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Untersuchungen zur physiologischen Funktion

der Progesteron-5β-Reduktase

in Arabidopsis thaliana und Vitis vinifera

der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat

vorgelegt von

Mona Ernst

aus Altdorf bei Nürnberg

Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der

Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg

Tag der mündlichen Prüfung: 05.02.2015

Vorsitzender des Promotionsorgans: Prof. Dr. Jörn Wilms

1. Gutachter: Prof. Dr. W. Kreis

2. Gutachterin: PD Dr. R. Stadler

Für meine Großeltern

in memoriam

„Imagine“

John Lennon, 1971

Danksagung

Meinem Doktorvater, Herrn Prof. Dr. Kreis, danke ich im besonderen Maße für die Bereitstel-

lung und Übertragung dieser interessanten und vielfältigen Thematik, die stete Diskussionsbe-

reitschaft und das mir entgegengebrachte Vertrauen.

Herrn Dr. Müller-Uri möchte ich für seine Hilfsbereitschaft und Diskussionsbereitschaft be-

danken. Ganz besonders Dank an die gute Zusammenarbeit, seine Unterstützung durch seinen

großen Erfahrungsschatz und für die Beteiligung an den COST Programmen.

Allen Mitarbeitern am Lehrstuhl der Pharmazeutischen Biologie danke ich für ihre Hilfsbereit-

schaft, Kollegialität, angenehme Arbeitsatmosphäre und Freundschaft. Es war eine wunderbare

Zeit! Frau Elisa Gärtner möchte ich noch besonders für die schöne und herzliche Kursbetreu-

ungszeit danken. Besonderer Dank gilt meinem Bachelorstudenten, Stefan Loos, der zum Ge-

lingen der Arbeit beigetragen hat.

Ein großer Dank gilt Dr. Franz Klebl, Dr. Ruth Stadler und der gesamten MPP für die Unter-

stützung und Ratschläge an der Real-Time-PCR und dem Fluoreszenzmikrokop. Ich danke

ihnen für die sehr gute, herzliche und offene Zusammenarbeit.

Meinem Supervisor, Dr. Stefan Martens, und Dr. Mickael Malnoy danke ich für die Gastfreund-

schaft und die Unterstützung während meiner Aufenthalte in ihren Laboren, sowie für ihr ste-

tiges Interesse an meiner Arbeit und ihrer Unterstützung. Dr. Manuela Campa und Dr. Antje

Feller danke ich ganz besonders für ihre offene, herzliche und liebenswürdige Art, die Auf-

nahme in ihr Team und ihre Unterstützung im Labor. Aus dieser Zusammenarbeit sind viele

Freundschaften entstanden.

Dr. Alexander Christmann, LS für Botanik an der TU München, danke ich für seine Ratschläge,

Anzuchtstipps und die Betreuung der augelagerten Samen von Arabidopsis thaliana.

Meinen Freunden danke ich für ihre Motivation, Geduld beim Zuhören und Unterstützung.

Ganz besonders bei Jennifer Munkert für die einzigartige und fantastische Laborzeit sowie ihre

wunderbare Freundschaft, die ich nicht mehr missen möchte.

Abschließend möchte ich mich besonders bei meinen Eltern, meiner Schwester, Martin und

seiner Familie bedanken. Sie waren mir stets eine Unterstützung, glaubten an meine Stärken

und Fähigkeiten und haben so einen ganz besonderen Anteil am Gelingen dieser Arbeit.

Inhaltsverzeichnis

I

Inhaltsverzeichnis

I. Einleitung .................................................................................................................... 8

1. Enon-Reduktasen (Steroid-/Progesteron-5β-Reduktasen) in Angiospermen............... 8

1.1. Progesteron-5β-Reduktase (P5βR) in cardenolidhaltigen Pflanzen ............................. 8

1.2. Progesteron-5β-Reduktasen in nicht cardenolidhaltigen Pflanzen ............................ 14

2. Zielsetzung dieser Arbeit ........................................................................................... 18

II. Material und Methoden ........................................................................................... 19

1. Material ...................................................................................................................... 19

1.1. Chemikalien ............................................................................................................... 19

1.2. Geräte ......................................................................................................................... 20

1.3. Verbrauchsmaterialien ............................................................................................... 22

1.4. Kits ............................................................................................................................. 22

1.5. Enzyme ....................................................................................................................... 23

1.6. Bakterienstämme ........................................................................................................ 24

1.7. Klonierungs- und Expressionsvektoren ..................................................................... 25

1.8. Wasser ........................................................................................................................ 25

1.9. Medien........................................................................................................................ 25

1.10. Puffer und Lösungen .................................................................................................. 28

1.11. Oligodesoxyribonukleotide-Primer ............................................................................ 33

1.12. Pflanzenmaterial ......................................................................................................... 35

2. Methoden ................................................................................................................... 37

2.1. Molekularbiologische Methoden ............................................................................... 37

2.2. Proteinchemische Methoden ...................................................................................... 45

2.3. Konstruktion von binären Expressionsplasmiden via Gateway System .................... 47

2.4. Kultivierung und Behandlung von Pflanzen .............................................................. 49

2.5. Aktivitätsbestimmung von Proteinen ......................................................................... 55

2.6. Chromatographische Analysemethoden..................................................................... 56

2.7. Computergestützte Analysen ..................................................................................... 58

III. Ergebnisse ................................................................................................................. 59

1. Generierung von binären Pflanzentransformationsvektoren via Gateway System .... 59

1.1. Erstellung der Überexpressionsvektoren.................................................................... 59

1.2. Erstellung der RNAi Vektoren ................................................................................... 62

2. Ergebnisse zu Arabidopsis thaliana ........................................................................... 66

2.1. Das VEP1 Gen............................................................................................................ 66

Inhaltsverzeichnis

II

2.2. Identifizierung homozygoter T-DNA Insertionsmutanten ......................................... 68

2.3. Überprüfung der homozygoten Transformationslinie AthVvP5βR ............................ 74

2.4. Morphologische Charakterisierung der Arabidopsis Pflanzenmutanten.................... 75

2.5. Proteinchemische Analyse und Einfluss von Methylvinylketon ............................... 80

2.6. Genexpression von unbehandelten und mit MVK behandelten Pflanzenlinien ......... 85

2.7. Generierung und Überprüfung transformierter Arabidopsis thaliana Pflanzen ........ 87

3. Ergebnisse zu Vitis vinifera ........................................................................................ 89

3.1. Vitis vinifera Progesteron-5β-Reduktase des Typ 1 ................................................... 89

3.2. Transformation und Regeneration von Kalluskulturen .............................................. 90

3.3. Analyse des Gefäßsystems von Weinlaubblättern ..................................................... 92

3.4. Genexpression des VvP5βR der RNAi-Linie GT13 ................................................... 93

3.5. Charakterisierung des rekombinanten VvP5βR aus Vitis vinifera.............................. 94

4. Ergebnisse zu Digitalis lanata ................................................................................. 102

IV. Diskussion ............................................................................................................... 109

1. Generierung von binären Pflanzentransformationsvektoren .................................... 109

2. Die physiologische Rolle von VEP1 (At4g24220) .................................................. 111

2.1. Einfluss des VEP1 Gens auf die Nervatur der Kotyledonen .................................... 111

2.2. Interaktion von VEP1 mit Methyvinylketon als Stressinduktor von HEL (PR4) .... 116

3. Diskussion der Ergebnisse zu P5βR aus Vitis vinifera............................................. 120

3.1. Physiologische Rolle des VvP5βR Gens .................................................................. 120

3.2. Charakterisierung des rekombinanten VvP5βR Proteins.......................................... 122

4. Diskussion der Ergebnisse zu Digitalis lanata ........................................................ 124

4.1. Regeneration von Digitalis lanata ........................................................................... 125

4.2. Transformation von Digitalis lanata ........................................................................ 127

V. Zusammenfassung .................................................................................................. 129

VI. Summary ................................................................................................................. 131

VII. Literaturverzeichnis ............................................................................................... 133

VIII. Anhang .................................................................................................................... 147

1. DNA-Sequenzen ...................................................................................................... 147

1.1. Sequenzen der Entry-Vektoren ................................................................................ 147

1.2. Sequenzen der Expressions-Klone ........................................................................... 152

1.3. cDNA Sequenz von At5g58750 ............................................................................... 159

1.4. Insertionssequenz der T-DNA Pflanzenlinie SALK_568840 .................................. 160

1.5. Sequenzen der klonierten DNA-Fragmente für qPCR ............................................. 160

Inhaltsverzeichnis

III

1.6. cDNA Sequenz von Vitis vinifera P5βR .................................................................. 161

2. GC-Chromatogramme .............................................................................................. 162

Abbildungsverzeichnis

IV


Abbildung 1: Digitalis lanata .................................................................................................... 8

Abbildung 2: Cardenolidbiosyntheserouten ............................................................................. 10

Abbildung 3: Kristallstruktur der P5βR ................................................................................... 11

Abbildung 4: Reaktionsmechanismus der P5βR ...................................................................... 12

Abbildung 5: Cladistische Analyse der P5βR-ähnlichen Progesteron-5β-Reduktasen mit den

stark konservierten Resten IV und V ................................................................ 13

Abbildung 6: Arabidopsis thaliana .......................................................................................... 15

Abbildung 7: Auszug aus getesteten Substraten ...................................................................... 16

Abbildung 8: Hfr-PCR Analyse der Hydroxysteroid-Dehydrogenasen und Progesteron-5β-

Reduktasen ........................................................................................................ 60

Abbildung 9: Colony PCR mit bar Primern der transformierten Bakterienkolonien der

Rekombinationsansätze .................................................................................... 61

Abbildung 10: Darstellung der Positionierung der Sequenz der VEP1 cDNA im

pEarlyGate100 Überexpressionsvektor ............................................................ 62

Abbildung 11: Hfr-Polymerase PCR Analyse der kleinen Genfragmente von Hydroxysteroid-

Deyhdrogenasen und Progesteron-5β-Reduktasen ........................................... 63

Abbildung 12: Darstellung der Positionierung und die Orientierung der Sequenz des

Genfragments EcP5βR im pHellsgate8 RNAi Expressionsvektor ................... 64

Abbildung 13: Expressionsanalyse des At4g24220 Gens ........................................................ 67

Abbildung 14: Genexpression von At5g58750 ........................................................................ 68

Abbildung 15: Schema der T-DNA Insertionsmutanten .......................................................... 69

Abbildung 16: T-DNA Insertionsanalyse der T4 Generation der Pflanzenlinie SALK_597798

.......................................................................................................................... 70


PFN5 HZ ........................................................................................................... 71

Abbildung 18: T-DNA Insertion SALK_597798 im VEP1 Gen ............................................. 72

Abbildung 19: PCR Agarosgel-Analyse der Transkription des VEP1 der homozygoten

T-DNA Insertionspflanzen ............................................................................... 73


T4/5 ................................................................................................................... 74

Abbildung 21: PCR Agarosegel-Analyse homozygoter Überexpressionspflanzen AthVvP5βR

.......................................................................................................................... 75

Abbildung 22: Verhältnis der Gefäßausbildung in den Kotyledonen ...................................... 76


V

Abbildung 23: Verhältnis der Gefäßausbildung in beiden Kotyledonen ................................. 77

Abbildung 24: Kotyledonen Nervatur ...................................................................................... 79

Abbildung 25: Expressions- und Sequenzanalyse des At3g04720 ........................................... 81

Abbildung 26: DC Analyse von AtP5βR Aktivität der Pflanzenrohextrakte ........................... 82

Abbildung 27: GC-MS Chromatogramm von Arabidopsis thaliana Col-0 Rohextraktassay . 83

Abbildung 28: P5βR-Aktivität in Pflanzenrohextrakten .......................................................... 84

Abbildung 29: Transkriptionsrate des VEP1 Gens .................................................................. 85

Abbildung 30: Transkriptionsrate des HEL (PR4) Gens .......................................................... 86

Abbildung 31: PCR Nachweis des bar Gens von transformierten Pflanzen ............................ 88

Abbildung 32: Darstellung Sequenzalignment mittels Clustal W ........................................... 89

Abbildung 33: Genexpression von Vitis vinifera P5βR ........................................................... 90

Abbildung 34: PCR Analyse der GT11 Überexpressionslinie ................................................. 91

Abbildung 35: PCR Analyse der GT13 RNAi Linie von regenerierten Pflanzen ................... 91

Abbildung 36: Vergleich der Nervatur von Weinblättern ........................................................ 92

Abbildung 37: Vergleich der Transkriptionsrate des VvP5βR Gens in Chardonnay ............... 93

Abbildung 38: Aminosäuresequenz der rVvP5βR im pDEST17 Vektor ................................. 94

Abbildung 39: Elutionsprofil der rVvP5βR nach IMAC .......................................................... 95

Abbildung 40: Überexpression und Reinigung mit rVvP5βR aus BL21 E. coli Zellen ........... 95

Abbildung 41: Aminosäuresequenz der rVvP5βR .................................................................... 96

Abbildung 42: Western Blot von rVvP5βR .............................................................................. 97

Abbildung 43: DC Analyse der rVvP5βR Aktvität .................................................................. 98

Abbildung 44: GC-MS Analyse der Reduktion von Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion

durch rVvP5βR .................................................................................................. 99

Abbildung 45: Zeitkinetik der rVvP5βR ................................................................................... 99

Abbildung 46: Temperatur- und pH- Optimum der rVvP5βR ................................................ 100

Abbildung 47: GC-MS Analyse der Reduktion von Citral zu Citronellal durch rVvP5βR.... 101

Abbildung 48: GC-MS Analyse der Reaktion von rVvP5βR mit β-Ionon ............................. 101

Abbildung 49: Reaktion der rVvP5βR mit Substraten ........................................................... 102

Abbildung 50: Regeneration von Digitalis lanata ................................................................. 104

Abbildung 51: Transiente Transformation von Digitalis lanata ............................................ 106

Abbildung 52: Stabile Transformation von Digitalis lanata ................................................. 108

Abbildung 53: Ausschnitt des codierenden Bereichs des VEP1 Gen .................................... 111

Abbildung 54: Expressionslevel des VEP1 in Arabidopsis thaliana ..................................... 114

Abbildung 55: Katabolismus der Abscisinsäure in Pflanzen ................................................. 116


VI

Abbildung 56: NADPH abhängige Reduktasen aus Arabidopsis thaliana ............................ 119

Abbildung 57: Synthese der wichtigsten chemischen, aromagebenden Verbindungen in Wein.

........................................................................................................................ 123

Abbildung 58: GC-MS Chromatogramm von Arabidopsis thaliana Überexpressionslinie

AthVvP5βR Rohextraktassay .......................................................................... 162

Abbildung 59: GC-MS Chromatogramm von Arabidopsis thaliana „knock down”

SALK_597798 Rohextraktassay .................................................................... 163

Abbildung 60: GC-MS Analyse der Reaktion von rVvP5βR mit Citral Negativkontrolle .... 163

Abbildung 61: GC-MS Analyse der Reaktion von rVvP5βR mit β-Ionon Negativkontrolle . 164

Tabellenverzeichnis

VII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Verwendete Oligodesoxyribonukletide (Primer) .................................................... 33

Tabelle 2: Arabidiopsis thaliana T-DNA Insertionslinien ....................................................... 36

Tabelle 3: Verwendete Internetprogramme .............................................................................. 58

Tabelle 4: Verwendete Template-Vektoren mit inserierten cDNAs verschiedener Gene ....... 59

Tabelle 5: Überblick der generierten Entry-Vektoren und Entry-Klone .................................. 60

Tabelle 6: Insertgrößen sowie Bezeichnung der Entry-Klone ................................................. 63

Tabelle 7: Zusammenfassung der rekombinierten Vektoren ................................................... 65

Tabelle 8: Überblick über ausgebrachte Samen der Pflanzeninsertionsline SALK_597798 ... 70

Tabelle 9: Verhältnis der Gefäßausbildung in beiden Kotyledonen ........................................ 78

Tabelle 10: Blattanzahl, Blattrosettendurchmesser und Blattfläche 45 Tage alter Pflanzen ... 80

Tabelle 11: Wurzellänge der Arabidopsis thaliana Pflanzen ................................................... 80

Tabelle 12: Generierte A. thaliana Pflanzenlinien ................................................................... 87

Tabelle 13: Anzahl der Verzweigungspunkte (NBPs) in Vitis vinifera Blättern ..................... 92

Tabelle 14: Phase III: Sprossinduktion und Sprossproliferation von Digitalis lanata Kallus 103

Tabelle 15: Wurzdelausbildung der Digitalis lanata Sprosse in Phase IV ............................ 104

Tabelle 16: Literaturzusammenfassung für Propagierung, Regenerierung und Transformation

von Digitalis Arten ......................................................................................... 126

Einleitung

8

I. Einleitung

1. Enon-Reduktasen (Steroid-/Progesteron-5β-Reduktasen) in Angiospermen

1.1. Progesteron-5β-Reduktase (P5βR) in cardenolidhaltigen Pflanzen

Cardenolide werden in vielen Angiospermen als Naturstoffprodukte gebildet (Luckner und

Wichtel, 2000; Habermehl et al., 2002; Hänsel und Sticher, 2010) und dienen diesen zur Inter-

aktion mit ihrer Umwelt, wie als Schutz vor Herbivoren durch Einlagerung in Pflanzenorganen.

Dabei kann die Bildung von Cardenoliden durch Phytohormone oder abiotischen und bioti-

schen Stress induziert werden (Stuhlfauth et al., 1987; Berglund und Ohlsson, 1992; Palazon et

al., 1995; Gavidia et al., 1996; Roca-Perez et al., 2004, Perez-Bermúdez et al., 2009).

Das C23-Steroidgrundgerüst, dessen Ringe A/B/C/D meist cis-trans-cis verknüpft sind, weist

zusätzliche Strukturmerkmale wie einen β-ständigen, einfach gesättigten 5-gliedrigen Lacton-

ring an Position C17, sowie zwei β-ständige Hydroxylgruppen an C3 und C14 als funktionelle

Gruppen auf. Die therapeutische Verwendung der, bei Überdosierung toxisch wirkenden, Pflan-

zenstoffe zur Behandlung von chronischer Herzinsuffizienz wird durch die am Grundgerüst

verknüpften seltenen Zucker, wie 6-Desoxy sowie 2,6-Didesoxyhexose möglich (Abbildung

1). Aglyka besitzen ebenso eine Herzwirksamkeit, werden aber im Organismus zügiger meta-

bolisiert (Hänsel und Sticher, 2010). Neben der nahezu obsoleten Behandlung von Herzinsuf-

fizienz finden immer mehr neue therapeutische Ansätze Betrachtung, wie die Wirkung von

Cardenoliden auf Tumorzellen und auf das Virus Herpes simplex (Langenhan et al., 2005; Pras-

sas und Diamandis, 2008; Newman et al., 2008; Bertol et al., 2011).

Abbildung 1: Digitalis lanata Konformationsformel von Digitoxin (Algycon Digitoxigenin verknüpft mit Digitoxose), so-wie Bild eines Blütenstandes der Digitalis lanata in Großaufnahme ©Dr. Bauer

Einleitung

9

Mit Hilfe von Fütterungsexperimenten durch radioaktive Vorstufen in Digitalis Arten konnten

einige Biosyntheseschritte der Cardenolidbildung aufgeklärt werden und sind bis dato Stand

intensiver Forschung (Kreis et al., 1998; Kreis und Müller-Uri, 2010). Im Fokus steht der An-

fang der Biosynthese mit Hauptaugenmerk auf die stereospezifische Reaktion zu 5β-konfigu-

rierten Pregnanen, welche zu therapeutisch aktiven Cardenoliden führt. Über die Abspaltung

der Seitenkette am C17 von Phytosterol-Vorstufen, wie Cholesterol, Stigmasterol oder Sitos-

terol, durch das Side-Chain-Cleaving-Enyzm (SCCE) entsteht Pregnenlon, welches den Beginn

des umfassenden Biosynthesewegs kennzeichnet (Pilgrim, 1972; Lindemann und Luckner,

1997; Milek et al., 1997). Progesteron entsteht anschließend über einen Zwischenschritt. Zu-

nächst wird Isoprogesteron über die NAD-abhängige Oxidation der Hydroxylgruppe an C3

durch die 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3βHSD) gebildet. Die Isomerisierung zu Pro-

gesteron erfolgt nach aktuellem Stand über das Enzym ∆5-∆4-Ketosteroid-Isomerase (KSI)

(Herl et al., 2007; Meitinger et al., 2014). Die nachfolgende Umwandlung von Progesteron zu

5β-Pregnan-3,20-dion ist essentiell für die β-Cardenolidbildung. In einer stereospezifischen,

NADPH-abhängigen Reaktion, wird ein Wasserstoffatom an die Doppelbindung in Position C5

durch das Enzym Progesteron-5β-Reduktase (P5βR1/2) gefügt. Daraus resultiert die cis-Ver-

knüpfung der Ringe A und B (Gärtner et al., 1990 und 1994).

Über mehrere Zwischenschritte entsteht 5β-Pregnan-3β,14 β,21-triol-20-on, welches dann zum

Aglykon Digitoxigenin umgesetzt wird. An die 21-OH-Gruppe wird mittels A:21-Hydroxyp-

regnan-21-Hydroxy-Malonyltransferase (MHPMT) Malonysäurerest angeknüpft und es ent-

steht ein Malonsäure-Hemiester (Luber, 2002; Kuate et al., 2008a, b). Der Ringschluss zum

Butenolidring verläuft vermutlich spontan unter Abspaltung von CO2 und Wasser (Stuhlemmer

und Kreis, 1996b). Anschließend oder während der dargestellten Biosynthese werden unter-

schiedlichste Zuckerketten an das Aglykon glykosidisch gebunden. Die große Vielfalt der

Cardenolide in Digitalis ergibt sich außerdem durch zusätzlich β-konfigurierte Hydroxylgrup-

pen an C12 (Bsp.: Digoxigenin) und C16 (Bsp.: Gitoxigenin). Neben dem postulierten Biosyn-

theseweg, welcher über Pregnanderivate verläuft, können Cardenolide auch über so genannten

den Norcholansäureweg entstehen (Maier et al., 1986; Schebitz et al, 2010; Kreis und Müller-

Uri, 2010).

Einleitung

10

Abbildung 2: Cardenolidbiosyntheserouten Klassischer Weg (oben), alternativer Weg über Norcholansäurederivate (unten). Als Start-punkt beider Biosyntheserouten wird Cholesterol angenommen. An der Biosynthese betei-ligten Enzyme: [1] Side chain cleaving enzyme (SCCE), [2] 3β-Hydroxysteroid-Dehydro-genase (3βHSD), [3] Ketosteroiddehydrogenase (KSI), [4] Progesteron-5β-Reduktase

(P5βR1/2), [5] 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase (3βHSD), [6] 14β-Hydroxylase, [7] 21-Hydroxylase, [8] Malonyl-CoenzymA:21-Hydroxypregnan 21-O-Malonyltransferase (21MAT) (Schebitz, 2010)

Einleitung

11

Nach Gärtner (1990) konnte die Enzymaktivität der Progesteron-5β-Reduktase (P5βR) in der

löslichen Fraktion des Homogenats aus zerkleinerten Digitalis Blättern nachgewiesen werden.

Im Gegensatz zur mikrosomal am endoplasmatischen Retikulum gebundenen Progeste-

ron-5α-Reduktase (P5αR) ist die P5βR im Cytosol lokalisiert. Als Cosubstrat dient NADPH,

welches nicht durch NADH ersetzt werden kann (Gärtner et al., 1990). Das Protein aus Spross-

kulturen von D. purpurea weist unter reduzierenden Bedingungen eine molekulare Masse von

43 kDa auf. Das native Protein besitzt eine Masse von 280 kDa und ist ein Polymer aus einigen

Untereinheiten (Gärtner et al., 1994). Gene die für diese Reduktase kodieren, wurden aus ver-

schieden Digitalis Arten kloniert und funktionell in E. coli exprimiert (Herl et al., 2006a, b,

2009; Gavidia et al., 2007). Durch die Aufklärung der Kristallstruktur konnte die P5βR der short

chain dehydrogenase/reduktase SDR-Protein Familie zugeordnet werden (Abbildung 3, A und

B) und eine neue Klasse bzw. Unterklasse definieren (Persson et al., 2003; Egerer-Sieber et al.,

2006; Gavidia et al., 2007; Thorn et al., 2008).

Abbildung 3: Kristallstruktur der P5βR A Kristallstruktur der P5βR als Komplex mit NADP - dargestellt ist die vereinfachte atomare Struktur des P5βR Monomers. β-Faltblätter erscheinen rot, α-Helices sind in blau und Loops in türkis dargestellt. Aminosäuresequenzmotive für die Funktionalität sind mit römischen Ziffern beschrieben (gelb). B P5βR Dimer – die Achse welche die Verbindung zwischen den Monomeren anzeigt ist als Doppelpfeil dargestellt. In orange dargestellt ist ein Wasser-Clus-ter, welches in der Dimergrenzfläche konserviert ist. C Alignmentausschnitt der Sequenzmo-tive I-VI. Motive I- III sind in allen NADPH abhängigen SDRs konserviert. Motive IV-V treten für diese neue Klasse der SDRs spezifisch auf und sind auch in orthologen Proteinen zu finden (Thorn et al., 2008)

Einleitung

12

Charakteristische Merkmale sind sechs konservierte Motive, die Rossmannfaltung als Struktu-

relement sowie die katalytische Triade, die aus den Aminosäuren Serin, Tyrosin und Lysin be-

stehen (Kavanagh et al., 2008). In der P5βR sind die Motive I-VI konserviert. Die Motive I-III

sind für die Bindung des Cosubstrates NADPH zuständig und sind in allen NADPH abhängigen

SDRs konserviert. Im Unterschied zur klassischen katalytischen Triade ist die katalytische Tri-

ade der neuen Klasse der SDRs, die in den neu definierten Motiven IV-VI zu finden ist (Abbil-

dung 3, C), durch das Fehlen der Aminosäure Serin modifiziert (Thorn et al., 2008).

Über die Kristallstrukturdaten ergibt sich der mögliche Katalysemechanismus der P5βR Reak-

tion. Die Carbonylgruppe an C3 des Progesterons stellt zusammen mit der ∆4, 5-Doppelbindung

ein konjugiertes System dar (Abbildung 4). Der Mechanismus ähnelt dem der Enoyl-Redukta-

sen nach Rafferty et al. (1995) und entspricht einer 1-4 Addition. Die spontane Protonierung

des Sauerstoffatoms O3 führt zu einem Enol-Intermediat, wodurch mittels einer spontanen

Enol-Keton-Tautomerie das Produkt 5β-Pregnan-3,20-dion gebildet wird (Thorn et al., 2008).

Abbildung 4: Reaktionsmechanismus der P5βR A Katalytischer Mechanismus der P5βR aus Thorn et al. (2008); B verallgemeinerte, sche-matische Reaktion der Progesteron-5β-Reduktasen nach Burda et al. (2009)

Die Enzymaktivität konnte nach Stuhlemmer et al. (1993) sowie Kreis et al. (1998) in Digitalis

Pflanzen, in deren Sprosskulturen und Organkulturen aber zunächst nicht in Suspensionskultu-

ren, welche keine herzwirksamen Steroide produzieren, nachgewiesen werden. Stuhlem-

mer (1993), Gärtner und Seitz (1993) sprachen der P5βR eine Schlüsselrolle in der Cardenolid-

Biosynthese zu, da das Enzym den ersten stereospezifischen Schritt in der Biosynthese hin zu

den 5β-Cardenoliden katalysiert. Demgegenüber steht die Aussage von Lindemann und Luck-

ner (1997), dass die P5βR zwar ein wichtiges Enzym für die Biosynthese darstelle, aber keine

Schlüsselrolle übernehme. Es wurde aufgezeigt, dass das Enzym auch in cardenolidfreiem Ge-

webe von proembryogenen Massen sowie Suspensionskulturen aktiv ist (Lindemann und Luck-

ner, 1997; Ernst et al., 2010). Die Stellung der P5βR als angenommenes Schlüsselenzym in der

A B

Einleitung

13

Cardenolidbiosynthese, scheint sich nach neuestem Forschungstand zu revidieren. Es wurden

orthologe P5βR Gene nicht nur aus cardenolidhaltigen Pflanzen, wie Digitalis oder Erysimum,

sondern auch aus cardenolidfreien Pflanzenarten isoliert, funktionell exprimiert und charakte-

risiert (Herl et al., 2006a, b, 2009; Bauer et al., 2010; Munkert et al., 2011). Daher ist eine

Beteiligung der orthologen Genen für die P5βR an weiteren Stoffwechselwegen oder pflanzli-

chen Reaktionen vor allem in cardenolidfreien Spezies möglich (Jun et al., 2002). Zudem treten

auch Isoformen der P5βR auf. Neben einer P5βR2 aus D. purpurea nach Stressinduktion, wel-

cher ebenfalls an der Cardenolidbiosynthese beteiligt sein könnte (Pérez-Bermúdez et al.,

2009), wurden inzwischen mehrere Paraloge der P5βR1/2 von Medicago truncatula und Catha-

rantus roseus isoliert und charakterisiert (Munkert et al., 2014). Die cladistische Analyse (Ab-

bildung 5) zeigt auf, dass die Isoformen der P5βR auch in zwei Cluster eingeordnet werden

können (Bauer et al., 2010, Munkert et al., 2014).

Abbildung 5: Cladistische Analyse der P5βR-ähnlichen Progesteron-5β-Reduktasen mit den stark konservierten Resten IV und V Cluster I – Vertreter der P5βR2-Typ II mit der P5βR2 aus D. pupurea (GU062787). Cluster II – Vertreter der P5βR1-Typ I wie den P5βR1 aus D. lanata (AAS76634), A. thaliana (At2g24220). ▲/∆ P5βR isoliert und kloniert ▲ zusätzliche funktionelle Expression (Bauer et al., 2010)

Einleitung

14

Neben Progesteron wurden auch Testosteron, 4-Androsten-3,17-dion, Cortisol und Cortison als

Substrate der P5βR aus D. lanata akzeptiert (Kreis et al., 1998; Herl et al., 2006a, b). Weitere

Moleküle mit aktivierter Doppelbindung, wie 2-Cyclohexenon oder Ethylacrylat, wurden als

Substrat getestet. Sowohl P5βR aus cardenolidhaltigen sowie von cardenolidfreien Pflanzen

reduzierten diese Verbindungen (Burda et al., 2009; Schebitz et al., 2010; Bauer et al., 2010;

Munkert et al., 2011; Durchschein et al., 2012). Dadurch kann man der charakterisierten re-

kombinanten P5βRs eine hohe Substratpromiskuität zuschreiben, welche die Annahme einer

umfänglichen physiologischen Rolle in der Pflanze als potentielle „Pontoon-Elemente“ in ver-

schiedenen Biosynthesen zu spielen bekräftigt (Bauer et al., 2010). Alle isolierten P5βR-Gene

werden der VEP1 (Vein Patterning 1) Genfamilie zugeordnet, deren Ursprung offenbar in ei-

nem α-Proteobakterium liegt und sich durch horizontalen Gentransfer verbreitet hat. Dieses

Ereignis fand in der Evolution mehrfach statt. Während bei Pilzen die Tendenz sichtbar ist, das

aufgenommene Gen wieder zu verlieren, scheint es bei den Pflanzen eine wichtige Aufgabe

übernommen zu haben, weshalb es erhalten bleibt (Tarrío et al., 2011).

1.2. Progesteron-5β-Reduktasen in nicht cardenolidhaltigen Pflanzen

1.2.1. Arabidopsis thaliana Steroid-5β-Reduktase

Arabidopsis thaliana, zu Deutsch Acker-Schmalwand oder auch Schotenkresse genannt ist ein

Vertreter der Brassicaceae (Ordnung: Brassicales). Auf Grund dessen relativ kleinen sequen-

zierten Genoms von 135 Mbp auf fünf Chromosomenpaaren, des kurzen Generationszykluses

von ca. acht Wochen und der erfolgreichen genetischen Manipulation, ist A. thaliana als Mo-

dellorganismus für die Physiologie höherer Pflanzen etabliert (Meinke et al., 1998; Abbildung

6, A bis E). Auf dem Locus At4g24220 befindet sich das VEP1 Gen, welches für eine Steroid-

5β-Reduktase (AtSt5βR/AtP5βR) codiert. Das Protein zeigt 70 % Sequenzidentität zu der P5βR

aus D. lanata an und ist gleichsam fähig Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion stereospezifisch

zu reduzieren (Herl et al., 2009). Die Effizienz der rekombinanten AtP5βR ist für diese Reaktion

50 fach höher im Vergleich zum rekombinanten Protein P5βR von D. lanata.

Einleitung

15

Abbildung 6: Arabidopsis thaliana A A. thaliana Col-0 Adult Pflanze im Blütenstadium (© Ernst); B A. thaliana Col-0 im Ro-settenblattstadium in der Aufsicht (© Ernst); C schematische Darstellung der 5 Chromosomen von NCBI Map Viewer (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mapview/map_search); D de-taillierter Überblick über die Genomregion des Chromosoms 4 von 12564955 bp bis 12566765 bp mit codierendem Bereich des VEP1 Gens (http://atensembl.arabidopsis.info/in-dex.html), E 3D-Struktur der AtSt5βR/AtP5βR, basierend auf der Kristallstruktur der P5βR von D. lanata als Template aus Herl et al. (2009)

Um die stark divergierenden Enzymaktiviäten zwischen hohen Aktivitäten der VEP1-like En-

zyme aus Pflanzen ohne Cardenolide zu jenen aus Pflanzen mit Cardenoliden aufzuklären, wur-

den als „hot spot“ bezeichnete Aminosäuren, welche mittels Sequenzalignment analysiert wur-

den, mittels „site directed mutagenisis“ in der rekombinanten P5βR von D. lanata ausgetauscht

(Bauer et al., 2012). Im Fokus standen die Aminosäuren Tyrosin (Y156) im Motiv IV, Aspara-

gin (N205) am Ende des Motivs VI und Serin (S248) in der Nähe des letzten Motivs von

rDlP5βR. In der rAtP5βR wurden hier die Aminosäuren Valin (V156) und Methionin (M205,

M248) gefunden. Eine deutliche Erhöhung der Enzymaktivität konnte in der Einfachmutante

N205M sowie in der Doppelmutante Y156V_N205M von rekombinanter D. lanata P5βR er-

zielt werden. Durch den Austausch konnte die Hydrophobizität der Bindetasche erhöht werden

und könnte, laut Hypothese, somit die Bindung von Progesteron durch hydrophobe Interaktio-

nen begünstigen (Bauer et al., 2012). Der Effekt konnte anhand des Substrates 2-Cyclohexenon,

Einleitung

16

welches um ein vielfaches besser umgesetzt wird, analog beobachtet wer-

den (Bauer et al., 2012). Da keine Cardenolide in A. thaliana beschrieben sind, aber das

rAtP5βR eine hohe Aktivität zu Progesteron im Vergleich zur P5βR cardenloidhaltigen Pflan-

zen aufweist, könnte diese in der Bildung von 5β-konfigurierte Phytoecdysteroide, welche die

Pflanze zum Fraßschutz einlagert, involviert sein (Herl et al., 2009; Dinan et al., 2001). Auf-

grund der hohen Substratpromiskuität könnte das Enzym auch an anderen Biosynthesewegen

beteiligt sein. Das Substratspektrum in vitro reicht von monocyclischen und acyclischen Subs-

traten mit aktivierter Doppelbindung (Abbildung 7), großen Molekülen wie Progesteron und

Cortisol, Nitrocyclohexene bis acyclische Monoterpen-Aldehyde, wie Citral (Herl et al., 2009;

Burda et al. 2009; Durchschein et al., 2012).

O

O

O O

NO2

O

OOHO

O

1 2 3 4

5

6

Abbildung 7: Auszug aus getesteten Substraten 1 Progesteron, 2 Cyclohexen-1-on, 3 Enal-Citral, 4 Nitrocyclohexen, 5 Hydroxyethylacrylat, 6 Ketoisophoron

In planta ist das VEP1 Gen, welches als „Vein Patterning“ bezeichnet wird, in der Ausbildung

der Nervatur in Blättern sowie Wurzel- und Stängeldicke involviert. Eine Antisense-Suppres-

sions-Mutante vep1-1D zeigte eine deutliche Reduzierung der Nervaturkomplexität in Kotyle-

donen und Rosettenblättern, verdeutlicht in der Anzahl an Verzweigungspunkten sowie der un-

vollendeten Ausbildung der Blattnerven (Jun et al., 2002). Eine weitere Bezeichnung des Gens

ist AWI 31, welches spezifisch nach Verwundung („wound inducing“) der Pflanze induziert und

exprimiert wird (Yang et al., 1997). Zudem wird die Gefäßausbildung durch Schädigung von

benachbarten Parenchymzellen eingeleitet (Steeves und Sussex, 1989). Durchaus ist daher eine

Beteiligung des Enzyms in Zusammenhang mit Stressinduktoren, welche α,β-ungesättigte Car-

bonylgruppen entalten und gleichsam als potentielle Substrate fungieren können, und in Ab-

wehrmechanismen der Pflanze möglich (Reymond et al., 2000; Alméras et al., 2003).

Einleitung

17

1.2.2. Progesteron-5β-Reduktasen in weiteren nicht cardenolidhaltigen Pflanzen

Neben der in A. thaliana identifizierten Progesteron-5β-Reduktase, konnten weitere Ste-

roid-5β-Reduktasen, welche ähnlich hohe Enzymaktivität gegenüber Progesteron aufweisen,

aus Plantago major und Mentha piperita rekombinant exprimiert werden (Bauer et al., 2012).

In der Dissertation von Munkert (2014) wurden aus Medicago truncatula, die als neue Modell-

pflanze für das Studium der Fabaceae auf genomischer Ebene gilt (Barker et al., 1990; Cook

et al., 1999), weitere acht Gene codierend für P5βR sequenziert und exprimiert. Außerdem wur-

den sechs P5βR-Gene aus Catharanthus roseus beschrieben und charakterisiert. Catharanthus

roseus gehört zur Familie der Apocyaceae und enthält von Iridoiden abstammende Monoterpen-

Indolalkaloide darunter das Alkaloid Vinblastine, welches als Zytostatika in der Chemotherapie

Anwendung findet. Ein als Iridoid-Synthase (JX974564.1) identifiziertes Enzym zeigte hohe

Übereinstimmung zur Progesterone-5β-Reduktase (P5βR2 aus Digitalis purpurea) auf, welche

in vitro sowie in vivo an der Umsetzung von 10-Oxogeranial zu cis/trans-Iridodial unter

NAD(P)H Verbrauch beteiligt ist (Geu-Flores et al., 2012). Zudem wurden Citral als auch

6,7-Dihydro-10-Oxogeranial als Substrate eingesetzt und eine 1,4-Reduktion anlog der Reak-

tion von Progesterone-5β-Reduktasen beobachtet (Geu-Flores et al., 2012). Die Mehrzahl der

Progesteron-5β-Reduktasen wurde aus Pflanzen der Ordnungen Gentianales, Brassicales oder

Lamiales beschrieben. Über Genomprojekte, wie von Vitis vinifera (Ordnung Vitales) könnten

durch Sequenzvergleiche putative Steroid-5β-Reduktase Gene identifiziert werden. Neben den

Sekundärmetaboliten wie Stilbene, Ellagitannine, Flavonole oder Anthocyanidine sind aroma-

gebende Metabolite wie Linalool, Gernaniol oder Demascenone und Ionone im Metabolom von

Vitis zu finden, die Sturkturmerkmale von Produkten bzw. Substraten der Progesterone-5β-Re-

duktasen aufweisen (Styger et al., 2011; Forester und Waterhouse, 2009; Boto-Ordóñez et al.,

2013).

Einleitung

18

2. Zielsetzung dieser Arbeit

Um die biologische Rolle der P5βR in Pflanzen weiter aufzuklären, wären Überexpressions-

sowie „knock-out“ Studien von P5βR in cardenolidhaltigen sowie cardenolidfreien Pflanzen

wichtig. Um transgene Pflanzen zu generieren, sollte im Zuge dieser Arbeit zunächst ein Trans-

formationssystem an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana etabliert werden. Basierend auf

Regenerationsstudien und getesteten Transformationssystemen, sollte das Transformationsver-

mögen in Grundzügen ferner auf Digitalis lanata angewendet werden.

Die physiologische Rolle von VEP1 in A. thaliana basierend auf den Studien von Jun et al.

(2002) und Yang et al. (1997) sollte in dieser Arbeit mittels Pflanzeninsertionslinien im VEP1

Gen, welche als „knock-out“ bezeichnet werden, und einer generierten Überexpressionsmu-

tante, weiter untersucht und ausgebaut werden.

Um der Frage nachzugehen inwieweit Stoffwechselwege von Pflanzen im Vergleich von Über-

expression und Herabregulierung der P5βR beeinflusst werden, sollten transformierte Pflan-

zenlinien mit Vitis vinifera während einer Kooperation mit Dr. Stefan Martens vom Agarinstitut

Fondazione-Edmund Mach (FEM-IASMA, Italien), generiert und untersucht werden.

Material und Methoden

19

II. Material und Methoden

1. Material

1.1. Chemikalien

Produkt Firma

Agar Merck KGaA, Darmstadt

Ampicillin Sigma, Taufkirchen

Anisaldehyd Fluca AG, Buchs

Ascorbinsäure Natriumsalz Carl Roth GmbH, Karlsruhe

BASTA Bayer CropScience, Langenfeld

Bromphenolblau Sigma, Taufkirchen

DNA Ladder 1 kb NEB Biolabs GmbH, Ipswich

DNA Ladder 100 bp NEB Biolabs GmbH, Ipswich

dNTPs Fermentas, St. Leon-Rot

Glucose-6-Phosphat Roche, Mannheim

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase Sigma, Taufkirchen

Glycerol Caesar & Loretz GmbH, Hilden

Hefeextrakt AppliChem GmbH, Darmstadt

Kanamycinsulfat Applichem GmbH, Darmstadt

Methylvinylketone Merk, Darmstadt

NADP-Natriumsalz Applichem GmbH, Darmstadt

Natrium-EDTA Applichem GmbH, Darmstadt

Oligonukleotide Eurogenetec, Seraing, Belgien

Pepton Fluka, Sigma-Aldrich St. Louis

Pregnanderivate Steraloids Inc., Newport R.I., USA

Progesteron Sigma Aldrich Chemie GmbH, Steinheim

PVPP cross-linked ISP Technologies, Wayne, NJ, USA

Rifampicin AppliChem GmbH, Darmstadt

Silwet General Electric Speciality Sarl, Schweiz

Spectinomycin Dihydrochlorid Pentahydrat AppliChem GmbH, Darmstadt

Tris AppliChem GmbH, Darmstadt

Tris/HCL Sigma, Taufkirchen

Trypton AppliChem GmbH, Darmstadt

β-Mercaptoethanol VWR, Darmstadt


20

Alle weiteren Chemikalien werden von den Firmen VWR (Darmstadt), Sigma (Taufkirchen)

und Carl Roth GmbH (Karlsruhe) in p.A. Qualität bezogen.

1.2. Geräte

Gerät Herkunft

Analysenwaage 440-33N Kern&Sohn GmbH, Balingen-Frommern

Analysenwaage Delta Range, AE166 Mettler Waagen, Bad Homburg

Autoklav 5075 ELVC Systec GmbH, Wettenberg

Autoklav Horizontal Systec DE-45 Systec GmbH, Wettenberg

Axioskop HBO 50 Zeiss, München

Brutschrank B 5050E Heraeus Instruments, Hanau

C-Digit Scanner LI-COR, USA

DC- Kammer Desaga, Heidelberg

DC- Workstation CAB UVIS; VD mit Kamera

IVC TK 1360 B

Desaga GmbH, Heidelberg

DC-Tauchkammer Desaga, Heidelberg

Digtial pH-Meter 646 Bachofer Laboratroiumsgeräte, Reutlingen

DNA-Elektrophorese Gelapparatur Biotec-Fischer GmbH, Reiskirchen

DNA-Elektrophorese Gelkammer Phero-sub 1 Biometra, Göttingen

DNA-Elektrophorese Spannungsgerät Müzeripari Müvek, Esztergom, Ungarn

Eismaschine 50-35 Ziegra-Eismaschinen, Isernhagen

Gaschromatograph GC2010 mit Massenspekt-

rometer QP-2010S

Shimadzu Deutschland GmbH, Duisburg

Gefriertruhe Hera freeze Heraeus, Hanau

Gelelektrophrose Protein System MiniPRO-

TEAN3

BioRAD, München

Gel-Print 10000i Bio Photonics® Corporation

Heizblock Stuart Scientific Bibby Sterlin LTD, Stone, Staffordshire,

U.K.

Heizplatte Bachofer Laboratoriumsgeräte, Reutlingen

Incubator G24 enviromental incubator shaker New Brunswick, NJ, USA

Kühlzentrifuge Rotorblock Sorvall SS 34 Kendro, München

Kühlzentrifuge Sorvall® RC-5B Plus Kendro, München

Magnetrührer REC/REC-G Janke & Kunkel GmbH & Co.KG, Staufen

Mikrowelle Sharp, Hamburg


21

Milli-Q Gradient A10 Millipore Corporate Headquaters, Biller-

ica MA, USA

Photometer GeneQuant pro Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg

Pipetten 10, 100, 1000 µL VWR, Darmstadt

Raiser RSI MWG Biotech, Ebersberg

RotorGene 2000 Corbett Research, Sydney, Australia

Schüttler Gyrotory® Water Bath Shaker New Brunswick, NJ, USA

Schüttler RC TK Infors AG, Bottmingen, Schweiz

Spannungsquelle PowerPACTM HC BioRAD, München

Spektrophotometer NanoDrop ND-2000 Peqlab, Erlangen

Sterilbank Meissner & Wurst, Stuttgart

Termal Cycler FlexCycler 2 twin 48 G Biometra, Analytik Jena, Göttingen

Thermocycler T3 Biometra, Göttingen

Thermomixer comfort/compact Eppendorf, Hamburg

Tischzentrifuge 400 R Hereaus GmbH, München

Tischzentrifuge mini Spin Eppendorf, Hamburg

Transillumintor, Benchtop 2UV (Geldoku-

mentation)

BioDoc-it Imaging System, UVP, Upland,

Kanada

Ultraschallbad-Homogenisator Sonoplus HD

2070

Bandelin, Berlin

Ultraschallbad Sonorex Bandelin, Berlin

UV-Detektions-Workstation

Vortex Genie 2 G560E Scientific Industries, New York, USA


22

1.3. Verbrauchsmaterialien

Produkt Firma

Amicon Ultra-15 10000 MWCO (Ultracell™) Millipor, Carrigtwohill, Irland

DC-Aluminium Platten, Kieselgel 60 F254 Merck, Darmstadt

Einmal Mikropipetten mit Ringmarke (1-5 µL) Hirschmann Laborgeräte GmbH & Go.KG,

Eberstadt

Micracloth™ Filtervlies Calbiochem, La Jolla, USA

PD-10 Columns (Sephadex™ G-25M) Amersham Biosciences Europe GmbH,

Freiburg

Petrischalen, steril, Ø 8,5 cm Greiner GmbH, Frickenhausen

Parafilm “M”® Laboratory Film American National Can™, Greenwich, CT.

