilarinhos A(eds.). IV International Scientific Meeting of theCassava Biotechnology Network. Resúmenes.Revista Brasileira de Mandioca (Suplemento)17:62.

Munyikwa TRI; Langeveld S; Salehuzzaman SNIM;Jacobsen E; Visser RGF. 1997. Cassava starchbiosynthesis: New avenues for modifying starchquantity and quality. Euphytica 96:65-75.

Murakami T; Anzai H; Imai S; Satoh A; Nagaoka K;Thompson C. 1986. The bialaphos biosyntheticgenes of Streptomyces hygroscopicus: Molecularcloning and characterization of the genecluster. Molecular & General Genetics205:42-50.

Murashige T; Skoog F. 1962. A revised medium forrapid growth and bioassays with tobacco tissuecultures. Physiologia Plantarum 15:473-497.

Nelson JC. 1997. QGENE: Software for markerbased genome analysis and breeding.Molecular Breeding 3:229-235.

Ocampo C; Angel F; Jiménez A; Jaramillo G;Hershey C; Granados E; Iglesias C. 1995. DNAfingerprinting to confirm possible geneticduplicates in cassava germplasm. En:Proceedings of the Second InternationalScientific Meeting of the Cassava BiotechnologyNetwork, Bogor, Indonesia, 1994. WorkingDocument no. 150. Centro Internacional deAgricultura Tropical (CIAT), Cali, Colombia.v. 1, p. 145-151.

Odell JJ; Caimi PG; Sauer B; Russell SH. 1990.Site-directed recombination in the genome oftransgenic tobacco. Molecular & GeneralGenetics 223:369-378.

Olsen KM; Schaal BA. 1999. Evidence on the originof cassava: Phylogeography of Manihotesculenta. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States ofAmerica 96(10):5586-5591.

402


Orellana MA. 1997. Desarrollo de un sistema decultivo in vitro para los explantes nodales decaoba (Swietenia macrophylla King). Tesis(Maestría). Centro Agronómico Tropical deInvestigación y Enseñanza (CATIE), Costa Rica.

Otim-Nape GW. 1993. Epidemology of the Africancassava mosaic geminivirus disease (ACMD) inUganda. Tesis (Ph.D.). University of Reading,Reading, Reino Unido.

Otim-Nape GW. 1995. The African cassava mosaicvirus (ACMV): A threat to food security inAfrica. En: Proceedings of the SecondInternational Scientific Meeting of the CassavaBiotechnology Network, Bogor, Indonesia,1994. Working Document no. 150. CentroInternacional de Agricultura Tropical (CIAT),Cali, Colombia. v. 2, p. 519-530.

Ow DW; Wood KV; DeLuca M; de Wet JR; HelinskiDR; Howell SH. 1986. Transient and stableexpression of the firefly luciferase gene in plantcells and transgenic plants. Science 234:856-859.

Perry BA. 1943. Chromosome number andphylogenetic relationships in theEuphorbiaceae. American Journal of Botany30:527-543.

Puonti-Kaerlas J; Frey P; Potrykus I. 1997a.Development of meristem gene transfertechniques for cassava. African Journal of Rootand Tuber Crops 2:175-180.

Puonti-Kaerlas J; Li H-Q; Sautter C; Potrykus I.1997b. Production of transgenic cassava(Manihot esculenta Crantz) via organogenesisand Agrobacterium-mediated transformation.African Journal of Root and Tuber Crops2:181-186.

Puonti-Kaerlas J; Li H-Q; Wohlwend H; Potrykus I.1998. Competence for embryogenesis andorganogenesis in cassava. En: Pires de MatosA; Vilarinhos A (eds.). IV InternationalScientific Meeting of the Cassava BiotechnologyNetwork. Resúmenes. Revista Brasileira deMandioca (Suplemento) 17:32.

Quin M; Bayley C; Stockton T; Ow DW. 1994.Recombinase-mediated site-specificrecombination between plant chromosomes.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America91:1706-1710.

