Les 4èmes Journées Maghrébines d’HématologieLes 9èmes Journées Nationales d’Hématologie

26,27 et 28 Avril 2007

INTRODUCTION (1)

TG :

Anomalie Felle Déficit quantitatif ou qualitatif des GP

IIbIIIa (intégrines αIIbβ3) Autosomale récessive Cause de saignement clinique

INTRODUCTION (2)

Exploration biologique :

TS/TO Num. Plaq. MO Fonctions plaquettaires SDS PAGE (classification) BM Phénotype membranaire (CMF)

INTRODUCTION (3)

Etude par CMF:

Méthode simple et précise Les données recueillies:

Le % des cellules qui expriment l’Ag L’intensité moyenne de fluorescence

(IMF)

IMF est proportionnelle à la quantité de sites antigéniques à la surface des plaquettes

Représentation schématique d’une plaquette

7-glycogène8-système canaliculaire9-granule α10-GP IbIXV: vWF11-granule dense12-GP IcIIa

1-GP IV: thrombospondine et collagène2-GP IIbIIIa: fibrinogène et vWF3-microtubules4-lysosome5-GP IaIIa: collagène6-recepteur de thrombine

Complexe GPIIbIIIa: intégrine αIIbβ3

MATERIELS 

*Groupe témoin : 10 donneurs de sang

5 F / 5 H Sans ATCD de troubles de l’hémostase Age moyen : 36,4 ans (25-51 ans) Taux moyen de plaquettes : 294,2 103/µl * 13 patients:

5 F / 8 H Classés type I ou II par l’étude de la

rétraction du caillot et/ou le SDS PAGE

N/PSexe

Age actu

el

Age et symptômes au Dg

Type de Sd Hgique

Bilan hémostase

Fonctions plaquettaire

s

Classifi-

cation

T.N

H8

1 an, gingivorragies

gingivorragies,circoncision préparée

Plq: 270.103/µlTS: 2’30’’/ V= 45µlTP:86%, TCA:31/30

Ag. nulle à l’ADPRC: nul

IRC

J.N

F29

3ans, épistaxis, gingivorragies

hématurie, ménométrorragies, gingivorragies

Plq:246.103/µl TS: 4’30’’/ V: NPTP:80%, TCA: 32/32

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP et AdrénalineRC: bonne

IIRC

L.N

F27

2 ans, épistaxis, gingivorragies, hgie. digest.

épistaxis, gingivorragies, ménorragies

Plq:250.103/µl TS: 9’ / V: NPTP:100%,TCA: 30/30

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP et AdrénalineRC: bonne

ISDS

PAGE

K.I

F16

9 ans, épistaxis, gingivorragies

gingivorragies, ménorragies, Hématome de l’épaule

Plq:347.103/µl TS: 2’30’’/ V=38µlTP:96%,TCA: 27/30

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP

IIRC

Z.T

H21

14 ans, épistaxis, gingivorragies

épistaxis, gingivorragies, circoncision sans préparation

Plq:254.103/µl TS: 4’/ V: NPTP:74%,TCA: 30/30

CMFII

Z.K

H29

4 ans, circoncision hémorragique

épistaxis + , gingivorragies +

Plq:240.103/µl TS: NFTP:98%, TCA: 29/30

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADPRC: NF

II

Caractéristiques des patients

B.R

H23

2 ans, épistaxis, gingivorragies, circoncision hémorragique

épistaxis, hgie. digest.otorragie

Plq: 450.103/µlTS: 5’30’’/ V: NPTP:100%, TCA:30/35

Ag. Nle au Risto Ag. nulle à l’ADPRC: bonne

IIRC

N.H

F7

3ans, épistaxis

épistaxis, gingivorragies,

Plq:214.103/µl TS: 3’/ V: NPTP:100%,TCA: 23/26

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP

ICMF

I.RI

H18

3 ans, épistaxis, circoncision hémorragique

épistaxis, gingivorragies, hgie. digest.

Plq:220.103/µl TS: 5’30’’(Duke)TP:100%,TCA: 30/30

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP et AdrénalineRC: nulle

IRC

I.RA

F12

5 ans, épistaxis,

épistaxis, gingivorragies

Plq:297.103/µl TS: 2’/ V=13µlTP:65%,TCA: 30/32

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP RC: nulle

IRC

G.S

H16

13 ans, épistaxis, gingivorragies

épistaxis, gingivorragies

Plq:230.103/µl TS: 2’30’’/ V: 16µlTP:50%,TCA: 29/30

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP

IICMF

M.W

H24

8 mois épistaxis

épistaxis, gingivorragies, hgie. digest.