Alle übrigen Verbrauchsmaterialien (Spitzen, Reaktionsgefäße, Zentrifugenröhrchen, UV-

Küvetten, etc.) werden von der Firma Sarstedt AG & Co. (Nümbrecht) bezogen. Zusätzlich zu

den hier aufgeführten Geräten, Materialien und Kits wird die Standardausrüstung eines mole-

kularbiologischen Labors genutzt.

1.4. Kits

Produkt Firma

cDNA-Synthese Kit H Plus peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen

Double Pure Kit Bio&Sell e.K., Feucht bei Nürnberg

E.Z.N.A.® RNA-ISOLATIONSKITS Omega bio-tek, VWR, Norcross, USA

Illustra™ RNAspin Mini RNA Isolation Kit GE Healthcare UKltd, little Chalfont,

Buchinhamshire, UK

InnuPrep RNA Mini Kit Analytik Jena AG, Jena

peqGold Plasmid Miniprep Kit peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen

QIAquick® PCR- Purification Kit Qiagen GmbH, Hilden

SuperScript™ III First Strand Synthesis System

for RT-PCR

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

TOPO TA Cloning® Invitrogen GmbH, Karlsruhe


23

1.5. Enzyme

1.5.1. Polymerasen

Produkt Hersteller

SAWADY Taq-DNA-Polymerase Kit PeqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen

Phusion Polymerase Kit Finnzymes, Schwerte

Q5 High Fidelity Polyermase New England BioLabs INC., Frankfurt am Main

QuantiTect® SYBR Green PCR Kit Qiagen GmbH, Hilden

1.5.2. Restriktasen

Produkt Erkennungssequenz 5'-3' Hersteller

EcoRV-HFTM GAT▼ATC New England BioLabs INC., Frank-furt am Main

EcoRI G▼AATTC Thermo Scientific, Schwerte

BamH1 G▼GATCC New England BioLabs INC., Frank-furt am Main

NcoI C▼CATGG Promega, Mannheim

DpnI methylierte DNA Thermo Scientific, Schwerte

SspI AAT▼ATT New England BioLabs INC., Frank-furt am Main

XbaI T▼CTAGA Promega, Mannheim

XhoI C▼TCGAG Promega, Mannheim

1.5.3. Gateway-Enyzme

Produkt Hersteller

BP-Clonase® Enzym Mix Invitrogen GmbH, Karlsruhe

LR-Clonase® Enzym Mix Invitrogen GmbH, Karlsruhe


24

1.6. Bakterienstämme

1.6.1. Escherichia coli Stämme

Stamm Genotyp Herkunft

DH5α F- Φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17(rk-, mk

+) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 λ-

Lehrstuhl der Phar-mazeutischen Bio-logie, FAU

Top10 F- mcrA ∆( mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆ lacX74 recA1 araD139 ∆( araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

Invitrogen GmbH, Karlsruhe

JM109 endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk–, mk+),

relA1, supE44, ∆( lac-proAB), [F´ traD36, proAB, laqIqZ∆M15] endA1, recA1, gyrA96, thi, hsdR17 (rk–, mk

+), relA1, supE44, ∆( lac-proAB), [F´ traD36, proAB, laqIqZ∆M15]

Promega, Mann-heim

DB3.1 F- gyrA462 endA1 glnV44 ∆(sr1-recA) mcrB mrr hsdS20(rB-, mB

-) ara14 galK2 lacY1 proA2 rpsL20(Smr) xyl5 ∆leu mtl1

Lehrstuhl der Phar-mazeutischen Bio-logie, FAU

M15 [pREP4] NaIs, Strs , Rifs , Thi- ,Lac-, Ara+, Gal+, Mtl-, F-, RecA-, Uvr+, Lon+ (KanR)

Qiagen GmbH, Hil-den

BL21 (DE3) F– ompT hsdSB(rB–, mB–) gal dcm (DE3) Lehrstuhl der Phar-mazeutischen Bio-logie, FAU

BL21(DE3)pLysS F– ompT hsdSB(rB–, mB–) gal dcm (DE3) pLysS (CamR)

Lehrstuhl für Bio-chemie, FAU

1.6.2. Agrobakterium tumefaciens Stämme

Stamm Genotyp Herkunft

AGL1 C58 pTiBo542 recA::bla Mop(+) rif carb FEM-IASMA, Italien

GV3101 C58 pTiC58 NOP pMP90 rif gen FEM-IASMA, Italien

C58 C58 pTiC58 NOP pMP90 Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie, FAU

C58C1 C58 pTiC58 NOP pMP90 pGV2260 rif carb FEM-IASMA, Italien

EHA105 C58 pTiBo542; T-region::aph, Km(S); A281 pEHA101

FEM-IASMA, Italien


25

1.7. Klonierungs- und Expressionsvektoren

Handelsname Verwendung Herkunft

pCR®2.1-TOPO Subklonierung Invitrogen GmbH, Karlsruhe

pGEM-T Subklonierung Promega, Mannheim

pENTR® D-TOPO Gateway Subklonierung Invitrogen GmbH, Karlsruhe

pDONR®221 Gateway Subklonierung Invitrogen GmbH, Karlsruhe

pDEST®17 Gateway Expression Invitrogen GmbH, Karlsruhe

pQE30 Expression Qiagen GmbH, Hilden

pEarlyGate100 Gateway Destination Expression ABRC, Ohio State Univerity, USA

pK7WG2 Gateway Destination Expression VIB, Gent; FEM-IASMA, Italien

pK7WGIGW2 I Gateway Destination RNAi VIB, Gent; FEM-IASMA, Italien

pHellsgate 8 Gateway Destination RNAi Lehrstuhl für Pflanzenphysiolo-gie, Bayreuth

1.8. Wasser

Bidestilliertes Wasser wird durch die Milli-Q-Anlage der Firma Millipore (Carigtwohill, Irland)

gewonnen. Für proteinchemische Arbeiten wird dieses direkt verwendet, für molekular-biolo-

gische Arbeiten zusätzlich autoklaviert.

1.9. Medien

1.9.1. Medien für Bakterien

Alle benötigten Medien werden nach Herstellung auf pH 7,0 eingestellt, autoklaviert und vor

der Verwendung gegebenenfalls mit der entsprechenden Menge an Antibiotikum versetzt. Für

Festmedien werden 1,5 % (m/V) an Agar dem Medium vor der Sterilisierung hinzugefügt.

Medien für Escherichia coli

* sterile Lösungen werden nach der Autoklavierung dem Medium hinzugefügt

LB- Medium SOC- Medium SOB- Medium

Trypton 10 g/L Trypton 20 g/L Trypton 20 g/L

Hefeextrakt 5 g/L Hefeextrakt 5 g/L Hefeextrakt 5 g/L

NaCl 10 g/L NaCl 10 mM NaCl 10 mM

KCl 2,5 mM KCl 2,5 mM

MgSO4* 10 mM MgSO4

* 10 mM

Glucose* 20 mM MgCl2* 10 mM


26

Medien für Agrobacterium tumefaciens

YNB- Medium

Peptone 10 g/L

Hefeextrakt 10 g/L

NaCl 5 g/L

1.9.2. Medien für Pflanzen

Alle benötigten Medien werden nach Herstellung auf pH 5,7 eingestellt und autoklaviert Für

Festmedien werden 1,0 % (m/V) an Agar dem Medium vor der Sterilisierung hinzugefügt.

Anzuchtsfestmedium für sterile Pflanzensamen

LS-Medium

(Linsmaier und Skoog, 1965)

LS Pulver 4,4 g/L

30 g/L

Für A. thaliana Samen wird das Festmedium nach dem Autoklavieren in Petrischalen gegossen.

Gegebenenfalls wird dem Medium ein Pflanzenselektionsmarker hinzugefügt. Für D. lanata

Samen wird das Medium vor der Sterilisierung zu 25 mL in Glasgefäße mit vorgelegtem Agar-

Anteil aliquotiert.

1.9.3. Regenerations- und Selektionsmedien

Medien für Digitalis lanata Regeneration und Transformation

Flüssig Medium (FM)

Kokultivierungsmedium

(CCM)*

Selektionsmedium (SM I und SM IIa)*

LS Pulver 4,4 g/L LS Pulver 4,4 g/L LS Pulver 4,4 g/L

Sacchrose 30 g/L Saccharose 30 g/L Saccharose 30 g/L

IAA 100 µg/L IAA 100 µg/L

TDZ 500 µg/L TDZ 500 µg/L

ASb 100 µM Timentinb 500 µg/L


27

I4 Medium* Wurzelmedium (RM)*

LS Pulver 4,4 g/L LS Pulver 4,4 g/L

Saccharose 30 g/L Saccharose 30 g/L

IAA 100 µg/L IAA 500 µg/L

TDZ 500 µg/L

a Selektionsmedium II (SM II) = SM I + Pflanzenselektionsmarker, b werden nach dem Autoklavieren hinzugefügt,

* Festmedien

Medien für Vitis vinifera Transformation und Regeneration

Alle Chemikalien, Lösungen, Stammlösungen und Medien wurden während eines Forschungs-

stipendiums am FEM-IASMA Institut, Italien, zur Verfügung gestellt bzw. hergestellt.

GS1CA Flüssig Medium (Franks et al. 1998)

Stammlösung Enkonzentration (EK)

Nitsch und Nitsch (NN) Macrosalze (10 x) 1 x

MS Microsalze (1000 x) 1 x

B5 Vitamine (1000 x) 1 x

FeSO4/ Na2EDTA (200 x) 1 x

Saccharose 6 %

pH Wert 6,2

Acetosyringone* 100 µM

* wird nach dem Autoklavieren hinzugefügt


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GS1CA Medium (Franks et al. 1998)

für Kalluserzeugung und Erhaltung

GE Medium

für Spross Bildung und Differenzierung

Stammlösung EK Stammlösung EK

NN Macrosalze (10 x) 1 x SM Macros (10 x) 1 x

MS Microsalze (1000 x) 1 x MS Microsalze (1000 x) 1 x

B5 Vitamine (1000 x) 1 x B5 Vitamine (1000 x) 1 x

FeSO4/ Na2EDTA (200 x) 1 x FeSO4/ Na2EDTA (200 x) 1 x

Saccharose 6 % Saccharose 1,5 %

NOA (1mM) 10 µM BAP (1 mM) 10 µM

BAP (1 mM) 1 µM Agar 1 %

IAA (1 mM)* 20 µM pH Wert 5,7

Agar 1 % Timentin* 1 mg/mL

Aktivkohle 0,25 % * wird nach dem Autoklavieren hinzugefügt

pH Wert 6,2

Als Selektionsmedium I wird dem GS1CA Medium Timentin (1 g/L) hinzugefügt. In der zwei-

ten Selektionsphase werden zusätzlich Pflanzenselektionsmarker dem Medium beigemischt.

Für Wurzelinduktion und Wurzelwachstum wird das WP (Woody Plant) Medium nach Llyod

und McCown (1981) verwendet.

1.10. Puffer und Lösungen

1.10.1. Lösungen für molekularbiologische Arbeiten

Antibiotikalösungen

Die Stammlösungen der Antbiotika werden steril filtriert und bis zu ihrer Verwendung bei 4 °C

oder Aliquots zu 1 mL bei -20 °C aufbewahrt.

Antibiotikum Stammlösung

Ampicilin 100 mg/mL

Kanamycin 50 mg/mL

Spectinomycin 50 mg/mL

Rifampicin 25 mg/mL

Timentin (Ticarcillin) 100 mg/mL


29

Acetosyringon (AS) Stammlösung

Acetosyringone wird zu einer Stammlösung von 500 mM abgewogen, in DMSO gelöst und bei

-20 °C eingefroren.

Isopropyl-β-thiogalactopyranosid (IPTG) Stammlösung

Für die Induktion der Expression von rekombinanten Proteinen wird 1 M IPTG Stammlösung

mit bd H2O hergestellt. Bis zur Verwendung wird die Lösung in 1 mL Aliquots bei -20 °C

gelagert.

Substratstammlösungen

Die Substrate werden in 96 % Ethanol gelöst und bei 4 °C luftdicht gelagert.

Substrat Molekulargewicht Stammlösung Konzentration in mg/mL

Progesteron 314,47 g/mol 30 mM 9,43

Citral 152,24 g/mol 50 mM 7,61

β- Ionon 192,30 g/mol 50 mM 9,62

Phytohormone

Die Phytohormone Indol-3-yl-essigsäure (IAA) und Thidiazuron (TDZ) werden zu einer

Stammkonzentration von 1 mg/mL abgewogen. TDZ wird in DMSO gelöst. IAA wird mit

Tropfen von 96 % Ethanol angelöst und mit H2O aufgefüllt. Die Stammlösungen werden

bei -20 °C aufbewahrt.

Lösungen für Dünnschichtchromatographie

Als Fließmittel wird Dichlormethan und Ethylacetat im Verhältnis 9:1 gemischt. Für die De-

tektion wird das Anisaldehyd-Tauchreagenz (Anisaldehyd 2,5 mL, konz. Essigsäure 50 mL,

Mehtanol 425 mL, Schwefelsäure 25 mL) verwendet.

1.10.2. Puffer für molekularbiologische Arbeiten

Agarosegelelektrophorese

50 x TAE Puffer 1 x TAE Puffer 10 x DNA Loadingpuffer

Tris/HCl 2 M 50 x TAE 20 mL Glyderol 50 %

Natriumacetat 1 M bd H2O 980 mL Bromphenolblau 0,1 %

EDTA 50 mM

pH Wert 7,5


30

Zusammensetzung für ein Agarosegel:

1 % Agarose-Gel

(Fragmentlängen von 0,5 bis 10 kb)

2 % Agarose- Gel

(Fragmentlängen von 0,05 bis 2 kb)

Agarose 0,5 g 1 g

50 x TAE 1 mL 1 mL

bd H2O 48,5 mL 48 mL

Puffer für genomische DNA Extraktion aus Blättern

Extraktionspuffer I Extraktionspuffer II

Tris/HCl pH = 7-8 200 mM Tris/HCl 100 mM

NaCl 250 mM NaCl 700 mM

EDTA 25 mM EDTA 50 mM

SDS 0,5 % pH Wert 8,0

Weitere molekularbiologische Puffer

TE-Puffer TB-Puffer

Tris 10 mM Tris/HCl 2 M

EDTA 1 mM Natriumacetat 1 M

pH Wert 7,5 bis 8 EDTA 50 mM

1.10.3. Lösungen und Puffer für proteinchemische Arbeiten

Proteinextraktionspuffer aus Blattmaterial

Extraktionspuffer (Finsterbusch et al., 1999)

Tris 25 mM

EDTA 2 mM

DTT 4 mM

pH Wert 7,5 bis 7,8

β- Mercaptoethanol

Zugabe erfolgt bei Verwendung des Puffers

1 mM


31

Puffer für native His-Tag-Reinigung

Lysepuffer Waschpuffer Elutionspuffer

NaH2PO4 50 mM NaH2PO4 50 mM NaH2PO4 50 mM

NaCl 300 mM NaCl 300 mM NaCl 300 mM

Imidazol 10 mM Imidazol 20 mM Imidazol 250 mM

pH Wert 8,0 pH Wert 8,0 pH Wert 8,0

(„The QIAexpressionist“- Version 2003, 5. Auflage)

Puffer für SDS-PAGE

3 x Lämmli Probenpuffer 1 x MOPS-Tris Laufpuffer

Tris/HCl pH 6,8 300 mM ( Proteine > 20 kDa)

SDS 6 % MOPS 50 mM

Glycerin 30 % Tris 50 mM

β- Mercaptoethanol 10 % EDTA 1 mM

Bromphenolblau 0,2 g SDS 0,1 %

Zusammensetzung von Trenngel und Sammelgel für ein Tris/Bis-Gel:

Trenngel Sammelgel

Bis/Tris (1,25 M; pH 6,5) 1 mL Bis/Tris (1,25 M; pH 6,5) 0,71 mL

Acrylamid (30 %) 1,5 mL Acrylamid (30 %) 0,35 mL

H2O 1,145 mL H2O 1,45 mL

Temed 7 µL Temed 8 µL

APS (10 %) 25 µL APS (10 %) 20 µL

sensitive Coomassie-Färbelösung (nach Kang et al., 2002)

Coomassie Brilliant Blue G-250 0,02 %

Aluminiumsulfat-(14,18)-Hydrat 5 %

Ethanol (96 %) 10 %

ortho-Phosphorsäure 2 %


32

Für die Herstellung der Lösung wird zuerst das Aluminiumsulfat in Wasser gelöst und anschlie-

ßend mit Ethanol homogenisiert. Dann werden der Farbstoff sowie die Phosphorsäure beigege-

ben und mit Wasser aufgefüllt. Für ein Gel werden 50 mL Färbelösung benötigt.

1.10.4. Puffer und Lösungen für Western Blot

Westerntransferpuffer 10 x TBS Puffer

Glycin 192 mM Tris 200 mM

Tris 25 mM NaCl 5 mM

EDTA 1 mM pH Wert 7,5

Methanol 20 %

Antikörperlösungen

Als erste Antikörper werden die Anti-His Antikörper von QIAGEN verwendet. Diese werden

als dreifach Mix von RGS-, Penta- und Tetra- His- Antikörper in einer 1:2000 Verdünnung mit

1 x TBS + 0,1 % Tween20 mit 5 % Milchpulver genutzt. Ein Antimouse-IgG wird als zweiter

Antikörper in einer Verdünnung von 1:10000 in 1 x TBS + 0,1 % Tween20 mit 5 % Milchpulver

verwendet.

1.10.5. Puffer und Lösungen für Proteinassays

P5βR-Assaypuffer (nach Gärtner et al., 1990) Regenerierendes System

HEPES KOH, pH 8,0 100 mM NADP 6,4 mM

Saccharose 250 mM Glucose-6-Phosphat 31,1 mM

EDTA 2 mM Glucose-6-Phosphat-

Dehydrogenase

42 nkat

β-Mercaptoethanol 1 mM

Zugabe erfolgt bei Verwendung des Puffers ad 45 µL P5βR-Assaypuffer


33

1.11. Oligodesoxyribonukleotide-Primer

Alle Primer werden von der Firma Eurogenetec (Seraing, Belgien) in einer Konzentration von

100 µM bezogen und bei 4 °C aufbewahrt. Genspezifische Primer werden anhand der in der

Datenbank hinterlegten mRNA/cds Sequenzen von Digitalis lanata P5βR (AY585867), Ery-

simum crepidifolium P5βR (GU354236) und Arabidopsis thaliana VEP1 (EF579963) generiert.

Tabelle 1: Verwendete Oligodesoxyribonukletide (Primer)

Anwen-dung

Genprodukt Bezeichnung 5´-3´ Sequenz TM [°C]

Klonier-

ung/RT-

PCR

VEP1

(1167 bp)

VEPdir CACCATGAGTTGGTGGTGGCTG 55

VEPrev TCAAGGTACGATCTTGAACGCCTT 50

EcP5βR

(1170 bp)

EryPORdirgate CACCCATGAGTTGGTGGGGG 62

EcPORrgrev TCAAGGCACGATCTT 44

DlP5βR

(1170 bp)

DlP5βR_Fgate GGGGACAAGTTTTACAAAAAAGCAGGCTTCA

TGAGCTGGTGGTGGGCTGG

68

DlP5βR_Rgate GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT

CAAGGAACAATCTTGTAAGCTT

65

AthHSD/ EcHSD

ErHSDgate CACCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGG 58

(774 bp) AtHSDrevPB CTACGGCTTCACCACCGAG 55

DlHSD

(780 bp)

DlHSDgate CACCATGTCGTCAAAGCCAAGGT 57

HSDrev CTAACGCACGACGGTGAA 50

VEP1/ EcP5βR

(460 bp)

iAEP1721 GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT

TGTACTTGTCAATCCAAGAGA

55

iAEP11119R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT

ATCCACCAGAAGCTGTTTTGAT

55

DlP5βR

(292 bp)

iDlP11 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC

ATGAGCTGGTGGTGGGCTG

55

iDlLP1230R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT

TAATTGATCGGATTATCCTCA

55

AthHSD/ EcHSD

iAEHSD11 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC

ATGTCTGGAAAAAGATTGG

55


34

(522 bp) iAEHSD1523R GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC

AGAAGGCTGGGAAGGGTTCA

DlHSD

(286 bp)

iDlHSD1146 GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTC

TCGTCGCTTCCGTAAACTCT

55

iDlHSD1431R GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCT

CAAATGATGGACCCCTTGAC

55

HEL (PR4)

(639 bp)

AthHELfor ATGAAGATCAGACTTAGCATAACC 47

AthHELrev TCAAACGCGATCAATGGCCGAAAC 52

VvP5βR

(1172 bp)

VvP5bRfwd ATGAGTTGGTGGTGGGCTGGAG 53

VvP5bRrev TCAGGGAGGAATGAGTTTGTGAC 50

RT-PCR/

qPCR

Actin

(312 bp)

AtAct2g1243rev GGAGATCCACATCTGCTGGAATGT 52

AtAct2g846fw ATTCAGGATGCCCAGAAGTCTTGTT 49

VEP1

(426 bp)

JM721DIR AGAAGGCTTGGGAAGGGTTCA 54

JM1119REV

TGTACTTGTCAATCCAAGAGA 48

VvP5βR

(213 bp) qVvP1630dir

CCCATATAGCATGATGAACATA 44

qVvP1843rev CAAATCTCCATTTGTGATGTTA 42

HEL (PR4)

(137 bp)

AthHELfor ATGAAGATCAGACTTAGCATAACC 47

HEL137R CAGTAGTCCGCGGTGGTAC 62

GAPDH qGADPHdir TTCTCGTTGAGGGCTATTCCA 53

qGAPDHrev CCACAGACTTCATCGGTGACA 54

VvActin qVvACTdir CTTGCATCCCTCAGCACCTT 54

qVvACTrev TCCTGTGGACAATGGATGGA 52

RT-PCR/

Vektor

M13for CAGGAAACAGCTATGAC 50

M13rev GTAAAAGGAGGGCCAG 50

35 S CGCACAATCCCACTATCCTT 60

35SR ACACGTGAGCGAAACCCTAT 58

BARfwd TGCACCATCGTCAACCACTACATCGAG 56


35

Resistenzgen bar

(426 bp)

BARrev CAGGCTGAAGTCCAGCTGCCAGAAAC 57

p1425::35S::GFP

(306 bp)

GFPdir GGTGAGCAAGGGCGATA 54

GFPrev GACTGTGGCGGGGTATCACTC 53

pHellsgate

(1469 bp)

pH81dir CCTTCGCAAGACCCTTCCTC 55

pH81rev ATTTCCTTACCAAGCTGGGG 51

pHellsgate

(1419 bp)

pH82dir AACAAAGCGCAAGATCTATC 50

pH82rev AGTTGACAGCGACAGCTATC 52

RT-PCR/

Pflanzen

Pflanzenins-

ertionslinie

097798

LBb1.3 ATTTTGCCGATTTCGGAAC 54

LP097798 TTATCGCCGTAACCACTTTTG 45

RP097798 AAACAACAACGGAGACCCTTC 47

Pflanzenin-

sertionslinie

568840

1103 (At4g24220f) TTGGGATTGAGGAGTATGGATTTGAGG 58

1102 (At4g24220r) AACACAGAATCTGGTATTTCCATTAGCC 57

220 (JMLBa1) TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 57

1.12. Pflanzenmaterial

Im Rahmen dieser Arbeit werden für genomische DNA- und RNA-Extraktion, Proteinrohex-

trakte, Regeneration und Transformation Pflanzen von Digitalis lanata und Arabidopsis thali-

ana, Ökotyp Columbia (Col-0) Wildtyp (WT) verwendet sowie verschiedene T-DNA-Inserti-

onslinien von A. thaliana, Ökotyp Columbia. Kultiviert werden diese im institutseigenen Ge-

wächshaus. Zusätzlich werden für einige Versuche Kalluskulturen von D. lanata der Linie

K3OHD sowie eigens generierte D. lanata Kalli verwendet. Samen der A. thaliana Insertions-

linien stellen die segregierende T3-Generation nach der Transformation dar und wurden über

das Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC) bezogen (Alonso et al. 2003). Die Pflan-

zenlinien sind nachstehend aufgeführt (Tabelle 2). Diese wurden mit Hilfe des SIGnAL „T-

DNA Express“ Arabidopsis Gene Mapping Tools (http://signal.salk.edu/cgibin/tdnaexpress)

ausgewählt und untersucht. Samen beider Linien wurden an den Arbeitskreis von Dr. Christ-

mann, Lehrstuhl für Botanik, Technische-Universtiät München, zur Kultivierung ausgelagert.


36

Tabelle 2: Arabidiopsis thaliana T-DNA Insertionslinien

T-DNA Insertionsline (NASC ID)

Interner Name Gen Region der Insertion Pflanzenresistenz

SALK_097798

(N597798)

597798 At4g24220 Beginn des zweiten

Exons

Kanamycin

SALK_068840

(N568840)

568840 At4g24220 Ende des zweiten

Exons

Kanamycin

Während mehrerer Forschungsaufenthalte am FEM-IASMA Institut, Italien, in der Arbeits-

gruppe von Dr. Stefan Martens und Dr. Michael Malnoy, konnte eine A. thaliana Überexpres-

sionslinie (AthVvP5βR, Kanamycin Resistenz), transformiert mit dem homologen P5βR Gen

aus Vitis vinifera (pK7WG2:35S::VvP5βR), generiert werden. Zudem wurden embryogene Kal-

luskulturen der Linie IT-24/01/12 Chardonnay 27 zur Herstellung von VvP5βR RNAi-Linie

mittels Agrobakterientransformation, verwendet.


37

2. Methoden

2.1. Molekularbiologische Methoden

2.1.1. Genomische DNA Isolierung

Schnellpräparation genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana

Das Protokoll basiert auf der Methode beschrieben bei Edwards et al. (1991). Alle Schritte

werden bei Raumtemperatur durchgeführt. Mit einem 1,5 mL Reaktionsgefäß wird eine Blatt-

scheibe ausgestanzt, mit einem Pistill für 15 s zerkleinert, mit 400 µL Extraktionspuffer I

(s. 1.10.2) versetzt und für 5 bis 10 s homogenisiert. Anschließend wird 1 min zentrifugiert

(14 000 rpm). 300 µL des Überstandes werden mit 300 µL Isopropanol versetzt und präzipitiert

(5 min, 14000 rpm). Das entstandene Präzipitat wird einige Minuten luftgetrocknet und in 50 µL

TE-Puffer gelöst.

Präparation von genomischer DNA aus Digitalis lanata

Von transient transformierten Blättern werden 60 mg bis 100 mg Material in flüssigem Stick-

stoff in einem 2 mL Reaktionsgefäß mittels Pistill zerkleinert. Die Proben werden mit 1330 µL

Extraktionspuffer II (65 °C; 1.10.2) versetzt, gevortext und 15 min bei 65 °C inkubiert. Dabei

empfiehlt sich ein mehrmaliges Invertieren der Ansätze. Nach einer Abkühlungsphase von ei-

ner Minute bei Raumtemperatur wird je 650 µL Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) hinzugefügt

und 5 min bei 400 rpm geschüttelt. Eine Phasentrennung wird bei maximaler Umdrehungszahl

für 2 min durch Zentrifugation erhalten. Die Oberphase wird in ein neues Reaktionsgefäß über-

führt. Die DNA wird durch Zugabe von 700 µL Isopropanol und einer Inkubationszeit von

2 min bei Raumtemperatur gefällt. Nach dem Pelletieren der DNA bei maximaler Umdrehungs-

zahl für 5-10 min wird mit 70 % Ethanol für 5 min gewaschen. Das getrocknete Pellet wird mit

50 µL bd H2O (65 °C) gelöst. Die Konzentration wird mittels NanoDrop (s. 2.1.4) photometrisch

bestimmt.

2.1.2. RNA-Isolierung

Gesamt-RNA aus Pflanzenblättern wird nach Anleitung des jeweiligen Hersteller Kits (s. 1.4)

gewonnen. Abweichend von den Vorschriften wird mit 30 µL RNAse freiem Wasser eluiert

und die Konzentration am NanoDrop ND-2000 vermessen. Die gewonnene Gesamt-RNA wird

bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

2.1.3. cDNA-Synthese

mRNA wird mit Hilfe einer Reversen Transkriptase und eines Oligo(dT)20 Primer in cDNA

umgeschrieben. Die Synthese wird nach Anleitung von Super Skript III First Strand Synthesis


38

System for RT-PCR, Invitrogen, oder cDNA-Synthese Kit H Plus, Peqlab, durchgeführt (s. 1.4).

Es wird für die Reaktion die maximale RNA Konzentration eingesetzt. Der Ansatz wird jeweils

auf Eis pipettiert und analog der Herstellerprotokolle bearbeitet.

2.1.4. Konzentrations- und Reinheitsbestimmung von Nukleinsäuren

Mittels NanoDrop-Analyse kann die DNA-, RNA- oder cDNA-Konzentration von 1µL Probe

mit sehr großer Genauigkeit und Reproduzierbarkeit bestimmt werden. Zur Anwendung kommt

das NanoDrop ND-2000 Spektrometer der Firma Peqlab, Erlangen. Konzentration bzw. Rein-

heit ergibt sich jeweils aus dem Absorptionsmaximum bei 260 nm bzw. dem Quotient der Ab-

sorptionen bei 260 und 280 nm. Besonders reine Fraktionen von DNA bzw. RNA liegen um

einen A 260/280 Wert von 1,8 bis 2,0.

2.1.5. Polymerase-Kettenreaktion (PCR)/RT-PCR

Die Polymerase-Kettenreaktion wird für die in vitro Amplifizierung von Genfragmenten ver-

wendet. Für die PCR-Reaktionen werden verschiedene Primerkombinationen und Templates

eingesetzt (s. 1.11). Für eine sequenzexakte Vervielfältigung von DNA-Fragmenten sowie die

Generierung von „blunt ends“ für das Gateway-Klonierungssystem wird eine Phusion bzw.

Pfu- Polymerase (Finnzymes, Biolabs) verwendet. Für die Standard PCR und Colony PCR wird

das SAWADY Taq-Polymerase Kit (Peqlab) benutzt (s. 1.5.1). Zudem werden Template unab-

hängige TA-Überhänge generiert. Grundsätzlich werden 50 µL Ansätze auf Eis pipettiert und

anschließend im Thermocycler inkubiert.

PCR Ansatz Phusion-Polymerase PCR Ansatz Taq-Polymerase

Template 0,1 µg Template 0,1 µg

Sense-/Antisense-Primer je 10 µM Sense-/Antisense-Primer je 10 µM

dNTP Mischung 500 µM je Nukleotid

dNTP Mischung 500 µM je Nukleotid

Reaktionspuffer mit MgSO4 (10x)

1 x Reaktionspuffer S (10 x) 1 x

Polymerase 2,5 U MgCl2 0,5 mM

H2O bd. ad 50 µL Polymerase 2,5 U

H2O bd. ad 50 µL


39

PCR- Programme

Folgende PCR- Programme werden je nach Anwendungsbereich verwendet:

PCR Programm für die Amplifzierung von spezifischen PCR-Produkten zur Gateway Klonie-

rung

PCR-Programm PCR-Schritt Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen

Hfr-PCR Initiale Denaturierung 98 °C 30 s x 1

Denaturierung 98 °C 10 s

Annealing X °C* 30 s

Elongation 72 °C 45 s x 30

Finale Elongation 72 °C 5 min x 1

Lagerung 4 °C ∞

* Annealing Temperatur ist abhängig von der Tm der jeweiligen Primer

PCR Programm für Standard Amplifizierung von spezifischen PCR- Produkten


Standard- PCR I Initiale Denaturierung 95 °C 3 min x 1

Denaturierung 95 °C 1 min

Annealing X °C* 1 min

Elongation 72 °C 2 min x 30


Lagerung 4 °C ∞

* Annealing Temperatur ist abhängig von der TM der jeweiligen Primer

2.1.6. Die Colony-PCR

Die Colony PCR ist eine Alternative zur konventionellen Plasmidpräparation und Restriktions-

ansatz zur schnellen Überprüfung von transformierten Kolonien. Als Template wird das voll-

ständige Bakterium eingesetzt. Einer Bakterien-Suspension werden 2 µL entnommen, mit

18 µL bd H2O vermischt und für 10 min im Thermocycler bei 95 °C denaturiert. Anschließend

wird der PCR-Ansatz mit den restlichen Komponenten einer Standard PCR versetzt und im

Thermocycler inkubiert. Die Colony-PCR erfolgt entweder mit Vektor spezifischen oder Insert

spezifischen Primern und wird zu einem Volumen von 25 µL angesetzt.


40

Programm für die Durchführung einer Colony PCR


Colony-PCR Vorrausgehende Dena-tur-ierung der E. coli Zell-wände in H2O ohne rest-liche PCR – Kom-ponenten

95 °C 10 min

Initiale Denaturierung 95 °C 1 min x 1

Denaturierung 95 °C 1 min

Annealing 55 °C 1 min

Elongation 72 °C 2 min x 30


Lagerung 4 °C ∞

2.1.7. Quantitative Real-Time Polymerasekettenreaktion (qPCR)

Die quantitative Polymerasekettenreaktion beruht auf dem Prinzip der herkömmlichen PCR mit

zusätzlicher Quantifizierung der amplifizierten DNA mittels Fluoreszenzmessung. Die Real-

Time-PCR wird mit QuantiTect™ SYBR® Green PCR Kit (Qiagen) und nach der Anleitung

QuantiTect™ SYBR® Green PCR Handbook (Qiagen, 2003) durchgeführt. Die relativen Gen-

expressionsraten werden auf der Basis von Actin-Kontrollwerten berechnet und repräsentieren

jeweils die Mittelwerte von drei unabhängigen Messungen in Doppelbestimmungen. Die Re-

aktionsansätze werden mit dem qPCR Gerät RotorGene 2000 der Firma Corbett Research, Syd-

ney, durchgeführt. Die Daten werden mit dem Computerprogramm Rotor-Gene Real-Time

Analysis (Rotor-Gene Real-Time Analysis Software, (Corbett Research 2000) aufgezeichnet

und ausgewertet.

qPCR- Programm Temperatur Zeit Anzahl der Zyklen

Aktivierungsschritt 95 °C 15 min x 1

Denaturierung

Annealing

Extension

95 °C

55 °C

72 °C

10 s

20 s

20 s

x 40

Schmelztemperatur 60 - 95 °C 5 s/Schritt


41

2.1.8. Nachweis und Trennung von DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese

PCR amplifizierte Gen-Fragmente werden über ihre Größe durch die Agarose-Gelelektropho-

rese aufgetrennt. Je nach erwarteter DNA- Fragmentlänge wird ein entsprechend prozentuiertes

1x TAE- Agarosegel (1,0 % bis 2,0 % (w/v)) benötigt (s. 1.10.2). Die Elektrophorese erfolgt

bei 60 mA. Durch die angelegte elektrische Spannung werden die auf Grund ihrer Phosphat-

gruppe negativ geladenen DNA-Fragmente der Größe nach zur Anode hin aufgetrennt. Nach

Terminierung der Elektrophorese wird das Agarosegel 10 min in ein 0,1 %-iges Ethidiumbro-

mid-Bad getaucht, welches wegen seiner planaren Struktur zwischen die Basen der DNA inter-

kaliert. Unter UV-Licht (UV365) werden die angefärbten DNA-Fragmente sichtbar und können

detektiert werden.

2.1.9. Aufreinigung von DNA

Die Reinigung von DNA aus PCR-Ansätzen und Restriktionsverdau wird nach dem Double

Pure Kit (Bio&Sell e.K., Feucht) durchgeführt. Der Elutionsschritt wird mit einem Volumen

von 15 µL H2O bd durchgeführt und bis zur weiteren Verwendung auf Eis bzw. bei -20 °C

aufbewahrt.

2.1.10. Klonierung von PCR-Produkten zur Sequenzanalyse

Für die Klonierung von Taq-Polymerase amplifizierten PCR-Produkten wird das TOPO TA

Cloning® Kit (Invitrogen) bzw. das pGEMT Vektor Kit (Promega) verwendet (s. 1.4). Hierbei

wird jeweils nach der Arbeitsvorschrift des Herstellers verfahren. Beide Vektoren unterliegen

dem gleichen Prinzip. Das PCR-Produkt wird in den linear vorliegenden Vektor über dessen

3´-T-Überhänge in die Multiple Cloning Site ligiert und das lacZ Gen codierend für eine β-Ga-

lactosidase somit unterbrochen. Es erfolgt eine Selektion über die Antibiotikaresistenz des Vek-

tors (Ampicillin) und zusätzlich eine mittels Blue-White-Screening. Negative Kolonien, welche

ein intaktes lacZ Gen enthalten, besitzen folglich eine aktive, den Farbstoff X-Gal spaltende β-

Galactosidase und erscheinen blau. Positive Klone sind entsprechend weiß.

Ligationsansatz TOPO 2.1 Vektor Ligationsansatz pGEMT-Vektor

gereinigtes PCR Produkt 4 µL gereinigtes PCR Produkt 3 µL

Salzlösung 1 µL 2x Rapid Ligation Buffer 5 µL

TOPO-Vektor 1 µL pGEMT Vektor 1 µL

Inkubation bei 23 °C für 5 min T4 DNA Ligase 1 µL

Inkubation bei 23 °C für 1 h oder bei 4 °C über Nacht


42

2.1.11. Klonierung von PCR Produkten mittels Gateway-System

Auf dem Prinzip des sequenzspezifischen homologen Rekombinationsvermögen des Bakterio-

phagen λ (Landy, 1989) basiert das Gateway System. Die Gateway Technologie ermöglicht die

Klonierung, die Kombination und die Übertragung von DNA-Segmenten von verschiedenen

Vektoren in einer schnellen und effizienten Weise, während die Orientierung sowie das Lese-

raster des Fragments oder Fragmente beibehalten werden (Katzen, 2007). Für die reversible

homologe Rekombination werden verschiedene DNA-Sequenzen benötigt, sogenannte „attach-

ment sites“ oder „recombinant sites“. Die Generierung von sogenannten Entry-Klonen ist ein

essentieller Schritt der Gateway Technologie. Erfolgreich rekombinierte PCR-Produkte können

nach einer überprüfenden Sequenzierung in jeglichen vom Gateway-System angebotenen „Des-

tiny“ (Bestimmungs-) Vektor umkloniert werden.

Das pENTR Directional TOPO Cloning

Das pENTR D Topo Directional Cloning System verbindet die schnelle und effiziente Methode

des direkten Klonierens von „blund end“ PCR-Produkten durch die integrierte Topoisomerase I

des Vaccinia Virus im Vektor mit den spezifischen Eigenschaften des Gateway Systems. Das

PCR-Produkt wird direkt und in der richtigen Orientierung ligiert, indem an den Vorwärts-

Primer zusätzliche vier Basen (CACC) angebracht werden. Flankiert wird das ligierte PCR-

Produkt mit den, für die GatewayReaktion erforderlichen, im Vektor vorhandenen attL-Seiten

(Chen und Shuman, 2000; Invitrogen User Guide 2012). Es wird nach den Angaben des

pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kit (Invitrogen®) Handbuchs verfahren. Der Reaktions-

ansatz setzt sich wie folgt zusammen:

Ligationsanstatz pENTR Vektor

gereinigtes PCR- Produkt 4 µL

pENTR D TOPO Vektor (15-20 ng/µL) 1 µL

Salzlösung 1 µL

Inkubation bei 23 °C, 5 min

Das pDONR Gateway System

Im Gegensatz zum pENTR Vektor System, in welchem die attL-Seiten für die spätere Rekom-

bination in einen Zielvektor schon vorhanden sind, müssen jene erst generiert werden. Um ein

spezifisches Produkt in einen pDONR Vektor klonieren zu können wird das PCR-Produkt mit

Primern, welche 25 festgelegte Basenpaare sequenzspezifisch für attB-sites enthalten, amplifi-

ziert. Katalytisch werden diese mittels eines BP-Clonase® Enzym Mix mit den attP-sites eines

entsprechenden Donor Vectors homolog rekombiniert. Dabei wird das zuvor zwischen den


43

attP-Seiten lokalisierte ccdB-Gen für negative Selektion der E. coli Bakterien durch das Zielgen

ersetzt. Das generierte ccdB-Nebenprodukt besitzt attR-Seiten, der generierte Entry Vektor die

attL-Seiten. Es wird analog den Angaben des Herstellers verfahren. Die Inkubationszeit der BP-

Clonase Reaktion wird von 1 h auf 3 h erhöht.

BP-Clonase Reaktionsansatz

gereinigtes PCR-Produkt 15-150 ng

pDONR221 Vektor (100 ng/µL) 1,5 µL

TE-Puffer (pH 8) Ad 8 µL

BP Clonase II Enzym Mix 2 µL

Inkubation bei 25 °C für 3 h

Proteinkinase K 1 µL

Terminierung der Reaktion bei 37 °C für 10 min

2.1.12. Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zellen

E. coli Bakterien des DH5α bzw. Top10 Stammes werden auf einer LB-Agarplatte (s. 1.9.1)

ohne Antibiotikazusatz nach dem Verdünnungsausstrichprinzip aufgetragen und über Nacht bei

37 °C angezogen. Eine vereinzelte Kolonie wird der Platte entnommen und in 4 mL LB Me-

dium angezogen. Dieser Vorkultur wird nach 10 h 1 mL entnommen und 125 mL SOB Medium

angeimpft. Die Kultur wird über Nacht unter Schütteln (200 rpm) bei 22 °C inkubiert. Bei einer

max. OD600nm von 0,2-0,5 werden die Zellen für 10 min auf Eis gekühlt und anschließend bei

4000 rpm, 4 °C für 10 min dreimal abzentrifugiert. Das Pellet wird in eiskaltem TB-Puffer

resuspendiert, 10 min auf Eis inkubiert und wiederum für 1 min zentrifugiert. Der Überstand

wird verworfen und die pelletierten Bakterien in 3,2 mL eiskaltem TB-Puffer aufgenommen.

Anschließend werden 0,2 mL DMSO tropfenweise hinzugefügt. Die Zellsuspension wird zu

50 µL Portionen aliquotiert, in flüssigem N2 schock gefroren und bei -80 °C gelagert.

2.1.13. Transformation in chemisch kompetente E. coli Zellen

Für die Transformation werden 5 µL des Reaktionsansatzes auf 50 µL chemisch kompetente

E. coli Zellen pipettiert und für 30 min auf Eis inkubiert. Durch einen anschließenden Hitze-

schock bei 42 °C für 30-60 s werden die Zellen geschlossen und die Bakterienkultur kann mit

350 µL SOC-Medium bei 37 °C für 1 h inkubiert werden. Die Ansätze werden für 1 min bei

max. Umdrehung zentrifugiert und in je 100 µL SOC-Medium resuspendiert. Die Zellsuspen-

sion wird auf LB-Agarplatten mit entsprechenden Antibiotika und gegebenenfalls X-Gal zur

Blue/White Screening ausplattiert und über Nacht bei 37 °C gelagert.


44

2.1.14. Anlegen einer Bakterienflüssigkultur

Einzelne Kolonien werden unter sterilen Bedingungen von der Agarplatte abgenommen und in

10 µL H2O bd resuspendiert. Davon werden 2 µL der Suspension in die Colony PCR (s. 2.1.6)

eingesetzt. Die restlichen 8 µL werden mit 2 mL LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika

versetzt und bei 37 °C, 115 rpm über Nacht angezogen. Die Kulturen dienen der Plasmidisola-

tion mittels Mini-Präparation und zum Anlegen von Glycerolstocks. Gegebenenfalls wird je

1 µL der Bakterienflüssigkultur auf negative Antibiotika Selektion hin überprüft und auf LB-

Agarplatten mit Ampicillin ausgestrichen um eine Verschleppung des Template-Vektors aus-

zuschließen.

2.1.15. Plasmid-DNA Isolierung aus transformierten Bakterienzellen

Die Gewinnung von Plasmid-DNA aus transformierten E. coli Zellen wird nach dem Protokoll

des peqGold Plasmid Miniprep Kit I für Low Copy Number Plasmide (peqlab Biotechnologie

GmbH, Arbeitsanleitung Classic-Line) durchgeführt. Die DNA wird mit 50 µL bd H2O eluiert.

Die Plasmide werden bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.

2.1.16. Restriktion von DNA

Mit Hilfe von Restriktionsenzymen (s. 1.5.2) kann DNA an spezifischen Erkennungssequenzen

geschnitten werden. Die Methode wird dazu verwendet, um auf das Vorhandensein bestimmter

Schnittstellen zu prüfen oder einen Größenvergleich geschnittener DNA-Fragmente mittels an-

schließender Gelelektrophorese durchführen zu können. Als Alternative zur Colony-PCR kann

die Insertion des PCR-Produkts im Plasmid durch Restriktion überprüft werden. Die Bedingun-

gen werden so gewählt, dass ein und dasselbe Enzym je nur einmal im Vektor und Insert schnei-

det (Einzelverdau) oder eine Kombination aus zwei Enzymen (Doppelverdau) verwendet wird,

von welchen nur ein Enzym einmal den Vektor und das andere Enzym einmal das Insert schnei-

den. Der jeweilige Reaktionsansatz wird nach Herstellerangaben verfahren. Des Weiteren kön-

nen über diese Methode auch Vektoren linearisiert werden, um zu vermeiden, dass diese anstatt

des neu kombinierten Plasmids bei einer Transformation von kompetenten Zellen aufgenom-

men werden. Hier kann der Restriktionsverdau vor oder nach einer PCR (s. 2.1.5) erfolgen.

2.1.17. Anlegung eines Glycerolstocks

Positive Bakterien-Übernachtkulturen, welche das Insert im Vektor enthalten, werden als Gly-

cerolstock-Erhaltungskultur angelegt. Je 500 µL Bakterienlösung und Glycerol werden ver-

mischt und bis zum weiteren Gebrauch bei -20 °C aufbewahrt.


45

2.1.18. DNA-Sequenzierung

Als positiv bewertete Plasmide werden zu einer Konzentration von 50 bis 100 ng/µL eingestellt

und in 15 µL Proben an die Firma MWG-Biotech (Martinsried) bzw. in 25 µL Proben an die

Firma GATC (Konstanz) zur Sequenzierung eingeschickt. Die erhaltenen Sequenzen werden

mit Onlineprogrammen bearbeitet und ausgewertet (s. Computer unterstützte Analysen 2.7).

2.2. Proteinchemische Methoden

2.2.1. Heterologe Expression von rekombinanter VvP5βR in E. coli

Für die heterologe Proteinexpression der rekombinanten Vitis vinifera P5βR wird ein Kon-

strukt, welches am Agrarinstitut FEM-IASMA, Italien, von Dr. Stefan Martens, im pDEST17

Vektor generiert wurde, verwendet. Zur Überexpression werden verschiedene BL21 Zellen

(BL21, BL21Lys) verwendet, sowie ein zweites Überexpressionsystem, das pQE30 System

(Qiagen). Bei diesem wird die kodierende Sequenz über die Restriktionsschnittstellen Sph I und

Sal I in den Expressionsvektor pQE30 kloniert und in M15(pREP4) Zellen überexprimiert. Bei-

den Vektorsystemen liegt das mit IPTG induzierbare Lac-Operon System zu Grunde. Der

künstliche Induktor bindet an den auf dem Operon sitzenden Repressor und gibt die Promotor-

bindestelle für die RNA-Polymerase frei. Die Transkription der DNA in mRNA wird eingeleitet

und die Translation zum sechsfach-Histidin getaggten Fusionsprotein erfolgt.