Raemakers CJJM; Sofiari E; Taylor NJ; HenshawGG; Jacobsen E; Visser RGF. 1996. Productionof transgenic cassava (Manihot esculentaCrantz) plants by particle bombardment usingluciferase activity as selection marker.Molecular Breeding 2:339-349.

Raemakers CJJM; Schreuder MM; Pereira I; SuursL; Vincken JP; Jacobsen E; Visser RGF. 2001.Production of amylose-free cassava plants bygenetic modification. Trabajo presentado en laFifth Scientific Meeting of the CassavaBiotechnology Network, noviembre 2001.Resúmenes ejecutivos. St. Louis, MO, E.U.p. S3-13.

Raemakers K; Schreuder M; Munyikwa T;Jacobsen E; Visser R. 2000. Towards a routinetransformation procedure for cassava. En:Carvalho LJCB; Thro AM; Vilarinhos AD (eds.).Proceedings of the IV International ScientificMeeting of the Cassava Biotechnology Network,1998. Brasilia, Brasil. p. 250-266.

Ritter E; Debener T; Barone A; Salamini F;Gebhardt C. 1991. RFLP mapping on potatochromosomes of two genes controlling extremeresistance to potato virus X (PVX). Molecular &General Genetics 227:81-85.

Roa AC; Maya MM; Duque M; Allem C; Tohme J;Bonierbale MW. 1997. AFLP analysis ofrelationships among cassava and otherManihot species. Theoretical and AppliedGenetics 95:741-750.

Roca WM. 1984. Cassava. En: Sharp WR; EvansDA; Ammirato PV; Yamada Y. Handbook ofplant cell culture. 2: Crop species. MacMillanPub., Nueva York. p. 269-301.

Rogers DJ; Appan SG. 1973a. Manihot;Manihotoides (Euphorbiaceae). FloraNeotropica. Monograph no. 13. Hafner Press,Nueva York, NY, E.U. 272 p.

403


Rogers DJ; Fleming HS. 1973b. A monograph ofManihot esculenta with an explanation of thetaximetric methods used. Economic Botany27:1-113.

Rogstad SH; Patton JC; Schaal BA. 1988. M13repeat probe detects DNA minisatellite-likesequences in gymnosperms and angiosperms.Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America85:9176-9178.

Rosling H. 1988. Cassava toxicity and foodsecurity. UNICEF African Household SecurityProgramme. Tryck Kontakt, Uppsala, Suecia.

Rosling H; Mlingi N; Tylleskär T; Banea M. 1993.Causal mechanisms behind human diseasesinduced by cyanide exposure from cassava. En:Roca WM; Thro AM (eds.). Proceedings of theFirst International Scientific Meeting of theCassava Biotechnology Network, Cartagena,Colombia, 1992. Working Document no. 123.Centro Internacional de Agricultura Tropical(CIAT), Cali, Colombia. p. 366-375.

Sánchez G; Restrepo S; Duque M; Fregene M;Bonierbale M; Verdier V. 1999. AFLPassessment of genetic variability in cassavaaccessions (Manihot esculenta) resistant andsusceptible to the cassava bacterial blight(CBB). Genome 42:163-172.

Santos LG; Escobar R; Chavarriaga P; Roca WM.2001. Cryopreservation of friable embryogeniccallus (FEC) lines. En: CIAT Annual Report2001; Project SB-02: Assessing and utilizingagrobiodoversity through biotechnology. CentroInternacional de Agricultura Tropical (CIAT),Cali, Colombia. p. 256-257.

Sarria R; Torres E; Angel F; Chavarriaga P; RocaWM. 2000. Transgenic plants of cassava(Manihot esculenta) with resistance to Bastaobtained by Agrobacterium-mediatedtransformation. Plant Cell Reports 19:339-344.

Schena M; Lloyd AM; Davis RW. 1991. A steroid-inducible gene expression system for plantcells. Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America88:10421-10425.

Schenk RU; Hildebrandt AC. 1972. Medium andtechniques for induction and growth ofmonocotyledonous and dicotyledonous plantcell cultures. Canadian Journal of Botany50:199-204.