Plq:176.103/µl TS: 7’ (Duke) TP:80%,TCA: 30/30

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADP RC: bonne

IISDS

PAGE

M.A

H23

3 mois, épistaxis, gingivorragies, circoncision hémorragique

épistaxisPlq:150.103/µl TS: 10’/ V: NPTP:80%,TCA: 30/30

Ag. Nle au RistoAg. nulle à l’ADPRC: bonne

IIRC

METHODES (1)

Pour ces 2 groupes :

Prélèvements : 2 tubes sur citrate de sodium 1 tube sur EDTA

Agrégation plaquettaire : Chrono-Log 500VSMéthode optiqueSur PRP

ADP : 20µMCollagène : 5µg Acide arachidonique (AA) : 2mMRistocétine : 1,25 µg

METHODES (2)

CMF : Coulter EPICS XL

CD41a-PE clone HIP8: GPIIb (αIIb integrin) BD. Bioscience

CD61-PE clone SZ21: GPIIIa (β3 integrin) Immunotech

CD42b-FITC clone HIP1: GPIb BD. Bioscience

Mouse IgG1-FITC et IgG1PE BD. Bioscience

Pour chaque échantillon :IgG1-FITC/IgG1-PECD42b-FITC/CD41a-PECD42b-FITC/CD61-PE

METHODES (3)

Sang avec EDTA PRP + GR

Culot plaquettaire + PPP

2 lavages PBS + EDTA à 0,33%

Resuspension dans le PBS à une cc de 105/µl

50µl de plaquettes + 10 µl Ac

Incubation 30 mn à l’obscurité

200 µl de solution de lyse (10 mn)

lavage PBS Resuspension PBS Lecture

RESULTATS (1)

Agents inducteurs ADP

20µM Collagène

5µg AA

2mM

Ristocétine

1,25µg

Hauteurmaximale

 :ΔTL

Moyenne 91,38 92,38 94,13Agglutinati

on +

Écart-type 11,35 10,04 7,63 -

Agrégation plaquettaire

Groupe Témoin :

Agents inducteurs ADP

20µM Collagène

5µg AA

2mM

Ristocétine

1,25µg

Hauteurmaximale

 :ΔTL

Moyenne Abce 24,95 49,32Agglutinati

on +

Écart-type - 8,27 9,91 -

Patients :p<0,01

% des cellules Ag+ : patients classés Type I

Étude en CMF

N/PCD41a (%

d’expression)CD61 (%

d’expression)

T.NH

0 % (Absence) 98 %

L.NF

33 % 63 %

N.HF

98 % 0 % (Absence)

I.RIH

55 % 10 %

I.RAF

58 % 14 %

RESULTATS (2)

Ac anti-GP CD42b CD41a CD61

Intensité moyenne de fluorescence

IMF

Moyenne 31,20 9,78 242,86

Écart-type 3,24 1,09 77,18

Étude en CMF

Ac anti-GP CD42b CD41a CD61

Intensité moyenne de fluorescence

IMF

Moyenne 29,23 3,66 10,75

Écart-type 11,39 2,05 11,45

Groupe Témoin :

Patients :

RESULTATS (3)

p<0,01P=0,56 p<0,01

Patients :

Étude en CMF

Ac anti-GP CD42b CD41a CD61

Intensité moyenne de

fluorescence IMF

Type I 35,22 1,82 1,79

Type II 25,49 4,80 16,35

IMF (% par rapport à la

normale)

Type I 112.88 18,63 0,74

Type II 81.69 49,13 6,71

RESULTATS (4)

p<0,01P=0,14

Contrôle

IMF: 2,41 IMF: 38,3

TG type I

IMF: 1,28 IMF: 43

TG type I

TG type I

IMF: 4,49 IMF: 28,4

TG type II

IMF: 37,2 IMF: 31,7

TG type II

TG type II

Pour le type I

CD41a: 18,63% de la normale CD61: 0,74 % de la normale Surexpression de la GPIb:112,88%

Pour le type II

CD41a:49,13% de la normale CD61: 6,71 % de la normale expression de la GPIb:81,69%

COMMENTAIRES (1)

Peu d’études sont réalisées dans ce sens:

Etude indienne: Am.J.Hematol. 2003 :

10 Patients: CD41 et CD61

6 Type I: absence de GP IIb IIIa3 Type II: GP IIb IIIa de 7,72 à 20,40 % de la

normale1 Variant: GP IIb IIIa de 46 %, RC: 60 %

COMMENTAIRES (2)

La détermination de l’IMF quantifier le nombre de molécules à la surface des cellules

Il y’a des trousses permettant de quantifier les GP: nombre de sites antigéniques

utilisation d’une gamme de calibration (4 suspensions de billes de calibration correspondant chacune à un taux connu de sites antigéniques)

Conversion de l’IMF en nombre d’Ac fixés par

cellule

COMMENTAIRES (3)

Proposition d’une classification pour la TG:

Type I

IMF (CD41a): 0 à 20 % de la normaleet/ou

IMF (CD61): 0 à 2 % de la normale

Type II ou variants:

IMF (CD41a) > 20 % de la normaleet

IMF (CD61) > 2 % de la normale

CONCLUSION (1)

Notre étude doit être complétée

Confirmation de nos résultats sur un effectif beaucoup plus important

Etude par CMF de la capacité des plaquettes activées à lier le fibrinogène (Variants)

CONCLUSION (2)