Induziert wird eine Überexpressionskultur von 1 L Volumen bei Bakteriendichte einer OD600nm

von 0,5-0,7 mit 0,1 mM und 0,3 mM IPTG. Nach der Induktion werden die Bakterienkulturen

bei verschiedenen Inkubationstemperaturen und Zeiten inkubiert.

Inkubationstemperatur Inkubationszeit

37 °C 4 h

22 °C 16 h

4 °C 96 h

Es schließt sich die Ernte der Bakterienzellen durch mehrmaliges zentrifugieren der Kultur in

einer Kühlzentrifuge für 20 min bei 4000 rpm an. Die Zellpellets werden in 50 mL Falcontubes

bis zur Verwendung bei -20 °C gelagert.

2.2.2. Reinigung rekombinanter Proteine mittels immobilisierter Metallchelat-Affini-

tätschromatographie (IMAC)

Die Bakterienpellets werden in 10 mL Lysepuffer resuspendiert und mit Lysozym

(1 mg/mL, 1 h) und Ultraschall (6 x 30 s) aufgeschlossen. Der Proteinrohextrakt wird durch


46

Zentrifugieren bei 13 000 rpm für 25 min erhalten. Der Überstand wird für einen Proteinakti-

vitätstest (s. 2.5) eingesetzt oder durch eine 45 µm Membran filtriert und über den ÄKTApuri-

fier mittels einer Nickelsäule gereinigt. Durch einen Gradienten von aufsteigender Imidiazol-

konzentration von 25 mM bis 300 mM von 15 Säulenvolumen mit Elutionspuffer wird das

rekombinante Protein aus dem Chelatkomplex mit den Nickelionen verdrängt und eluiert. Die

Fraktionen werden zu 1 mL in Probengefäßen aufgefangen. Von jedem Schritt werden Proben

für ein SDS-Gel abgenommen und der Proteingehalt nach Bradford (1976) vermessen.

2.2.3. Proteinquantifizierung

Die Konzentration der Gesamtproteine wird nach der Bradford-Methode (Bradford, 1976)

durchgeführt. Bei Konzentrationen von 0,1-1 mg/mL werden 20 µL Probe mit 2 mL Bradford-

Reagenz (Coomassie Brilliant Blue G 250 (100 mg), Ethanol (96 %, 50 mL), o-Phosphorsäure

(85 %, 100 mL), bd H2O (ad 1000 mL)) vermischt. Der gebildete blaue Farbstoff-Proteinkom-

plex kann nach 10 min bei 595 nm an einem Photometer vermessen werden. Die Konzentration

der Proteine wird mit gegebener Formel in [mg/mL] berechnet:

�� = �� ∙ ��

��ö�� ∙ ��ü��

Der Bradfordfaktor wird über eine erstellte Kalibrierungsgerade mittels verschiedener Konzent-

rationen an Rinderserumalbumin bestimmt. Zur Messung höherer Konzentrationen ist eine

1:4 Verdünnung der Probe mit dem jeweiligen verwendeten Puffer nötig.

2.2.4. SDS-Polyakrylamidgelelektrophorese (PAGE)

Das SDS-PAGE Verfahren dient dazu Proteine nach ihrem Molekulargewicht über ein diskon-

tinuierliches Polyakrylamidgel in einem elektrischen Feld aufzutrennen. Die Proteine der Pro-

ben werden durch die Zugabe des Lämmli-Probenpuffer (1:3) und das Erhitzen auf 100 °C für

10 min denaturiert, linearisiert und die Eigenladung der Proteine durch das anionische Tensid,

SDS, maskiert (s. 1.10.3). Es entstehen negativ geladene SDS-Proteinkomplexe mit einem kon-

stanten Ladungs- zu Massenverhältnis. Die Proben (15 µL Volumen) werden auf ein 12 % Bis-

Trisgel, zusammengesetzt aus einem Trenngel (unten) und einem Sammelgel (oben, Aufkon-

zentrierungszone) zwischen zwei Glasplatten, geladen. Dieses befindet sich in einer Mini-Pro-

tean 3 Kammer (Biorad) befüllt mit MOPS-Tris Puffer. Die zunächst angelegte Spannung wird

von 100 mV auf 180 mV nach Erreichen des Trenngels erhöht. Nach der Elektrophorese wird

das Gel zwei bis dreimal für 10 min mit H2O bd gewaschen um das SDS zu entfernen. Das Bis-

Tris Gel wird entweder für einen Western Blot weiterverwendet oder über Nacht mit sensitiver

Coomassie Lösung (Kang et al. 2002) zur Proteindetektion gefärbt (s. 1.10.3).


47

2.2.5. Spezifische Proteindetektion mittels Western Blot

Mittels Western Blot werden Proteine aus einem Polyakrylamidgel durch ein gerichtetes elekt-

risches Feld auf eine Nitrozellulosemembran übertragen. Es werden der Größe des Poly-

akrylamidgels (5,7 cm x 8,6 cm) angepasste dünne (2) und dicke (5) Filterpapiere sowie eine

Nitrozellulosemembran zugeschnitten und gestapelt. Die Reihenfolge auf der Blotting Appara-

tur beginnt mit drei dicken und einem dünnen, in Transferpuffer eingeweichten, Filterpapieren

gefolgt von der Nitrozellulosemembran und aufliegendem SDS-Gel. Abschließend werden

noch eine dünne und zwei dicke, mit Transferpuffer (s. 1.10.4) getränkte, Filterpapiere luftbla-

senfrei aufgelegt. Pro cm2 Membran werden 2 mA Spannung für 90 min angelegt. Nach dem

Transfer werden die freien Proteinbindestellen auf der Membran über Nacht bei 4 °C in 5 %

Milchpulver 1 x TBS mit 0,1 % Tween 20 blockiert. Die Identifizierung des Proteins erfolgt

über Antikörper. Als erstes wird ein His-Tag spezifischer Antikörper, welcher das rekombi-

nante His-Tag Fusionsprotein erkennt, eingesetzt und die Membran mit jenem für 2 h inkubiert.

Nach dreimaligem Waschen mit 5 % Milchpulver 1 x TBS 0,1 % Tween 20, schließt sich eine

Inkubation von 2 h mit einem zweiten Anti-mouse IgG Antikörper, welcher als Grundlage für

die Detektion über Chemilumineszenz dient, an. Die Entwicklung und Detektion erfolgt über

den C-Digit (Licor) Scanner. Die Membran wird für 5 min in einer „Working Solution“ aus

gleichen Teilen an Peroxid-Lösung und Luminol-Lösung 0,1 mL pro cm2 Membran bei Raum-

temperatur inkubiert. Danach wird die Membran mit der Proteinseite nach unten auf den Scan-

ner gelegt, mit einer Folie abgedeckt und 12 min bei hoher Intensität gescannt. Über die Image

Studio Software wird das generierte Bild ausgewertet.

2.3. Konstruktion von binären Expressionsplasmiden via Gateway System

Der Expressions Klon wird mittels LR-Clonase generiert. Hier werden die attL-sites der nach

der Methode 2.1.11 generierten Entry-Klone mit den attR-sites des Zielvektors durch den LR-

Clonase-Enzym-Mix, welcher aus der Integrase, dem integration host factor und einer Excisio-

nase des Bakteriophagen λ besteht, rekombiniert. Das Gateway System von Invitrogen basiert

auf zwei Selektionsmechanismen. Zum einen enthalten der Entry-Klon und der Zielvektor in

der Regel verschiedene Antibiotika Resistenzen. Zum anderen enthält der Zielvektor einen Ge-

genselektionsmarker, das F-Plasmid kodierte ccdB Gen (Bernard und Couturier 1992;

Miki et al. 1992), welches auf das Wachstum von E. coli inhibierend wirkt und bei der Rekom-

bination mit dem inserierten Gen in den Entry-Klon ausgetauscht wird. Die LR-Clonase Reak-

tion wird aus folgenden Komponenten nach den Angaben des Herstellers zusammenpipettiert.

Die Inkubationszeit der LR-Clonase Reaktion wird über Nacht durchgeführt. Der Ansatz wird

in kompetente E. coli Bakterien transformiert und anschließend überprüft.


48

LR-Clonase Reaktionsansatz

Entry Clone 15-150 ng

Destination Vektor 100 ng

TE-Puffer (pH 8) ad 8 µL

LR Clonase II Enzym Mix 2 µL

Inkubation bei 25 °C über Nacht

Proteinkinase K 1 µL

Terminierung der Reaktion bei 37 °C für 10 min

Ist die Antibiotikaresistenz des Entry-Klones gleich dem Destination-Vektor können verschie-

dene Methoden zur Anwendung kommen. Zum einen kann der Entry-Klon zuvor mittels Rest-

riktion linearirsiert werden.

Zum anderen kann nach dem Protokoll von Xu und Li (2008) vorgegangen werden. Nach der

Transformation in E. coli Bakterien kann neben korrekt zusammengesetzten Plasmiden auch

der Entry-Klon von den Bakterien aufgenommen worden sein. Durch direkte Weitertransfor-

mation eines isolierten Plasmidmix (Entry-Klone und Expression Klone) in Agrobakterien wer-

den die Expressionsplasmide selektioniert, da diese im Gegensatz zum Entry-Klon ein ORI

(origin of replication) für Agrobakterien aufweisen.

2.3.1. Herstellung und Transformation chemisch kompetenter Agrobakterien

Die Herstellung und Transformation von chemisch kompetenten Agrobakterien erfolgt nach

der „freeze-thaw“ Methode (Holsters et al., 1987). Der Binär-Vektor wird während der Auf-

tauphase schockgefrorener Bakterien übertragen. Der schnellen und einfachen Ausführung

steht eine geringe Transformationsrate von ca. 10-3 Transformanten pro µg DNA gegenüber.

Per Einzelkolonie werden 3 mL YNB Medium mit entsprechenden Antibiotika angeimpft und

24-36 h bei 28 °C, 200 rpm inkubiert. Mit der Starterkultur werden 50 mL YNB (mit Antibio-

tika versetzt) unter den oben genannten Bedingungen bis zu einer OD600nm von 0,5 bis 1 wach-

sen gelassen. Anschließend wird die Kultur 10 min auf Eis gekühlt, zentrifugiert (4 °C, 10 min,

4000 rpm) und in 200 mL kaltem bd H2O resuspendiert. Dieser Waschschritt erfolgt dreimal.

Die Zellen werden in 1 mL kalter CaCl2 Lösung (20 mM) aufgenommen, zu 100 µL aliqoutiert

und in flüssigem Stickstoff schockgefroren.

Die kompetenten Agrobakterien werden auf Eis angetaut und mit mind. 1 µg binärer Plasmid-

DNA versetzt. Der Ansatz wird 5 min auf Eis, 5 min in flüssigem Stickstoff und 5 min bei 37 °C

inkubiert. Nach Zugabe von 1 mL YNB-Medium werden die Zellen bei 28 °C über 4 h im


49

Thermomixer geschüttelt. Die Bakteriensuspension wird für 1 min bei max. Umdrehung pelle-

tiert. Das Pellet wird in 100 µL YNB-Medium aufgenommen und auf Festmedium mit entspre-

chenden Antibiotika ausplattiert. Die Inkubation erfolgt bei 28 °C für 2 bis 4 Tage.

2.4. Kultivierung und Behandlung von Pflanzen

2.4.1. Oberflächensterilisierung von Samen

Reife Samen werden in einem 2 mL Reaktionsgefäß mit 70 % Ethanol für 15 min inkubiert.

Das überstehende Ethanol wird dekantiert. Danach werden die Samen mit 2 mL 96 % Ehtanol

versetzt und weitere 5 min inkubiert. Die Samen werden auf ein steriles Filterpapier zum Trock-

nen ausgebracht oder mit 500 µL sterilem Wasser überschichtet.

2.4.2. Anzucht und Selektion von Arabidopsis thaliana unter sterilen Bedingungen

Sterilisierte Samen in Wasser werden über eine Pipette mit vergrößerter Pipettenspitze auf

LS-Festmediumplatten mit entsprechenden Antibiotika in drei Linien aufgetragen. Um eine

gleichzeitige Keimung der Samen zu erhalten werden die Platten für 2 bis 4 Tage bei 4°C unter

Lichtauschluss aufbewahrt. Die Kultivierung erfolgt im Klimaraum bei 22 °C unter Langtag-

Bedingungen (16 h Tag/8 h Nacht) vertikal. Selektionierte, gesunde Keimlinge werden nach

3-4 Wochen auf Erde umgesetzt.

2.4.3. Kultivierung und Selektion von Arabidopsis thaliana auf Erde

Homozygote Samen der Pflanzenlinien der F4/F5 Generation der T-DNA Insertionslinien, der

Pflanzenüberexpressionlinie AthVvP5βR (s. 1.12), A. thaliana Col-0 sowie gewonnene Samen

von transformierten Pflanzen mit erworbener BASTA-Resistenz werden auf Erde ausgesät und

stratifiziert (2- 4 Tage, 4 °C, dunkel). Pflanzen für die Transformation mittels „Floral Dip“

Methode (s. 2.4.4), für die Samengewinnung sowie für Transformationsüberprüfungen werden

pikiert (4 Keimlinge pro Topf) und mit Beginn der Blütenbildung räumlich getrennt, um eine

Kreuz-Kontamination zu vermeiden. Zur Samenernte wird der oberirdische Pflanzenabschnitt

mit Papiertüten umgeben und getrocknet. Die Samen werden aus den Schoten manuell heraus-

gelöst und mittels eines handelsüblichen Teesiebes von den Pflanzenbestandteilen getrennt. Die

Samen werden trocken bei Raumtemperatur gelagert. Die Selektion mittels BASTA erfolgt

durch Besprühen der Pflanzen im Zweiblattstadium mittels einer BASTA- Lösung (1 g/L) drei-

mal innerhalb von 3 bis 4 Tagen. Gesund hochgewachsene Pflanzen werden, sobald sie groß

genug sind, pikiert.


50

2.4.4. Transformation von Arabidopsis thaliana mit Agrobakterien

Basierend auf dem Protokoll von Clough und Bent (1998, modifizierte Methode von Bechtold

et al., 1993) wird die „Floral Dip“ Methode für die stabile Transformation von A. thaliana ver-

wendet. Mit einer 5 mL Agrobakterien Vorkultur werden 350 mL YNB-Medium mit entspre-

chenden Antibiotika angeimpft und über Nacht bei 28 °C inkubiert. Die Kultur wird auf eine

OD600nm von 0,8 eingestellt. Es wird Saccharose (30 g/L) und 0,05 % Silwet L-77 hinzugefügt.

Zur Transformation werden gesunde Pflanzen mit reifen geschlossenen bzw. sich leicht öffnen-

den Blüten verwendet. Diese werden in die Agrobakterienlösung für 1 min getaucht und für 48-

72 h unter erhöhter Luftfeuchte in die Klimakammer gestellt. Anschließend werden die Pflan-

zen unter normalen Gewächshausbedingungen kultiviert.

2.4.5. Analyse des Gefäßsystems (Vein Patterning) der Kotyledonen

Es wird die Ausbildung des Gefäßsystems der Kotyledonen der Pflanzenlinien SALK_597798,

SALK_568840, Columbia Col-0 WT und AthVvP5βR verglichen (s. 1.12). Dazu wird den

14 Tage alten Keimlingen über Nacht mittels Ethanol-Essigsäure Lösung (3:1) das Chlorophyll

entzogen. Die entfärbten Pflanzen werden mit Wasser gewaschen und auf einen Objektträger

platziert. Die Ausbildung des Gefäßsystems wird unter einem Axioskop HBO 50 (Zeiss) be-

trachtet und ausgewertet. Zur Bildaufnahme wird die Software Cell´D von Olympus verwendet.

2.4.6. Messung der Wurzellängen und Blattgrößenbestimmung

Von sechs Wochen alten Pflanzen werden die Rosettenblätter gezählt und deren Blattstängel,

Blattbreite und -Länge vermessen. Die Blattfläche wird in Annäherung einer Ellipse mit der

Formel = �� ä�� beschrieben. Wurzeln der vertikal kultivierten WT Pflanzen

und Mutanten auf LS-Festmediumplatten werden nach 12 Tagen ihrer Länge nach vermessen.

Es werden jeweils 15 bis 20 Keimlinge pro Platte zufällig ausgewählt. Die Signifikanzprüfung

erfolgt mittels T-Test.

2.4.7. Behandlung mit Methylvinylketon (MVK)

SALK_597798, SALK_568840, Columbia Col-0 WT und AthVvP5βR werden für den Versuch

in eine Glaskammer gestellt und mit Methylvinylketon (2 µmol/L) für 3 h und 24 h inkubiert.

Es werden drei bis vier Wochen alte Pflanzen verwendet. Blätter der behandelten Pflanzen wer-

den zu den jeweiligen Zeitpunkten für RNA Extraktion (s. 2.1.2) und Proteinrohextraktgewin-

nung (s. 2.4.8) eingesetzt.


51

2.4.8. Proteinextraktion aus Pflanzenblättern von Arabidopsis thaliana

Zur Gewinnung von Pflanzenproteinrohextrakten werden alle Arbeitsschritte bei 4 °C durchge-

führt. Die hierfür verwendeten Arbeitsgeräte, Chemikalien und Verbrauchsmaterialien werden

auf diese Temperatur vorgekühlt. Es werden 1-3 g frische Pflanzenblätter eingewogen, mittels

flüssigen Stickstoffs schockgefroren und zu einem feinen Pulver zermahlen. Um einen besseren

Zerkleinerungsgrad des Materials zu erhalten, wird zusätzlich feiner Seesand hinzugefügt.

Nach der Pulverisierung wird PVPP im Verhältnis 0,2 g pro g eingesetztem Material hinzuge-

fügt und vermengt. Dadurch werden störende Polyphenole quervernetzt und ausgefällt. Das

erhaltene Pulver wird in den jeweils vorgelegten Extraktionspuffer (3 mL/g; s. 1.10.3) überführt

und 30 min bei 4 °C gerührt. Das erhaltene Homogenat wird durch Miracloth Filtervlies in

Zentrifugenröhrchen filtriert und bei 4 °C, 20000 rpm für 20 min zentrifugiert. Die klare Pro-

teinlösung wird wiederum über Miracloth Filtervlies gefiltert und je 2,5 mL werden auf zuvor

equilibrierten PD-10-Säulen (Sephadex G-25M) aufgetragen. Dieses Säulenverfahren dient der

Abtrennung von niedermolekularen Substanzen aus der Proteinlösung. Die Proteinlösung wird

mit 3,5 mL Assaypuffer eluiert. Der Gesamtproteingehalt des Rohextraktes wird anschließend

nach der Bradford-Methode (s. Methode 2.2.3) bestimmt.

2.4.9. Transformation von embryogenen Vitis vinifera Kallus

In einer Forschungskooperation mit dem Agrarinstitut FEM-IASMA, Italien, mit der Arbeits-

gruppe von Dr. Stefan Martens und Michael Malnoy über COST, wird das etablierte Regene-

rations- und Transformationssystem von Kalluskulturen aus Weinreben für Versuche verwen-

det. Sämtliche Arbeitsschritte werden vor Ort durchgeführt und von Dr. Manuela Campa weiter

betreut.

Bakterienanzucht

Eine Agrobakterienkultur (100 mL) wird über Nacht bei 28 °C in YNB-Medium mit entspre-

chenden Antibiotika versetzt angezogen. Die Übernachtkultur wird bei 4000 rpm für 5 min bei

Raumtemperatur zentrifugiert. Das Pellet wird in flüssigem GS1CA Medium (s. 1.9.3) versetzt

mit Acetosyringone 100 µM zu einer optischen Dichte von 0,3 (OD600nm) resuspendiert. Die

Agrobakterien werden weitere 3 h bei Raumtemperatur unter Bewegung inkubiert.

Kokultivierung

Es werden 20 mL der Bakterienlösung mit 5-7 g von Embryogenen Kallus IT-24/01/12 Char-

donnay 27 für 10 min bei Raumtemperatur unter Bewegung (80 rpm) inkubiert und anschlie-

ßend wird die Agrobakterienlösung dekantiert. Nach Trocknung auf sterilem Filterpapier wer-

den die Kallus auf GS1CA Medium (s. 1.9.3) aufgebracht und bei 22 °C dunkel gelagert. Nach


52

48 Stunden werden die Kalli mit flüssigem GS1CA Medium, versetzt mit Dithiothreitol (DTT,

1 g/L) und Timentin (1 g/L),10 min bei 80 rpm gewaschen. Die Kalli werden auf sterilem Fil-

terpapier getrocknet.

Selektionsphase

Die Weinrebenkalli werden auf festes GS1CA Medium mit Tementin (1 g/L) bei 25 °C für

3 Wochen unter Lichtausschluss subkultiviert. Danach werden die Kalli auf GS1CA mit Ti-

mentin 1 g/L und Kanamycin 150 mg/L als Pflanzenselektionsmarker für mindestens 4 Monate

unter den oben genannten Bedingungen inkubiert. Dabei wird monatlich auf frisches Selekti-

onsmedium transferiert.

Regenerationsphase

Die weiterentwickelten Embryonen werden auf GE Medium mit Kanamycin 25 mg/L zur Dif-

ferenzierung und Entwicklung unter Lichteinwirkung und 25 °C umgesetzt. Gut differenzierte

Sprosse werden anschließend auf WP Medium (s. 1.9.3) zur Wurzelbildung und Längenwachs-

tum gesetzt.

Es wird die RNAi-Transformationslinien GT13 durch den Antisensevektor pK7WGIGWII

(s. 1.7) mit entgegengerichteter, doppelt inserierter cDNA von VvP5βR (JF460012.1) generiert.

Kalli sowie regenerierte Pflanzen, welche durch eingebrachte Kanamycinresistzen selektioniert

wurden, werden zur RNA und gDNA Isolation und molekluarbiologischen Überprüfung einge-

stetzt.

2.4.10. Anzucht der Digitalis lanata Pflanzen zur Explantatgewinnung

Oberflächensterilisierte Samen (s. Methode 2.4.1) werden auf LS-Festmedium verteilt und bei

22 °C unter Licht zum Keimen gebracht. Einen Monat alte Pflanzenkeimlinge werden unter

sterilen Bedingungen dem Anzuchtsmedium entnommen. Die Blätter werden abgetrennt und in

Stücke geteilt. Diese werden mit einer Pinzette aufgenommen, verletzt und 20 min in autokla-

viertem LS-Flüssigmedium mit 3 % Saccharose inkubiert. Die Blattstücke werden zum Trock-

nen auf sterilem Filterpapier ausgebracht. Je 20 Blattstücke werden auf I4 Festmedium (s. 1.9.2)

ausgelegt und mit Parafilm verschlossen. Die Petrischale wird bei 22 °C dunkel gelagert. Alle

zwei bis vier Wochen werden die Explantate auf Kallusbildung, Kontamination und Nekrose

hin überprüft.


53

2.4.11. Indirekte somatische Embryogenese und Pflanzenregeneration

Kulturphase I: Kallusentwicklung und Propagierung

Induzierte Kalli an Blattstücken werden steril auf frisches I4 Festmedium transferiert und bei

22 °C dunkel gelagert. Alle vier bis acht Wochen wird auf Kontamination, Nekrose, Wachstum

und Stadien der Regeneration überprüft. Die Subkultur erfolgt alle zwei Monate auf neues

I4 Medium unter den oben genannten Bedingungen.

Kulturphase II: Sprossentwicklung und Wurzelbildung

Sprossanlagen, welche eine Größe von 1 cm erreicht haben und amorphe Blattanlagen ausge-

bildet hatten, werden zur Kultivierung auf R-Medium in 100 mL bis 250 mL Glasgefäßen über-

führt. Die in vitro Kultur wird bei 22 °C und einem 16 h Licht-Tag aufbewahrt. Es erfolgt die

Rechlorophyllierung der Sprosse, die Ausbildung von rosettenständigen Blättern sowie die In-

duktion von Wurzelanlagen und Ausbildung von Wurzeln. Sprosse mit normalem Habitus wer-

den auf R-Medium alle vier Wochen vereinzelt.

Kulturphase III: Regeneration von Pflanzen

Gesunde und vitale Sprosse mit ausreichender Bewurzelung werden in ein Erde/Sand-Gemisch

(3:1) überführt und für 14 bis 20 Tage mit erhöhter Luftfeuchtigkeit weiter kultiviert. Gutwüch-

sige Pflanzen werden anschließend in das Gewächshaus gebracht und unter den dortigen Um-

weltbedingungen gehalten.

2.4.12. Transiente Transformation von Digitalis lanata

Für die transiente Transformation werden ein Jahr alte D. lanata Pflanzen aus dem Gewächs-

haus verwendet. Von einer am Vortag angelegten 5 mL Agrobakterienkultur wird 1 mL ent-

nommen und in 50 mL YNB-Medium, versetzt mit entsprechenden Antibiotika, 1 M MES-

Lösung (EK 10 mM) sowie 100 mM Acetosyringon-Lösung (EK 0,02 mM), überführt. Die

Hauptkultur wird bei 28 °C bis zum nächsten Tag inkubiert. Die Agrobakterien werden bei

5000 rpm, 10 min abzentrifugiert. Anschließend wird das Pellet mit Infiltrationspuffer bis zu

einer OD600nm von 0,8-1 resuspendiert. Die Infiltrationslösung wird weitere 2-3 h bei Raum-

temperatur inkubiert. Mittels einer Spritze ohne Kanüle wird die Agrobakterienlösung in die

Unterseite von jungen Blättern unter Druck eingebracht. Die infiltrierten Pflanzen werden 3-4

Tage unter normalen Gewächshausbedingungen inkubiert.


54

2.4.13. Detektion der GFP-Aktivität durch Fluoreszenzmikroskopie

Den infiltrierten Blättern werden an der Injektionsstelle Segmente herausgeschnitten und unter

einem Fluoreszenzmikroskop (Axioskop HBO 50, Zeiss) bei einem Anregungslicht von 450 nm

betrachtet. Zur Bildaufnahme wird die Software Cell´D von Olympus verwendet.

2.4.14. Stabile Transformation von Digitalis lanata

Agrobakterien Anzucht

Die Agrobakterien (s. 1.6.2) werden zuvor auf ein YNB-Festmedium (s. 1.9.1) mit entsprechen-

den Antibiotika ausgestrichen und vereinzelt. Die Agrobakterien werden bei 28 °C zwei Tage

inkubiert. Eine einzelne Kolonie wird für eine Starterkultur von 5 mL YNB Flüssigmedium mit

Antibiotika verwendet. Die Kultur wird für einen Tag unter Schütteln bei 28 °C angezogen.

Eine Hauptkultur von 250 mL flüssigem Anzuchtsmedium wird mit 1 mL der Agrobakterien-

Vorkultur versehen und wiederum einen Tag unter den genannten Bedingungen inkubiert. Die

Agrobakterien werden bei 5000 rpm 10 min abzentrifugiert. Anschließend wird das Pellet in

flüssigem LS-Medium mit Acetosyringon (EK 100 µM) bis zu einer OD600nm von 0,5 - 0,8

resuspendiert. Es folgt eine abschließende Inkubation über 3 h bei 28 °C und 140 rpm.

Inokulation und Kokultivierungsphase

1,5 g bis 2 g Kallusgewebe bzw. Suspensionskulturzellen der Lehrstuhl eignenen K3OHD Linie

werden mit 35 mL Agrobakterienlösung für 10 min bei Raumtemperatur unter leichter Bewe-

gung inkubiert. 20 bis 40 Blätter werden durch eine Pinzette verletzt und in eine Petrischale mit

Agrobakterienlösung für 20 min gelegt. Anschließend werden Kalli sowie Blätter auf sterilem

Filterpapier zum Abtrocknen ausgelegt und auf Cokultivierungsmedium aufgebracht. Dabei

werden die Pflanzenblätter richtig orientiert auf die Platte aufgelegt und für 4 Tage bei 22 °C

unter Lichtausschluss gelagert. Die Cokultivierungsphase der Kallustranformation ist auf zwei

Inkubationstage reduziert.

Selektionsphase

Blätter sowie embryogener Kallus werden mit 35 mL flüssig LS-Medium mit Timentin für

10 min gewaschen und anschließend auf sterilem Filterpapier ausgebracht. Bräunlich verfärbte

Stellen werden von den Blättern abgetrennt. Die Blattstücke werden dreigeteilt und mit der

Oberfläche nach unten auf das Selektionsmedium I aufgebraucht. Die Kalli werden zu 0,5 cm

bis 1 cm Gruppen auf SMI (s. 1.9.3) gesetzt. Alle ein bis zwei Wochen werden die Ansätze

kontrolliert und auf SMI umgesetzt. Dies wiederholt sich dreimal. Danach wird auf Selektions-

medium II, welches einen zusätzlichen Pflanzenselektionsmarker enthält, weiter kultiviert. Es


55

schließt sich die Pflanzenregeneration, mit auf Pflanzenselektion angepassten Regenerations-

medien, an.

2.5. Aktivitätsbestimmung von Proteinen

Ein P5βR-Standardassay, abgewandelt nach Stuhlemmer und Kreis (1996a), wird zum Nach-

weis auf Enzymaktivität der Progesteron-5β-Reduktase (VEP1 like) im Pflanzenrohextrakt von

Arabidopsis Pflanzen (s. 1.12) sowie Proteinrohextrakt nach Bakterienzellaufschluss und zur

katalytische Enzymaktivitätsüberprüfung der rekombinanten VvP5βR angewendet. Der Assay

setzt sich folgendermaßen zusammen:

P5βR-Standardassay Konzentration Volumen

Proteinlösung Pflanzenrohextrakt 0,5 mg/ mL bis 1 mg/mL 945 µL

Bakterienrohextrakt 1 mg/mL bis 2 mg/mL

rVvP5βR 0,2 mg/mL

Substratlösung 0,3 bis 0,5 mM 10 µL

NADPH regenerierendes System 45 µL

Die Proteinlösung wird zusammen mit dem regenerierenden System (s. 1.10.5) bei 40 °C für

10 min, 550 rpm vorinkubiert. Danach wird die Substratlösung zugegeben. Die Inkubations-

dauer ist von der Proteinlösung abhängig, Pflanzenrohextraktassays werden weitere 5 h bei 40

°C und 550 Upm inkubiert, für Bakterienrohextraktassays 18 h. Das Substrat wird hierbei unter

Verbrauch des Cosubstrates NADPH, welches durch das System der Glucose-6-Phosphat und

Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase regeneriert wird, reduziert (Gärtner et al., 1990). Als Ne-

gativkontrolle dient ein Assay, dessen Proteinlösung zuvor bei 100 °C für 10 min denaturiert

wurde. Durch Zugabe von 1 mL Dichlormethan wird die Reaktion beendet. Für quantitative

Analysen werden 10 µL des internen Standards 21-Hydroxy-Pregnenolon (0,2 mM, EK) hin-

zugefügt. Durch sorgfältiges Vortexen werden die Steroide in die Dichlormethanphase extra-

hiert. Eine optimale Phasentrennung wird durch Zentrifugation bei 13000 rpm für 5 min er-

reicht. Die organische Phase) abgetrennt und zur Trockene gebracht. Der Rückstand wird für

qualitative DC-Analytik in 50 µL Ethanol (96 %) gelöst. Zur Bestimmung der spezifischen

Aktivität über das gebildete Produkt nach GC/MS-Analytik werden die Proben in 100 µL Ace-

ton oder Dichlormethan aufgenommen.


56

2.6. Chromatographische Analysemethoden

2.6.1. Dünnschichtchormatographie (DC)

Die DC Analytik ist eine schnelle und effiziente Methode zur qualitativen Untersuchung der

Zusammensetzung von Proben. Auf eine Kieselgel-60 DC-Platte werden jeweils 50 µL Probe

und 10 µL Referenzen (1 mg/mL) strichförmig aufgetragen. Die Detektion der Substanzen er-

folgt mit Hilfe des Anisaldehyd-Tauchreagenz, in welches die entwickelte DC-Platte kurz ein-

getaucht wird und anschließend bei 100 °C auf der Heizplatte bis zum sichtbar werden der

Banden inkubiert wird. Die Auswertung erfolgt an der DC-Workstation CAB UVIS (Desaga)

bei Tageslicht.

2.6.2. Gaschromatographie mit Massenspektrometrie (GC-MS)

Die GC-MS Analytik wird zur Auftrennung und zur quantitativen Auswertung der P5βR En-

zymassays verwendet. Die Messungen werden an einer GC-2010 mit MS QP-2010S von

Shimadzu durchgeführt. Als stationäre Phase wird eine Agilent J & W GC Säule

(30 m x 25 mm x 0,25 µm) und als mobile Phase Helium mit einer Flussrate von 1,2 mL/min

verwendet. Die Injektionstemperatur von 1 µL Probenvolumen im Injektionsmodus „split“ be-

trägt 240 °C. Je nach zu detektierender Substanz werden verschiedene GC-MS Programme ver-

wendet.

GC-MS Programm I-Detek-tion von Pregnanen

Aufheizrate [°C/min]

Temperatur [°C]

Dauer [min]

Stufe I - 200 4

Stufe II 20 290 0

Stufe III 4 300 4

Massenspektrometer:

IonSource Temperatur 200 °C

Interface Temeratur 280 °C

Solvent Cut Time 5 min


57

GC-MS Programm II-Detek-tion von Iridoiden


Temperatur [°C]

Dauer [min]

Stufe I - 60 0

Stufe II 5 150 0

Stufe III 20 240 0

Stufe IV 20 290 5

Massenspektrometer:




GC-MS Programm III- Detek-tion von β-Ionon


Temperatur [°C]

Dauer [min]

Stufe I - 100 1

Stufe II 4 220 0

Massenspektrometer:





58

2.7. Computergestützte Analysen

Für Recherchen, Sequenzvergleiche und Auswertung, dienten nachstehende aufgelistete On-

linedatenbanken bzw. Software von Datenbanken.

Tabelle 3: Verwendete Internetprogramme Verwendung Internetadresse

Informationen zu Arabidopsis http://arabidopsis.info/

http://www.arabidopsis.org/

http://signal.salk.edu/

http://atensembl.arabidopsis.info/index.html

http://bar.utoronto.ca/welcome.htm

Vitis vinifera Genomprojekt http://www.genoscope.cns.fr/spip/Vitis-vinifera-e.html

Proteindatenbank http://www.expasy.org/

Recherche http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

BLAST (Homologiesuche) http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

(Altschuh et al., 1990; 1997)

CLUSTAL W (Sequenzver-

gleiche)

https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/

(Thompson et al., 1994)

Transeq http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/

Reverse Complement http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html

Primerdesign http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

Gateway-Vektoren http://gateway.psb.ugent.be/vec-

tor/show/pK7GWIWG2%28I%29/search/index/silen-

cing/any

http://sites.bio.indiana.edu/~pikaard-

lab/pEarleyGate%20plasmid%20vec-

tors%20copy/Table%20of%20vectors.html

Ergebnisse

59

III. Ergebnisse

1. Generierung von binären Pflanzentransformationsvektoren via Gateway System

Als Fundament der Pflanzentransformationsmethode sollte ein geeignetes Klonierungssystem

etabliert und ausgebaut werden. Zur Erstellung des Entry-Klons wurde zunächst das einfach zu

handhabende pENTR D Topo Vektor System (Invitrogen®, s. II.2.1.11) genutzt. Später wurde

der pDONR221 Vektor verwendet. Entry-Vektoren mit Genen, welche in der Cardenolidbio-

synthese involviert sind, sollten erstellt und mit binären Zielvektoren für Überexpression sowie

RNAi Expression in Pflanzen rekombiniert werden.

1.1. Erstellung der Überexpressionsvektoren

1.1.1. Anfertigung der Entry-Vektoren

Für die Hfr-PCR (s. II.2.1.5) wurden Template-Vektoren mit inserierten vollständigen cDNAs

verschiedener Gene verwendet. Nachstehend in Tabelle 4 sind die verwendeten Template-Vek-

toren im Detail erfasst. Benutzt wurden die bereits gegenwärtige Progesteron-5β-Reduktase

(P5βR) full length cDNAs sowie die cDNAs codierend für eine 3β-Hydroxysteroid-Dehydro-

genase (3βHSD; HSD) der jeweiligen Pflanzen.

Tabelle 4: Verwendete Template-Vektoren mit inserierten cDNAs verschiedener Gene

Pflanze Genbezeichnung Templatevektor Accessionnr. Bezeichnung

D. lanata P5βR TOPO 2.1 AY585867 DlP5βR 3βHSD pQE30 AY844960.1 DlHSD

E. crepidifoilium P5βR pQE30UA GU354236 EcP5βR 3βHSD TOPO 2.1 JF504668.1 EcHSD

A. thaliana P5βR TOPO 2.1 EF579963 VEP1 3βHSD At2g47140

pQE30 AY063106.1 AthHSD

Die Annealingtemperatur des PCR-Programmes wurde den jeweiligen Primern angepasst

(s. Tabelle 1). Nach Aufreinigung der PCR Ansätze wurde die Reinheit mittels NanoDrop Ana-

lyse vermessen und zudem mittels Agarosgel-Elektrophorese überprüft (s. II.2.1, II.2.1.8,

II.2.1.5) und ist in Abbildung 8 dargestellt. Parallel für die Ligation in den pENTR Vektor

wurde das Insert DlP5βR mit spezifischen Primern für die BP-Clonase Reaktion in den

pDONR221 Vektor generiert.

Ergebnisse

60

Abbildung 8: Hfr-PCR Analyse der Hydroxysteroid-Dehydrogenasen und Progesteron-5β-Reduktasen A M1- DNA Marker 100 bp; 1- PCR AthHSD, Templatevektor pQE30; 2- PCR EcHSD, Templatevektor TOPO 2.1 D; 3- PCR DlHSD, Templatevektor pQE30 B M1- DNA Marker 100 bp, M2- DNA Marker 1 kb, M4 – DNA Marker 1 kb Plus; 1- PCR VEP1, Templatevektor TOPO 2.1 D; 2- PCR EcP5βR, Templatevektor pQE30UA; 3- PCR DlP5βR, Templatevektor TOPO 2.1; 4- PCR DlP5βR für pDONR221 Vektor, Templatevektor TOPO 2.1

Die Überprüfung der pENTR-Ligationsreatkionen und Transformationen erfolgten mittels Co-

lony-PCR und anschließender Plasmidisolierung der für positiv erachteten, in Flüssigmedium

kultivierten Bakterienkolonien mit anschließender Sequenzierung. Trotz positiver PCR Signale

in der Colony-PCR konnte nur von AthHSD im ersten Ligationsansatz ein positiv sequenziertes

Plasmid erhalten werden. Sequenzanalysen der vermeintlich positiven Plasmide konnten ent-

weder nicht durchgeführt werden oder gaben den Template Vektor TOPO 2.1 D an. Daher

mussten verschiedene Strategien für jedes einzelne zu klonierende Gen generiert werden. In

Tabelle 4 findet sich ein Überblick über die Überprüfungsstrategien und Bezeichnung positiv

sequenzierter Plasmide.

Tabelle 5: Überblick der generierten Entry-Vektoren und Entry-Klone

Gen Überprüfungsstrategie Bezeichnung der Plasmide AthHSD Colony-PCR pENTRAthHSD_4

EcHSD Abverdau des Topo 2.1 D Vektors im PCR An-satz durch Restriktionsenzym BamH1, Colony PCR und negative Antibiotikaselektion

pENTREcHSD_8

DlHSD Restriktionsverdau nach Plasmidisolierung mit EcoRV und BamHI

pENTRDlHSD_1

VEP1 Colony-PCR und negative Antibiotika-Selektion auf pENTR Vektor

pENTRVEP1_8

EcP5βR Restriktionsverdau nach Plasmidisolierung mit EcoRV

pENTREcP5βR_19

DlP5βR Colony- PCR und negative Antibiotika-Selektion auf pDONR221 Vektor

pDONRDlP5βR_86

A B

Ergebnisse

61

1.1.2. Generierung der Überexpressions-Klone

Zur Überexpression der Gene in Pflanzen wurde der binäre Vektor pEarlygate100 (pEarly100;

Early et al., 2006) verwendet. Um eine Verschleppung des Entry-Klones zu minimieren wurde

zuvor eine Restriktion mit EcoRV oder SspI durchgeführt. Die linearisierten Entry-Vektoren

wurden zur Rekombination in die LR-Clonase Reaktion nach Invitrogen® eingesetzt. Anschlie-

ßend wurden in der Colony-PCR auf das Insert sowie auf das BASTA Resistenzengen bar ge-

prüft. Die 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen von Arabidopsis und Digitalis konnten im

zweiten bzw. dritten Ansatz positiv in den Überexpressionvektor pEarly100 kloniert werden

(s. Anhang VIII.1.2.1). Ausstehende Ansätze nach Protokoll von Invitrogen® führten zu keiner

weiteren erfolgreichen Sequenzierung. Ad hoc wurde frisch isoliertem pEarly100 Vektor je ein

Ansatz von bei -20 °C gelagerterem, mit SspI geschnittenem und aufgereinigtem Entry-Vektor

beigemischt. Die LR-Clonase Reaktion wurde analog der Beschreibung durchgeführt und in

kompetente DH5α Bakterien transformiert. Je fünf Kolonien jedes Ansatzes wurde mittels Co-

lony-PCR auf das bar Gen geprüft (Abbildung 9).

Abbildung 9: Colony PCR mit bar Primern der transformierten Bakterienkolonien der Re-kombinationsansätze M2- DNA Marker 1 kb; 1/22- positiv Kontrolle pEarly100 Vektor, 2-6- Kolonien 1 bis 5 des pEarly100VEP1 Ansatzes; 7- 11- Kolonien 1 bis 5 des pEarly100EcHSD Ansatzes; 12-16- Kolonien 1 bis 5 des pEarly100EcP5βR Ansatzes; 17-22- Kolonien 1 bis 5 des pEarly100DlP5βR Ansatzes

In der Colony-PCR wurde ein Produktsignal auf der Höhe der bar-Positivkontrolle detektiert

und nach II.2.1.15und II.2.1.18 weiter behandelt. Exemplarisch ist in Abbildung 10 der

pEarly100 Vektor sowie die Sequenz der inserierten VEP1 cDNA dargestellt.

Ergebnisse

62

Abbildung 10: Darstellung der Positionierung der Sequenz der VEP1 cDNA im pEarly-Gate100 Überexpressionsvektor Sequenz: Grau hinterlegt = VEP1 Gensequenz; rot eingefärbt = attB1-Site, nicht markierte Sequenz = pEarylGate100 Vektor, Vektorkarte : blauer Pfeil = attR-Kassette, roter Pfeil = 35S CaMV Promotor, magenta Pfeil = ccdB Gen, grüner Pfeil = BASTA Resistensgen für Pflanzenselektion, Primer 35S in magenta Farben, Restriktionsenzyme in schwarz

1.2. Erstellung der RNAi Vektoren

Im Rahmen der Bachelorarbeit von Stefan Loos, wurden kürzere Inserts der oben genannten

Gene amplifiziert und in RNAi Vektoren rekombiniert. Die LR-Reaktion wurde nach Vor-

schrift, sowie mit der beschriebenen Modifikation durchgeführt.

1.2.1. Generierung der Entry-Klone

Für die Generierung von RNAi- Vektoren werden kleinere Genfragmente bis zu 500 bp in den

pDONR221 Vektor kloniert (Hirai und Kodama, 2008). Die Template-Plasmide wurden mit

dem Restriktionsenzym EcoRV linearisiert und anschließend für die Hfr-PCR verwendet (Ab-

bildung 11). Im Anschluss folgte die BP Clonase-Reaktion mit pDONR®221. Es wurden analog

die unter 1.1.1 beschriebenen Überprüfungsmechanismen zur eindeutigen Generierung der

Entry-Vektoren verwendet.

Ergebnisse

63

Abbildung 11: Hfr-Polymerase PCR Analyse der kleinen Genfragmente von Hydroxyste-roid-Deyhdrogenasen und Progesteron-5β-Reduktasen M1- DNA Marker 100 bp; 1- PCR AthHSD RNAi von 604 bp, Templatevektor pGEM®T; 2- PCR VEP1 RNAi von 460 bp, Templatevektor pGEM®T; 3- PCR EcHSD RNAi von 585 bp, Templatevektor pCR®2.1TOPO; 4- PCR EcP5βR RNAi von 487 bp, Templatevektor pCR®2.1TOPO; 5- PCR DlHSD RNAi von 348 bp, Templatevektor pEarly100; 6- PCR EcP5βR RNAi von 372 bp, Templatevektor pEarly100

Aufgrund der angefügten attB-Sites der RNAi-Primer weisen die amplifizierten Fragmente zu-

sätzlich 62 bp mehr auf. Die nachstehende Tabelle gibt die Insertgrößen und die Bezeichnung

der positiv sequenzierten Entry-Klone an.

Tabelle 6: Insertgrößen sowie Bezeichnung der Entry-Klone

Genfragment Insertgröße [bp] Bezeichnung positiv sequenzierter Plasmide

AthHSD 522 pDONRAthHSDi

EcHSD 523 pDONREcHSDi

DlHSD 286 pDONRDlHSDi

VEP1 398 pDONRVEP1i

EcP5βR 425 pDONREcP5βRi

DlP5βR 310 pDONRDlP5βRi

1.2.2. Generierung der RNAi Expressions Klone

Die entsprechenden Genfragmente sollten in sense und antisense Orientierung zueinander in

einen pHellsgate8 Vektor rekombiniert werden. Die Ausgangsplasmide wurden mit dem SspI

Enzym geschnitten. Die Entry-Vektoren wurden nach Protokoll von Invitrogen® in die LR-

Reaktion eingesetzt. Mit der Protokoll-Methode konnte keine erfolgreiche Rekombination er-

reicht werden. Die geschnittenen und aufgereinigten Entry-Vektoren wurden wiederum für ei-

nen Tag bei -20 °C gelagert, welches schon unter 1.1.2 positive Auswirkungen auf die Rekom-

bination der Überexpressions-Klone hatte. Anschließend wurde die LR-Clonase Reaktion wie

Ergebnisse

64

beschrieben durchgeführt. Hier konnten alle Genstücke in sense und antisense Orientierung in

den RNAi-Vektor rekombiniert werden. Der zuvor unter 1.1.2 herausgefundene und dargestell-

ten Effekt des vorherigen Gefrierens der linerarisierten Entry-Vektoren konnte somit bestätigt

werden. Dieser war zudem Bedingung einer erfolgreichen Reaktion. Alle pHellsgate8 Rekom-

binanten wurden mit den Primern ME_pH81dir in der sense und mit ME_pH82dir in der anti-

sense Orientierung sequenziert. In nachstehender Abbildung 12 sind die Positionierung und die

Orientierung anhand des EcP5βR Genfragmentes im Vektor dargestellt.