Schöpke C; Franche C; Bogusz D; Chavarriaga P;Fauquet CM; Beachy RN, 1993. Transformationin cassava (Manihot esculenta Crantz). En:Bajaj N (ed.). Biotechnology in agriculture andforestry; Plant protoplasts and geneticengineering. Springer-Verlag, Berlín. v. 23,p. 273-289.

Schöpke C; Taylor N; Carcamo R; Konan N;Marmey P; Henshaw GG; Beachy RN; FauquetC. 1996. Regeneration of transgenic cassavaplants (Manihot esculenta Crantz) frommicrobombarded embryogenic suspensioncultures. Nature Biotechnology 14:731-735.

Schöpke C; Taylor N; Carcamo R; González deSchöpke AE; Konan N; Marmey P; HenshawGG; Beachy RN; Fauquet C. 1997a. Stabletransformation of cassava (Manihot esculentaCrantz) by particle bombardment and byAgrobacterium. African Journal of Root andTuber Crops 2:187-193.

Schöpke C; Carcamo R; Beachy RN; Fauquet C.1997b. Plant regeneration from transgenic andnon-transgenic embryogenic suspensioncultures of cassava (Manihot esculenta Crantz).African Journal of Root and Tuber Crops2:194-195.

Schrott M. 1995. Selectable marker and reportergenes. En: Potrykus I; Spangenberg G (eds.).Gene transfer to plants. Springer-Verlag,Berlín. p. 325-336.

Second G; Allem A; Emperaire L; Ingram C;Colombo C; Mendes R; Carvalho L. 1997. AFLPbased Manihot and cassava numericaltaxonomy and genetic structure analysis inprogress: implications for dynamicconservation and genetic mapping. AfricanJournal of Root and Tuber Crops 2(1-2):140-147.

404


Siritunga D; Arias-Garzón D; Sayre R. 2001.Reduction in the cyanogenic potential ofcassava roots; transgenic plants expressinghydroxynitrile lyase in the roots. En:Proceedings of the Fifth Scientific Meeting ofthe Cassava Biotechnology Network, noviembre2001, St. Louis, MO, E.U. Resúmenes.p. S7-27.

Siritunga D; Sayre R. 2001. Down-regulation ofCYP79D1 and CYP79D2 to obtain acyanogeniccassava (Manihot esculenta). En: Proceedings ofthe Fifth Scientific Meeting of the CassvaBiotechnology Network, noviembre 2001, St.Louis, MO, E.U. Resúmenes. p. S7-28.

Sommer A. 1988. New imperatives for an oldvitamin A. Journal of Nutrition 119:96-100.

Stamp JA; Henshaw GG. 1982. Somaticembryogenesis in cassava. Zeitschrift fuerPflanzenphysiol. 105:183-187.

Suárez MC; Bernal A; Gutiérrez J; Tohme J;Fregene M. 2000. Development of expressedsequence tags (ESTs) from polymorphictranscription derived fragments (TDFs) incassava (Manihot esculenta Crantz). Genome43:62-67.

Szabados L; Hoyos R; Roca W. 1987. In vitrosomatic embryogenesis and plant regenerationof cassava. Plant Cell Reports 6:248-251.

Tanksley SD; Ganal MW; Martin GB. 1995.Chromosome landing: A paradigm for map-based gene cloning in plants with largegenomes. Trends in Genetics 11(2):63-68.

Tanksley SD; Young ND; Paterson AH; BonierbaleMW. 1989. RFLP mapping in plant breeding:New tools for an old science. Biotechnology7:257-263.

Taylor NJ; Edwards M; Kiernan RJ; Davey CDM;Blakesley D; Henshaw GG. 1996. Developmentof friable embryogenic callus and embryogenicsuspension culture systems in cassava(Manihot esculenta Crantz). NatureBiotechnology 14:726-730.