Abbildung 12: Darstellung der Positionierung und die Orientierung der Sequenz des Gen-fragments EcP5βR im pHellsgate8 RNAi Expressionsvektor Sequenzen: Grau hinterlegt = Genfragment EcP5βR; rot eingefärbt = attB-Sites, nicht mar-kierte Sequenz = pHellsgate8 Vektor, MWG Sequenz mit pH81dir Primer gibt die sense- Orientierung im Vektor an; MWG Sequenz mit pH82dir gibt die antisense Orientierung im Vektor an; Vektorkarte : Auschnitt der attR-Kassetten, roter Pfeil = 35S CaMV Promotor, blaue Pfeile = attR- Siten (Abfolge: attR1-attR2, Intron, attR2-attR1), magenta Pfeil = ccdB Gen, schwarzer Strich = Intron, grüner Pfeil = Kanamycin Resistensgen für Pflanzenselek-tion, Primer pH81dir und pH82 dir in magenta Farbe, Restriktionsenzyme in schwarz

Alle erfolgreich analysierten binären Pflanzenvektoren der Überexpressionslinie sowie der

RNAi Linie wurden nach Anleitung in verschiedene Stämme des Agrobacterium tumefaciens

transformiert (s. II.2.3.1). Angewachsene Kolonien wurden mit einer Colony-PCR hinsichtlich

des Inserts überprüft. Bis zur weiteren Verwendung der Pflanzentransformation lagerten die

Bakterien als Glycerolstocks bei -80 °C. Nachstehend sind in Tabelle 7 alle konstruierten Entry-

Vektoren, binären Pflanzenvektoren und positiv transformierte Bakterien zusammengefasst.

Ergebnisse

65 T

abelle 7: Zusam

men

fassung der rekom

binierten Vektoren

Bakterienstämme (Bezeichnung) E. coli Top 10 (K2) C58C1 (L1, L2, L4, Y1, Y3) AGL1 (K1, K2, K3) E. coli DH5α (K3) AGL1 (K1, K2) E. coli DH5α (K3) GV3101 (K4; K5) AGL1 (K1) E. coli DH5α (K2) AGL1 (K1, K2) E. coli DH5α (K1) C58C1 (Y3, Y4, Y026-2; Y026-4) AGL1 (K1, K2, K3) E. coli DH5α (K16) AGL1 (K1, K2) E. coli DH5α (K1) GV3101(K3, K5) AGL1 (K1, K2) E. coli DH5α (K24) AGL1 (K1, K2) E. coli DH5α (K5) GV3101(K1, K2) AGL1 (K1) E. coli DH5α (K3) AGL1 (K1, K2) E. coli DH5α (K4) AGL1 (K2) E. coli DH5α (K6) AGL1 (K1, K2)

Expressionsvektor

pEarly100AthHSD_2 pHellsgate8AthHSD_31 pEarly100EcHSD_3 pHellsgate8EcHSD_2 pEarly100DlHSD_1 pHellsgate8DlHSD_16 pEarly100VEP1_11 pHellsgate8VEP1_24 pEarly100EcP5βR_5 pHellsgate8EcP5βR_3 pEarly100DlP5βR_4 pHellsgate8DlP5βR_6

Bakterienstamm (Bezeichnung) E. coli Top 10 (K4) E. coli DH5α (C7) E. coli Top 10 (K8) E. coli DH5α (K1) E. coli Top 10 (K6) E. coli DH5α (K86) E. coli DH5α (K1) E. coli DH5α (A7) E. coli Top 10 (K19) E. coli DH5α (K1) E. coli DH5α (K86) E. coli DH5α (K8)

Entry-Vektor

pENTRAthHSD_4 pDONR221_AthHSDi_C7 pENTREcHSD_8 pDONR221_EcHSDi_1 pENTRDlHSD_6 pDONR221_DlHSDi_1 pENTRVEP1_8 pDONR221_VEP1i_A7 pENTREcP5βR_19 pDONR221_EcP5βRi_1 pDONRDlP5βR_86 pDONR221_DlP5βRi_8

Verwendung

Überexpression RNAi Überexpression RNAi Überexpression RNAi Überexpression RNAi Überexpression RNAi Überexpression RNAi

Gen

AthHSD EcHSD DlHSD VEP1 EcP5βR DlP5βR

Ergebnisse

66

2. Ergebnisse zu Arabidopsis thaliana

2.1. Das VEP1 Gen

Über den Arabidopsis eFP („electronic fluorescent pictographic“) Browser (Winter et al., 2007)

können Informationen über differentielle Genexpression von Arabidopsis bezogen werden. Für

das VEP1 Gen (At4g24220) konnte die höchste Expressionsrate in reifen Samen verzeichnet

werden und eine ubiquitäre Expression des Gens in allen Pflanzenabschnitten (Abbildung

13, A). Die Expression von At4g24220 wird durch abiotischen Stress, zum Beispiel durch Kälte

(4 °C; Abbildung 13, B), in den Blättern induziert. Die angeführten Daten der differentiellen

Expression wurden in Blättern, Blüten, Stängel und Wurzeln von drei Monate alten A. thaliana

Col-0 Pflanzen ungestresst und nach 36 h Inkubation bei 4 °C getestet. Es wurde eine semi-

quantitative PCR mit cDNA bei einer Annealingtemperatur von 55 °C durchgeführt. In den

untersuchten Pflanzenabschnitten konnte jeweils das VEP1 Gentranskript nachgewiesen wer-

den. Eine Expressionssteigerung im Vergleich zum Kontrollgen Actin nach Kältestress über

36 h konnte durch die Zunahme der Bandenintensität im Agarosegel bestätigt werden (Abbil-

dung 13, C und D).

Ergebnisse

67

Abbildung 13: Expressionsanalyse des At4g24220 Gens Expressionsraten des Arabidopsis eFP Browsers: rot entspricht hohem absoluten Expressions-level, gelb entspricht keiner bis wenig Genexpression: A Entwicklungsabbildung der Genex-pression des VEP1 in Pflanzenabschnitten, B Darstellung der induzierten Expression durch abiotischen Kältestress über 24 h von 18 Tage alten Pflanzen (Bilderquelle: http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi) Semiquantitative PCR Genexpression in Wurzeln (R), Blättern (L) Stängel (S) und Blüten (F) von 3 Monate alten A. thaliana Pflanzen, Aktin als Kontrolle aufgetragen linksseitig von M1

(DNA Marker 100 bp), Expression des VEP1 rechtsseitig von M1 C Genexpression der unge-stressten A. thaliana Pflanze, D Genexpression der A. thaliana Pflanze nach 36 h Kältebehand-lung

Ein weiteres A. thaliana P5βR Gen befindet sich im Locus At5g58750. Dieses ist zu 72 % dem

At4g24220 identisch. Die Datenanalyse über den eFP Browser gab für das At5g58750 eine ge-

ringe bis keine Expression in Blättern von A. thaliana an. Eine Transkription des Gens konnte

in der Wurzel festgestellt werden, welche durch abiotischen Stress, wie Kälte, erhöht wird.

Analog zum VEP1 Gen wurde die Expression des homologen Gens in cDNA von Wurzel, Blatt,

Stängel und Blüte ungestresst und nach 36 h Kältebehandlung untersucht. Für die Amplifizie-

rung wurden die Primer At5g58750dir/At5g58750rev verwendet.

Ergebnisse

68

Abbildung 14: Genexpression von At5g58750 Semiquantitative PCR Genexpression in Wurzeln (R), Blättern (L) Stängel (S) und Blü-ten (F) von 3 Monate alten A. thaliana Pflanzen, Aktin als Kontrolle aufgetragen links-seitig von M1 (DNA Marker 100 bp), Expression des At5g58750 rechtsseitig von M1 A P5βR Genexpression der ungestressten A. thaliana Pflanze, B P5βR Genexpression der A. thaliana Pflanze nach 36 h Kältebehandlung

In der unbehandelten A. thaliana Pflanze konnte in keiner der vier untersuchten Pflanzenorgane

ein Transkript des At5g58750 amplifiziert werden (Abbildung 14, A). Erst nach Kältebehand-

lung konnte in den Wurzeln, Blättern und im Stängel ein Produkt detektiert werden (Abbildung

14, B). Dieses konnte nach Klonierung in den pGEMT-Vektor und anschließender Sequenana-

lyse als At5g58750 identifziert werden (Anhang, VIII.1.3). Für die quantitative Expressions-

analyse wurden für den Nachweis des VEP1 Transkripts in gestressten Pflanzen die Primer

dahingehend gewählt, dass diese spezifisch binden und keine Verfälschung durch At5g58750

besteht.

2.2. Identifizierung homozygoter T-DNA Insertionsmutanten

Die käuflich erworbene SALK T-DNA Pflanzenlinie 597798 (s. II.1.12) der dritten Generation

wurde steril auf LS-Festmediumplatten mit Kanamycin als Selektionsmarker aufgebracht. Ka-

namycin sensitive Pflanzen entwickeln sich mit kleinen, weißen bis hellgrünen Keimblättern

und wachsen über dieses Stadium nicht hinaus (Harrison et al., 2006). Es wurden dunkelgrüne,

resistente Keimlinge nach 17 Tage auf Erde pikiert. Von jeder einzelnen Pflanze wurde mittels

Schnellpräparation genomische DNA extrahiert (s. II.2.1.1) und über PCR untersucht, ob diese

bezüglich der T-DNA-Insertion homozygot oder heterozygot waren. Ein Teil der Samen dieser

Ergebnisse

69

Linie sowie eine zweite SALK T-DNA Pflanzenlinie 568840 (s. II.1.12) wurde an Dr. Christ-

mann von der TU München zur Analyse unter optimalen Anzuchtbedingungen ausgelagert. Je

Pflanze wurden zwei PCR-Reaktionen bei 50 °C mit unterschiedlichen Primer-Kombinationen

angesetzt. Über das online Programm „SALK T-DNA verification primer design“ wurden die

genspezifischen Primer LP097798 und RP097798, welche eine Amplicon von 1230 bp gene-

rierten, ermittelt. Zudem wurde der für die Left-Border T-DNA Insertion spezifische Primer

LBb3.1, welcher in Kombination mit den rechtsseitig von der T-DNA flankierenden RP-Primer

ein PCR-Produkt zwischen 597 bp und 897 bp ergeben sollte, verwendet. Homozygotie bezüg-

lich der Insertion lag dann vor, wenn nur das PCR-Produkt der Primerkombination von LBb3.1

und RP-Primer amplifiziert wurde; Heterozygotie, wenn beide PCR-Produkte detektiert wur-

den, und der Wildtyp, wenn nur das PCR-Produkt der genspezifischen Primer generiert wird.

Nachstehend in der Abbildung 15 ist die Vorgehensweise schematisch dargestellt.

Abbildung 15: Schema der T-DNA Insertionsmutanten LP-Primer- linker genspezifischer Primer, RP- rechter genspezifischer Primer, LBb1.3- T-DNA Left-Border (BP) Primer, BPos- Distanz zwischen BP und der Insertionsstelle (ca. 310 bp); Theoretisches PCR Ergebnis der Zygotieanalyse, LP-und RP-Primer liefert das WT Amplikon, der Bereich zwischen Left-Border Insertion und flankierender genomischer Re-gion wird über das Primerpaar LBb1.3 und RP amplifiziert. Wenn kein WT-Allel amplifiziert werden kann ist die Pflanze für T-DNA Insertion homozygot.

In der T4 Generation konnten keine homozygoten Pflanzen festgestellt werden. Von einer ers-

ten Samen-Charge wurden 62 Samen auf Selektionsplatten aufgebracht. Davon wurden 23

Keimlinge pikiert. Von 19 Pflanzen konnte die DNA extrahiert und analysiert werden. Alle

Pflanzen zeigten in der PCR nur das amplifizierte Wildtyp Allel und wiesen keine T-DNA In-

sertion auf. Von einer zweiten Samen-Charge wurden wiederum 45 Samen zum Keimen auf

Selektionsplatten ausgebracht. Es wurden 5 dunkelgrüne Pflanzen pikiert und auf Erde angezo-

gen. Die Pflanzen wurden der Reihenfolge nach nummeriert. Von den Pflanzen 1, 2, 4 und 5

konnte genomische DNA gewonnen werden. Drei der vier Pflanzen zeigten durch PCR-Ana-

lyse Heterozygotie in Bezug auf die T-DNA Insertion auf (Abbildung 16).

Ergebnisse

70

Abbildung 16: T-DNA Insertionsanalyse der T4 Generation der Pflanzenlinie SALK_597798 M2- DNA Marker 1 kb, a = PCR Ansatz mit LP-und RP-Primer, b = PCR Ansatz mit LBb1.3- und RP-Primer, 1- PCR von gen. DNA der Pflanze 1 (HZ), 2- PCR von gen. DNA der Pflanze 2 (WT), 4- PCR von gen. DNA der Pflanze 4 (HZ), 5- PCR von gen. DNA der Pflanze 5 (HZ)

Die bezüglich der T-DNA-Insertion heterozygoten Pflanzen 1, 4 und 5 wurden zur Blütenbil-

dung und Samenernte im Gewächshaus kultiviert. Die geernteten Samen wurden bis zur Ver-

wendung trocken gelagert. In der T5-Generation wäre die Häufigkeitsverteilung der Merkmale

der verschiedenen Genotypen in den Nachkommen nach der mendelschen Aufspaltungsregel

1:2:1 (HM/WT:HZ:HM/T-DNA) zu erwarten. Samen der drei heterozygoten Pflanzen wurden

auf Selektionsplatten ausgelegt und zum Keimen gebracht. Ein Überblick über die ausgebrachte

Samenanzahl und Keimung ist in nachfolgender Tabelle 8 zusammengefasst.

Tabelle 8: Überblick über ausgebrachte Samen der Pflanzeninsertionsline SALK_597798 PFN = Pflanzen Nummer

Pflanzenlinie Samenanzahl Anzahl der Keimlinge

pikierte Pflanzen

Anzahl der Pflanzen für DNA Extrat-kion

Zygotie-Analyse

SALK_597798 PFN1 HZ

120 88 9 1 WT

SALK_597798 PFN4 HZ

67 52 10 0 /

SALK_597798 PFN5 HZ

244 178 20 10 WT: 4 HZ: 6

Ergebnisse

71

Im ersten Anlauf konnten keine homozygoten Pflanzen identifiziert werden. Es wurden noch-

mals 50 Samen der SALK_597798 PFN5 HZ auf Selektionsplatten ausgebracht und 24 Keim-

linge nach 17 Tagen auf Erde überführt. Genomische DNA wurde von 21 Pflanzen isoliert und

analysiert.

Abbildung 17: T-DNA Insertionsanalyse der T5 Generation der Pflanzenlinie SALK_597798 PFN5 HZ M1- DNA Marker 100 bp; M2- DNA Marker 1 kb; a = PCR Ansatz mit LP-und RP-Primer, b = PCR Ansatz mit LBb1.3- und RP-Primer; 3- PCR von gen. DNA der Pflanze 3 (HM), 5- PCR von gen. DNA der Pflanze 5 (HM), 6- PCR von gen. DNA der Pflanze 6, 10- PCR von gen. DNA der Pflanze 10 (WT), 13- PCR von gen. DNA der Pflanze 13 (WT), 14- PCR von gen. DNA der Pflanze 14, 16- PCR von gen. DNA der Pflanze 16 (HM), 18- PCR von gen. DNA der Pflanze 18 (WT), 20- PCR von gen. DNA der Pflanze 20 (WT), 21- PCR von gen. DNA der Pflanze 21 (HZ)

Von den 21 getesteten Pflanzen konnten drei als Homozygot (Nr. 3, 5 und 16), eine als Hete-

royzgot (Nr. 21) und Nr. 13 als Wildtyp identifiziert werden (Abbildung 17). Das PCR Produkt

(b) der Pflanze Nr. 3 wurde in den pGEMT-Vektor zur Sequenzüberprüfung der T-DNA Inser-

tion kloniert. Die Sequenz (Abbildung 18) konnte mittels geeigneter Online-Programme analy-

siert werden (s. II.2.7).

Ergebnisse

72

Abbildung 18: T-DNA Insertion SALK_597798 im VEP1 Gen Bearbeitete Nukleotidsequenz des 762 bp klonierten PCR-Stücks (3b) In Gelb gehalten sind der LBb1.3 und RP097798 Primer; blau markiert ist die inserierte T-DNA Sequenz nach Analyse über ein CLUSTAL W Sequenzalignment mit der pROK2-Vek-tor Sequenz (http://signal.salk.edu/pBIN-pROK2.txt-new); rot eingefärbt wurde die unter http://www.ebi.ac.uk/Tools/dbfetch/dbfetch?db=emblsva&id=BH902630 hinterlegte T-DNA flankierende Sequenz; mittels BLAST Suche wurde die restliche Sequenz der VEP1 Gensequenz zugeordnet (Accessionnr.: EF579963)

Die Insertionsstelle der T-DNA konnte zwischen dem 153 und 154 Nukleotid des At4g24220

Gens am Anfang des zweiten Exons lokalisiert werden. Inwieweit die Transkription durch die

eingefügte Fremd-DNA beeinflusst wurde, sollte zunächst durch RNA-Isolation und cDNA

Generierung mit anschließender Standard-PCR aller drei homozygoten Pflanzen untersucht

werden. Es wurden zwei PCR-Ansätze für jede cDNA durchgeführt. Zur Überprüfung der Tran-

skription von RNA in cDNA wurde auf das Kontrollgen Actin in einem PCR Ansatz geprüft.

Der zweite Ansatz wurde mit genspezifischen VEP1 Primern versetzt. Die Annealingtempera-

tur wurde auf 55 °C eingestellt.

Ergebnisse

73

Abbildung 19: PCR Agarosgel-Analyse der Transkription des VEP1 der homozygoten T-DNA Insertionspflanzen M1- DNA Marker 100 bp; M2- DNA Marker 1 kb; Template SALK_597798 PFN3 HM: 1- PCR Ansatz mit Actin-Primern, 2- PCR Ansatz mit VEP1-Primern; Template SALK_097798 PFN5 HM: 3- PCR Ansatz mit Actin-Primern, 4- PCR Ansatz mit VEP1- Primern; Template SALK_597798 PFN16 HM: 5- PCR Ansatz mit Actin-Primern, 6- PCR Ansatz mit VEP1-Primern;

Durch den Nachweis des Kontrollgens Actin in allen drei Ansätzen (Abbildung 19; Agarose-

gelbahnen 1, 3 und 5) konnte eine erfolgreiche RNA-Transkription nachgewiesen werden. Der

homozygoten Pflanze Nr. 3 (SALK_597798 PFN3 HM) konnte kein Transkript des VEP1 mit-

tels PCR nachgewiesen werden (Abbildung 19; Agarosegelbahn 2) und konnte daher als „knock

out“ bezeichnet werden. Hingegen wurde bei der homozygoten Pflanze Nr. 5 (SALK_597798

PFN5 HM) und Nr. 16 (SALK_597798 PFN16 HM) ein amplifiziertes Produkt in Höhe von

1200 bp detektiert (Abbildung 19; Agarosegelbahnen 4 und 6), welches der Größe des VEP1

entspricht. Eine Klonierung in den pGEMT-Vektor konnte nicht erfolgreich durchgeführt wer-

den, daher war ein Ausschluss des PCR-Produkts als VEP1 Transkript nicht möglich. Es wurde

die SALK_597798 PFN3 HM Linie für weitere Versuche verwendet. Zudem konnten durch die

Auslagerung von Samen der Linie SALK_597798 und SALK_568840 an den Lehrstuhl der

Botanik an der TUM durch den Arbeitskreis von Dr. Christmann homozoygote Pflanzenlinien

erhalten werden. Es wurden die homozygoten Pflanzenlinien SALK_597798 T5/1, T5/2 und

T5/3 sowie die SALK_568840 T4/5 Linie zur Verfügung gestellt. Zur Insertionsüberprüfung

wurden die SALK_597798 Linien analog wie beschrieben analysiert und die Homozygotie

konnte bestätigt werden. Die isolierte genomische DNA von einer angezogenen Pflanze der

SALK_568840 T4 Linie wurde analog der beschriebenen Vorgehensweise mit anderen Primer

Paarungen durchgeführt. Die Primerkombination #1102 (AT4g24220r) und #1103

(AT4g24220f) amplifiziert das WT-Amplikon von 563 bp. Zur Überprüfung der Insertion

Ergebnisse

74

wurde der Primer #220 (JMLBa1) mit dem #1103 Primer kombiniert. Mittels Agarosegelelekt-

rophorese konnte das erwartete Produkt von 622 bp für den Bereich zwischen Left-Border In-

sertion und flankierender genomischer Region detektiert werden (Abbildung 20; VIII.1.4). Die

Homozygotie dieser Linie konnte bestätigt werden.

Abbildung 20: T-DNA Insertionsanalyse der T4 Generation der Pflanzenlinie SALK_568840 T4/5 M1- DNA Marker 100 bp; M2- DNA Marker 1 kb; 1- PCR Ansatz mit #1102 (AT4g24220r) und #1103(AT4g24220f) zur Amplifizierung des WT Amplikons, 2- PCR Ansatz mit #220 (JMLBa1) und #1103 Primer zur Überprüfung der Insertion

2.3. Überprüfung der homozygoten Transformationslinie AthVvP5βR

Am FEM-IASMA Institut wurden in der Arbeitsgruppe von Dr. Stefan Martens und Michael

Malnoy A. thaliana mittels Agrobakterien (EHA105), welche den binären Vektor pK7WG2 mit

inserierter Vitis vinifera Progesteron-5β-reduktase 1 full length cDNA (VvP5βR; JF460012.1)

enthielten, über die Floral Dip-Methode (s. II.2.4.4) transformiert. Die Samen dieser Linie wur-

den zur Selektion auf MS Medium mit Kanamycin ausgebracht und weiter analysiert. Homozy-

gote Pflanzen der F3-Generation wurden für weitere Experimente zur Verfügung gestellt. Am

FEM-IASMA Institut wurde von sechs als homozygot bezeichneten Transformationslinien

gDNA isoliert und mittels PCR auf die inserierte Vektor-DNA überprüft. Es wurden die Primer

35SR und 35S zur Überprüfung der Transformationinsertion verwendet. Die Annealingtempe-

ratur wurde auf 58 °C eingestellt.

Ergebnisse

75

Abbildung 21: PCR Agarosegel-Analyse homozygoter Überexpressionspflanzen AthVvP5βR M3- DNA Marker 1 kb Plus; Amplifizierung der 35S-Promotorregion des pK7WG2::VvP5βR Vektors mit 35SR und 35SL Primern: 1- gDNA von AthVvP5βR Linie P2; 2- gDNA von AthVvP5βR Linie P4; 3- gDNA von AthVvP5βR Linie P5; 4- gDNA von AthVvP5βR Linie P6; 5- gDNA von AthVvP5βR Linie P7; 6- gDNA von AthVvP5βR Linie P8; 7- gDNA von A. thaliana Col-0;

In allen AthVvP5βR Überexpressionspflanzenlinien konnte ein PCR-Produkt in Höhe von

300 bp detektiert werden (Abbildung 21). Der PCR Ansatz mit eingesetzter A. thaliana Col-0

gDNA zeigte kein amplifiziertes Produkt (Abbildung 21, Agarosegelbahn Nr. 7).

2.4. Morphologische Charakterisierung der Arabidopsis Pflanzenmutanten

2.4.1. Analyse des Gefäßsystems (Vein Patterning) der Kotyledonen

Basierend auf der Arbeit von Jun et al., 2002, welche eine gestörte Nervatur Anordnung in

Blättern von A. thaliana Transformanten mit einem VEP1 antisense Konstrukt beschreibt,

wurde die Nervatur der Kotyledonen von 14 Tage alten Keimlingen der homozygoten T-DNA

Insertionslinien SALK_597798 und SALK_568840, von A. thaliana Col-0 und der Überex-

pressionsmutante AthVvP5βR, nach Chlorophyllentzug unter einem Präparationsmikroskop,

betrachtet (s. II.2.4.5). Pro Linie wurden von jeweils über 200 Pflanzen beide Keimblätter hin-

sichtlich ihrer Gefäßsystemanordnung in verschiedene Kategorien eingeteilt. Zunächst wurde

die Nervatur jedes Keimblattes nach intakt „Ausbildung von geschlossenen Areolen“ oder ge-

stört „Ausbildung von sekundären Leitbündel ohne Endpunkt“ eingestuft (Abbildung 22). Die

Mittelvene (mv) war in keiner Pflanzenlinie abnormal. Die beobachtete gestörte Ausbildung

der Nervatur wurde in der distalen sekundären Vene (ds) bzw. proximalen sekundären Vene

(ps) beobachtet (Abbildung 24, A bis H). Anschließend wurde die Pflanze mit beiden Kotyle-

Ergebnisse

76

donen betrachtet. Hier wurden die Pflanzen in in drei Kategorien eingeteilt: (a) beide Keimblät-

ter besitzen vollständig geschlossene Areolen, (b) ein Keimblatt besitzt vollständig geschlos-

sene Areolen und eines eine gestörte Nervatur und (c) beide Keimblätter besitzen eine gestörte

Nervatur (Abbildung 22 und Abbildung 23). Die nachstehenden Diagramme veranschaulichen

beide Betrachtungsweisen.

Abbildung 22: Verhältnis der Gefäßausbildung in den Kotyledonen Anzahl der Keimblätter mit intakter Nervatur (schwarz); Anzahl der Keimblätter mit gestörter Nervatur (grau), Ordinate: Anzahl der betrachteten Keimblätter unabhängig voneinander; Abszisse: untersuchte Pflanzenlinien (links nach rechts): A. thaliana Col-0 (Col-0 WT), Über-expressionsmutante AthVvP5βR, T-DNA Insertionsmutante SALK_597798, T-DNA Inserti-onsmutante SALK_568840

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

Anz

ahl d

er K

eim

blät

ter intakte Nervatur

gestörte Nervatur

Ergebnisse

77

Abbildung 23: Verhältnis der Gefäßausbildung in beiden Kotyledonen Ordinate: Anzahl der betrachteten Pflanzen (Keimblätter abhängig voneinander); Abszisse: untersuchte Pflanzenlinien (links nach rechts): A. thaliana Col-0 (Col-0 WT), Überexpressi-onsmutante AthVvP5βR, T-DNA Insertionsmutante SALK_597798, T-DNA Insertionsmu-tante SALK_568840

In Abbildung 22 wiesen 22 % der betrachteten Kotyledonen des Wildtyps ein abnormales Ge-

fäßsystem auf. Die Überexpressionsmutante AthVvP5βR zeigte sich ähnlich wie der Col-0 WT

mit 13 % gestörter Nervatur der Keimblätter. Die T-DNA Insertionslinie SALK_597798 zeigte

ein Verhältnis von normaler Nervatur zur abnormaler Nervatur von 1:1. Dieses war bei der

zweiten T-DNA Insertionslinie SALK_568840 mit 1,5:1 zu beziffern. Betrachtet man beide

Keimblätter einer Pflanze in Kombination erhält man eine differenziertere Auswertung (Abbil-

dung 23).

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180A

nzah

l der

Pfla

nzen

normale Nervatur beiderKeimblätter

je ein Keimblatt mitnormaler und gestörterNervatur

gestörte Nervatur beiderKeimblätter

Ergebnisse

78

Nachstehende Tabelle stellt die relativen Häufigkeiten dar.

Tabelle 9: Verhältnis der Gefäßausbildung in beiden Kotyledonen

Pflanzenlinie Gefäßausbildung beider Kotyledonen nach

(n = Anzahl der Pflanzen) (a) (b) (c)

AthCol-0 WT (n = 217) 63,6 % 27,6 % 8,8 %

AthVvP5βR (n = 207) 75,4 % 22,2 % 2,4 %

SALK_597798 (n = 208) 26,0 % 42,3 % 31,7 %

SALK_568840 (n = 201) 38,8 % 47,3 % 13,9 %

Im Vergleich der SALK_597798 Insertionslinie zur SALK_568840 Insertionslinie weist diese

doppelt so viele Pflanzen mit zwei abnormalen Keimblättern auf. Der Prozentsatz dieser Pflan-

zen geht in der Überexpressionsmutante auf 2,4 % zurück. Ein deutlicher Unterschied zwischen

dem A. thaliana Col-0 und AthVvP5βR konnte nicht ermittelt werden. Prozentual betrachtet

wurden 64 % der Pflanzen mit intakter Nervatur beider Keimblätter des Wildtyp und 75 % der

Überexpressionsmutante gezählt, die Anzahl der Pflanzen mit zwei verschiedener Nervatur-

ausprägungen der Keimblätter mit 28 % (Col-0 WT) und 22 % (AthVvP5βR) lag im gleichen

Bereich. Im Unterschied konnte eine Erhöhung der Pflanzen mit zwei abnormalen Keimblättern

von 2,4 % (AthVvP5βR) auf 8,8 % (Col-0 WT) abgelesen werden. Eine Differenzierung konnte

hinsichtlich der Anzahl an ausgebildeten Areolen herausgearbeitet werden. Während der Wild-

typ eine geschlossene Nervatur von zwei bis vier Areolen aufweist (Abbildung 24, A und B),

konnten bei der Überexpressionsmutante bis zu sechs Areolen beobachtet werden (Abbildung

24, C und D). Zudem konnte eine Pflanzenmutation von drei Keimblättern (Abbildung 24, E),

ausschließlich bei AthVvP5βR Keimlingen, was 0,01 % der betrachteten AthVvP5βR Pflanzen

entspricht, detektiert werden.

Ergebnisse

79

Abbildung 24: Kotyledonen Nervatur A Normale Nervatur eines Keimblattes von Arabidopsis thaliana Col-0 mit vier Areolen, mv = Mittelvene, ds = distale sekundäre Vene, ps = proximale sekundäre Vene, d = distale Are-ole, p = proximale Areole; B Nervatur eines Keimblattes von A. thaliana Col-0 mit drei Are-olen; C Keimblatt der Überexpressionsmutante AthVvP5βR mit 6 ausgebildeten Areolen und 5 ausgebildeten Areolen (D); E- AthVvP5βR Keimling mit drei Kotyledonen; Keimblätter mit gestörter Gefäßsystemausbildung (F-H): F Keimblatt von T-DNA Insertionslinie SALK_597798 mit zwei geschlossenen distalen Areolen und zwei proximalen sekundärve-nen ohne Endpunkt; G Nervatur eines Keimblattes der SALK_568840 Linie mit einer nicht geschlossenen ps Vene und (H) einer offenen ds Vene (Bilder ©Ernst)

Ferner wurde in der AthVvP5βR Überexpressionslinie eine Zunahme der ausgebildeten Areolen

im Kotyledon detektiert. Über die Hälfte der betrachteten Blätter (304 von 450) hatten vier

Areolen (Col-0 WT: 161/435), fünf geschlossene Bereiche wiesen 40/450 Blätter auf und sechs

Areolen kamen bei 12/450 vor. Zur weiteren Analyse wurde neben A. thaliana Col-0 und der

Überexpressionsmutante die T-DNA Insertionsmutante SALK_597798 weiter verwendet.

Diese zeigte den stärker ausgeprägten Phänotyp in der Nervatur der Keimblätter.

Ergebnisse

80

2.4.2. Untersuchung und Bestimmung auf die Entwicklung von Blättern und Wurzeln

Da das VEP1 Gen Einfluss auf die Ausbildung der Nervatur in Keimblättern besitzt, wurden

zusätzlich morpholgische Merkmale der Blätter und der gesamten Blattrosette der Überexpes-

sionsmutante AthVvP5βR und der T-DNA Insertionslinie SALK_597798 im Vergleich zu

A. thaliana Col-0 untersucht.

Tabelle 10: Blattanzahl, Blattrosettendurchmesser und Blattfläche 45 Tage alter Pflanzen Angegeben sind die Standardabweichung (± SE) und Anzahl der Pflanzen (n); Arabidopsis thaliana Col-0 wird als Wildtyp bezeichnet.

Wildtyp

(n = 257)

AthVvP5βR

(n = 272)

SALK_597798

(n = 102)

Blattanzahl 17,0 ± 2,4 16,5 ± 2,7 16,3 ± 2,3 Rosettendurchmesser [cm] 8,2 ± 1,2 7,6 ± 1,8 7,0 ± 1,4 Blattfläche [cm2] 6,5 ± 3,5 7,7 ± 3,1 6,4 ± 2,7

Wie in Tabelle 10 aufgeführt ist, konnte kein statistisch signifikanter Unterschied in Bezug auf

Blattanzahl, Rosettendurchmesser oder Blattfläche ermittelt werden. Alle drei Pflanzenlinien

wiesen ähnliche Blattanatomie auf. Auch Wurzeln zählen neben Blättern zu den wichtigsten

Pflanzenorganen. Zur Betrachtung der Wurzellängen bei Keimlingen wurden 12 Tage alte

Keimlinge, die senkrecht auf Nähragar gewachsen waren, untersucht. Dabei konnte festgestellt

werden, dass die Länge der Keimlingswurzel der „knock out“ Linie des VEP1 Gens sowie die

der Überexpressionslinie AthVvP5βR im Vergleich zur Wurzellänge des Wildtyps in Tabelle

11 keinerlei statistisch signifikante Unterschiede (t-Test, p>0,05) aufzeigte.

Tabelle 11: Wurzellänge der Arabidopsis thaliana Pflanzen

Wildtyp (n = 107)

AthVvP5βR (n = 156)

SALK_597798 (n = 100)

Wurzellänge [cm] 1,6 ± 0,5 1,3 ± 0,6 1,2 ± 0,3

2.5. Proteinchemische Analyse und Einfluss von Methylvinylketon

Die physiologische Rolle des Gens sollte weiter ermittelt werden. Mit MVK behandelte

A. thaliana Col-0 zeigten eine induzierte Genexpression des HEL (PR4) Gens (Potter et al.,

1993). Der Einfluss des AtP5βR auf das HEL nach Inkubation mit MVK sollte mittels Überex-

pressionsmutante und „knock out“ Linie untersucht werden. Hierzu wurden beide Pflanzenli-

nien mit A. thaliana Col-0 (Wildtyp) verglichen. Es wurden unbehandelte Pflanzen sowie mit

MVK behandelte Pflanzen nach 3 h und 24 h Inkubation für Proteinextraktion aus Pflanzen-

blättern sowie RNA Isolierung verwendet (II.2.4.7., II.2.4.8, II.2.1.2)

Ergebnisse

81

2.5.1. Das HEL (PR4) Gen

Über den eFP Bowser wurden die Expressionsraten des HEL (PR4) Gens (At3g04720) verifi-

ziert (Abbildung 25, A). Angegeben wurde eine mittlere Transkriptionsrate in den Blättern. Zur

Überprüfung wurde RNA von unbehandelten Arabidopsis Pflanzen und mit MVK behandelten

Pflanzen, nach 3 h und 24 h, isoliert und in cDNA umgeschrieben. Anschließend wurde eine

Standard-PCR durchgeführt mit Primern abgeleitet von At3g04720 sowie Actin als Kontrolle.

Das erhaltene PCR Produkt auf Höhe von 600 – 650 bp wurde zur Sequenzierung kloniert und

konnte nach Homologiesuche über BLAST dem HEL (PR4) zugeordnet werden(Abbildung 25,

B und C).

Abbildung 25: Expressions- und Sequenzanalyse des At3g04720 Expressionsraten des Arabidopsis eFP Browsers: rot entspricht hohem absoluten Expressi-onslevel, gelb entspricht keiner bis wenig Genexpression: A Entwicklungsabbildung der Ge-nexpression des HEL (PR4) in Pflanzenabschnitten (Bildquelle: http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi), B Darstellung der Expression durch MVK nach 3 h und 24 h von 18 Tage alten Pflanzen; M1- DNA Marker 100 bp; Template cDNA der Kontrollpflanze: 1- PCR Ansatz mit HEL-Primern, 2- PCR Ansatz mit Actin-Primern; Template cDNA 3 h MVK inkubierte Pflanze: 3- PCR Ansatz mit HEL-Primern, 4- PCR Ansatz mit Actin-Primern; Template cDNA 24 h MVK inkubierte Pflanze: 5- PCR Ansatz mit HEL -Primern, 6- PCR Ansatz mit Actin-Primern; C Bearbeitete Nukleotidsequenz des 635 bp klonierten PCR-Stücks: blau = HEL Primerpaar; gelb = markierte HEL (PR4) cDNA, schwarz = Klonierungsvektor pGEMT Sequenz

Ergebnisse

82

2.5.2. Progesteron-5β-Reduktase Gesamtenzymaktivität in planta

Zur Bestimmung der Enzymaktivität des VEP1 von Arabidopsis thaliana Col-0, Überexpressi-

onsmutante AthVvP5βR und „knock out“ SALK_597798 wurde jeweils Pflanzenrohextrakte

von unbehandelten, sowie mit MVK behandelten (3 h und 24 h) Pflanzen hergestellt. Parallel

wurden jeweils Proben für RNA-Extraktion mit anschließender Genexpressionsanalysen über

qPCR abgenommen. Die spezifische Aktivität wurde für Progesteron mit dem Cosubstrat

NADPH in einem regenerierenden System mittels GC-Analyse bestimmt (II.2.5; II.2.6.2).

Exemplarisch wurde je ein Assay der Pflanzenlinien auf DC aufgetragen und analysiert (Ab-

bildung 26).

Abbildung 26: DC Analyse von AtP5βR Aktivität der Pflanzenrohextrakte Detektion mit Anisaldehyd-Tauchreagenz (100 °C, 5-10 min), R = Referenzen; R1- Proges-teron (Rf = 0,5), R2- 5β-Pregnan-3,20-dion (Rf = 0,6), R3- 5β-Pregnan-3β-ol-20-on (Rf = 0,4), R4- 5β-Pregnan-3α-ol-20-on (Rf = 0,3); 1- aktiver Assay aus AthCol-0 Rohextrakt mit 0,3 mM Progesteron, 2- aktiver Assay aus AthVvP5βR Rohextrakt mit 0,3 mM Progesteron, 3- aktiver Assay aus SALK_597798 Rohextrakt mit 0,3 mM Progesteron, 4- Negativkon-trolle von AthCol-0 Rohextrakt (100 °C, 10 min) mit 0,3 mM Progesteron

Es konnte für den Wildtyp sowie für die Überexpressionsmutante eine P5βR-Aktivität nachge-

wiesen werden. Im nachstehenden Gaschromatogramm (Abbildung 27) ist exemplarisch ein

Rohextraktassay von A. thaliana Col-0 dargestellt, weitere Chromatogramme befinden sich zur

jeweiligen Pflanzenlinie im Anhang VIII.2, Abbildung 58 und Abbildung 59.

Ergebnisse

83

Abbildung 27: GC-MS Chromatogramm von Arabidopsis thaliana Col-0 Rohextraktassay A Negativkontrolle von AthCol-0 Rohextrakt (100 °C, 10 min) mit 0,3 mM Progesteron, B aktiver Assay aus AthCol-0 Rohextrakt mit 0,3 mM Progesteron; 1- 5β-Pregnan-3α-ol-20-on (Rt= 9,71), 2- 3-Hydroxy-5-Pregnen-20-on (Rt= 9,75), 3- 5β-Pregnan-3,20-dion (Rt= 9,91), 4- Progesteron (Rt= 10,61), 5- Interner Standard 21-Hydroxypregnenolon (Rt= 12,42)

Bei einer Retentionszeit von 9,9 min konnte das Produkt 5β-Pregnane-3,20-dion detektiert wer-

den. Das Folgeprodukt 5β-Pregnane-3α-ol-20-on konnte bei einer Retentionszeit von 9,7 min

nachgewiesen werden. Dieses entsteht im postulierten Cardenolidbiosyntheseweg über eine Re-

duktionsreaktion der 3β-Hydroxysteroiddehydrogenase 3β-HSD unter Verwendung von der

5β-Progesteron-Reduktase gebildeten Produktes (s. I.1.1; Abbildung 2). Eine P5βR-Aktivität

konnte in der T-DNA Insertionslinie SALK_597798 nicht nachgewiesen werden (s. Anhang

VIII.2, Abbildung 59). Auch mit MVK gestressten Pflanzenproteinextrakt konnte keine P5βR-

Aktivität in der T-DNA Insertionslinie SALK_597798 verzeichnet werden. Die spezifische Ak-

tivität wurde für den Wildtyp sowie die Überexpressionsmutante von A. thaliana bestimmt (Ab-

bildung 28).

Ergebnisse

84

Abbildung 28: P5βR-Aktivität in Pflanzenrohextrakten Assays mit Progesteron (0,3 mM) als Substrat über 5 h bei 40 °C. Die spezifische Aktivität wurde mit GC-MS bestimmt. Die Mittelwerte stammen aus drei unabhängigen Messungen von je drei generierten Rohextrakten mit entsprechenden Standardabweichungen. A. thali-ana Col-0 = Col-0 WT

Zwischen der Aktivität des P5βR Enzym im ungestressten Rohextrakt der Überexpressionsmu-

tante zum Wildtyp konnte eine leichte Erhöhung, welche aber nicht signifikant ist, festgestellt

werden. Die Aktivität der unterschiedlich behandelten Rohextrakte des Wildtyps zeigten keinen

deutlichen Unterschied auf, jedoch ging die Aktivität nach 3h Inkubation zurück. Nach Behand-

lung der Pflanzen der AthVvP5βR mit MVK konnte eine reduzierte P5βR-Aktivität detektiert

werden. Ein Unterschied zwischen Wildtyplinie und Überexpressionslinie von Arabidopsis

konnte nicht festgestellt werden.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

Col-0 WT AthVvP5βR1

spez

ifisc

he A

ktiv

ität i

n [n

kat/m

g]

Kontrolle3h MVK24h MVK

Ergebnisse

85

2.6. Genexpression von unbehandelten und mit MVK behandelten Pflanzenlinien

Die Transkriptionsrate von VEP1 nach 3 h und 24 h Stressinduktion wurde mittels qPCR be-

stimmt und mit der Genexpressionsrate in nicht gestressten Pflanzen verglichen. Es sollte zu-

dem die Auswirkung von VEP1 auf das HEL (PR4), betrachtet werden. Alle über qPCR Primer

amplifizierten Produkte wurden zur Überprüfung kloniert und sequenziert (s. Anhang,

VIII.1.5).

Abbildung 29: Transkriptionsrate des VEP1 Gens Vergleich der Transkriptionsrate von VEP1 nach 3h und 24 h MVK Stressinduktion in Blät-tern mittels qPCR. Die Ergebnisse wurden bezogen auf die Werte für die Transkriptionsrate von Actin. Die Mittelwerte von drei unabhängigen Messungen der Transkriptionsrate mit den entsprechenden Standardabweichungen sind dargestellt. Arabidopsis thaliana Col-0 = Col-0 WT; Die Signifikanz wurde mittels T-Test berechnet und Werte p < 0,05 wurden als signifi-kant markiert: * = signifikanter Unterschied in Bezug auf Kontrollwerte in der jeweiligen Pflanzenlinie; x = signifikanter Unterschied Kontrolle der Pflanzenlinien zur Col-0 Kon-trolle; + = signifikanter Unterschied nach 3h MVK der Mutationslinie zu Col-0 WT; □ = sig-nifikanter Unterschied nach 24h MVK der Mutationslinie zu Col-0 WT

0

10

20

30

40

50

Col-0 WT AthVvP5βR SALK_597798

Tra

nskr

iptio

nsra

te d

es V

EP

1

PflanzenlinienKontrolle 3 h MVK 24 h MVK

x

+

*

*

*

□

Ergebnisse

86

Abbildung 30: Transkriptionsrate des HEL (PR4) Gens Vergleich der Transkriptionsrate von HEL (PR4) nach 3 h und 24 h MVK Stressinduktion in Blättern mittels qPCR. Die Ergebnisse wurden bezogen auf die Werte für die Transkrip-tionsrate von Actin. Die Mittelwerte von drei unabhängigen Messungen der Transkriptions-rate mit den entsprechenden Standardabweichungen sind dargestellt. Arabidopsis thaliana Col-0 = Col-0 WT; Die Signifikanz wurde mittels T-Test berechnet und Werte p < 0,05 wurden als signifikant markiert: * = signifikanter Unterschied in Bezug auf Kontrollwerte in der jeweiligen Pflanzenlinie; ° = signifikanter Unterschied zwischen den Daten nach 3 MVK und 24 MVK innheralb einer Pflanzenlinie; x = signifikanter Unterschied Kontrolle der Pflanzenlinien zur Col-0 Kontrolle; + = signifikanter Unterschied nach 3h MVK der Muta-tionslinie zu Col-0 WT; □ = signifikanter Unterschied nach 24h MVK der Mutationslinie zu Col-0 WT

Im direkten Vergleich zwischen ungestressten und gestressten Pflanzen der Wildtyplinie und

der Überexpressionslinie konnte ein signifikanter (p < 0,05) Unterschied in der Expressionsrate

des VEP1 zur Kontrolle der jeweiligen Pflanzenlinie intern festgestellt werden (Abbildung 29).

Dabei verhielten sich die Daten des Wildtyps und der Überexpressionsmutante gleich. Auf

Grund der hohen Standardabweichung zwischen den Werten „3 h MVK Inkubation“ und Kon-

trolle des Wildtyps konnte keine Signifikanz berechnet werden. Für die SALK_597798 T-DNA

Insertionslinie wurde eine geringe Menge an Transkript detektiert, welches Innerhalb der Pflan-

zenlinie nicht siginfikant war. Im Vergleich der jeweiligen Datenpaar der „knock-out“ Linie

zum Wildtyp (Kontrolle, 3h MVK, 24 h MVK) ergab der T-Test jeweils einen deutlich unter

0,05 liegenden signifikanten Wert. In Bezug auf die Transkriptionsrate des HEL (PR4), in Ab-

bildung 30, konnte im Wildtyp eine siebenfache Erhöhung dieser nach 24 h Inkubation mit

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

Col-0 WT AthVvP5βR SALK_597798

Tra

nskr

iptio

nsra

te d

es H

EL

(PR

4)

Pflanzenlinien

Kontrolle 3 h MVK 24 h MVK

° * °

* °

* ° +

x

□* °

Ergebnisse

87

MVK ermittelt werden. Zwischen Kontrollpflanzen und Pflanzen nach 3 h Stressinkubation

wurde kein deutlicher Unterschied in der Expression des Gens festgestellt. Die Pflanzenlinie

AthVvP5βR war gleich dem Wildtyp. In der Pflanzeninsertionslinie SALK_597798 wurde ein

14-facher Anstieg der Genexpression schon nach 3 h MVK Inkubation verzeichnet, welcher

nach 24 h auf das Niveau des Wildtyps nach 3 h Stressaussetzung herabsank, dennoch ca. fünf-

fach höher liegt als die Kontrolle der T-DNA Linie.

2.7. Generierung und Überprüfung transformierter Arabidopsis thaliana Pflanzen

A. thaliana Col-0 sowie SALK_597798 wurden zur Transformation mit binären Vektoren

durch A. tumefaciens verwendet. In nachstehender Tabelle 12 sind die gedippten Pflanzenlinien

aufgeführt.

Tabelle 12: Generierte A. thaliana Pflanzenlinien a) OE = Überexpressionslinie b) C = Komplementation der VEP1 T-DNA Insertion; A. thaliana Col-0 = Ath Col-0

Verwendete Pflanzenlinie Binärer Vektor Bakterienstamm

Resistenz der Pflanze

Name der generier-ten Linie

Ath Col-0 p100VEP1 GV3101/AGL1 BASTA AthVEP1_OE a)

Ath Col-0 p100EcP5βR GV3101 BASTA AthEcP5βR_OE

Ath Col-0 p100DlP5βR GV3101 BASTA AthDlP5βR_OE

Ath Col-0 pHellsgateVEP1 AGL1 Kan AthVEP1_RNAi

Ath Col-0 pHellsgateEcP5βR AGL1 Kan AthEcP5βR_RNAi

Ath Col-0 pHellsgateDlP5βR AGL1 Kan AthDlP5βR_RNAi

SALK_597798 p100VEP1 AGL1 BASTA S98_VEP1_C b)

SALK_597798 p100EcP5βR AGL1 BASTA S98_EcP5βR_C

SALK_597798 p100DlP5βR AGL1 BASTA S98_DlP5βR_C

Zur Analyse wurden die zuerst gewonnen Samen der Linien AthVEP1_OE, AthEcP5βR_OE

und AthDlP5βR_OE ausgesät und Keimlinge zur Selektion mit BASTA besprüht. 21 Pflanzen

der AthEcP5βR_OE, drei Pflanzen der Linie AthVEP1_OE und 8 Pflanzen der AthDlP5βR_OE

wurden pikiert und analysiert. Für PCR Analysen wurde genomische DNA mittels Schnellprä-

peration gewonnen, eingesetzt. Es wurde auf das Resistenzgen bar mittels BARdir/BARrev

Primer geprüft.

Ergebnisse

88

Abbildung 31: PCR Nachweis des bar Gens von transformierten Pflanzen M1- DNA Marker 100 bp; 1- PCR Ansatz AthEcP5βR_OE Pflanze 16; 2- PCR Ansatz mit Col-0 WT DNA: 3- PCR Ansatz AthDlP5βR_OE Pflanze 3; 4- PCR Ansatz AthVEP1_OE Pflanze 3; 5- PCR Ansatz Kontrolle pEarly100 Vektor

Exemplarisch wurden von den PCR-Ansätzen der Pflanzen jeder getesteten F1-Linie zur Dar-

stellung auf ein Agarosegel aufgetragen. Als Positivkontrolle wurde der pEarly100 Vektor ver-

wendet (Abbildung 31; Bahn 5). Alle aufgetragenen Pflanzen zeigten ein Amplifikat auf Höhe

der Kontrolle, auch der Wildtyp zeigte ein abgeschwächtes Produkt. Aufgereinigte PCR An-

sätze wurden in den pGEMT-Vektor zur Sequenzierung kloniert. Einzig das PCR Amplifikat

von AthEcP5βR_OE Pflanze 16 (Abbildung 31; Bahn 1) konnte mittels Sequenzalignment mit

der pEarly100 Vektorsequenz des bar Gen als transgen identifiziert werden (Abbildung 32).

Ergebnisse

89

Abbildung 32: Darstellung Sequenzalignment mittels Clustal W pEarly100 = Vektorsequenz des binären Überexpressionsvektor Basenpaarabschnitt 360 bis 840 entspricht bar BlpR; AthEcP5βR_OE = Insert Sequenz der Überexpressionsmutante AthEcP5βR_OE Pflanze Nr. 16; * = Übereinstimmung der Sequenzen

Die Pflanze AthEcP5βR_OE Nr. 16 wurde zur Blüte und Schotenreife weiter kultiviert und die

Samen der F2-Generation konnten gewonnen werden. Weitere Analysen zur Überprüfung der

Transformation, sowie die Kultivierung homozygoter Linien stehen indessen noch aus. Samen

der F1-Generation aller gedippten Pflanzen und F2-Generation der AthEcP5βR_OE Pflanze 16

wurden gesammelt.

3. Ergebnisse zu Vitis vinifera

3.1. Vitis vinifera Progesteron-5β-Reduktase des Typ 1

Im Rahmen des Wein-Genom-Projektes konnte in ein zum VEP1 homologes Gen auf Chromo-

som 18 identifiziert werden. Dieses codiert für eine Progesteron-5β-Reduktase des Typ 1, wel-

che zu 72 % identisch zur Progesteron-5β-Reduktase aus Digitalis lanata (AY574950.1) ist und

eine 70 % Übereinstimmung zum At4g24220 (VEP1) aufweist. Lokalisiert ist das Gen in der

Genomregion 7891435 bis 7890334 (http://www.genoscope.cns.fr/spip/Vitis-vinifera-whole-

genome.html). Für die differentielle Genexpressionsanalyse wurde mRNA aus Blättern, Stän-

geln und Wurzeln von V. vinifera Chardonnay Wildtyp Pflanzen isoliert und in cDNA umge-

schrieben.

Ergebnisse

90

Abbildung 33: Genexpression von Vitis vinifera P5βR Semiquantitative PCR Genexpression in Wurzeln (R), Stängel (S) und Blättern (L) von V. vinifera P5βR im Vergleich zu Actin.

Das Bandenmuster wiederholte sich in den PCR Ansätzen der Pflanzenorgane. Neben unspezi-

fischen PCR Signalen mit VvP5βR Primern konnte eine Bande in Höhe von 1200 bp identifi-

ziert werden (Abbildung 33). Diese entspricht der Anzahl an Basenpaaren der veröffentlichten

Sequenz der putativen Steroid-5β-Reduktase mRNA (JF460012.1). Für Sequenzanalysen

wurde diese Bande subkloniert und konnte dem Datenbankeintrag zugeordnet werden (Anhang,

VIII.1.6). Das Transkript der VvP5βR konnte in der Wurzel, im Stängel und im Blatt nachge-

wiesen werden.

3.2. Transformation und Regeneration von Kalluskulturen

Zur Transformation wurde ein RNAi Konstrukt des Vektors pK7WGIGW2 (II) mit der gesam-

ten VvP5βR codierenden Sequenz in sense und antisense Orientierung verwendet. Agrobakte-

rien des Stammes EHA105, transformiert mit dem binären Vektor, wurden vom Agrarinstitut

Fondazione-Edmnund-Mach (FEM, IASMA, Italien) zur Verfügung gestellt. Die Kallus-Wild-

typ-Linie IT-24/01/12 “Chardonnay 27” (GT) wurde verwendet (s. II.1.12). Die Inokulations-

phase wurde mit einer Bakteriendichte der OD600nm von 0,35 durchgeführt und nach Protokoll

II.2.4.9 verfahren. Es resultierte die Kalluslinien GT13 (RNAi Linie). Eine weitere transfor-

mierte Kallusline mit einem Überexpressionsvektor pK7WG2 mit inserierter VvP5βR cDNA

(GT11, Überexpressionslinie), wurde von Dr. Manuela Campa (FEM, IASMA, Italien) zur Ver-

fügung gestellt. Bis dato konnten keine Regenerate der Überexpressionlinie GT11 erhalten wer-

den. Regenerierte Pflanzen der RNAi-Linie GT13, sowie Kalluskulturen von GT11 mit Ansät-

zen der morphologischen Differenzierung wurden auf ihre Transformation überprüft. Um ge-

nügend Material für die DNA Isolation zu erhalten wurden die GT11-Kalli halbiert. Amplifi-

ziert wurde die 35S Promotor Region beider Linien, zusätzlich wurde bei der Überexpressions-

linie ein genspezifisches Primerpaar verwendet.

Ergebnisse

91

Abbildung 34: PCR Analyse der GT11 Überexpressionslinie A PCr mit Primerpaar VvP5βR, B PCR mit Primerpaar 35S Region, M3- DNA Marker 1 kb Plus, WT- Negativkontrolle von nicht transformierter Kalluskultur Linie IT-24/01/12 “Char-donnay 27”; P- Positivkontrolle binäres Plasmid, 1- 18 Proben von durchnummerierten Kalli

Abbildung 35: PCR Analyse der GT13 RNAi Linie von regenerierten Pflanzen M3- DNA Marker 1 kb Plus, WT- Negativkontrolle von Vitis vinifera Wildtyp “Chardonnay 27”; P- Positivkontrolle pK7WG2 Vektor; 1-5 regenerierte Pflanzen Nr. 1 bis 5.

Die Überexpressionslinie wurde mit den genspezifischen Insertprimern für VvP5βR und mit

vektorspezifischen Primern überprüft (Abbildung 34). Für positiv transformiert erachtet wur-

den jene Kalli, welche PCR-Signale beider Analysen aufwiesen. Diese waren die Kalli Nr. 2,

4, 9, 11, 12, 17 und 18. Die PCR-Analyse der GT13-RNAi-Linie von fünf regenerierten Vitis

vinifera Pflanzen ergab vier positiv transformierte Pflanzen (Abbildung 35; Nr. 1 bis 3 und

Nr 5). Es wurde mit der regenerierten Pflanzenlinie GT13 weiter gearbeitet.

Ergebnisse

92

3.3. Analyse des Gefäßsystems von Weinlaubblättern

In Laubblättern des Weins kann die Komplexität der Blattnervatur durch die Anzahl von Ver-

zweigungspunkte (number of branching points NBPs) dargestellt werden (Hamada et al., 2000).

Laubblätter von regenerierten Pflanzen der Wildtyplinie Chardonnay sowie der RNAi-Linie

GT13 wurden vor der Betrachtung entfärbt. Die Blätter wurden am Mikroskop in Segmenten

abfotografiert und anschließend am Computer zu einem Blatt zusammengefügt.

Tabelle 13: Anzahl der Verzweigungspunkte (NBPs) in Vitis vinifera Blättern

Linie Anzahl der Verzweigungspunkte (NBPs) Blatt 1 Blatt 2 Blatt 3 MW ± SD

WT 1392b) 1046a) 1368b) 1274 ± 183

GT13/1 3836c) 2772b) / /

GT13/3 1881b) / / /

GT13/4 785a) 1635c)) / /

GT13/5 1469b) 1282b) / /

a) junges Blatt, obere Stängelposition b) Blatt von mittlere Stängelposition c) großes Blatt, untere Stängelposition

In der RNAi-Linie GT13 Linie konnte kein eindeutiger Unterschied der Anzahl von Verzwei-

gungspunkten im Vergleich zum Wildtyp herausgearbeitet werden. Die Pflanzen GT13/1 und

GT13/3 weisen eine Tendenz zu einer Erhöhung der Verzweigungspunkte auf, wohingegen

GT13/5 in etwa die gleiche Anzahl von Verzweigungspunkten wie der Wildtyp aufweist. Wei-

terhin wurden die Blätter optisch miteinander verglichen (Abbildung 36).

Abbildung 36: Vergleich der Nervatur von Weinblättern A Blatt von Chardonnay Wildtyp; B Blatt von GT13/3; C Blatt von GT13/1; D Blatt von GT13/4; E Blatt von GT13/5 (Bilder ©Ernst)

Ergebnisse

93

Beobachtet werden konnte, dass sich Dichte und Verzweigung der Nerven der Pflanzen GT13/1

(Abbildung 36, C) und GT13/3 (Abbildung 36, D) im Vergleich zum Wildtyp (Abbildung

36, A) intensiviert. Zudem konnte eine stärkere, gesägte Blattlappung studiert werden. Die Li-

nien GT13/4 und GT13/5 entsprachen der Blattform des Wildtyps. Die Anzahl der Verzwei-

gungspunkte indessen blieb unverändert, wohingegen die Intensität der Nervatur in der GT13/5

Linie zurückging. Die Pflanzen aller Linien wurden hinsichtlich ihrer Genexpression mittels

qPCR untersucht.

3.4. Genexpression des VvP5βR der RNAi-Linie GT13

Für die quantitative Real-Time-PCR wurde zuvor isolierte RNA der regenerierten Weinlinien

in cDNA umgeschrieben. Neben Actin als Kontrollgen wurde zudem das Glycerinaldehyd-3-

phosphat-Dehydrogenase Gen (GAPDH) amplifiziert. Untersucht wurde die Auswirkung des

eingebrachten Vektorkonstrukts auf die Transkriptionsrate des nativen VvP5βR Gens.

Abbildung 37: Vergleich der Transkriptionsrate des VvP5βR Gens in Chardonnay Die Ergebnisse wurden bezogen auf die Werte für die Transkriptionsrate von Actin und GADPH. Die Mittelwerte von drei unabhängigen qPCR Messungen der Transkriptionsrate mit den entsprechenden Standardabweichungen sind dargestellt. WT- Chardonnay Wildtyp, GT13- regenerierte Pflanzen der RNAi-Linie, Die Signifikanz wurde mittels T-Test berech-net und Werte p < 0,05 wurden als signifikant markiert:*= signifikanter Unterschied zum Wildtyp

Obwohl ein Vektor für RNAi Induktion über ein Hairpinkonstrukt verwendet wurde, konnte in

den Linien GT13/1 und GT13/3 eine Erhöhung der Transkriptionsrate des VvP5βR verzeichnet

werden (Abbildung 37). Die regenerierte Linie GT13/4 entsprach dem Wildtyp. Einzig GT13/5

zeigte eine reduzierte Genexpression. In Zusammenhang mit der beobachteten Ausprägung der

Blattnervatur ist auch in GT13/5 eine schwächere Intensität der Gefäßausbildung zu sehen.

0,00

0,50

1,00

1,50

WT GT13/1 GT13/3 GT13/4 GT13/5

Tra

nskr

iptio

nsra

te d

es V

vP5β

R1

Pflanzenlinien

*

*

*

Ergebnisse

94

Auch unterscheiden sich GT13/1 und GT13/3 in ihrer stärkeren Nervaturausbildung, sowie in

ihrer Blattlappung gegenüber dem Wildtyp (vgl. Abbildung 36).

3.5. Charakterisierung des rekombinanten VvP5βR aus Vitis vinifera

3.5.1. Expression des rekombinanten Histidinfusionsproteins

Zur heterologen Expression von VvP5βR wurde der Gateway-Destination-Vektor pDEST17

verwendet. Dazu wurde das PCR-Produkt mittels Taq-Polymerase in den Entry-Vektor pCR8

ligiert. Über ein Blue-White-Screening wurden positive Klone selektioniert. Durch Sequenzie-

rung wurde auf richtige Orientierung geprüft und das Plasmid in die LR-Reaktion mit dem

pDEST17 Vektor eingesetzt.Die Anordnung des N-terminalen Histidin-Tags sowie der Leser-

ahmen wurden mittels Sequenzanalyse überprüft (Abbildung 38).

EGDIHMSYYHHHHHHLESTSLYKKAGSEFALMSWWWAGAIGAAKKKFDEDDAPRGFQNVG

LVIGVTGIVGDSLAEILPLSDTPGGPWKVYGVARRPRPDWNADHPVEYTQCDISDSEDAL

AKLSPLTDVTHVFYVTWTNRATEIENCEANGTMLRNVLRALIPNAPNLRHICLQTGGKHY

IGPFEAFGKIKPHDPPYHEDLPRLDAPNFYYTLEDILFEECEKKDDLTWSVHRPVIIFGF

SPYSMMNILGTLCIYAAICKHEGIPLKFPGSKAAWDCYSDASDADLIAEQQIWATVDPYA

RNEAFNITNGDLFKWKHLWKVLAEQFDMEYAEFEEGEEKQSMVEMMKDKGPVWEEIVREK

ELLPTKLEDVAQWWFIDLVLGGESLLNCMNKSKEHGFLGFRNSRNSFVWWIDKMRGHKLI

P*

Abbildung 38: Aminosäuresequenz der rVvP5βR im pDEST17 Vektor 6 x N-terminalen His-Tag (magenta); Das Methionin als Startaminosäure des rekombinanten Proteins ist grün unterlegt.

Zur Überexpression des rekombinanten Proteins wurde eine 35 mL Übernachtkultur mit 10 µL

des Glycerolstocks in LB-Medium mit Ampicillin (100 µg/mL) angezogen. Diese wurde nach

der Methode II.2.2.1 behandelt. Nach Zelllyse der Bakterienpellets wurde das rekombinante

Protein mittels Äktapurifier gereinigt (s. II.2.2.2). Exemplarisch ist das Elutionsprofil der

rVvP5βR nachfolgend dargestellt.

Ergebnisse

95

Abbildung 39: Elutionsprofil der rVvP5βR nach IMAC

Die Proteinkonzentration der eluierten Fraktionen wurde bestimmt. Die maximale Konzentra-

tion wurde mit 0,29 mg/mL berechnet. Die Fraktionen wurden zu 0,1 mg/mL auf ein 12 %iges

Bis-Tris-Polyacrlyamidgel aufgetragen und entsprechend ihres Molekulargewichtes aufge-

trennt (s. II.2.2.4).

Abbildung 40: Überexpression und Reinigung mit rVvP5βR aus BL21 E. coli Zellen Angefärbtes 12 % Bis-Tris-Polyacrylamidgel mit Coomassie-Lösung; M- Molekularge-wichtsmarker SeeBlue® Plus2 pre-stained Standard (Invitrogen®); 1- Zellpellet vor Induk-tion mit IPTG, 2- Zellpellet nach Induktion mit IPTG, 3- löslicher Teil des Zelllysates nach Sonication, 4- unlösliche Bestandteile aus Bakterienpellet nach Sonication, 5- Äktafraktion Nr. 1 (Waschfraktion), 6- Äktafraktion Nr. 6, 7- Äktafraktion Nr. 7, 8- Äktafraktion Nr. 8

0

20

40

60

80

100

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 10 20 30 40 50

0,25

M Im

idaz

ol [%

]

Abs

orpt

ion λ

280

[mA

U]

Elutionsvoulumen [mL]

Absorption λ280

Ergebnisse

96

Über den Expasy-Protein-Parameterrechner wurde ein theoretisches Molekulargewicht der

Aminosäuresequenz von 47,74 kDa berechnet. Im Polyacrylamidgel konnte eine dementspre-

chende Bande knapp unterhalb der 49 kDa Markerbande zugeordnet werden (Abbildung 40).

Eine Aufreinigung wurde nicht nachgewiesen. Das Protein befand sich in „Inclusion Bodies“

im Zellpellet (Abbildung 40, Pfeil in Spur 4). Es konnte keine bzw. nur eine geringe verunrei-

nigte Menge an rVvP5βR gewonnen werden. Um die Aggregation zum unlöslichen Protein zu

verhindern, wurde das Plasmid in einen modifizierten BL21 E. coli Stamm (BL21sol) transfor-

miert, welcher die Löslichkeit des exprimierten Proteins erhöhen sollte. Zudem wurde die

VvP5βR cDNA in den pQE30 Vektor mittels Restriktion und anschließender Ligation kloniert

(s. II.2.2.1). Der Ligationsansatz wurde in kompetente M15 [pREP4] E. coli Zellen transfor-

miert. Positive Klone wurden durch Sequenzierung in Bezug auf Anordnung des N-terminalen

Histidin-Tags und Leserahmen überprüft (Abbildung 41).

QFHTEFIKEEKLTMRGSHHHHHHGSACMSWWWAGAIGAAKKKFDEDDAPRGFQNVGLVIG

VTGIVGDSLAEILPLSDTPGGPWKVYGVARRPRPDWNADHPVEYTQCDISDSEDALAKLS

PLTDVTHVFYVTWTNRATEIENCEANGTMLRNVLRALIPNAPNLRHICLQTGGKHYIGPF

EAFGKIKPHDPPYHEDLPRLDAPNFYYTLEDILFEECEKKDDLTWSVHRPVIIFGFSPYS

MMNILGTLCIYAAICKHEGIPLKFPGSKAAWDCYSDASDADLIAEQQIWATVDPYARNEA

FNITNGDLFKWKHLWKVLAEQFDMEYAEFEEGEEKQSMVEMMKDKGPVWEEIVREKELLP

TKLEDVAQWWFIDLVLGGESLLNCMNKSKEHGFLGFRNSRNSFVWWIDKMRGHKLIP*

Abbildung 41: Aminosäuresequenz der rVvP5βR pQE30 Vektor mit 6 x N-terminalen His-Tag (magenta) im richtigen Leserahmen. Das Me-thionin als Startaminosäure des rekombinanten Proteins ist grün unterlegt, berechnetes Mo-lekulargewicht kDa = 46,2 (Expasy Protein Parameter)

Außerdem wurden neben der Expression bei 4 °C für 96 h die heterologe Expression bei 37 °C

für 4 h und 22 °C für 16 h in Betracht gezogen. Die Proteinkonzentration nach der Aufreinigung

mit bis max. 0,5 mg/mL in allen getesteten Expressions-Strategien war sehr gering. Proben des

Proteinüberstands sowie Zellpellets nach Aufschluss mittels Ultraschall wurden von BL21(sol)

pDEST17_VvP5βR und M15 [pREP4] pQE30_ VvP5βR mittels SDS-Gelanalyse und Western

Blots analysiert (s.II.1.10.4., II.2.2.5).

Ergebnisse

97

Abbildung 42: Western Blot von rVvP5βR A Mit Amidoschwarz angefärbte Nitrocellulose Membran; B Western Blot mit rVvP5βR mit spezifischen Anti-His-Antikörpern; M- Marker peqGold Protein Marker IV für Transfereffi-zienz (Peqlab), 1- unlösliche Bestandteile aus Bakterienpellet nach Zellaufschluss von BL21(sol) pDEST17_VvP5βR; 2- löslicher Teil des Zelllysates BL21(sol) pDEST17_VvP5βR; 3- löslicher Teil des Zelllysates von M15 [pREP4] pQE30_VvP5βR 4- unlösliche Bestandteile aus einem Bakterienpellet nach Zellaufschluss von M15 [pREP4] pQE30_VvP5βR

Sowohl in der Probe der unlöslichen Bestandteile aus Bakterienpellet nach Zellaufschluss von

BL21(sol) pDEST17_VvP5βR als auch von M15 [pREP4] pQE30_VvP5βR konnte das

rVvP5βR Protein spezifisch mittels Antikörper nachgewiesen werden (Abbildung 42, Bahn 1

und 4). Eine Detektion im Zelllysat war anhand der geringen löslichen Konzentration der

rVvP5βR nicht möglich. Das schwach exprimierte rekombinante Protein wurde auf katalytische

Aktivität hin geprüft.

3.5.2. Nachweis der katalytischen Aktivität und biochemische Charakterisierung

Um für die exprimierte rVvP5βR katalytische Aktivität nachzuweisen, wurde ein Standardass-

say mit Progesteron als Substrat durchgeführt. Die maximale Konzentration des aufgereinigten

rekombinanten Proteins wurde eingesetzt. Außerdem wurden Proben nach Aufschluss mittels

Ultraschall, sowie eine Probe des Zelllysates nach Zentrifugation (Überstand) und des in P5βR-

Assay-Puffer resuspendierten Bakterienpellets nach Aufschluss angesetzt. Als Cosubstrat

wurde ein regenerierendes System aus NADP, Glucose-6-Phosphat und Glucose-6-Phosphat-

Dehydrogenase verwendet (s. II.1.10.5; II.2.5). Inkubiert wurde die Reaktion von 15 h bei 40 °C

und 500 rpm, um eine größt mögliche Umsetzung von Progesteron zu erzielen. Die Proben

wurden mittels DC und GC-MS analysiert (vlg. II.2.6). Eine hitzedenaturierte Probe (10 min,

100 °C) diente als Negativkontrolle.

Ergebnisse

98

Abbildung 43: DC Analyse der rVvP5βR Aktvität R1- Progesteron Reinsubstanz (Rf = 0,55), 1- Negativkontrolle der Proben nach Aufschluss mittels Ultraschall; 2- Assay der Proben nach Aufschluss mittels Ultraschall; 3- Negativkon-trolle rekombinantes aufgereinigtes VvP5βR Protein; 4- Assay rekombinantes aufgereinigtes VvP5βR Protein: 5- Assay der Probe des löslichen Teils des Zelllysates; 6- Assay der resus-pendierten Bakterienpellets nach Aufschluss

Die Aktivität der rVvP5βR konnte in allen aktiven Assays, durch die stereospezifische Redu-

zierung der C4-C5 Doppelbindung zu 5β-Pregnan-3,20-dion (Rf = 0,65) detektiert werden (Ab-

bildung 43). Auch die Probe des resuspendierten Bakterienpellets, nach Ultraschallaufschluss

und Zentrifugation, zeigte eine Umsetzung von Progesteron auf (Abbildung 43, Bahn 6), da

neben ungefalteten auch intaktes Protein in „Inclusion Bodies“ vorhanden war. Zusätzlich

wurde eine GC-MS Analyse des Assays mit rekombinanten aufgereinigten VvP5βR durchge-

führt und ist in Abbildung 44 dargestellt.

Ergebnisse

99

Abbildung 44: GC-MS Analyse der Reduktion von Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion durch rVvP5βR Inkubationsdauer 15 h, Substrat Progesteron 0,3 mM, rVvP5βR 0,25 mg/mL, 1- Produkt 5β-Pregnan-3,20-dione (Rt = 9,929 min), 2- Substrat Progesteron (Rt = 10,637), 3- Interner Standard (Rt = 11,399)

Für die anschließende biochemische Charakterisierung des rekombinanten Proteins auf die Pa-

rameter Temperatur und pH-Optimum wurde zunächst der Verlauf der P5βR-Reaktion über

eine Zeitkinetik bis 8 h ermittelt, um eine Reduzierung der Inkubationszeit zu erhalten. Dabei

wurden 0,2 mg/mL rVvP5βR Protein, 0,3 mM Progesteron und regenerierendes System mit

NADP eingesetzt. Über GC-MS Analytik wurde die gebildete Produktmenge (5β-Pregnan-

3,20-dion) in nmol/mg Protein quantifiziert.

Abbildung 45: Zeitkinetik der rVvP5βR Progesteron als Substrat über einen Zeitraum von 8 Stunden

1

2 3

Ergebnisse

100

Ein linearer Verlauf konnte in Abbildung 45 zwischen den Inkubationszeiten von 0 h bis 4 h

festgestellt werden. Für die biochemische Charakterisierung der Parameter Temperatur und pH-

Wert wurde die Inkubationszeit der Assays auf 2 h begrenzt. Für die rVvP5βR konnte ein Tem-

peraturoptimum bei 45 °C ermittelt werden (Abbildung 46, A), welches sich über ein Plateau

von 40 °C bis 50 °C erstreckte. Der optimale pH-Wert betrug 8,0 (Abbildung 46, B).

Abbildung 46: Temperatur- und pH- Optimum der rVvP5βR A Temperaturoptimum der rVvP5βR mit relativen Aktivitäten, Substrat Progesteron, Inku-bationszeit 2 h, 0,2 mg/mL Protein; B pH Optimum der rVvP5βR mit relativen Aktivitäten, Substrat Progesteron, Inkubationszeit 2 h, 0,2 mg/mL Protein

Eine weitere Charakterisierung auf Km und kcat Werte war durch die geringe Ausbeute an

aufgereinigtem Protein nicht möglich. Es wurden neben Progesteron zwei weitere Substrate auf

ihre Umsetzung hin überprüft. Es wurde das Substrat Citral, welches ein Gemisch aus den Ste-

roidisomeren Geranial (Citral A) und Neral (Citral B) ist, verwendet (s. Strukturformel in Ab-

bildung 49). Zudem wurde β-Ionon, welches durch Oxidation von Carotinoiden entsteht und zu

den C13-Norisoprenoiden zählt, getestet. Nachstehend sind die GC-Chromatogramme von

durchgeführten Assays beider Substrate dargestellt. In Abbildung 47 ist die Reduktion von Ci-

tral zu Citronellal durch rVvP5βR verzeichnet. Abbildung 48 ist ein Chromatogramm des akti-

ven Assays mit dem Substrat β-Ionon.

0

20

40

60

80

100

30 35 40 45 50 55 60 65 70

rela

tive

Akt

ivitä

t [%

]

Temperatur [°C]

Temperaturoptimum rVvP5βR

0

20

40

60

80

100

5,5 6,5 7,5 8,5 9,5

rela

tive

Akt

ivitä

t [%

]

pH Wert

pH-Optimum rVvP5βR

B A

Ergebnisse

101

Abbildung 47: GC-MS Analyse der Reduktion von Citral zu Citronellal durch rVvP5βR Inkubationsdauer 2 h, Substrat Citral 0,3 mM, rVvP5βR 0,2 mg/mL, 1- Citral B/Neral (Rt = 11,47 min), 2- Citral A/Geranial (Rt = 12,26), 3- Produkt Citronellal (Rt = 20,30)

Abbildung 48: GC-MS Analyse der Reaktion von rVvP5βR mit β-Ionon Inkubationsdauer 2 h, Substrat β-Ionon 0,2 mM, rVvP5βR 0,2 mg/mL, 1- β-Ionon (Rt = 15,55 min); weitere Peaks konnten nicht zugeordnet werden

Eine Reduzierung des Substrat Citral zu Citronellal konnte beobachtet werden. Wohingegen

eine Umsetzung von β-Ionon zu dem theoretischen Produkt Dihydro-β-Ionon nicht nachgewie-

sen werden konnte. Chromatogramme der Negativkontrollen sind im Anhang VIII.2 in den Ab-

bildung 60 und Abbildung 61 dargestellt. Nachstehend sind Strukturformeln der Reaktionen

veranschaulicht.

1

Ergebnisse

102

Abbildung 49: Reaktion der rVvP5βR mit Substraten A Reaktion mit Substrat Citral, bestehend aus den Steroidisomeren Geranial (Citral A) und Neral (Citral B), Produkt Citronellal; B Reaktion mit Substrat β-Ionon

4. Ergebnisse zu Digitalis lanata

Im Rahmen der vorliegenden Dissertation sollten die Grundsteine für eine weiterführende und

erfolgreiche Herstellung von transgenen Pflanzen durch agrobakterienvermittelten Gentransfer

gesetzt werden. In der Doktorarbeit von Dr. Buhara Yucesan (2013) wurden verschiedene Me-

dien zur Optimierung von in vitro Propagierung und Regenerierung von unterschiedlichen Di-

gitalis Arten getestet. Für die Etablierung eines Transformationssystems wird ein auf die

Pflanze abgestimmtes Regenerationssystem benötigt.

4.1.1. Propagierung und Regenerierung von Digitalis lanata

Zur Sprossinduktion und Stimulierung der Zellteilung wurde neben dem als Phytohormon wir-

kendes Phenylharnstoff-Derivat Thidiazuron (TDZ), das Auxin Indol-3-Essigsäure (IAA) ein-

gesetzt. Im Gegensatz zu Cytokininen (TDZ) fördert IAA die Wurzelbildung und wird als ein-

ziges Phytohormon im Rooting-Medium verwendet. Als Basismedium wird das LS-Medium

nach Linsmaier und Skoog, 1965, mit einem erhöhten Thiamingehalt verwendet. Alle Pflan-

zengewebeversuche und Regeneration wurden in vitro unter sterilen Bedingungen durchge-

führt. Hierfür wurden sämtliche Oberflächen der Gebrauchsmaterialien sterilisiert und herge-

stellte Medien autoklaviert. Für die Herstellung von Explantaten wurden Samen von D. lanata

zuvor mittels verschiedener Ethanolkonzentrationen nach II.2.4.1 sterilisiert. Zur Keimung

wurden jeweils 3 bis 5 Samen in Glasgefäße mit 25 mL LS-Festmedien gesetzt. Insgesamt wur-

den 310 Samen ausgebracht. Davon konnten 46 Keimlinge gewonnen werden, was eine Kei-

mungsrate von 15 % entspricht. Nach zwei Monaten wurden die Pflanzen für Regenerations-

A B

Ergebnisse

103

versuche bzw. Transformation mittels Agrobakterien verwendet. Durch die geringe Keimungs-

rate konnten die Versuche nur in einem kleinen Maßstab angefertigt werden. Die verschiedenen

Phasen der Regeneration lassen sich folgendermaßen beschreiben (Abbildung 50):

Phase I: Kallusinitiation, Dedifferenzierung der Zellen der Explantate

Die Induktion von Kallus an Gewebeexplantaten ist mit der Verwendung einer niedrig kon-

zentrierten ausgeglichenen Auxin/Cytokinin-Mischung ein Standard der Gewebekultur. Für die

Kallusinduktion wurden aus jeweils sechs bis sieben Pflanzen 36 bis 42 Explantate gewonnen.

Insgesamt wurden 115 Blattstücke auf I4 Medium ausgebracht. Nach 6 Wochen Inkubation un-

ter Lichtausschluss bei 22 °C wurde auf Zelldedifferenzierung und Kallusbildung überprüft.

Beobachtet werden konnten eine starke, nekrotische Braunfärbung der Blattexplantate sowie

eine Kallusinduktion von 14,7 %, welche vorwiegend an den Wundrändern auftrat (Abbildung

50; Bild B).

Phase II: Kalluswachstum durch Steigerung der Cytokinese

Die induzierten Kalli wurden von den Explantaten abgetrennt und im Dunkeln bei 22 °C auf I4

Medium weiter propagiert. Alle zwei Monate wurde auf frisches Medium umgesetzt. Kalli grö-

ßer als 0,5 cm Durchmesser wurden geteilt. Erste weiße Sprossansätze traten nach zwei Mona-

ten auf.

Phase III: Sprossinduktion und Sprossproliferation

Nach sechsmonatiger Inkubation konnte eine Steigerung an elongierten, weißen Sprossen mit

Blattstrukturen festgestellt werden. Ein Überblick über die Sprossausbildung pro Kallus nach

jeweils zwei Monaten Inkubation ist in nachstehender Tabelle 14 dargestellt.

Tabelle 14: Phase III: Sprossinduktion und Sprossproliferation von Digitalis lanata Kallus

Umsetzung Anzahl der Kalli Anzahl Spross/Kallus Mittelwert ( %)

U III 229 0,24 0,29 ± 0,14

(30 %) U IV 284 0,19 U V 302 0,46

Phase IV: Wurzelinduktion, Sprosselongation und Rechlorophyllierung

Geeignete Sprosse (Abbildung 50, Bild D und E) von einem Durchmesser von 1 cm bis 1,5 cm

wurden auf Rooting-Medium umgesetzt. Bedingt durch die alleinige Zugabe des Phytohormons

IAA werden Zellen zur Wurzelausbildung stimuliert. Durch den Lichteinfluss wurden die

Sprosse nach wenigen Tagen grün. Während eines Monats bildeten sich Sprosse mit normalen

Ergebnisse

104

rosettenständigen Blättern aus, welche Ansätze von Wurzeln aufwiesen. Diese wurden monat-

lich auf frisches RM umgesetzt.

Tabelle 15: Wurzdelausbildung der Digitalis lanata Sprosse in Phase IV

Dauer der Wurzelausbildung 8 Wochen 12 Wochen 16 Wochen Pflanzen mit Wurzeln* 16 % 34 % 65 %

geeignete Pflanzen für Phase V 6 6 15 * pro Monat wurden 50 bis 70 Pflanzen begutachtet

Phase V: Regenerationspflanze

In vitro Pflanzen mit einem ausgeprägten Wurzelsystem (Abbildung 50; Bild F) wurden in Erde

eingesetzt. Von insgesamt 27 Explantaten entwickelten sich 14 zu Pflanzen mit einem normalen

Habitus (Abbildung 50; Bild G). Dies entspricht einer Rate von 52 %.

Abbildung 50: Regeneration von Digitalis lanata A 28 Tage alter D. lanata Keimling auf LS-Festmedium; B Kallusbildung von Explantaten auf I4 Medium (Phase I); C typischer Kallus der Phase II nach sechsmonatiger Kulturdauer; D Sprossbildung an Phase II Kallus, geeignet für Transfer auf Rooting-Medium; E Spross am Anfang der Phase IV; F Spross nach Rechlorophyllierung und Wurzelausbildung nach acht Wochen Kultivierung; G erfolgreich regenerierte D. lanata Pflanze auf Erde unter Ge-wächshausbedingungen (Bilder ©Ernst)

Ergebnisse

105

4.1.2. Transformation von Digitalis lanata

Der Begriff Transformation, auch Transfektion genannt, bezeichnet das Einbringen von frem-

der DNA in Zellen oder Organismen. Das Fremdgen kann entweder stabil in das Genom der

Pflanze integriert werden (stabile Tranformation) oder nur kurzfristig in der transformierten

Zelle verbleiben (transiente Transformation).

4.1.2.1. Transiente Transformation

Die Methode der Infiltration von Blattgeweben mit einer Agrobakterien-Suspension wird zu

den transienten Transformationsmethoden gezählt, obwohl auch eine Integration der Ziel-DNA

in das Genom der Pflanzenzellen stattfinden kann. Es wurde die Transformationsmöglichkeit

von D. lanata überprüft. Verwendet wurden ein Jahr alte Digitalis Pflanzen, welche im Ge-

wächshaus kultiviert worden waren. Jeweils drei juvenile, hellgrüne Blätter der Rosettenmitte

und drei ältere, dunkelgrüne Blätter einer Pflanze wurden zur Infiltration ausgesucht. Eine

Pflanze diente als Negativkontrolle und die dort entnommenen Blätter wurden nur mit dem

Infiltrationspuffer behandelt. Das Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander durch-

geführt. Zur Infiltration wurde der Agrobakterienstamm C58C1 mit dem Vektor p1425 benutzt.

Der Vektor enthält die unter einem 35S-Promotor stehende cDNA codierend für das GFP-Pro-

tein aus der Qualle Aquorea victoria. Infiltrierte Pflanzen wurden für 3 bis 4 Tage unter Ge-

wächshausbedingungen inkubiert (s. II.2.4.12, II.2.4.13.).

Ergebnisse

106

Abbildung 51: Transiente Transformation von Digitalis lanata Fluoreszenzmikroskopaufnahmen (Axioskop HBO 50, Zeiss; Software Cell'D, Olympus) bei einem Anregungslicht von 450 nm A Kontrolle D. lanata Blatt Infiltrationspuffer; B juveniles D. lanata Blatt infiltriert mit C58C1/p1425, GFP Fluoreszenz Detektion in den Spaltöffnungen; molekularbiologische Überprüfung der Transformation: C EtBr gefärbtes 1x TAE 1 % Agarosegel aufgetragene PCR Ansätze: 1- Vektor p1425 GFP Primer, 2- gDNA von Blatt mit GFP Signal (vgl. B) mit GFP Primern, 3- gDNA von Kontrollblatt Infiltrationspuffer (vgl. A) mit GFP Primern, M1- 100 bp Marker; D BLAST Homologiesuchergebnis von der Sequenz des subkloniertem 306 bp PCR-Produkts mit Übereinstimmung zu Agrobakterienstamm C58

Nach Expression in pflanzlichen Zellen konnte das gebildete GFP-Protein mittels Fluoreszens-

mikroskop im Cytoplasma und in den Spaltöffnungen nachgewiesen werden (Abbildung 51,

B). Die Transformations- und Infiltrationseffizienz nahm zu älteren Blättern hin ab. Die Pflan-

zenblätter behandelt mit Infiltrationspuffer sowie negativ transformierte Blätter emittierten die

Komplementärfarbe Rot (Abbildung 51, A). Blätter der Kontrollpflanzen, sowie Blätter mit

positiven GFP-Signal wurden zur Extraktion von genomischer DNA (s. II.2.1.1) verwendet. Es

wurde eine PCR mit Primern, abgeleitet von der Vektorsequenz, mit gDNA von D. lanata Puf-

ferkontrolle sowie positiven GFP Signal und dem Vektor p1425 als Positivkontrolle angesetzt.

Die Agrosegel-Analyse zeigte, dass die abgeleiteten Primer nicht spezifisch waren, aber ein

charakteristisches Bandenmuster entstehen ließen. Die detektierten Banden bei 300 bp, 750 bp

und 2000 bp konnten sowohl beim Vektoransatz als auch bei positiv transformierter gDNA

Ergebnisse

107

nachgwiesen werden (Abbildung 51, C). Die gDNA der Pufferkontrolle zeigte kein charakte-

ristisches Bandenmuster zum Vektor auf. Die PCR-Ansätze wurden für die Subklonierung in

den pGEMT Vektor aufgereinigt, transformiert und analysiert. Die 300 bp großen PCR-Frag-

mente konnten erfolgreich kloniert und sequenziert werden. Mittels einer BLAST Homologie-

suche konnte eine Übereinstimmung zum Agrobakteriengenom C58 nachgewiesen werden

(Abbildung 51, D).

4.1.2.2. Stabile Transformation

Für die Transformation von Blattstücken und Kalluskulturen wurde dem Regenerationssystem

eine Kokultivierungsphase vorangestellt. Die Selektion erfolgte auf modifizierte Regenerati-

onsmedien, welche dem jeweiligen Agrobakterium und binären Vektor angepasst wurden. Zu-

nächst wurde der Agrobakterienstamm C58 mit dem binären GFP-Vektor p1425 verwendet.

Für die Inokulation wurden steril angezogene einen Monat alte Keimlinge verwendet. Die Blät-

ter wurden abgetrennt, mit einer Pinzette verletzt und in eine Petrischale mit der Agrobakte-

rienlösung (OD600nm = 0,8) inkubiert. Die Blätter wurden für vier Tage auf einer Kokultivie-

rungsplatte ausgelegt. Für die Inokulation von Kalluskulturen wurden 2 g Linie K3OHD sowie

5 g von der Regenerationslinie verwendet. Die Inkubationsphase wurde auf zwei Tage redu-

ziert. Bis dato konnten von 90 ausgebrachten Blattexplantaten nur drei Kalli induziert werden.

Innerhalb weniger Tage auf selektivem Medium wurden die Blattsegmente braun und nekro-

tisch. Nach einer weiteren Subkultivierung der drei Kalli konnte kein Wachstum verzeichnet

werden. Als Alternative wurden Kalli der Regenerationslinie und die Dauersuspensionskultur-

linie K3OHD verwendet. Neben dem Bakterienstamm C58 wurden die Stämme GV3101 und

AGL1 verwendet, sowie der binäre Vektor pEarlyGate100 mit inserierter cDNA DlP5βR zur

Überexpression. Auch hier zeigte sich eine nekrotische Braunfärbung innerhalb weniger Wo-

chen. Ausfall von Ansätzen durch Bakterienüberwuchs traten erhöht in Zusammenhang mit den

Stämmen GV3101 und AGL1 in der ersten Subkultur auf. Einzig eine Linie von K3OHD Zel-

len, transformiert mit dem p1425 Vektor, zeigte neben braun gefärbten Zellen Wachstumszonen

mit hellen, beigen Zellen auf. In Abbildung 52 sind nicht transformierte K3OHD Zellen in

Bild A neben den transformierten Zellen (Bild B) im Vergleich dargestellt. Die sterilen Kultur-

platten wurden unter ein binokulares Präpariermikroskop, verbunden mit einer Fluoreszens-

lampe, auf GFP-Expression in Zellen überprüft. Es konnte in einzelnen Zellen grüne GFP-Flu-

oreszenz nachgewiesen werden (Abbildung 52, Bild C und D). Nicht transformierte Zellen er-

schienen schwarz. Ein molekularbiologischer Nachweis konnte nicht erbracht werden.

Ergebnisse

108

Abbildung 52: Stabile Transformation von Digitalis lanata GFP Expressionsüberprüfung in K3OHD Zellen mittels Fluoreszenzanregung A K3OHD Zellen als Kontrolle auf I4 Medium, B transformierte K3OHD Zellen mit p1425-Vektor durch Agrobakterienstamm C58 auf Selektionsmedium II, C/D grünes GFP-Fluores-zenzsignal der transformierten K3OHD-Linie

Diskussion

109

IV. Diskussion

1. Generierung von binären Pflanzentransformationsvektoren

Für die Genmanipulation bei Pflanzen Agrobakterien-System am weitesten verbreitet. Diese

Bakterien besitzen ein Ti-Plasmid („Tumor inducing- Plasmid“), von welchem ein spezifischer

Abschnitt des Plasmids, die so genannte T-DNA-Region in das Genom einer infizierten Pflanze

transferiert werden kann (Tzfira und Citovsky, 2006). Definiert wird die T-DNA-Region durch

zwei Grenzabschnitte, der RB („right border“) und der LB („left border“). Binäre Vektoren

wurden entwickelt, welche neben der T-DNA-Region, je einen Replikationsursprung Ori („ori-

gin of replication“) für E. coli und A. thumefaciens,ein Antibiotika-Resistenzgen für Bakterien

sowie ein Selektionsmarkergen für Pflanzen enthalten (Tanaka et al., 2012). Es wurden eine

große Anzahl von binären Vektoren kompatibel zum Gateway System, die Destination-Vekto-

ren, entwickelt (Karmimi et al., 2002; Curtis und Grossniklaus, 2003; Helliwell und Water-

house, 2003; Brand et al., 2006; Early et al., 2006; Karimi et al., 2007 a/b). Grundlage ist die

Rekombination des Zielgens aus dem Entry-Vektor in den pDest-Vektor durch die so genannte

LR-Reaktion. Das System benutzt das genaue, ortspezifische Rekombinationssystem des Bak-

teriophagen lambda um Sequenzen zwischen Plasmiden mit kompatiblen Rekombinationsorten

zu transferieren (Landy, 1989). Diese sind über bestimmte Basensequenzabfolgen definiert und

werden als „attX-Sites“ (für X = B, P, L, R) bezeichnet. Die Stellen beruhen auf einer Haupt-

sequenz aus sieben Basenpaaren. Durch Mutation können verschiedene Varianten mit hoher

Spezifität und Orthogonalität erzeugt werden. Das System basiert grundlegend auf zwei Reak-

tionen:

(1) attB x attP � attL + attR wird vermittelt durch die Enzyme Integrase (Int) und den

„integration host factor“ (IHF). Diese Reaktion wird auch als „Integration“ oder BP-

Reaktion bezeichnet und es wird der so genannte Entry-Vektor erzeugt.

(2) attR x attL � attB + attP wird neben Int und IHF mittels einer Excisionase (Xis) kom-

biniert. Die Reaktion wird als „Excision“ oder gängiger als LR-Reaktion angegeben

(Hartley et al., 2000; Katzen, 2007).

Als Überexpressionsvektor wurde der pEarlyGate100 Vektor (Early et al., 2006) erworben. Die

generierten Entry-Vektoren unter III.1.1.1 wurden für die LR-Reaktion eingesetzt. Invitrogen

gibt die Effizienz dieser Reaktion mit 30 % erfolgreich rekombinierten Ausgangsmaterials an.