Taylor NJ; Masona MV; Schöpke C; Carcamo R; HoT; González AE; Beachy RN; Fauquet C. 2000.Production of genetically transformed cassavaplants containing various genes of interest. En:Carvalho LJCB; Thro AM; Vilarinhos AD (eds.).Proceedings of the IV International ScientificMeeting of the Cassava Biotechnology Network,1998. Brasilia. Brasil. p. 267-276.

Teisson C; Alvard D. 1994. A new concept of plantin vitro cultivation liquid medium: temporaryimmersion. En: Terce M; Cella R; Falavigna A(eds.). Current issues in plant molecular andcell biology. Kluwer Academic Pub., Holanda.p. 105-110.

Thompson GA; Hiatt WR; Facciotti D; Stalker DM;Comai L. 1987. Expression in plants of abacterial gene coding for glyphosate resistance.Weed Sci. 35 (Suppl):19-23.

Thro AM; Roca WM; Restrepo J; Caballero H; PoatsS; Escobar R; Mafla G; Hernández C. 1999.Can in vitro biology have farm-level impact forsmall-scale cassava farmers in Latin America?In Vitro Cellular & Development Biology Plant35:382-387.

Towill LE. 1996. Germplasm preservation. En:Trigiano RN; Gray DJ (eds.). Plant tissueculture: Concepts and laboratory exercises.CRC Press. p. 291-196.

Tylleskär T; Banea M; Bikangi N; Cooke RD;Poulter NH; Rosling H. 1992. Cassavacyanogens and konzo, an upper motoneurondisease found in Africa. Lancet 339:208-211.

Umanah EE; Hartman RW. 1973. Chromosomenumbers and karyotypes of some Manihotspecies. Journal of the American Society forHorticultural Science 98:272-274.

Van den Elzen P; Townsend J; Lee KY; Bedbrook J.1985. A chimeric hygromycin resistance geneas a selectable marker in plant cells. PlantMolecular Biology 5:299-302.

Wang MB; Upadhaya NM; Brettell RIS; WaterhousePM. 1997. Intron-mediated improvement of aselectable marker gene for plant transformationusing Agrobacterium tumefaciens. Journal ofGenetics & Breeding 51:325-334.

405


West Jr. KP; Howard GR; Sommer A. 1989.Vitamin A and infection: Public healthimplications. Annual Review of Nutrition9:63-86.

Withers L; Williams JT. 1986. In vitro conservation.International Board for Plant GeneticResources (IBPGR) and FAO, Roma. 21 p.

Wohllenben W; Arnold W; Broer I; Hillemann D;Strauch E; Puehler A. 1988. Nucleotidesequence of the phosphinothricin N-acetyltransferase gene from Streptomycesviridochromogenes Tü494 and its expression inNicotiana tabacum. Gene 70:25-38.

Woodward BR; Puonti-Kaerlas J. 2000. Somaticembryogenesis from floral tissue of cassava(Manihot esculenta Crantz). En: CarvalhoLJCB; Thro AM; Vilarinhos AD (eds.).Proceedings of the IV International ScientificMeeting of the Cassava Biotechnology Network,1998. Brasilia, Brasil. p. 431-438.

Wu KK; Burnquist W; Sorrells ME; Tew TL; MoorePH; Tanksley SD. 1992. The detection andestimation of linkage in polyploids using single-dose restriction fragments. Theoretical andApplied Genetics 83:294-300.

Zhang H; Zhao X; Ding X; Paterson A; Wing R.1995. Preparation of megabase-size DNA fromplant nuclei. Plant Journal 7(1):175-184.

Zhang P; Legris G; Coulin P; Puonti-Kaerlas J.2000. Production of stably transformedcassava plants via particle bombardment.Plant Cell Reports 19:939-945.

Zhang P; Puonti-Kaerlas J. 2000. PIG-mediatedcassava transformation using positive andnegative selection. Plant Cell Reports19:1041-1048.

Biotecnología para la Yuca - COnnecting REpositories · la solución de éstos y otros problemas...

Documents

Transcript of Biotecnología para la Yuca - COnnecting REpositories · la solución de éstos y otros problemas...