Jene kann durch verschiedene Strategien gesteigert werden. Zum einen kann eine Verlängerung

der Inkubaionszeit der LR-Reaktion kann die Kolonienanzahl bis zu 10-fach erhöhen. Zum an-

deren kann die Linearisierung des Entry-Vektors oder Destination-Vektors die Effizienz um

das zweifache steigern (Invitrogen User Guide, S. 29, 2012). Der pEarlyGate100 Vektor und

Diskussion

110

die Entry-Klonen weisen die gleiche Antibiotika Resistenz auf. Dies ist ein gängiges Problem

in der Pflanzentransformation, da viele Vektoren das gleiche Grundgerüst besitzen (Xu und Li,

2008). Die Restriktion diente zur Minimierung einer Verschleppung des Ausgangsvektors. Kei-

nes der Zielgene konnte auf Anhieb erfolgreich rekombiniert werden. Die cDNA Sequenz der

3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenasen von Arabidopsis und Digitalis konnten erst im zweiten

und dritten Ansatz positiv in den Überexpressionvektor pEarly100 kloniert werden. Trotz wei-

terer Überprüfungen und Optimierungen, in denen alle restlichen vier Entry-Vektoren sowie

der pEarly100 neu isoliert wurden und frische Restriktionsenzyme sowie eine neuwertige LR-

Clonase verwendet wurden, konnte keine erfolgreiche Rekombination erzielt werden. Insge-

samt wurden 13 Reaktionen nach dieser Methode mit nur zwei erfolgreichen Rekombinationen

durchgeführt, was einer geringen Erfolgsrate von 15,4 % entspricht. Eine Strategieänderung

nach dem Protokoll von Xu und Li, 2008, führte zu keinem Erfolg. Nach Protokoll können nur

die binären Vektoren in den Agrobakterien vermehrt werden, da diese neben dem Ori für E.

coli Bakterien auch eines für Agrobakterien besitzen und somit dort repliziert werden können.

Die Daten legten nahe, dass im Vorfeld durch die Colony-PCR es zu falsch positiven Ergebnis-

sen kam und unligierte Vektoren als Template in der PCR fungierten (Agrawal und Roy, 2007).

Bis zu über 90 % der getesteten Kolonien können sich als falsch positiv heraus stellen (Dallas-

Yang et al., 1997; Agrawal und Roy, 2007; eigene Beobachtungen). Zusätzlich wurden ad hoc

linearisierte Entry-Vektoren, welche bei -20 °C gelagert waren, in die LR-Reaktion mit neu

isoliertem pEarly100 Vektor eingesetzt. Durch diese Modifikation konnten alle noch ausste-

henden Gensequenzen direkt in den binären Überexpressionsvektor integriert werden. Zur Be-

stätigung dieser Methodenanpassung wurden die generierten und linearisierten Entry-Vektoren

für den pHellsgate8 RNAi-Destination Vektor (s. III.1.2.1; Helliwell et al., 2002) in die LR-

Reaktion einmal direkt und einmal nach Lagerung für einen Tag bei -20 °C eingesetzt. Alle

Ansätze mit zuvor eingefrorenen, linearisierten Entry-Vektoren konnten erfolgreich rekombi-

nieren, wohingegen die Ansätze ohne Modifikation kein postives Ergebnis erbrachten. Mit ei-

ner Erfolgsrate von 83 % (10 von 12 rekombinierten Entry-Vektoren) ist diese Anpassung aus-

schlaggebend für die anschließende LR-Reaktion. Diese Modifikation wurde in der Literatur

und von Invitrogen® nicht beschrieben. Die Reaktionsansätze selbst bedürfen keiner Optimie-

rung.

Es konnte für jedes hier behandelte Gen ein Set an binären Pflanzenvektoren, mit je einem

Konstrukt für Überrexpressionstudien und einem Konstrukt für RNAi-Studien in der Pflanze,

generiert werden (Tabelle 7). Ein Grundstock von binären Pflanzenvektoren wurde somit er-

stellt (s. III.1, III.1.1.2, III.1.2.2). Zudem war es dadurch möglich das Transformationssystem

Diskussion

111

für A. thaliana über die „floral dip“-Methode zu etablieren und eine Pflanzenmutantenbiblio-

thek anzulegen, welche eine weitere Forschung zur physiologischen Rolle des VEP1 Gens bzw.

der Progesteron-5β-Reduktasen unterstützen wird (s. III.2.7).

2. Die physiologische Rolle von VEP1 (At4g24220)

2.1. Einfluss des VEP1 Gens auf die Nervatur der Kotyledonen

Studien zur Ausbildung des Gefäßsystems in Blättern von A. thaliana von Jun et al., 2002,

bildeten die Grundlage weiterer Untersuchungen zur physiologischen Rolle des VEP1 („Vein

Patterning) Gens. Über eine Antisense-Suppressions-Mutante vep1-1D konnte eine Reduzie-

rung der Nervaturkomplexität in Kotyledonen und Rossettenblättern, verdeutlicht durch die

Anzahl der Verzweigungspunkte (NBPs), dargestellt werden. In der Veröffentlichung wurde

eine Reduzierung von 50 % der NBPs im Vergleich zum Wildtyp detektiert. Zudem wurde die

„knock down“-Mutante des VEP1 Gens durch die unvollendete Ausbildung der Blattnerven

und der Reduzierung von Wurzel- und Stängeldicke charakterisiert. Für Studien zur Nervat-

uranordnung in den Kotyledonen wurden die SALK_597798 Insertionlinie, welche die Inser-

tion zu Beginn des zweiten Exons des VEP1 Gens aufweisen soll, und die SALK_586640 In-

sertionslinie, in welcher die T-DNA am Ende des zweiten Exons integiert sein soll, ausgewählt.

In wieweit der Insertionsort Einfluss (Abbildung 53) auf die Ausprägung der phänotypischen

Symptome nimmt, konnte durch die erhobenen Daten bestimmt werden.

Abbildung 53: Ausschnitt des codierenden Bereichs des VEP1 Gen Überblick über die Genomregion des Chromosomes 4; Rot markiert sind due Insertionsstel-len der T-DNA der SALK-Linien. „Knock out“-Linien sind durch Dreiecke dargestellt; in grün sind die SALK- Linien dargestellt (gelb sind FLAG-Linien, grau sind SAIL-Linien) (http://atensembl.arabidopsis.info/Arabidopsis_thaliana_TAIR/contigview)

In Abbildung 22 wurde die Gefäßausbildung der Kotyledonen unabhängig voneinander abe-

trachtet. Auffallend ist, dass schon 22 % der Kotyledonen von A. thaliana Col-0 eine abnormale

Nervatur aufweisen. Als normal gelten Koteyldonen mit geschlossene Areolen ab einer Anzahl

von zwei bis vier (Carland et al., 1999). Als abnormal wurden jene Keimblätter angesehen,

welche neben geschlossenen Areolen, offene Xylemstrangenden aufweisen. Diese Betrach-

tungsweise geht konform zu den Studien von Jun et al., 2002. In der Überexpressionsmutante

wies nur noch eins von zehn Kotyledonen eine gestörte Nervatur auf. Im Vergleich zu den

Diskussion

112

T-DNA-Insertionslinien wurde eine deutliche Erhöhung von abnormaler Gefäßausbildung in

Kotyledonen aufgezeigt, welche mit 50 % in der SALK_597798 Linie am stärksten auftritt.

Setzt man diese Beobachtung in Zusammenhang mit den Insertionsort zeigt sich, dass je weiter

aufwärts der Integrationsort der T-DNA im Gen liegt, desto schwächer treten die phänotypi-

schen Symptome auf. Zur genaueren Betrachtungsweise wurden die Pflanzen in die beschrie-

benen drei Kategorien (vgl. III.2.4.1) eingeteilt: (a) beide Keimblätter besitzen vollständig ge-

schlossene Areolen, (b) ein Keimblatt besitzt vollständig geschlossene Areolen und eines eine

gestörte Nervatur und (c) beide Keimblätter besitzen eine gestörte Nervatur (vgl. Abbildung 23,

Tabelle 9). Deutlich zeigt sich hier, dass je weiter der Integrationsort der T-DNA im Gen liegt,

wie bei SALK_597798, desto häufiger (Faktor 3 in Bezug auf den Wildtyp) erscheinen beide

Keimblätter in einer Pflanze mit abnormaler Nervatur. Demgegenüber stehen die Auswertun-

gen der Überexpressionslinie. Hier zeigt sich ein positiver Effekt auf die korrekte Ausbildung

der Xylemstränge. Es treten nur noch unter 5 % der Keimblätter von Kategorie (c) auf. Die

Mutanten besitzen ein deutlich verändertes Gefäßbündelmuster, wohingegen ihre Gesamtmor-

phologie im Wesentlichen normal erscheint (s. III.2.4.2). Neben der beschriebenen vep1-1D

Mutante von Jun et al. (2002) und der hier untersuchten Pflanzenlinien werden weitere Mutan-

ten beschrieben, welche ein verändertes Gefäßsystem in den Blättern aufweisen. In der monop-

teros (MP) Mutante sind die Randvenen der Blätter entweder unterbrochen oder fehlen gänzlich

(Berleth und Jürgens, 1993). Die Pflanzen mit fass und fackel Abnormalität zeigen gestörte

Ausbildung der lateralen Venen auf (Mayer et al., 1991; Torres Ruitz und Jürgens, 1994). Eine

weitere Mutante, die lopped 1, bestitzt einen Defekt in dem basipetalen Auxintransport, welcher

sich durch verengte Blätter mit einer gespaltenen und verdrehten Mittelvene ausprägt (Carland

und McHale, 1996). Auch über die monopteros Abnormalität wurde ein reduziertes Aufnahme-

vermögen des polaren Auxintransprots beschrieben (Przemek et al., 1996). Das MP Gen kodiert

für ein Transkriptionsfaktor. Dieser ist als Regulator der Genaktiviät als Antwort auf Auxinsig-

nale involviert. Die resultierenden Effekte beeinflussen die embryonale Achsenformation und

Gefäßssystemausbildung (Hardtke und Berleth, 1998). Weitere Mutanten wurde von Koizumi

et al., 2000, beschrieben, welche umfassend als van (vascular network) bezeichnet werden und

eine Fragmentierung bzw. Fehlen der lateralen Venen hervorrufen. Die genannten Mutanten

wurden ursprünglich in der Beeinflussung der Formausbildung des Keimlings identifiziert, wel-

che ihren Ursprung in einer veränderten Embryogenese haben. Daher ist es wahrscheinlich,

dass das Auftreten der abnormalen Nervatur als sekundärer Effekt anzusehen ist, welcher durch

einen veränderten Pflanzenaufbau in der Embryogenese bedingt ist (Koizumi et al., 2000). Eine

Involvierung dahingehend wäre auch für das VEP1 Gen möglich. Jedoch steht der Phänotyp im

Diskussion

113

Gegensatz zu dem in den anderen bekannten Mutationen beobachteten Venenmuster. In diesen

Mutanten wird die Gesamtarchitektur des Venenmusters stark verändert (Jun et al., 2002). Es

ist anzunehmen, dass das VEP1 Gen eher als positiver Regulator in der Entwicklung der Ner-

vatur in der Embryogenese Einfluss nimmt. Die Expressionsdatenanalyse des Arabpidopsis eFP

Browsers zeigt hier eine fünf- bis siebenfache Erhöhung des VEP1 Transkripts in getrockneten

Samen und Keimlingen ohne Schoten des Stadiums 8 bis 10. Diese entsprechen einem Embry-

ostadium mit zusammengerollten und grünen Kotyledonen. Im Vergleich dazu ist die Expres-

sion in ausgereiften Keimblättern reduziert (Abbildung 54).

Diskussion

114

Abbildung 54: Expressionslevel des VEP1 in Arabidopsis thaliana Darstellung des eFP-Browsers als Balkendiagramm: Abszisse: Expressionssignale basierend auf Microarary Daten des VEP1 Gens, berechnet mit der GCOS (GeneChipOperatingSoft-ware), TGT = Schwellenwert von 100; Bkg = Normalisationswert von 20; Ordinate: Unter-suchte Pflanzenabschnitte bzw. Pflanzenstadium; (http://bar.utoronto.ca/efp/cgi-bin/out-put/efp-mv3Hce.png)

Diskussion

115

Während der normalen Entwicklung können adaptive Reaktionen auf Verwundung der Pflanze

oder abnormale Wachstumsbedingungen eine Auswirkung auf die Gefäßmusterbildung haben

und spiegeln damit eine hohe Flexibilität in der Anpassung an Umweltbedingungen wider. Das

VEP1 Gen wurde in einer vorherigen Arbeit als AWI Gen bezeichnet und spezifisch nach

Verwundung der Pflanze induziert und exprimiert (Yang et al., 1997). Dies bestätigten auch

Promotor Studien anhand eines VEP1-Promotor-GUS Fusioneskonstrukts in transformierten

Arabidopsis Pflanzen (Jun et al., 2002). Der Nachweis auf Promotoraktivität erfolgte drei

Stunden nach der Verletzung durch einen histochemischen Farbnachweis mit X-Gluc (5-Brom-

4-chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronsäure (Jefferson, 1987; Jefferson et al., 1987; Platteeuw et al.,

1994). Eine deutliche Färbung trat um die Verletzungstellen auf (Jun et al., 2002). Durchaus ist

daher eine Beteiligung des Enzyms auch in Zusammenhang mit Stressinduktoren sowohl in der

Keimung als auch in Abwehrmechanismen der Pflanze möglich (Alméras et al., 2003;

Reymond et al., 2000). Überlegungen dahingehend wurden in der Dissertation von Dr. Peter

Bauer (2012) aufgegriffen. Es wurde eine Rolle des VEP1 im Jasmonatstoffwechsel diskutiert.

In der Biosynthese zu Methyljasmontat, welches ein pflanzliches (Stress-)Hormon als Antwort

auf biotischen und abiotischen Stress ist und in der Folge zahlreiche Entwicklungsvorgänge

auslöst (Cheong und Choi, 2003), wäre OPDA („12-oxo-phytodenoic acid“) ein denkbares

Substrat für eine Progesteron-5β-Reduktase. Dieses wurde jedoch nicht von dem

rekombinanten rAtP5βR Protein akzeptiert (Bauer, 2012). Ein weiteres Pflanzenhormon,

welches als Stressfaktor Einfluss auf die Entwicklung von Pflanzen nimmt, ist die

Abscisinsäure. Die Biosynthese dieses Stoffes findet vor allem in Blättern als allgemeine

Stressantwort (vor allem bei Trockenstress) statt. Die Biosynthese geht vom Abbau von

Carotinoiden in den Plastiden zu Xanthoxin aus (Weiler und Nover, 2008). Dieses wird im

Cytoplasma zur Abscisinsäure (ABA) oxidiert. Abscisinsäure wirkt allgemein antagonistisch

zu anderen wachstumsfördernden Phytohormonen wie den Auxinen und ist dadurch ein

natürlicher Wachstumsinhibitor (Weiler und Nover, 2008). Involviert ist ABA in der

Blattseneszenz, Fruchtreife und Samenruhe. Zur Keimung ist das Verhältnis zwischen ABA und

Gibberellinen wichtig. Im Katabolismus (Abbildung 55) wird die Absicinsäure durch das

Schlüsselenzym ABA 8´-Hydroxylase, kodiert durch Cytrochrom P450 CYP707A, zu 8´-

Hydroxy-ABA inaktiviert (Kushiro et al., 2004; Nambara und Marion-Poll, 2005; Weiler und

Nover, 2008).

Diskussion

116

Abbildung 55: Katabolismus der Abscisinsäure in Pflanzen Abscisinsäure ((+)-S-ABA) wird durch eine Hydroxylase zu 8´-Hydroxy ABA, welches sich zur Phaseinsäure umwandelt. Eine Inaktivierung von ABA kann auch durch eine Gluco-syltransferase eintreten. (aus Kushiro et al., 2004)

Auf Grund des Strukturelements einer ungesättigten Carbonylgruppe wäre ABA ein mögliches

Substrat für Progeseron-5β-Reduktasen. Denkbar wäre demnach durch die erhöhte Tran-

skriptrate in trockenen und keimenden Samen eine Beteiligung der AtP5βR in der Inaktivierung

der Abscisinsäure. Dies gilt es zu überprüfen.

2.2. Interaktion von VEP1 mit Methyvinylketon als Stressinduktor von HEL (PR4)

Progesteron-5β-Reduktasen können Moleküle mit aktivierter C=C Doppelbindung wie mono-

cyclische Enone oder acyclische Enonester reduzieren (Burda et al. 2009; Munkert et al., 2011).

Kleine α,β-ungesättigte Carbonylgruppen, wie Methylvinylketon (3-Buten-2-on), können ei-

nerseits als Substrat der Progesteron-5β-Reduktasen fungieren, anderseits konnten diese als

hochpotente Regulatoren der Genexpression beschrieben werden (Alméras et al., 2003). Mit

MVK behandelte A. thaliana Col-0 zeigten eine induzierte Genexpression des HEL (PR4) Gens,

welches eine Rolle in der Abwehr von Pathogenen spielt (Potter et al., 1993). Der Einfluss des

VEP1 Gens auf das HEL Gen nach Inkubation mit MVK wurde mittels Überexpressionsmu-

tante und „knock out“ Linie untersucht. Im Vergleich der qPCR Daten und Aktivitätsdaten des

Rohextraktes von unbehandelten Pflanzen des Wildtyps und der Überexpressionsmutante

konnte zwar eine Erhöhung in den Daten der AthVvP5βR verzeichnet werden, welche aber nicht

als deutlich unterschiedlich anzusehen ist. Generell verhielten sich die A. thaliana Col-0 und

AthVvP5βR in den Transkriptionsraten des VEP1 Gens, HEL Gens und der AtP5βR-Aktivität

im Rohextrakt gleich (s. III.2.5; 0; III.2.6). Durch MVK Inkubation der Linien AthCol-0 und

AthVvP5βR konnte nach 3 h und 24 h eine signifikante Zunahme des VEP1 Transkripts detek-

Diskussion

117

tiert werden (Abbildung 28). Folglich hätte auch eine Erhöhung der Enzymaktivität im Rohex-

trakt vermutet werden können, welche jedoch gleich der Aktivität von unbehandelten Pflanzen

war. MVK kann durch Progesteron-5β-Reduktasen zu Methylethylketon umgesetzt werden

(Munkert, 2014). Eine mögliche Argumentation wäre demnach, dass im Pflanzenrohextrakt

nach 3 h und 24 h MVK Inkubation nur noch ¼ des freien Enzyms zur Umsetzung von Proges-

teron im Assay zur Verfügung stünde und die restlichen AtP5βR Proteine durch MVK abge-

stättigt wären. Für die „knock out“ Mutante SALK_597798 konnte eine marginale Transkript-

menge an VEP1 anhand der qPCR Daten registriert werden (Abbildung 28). Diese könnte auf

die verwendete Primerpaarung JM721DIR/JM1119REV zurück zu führen sein, welche ein 462

bp langes Genstück nach der T-DNA Insertionsstelle amplifizieren. Auf Grund der hohen Spe-

zifität der Primer mit einer Effiezienzkalkulation von 104 % könnten noch eine geringe aber

vollständig, mit Insertion, transkribierte mRNA-Mengen messbar sein, welche anschließend zu

keinem aktiven Protein in der Pflanze translatiert werden können. Eine Umsetzung von Proges-

teron konnte weder in Blattrohextrakten der SALK_597798 Linie von unbehandelten Pflanzen,

noch in jenen mit MVK behandelten Pflanzen nachgewiesen werden. Demnach kann die im

Wildtyp und in der Überexpressionsmutante detektierte Progesteron-5β-Reduktasen Aktivität

dem AtP5βR zugeordnet werden. Eine Reduktionsbeteiligung des Proteins codiert durch

At5g58750 an Progesteron im Rohextrakt von ungestrestten und MVK gestressten Pflanzen

kann ausgeschlossen werden. Das HEL (PR4) Gen wird als „Hevein like protein- pathogenesis

related“ Gen bezeichnet und codiert ein Protein mit antifungaler Wirkung (Potter et al., 1993;

Bertini et al., 2012). Das Gen wird durch Verwundung der Pflanze durch Pieris rapae Raupen

(kleiner Kohlweißling), Pathogene wie TCV (Turnip crinkle Virus) oder den Pilz Alternaria

brassicicola (Kohlschwärze) als Stressimmunantwort zur Abwehr induziert (Potter et al., 1993;

Thomma et al., 1999; Reymond et al., 2000; Bertini et al., 2012). Die Expression wird hierbei

über den Ethylen/Jasmonat abhängigen Signaltransduktionsweg herbeigeführt, was Studien

durch exogen verabreichtes Ehylen und Methyljasomonat bekräftigen (Potter et al., 1993;

Thomma et al., 1998 und 1999). Daneben kann eine Induktion auch durch reaktive elektrophile

Moleküle wie Acrolein und Methylvinylketon ausgelöst werden (Alméras et al., 2003). Eine

deutliche Genexpressionssteigerung von HEL (PR4) in A.thaliana Col-0 nach 3 h MVK Inku-

bation wie nach Alméras et al., 2003, konnte nicht detektiert werden. Eine eindeutige Induzie-

rung des HEL Gens konnte nach 24 h Inkubation um den Faktor 7 im Vergleich zur Kontrolle

in Wildtypflanzen nachgewiesen werden. In der SALK_597798 Mutante trat eine vierzehnfa-

che Erhöhung von HEL (PR4) schon nach 3 h, im Vergleich der zugehörigen Kontrolle (Abbil-

Diskussion

118

dung 29), auf. Daraus folgt, dass eine Reduzierung des VEP1 Transkriptes sowie dessen Trans-

lation, Einfluss auf die Stressantwort auf MVK durch HEL hat. Diese tritt in A. thaliana Col-0

im Vergleich zur „knock out“-Mutante verzögert nach 24 h und nicht schon nach 3 h auf. Be-

gründet werden kann dies, da das MVK ein Substrat für AtP5βR ist und freies MVK in der

Pflanze umgesetzt werden könnte. Methylvinylketon sowie Acrolein entstehen in der Pflanze

durch Lipidoxidation und schädigen das Photosynthese-System II gravierend (Alméras et al.,

2003; Yamauchi et al., 2011). Neben der Eigenschaft als Signalinduktor bei Stress und somit

eine positive Beteiligung an der Signaltransduktion für Abwehrmechanismen, steht dazu im

Gegensatz die zelltoxische Wirkung durch Beschädigung von Biomolekülen, wie Proteinen und

Nukleotiden (Alméras et al., 2003; Weber et al., 2004). Daher ist eine Entgiftung der reaktiven

Carbonylgruppen wichtig für das Gleichgewicht der Zelle (Yamauchi et al., 2011). In Ara-

bidopsis katalysieren verschiedene Enzyme eine NADPH-abhängige Reduktion von α,β-unge-

sättigte, sowie gesättigten Aldehyden in Chloroplasten sowie im Cytosol. Mehrere Gene aus

Arabidopsis, welche zu einem Gen kodierend für eine Alkenal/-on Oxidodreduktase (AOR) aus

Cucumis sativus homolog sind, wurden in den Studien von Yamauchi et al, 2011, identifiziert.

Auf Grund phylogenetischer Homologiestudien basierend auf den Proteinsequenzen wurden

fünf in den Chloroplasten (Chl) lokalisierte und zwei im Cytosol (Cyt) sich befindende

NADPH-abhängige Reduktasen verschiedener Proteinsuperfamilien zugeordnet (Abbildung

56, A). Eine AtAOR (At1g23740) sowie eine AtAER (Alkenal Reduktase, At5g16970) wurden

der MDR („medium-chain dehydrogenase/reductase“) Superfamilie zugeordnet. Eine AtAKR

(At2g37770), aus der Aldo-Keto-Reduktase Superfamilie (AKR) stammend, wurde identifiziert

sowie zwei in den Chloroplasten anzutreffende Alkolhol-Dehydrogenasen/Reduktasen (ADR),

At1g54870 und At3g04000, und zwei cytosolische ADRs (At2g24190 und At3g61220) wurden

der SDR-Superfamilie („short-chain dehydrogenase/reductase“) zugeordnet.

Diskussion

119

Abbildung 56: NADPH abhängige Reduktasen aus Arabidopsis thaliana A Phylogenetische Analyse der Aminosäurensequenzen der beschriebenen Enzyme aus Ara-bidopsis, modifizierte Abbildung durch Farbhinterlegung: blau = MDR („medium-chain de-hydrogenase/reductase“) Superfamilie mit AtAOR (At1g23740) und AtAER (At5g16970); gelb = AKR (Aldo-Keto Reduktase) Superfamilie mit AtChlAKR (At2g37770); grün = SDR („short-chain dehydrogenase/reductase“) Superfamilie mit AtADRs (Cyt: At2g24190, At3g61220; Chl: At1g54870, At3g04000); B Strukturen der Moleküle, welche als Substrat katalysiert wurden, Farbcodierung analog der zugehörigen Proteinsuperfamilie: blau = Sub-strate der AtAOR (At1g23740); gelb = Substrate der AtChlAKR (At2g37770); grün = Sub-strate der AtADRs; (Yamauchi et al., 2011)

Verschiedene α,β-ungesättigte Moleküle wurden als Substrat durch die oben aufgeführten Pro-

teine als rekombinante Enzyme getestet (Abbildung 56, B). Dabei setzten die rekombinanten

AtADRs sowie AtAKRs kein Methylvinylketon um. MVK konnte nur von der rAtAOR, welche

in vivo in den Chloroplasten lokalisiert ist, reduziert werden. Das VEP1 (At4g24220) wird auf

Grund seiner Homologie zur Digitalis lanata P5βR, der „short chain dehydrogenase/reductase“

SDR-Proteinfamilie zugeordnet (Persson et al., 2003; Egerer-Sieber et al., 2006; Gavidia et al.,

2006, Thorn et al., 2008). Verschiedene Studien zur Substratspezifität von rekombinanten Pro-

gesteron-5β-Reduktasen aus A. thaliana, sowie aus anderen Pflanzen, zeigen eine Vielzahl von

angenommenen Molekülen und weisen somit eine hohe Substratpromiskuität auf. Cyclische

Enone, wie 2-Cyclohexen-1-on, können als Substrat fungieren (Burda et al., 2009; Schebitz et

al., 2010; Bauer et al., 2010; Munkert et al., 2011; Durchschein et al., 2012). Cyclohexenon

wird von der rekombinanten CsAOR der Gurke nicht als Substrat angenommen und wurde als

weiteres Substrat für NADPH-abhängigen Reduktasen aus Arabidopsis nicht weiter in Betracht

gezogen (Yamauchi et al., 2011). Die rekombinante AtSt5βR hingegen zeigt eine hohe relative

Enzymaktiviät von 559 % für Cyclohexenon in Bezug auf die Umsetzung von Progesteron

Diskussion

120

(100 %) (Burda et al., 2009). Auf Grund der Annahme, Progesteron-5β-Reduktasen könnten

eine umfänglichen physiologische Rolle in Pflanzen als potentielle „Pontoon-Elemente“ in ver-

schieden Biosynthesen spielen (Bauer et al., 2010), wäre dem AtP5βR, als ein weiterer cytoso-

lischer Vertreter der NADPH-abhängigen Reduktasen, eine Rolle in der Entgiftung kleiner so-

wie cyclischer, reaktiver Moleküle anzudenken.

3. Diskussion der Ergebnisse zu P5βR aus Vitis vinifera

Alle bis dato isolierten P5βR Gene werden der VEP1 (Vein Patterning 1) Genfamilie zugeord-

net, deren Ursprung offenbar in einem α-Proteobakterium liegt und sich durch horizontalen

Gentransfer verbreitet hat. Während bei Pilzen die Tendenz sichtbar ist das aufgenommene Gen

wieder zu verlieren, scheint es bei den Pflanzen eine wichtige Aufgabe übernommen zu haben,

weshalb es erhalten bleibt (Tarrío et al., 2011; Bauer et al., 2012). Die Mehrzahl der Progeste-

ron-5β-Reduktasen wurde aus Pflanzen der Ordnungen Gentianales, Brassicales oder Lamiales

beschrieben. Im Zuge des Genomprojekts von Vitis vinifera (Ordnung Vitales) konnte durch

Sequenzvergleich ein Steroid-5β-Reduktase Gen, welches zugehörig zu einem hypothetischen

Protein des Locus LOC100247199 (Chromosom 18) ist, identifiziert werden. Über die Koope-

ration mit Dr. Stefan Martens, FEM-IASMA, Italien, konnte das etablierte Transformationssys-

tem für Vitis vinifera genutzt werden. Ziel war es, die physiologische Rolle der Progesteron-

5β-Reduktasen aus der VEP1 Genfamilie weiter aufzuklären.

3.1. Physiologische Rolle des VvP5βR Gens

Es wurde eine Transformationslinie erstellt sowie eine vom FEM-IASMA Institut zur Verfü-

gung gestellt. Die Überexpressionslinie (GT11) und eine „Silencing“-Linie (GT13) wiesen Re-

sistenz gegenüber Kanamycin auf und wurden mittels PCR positiv auf ihre T-DNA Integration

getestet. Jedoch war nur von GT13 eine Regeneration zu Pflanzen möglich. Interessanterweise

konnte die Überexpressionslinie sich nicht weiter entwickeln und verblieb im Kallus-Stadium.

Eine letale Auswirkung eines zusätzlichen VvP5βR Gens stünde im starken Gegensatz zur be-

obachteten Involvierung des Gens in Arabidopsis und ist daher zweifelhaft. Eine Insertion der

T-DNA Region in einen Genombereich von Vitis, welcher zur Unterbrechung der Entwicklung

führt, wäre denkbar, aber auf Grund der Tatsache, dass die gesamte Kalluslinie ein verzögertes

Wachstum aufweist, unwahrscheinlich. Unabhängig voneinander müsste die Integration in je-

der transformierten Kalluszelle stattgefunden haben. Durch die Agrobakterien abhängige

Transformation kann ein stabiles Einbringen von Fremd-DNA in das Wirtsgenom stattfinden,

dennoch ist die Effizienz gering (Perl et al., 1996). Daher werden nur wenige Kalluszellen stabil

transformiert. Durch die Selektionsphase werden nicht resistente Zellen aussortiert, nekrotisch

und sterben ab. Da die Kalluszellen im Verbund sind, wäre es möglich, dass die Nekrose auch

Diskussion

121

auf transformierte Zellen übergreift und deren Wachstum inhibiert. Es wurde der Focus daher

auf die RNAi-Linie GT13 gelegt. Hier war es nach 17 Monaten möglich regenerierte Pflanzen

zu erhalten. Als Kriterium zur Nervaturausprägung wurde die Anzahl der Verzweigungspunkte

(NBPs) bis zur quartären Vene gezählt. Dabei wurde die Stängelposition der Blätter mit einbe-

zogen. Es zeigte sich, dass je älter das Blatt ist, desto mehr NBPs zu verzeichnen sind. Eine

klare Linie konnte anhand der ausgezählten Verzweigungspunkte zwischen einer regenerierten

Chardonnay Wildtyp-Linie und der GT13-Linie nicht herausgearbeitet werden. Jedoch zeigte

sich eine Tendenz in den Pflanzen 1 und 3, bei denen unerwartet eine Erhöhung der NBPs

(GT13/1: 2772; GT13/3: 1881) festgetellt wrude. Im Vergleich dazu haben Blätter des Wild-

typs, abgenommen von einer mittleren Stängelspostion, 1380 NBPs. Bei der Betrachtung der

Blätter fiel auf, dass diese auch eine intensivere Blattnervatur sowie eine gesägte Blattlappung

aufwiesen. Obwohl kein Unterschied in den NBPs von Pflanze 5 zum Wildtyp erkennbar war,

ging die Nervaturintensität in dieser zurück. Unter der Annahme, VvP5βR analog zum VEP1 in

der Nervaturausprägung involviert ist, wurden zustätzlich die qPCR Daten der Transkriptions-

rate des VvP5βR in den Pflanzen Wildtyp und GT13/1 bis GT13/5, betrachtet. In Bezug auf den

Wildtyp wurde in GT13/1 eine 50 %ige und in GT13/3 eine 30 %ige Erhöhung des VvP5βR

Transkriptes gemessen. Die Real-Time-PCR-Daten und die korrelierende Intensivierung der

Blattnervatur in GT13/1 und GT13/3 deuten eher auf eine Überexpression, welche eigentlich

nicht vereinbar ist mit dem eingebrachten Vektorkonstrukt. Die Pflanze 5 der RNAi-Linie wies

eine 40 %ige Reduzierung des VvP5βR Transkriptes in Bezug auf den Wildtyp auf. Auf Grund

der Kanamycinresitzenz der Pflanzen muss die T-DNA Region des binären Vektors

pK7WGIGW2(I) vollständig in das Weingenom inseriert worden sein. Der Transfer der

T-DNA wird durch die rechte Grenzsequenz RB initiiert und durch die linke Grenzsequenz LB

terminiert. Vor der LB-Basenabfolge befindet sich das nptII, codierend für die Kanamycinre-

sistenz. In den binären Vektor wurde die vollständige cDNA des VvP5βR rekombiniert. Dies

ergibt ein Hairpin-Konstrukt mit einem Stamm von 1200 nt Länge. Studien über die Hairpin-

Stammlänge und dessen Effekt auf die Effizienz des Gen-Silencing ergaben eine häufig ver-

wendete Länge von 200 bis 500 nt (Hirai und Kodama, 2008). Ein „Knock down“ eines Gly-

cosgensynthase Gens (GBSSI) konnte auch mit einem Hairpin-Konstrukt mit einer Länge von

1100 nt gelingen (Heilersig et al., 2006). Die Effizienz der Stilllegung ist nicht nur abhängig

von der gewählten Stammlänge des Konstruktes, sondern auch von der ausgewählten Zielse-

quenz (Hirai und Kodama, 2008). Die erhöhten qPCR Daten von GT13/1 und GT13/3 könnten

demnach ein falsch positives Signal darstellen, da mRNA des Hairpinkonstruktes detektiert

Diskussion

122

werden könnte vor dessen Abbau. Denkbar wäre auch, dass die eingebrachte T-DNA nicht voll-

ständig transkribiert wird. Die Gateway-Kassetten sind in dem verwendeten binären Vektor

dahingehend angeordnet, dass die erste inserierte cDNA „in sense“ orientiert ist. Ein Abbruch

der Transkription vor bzw. im Intron-Bereich würde eine mRNA des eingebrachten VvP5βR

erbringen und eine Überexpression darstellen. Unter diesem Gesichtspunkt würden die qPCR

Daten mit der beobachteten Intenstität der Nervatur in den Blättern einhergehen. GT13/1 zeigt

die intensivste und verzweigteste Nervatur mit einer stark gesägten Blattlappung. Eine Ab-

schwächung dieser Beobachtung weist GT13/3 auf. Die in der Transkriptionsrate reduzierte

Pflanze GT13/5 enspricht der Blattlappung des Wildtyps, jedoch ist sie in der Nervaturstärke

reduziert. Die beobachtete Tendenz der Blattnervaturintenstität lässt eine Involvierung des

VvP5βR analog zu VEP1 aus Arabidopsis in die Ausbildung der Blattnerven vermuten, jedoch

kann dies nicht eindeutig belegt werden und bedarf einer weiteren Betrachtung von repräsenta-

tiver Blatt- und Pflanzenanzahl.

3.2. Charakterisierung des rekombinanten VvP5βR Proteins

Eine Vielzahl an Sekundärmetaboliten weisen Sturkturmerkmale von Produkten bzw. Substra-

ten der Progesterone-5β-Reduktasen auf (Styger et al., 2011; Forester und Waterhouse, 2009;

Boto-Ordóñez et al., 2013). Die „full length“ VvP5βR cDNA wurde zunächst in den Gateway

Expressionsvektor pDEST17 für die Produktion eines N-terminalen Histidinfusionsproteins re-

kombiniert. Dies sollte eine in vitro Charakterisierung des rekombinanten VvP5βR Proteins er-

möglichen. Aufgrund der Aggregation des rekombinanten Proteins in „Inclusion Bodies“ wäh-

rend der Expression in E. coli Zellen konnten nur geringe und zudem verunreinigte Mengen

davon aus den Bakterien gewonnen werden (max. 0,5 mg/mL). Es ist nicht auszuschließen, dass

die 25 Basen lange attB1 Seite, welche zwischen der Basenregion des Histidin-Tags und der

eingebrachten cDNA im Vektor liegt, Auswirkungen auf die Löslichkeit des rekombinierten

Proteins hat. Das exprimierte Fusionsprotein besitzt neben den sechs N-terminalen Histidinen

eine zusätzliche Sequenz aus mindestens acht Aminosäuren (Thr-Ser-Leu-Tyr-Lys-Lys-Ala-

Gly). Diese haben laut Invitrogen® keinen Einfluss auf die Expression nach Induktion des Sys-

tems, jedoch könnten die translatierten rekombinierten Proteine unlöslich sein und eine nicht

korrekte Faltung aufweisen (Invitrogen®, Hompage, Fragen und Antworten, Kennung 3223).

Verschiedene Strategien wurden verwendet um der Proteinaggregation entgegenzuwirken

(Schein, 1989; Sørensen und Mortensen, 2005a, b). Neben unterschiedliche langen Expressi-

onszeiten und Temperaturen und E. coli Bakterienstämmen, wurde die cDNA in einen weiteren

Vektor (pQE30) umkloniert. Eine Verbesserung der Löslichkeit konnte aber nicht erzielt wer-

den. Über eine Westernblot-Analyse wurde zwar eine erfolgreiche Induktion und Expression

Diskussion

123

des Proteins ermittelt, jedoch wurde das Protein in den aufgeschlossenen Bakterienpellets de-

tektiert. Daher ist anzunehmen, dass sich das rekombinante Protein unabhängig vom gewählten

Überexpressionsvektors nicht löslich exprimiert wird bzw. die Summe von vielen Faktoren, die

ineinander greifen, eine Rolle spielen. Theoretisch erhöhen auch hydrophope Aminosäuren, vor

allem die Häufigkeit von Prolin in der Proteinsequenz die Wahrscheinlichkeit von „Inclusion

Bodies“ (Schein, 1989). Von 18 Proteinen verblieben 13, mit 3 % bis 7,1 % an Prolinresten pro

insgesamter Aminosäurenanzahl, unlöslich (Schein, 1989). Das VvP5βR Protein würde sich in

diese Reihe mit 6,4 % an Prolinresten (25 Proline pro 391 Aminosäuren) eingliedern. Es konnte

daher eine Charakterisierung des rekombinanten VvP5βR in Grundzügen erfolgen. Die Optima

für Temperatur sowie pH-Wert liegen bei rekombinanten Progesteron-5β-Reduktasen zwischen

40 °C und 45 °C bzw. einem pH-Wert von 7,8 bis 8,5 (Herl et al., 2006; Herl et al., 2009;

Munkert et al., 2011). Die ermittelten Optima der rVvP5βR gruppieren sich in diese Werte mit

45 °C und pH-Wert von 8,0 mit ein. Es wurden drei Substrate auf ihre Umsetzung hin überprüft.

Neben Progesteron wurden Verbindungen, welche aromabestimmend in Weintrauben sind, als

potentielle Substrate ausfindig gemacht (Abbildung 57).

Abbildung 57: Synthese der wichtigsten chemischen, aromagebenden Verbindungen in Wein. Monoterpene sowie C13-Norisoprenoide werden aus Mevalonat gebildet, welches ein Meta-bolit von Acetyl-CoA ist. (Styger et al., 2011)

Diskussion

124

Monoterpene wie Geraniol und Citronellol kommen im Weinmetabolom vor und sind wichtige

chemische Komponenten, die das Weinaroma bestimmen (Iriti und Faoro, 2006; Styger et al.,

2011). Es wurde das Substrat Citral, welches ein Gemisch aus den Steroidisomeren Geranial

(Citral A) und Neral (Citral B) ist, verwendet. Das Substrat Enal-Citral wurde druch Steroidre-

duktase aus Arabdiopsis thaliana sehr gut umgesetzt (Durchschein et al., 2012). Ein weiterer

Vertreter C10-Monoterpene 10-Oxogeranial erwies sich nach Geu-Flores et al. (2012), als sehr

gutes Substrat einer „Iridoidsynthase“ mit sehr hoher Sequenzhomologie zu P5βR. Citral wurde

auch von rVvP5βR umgesesetzt zu Citronellal, welchem ein fruchtiges Aroma zugeordnet wird.

Zudem wurde β-Ionon, welches durch Oxidation von Carotinoiden entsteht und zu den C13-

Norisoprenoiden zählt, getestet. Der chemischen Verbindung wird ein Veilchenaroma zuge-

sprochen, wohingegen die reduzierte Verbindung Dihydro-β-Ionon ein holziges Aroma auf-

weist (Styger et al., 2011; Klesk et al., 2004). Es konnte keine Umsetzung durch die rekombi-

nante VvP5βR detektiert werden. Rückschlüsse auf eine etwaige physiolgische Rolle der nati-

ven VvP5βR können daher noch nicht getroffen werden. Bedingt durch die Aggregation der

rVvP5βR in „Inclusion Bodies“ konnte keine effektive Aufreinigung des Proteins erzielt wer-

den. Hier bedarf es weiterer Lösungsansätzen. Mehrere Studien zeigten einen positiven Effekt

auf die Löslichkeit von rekombinanten Proteinen durch Fusion eines weiteren Proteins, wie das

Hitzeprotein D (gpD) des Bakteriophagen Lambda oder ein Maltosebindeprotein (MBP) (For-

rer und Jaussi, 1998; Nominé et al., 2001; Sørensen und Mortensen, 2005). Eine Analyse des

Weinmetaboloms im Vergleich zum Wildtyp mit der generierten RNAi-Linie könnte weiteren

Aufschluss über die physiologoische Rolle der Enon-Reduktase in vivo bringen. Schritte dahin-

gehend wurden während der Kooperation mit Dr. Stefan Martens am Agrarinstitut Fondazione-

Edmund-Mach in Italien eingeleitet. Blattextrakte von regenerierten Chardonnay Wildtyp

Pflanzen sowie der Linie GT13 wurden mittels Acquity UPLC mit einer Synapt HDMS QTOF

MS (Waters) und einer GC-MS/MS Agilent 7890 A (Agilent Technologies) mit LECO Pegasus

4D CV GCxGC TOF MS (Leco) vermessen. Die erhobenen Datensätze werden auf Grund ihrer

Komplexität noch weiteren statistischen Analysen unterzogen.

4. Diskussion der Ergebnisse zu Digitalis lanata

Herzglykoside werden bis heute aus Digitalis Blättern für medizinische Zwecke gewonnen. Die

Biosynthese dieser ist seit den 90er Jahren in intensiver Forschung. Verschiedene Gene, welche

in den Biosyntheseweg involviert sein sollen, wurden kloniert und charakterisiert und führten

zum postulierten, putativen Biosyntheseweg (Abbildung 2). Eingängig wurde die stereospezi-

fische Reaktion zu 5β-konfigurierte Pregnanen über Progesteron-5β-Reduktasen untersucht.

Bis dato sind keine Überexpressionsmutanten oder Knock-Out bzw. Knock-down Mutanten in

Diskussion

125

Bezug auf die Progesteron-5β-Reduktasen in D. lanata, welche die Rolle jener weiter aufklären

könnte, bekannt. Basierend auf Regenerationsstudien und erlernten und studierten Transforma-

tionssystemen, wurde das Transformationsvermögen in Grundzügen zum weiterführenden Auf-

bau von transformierten Pflanzen, studiert.

4.1. Regeneration von Digitalis lanata

Um positiv transformierte Pflanzen zu erhalten muss ein effektives Regenerationsprotokoll und

Selektionssystem vorliegen. D. lanata sowie Digitalis spec. sind seit Ende der 1970er Objekte

der in vitro Progagierung und Regenerierung aus unterschiedlichen Pflanzenorganen. Eine Li-

teraturzusammenfassung darüber ist in Tabelle 16 aufgelistet. Je nachdem, welches Pflanzen-

organ zur Explantat-Gewinnung verwendet wurde, variierten Medien, Phytohormonzusam-

mensetzung und Kultivierungsdauer. Basierend auf der Dissertation von Yüsecan (2012), sowie

auf gegenwärtigen Regenerationsstudien zu Erysimum spec. im Rahmen einer Doktorarbeit von

El-Nahhas (2014) wurde in Hinblick auf ein einheitliches Regenerations- und Transformations-

system, ein LS-Medium mit dem Auxin IAA (Indol-3-Essigsäure; 0,1 mg/mL) und dem Cyto-

kinin TDZ (Thidiazuron; 0,5 mg/mL) für Kallus- und Sprossinduktion auch für D. lanata ver-

wendet. Zur Wurzelinduktion wurde nur IAA in einer Konzentration von 0,5 mg/L verwendet,

welches sich als sehr effektiv erwies (Yücesan et al., 2013). Es zeigte sich, dass das Medium

zur Kallusinduktion nicht geeignet ist. Die ausgelegten Blattstücke zeigten eine hohe Nekrose

an. Nur an den Rändern wiesen 17 % der 115 Blattsegmente eine Kallusformation auf. In Hin-

blick auf die Regeneration von transformierten Pflanzen durch Agrobakterieninfektion von

Blattstücken muss ein besseres Medium zur Kallusinduktion verwendet werden. Medien mit

der Kombination von NAA (1-Naphtylessigsäure) und BAP (Benzylaminopurin) auch BA

(Benzyladenin) genannt, sind daher eher zu empfehlen (Li, 1981; Fatima et al., 2009; Yücesan

et al., 2013). Nach sechs Wochen bildeten sich die ersten embryogenen Strukturen an den Kalli

aus. Ab der dritten Subkultivierung wurden 30 % an neuen Sprossstrukturen an Kalli gezählt.

Diese konnten nach einer weiteren Subkultivierung von zwei Monaten auf Rooting Medium

umgesetzt werden. Die Regeneration von anfänglichen Blattstrukturen zu einer Blattrosette mit

normalen Habitus sowie Wurzelbildung verlief innerhalb eines Monats. Nach insgesamt sechs

bis acht Monaten konnten regenerierte Pflanzen in Erde überführt werden. Dieses geht einher

mit den Literaturdaten aus Tabelle 16.

Diskussion

126 T

abelle 16: Literaturzusamm

enfassung fü

r Propa

gierung, R

egene

rierun

g und T

ransformation

von Dig

italis A

rten

Regenera-tionsdauer

6,5 Mona-te

5 Wochen bis erste Blattstruk-turen sichtbar

min. 5 Monate

7 Monate

8 Monate

6 Monate

6 Monate

Induktion

Kallus Spross und Wurzel

Kallus Spross Wurzel

Kallus Spross und Wurzel

Spross und Wurzel



Kallus und Spross Wurzel

Phytohormone der Gruppe

Cytokinine

BAP (0,6 mg/L) BAP (0,1 mg/L)

BAP (5 µM)

BAP (3 mg/L) BAP (6 mg/L) BAP (3 mg/L)

BAP (3 mg/L) BAP (0,25 mg/L)

TDZ (0,5 mg/L)

Gibberiline

GA3 (0,5 mg/L)

Auxine

2,4-D (5 mg/L) Auxin frei

NAA (1,5 mg/L) 2,4,5-T (0,5 mg/L) IAA (0,2 mg/L) IAA (0,2 mg/L)

2,4-D (5 mg/L) Auxin frei

IAA (0,5 µM) IBA (2 mg/L)

NAA (6 mg/L) NAA (6 mg/L)

NAA (2 mg/L) IAA (0,5 mgL)

IAA (0,25 mg/L) IAA (0,5 mg/L)

Me-dium

NN

MS

NM

MS

MS

LS

LS

Explantat

Antheren

Protoplas-ten

Blüten-filament

Merstem-zellen

Blätter

Blätter

Blätter

Pflanze

D. purpurea

D. lanata

D. lanata

D. lanata

D. lanata

D. lamarckii

D. davisiana D. cariensis D. trojana

Literatur

Corduan und Spix (1975)

Li (1981)

Tewes et al. (1982) Kuberski et al.(1984) Reinbothe et al. (1990)

Schöner und Rein-hard (1986) Fatima et al. (2009)

Yücesan et al. (2013)

Yücesan (Dissertation, 2012)

Diskussion

127

4.2. Transformation von Digitalis lanata

Durch die Etablierung von binären Pflanzenvektoren mit je einem Konstrukt für Überrexpres-

sionstudien und einem Konstrukt für RNAi Studien in Pflanzen (s. III.1) und einer Auswahl an

verschieden virulenten Agrobacterium tumefaciens Stämmen, konnte die Transformation von

D. lanata in Grundzügen begonnen werden. Um einen ersten Einblick in das Transformations-

vermögen von D. lanata zu erhalten wurde die Infiltrationsmethode in Blättern gewählt. Erste

Studien zur Agrobacterium-vermittelten Transfektion wurden 1990 von Moldenhauer et al.

durchgeführt. Beschrieben wurde eine Infektion von Blättern mit verschiedenen Agrobacterium

tumefaciens Stämmen und natürlichen Ti-Plasmiden. Blätter von Pflanzen, die mit einem Skal-

pell, versetzt mit Agrobakterien, verletzt wurden, bildeten Gallentumore („crown galls“) aus.

Eine Infiltrationsmethode in Bezug auf Digitalis wurde in der Literatur nicht gefunden. In die-

ser Arbeit wurde erstmalig die transiente Expression eines gfp Gens unter dem Einfluss des

CaMV 35S Promotors mittels Fluoreszensemission des gebildetetn GFP Protein nach einer An-

regung von 450 nm in Blättern von D. lanata Pflanzen detektiert und über einen molekularbio-

logischen Nachweis mittels PCR und Sequenzierung bestätigt (s. III.4.1.2.1). Eine positive tran-

siente Transformation könnte ein Hinweis darauf sein, dass auch die Pflanze stabil transfor-

mierbar sein könnte. Jedoch wurde anhand von A. thaliana gezeigt, dass eine gut stabil tranfor-

mierbare Pflanze Defizite in der transienten Transformation durch Blattinfiltration aufweist

(Wroblewski et al., 2005; Kim et al., 2009; Tsuda et al., 2012). Studien zur stabilen Transfor-

mation von Digitalis spec. wurden über Kallusinduktion von Blattstückexplantaten, behandelt

mit Agrobacterium tumefaciens, angestrebt (Lehmann et al., 1995; Sales et al., 2002, 2003,

2007). Eine positive Regeneration von stabil transformierter Digitalis minor wurden in den

Studien von Sales et al., 2002, 2003 und 2007 beschrieben. Die hier verwendete Methode zur

Transformation geht einher mit der von Sales et al. (2003), beschriebenen AgrobakterienAn-

zucht und Inokulation der Blattstücke (s. II.2.4.14). Neben dem beschriebenen Medium wurde

auch Blattstücke auf ein Medium mit der Kombination der Phytohormone IAA und BAP aus-

gelegt (nach Sales et al., 2003). Es konnten keine Kalli induziert werden, weder bei unbehan-

delten noch mit Agrobakterien behandelten Blattstücken. Blattexplantate auf Regenerationsme-

dium bzw. Selektionsmedium mit der Phytohormonkombination IAA und TDZ wiesen 14,7 %

bzw. 3 % Kalli auf. Letztere verblieben ohne Wachstum und nekrotisch. Es konnten keine trans-

formierten Kalli bzw. Pflanzen gewonnen werden. Hier bedarf es einer Optimierung insbeson-

dere der Kalluspropagierung, wie schon unter 4.1 erwähnt. Analog zur erworbenen Transfor-

mationsmethode von Vitis vinifera Kalluskulturen (s. II.2.4.9) wurden Kalli, gewonnen aus der

Regenerationslinie (diese Arbeit), und der K3OHD Dauerkulturlinie (Kreis et al., 1988) zur

Diskussion

128

Inokulation mit Agrobakterien verwendet. Es wurden verschiedene Stämme von Agrobakterien

zur Transformation benutzt. Zum einen C58 mit integrierten p1425 Vektor, welcher bei der

transienten Transformation verwendet worden war, zum anderen die Stämme AGL1 und

GV3101 mit jeweils dem erstellten Vektor pEarly100 mit inserierter full length cDNA der P5βR

aus D. lanata zur Überexpression (III.4.1.2.2). Während der ersten Subkultivierung auf Selek-

tionsmedium mussten alle Kalluslinien auf Grund des Überwachsens von Agrobakterien des

verwendeten Stammes AGL1 und GV3101 verworfen werden. Beide Bakterienstämme stam-

men vom Agrobakterium C58 ab und besitzen modifizierte Ti-Plasmide, welche die Virulenz

erhöhen und daher aggressiver in der Transformation agieren als C58 (Holsters et al., 1980;

Lazo et al., 1991; Hellens et al., 2000). Einzig die K3OHD-Zellinie wurde stabil durch das

Agrobakterium C58 mit dem GFP-Konstrukt des Vektors p1425 transformiert. Der Nachweis

erfolgte mittels Flouoreszenzemission nach Anregung der Wellenlänge 450 nm. Erstmalig

wurde im Rahmen dieser Arbeit eine stabile Transformation von Kalluskulturen von Digitalis

beschrieben. Jedoch bedarf es auch in der Kallustransformation weiterer Optimierungen. Stu-

dien über den Einfluss von verschiedenen Agorbakterienstämme in Zusammenhang der zu ver-

wendeten Inokulations-Zelldichte sollten verbessert werden. Weitere Parameter zur Optimie-

rung wären Inokulationszeit und Einfluss der Konzentration von Antibiotika zur Selektion. Eine

alternative Methode wäre die Protoplastentransformation und Regeneration von D. lanata.

1981 wurden von Xiang-Hui Li Protoplasten von D. lanata Blättern isoliert und daraus Pflanzen

regeneriert. Der geringen Ausbeute an regenerierten Pflanzen steht eine schnelle Entwicklung

von Protoplasten über Kallusaggregation und ersten Blattstrukturen in fünf Wochen gegenüber.

Eine erfolgreiche Transformation von Protoplasten publizierte Lehmann et al., 1995. Protop-

lasten wurden aus der Kalluslinie VII gewonnen und mit dem Agrobakterium C58C1 inkubiert.

Verwendet wurde ein Vektor mit den Genen gus, codierenden für eine β-Glucuronidase, und

nptII, codierend für eine Kanamycinresistenz (Diettrich et al., 1991; Deblaere et al., 1985; Leh-

mann et al., 1995). In einer aktuellen Studie an Digitalis purpurea L. von Li et al. (2014) konnte

eine stabile Methode für in vitro Propagierung und agrobakterienvermittelter Transformation

von ausgewachsenen Blätter mittels Adventivsprossbildung entwickelt werden. Die höchste

Regenerations-Effizienz (100 %) mit mehr als sechs adventiven Sprossen pro Blattexplantat

konnte auf einem MS-Medium mit 1,0 mg/mL TDZ und 0,1 mg/mL NAA erziehlt werden.

Innerhalb von max. fünf Monaten konnten aus mit Agrobakterien (GV3101 und GV2260) be-

handelten Blattexplantaten bis 60 % transgene Pflanzen mit Kanamycin-Resistenz und GUS

Aktivität regeneriert werden (Li et al., 2014). Diese Methode könnte als Basis für eine erfolg-

reiche Transformation von D. lanata fungieren.

Zusammenfassung

129

V. Zusammenfassung

Der Biosyntheseweg der 5β-konfigurierten Cardenolide inkludiert die stereospezifische Um-

wandlung von Progesteron zu 5β-Pregnan-3,20-dion durch das Enzym Porgesteron-5β-Reduk-

tase (P5βR). Die korrespondierenden P5βR-Gene werden der VEP1 (Vein Patterning 1) Gen-

familie zugeordnet. Die Frage nach einer allgemeinen physiologischen Rolle der P5βR in Pflan-

zen, bleibt zunächst unklar. Basierend auf der Arbeit von Jun et al. (2002), welche eine deutli-

che Reduzierung der Nervaturkomplexität in Kotyledonen und Rosettenblättern einer Anti-

sense-Suppresions-Muntante, vep1-1D, von Arabidiopsis thaliana aufzeigte, wurden die Pflan-

zeninsertionslinien SALK_597798, SALK_568840 und eine Überexpressions-Pflanzenlinie

mit einem orthologen P5βR Gen aus Vitis vinifera im Vergleich zum Wildtyp hinsichtlich der

Blattmorphologie, sowie die Frage nach einer potentiellen Funktion der P5βR im Abwehr- bzw.

Stressantwortmechanismus der Pflanze untersucht und diskutiert. In den erworbenen T-DNA

Insertionslinien zeigte sich ein deutlicher Einfluss des Integrationsortes der T-DNA im VEP1

Gen. Bei der SALK_597798 Linie zeigte sich eine Häufung an abnormaler Nervatur der Keim-

blätter. Demgegenüber zeigte sich in der Überexpressionslinie ein positiver Effekt auf die kor-

rekte Ausbildung der Xylemstränge. Weniger als 5 % der Keimblätter zeigten abnormale Ner-

vatur. Die Mutanten besitzen ein deutlich verändertes Gefäßbündelmuster, wohingegen die Ge-

samtmorphologie aller Pflanzen im Wesentlichen normal erschien. Es ist anzunehmen, dass das

VEP1 Gen daher eher als positiver Regulator in der Entwicklung der Nervatur in der Embryo-

genese Einfluss nimmt. Kleine α,β-ungesättigte Carbonylverbindungen, wie Methylvinylketon,

können einerseits als Substrat der Progesteron-5β-Reduktasen fungieren, anderseits sind sie

hochpotente Regulatoren der Genexpression. Mit MVK behandelte A. thaliana Col-0 zeigten

eine induzierte Genexpression des HEL (PR4) Gens, welches eine Rolle in der Abwehr von

Pathogenen spielt. Der Einfluss des VEP1 Gens auf das HEL Gen nach Inkubation mit MVK

wurde mittels Überexpressionsmutante und „knock out“ Linie untersucht. Die Reduzierung des

VEP1 Transkriptes hatte Einfluss auf die Stressantwort auf MVK. Diese tritt in A. thaliana Col-

0 im Vergleich zur „knock out“-Mutante verzögert auf. Methylvinylketon sowie Acrolein ent-

stehen in der Pflanze durch Lipidoxidation und schädigen das Photosynthese-System II. P5βR

könnten daher eine Rolle in der Entgiftung reaktiver Enone haben.

Über Agrobakterien vermittelten Gentransfer konnte eine RNAi- Linie von Vitis vinifera mit

einer 40 % Reduzierung des VvP5βR Transkriptes gewonnen werden. Diese zeigte eine Ver-

minderung der Nervaturstärke in Laubblättern. Die beobachtete Tendenz der Blattnervaturin-

tenstität lässt eine Involvierung des VvP5βR analog zu VEP1 aus Arabidopsis in die Ausbildung

der Blattnerven vermuten. Grundlagen für weiterführende Studien zur physiologischen Rolle

Zusammenfassung

130

des VEP1 in Arabidopsis wurden durch die Modifikation der Gateway-Methode als Basis für

die Generierung von binären Pflanzenvektoren und durch den Beginn von Pflanzenmutanten in

Hinblick auf die Komplementierung des „Knock-outs“ der SALK_598876 Linie und die Her-

stellung von Überexpressionsmutanten durch homologer P5βR Gene aus verschiedener Pflan-

zen, geschaffen. Um die Involvierung der P5βR in der Cardennolidbiosynthese aufzuklären be-

darf es in der Folge der Transformation von cardenolidhaltigen Pflanzen, z.B. Digitalis lanata

und Erysimum crepidifloum, einer nahen Verwandten der Modellplanze A. thaliana.

Summary

131

VI. Summary

The biosynthetic pathway of 5β-cardenolides includes the stereospecific conversion of proges-

terone to 5β-pregnane-3,20-dione by the enzyme Porgesteron-5β-reductase (P5βR). The corre-

sponding P5βR genes are members of the VEP1 (Vein Patterning 1) gene family. These findings

challanged the role of this class of enzymes in cardenolide biosynthetic pathway. The question

of a general physiological role of P5βR in plants initially remains unclear. Jun et al. (2002)

disclosed a significant reduction in vein patterning in cotyledons and rosette leaves an antisense

suppresion mutant, vep1-1D, of Arabidiopsis thaliana. Here “knock out” mutants

SALK_597798, SALK_568840 and an overexpression plant line with an orthologous P5βR

gene from Vitis vinifera were compared with regard to leaf morphology as well as the question

of a potential function of P5βR in defense or response to stress. The acquired T-DNA insertion

plant-lines showed a clear influence of the integration site of the T-DNA in VEP1 Gen.

SALK_597798 demonstrated an accumulation of abnormal venation in both cotyledons.

Whereas the overexpression had a positive effect on the correct formation of the xylem. There

were less than 5% of the cotyledons with abnormal veins. The mutants have considerably al-

tered vascular patterns, whereas the overall morphology of all plants generally appeared nor-

mal. It is likely that the gene VEP1 takes part as a positive regulator in vein development during

embryogenesis. Small α, β-unsaturated carbonyl groups, such as methyl vinyl ketone can act as

a substrate of progesterone 5β-reductase, and are described as highly potent regulators of gene

expression and earyl plant developement. A. thaliana Col-0 treated with MVK showed an in-

duced expression of HEL (PR4) gene, which plays a role in the defense against pathogens. The

effect of the VEP1 on HEL was investigated by the overexpression mutant and “knock out”

line. The reduction of the VEP1 transcript influenced stress response to MVK. Compared to

"knock out" mutant A.thaliana Col-0 plants react slower. MVK and acrolein are formed in the

plant by lipid oxidation and damage the photosynthetic system II seriousy. Thus would lead to

the adoption that P5βR could play a role in the detoxification of reactive enones.

An RNAi line of Vitis vinifera with a 40 % transcript reduction of the VvP5βR was obtained by

agrobacterium mediated gene transfer. It showed a reduction in the vein patterning intensity in

foliar leaves. The observed tendency suspect an involvement of VvP5βR analogous to VEP1

from Arabidopsis in the formation of the veins. The “Gateway” method for generating binary

plant vectors was optimized to further study the physiological role of VEP1. Arabidopsis plant

mutants were analyzed in relation to complementation of the "knock-out" SALK_597798 and

the production of overexpression mutants by homologous P5βR genes from different plants.

Future studies have to concentrate on the transformation of cardenolide-containing plants, such

Summary

132

as Digitalis lanata and the A. thaliana relative Erysimum crepidifolium to elucidate the involve-

ment of P5βR in the cardenolid biosynthetic pathway.

Literaturverzeichnis

133

VII. Literaturverzeichnis

Alméras, E., Stolz, S., Vollenweider, S., Reymond, P., Mène-Saffrané, L., Farmer, E.E.

Reactive electrophile species activate defense gene expression in Arabidopsis. Plant J, Gene

Expression Laboratory, University of Lausanne, Biology Building, Switzerland. 2003, Vol. 34

(2), S. 205-216.

Alonso, J. M., Stepanova, A. N., Leisse, T. J., Kim, C. J., Chen, H., Shinn, P., Stevenson, D.K.,

Zimmerman, J, Barajas, P., Cheuk, R., Gadrinab, C., Hellser, C., Jeske, A., Koesma, E., Meyers,

C.C., Parker, H., Prednis, L., Anasari, Y., Choy, N., Deen, H., Geralt, M., Hazari, N., Hom, E.,

Karnes, M., Mulholland, C., Ndubaku, R., Schmidt, I., Guzman, P., Aguilar-Henonin, L.,

Schmid, M., Weigel, D., Carter, D.E., Marchand, T., Risseeuw, E., Brogden, D., Zeko, A.,

Crosby, W.L., Berry, C.C., Ecker, J. R., Genome-wide insertional mutagenesis of Arabidopsis

thaliana. Science, 2003, 301(5633), S. 653-657.

Barker, D. G., Bianchi, S., London, F., Dattee, Y., Duc, G. Medicago truncatula, a model plant

for studying the molecular genetics of the Rhizobium-legume symbiosis. Plant Mol. Biol. 1990,

8, S. 40-49.

Bauer, P., Munkert, J., Brydziun, M., Burda, E., Müller-Uri, F., Gröger, H., Muller, Y.A.,

Kreis, W. Highly conserved progesterone 5β-reductase (P5βR) genes, from 5β-cardenolide-free

and 5β-cardenolide-producing angiosperms. Phytochemistry. 2010, 71 (13), S. 1495-1505.

Bauer, P. Expression und Mutagenese von VEP1-kodierten Progesteron 5β-Reduktasen aus

pharmazeutisch interessanten Angiospermen. Dissertation, FAU Erlangen, 2012.

Bechtold, N., Ellis, J., Pelletier, G. In planta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltra-

tion of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad. Sci. Paris, Life Sciences, 1993, 316,

S. 1194-1199.

Berglund, T., Ohlsson A.B. Effects of ethylene and aminoethoxyvinylglycine on cardenolide

accumulation in tissue cultures of Digitalis lanata. J. Plant Physiol. 1992, 140 (4), S. 395-398.

Berleth, T., Jurgens, G. The role of the monopteros gene in organising the basal body region

of the Arabidopsis embryo. Development, 1993, 118(2), 575-587.

Bernard P., Couturier M. Cell killing by the F plasmid CcdB protein involves poisoning of

DNA-topoisomerase II complexes. J. Mol. Biol., 1992, 226 (3): 735-745.


134

Bertini, L. , Proietti, S., Aleandri, M. P., Mondello, F., Sandini, S., Caporale, C., Caruso, C.

Modular structure of HEL protein from Arabidopsis thaliana reveals new potential functions

for PR-4 proteins. Biological chemistry, 2012, 393 (12), S. 1533-1546.

Bertol, J.W., Rigotto, C., de Pàdua, R.M., Kreis, W., Barardi, C.R., Braga, F.C., Simões, C.M.

Antiherpes activity of glucoevatromonside, a cardenolide isolated from Brazilian cultivar of

Digitalis lanata. Antiviral Res., 2011, 92, 73-80.

Boto‐Ordóñez, M., Rothwell, J. A., Andres‐Lacueva, C., Manach, C., Scalbert, A., Urpi‐Sarda,

M. Prediction of the wine polyphenol metabolic space: An application of the Phenol‐Explorer

database. Molecular nutrition & food research. 2013, 58 (3), S. 466-477.

Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of

protein utilizing the principle of protein-dye binding. In: Anal. Biochem., 1976, 72, S. 248-254.

Brand, L., Hörler, M., Nüesch, E., Vassalli, S., Barrell, P., Yang, W., Curtis, M. D. A versatile

and reliable two-component system for tissue-specific gene induction in Arabidopsis. Plant

physiology, 2006, 141 (4), S. 1194-1204.

Burda, E., Krausser, M., Fischer, G., Hummel, W., Müller-Uri, F., Kreis, W., Gröger, H. Re-

combinant ∆4,5-steroid 5β-reductases as biocatalysts for the reduction of activated C=C-double

bonds in acyclic and monocyclic molecules. Advanced Synthesis & Catalysis, 2009, 351,

S. 2787-90.

Carland, F. M., Berg, B. L., FitzGerald, J. N., Jinamornphongs, S., Nelson, T., Keith, B. Ge-

netic regulation of vascular tissue patterning in Arabidopsis. The Plant Cell Online, 1999, 11

(11), S. 2123-2137.

Carland, F. M., McHale, N. A. LOP1: a gene involved in auxin transport and vascular pattern-

ing in Arabidopsis. Development, 1996, 122 (6), S. 1811-1819.

Cheng, C., Shuman, S. Recombinogenic flap ligation pathway for intrinsic reapair of Topoiso-

merase IB-induced double-strand breaks. Molecular and Cellular Biology, 2000, 20 (21),

S. 8059-8068.

Cheng, Z. M., Schnurr, J. A., Kapaun, J. A. Timentin as an alternative antibiotic for suppres-

sion of Agrobacterium tumefaciens in genetic transformation. Plant Cell Reports, 1998, 17 (8),

S. 646-649.

Cheong, J., Choi, Y.D. Methyl jasmonate as a vital substance in plants. TRENDS in Genetics,

2003, 19 (7), S. 409-413.


135

Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium‐mediated trans-

formation of Arabidopsis thaliana. The plant journal, 1998, 16 (6), S. 735-743.

Cook, D. R. Medicago truncatula - a model in the making! Curr. Opin. Plant Biol., 1999, 2,

S. 301–304.

Corduan, G., Spix, C. Haploid callus and regeneration of plants from anthers of Digitalis pur-

purea L. Planta, 1975, 124 (1), S. 1-11.

Curtis, M. D., Grossniklaus, U. A gateway cloning vector set for high-throughput functional

analysis of genes in planta. Plant physiology, 2003, 133 (2), S. 462-469.

Deblaere, R., Bytebier, B., De Greve, H., Deboeck, F., Schell, J., Van Montagu, M., Leemans,

J. Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer to

plants. Nucleic acids research, 1985, 13 (13), S. 4777-4788.

Diettrich, B., Schneider, V., Luckner, M. High Variation in Cardenolide Content of Plants Re-

generated from Protoplasts of the Embryogenic Cell Strain VII of Digitalis lanata. Journal of

plant physiology, 1991, 139 (2), S. 199-204.

Durchschein, K., Wallner, S., Macheroux, P., Schwab, W., Winkler, T., Kreis, W., Faber, K.

Nicotinamide-Dependent Ene Reductases as Alternative Biocatalysts for the Reduction of Ac-

tivated Alkenes. Eur. J. Org. Chem. 2012, (26), S. 4963-4968.

Earley, K. W., Haag, J. R., Pontes, O., Opper, K., Juehne, T., Song, K., Pikaard, C. S. Gateway‐

compatible vectors for plant functional genomics and proteomics. The Plant Journal, 2006, 45

(4), S. 616-629.

Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of

plant genomic DNA for PCR analysis. Nucl Acid Res. 1991, 19, S. 1349.

Egerer-Sieber, C., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W., Muller, Y.A. Chrystallization and pre-

liminary crystallographie analysis of slenomethionine-labelled progsterone 5β-reductase from

Digitalis lanata Ehrh. Acta Crystallogr. 2006, 62, S. 186-188.

Ernst, M., Pádua, R.M., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W. Expression of 3β-HSD und P5βR,

genes encoding for ∆5-3β-hydroxisteroid dehydrogenase (3β-HSD) and progesterone 5β-reduc-

tase (P5βR) in leaves and cell cultures of Digitalis lanata Ehrh. Planta Med. 2010, 76 (9),

S. 923-927.


136

Fatima, Z., Mujib, A., Fatima, S., Arshi, A., Umar, S. Callus induction, biomass growth, and

plant regeneration in Digitalis lanata Ehrh.: influence of plant growth regulators and carbohy-

drates. Turkish Journal of Botany, 2009, 33 (6), S. 393-405.

Finsterbusch, A., Lindemann, P., Grimm, R., Eckerskorn, C., Luckner, M.: ∆5-3β-hydroxys-

teroid dehydrogenase from Digitalis lanata Ehrh. – a multifunctional enzyme insteroid metab-

olism? In: Planta, 1999, 209 (4), S. 478-486.

Forester, S. C., Waterhouse, A. L. Metabolites are key to understanding health effects of wine

polyphenolics. The Journal of nutrition, 2009, 139 (9), S. 1824-1831.

Forrer, P., Jaussi, R. High-level expression of soluble heterologous proteins in the cytoplasm

of Escherichia coli by fusion to the bacteriophage Lambda head protein D. Gene, 1998, 224

(1), S. 45-52.

Franks, T., He, D.G., Thomas, M.R. Regeneration of transgenic Vitis vinifera L. Sultana plants:

Genotypic and phenotypic analysis. Mol Breed, 1998, 4, S. 321-333.

Gärnter, D.E., Wendroth, S., Seitz, H.U.: A stereospecific enzyme of the putative biosynthetic

pathway of cardenolides. Characterization of a progesterone 5β-reductase from leaves of Digi-

talis purpurea L. In: FEBS Lett. 1990, 271 (1-2), S. 239-242.

Gärtner, D.E., Keilholz, W., Seitz, H.U. Purification, characterization and partialpeptide mi-

crosequencing of progesterone 5β-reductase from shoot cultures of Digitalis purpurea. In: Eur

J Biochem, 1994, 225 (3), S. 1125-1132.

Gärtner, D.E., Seitz, H.U. Enzyme activities in cardenolide-accumulation, mixotrophic shott

cultures of Digitalis purpurea L. In: Journal of plant physiology, 1993, 141 (3), S. 269-267.

Gateway® Technology with Clonase® II, A universal technology to clone DNA sequences for

functional analysis and expression in multiple systems; Life Technologies ™ 2012.

Gavidia, I., Del Castillo Agudo, L., Pe´rez-Bermu´dez, P. Selection and long-term cultures of

high-yielding Digitalis obscura plants: RAPD markers for analysis of genetic stability. Plant

Science, 1996, 121, S. 197–205.

Gavidia, I., Tarrío, R., Rodrígues-Trelles, F., Pérez-Bermúdez, P., Seitz, H.U. Plant progester-

one 5β-reductase is not homologous to the animal enzyme. Molecular evolutionary chracteri-

sation of P5βR from Digitalis purpurea. In: Phytochemistry, 2007, 68 (6), S. 853-864.


137

Geu-Flores, F., Sherden, N. H., Courdavault, V., Burlat, V., Glenn, W. S., Wu, C., Nirms, E.,

Cui, Y., O´Connor, S. E.An alternative route to cyclic terpenes by reductive cyclization in iri-

doid biosynthesis. Nature, 2012, 492 (7427), S. 138-142.

Habermehl, G., Hammann P.E., Krebs, H.C. Naturstoffchemie. Springer Verlag, 2. Auflage,

2002.

Hamada, S., Onouchi, H., Tanaka, H., Kudo, M., Liu, Y. G., Shibata, D., Machida, Y. Muta-

tions in the WUSCHEL gene of Arabidopsis thaliana result in the development of shoots with-

out juvenile leaves. The Plant Journal, 2000, 24 (1), S. 91-101.

Hänsel, R., Sticher, O., Steinegger, E. Pharmakognosie- Phytopharmazie. Springer Verlag,

9. Auflage, 2010.

Hardtke, C. S., Berleth, T. The Arabidopsis gene MONOPTEROS encodes a transcription

factor mediating embryo axis formation and vascular development. The EMBO Journal, 1998,

17 (5), S. 1405-1411.

Harrison, S. J., Mott, E. K., Parsley, K., Aspinall, S., Gray, J. C., Cottage, A. A rapid and

robust method of identifying transformed Arabidopsis thaliana seedlings following floral dip

transformation. Plant methods, 2006, 2 (1), S. 19.

Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. DNA cloning using in vitro site-specific recom-

bination. Genome research, 2000, 10 (11), S. 1788-1795.

Heilersig, B. H., Loonen, A. E., Janssen, E. M., Wolters, A. M. A., Visser, R. G. Efficiency of

transcriptional gene silencing of GBSSI in potato depends on the promoter region that is used

in an inverted repeat. Molecular Genetics and Genomics, 2006, 275 (5), S. 437-449.

Hellens, R., Mullineaux, P., Klee, H. Technical Focus: A guide to Agrobacterium binary Ti

vectors. Trends in plant science, 2000, 5 (10), S. 446-451.

Helliwell, C. A., Wesley, S. V., Wielopolska, A. J., Waterhouse, P. M. High-throughput vectors

for efficient gene silencing in plants. Functional plant biology, 2002, 29 (10), S. 1217-1225.

Helliwell, C., Waterhouse, P. Constructs and methods for high-throughput gene silencing in

plants. Methods, 2003, 30 (4), S. 289-295.

Herl, V., Albach, D.C., Müller-Uri, F., Bräuchler, C., Heubl, G., Kreis, W. Using progesterone

5β-reductase, a gene encoding a key enzyme in the cardenolide biosynthesis, to infer the phy-

logeny of the genus Digitalis. In: Plant Syst Evol. 2006a, 271 (1-2), S. 65-78.


138

Herl, V., Fischer, G., Müller-Uri, F., Kreis, W. Molecular cloning and heterologous expression

of progesterone 5β-reductase from Digitalis lanata Ehrh. In: Phytochemistry, 2006b, 67 (3),

S. 255-231.

Herl, V., Fischer,G., Reva, V.A., Stiebritz, M., Müller-Uri, F., Muller, Y.A., Kreis, W. The

VEP1 gene (At4g24220) encodes a short-chain dehydrogenase/reductase with 3-oxo-∆4,5-ster-

oid 5β-reductase activity in Arabidopsis thaliana L. In: Biochimie, 2009, 91, S. 517-525.

Herl, V., Frankenstein, J., Meitinger, N., Müller-Uri, F., Kreis, W. ∆5-3β-hydroxysteroid de-

hydrogenase (3βHSD) from Digitalis lanata. Heterologous expression and characterisation of

the recombinant enzyme. In: Planta Med. 2007, 73, S. 704-710.

Hirai, S., Kodama, H. RNAi Vectors for Manipulation of gene expression in higher plants. The

Open Plant Science Journal, 2008, 2, S. 21-30.

Holsters, M., deWaele, D., Depecker, A.D., Messens, E., VanMontagu, M., Schell, J. Trans-

fection and transformation of A. tumefaciens. Mol. Gen. Genet., 1987, 163, S. 181–187.

Holsters, M., Silva, B., Van Vliet, F., Genetello, C., De Block, M., Dhaese, P., Schell, J. The

functional organization of the nopaline A. tumefaciens plasmid pTiC58. Plasmid, 1980, 3 (2),

S. 212-230.

Invitrogen™ GmbH: SuperScript™ III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (User

Manual), 2003.

Invitrogen™ GmbH: TOPO TA Cloning® Kit (User Manual), 2006.

Iriti, M. , Faoro, F. Grape phytochemicals: A bouquet of old and new nutraceuticals for human

health. Medical hypotheses, 2006, 67 (4), S. 833-838.

Jefferson, R. A. Assaying chimeric genes in plants: the GUS gene fusion system. Plant molec-

ular biology reporter, 1987, 5 (4), S. 387-405.

Jefferson, R. A., Kavanagh, T. A., Bevan, M. W. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensi-

tive and versatile gene fusion marker in higher plants. The EMBO journal, 1987, 6 (13), S. 3901.

Jun, J.H., Ha, C.M., Nam, H.G. Involvement of the VEP1 gene in vascular strand development

in Arabidopsis thaliana. Plant Cell Physiol, Division of Molecular Life Sciences, Pohang

University of Science and Technology, Hyoja Dong, Kyungbuk, 790-784, Korea., 2002, 43 (3),

S. 323-330.


139

Kang, D., Gho, Y. S., Suh, M., Kang, C. Highly sensitive and fast protein detection with coo-

massie brilliant blue in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. Bulletin-

Korean chemical society, 2002, 23 (11), S. 1511-1512.

Karimi, M. , Bleys, A., Vanderhaeghen, R., Hilson, P. Building blocks for plant gene assembly.

Plant physiology, 2007a, 145 (4), S. 1183-1191.

Karimi, M. , Depicker, A., Hilson, P. Recombinational cloning with plant gateway vectors.

Plant physiology, 2007b, 145 (4), S. 1144-1154.

Karimi, M. , Inzé, D., Depicker, A. GATEWAY™ vectors for Agrobacterium-mediated plant

transformation. Trends in plant science, 2002, 7 (5), S. 193-195.

Katzen, F. Gateway recombinational cloning: a biological operating system Invitrogen Corp.,

1600 Faraday Avenue, Carlsbad, CA 92008, USA,Expert Opin Drug Discovery: 2007, 2 (4),

S. 571-589.

Kavanagh, K.L., Jörnvall, H., Persson, B., Oppermann, U. The SDR superfamily: functional

and structural diversity within a family of metabolic and regulatory enzymes. In: Cellular and

Molecular Life Sciences, 2008, 65, S. 3895-3906.

Kim, M. J. , Baek, K., Park, C. M.. Optimization of conditions for transient Agrobacterium-

mediated gene expression assays in Arabidopsis. Plant cell reports, 2009, 28 (8), S. 1159-1167.

Klesk, K., Qian, M., Martin, R. R. Aroma extract dilution analysis of cv. Meeker (Rubus idaeus

L.) red raspberries from Oregon and Washington. Journal of agricultural and food chemistry,

2004, 52 (16), S. 5155-5161.

Koizumi, K. , Sugiyama, M., Fukuda, H. A series of novel mutants of Arabidopsis thaliana that

are defective in the formation of continuous vascular network: calling the auxin signal flow

canalization hypothesis into question. Development, 2000, 127 (15), S. 3197-3204.

Kreis, W., Hensel, A., Stuhlemmer, U. Cardenolide biosynthesis in foxglove. In: Planta Med.

1998, 64, S. 491-499.

Kreis, W., Müller-Uri, F. Biochemistry of sterols, cardiac glycosides, brassinosteroids, phy-

toecdysteroids and steroid saponins, in: Wink, M. (Ed.), Biochemistry of Plant Secondary Me-

tabolism. Wiley-Blackwell, Oxford, 2010, S. 304-363.

Kreis, W., Reinhard, E. 12β-hydroxylation of digitoxin by suspension-cultured Digitalis lanata

cells. Production of deacetyllanatoside C using a two-stage culture method. Planta Med. 1988,

54, S. 143-148.


140

Kuate, S.P., Pádua, R.M., Eisenbeiss, W.F., Kreis, W. Purification and characterization of mal-

onyl-coenzyme A: 21-hydroxypregnane 21-O-malonyltransferase (Dp21MaT) from leaves of

Digitalis purpurea L. Phytochemistry, 2008, 69, S. 619-26.

Kuate, S.P. Malonylcoenzyme A:21-hydroxypregnane-21-O-malonyltransferases from Digi-

talis sp. Dissertation, FAU Erlangen, 2008.

Kuberski, C., Scheibner, H., Steup, C., Diettrich, B., Luckner, M.. Embryogenesis and

cardenolide formation in tissue cultures of Digitalis lanata. Phytochemistry, 1984, 23 (7),

S. 1407-1412.

Kushiro, T., Okamoto, M., Nakabayashi, K., Yamagishi, K., Kitamura, S., Asami, T., Nam-

bara, E. The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8′‐hydroxylases: key en-

zymes in ABA catabolism. The EMBO journal, 2004, 23 (7), S. 1647-1656.

Landy, A. Dynamic, Structural, and Regulatory Aspects of lambda Site-Specific Recombina-

tion, Annual Review of Biochemistry, 1989, 58, S. 913-941.

Langenhan, J.M., Peters, N.R., Guzei, I.A., Hoffmann, F.M., Thorson, J.S.. Enhancing the

anticancer properites of cardic glycosides by neoglycorandomization. Proc. Natl. Acad. Sci.

2005, USA 102, Nr. 35, S. 12305-12310.

Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. A DNA transformation-competent Arabidopsis ge-

nomic library in Agrobacterium. Nature Biotechnology, 1991, 9 (10), S. 963-967.

Lehmann, U., Moldenhauer, D., Thomar, S., Diettrich, B., Luckner, M. Regeneration of plants

form Digitalis lanata cells tranformed with Agrobacterium tumefaciens carrying bacterial

genes encoding Neomycin Phosphotransferase II and β-glucoronidase. J. Plant Physiol. 1995,

147, S. 53- 57.

Li, X. H. Plantlet regeneration from mesophyll protoplasts of Digitalis lanata Ehrh. Theoretical

and applied genetics, 1981, 60 (6), S. 345-347.

Li, Y. , Gao, Z., Piao, C., Lu, K., Wang, Z., Cui, M. L. A stable and efficient Agrobacterium

tumefaciens-mediated genetic transformation of the medicinal plant Digitalis purpurea L. Ap-

plied biochemistry and biotechnology, 2014, 172 (4), S. 1807-1817.

Lindemann, P., Luckner, M.: Biosynthesis of pregnane derivatives in somatic embryos of Dig-

italis lanata. In: Phytochemistry, 1997, 46 (3), S. 507-513.

Linsmaier, E. M., Skoog, F. Organic growth factor requirements of tobacco tissue cultures.

Physiologia plantarum, 1965, 18 (1), S. 100-127.


141

Lloyd, G., McCown, B. Commercially-feasible micro-propagation of Mountain laurel, Kalmia

latifolia, by use of shoot tip culture. Comb. Proc. Int. Plant. Prop. Soc. 1981, 30, S. 421-427.

López-Pérez, A. J., Carreño, J., Martinez-Cutillas, A., Dabauza, M. High embryogenic ability

and plant regeneration of table grapevine cultivars (Vitis vinifera L.) induced by activated char-

coal. Vitis, 2005, 44 (2), S. 79-85.

Luber, E. Reinigung der Malonyl-Coenzym A: 21 Hydroxypregnan 21-Hydroxy-Ma-

lonyltransferase und Versuche zur Isolierung einer Steroid-21-Hydroxylase aus Digitalis lanata

Ehrh., FAU Erlangen, Dissertation 2002.

Luckner, M. , Wichtl, M.: Digitalis. Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH, 2000.

Maier, M. , Seldes, A., Gros, E. Biosynthesis of the butenolide ring of cardenolides in Digitalis

purpurea. Phytochemistry, 1986, 25, S. 1327-1329.

Mayer, U., Torres-Ruiz, R.A., Berleth, T., Misera, S., Jürgens, G. Mutations affecting the body

organization in the Arabidopsis embryo. Nature, 1991, 353, S. 402–407.

Meinke, D. W., Cherry, J. M., Dean, C., Rounsley, S. D., Koornneef, M. Arabidopsis thaliana:

a model plant for genome analysis. Science, 1998, 282 (5389), S. 662-682.

Meitinger, N. KSI in Digitalis lanata. Master Thesis, FAU Erlangen, 2006.

Meitinger, N. Reinigung und Charakterisierung der 3-Ketosteroidisomerase aus Digitalis

lanata. Dissertation, FAU Erlangen, 2011.

Miki, T. , Ae Park, J., Nagao, K., Murayama, N., Horiuchi, T. Control of segregation of chro-

mosomal DNA by sex factor F in Escherichia coli Mutants of DNA gyrase subunit A suppress

letD (ccdB) product growth inhibition. Journal of molecular biology, 1992, 225 (1), S. 39-52.

Milek, F., Reinhard, E., Kreis, W. Influence of precursors and inhibitors of the sterol pathway

on sterol and cardenolide metabolism in Digitalis lanata EHRH. Plant Physiol. Biochem. 1997,

35, S. 111-121.

Moldenhauer, D., Fürst, B., Diettrich, B., Luckner, M. Cardenolides in Digitalis lanata cells

transformed with Ti-plasmids. Planta medica, 1990, 56 (05), S. 435-438.

Munkert, J. , Bauer, P., Burda, E., Müller-Uri, F., Kreis, W. Progesterone 5β-reductase of Er-

ysimum crepidifolium: cDNA cloning, expression in Escherichia coli, and reduction of enones

with the recombinant protein. Phytochemistry. 2011, 72, S. 1710-1717.


142

Munkert, J. : Enone-Reduktasen und 3-β-Hydroxysteroiddehydrogenasen in ausgewählten An-

giospermen. Dissertation; FAU Erlangen, 2014.

Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bioassay with tobacco tissue

culture. Physiol Plant 1962, 15, S. 473-496.

Nambara, E., Marion-Poll, A. Abscisic acid biosynthesis and catabolism. Annu. Rev. Plant

Biol., 2005, 56, S. 165-185.

Newman, R.A., Yang, P., Pawlus, A.D., Block, K.I. Cardiac glycosides as novel cancer thera-

peutic agents. Molecular Interactions 2008, 8 (1), S. 36-40.

Nominé, Y., Ristriani, T., Laurent, C., Lefèvre, J. F., Weiss, É. Travé, G.. A strategy for opti-

mizing the monodispersity of fusion proteins: application to purification of recombinant HPV

E6 oncoprotein. Protein engineering, 2001, 14 (4), S. 297-305.

Palazón, J., Bonfill, M., Cusidó, R.M., Piñol, M.T., Morales, C: Effects of auxin and pheno-

barbital on morphogenesis and production of digitoxin in Digitalis callus cultures. Plant Cell

Physiol. 1995, 36, S. 247–252.

Pérez-Bermúdez, P., MoyaGarcia, A.A., Tunon, I., Gavidia, I. Digitalis purpurea P5βR2, en-

coding steroid 5β-reductase, is a novel defence-related gene involved in cardenolide biosynthe-

sis. New Phytol. 2009, 185, S. 687-700.

Perl, A., Lotan, O., Abu-Abied, M., Holland, D. Establishment of an Agrobacterium-mediated

transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the role of antioxidants during grape–Agro-

bacterium interactions. Nature Biotechnology, 1996, 14 (5), S. 624-628.

Persson, B., Kallberg, Y., Oppermann, U., Jörnvall, H. Coenzyme-based functional assign-

ments of short-chain dehydrogenases/reductases (SDRs).Chem. Biol. Interact. 2003, 143,

S. 271-278.

Pilgrim, H. Cholesterol side-chain cleaving enzyme Aktivität in Keimlingen und in vitro kul-

tivierten Geweben von Digitalis purpurea. In: Pyhtochemistry 1972, 11, S. 1725-1728.

Platteeuw, C., Simons, G., De Vos, W. M. Use of the Escherichia coli beta-glucuronidase

(gusA) gene as a reporter gene for analyzing promoters in lactic acid bacteria. Applied and

environmental microbiology, 1994, 60 (2), S.587-593.

Potter, S., Uknes, S., Lawton, K., Winter, A. M., Chandler, D., DiMaio, J., Ryals, J. Regulation

of a hevein-like gene in Arabidopsis. MPMI-Molecular Plant Microbe Interactions, 1993, 6 (6),

S. 680-685.


143

Prassas, I., Diamandis, E.P. Novel therapeutic applications of cardiac glycosides. Nat Rev

Drug Discov. 2008, 7, S. 926-935.

Przemeck, G. K., Mattsson, J., Hardtke, C. S., Sung, Z. R., Berleth, T.. Studies on the role of

the Arabidopsis gene MONOPTEROS in vascular development and plant cell axialization.

Planta, 1996, 200 (2), S. 229-237.

Rafferty J. B., Simon J. W. , Baldock C., Artymiuk P. J., Baker P. J. , Stuitje A. R., Slabas A.

R., Rice D. W. Common themes in redox chemistry emerge from the X-ray structure of oilseed

rape (Brassica napus) enoyl acyl carrier protein reductase. Structure. 1995, 3 (9), S. 927-938.

Reinbothe, C., Diettrich, B., Luckner, M. Regeneration of plants from somatic embryos of

Digitalis lanata. Journal of plant physiology, 1990, 137 (2), S. 224-228.

Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response

to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. The Plant Cell Online, 2000, 12 (5),

S. 707-719.

Roca-Pe´rez, L., Boluda, R., Gavidia, I., Pe´rez-Bermu´dez, P. Seasonal cardenolide produc-

tion and Dop5br gene expression in natural populations of Digitalis obscura. Phytochemistry,

2004, 65, S. 1869-1878.

Sales, E., Muñoz-Bertomeu, J., Arrillaga, I., Segura, J. Enhancement of cardenolide and phy-

tosterol levels by expression of an N-terminally truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA re-

ductase in transgenic Digitalis minor. Planta medica, 2007, 73 (6), S. 605-610.

Sales, E., Nebauer, S. G., Arrillaga, I., Segura, J. Plant hormones and Agrobacterium tumefa-

ciens strain 82.139 induce efficient plant regeneration in the cardenolide-producing plant Dig-

italis minor. Journal of plant physiology, 2002, 159 (1), S. 9-16.

Sales, E., Segura, J., Arrillaga, I. Agrobacterium tumefaciens-mediated genetic transformation

of the cardenolide-producing plant Digitalis minor L. Planta medica, 2003, 69 (2), S. 143-147.

Schebitz, P. Norcholansäureweg in der Cardenolidbiosynthese. Dissertation, FAU-Erlangen,

2010.

Schebitz, P., Nothdurft, L., Hensel, A., Müller-Uri, F., Kreis, W.: Norcholanic acids as sub-

strates for recombinant 3β-hydroxysteroid dehydrogenase and progsterone 5β-reductase, en-

zymes of the 5β-cardenolide biosynthesis. Tetrahedron Lett., 2010, Vol. 51 (2), S. 367-370.

Schein, C. H. Production of soluble recombinant proteins in bacteria. Nature Biotechnology,

1989, 7 (11), S. 1141-1149.


144

Schöner, S., Reinhard, E. Long-Term Cultivation of Digitalis lanata Clones Propagated in

Vitro: Cardenolide Content of the Regenerated Plants1. Planta medica, 1986, 52 (6), S. 478-

481.

Seidel, S., Kreis, W., Reinhard, E. ∆5-3β-Hydroxysteroid dehydrogenase/ ∆5-∆4-ketosteroid

isomerase (3β-HSD), a possible enzyme of cardiac glycoside biosynthesis, in cell cultures and

plants of Digitalis lanata Ehrh. In: Plant Cell Rep. 1990, 8, S. 621-624.

Shuman, S. Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia

DNA topoisomerase. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269 (51), S. 32678-32684.

Shuman, S. Recombination mediated by vaccinia virus DNA topoisomerase I in Escherichia

coli is sequence specific. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1991, 88 (22),

S. 10104-10108.

Sørensen, H. P., Mortensen, K. K. Advanced genetic strategies for recombinant protein ex-

pression in Escherichia coli. Journal of biotechnology, 2005b, 115 (2), S. 113-128.

Sørensen, H. P., Mortensen, K. K. Soluble expression of recombinant proteins in the cytoplasm

of Escherichia coli. Microbial cell factories, 2005a, 4(1), S. 1.

Steeves, T. A., Sussex, I. M. Patterns in plant development. Cambridge University Press. 1989.

Stuhlemmer, U., Hausmann, W., Milek, F., Kreis, W., Reinhard, E. 3α-hydroxysteroid-5β-

oxidoreductase in tissue cultures of Digitalis lanata. In: Z. Naturforsch. 1993, 84, S. 713-721.

Stuhlemmer, U., Kreis, W.: Does malonyl coenzyme A: hydroxyprengane 21-hydroxymalo-

nyltransferase catalyze the first step in butenolide ring formation? In: Tetrahedron Lett. 1996,

37, S. 2221-2224.

Stuhlfauth, T., Klug, K., Fock, H.P. The production of secondary metabolites by Digitalis

lanata during CO2 enrichment and water stress. Phytochemistry, 1987, 26, S. 2735-2739.

Styger, G., Prior, B., Bauer, F. F. Wine flavor and aroma. Journal of industrial microbiology

& biotechnology, 2011, 38 (9), S. 1145-1159.

Tanaka, Y., Kimura, T., Hikino, K., Goto, S., Nishimura, M., Mano, S., Nakagawa,T. Gateway

Vectors for Plant Genetic Engineering: Overview of Plant Vectors, Application for Bimolecular

Fluorescence Complementation (BiFC) and Multigene Construction, Genetic Engineering - Ba-

sics, New Applications and Responsibilities, InTech, 2012.


145

Tarrío, R., Ayala, F.J., Rodríguez-Trelles, F. The Vein Patterning 1 (VEP1) gene family laterally

spread through an ecological network. PLoS One, 2011, 6 (7), S. e22279.

Tewes, A., Wappler, A., Peschke, E. M., Garve, R., Nover, L. Morphogenesis and Embryogen-

esis in Long-term Cultures of Digitalis. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie, 1982, 106 (4),

S. 311-324.

Thomma, B. P., Eggermont, K., Penninckx, I. A., Mauch-Mani, B., Vogelsang, R., Cammue,

B. P., Broekaert, W. F. Separate jasmonate-dependent and salicylate-dependent defense-re-

sponse pathways in Arabidopsis are essential for resistance to distinct microbial pathogens.

Proceedings of the National Academy of Sciences, 1998, 95 (25), S. 15107-15111.

Thomma, B. P., Eggermont, K., Tierens, K. F. J., Broekaert, W. F. Requirement of Functional

Ethylene-Insensitive 2 Gene for Efficient Resistance of Arabidopsis to Infection by Botrytis

cinerea. Plant Physiology, 1999, 121 (4), S. 1093-1101.

Thorn, A., Egerer-Sieber, C., Jäger, C.M., Herl, V., Müller-Uri, F., Kreis, W., Muller, Y.A.

The crystal structure of progesterone 5β-reductase from Digitalis lanata defines a novel class

of short chain dehydrogenases/reductases. In: The Journal of Biological Chemistry, 2008, 28 3

(25), S. 17260-17269.

Torres-Ruiz, R. A., Jurgens, G. Mutations in the FASS gene uncouple pattern formation and

morphogenesis in Arabidopsis development. Development, 1994, 120 (10), S. 2967-2978.

Tsuda, K., Qi, Y., Nguyen, L. V., Bethke, G., Tsuda, Y., Glazebrook, J., Katagiri, F.. An effi-

cient Agrobacterium‐mediated transient transformation of Arabidopsis. The Plant Journal,

2012, 69 (4), S. 713-719.

Tzfira, T. , Citovsky, V. Agrobacterium - mediated genetic transformation of plants: biology

and biotechnology. Current opinion in biotechnology, 2006, 17 (2), S. 147-154.

Weber, H., Chételat, A., Reymond, P., Farmer, E. E. Selective and powerful stress gene ex-

pression in Arabidopsis in response to malondialdehyde. The Plant Journal, 2004, 37 (6),

S. 877-888.

Weiler, E. W., Nover, L. Allgemeine und molekulare Botanik. Georg Thieme Verlag. Kapitel

16, 2008.

Winter, D., Vinegar, B., Nahal, H., Ammar, R., Wilson, G. V., Provart, N. J. An “Electronic

Fluorescent Pictograph” browser for exploring and analyzing large-scale biological data sets.

PloS one, 2007, 2 (8), S. e718.


146

Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium‐mediated tran-

sient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnology Jour-

nal, 2005, 3 (2), S. 259-273.

Xu, R., Li, Q. Q. Protocol: Streamline cloning of genes into binary vectors in Agrobacterium

via the Gateway TOPO vector system. Plant Methods, 2008, 4 (1), S. 4.

Yamauchi, Y., Hasegawa, A., Taninaka, A., Mizutani, M., Sugimoto, Y. NADPH-dependent

reductases involved in the detoxification of reactive carbonyls in plants. Journal of biological

chemistry, 2011, 286 (9), S. 6999-7009.

Yang, K.Y., Moon, Y.H., Choi, K.H., Kim, Y.H., Eun, M.Y., Guh, J.O., Kim, K.C., Cho, B.H.

Structure and expression of the AWI 31 gene specifically induced by wounding in Arabidopsis

thaliana. Mol Cells, College of Agriculture, Chonnam National University, Kwangju, Korea.,

1997, 7 (1), S. 131-135.

Yücesan, B. In vitro propagation and cardiac glycoside production in endemic Digitalis L. spe-

cies of Anatlia. Dissertation, 2011.

Yücesan, B., Müller-Uri, F., Kreis, W., Gürel, E.. Cardenolide estimation in callus-mediated

regenerants of Digitalis lamarckii Ivanina (dwarf foxglove). In Vitro Cellular & Developmental

Biology-Plant, 2013, 50 (1), S. 137-142.

Anhang

147

VIII. Anhang

1. DNA-Sequenzen

1.1. Sequenzen der Entry-Vektoren

1.1.1. Entry-Vektoren mit full length cDNA für pEarlyGate1 00 Destination Vektor

Arabidopsis thaliana HSD

Vektorbezeichnung: pENTRAthHSD_4 (s. Tabelle 5)

MWG Sequenzierung (M13uni) TATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTAATTATTACTGGCGGAGCAAGCGGGATTGGGGCTGAGTCCGTTCGATTATTTACCGAACACGGCGCTCGAGTCGTGATCGTTGATGTACAGGATGAGCTCGGTCAAAACGTTGCAGTTTCGATCGGTGAAGACAAAGCGAGTTACTATCATTG CGATGTCACGAACGAGACGGAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCGAAAAATATGGGAAGCTTGACGTTCTGTTTAGTAACGCCGGCGTAATAGAGCCGTTTGTGAGCATCCTCGACTTAAACCTCAACGAGTTAGACCGAACGATCGCCATTAACCTCCGCGGCACAGCCGCATTCATCAAGCATGCTGCACGTGCCATGGTGGAGAAAGGCATCCGCGGCTCCATCGTTTGCACCACTAGCGTCGCGGCTGAGATCGCTGGCACGGCACCACACGGGTACACGACGTCGAAGCA TGGGCTGTTGGGTTTGATCAAATCGGCTTCTGGTGGATTAGGAAAATATGGTATAAGAGTAAACGGCGTTGCTCCATTTGGTGTCGCAACACCGTTAGTTTGTAATGGTTTCAAGATGGAACCAAACGTGGTGGAGCAGAACACGTCAGCTTCGGCGAATCTAAAGGGCATTGTATTGAAAGCTCGTCACGTGGCAGAAGCTGCTCTGTTTTTAGCGTCCGATGAGTCGGCTTACGTTAGCGGACAGAACCTGGCTGTTGACGGTGGTTACTCGGTGGTGAAGCCGTAGAAAGGGTGGGC GCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGATATCCCCTATAGTGAGTCGTATTACA Darstellung der HSD aus Arabidopsis thaliana in pENTR D-TOPO®. Grau hinterlegt: HSD Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Erysimum crepidifolium HSD

Vektorbezeichnung: pENTREcHSD_8 (s. Tabelle 5)

MWG Sequenzierung (M13uni) ATATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTTATTATCACCGGTGGAGCAAGCGGGATTGGTGCTGAGTCCGTCAGGCTATTTACCGACCATGGCGCTCGAGTCGTCATAGTTGACATACAAGACGAGCTCGGTCAAAACGTTGCCGTTTCGGTCGGAGAAGACAAGGCGACTTACTATCATTGCGATGTTACCAACGAGACGGAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCGAAAAACACGGGAAGCTTGACGTTCTGTTCAGTAACGCCGGCGTTATAGAAACATTTACGAGCATCCTCGACTTAGATCTGGACGAATTCGACCGAGTGGTCACCGTTAACCTCCGTGGCGCAGCCGCATTTATCAAATATGCTGCACGTGCCATGGTCGAGAAAGGCACGCGCGGCTCCATCGTTTGCACGACCAGCGTCTCAGGTGAGGTCGCCGGCACCGGACCACACGGGTACACGGCGGCTAAGC ATGGGCTAGTGGGTTTGATCAAAACAGCTTCTGGTGGATTGGGGAAATACGGAATAAGAGTAAACGGCGTTGCTCCGTTTGGGGTCGCTACACCGTTAGTTTGTGATAGGTACAATATGGAGCCAAACGCGGTGGAGGAGAGCACTCTAGCGTCCGGAAATCTAAAGGGCATCATGTTGAAAGCTCGCCACGTGGCAGAAACTGCTTTGTTTTTAGCATCCGATGCGTCGGCTTACGTTAGCGGACAGAACCTGCCCGTT MWG Sequenzierung (M13rev) GGGGATCAGCTGGATGGCAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGCGCCCACCCTTCTACGGCTTCACCACCGAGTAACCCCCGTCAACGGCCAGGTTCTGTCCGCTAACGTAAGCCGACGCATCGGATGCTAAAAACAAAGCAGTTTCTGCCACGTGGCGAGCTTTCAACATGATGCCCTTTAGATTTCCGGACGCTAGAGTGCTCTCCTCCACCGCGTTTGGCTCCATATTGTACCTATCACAAACTAACGGTGTAGCGACCCCAAACGGAGCAACGCCGTTTACTCTTATTCCGTATTTCCCCAATCCACCAGAAGCTGTTTTGATCAAACCCACTAGCCCATGCTTAGCCGCCGTGTACCCGTGTGGTCCGGTGCCGGCGACCTCACCTGAGACGCTGGTCGTGCAAACGATGGAGCCGCGCGTGCCTTTCTCGACCATGGCACGTGCAGCATATTTGATAAATGCGGCTGCGCCACGGAGGTTAACGGTGACCACTCGGTCGAATTCGTCCAGATCTAAGTCGAGGATGCTCGTAAATGTTTCTATAACGCCGGCGTTACTGAACAGAACGTCAAGCTTCCCGTGTTTTTCGACGGTGAACTTAACGGCGTTTTCAACTTCCGTCTCGTTGGTAACATCGCAATGATAGTAAGTCGCCTTGTCTTCTCCGACCGAAACGGCAACGTTTTGACCGAGCTCGTCTTGTATGTCAACTATGACGACTCGAGCGCCATGGTCGGTAAATAGCCTGACGGACTCAGCACCAATCCCGCTTGCTCCACCGGTGATAATAACGATTTTGCCATCCAATCTTTTTCC

Anhang

148

AGACATGGTGAAGGGGGCGGCCGCGGAGCCTGCTTTTTTGTACAAAGTTGGCATTATAAAAAAGCATTGCTCATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGGGGCCCGAGCTTAAGACTGG Darstellung der HSD aus Erysimum crepidifolium in pENTR D-TOPO®. Grau hinterlegt: HSD Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Digitalis lanata HSD

Vektorbezeichnung: pENTRDlHSD_1 (s. Tabelle 5)

MWG Sequenzierung (M13uni) TGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGTCGTCAAAGCCAAGGTTGGAGGGTAAAGTGGCAATCATCACCGGAGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGACGGCAAGATTGTTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAGGTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGACGTCAGAGATGAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACATCATGCTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGGGGCCTTGATGACGAACGTAATCGATCTCGACATGGTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCACGCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTGTCGGCGAGCCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGTCCTGGGCCTAGTCAAGGCGGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCG MWG Sequenzierung (M13rev) GGAATCAGCTGGATGGCAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGCGCCCACCCTTCTAACGCACGACGGTGAAGCCGCCGTCGACAGCCAAGTTTTGTCCACTGACATAAGCCGACTCATCGGAAGCCAAGAAGAGAGCCGCCTCAGCTACATGCTTAGCCTTCAAAACCACCCCCTTCAAGTTAGCCCTGGAGTTATTGGCCTCCTCCATCTGACTCGGTGTC ATTCCGTAAGCACTGCACGGCATCGGGGTCGCCACACCGTACGGCGCCACCGAGTTGACTCGGATCCCGTGCACCCCCAACTCGGCGCAAGCCGCCTTGACTAGGCCCAGGACGGCGTGTTTGGAAGCCGTGTAAGCGGGCGGGCCCATGCCTCCAAGGCTCGCCGACACGCTGGCGGTGCAAATGATGGACCCCTTGACCTTCCCCTCCACCATGGCTCGTGCCGCGTGCTTTATAGTGTTGGCAACTCCGCGCACGTTAGTCGCCAATACATTTTCAAAGTCAACCATGTCGAGATCGATTACGTTCGTCATCAAGGCCCCGAAGACTCCGGCGTTGCTCAGCATGATGTCGAGGCGCCCGTATTTCTCCACCGCGTAGCGGACGGTGGCCGCCACTTGTTTTTCATCTCTGACGTCGCAGTGGTAGTAACTTATCTTGTCGTCAGAGTTTACGGAAGCGACGACCTGGCGCCCCAATTCGTCCTGGACGTCCGCCACCACCACTGAGGCGCCATGCTCCACGAACAATCTTGCCGTCTCCTCGCCGATGCCGCTAGCGGCTCCGGTGATGATTGCCACTTTACCCTCCAACCTTGGCTTTGACGACATGGTGAAAGGGGGCGGCCGCGGAG Darstellung der HSD aus Digitalis lanata in pENTR D-TOPO®. Grau hinterlegt: HSD Sequenz; Rot her-vorgehoben: attL-Sites

Arabidopsis thaliana VEP1

Vektorbezeichnung: pENTRVEP1_8 (s. Tabelle 5)

MWG Sequenzierung (M13uni) ATATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGAGTTGGTGGTGGGCTGGCGCCATCGGAGCTGCCAAGAAGAAACTCGACGAAGATGAACCATCACAAAGCTTCGAGAGCGTCGCTCTCATCATCGGCGTTACTGGAATCGTCGGAAACAGCTTGGCGGAGATTCTCCCTCTTTCCGACACACCCGGTGGTCCATGGAAAGTCTACGGCGTCG CTCGTCGTCCTCGTCCTACCTGGAACGCCGATCATCCGATCGATTACATCCAGTGCGATGTCTCCGACGCCGAAGACACAAGATCCAAGCTTTCCCCTTTAACCGATGTCACACATGTCTTCTACGTCACCTGGACCAATCGTGAATCGGAAAGTGAAAACTGTGAAGCAAATGGCTCAATGCTCCGTAACGTTCTCCAAGCGATTATCCCATACGCGCCAAATCTCCGACATGTTTGTCTCCAGACAGGGACAAAGCACTACCTTGGCCCTTTCACCAACGTTGACGGACCTCGTCACGATCCACCGTTCACTGAGGATATGCCGAGATTGCAGATCCAGAATTTCTATTATACCCAAGAGGATATTCTGTTTGAAGAGATCAAGAAGATAGAAACCGTGACGTGGTCTATCCACAGACCAAACATGATCTTTGGGTTCTCTCCTTATGTTTGATGAACATTGTTGGGACTCTCTGTGTCTATGCAGCGATATGTAAGCATGAAGGGTCTCCGTTGTTGTTTCCTGGGAGCAAGAAAGCTTGGGAAGGGTTCATGACGGCTTCTGACGCGGATTTGATTGCGGAGCAGCAGATTTGGGCGGCGGTTGATCCGTATGCGAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAATGCTGATATCTTCAAGTGGAAGCATCTGTGGAAGATTCTAGCTGAGCAGTTTGGGATTGAGAG MWG Sequenzierung (M13rev) GGGTTCAGCTGGATGGCAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGCGCCCACCCTTTCAAGGTACGATCTTGAAC

Anhang

149

GCCTTGTACTTGTCAATCCAAGAGATAAAAGAGTTGTTGGAGTTCCTGAAACCAAGGAAGCCATATTCCTTACTCTTGTTCATACTATCAATCATTCCTTCAACTCCAAGTATAACATCAGCAAACCACCACACACCAACTTCCTCAAGC TTCTTCTCTTGCAATTGATTCTCCTTAACCATCTCCTCCCACACTCTCTCTTTCCCTTTCATCATCTCCACCAACCCAAATTCTTCCCTTCCTCAAATCCATACTCCTCAATCCCAAACTGCTCAGCTAGAATCTTCCACAGATGCTTCCACTTGAAGATATCAGCATTGTTGCAGTTAAACGCCTCGTTCTTCGCATACGGATCAACCGCCGCCCAAATCTGCTGCTCCGCAATCAAATCCGCGTCAGAAGCCGTCATGAACCCTTCCCAAGCTTTCTTGCTCCCAGGAAACAACAACGGAGACCCTTCATGCTTACATATCGCTGCATAGACACAGAGAGTCCCAACAATGTTCATCAAACTATAAGGAGAGAACCCAAAGATCATGTTTGGTCTGTGGATAGACCACGTCACGGTTTCTATCTTCTTGATCTCTTCAAACAGAATATCCTCTTGGGTATAATAGAAATTCTGGATCTGCAATCTCGGCATATCCTCAGTGAACGGTGGATCGTGACGAGGTCCGTCAACGTTGGTGAAAGGGCCAAGGTAGTGCTTTGTCCCTGTCTGGAGACAAACATGTCGGAGATTTGGCGCGTATGGGATAATCGCTTGGAGAACGTTACGGAGCATTGAGCCATTTGCTTCACAGTTTTCACTTTCCGATTCACGATTGGTCCAGGTGACGTAGAAGACATGTGTG Darstellung der VEP1 aus Arabidopsis thaliana in pENTR D-TOPO®. Grau hinterlegt: VEP1 Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Erysimum crepidifolium P5βR

Vektorbezeichnung: pENTREcP5βR_19 (s. Tabelle 5)

MWG Sequenzierung (M13uni) CATATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGAGTTGGTGGGGGGCTGGCGCCATCGGAGCTGCCAAGAAGAAACTCGACGACGATGAGCCGTCGCAAAGCTACGAGAGCGTCGCTCTCATCATCGGCGTTGCAGGAATCGTCGGAAACAGCCTGGCGGAGATTCTCCCTCTTTCCGACACACCCGGTGGTCCCTGGAAAGTCTACGGCGTC GCTCGCCGTCCCCGTCCCAGCTGGAACGCCGATCATCCGATCGATTACATCCAGTGCGATGTCTCCAACGCCGAAGATGCAAGATCCAAGCTTTCCCCTTTAACCGATGTCACTCACGTCTTCTACGTCACCTGGACCAAGCGCGAATCGGAGAGCGAAAACTGCGAGGCTAACGGCTCAATGCTCCGTAACGTTCTCCAAGCGATTGTCCCACACGCGCCTAATCTCCGGCACATTTGTCTCCAGACGGGGACGAAGCACTACCTCGGCCCTTTCAGCAACCTCGACGGACCTCGCCAC GATCCGCCTTTTACTGAGGATATGCCGAGATTGCAGATCCAGAATTTCTATTACACTCAGGAGGATATTCTGTTTGAAGAGATCAAGAAGAAAGAAATTAGTGTGACGTGGTCTATACATAGGCCAAACACGATCTTTGGATTCTCTCCTTACAGTTTGATGAACATTGTTGGGACTCTCTGTGTGTACGCAGCGATCTGCAAGCATGAAGGGTCGCCGTTGTTGTTTCCTGAGAGCAAGAAAGCTTGGGAAGGGTTCACGACGGCTTCGGACGCGGACCTGATCGCTGAGCAGCAGATT TGGGCTGCGGTTGATCCGTATGCTAGAACGAG

MWG Sequenzierung (M13rev) GGGAATCAGCTGGATGGCAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGGCGCGCCCACCCTTTCAAGGCACGATCTTGAAAGCCTTGTACTTGTCAATCCAAGAGATAAAAGAGTTGTTGGAGTTCCTAAAACCAAGGAAGCCATGTTCCTTACTCTTGTTCATACTATCAATCATTCCTTCAACTCCAAGTATAACATCCGCAAACCACCACACACCAACTTCCTCAAG CTTCTTCTCCTGCAGCTGATTCTCCTTCACCATTTCCTCCCACACTCTCTCTTTCCCCTTCATCATCTCCACTAACCCCAAATTCTTCCCTTCCTCAAATCCATACTCCTCAATCCCAAACTGCTCAGCCAGAATCTTCCACAGATGTTTCCACTTGAAGATATCCGCGTTGTTGCAGTTAAACGCCTCGTTCTTAGCATACGGATCAACCGCAGCCCAAATCTGCTGCTCAGCGATCAGGTCCGCGTCCGAAGCCGTCGTGAACCCTTCCCAAGCCTTCTTGCTCCCAGGAAACAACAA CGGCGACCCTTCATGCTTGCAGATCGCTGCGTACACACAGAGAGTCCCAACAATGTTCATCAAACTGTAAGGAGAGAATCCAAAGATCGTGTTTGGCCTATGTATAGACCACGTCACACTAATTTCTTTCTTCTTGATCTCTTCAAACAGAATATCCTCCTGAGTGTAATAGAAATTCTGGATCTGCAATCTCGGCATATCCTCAGTAAAAGGCGGATCGTGCGAGGTCCGTCGAGGTTGCTGAAAGGGCCGAGGTAGTGCTTCGTCCCCGTCTGGAGACAAATGTGCCGGAGATTAGGC Darstellung der P5βR aus Erysimum crepidifolium in pENTR D-TOPO®. Grau hinterlegt: P5βR Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Digitalis lanata P5βR

Vektorbezeichnung: pDONRDlP5βR_86 (s. Tabelle 5)

MWG Sequenzierung (M13uni) AAATATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGACGCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACC

Anhang

150

CGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGACCATTTGAATCCTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACAC TGAGGATTTGCCCAGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAGAAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAGGGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCTGATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCC TTATGCAAAAACGAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGTGTT MWG Sequenzierung (M13rev) GGATTCAGCTGGATGGCAATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATAAGCAATGCTTTCTTATAATGCCAACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAAGGAACAATCTTGTAAGCTTTTGCCTTGTCAATCCAAGAAATGAACGCATTCTTGGAGTTCCTAAATCCCAAAAAGCCATGCTCCTTGCTCTTGTTCATACTATCCAGGAAACACTCATTCCCAAGTATAACATCACCAAACCACCAAATTCCGACATCCTTCAGTTTCGTAGGTGTCAAT CCATTCTCCCTCACGATTTCCTCCCAAACCGGCTCCTTCCCCTTCATTAAATCCTGCAATTTCAAATCCACCCCTTCTTCATACTCTCCACACTCTACTCCAAACTGCTCCGCCAACACCTTCCAAAAATGCTTCCATTTAAACACATCTCCATTACTCACATTAAAGGCCTCGTTTTTTGCATAAGGATCCACTGCAGCCCAAATATGATGCTCCGCTATCAAATCCGCATCAGAGCAATCCGAGTACCCATCCCACGCAGCCTTACAACCAGTAAACCTCAAAACCTTTCCCTCGTGT TTGCAAATAGCTGCATAAACACAAAGGGTACCCACCAAATTCATCATACTATATGGAGAAAACCCGAATATATTCCCTGGGCGATGAACCGACCAAGTCAAACCCTCCTTCTTCTCCACCTCCTCAAGCATAATATCCTCTAAATCATAGTAAAAGTTCATGTACTTCAACCTGGGCAAATCCTCAGTGTAGGGTGGATCATGGGATTCTATTTTCCCGTAGATTCAAATGGTCCCATGTAATGCTTCCTCCCAGTCTGCAATGAGATGTGCTTCAAATTGGGGCAATTAGGGATAACTG CATCAAGCACGTTCCTGAACATTTTGCTATTGGCTTCACA Darstellung der P5βR1 aus Digitalis lanata in pDONR221. Grau hinterlegt: P5βR1 Sequenz; Rot hervorge-hoben: attL-Sites

1.1.2. Entry-Vektoren mit DNA-Fragmenten für pHellsgate8-RNAi Destination Vektor

Arabidopsis thaliana HSD- Fragment

Vektorbezeichnung: pDONRAthHSDi (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (M13uni) ATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTTATTATCACCGGTGGAGCAAGCGGGATTGGTGCTGAGTCCGTCAGGCTATTTACCGACCATGGCGCTCGAGTCGTCATAGTTGACATACAAGACGAGCTCGGTCAAAACGTTGCCGTTTCGGTCGGAGAAGACAAGGCGACTTACTATCATTGCGATGTTACCAACGAGACG GAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCGAAAAACACGGGAAGCTTGACGTTCTGTTCAGTAACGCCGGCGTTATAGAAACATTTACGAGCATCCTCGACTTAGATCTGGACGAATTCGACCGAGTGGTCACCGTTAACCTCCGTGGCGCAGCCGCATTTATCAAATATGCTGCACGTGCCATGGTCGAGAAAGGCACGCGCGGCTCCATCGTCTGCACGACCAGCGTCTCAGGTGAGGTCGCCGGCACCGGACCACACGGGTACACGGCGGCTAAGCATGGGCTAGTGGGTTTGATC AAAACAGCTTCTGGTGGATAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGATATCCCCTATAGTGAGTCGTATTACATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAGGGGTGTTATGAGCCATAT TCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATATGTCGGGCAATCAGTG Darstellung des HSD-Fragments aus Arabidopsis thaliana in pDONR221. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Anhang

151

Arabidopsis thaliana P5βR- Fragment

Vektorbezeichnung: pDONRVEP1i (s. Tabelle 7) MWG Sequenzierung (M13uni) CAATATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGAAGGCTGGGAAGGGTTCATGACGGCTTCTGACGCGGATTTGATTGCGGAGCAGCAGATTTGGGCGGCGGTTGATCCGTATGCGAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAATGCTGATATCTTCAAGTGGAAGCATCTGTGGAAGATTCTAGCTGAGCAGTTTGGGATTGAGGAGTATGGATTTGAGGAAGGGAAGAATTTGGGGTTGGTGGAGATGATGAAAGGGAAAGAGAGAGTGTGGGAGGAGATGGTTCAGGAG Darstellung des VEP1-Fragments aus Arabidopsis thaliana in pDONR221. Grau hinterlegt: VEP1-Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Digitalis lanata HSD- Fragment

Vektorbezeichnung: pDONRDlHSDi (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (M13uni) GGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGACGTCAGAGATGAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACATCATGCTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGGGGCCTTGATGACGAACGTAATCGATCTCGACATGGTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCACGCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGATATCCCCTATAGTGAGTCGTATTACATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGGTGCGACAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCGATGCGCCAGAGTTGTTTCTGAAACATGGCAAAGGTAGCGTTGCCAATGATGTTACAGATGAGATGGTCAGACTAAACTGGCTGACGGAATTTATGCCTCTTCCGACCATCAAGCATTTTATCCGTACTCCTGATGATGCATGGTTACTCACCACTGCGATCCCCGGAAAACA Darstellung des HSD-Fragments aus Digitalis lanata in pDONR221. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Digitalis lanata P5βR- Fragment

Vektorbezeichnung: pDONRDlP5βRi (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (M13uni)

ATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGACGCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGA AAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAAC Darstellung des P5βR-Fragments aus Digitalis lanata in pDONR221. Grau hinterlegt: P5βR-Sequenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Erysimum crepidifolium HSD- Fragment

Vektorbezeichnung: pDONREcHSDi (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (M13uni) TCATATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTTATTATCACCGGTGGAGCAAGCGGGATTGGTGCTGAGTCCGTCAGGCTATTTACCGACCATGGCGCTCGAGTCGTCATAGTTGACATACAAGACGAGCTCGGTCAAAACGTTGCCGTTTCGGTCGGAGAAGACAAGGCGACTTACTATCATTGCGATGTTACCAACGA

Anhang

152

GACGGAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCGAAAAACACGGGAAGCTTGACGTTCTGTTCAGTAACGCCGGCGTTATAGAAACATTTACGAGCATCCTCGACTTAGATCTGGACGAATTCGACCGAGTGGTCACCGTTAACCTCCGTGGCGCAGCCGCATTTATCAAATATGCTGCACGTGCCATGGTCGAGAAAGGCACGCGCGGCTCCATCGTTTGCACGACCAGCGTCTCAGGTGAGGTCGCCGGCACCGGACCACACGGGTACACGGCGGCTAAGCATGGGCTAGTGGGTTTGATCAAAACAGCTTCTGGTGGATAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGATATCCCCTATAGTGAGTCGTATTACATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAACGTCGAGGCCGCGATTAAATTCCAACATGGATGCTGATTTATATGGGTATAAATGGGCTCGCGATAATGTCGGGCAATCAGTG Darstellung des HSD-Fragments aus Erysimum crepidifolium in pDONR221. Grau hinterlegt: HSD-Se-quenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

Erysimum crepidifolium P5βR- Fragment

Vektorbezeichnung: pDONREcP5βRi (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (M13uni) CATAATGATTTTATTTTGACTGATAGTGACCTGTTCGTTGCAACAAATTGATGAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAGAAGGCTGGGAAGGGTTCACGACGGCTTCGGACGCGGACCTGATCGCTGAGCAGCAGATTTGGGCTGCGGTTGATCCGTATGCTAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAACGCGGATATCTTCAAGTGGAAACATCTGTGGAAGATTCTGGCTGAGCAGTTTGGGATTGAGGAGTATGGATTTGAGGAAGGGAAGAATTTGGGGTTAGTGGAGATGATGAAGGGGAAAGAGAGAGTGTGGGAGGAAATGGTGAAGGAGAATCAGCTGCAGGAGAAGAAGCTTGAGGAAGTTGGTGTGTGGTGGTTTGCGGATGTTATACTTGGAGTTGAAGGAATGATTGATAGTATGAACAAGAGTAAGGAACATGGCTTCCTTGGTTTTAGGAACTCCAACAACTCTTTTATCTCTTGGATTGACAAGTACAAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTTGGCATTATAAGAAAGCATTGCTTATCAATTTGTTGCAACGAACAGGTCACTATCAGTCAAAATAAAATCATTATTTGCCATCCAGCTGATATCCCCTATAGTGAGTCGTATTACATGGTCATAGCTGTTTCCTGGCAGCTCTGGCCCGTGTCTCAAAATCTCTGATGTTACATTGCACAAGATAAAAATATATCATCATGAACAATAAAACTGTCTGCTTACATAAACAGTAATACAAGGGGTGTTATGAGCCATATTCAACGGGAAAACGTCGAGGCCCGCGATTAAATTCC Darstellung des P5βR-Fragments aus Erysimum crepidifolium in pDONR221. Grau hinterlegt: P5βR-Se-quenz; Rot hervorgehoben: attL-Sites

1.2. Sequenzen der Expressions-Klone

1.2.1. pEarlyGate100 Überexpressions-Klone

Arabidopsis thaliana VEP1 Vektorbezeichnung: pEarly100VEP1_11 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (35S) TTTAGGAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGAGTTGGTGGTGGGCTGGCGCCATCGGAGCTGCCAAGAAGAAACTCGACGAAGATGAACCATCACAAAGCTTCGAGAGCGTCGCTCTCATCATCGGCGTTACTGGAATCGTCGGAAACAGCTTGGCGGAGATTCTCCCTCTTTCCGACACACCCGGTGGTCCATGGAAAGTCTACGGCGTCGCTCGTCGTCCTCGTCCTACCTGGAACGCCGATCATCCGATCGATTACATCCAGTGCGATGTCTCCGACGCCGAAGACACAAGATCCAAGCTTTCCCCTTTAACCGATGTCACACATGTCTTCTACGTCACCTGGACCAATCGTGAATCGGAAAGTGAAAACTGTGAAGCAAATGGCTCAATGCTCCGTAACGTTCTCCAAGCGATTATCCCATACGCGCCAAATCTCCGACATGTTTGTCTCCAGACAGGGACAAAGCACTACCTTGGCCCTTTCACCAACGTTGACGGACCTCGTCACGATCCACCGTTCACTGAGGATATGCCGAGATTGCAGATCCAGAATTTCTATTATACCCAAGAGGATATTCTGTTTGAAGAGATCAAGAAGATAGAAACCGTGACGTGGTCTATCCACAGACCAAACATGATCTTTGGGTTCTCTCCTTATAGTTTGATGAACATTGTTGGGACTCTCTGTGTCTATGCAGCGATATGTAAGCATGAAGGGTCTCCGTTGTTGTTTCCTGGGAGCAAGAAAGCTTGGGAAGGGTTCATGACGGCTTCTGACGCGGATTTGATTGCGGAGCAGCAGATTTGGGCGGCGGTTGATCCGTATGCGAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAATGCTGATATCTTCAAGTGGAAGCATCTGTGGGAGATTCTAGCTGAGCAGTTTGGGATGAGAGTA Darstellung des VEP1 aus Arabidopsis thaliana in pEarlyGate100. Grau hinterlegt: VEP1-Sequenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

Anhang

153

Arabidopsis thaliana HSD

Vektorbezeichnung: pEarly100AthHSD_2 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (35S) ATGAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTAATTATTACTGGCGGAGCAAGCGGGATTGGGGCTGAGTCCGTTCGATTATTTACCGAACACGGCGCTCGAGTCGTGATCGTTGATGTACAGGATGAGCTCGGTCAAAACGTTGCAGTTTCGATCGGTGAAGACAAAGCGAGTTACTATCATTGCGATGTCACGAACGAGACGGAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCGAAAAATATGGGAAGCTTGACGTTCTGTTTAGTAACGCCGGCGTAATAGAGCCGTTTGTGAGCATCCTCGACTTAAACCTCAACGAGTTAGACCGAACGATCGCCATTAACCTCCGCGGCACAGCCGCATTCATCAAGCATGCTGCACGTGCCATGGTGGAGAAAGGCATCCGCGGCTCCATCGTTTGCACCACTAGCGTCGCGGCTGAGATCGCTGGCACGGCACCACACGGGTACACGACGTCGAAGCATGGGCTGTTGGGTTTGATCAAATCGGCTTCTGGTGGATTAGGAAAATATGGTATAAGAGTAAACGGCGTTGCTCCATTTGGTGTCGCAACACCGTTAGTTTGTAATGGTTTCAAGATGGAACCAAACGTGGTGGAGCAGAACACGTCAGCTTCGGCGAATCTAAAGGGCATTGTATTGAAAGCTCGTCACGTGGCAGAAGCTGCTCTGTTTTTTAGCGTCCGATGAGTCGGCTTACGTTAGCGGACAGAACCTGGCTGTTGACGGTGGTTACTCGGTGGTGAAGCCGTAGAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGCCTAGGTGAGTCTAGAGAGTTAATTAAGACCCGGGACTAGTCCCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTT Darstellung des HSD aus Arabidopsis thaliana in pEarlyGate100. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz; Rot her-vorgehoben: attB-Sites

Erysimum crepidifolium P5βR Vektorbezeichnung: pEarly100EcP5βR_5 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (35S) GGAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGAGTTGGTGGGGGGCTGGCGCCATCGGAGCTGCCAAGAAGAAACTCGACGACGATGAGCCGTCGCAAAGCTACGAGAGCGTCGCTCTCATCATCGGCGTTGCAGGAATCGTCGGAAACAGCCTGGCGGAGATTCTCCCTCTTTCCGACACACCCGGTGGTCCCTGGAAAGTCTACGGCGTCGCTCGCCGTCCCCGTCCCAGCTGGAACGCCGATCATCCGATCGATTACATCCAGTGCGATGTCTCCAACGCCGAAGATGCAAGATCCAAGCTTTCCCCTTTAACCGATGTCACTCACGTCTTCTACGTCACCTGGACCAAGCGCGAATCGGAGAGCGAAAACTGCGAGGCTAACGGCTCAATGCTCCGTAACGTTCTCCAAGCGATTGTCCCACACGCGCCTAATCTCCGGCACATTTGTCTCCAGACGGGGACGAAGCACTACCTCGGCCCTTTCAGCAACCTCGACGGACCTCGCCACGATCCGCCTTTTACTGAGGATATGCCGAGATTGCAGATCCAGAATTTCTATTACACTCAGGAGGATATTCTGTTTGAAGAGATCAAGAAGAAAGAAATTAGTGTGACGTGGTCTATACATAGGCCAAACACGATCTTTGGATTCTCTCCTTACAGTTTGATGAACATTGTTGGGACTCTCTGTGTGTACGCAGCGATCTGCAAGCATGAAGGGTCGCCGTTGTTGTTTCCTGTGAGCAAGAAAGCTTGGGAAGGGTTCACGACGGCTTCGGACGCGGACCTGATCGCTGAGCAGCAGATTTGGGCTGCGGTTGATCCGTATGCTAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAACGCGGATATCTTCAAGTGGAAACATCTGTGGAGAT Darstellung des P5βR aus Erysimum crepidifolium in pEarlyGate100. Grau hinterlegt: P5βR-Sequenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

Erysimum crepidifolium HSD

Vektorbezeichnung: pEarly100EcHSD_3 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (35S) ATGAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTTATTATCACCGGTGGAGCAAGCGGGATTGGTGCTGAGTCCGTCAGGCTATTTACCGACCATGGCGCTCGAGTCGTCATAGTTGACATACAAGACGAGCTCGGTCAAAACGTTGCCGTTTCGGTCGGAGAAGACAAGGCGACTTACTATCATTGCGATGTTACCAACGAGACGGAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCGAAAAACACGGGAAGCTTGACGTTCTGTTCAGTAACGCCGGCGTTATAGAAACATTTACGAGCATCCTCGACTTAGATCTGGACGAATTCGACCGAGTGGTCACCGTTAACCTCCGTGGCGCAGCCGCATTTATCAAATATGCTGCACGTGCCATGGTCGAGAAAGGCACGCGCGGCTCCATCGTTTGCACGACCAGCGTCTCAGGTGAGGTCGCCGGCACCGGACCACACGGGTACACGGCGGCTAAGCATGGGCTAGTGGGTTTGATCAAAACAGCTTCTGGTGGATTGGGGAAATACGGAATAAGAGTAAACGGCGTTGCTCCGTTTGGGGTCGCTACACCGTTAGTTTGTGATA

Anhang

154

GGTACAATATGGAGCCAAACGCGGTGGAGGAGAGCACTCTAGCGTCCGGAAATCTAAAGGGCATCATGTTGAAAGCTCGCCACGTGGCAGAAACTGCTTTGTTTTTAGCATCCGATGCGTCGGCTTACGTTAGCGGACAGAACCTGCCCG Darstellung des HSD aus Erysimum crepidifolium in pEarlyGate100. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

Digtialis lanata P5βR Vektorbezeichnung: pEarly100DlP5βR_4 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (35S) AGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGACGCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTACGTCCAGTGCGACATATCCGATCCAGATGACTCCCAAGCCAAGCTGTCACCTCTGACTGATGTTACCCACGTGTTCTACGTTACCTGGGCTAATCGATCCACCGAACAAGAAAACTGTGAAGCCAATAGCAAAATGTTCAGGAACGTGCTTGATGCAGTTATCCCTAATTGCCCCAATTTGAAGCACATCTCATTGCAGACTGGGAGGAAGCATTACATGGGACCATTTGAATCCTACGGGAAAATAGAATCCCATGATCCACCCTACACTGAGGATTTGCCCAGGTTGAAGTACATGAACTTTTACTATGATTTAGAGGATATTATGCTTGAGGAGGTGGAGAAGAAGGAGGGTTTGACTTGGTCGGTTCATCGCCCAGGGAATATATTCGGGTTTTCTCCATATAGTATGATGAATTTGGTGGGTACCCTTTGTGTTTATGCAGCTATTTGCAAACACGAGGGAAAGGTTTTGAGGTTTACTGGTTGTAAGGCTGCGTGGGATGGGTACTCGGATTGCTCTGATGCGGATTTGATAGCGGAGCATCATATTTGGGCTGCAGTGGATCCTTATGCAAAAAACGAGGCCTTTAATGTGAGTAATGGAGATGTGTTTAAATGGAAGCATTTTTGGAAGTGTTGGC Darstellung des P5βR aus Digitalis lanata in pEarlyGate100. Grau hinterlegt: P5βR-Sequenz; Rot hervor-gehoben: attB-Sites

Digtialis lanata HSD

Vektorbezeichnung: pEarly100DlHSD_1 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (35S) ATAGGAAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACACGCTCGAGATCACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCGCCCCCTTCACCATGTCGTCAAAGCCAAGGTTGGAGGGTAAAGTGGCAATCATCACCGGAGCCGCTAGCGGCATCGGCGAGGAGACGGCAAGATTGTTCGTGGAGCATGGCGCCTCAGTGGTGGTGGCGGACGTCCAGGACGAATTGGGGCGCCAGGTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGACGTCAGAGATGAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACATCATGCTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGGGGCCTTGATGACGAACGTAATCGATCTCGACATGGTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCACGCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGCACCGCCAGCGTGTCGGCGAGCCTTGGAGGCATGGGCCCGCCCGCTTACACGGCTTCCAAACACGCCGTCCTGGGCCTAGTCAAGGCGGCTTGCGCCGAGTTGGGGGTGCACGGGATCCGAGTCAACTCGGTGGCGCCGTACGGTGTGGCGACCCCGATGCCGTGCAGTGCTTACGGAATGACACCGAGTCAGATGGAGGAGGCCAATAACTCCAGGGCTAACTTGAAGGGGGTGGTTTTGAAGGCTAAGCATGTAGCTGAGGCGGCTCTCTTCTTGGCTTCCGATGAGTCGGCTTATGTCAGTGGACAAAACTTGGCTGTCGACGGCGGCTTCACCGTCGTGCGTTAGAAAGGGTGGGCGCGCCGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTGCCTAGTGAGTCTAGAGAGTTAATTAAGACCCGGGACTAGTCCCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCATT Darstellung des HSD aus Digitalis lanata in pEarlyGate100. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz; Rot hervorge-hoben: attB-Sites

Anhang

155

1.2.2. pHellsgate8 RNAi- Klone

Arabidopsis thaliana HSD-Fragment

Vektorbezeichnung: pHellsgate8AthHSD_31 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (ME_pH81dir) GAGGACACGCTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTTATTATCACCGGTGGAGCAAGCGGGATTGGTGCTGAGTCCGTCAGGCTATTTACCGACCATGGCGCTCGAGTCGTCATAGTTGACATACAAGACGAGCTCGGTCAAAACGTTGCCGTTTCGGTCGGAGAAGACAAGGCGACTTACTATCATTGCGATGTTACCAACGAGACGGAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCGAAAAACACGGGAAGCTTGACGTTCTGTTCAGTAACGCCGGCGTTATAGAAACATTTACGAGCATCCTCGACTTAAATCTGGACGAATTCGACCGAGTGGTCACCGTTAACCTCCGTGGCGCAGCCGCATTTATCAAATATGCTGCACGTGCCATGGTCGAGAAAGGCACGCGCGGCTCCATCGTCTGCACGACCAGCGTCTCAGGTGAGGTCGCCGGCACCGGACCACACGGGTACACGGCGGCTAAGCATGGGCTAGTGGGTTTGATCAAAACAGCTTCTGGTGGATAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCTCGAGGAATTCGGTACCCCAGCTTGGTAAGGAAATAATTATTTTCTTTTTTCCTTTTAGTATAAAATAGTTAAGTGATGTTAATTAGTATGATTATAATAATATAGTTGTTATAATTGTGAAAAAATAATTTATAAATATATTGTTTACATAAACAACATAGTAATGTAAAAAAATATGACAAGTGATGTGTAAGACGAAGAAGATAAAAGTTGAGAGTAAGTATATTATTTTTAATGAATTTGATCGAACATGTAAGATGATATACTAGCATTAATATTTGTTTAATCATAATAGTAATTCTAGCTGGTTTGATGAATTTAATATCATGATAAATACTATAGTAAAAATTAGAATAA Darstellung des HSD-Fragments aus Arabidopsis thaliana in pHellsgate8. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

MWG Sequenzierung (ME_pH82dir) ATTTTTCATCACATTCTTATTAATTTCTAAATAATACTTGTAGTTTTATTAACTTCTAAATGGATTGACTATTAATTAAATGAATTAGTCGAACATGAATAAACAAGGTAACATGATAGATCATGTCATTGTGTTATCATTGATCTTACATTTGGATTGATTACAGTTGGGAAGCTGGGTTCGAAATCGATAAGCTTGGATCCTCTAGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATCCACCAGAAGCTGTTTTGATCAAACCCACTAGCCCATGCTTAGCCGCCGTGTACCCGTGTGGTCCGGTGCCGGCGACCTCACCTGAGACGCTGGTCGTGCAGACGATGGAGCCGCGCGTGCCTTTCTCGACCATGGCACGTGCAGCATATTTGATAAATGCGGCTGCGCCACGGAGGTTAACGGTGACCACTCGGTCGAATTCGTCCAGATCTAAGTCGAGGATGCTCGTAAATGTTTCTATAACGCCGGCGTTACTGAACAGAACGTCAAGCTTCCCGTGTTTTTCGACGGTGAACTTAACGGCGTTTTCAACTTCCGTCTCGTTGGTAACATCGCAATGATAGTAAGTCGCCTTGTCTTCTCCGACCGAAACGGCAACGTTTTGACCGAGCTCGTCTTGTATGTCAACTATGACGACTCGAGCGCCATGGTCGGTAAATAGCCTGACGGACTCAGCACCAATCCCGCTTGCTCCACCGGTGATAATAACGATTTTGCCATCCAAATCTTTTTCCAGACATGAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTTGTGCACGTTGTAAAAAACCTGAGCAATGTGTAGCTCAGATCCTTACCGCCGGTTTCGGTTCATTCT Darstellung des HSD-Fragments (reverse) aus Arabidopsis thaliana in pHellsgate8. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz (reverse); Rot hervorgehoben: attB-Sites (reverse)

Arabidopsis thaliana VEP1-Fragment

Vektorbezeichnung: pHellsgate8VEP1_24 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (ME_pH81dir) GCGGAATTCTTTCTTTGGAGAGGACACGCTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAAGAAGCTGGGAAGGGTTCATGACGGCTTCTGACGCGGATTTGATTGCGGAGCAGCAAATTTGGGCGGCGGTTGATCCGTATGCGAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAATGCTGATATCTTCAAGTGGAAGCATCTGTGGAAGATTCTAGCTGAGCAGTTTGGGATTGAGGAGTATGGATTTGAGGAAGGGAAGAATTTGGGGTTGGTGGAGATGATGAAAGGGAAAGAGAGAGTGTGGGAGGAGATGGTTAACGAGGATCAAATGGCACAAGAAACCTTGTGTACCTGGCTGGGTGCCGACCC Darstellung des VEP1-Fragments aus Arabidopsis thaliana in pHellsgate8. Grau hinterlegt: VEP1-Sequenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

MWG Sequenzierung (ME_pH82dir) TATGGCATTATTTTTCATCACATTCTTATTAATTTCTAAATAATACTTGTAGTTTTATTAACTTCTAAATGGATTGACTATTAATTAAATGAATTAGTCGAACATGAATAAACAAGGTAACATGATAGATCATGTCATTGTGTTATCATTGATCTTACATTTGGATTGATTACAGTTGGGAAGCTGGGTTCGAAATCGATAAGCTTGGATCCTCTAGACCACTTT

Anhang

156

GTACAAGAAAGCTGGGTCTTGTACTTGTCAATCCAAGAGATAAAAGAGTTGTTGGAGTTCCTGAAACCAAGGAAGCCATATTCCTTACTCTTGTTCATACTATCAATCATTCCTTCAACTCCAAGTATAACATCAGCAAACCACCACACACCAACTTCCTCAAGCTTCTTCTCTTGCAATTGATCCTCCTTAACCATCTCCTCCCACACTCTCTCTTTCCCTTTCATCATCTCCACCAACCCCAAATTCTTCCCTTCCTCAAATCCATACTCCTCAATCCCAAACTGCTCAGCTAGAATCTTCCACAGATGCTTCCACTTGAAGATATCAGCATTGTTGCAGTTAAACGCCTCGTTCTTCGCATACGGATCAACCGCCGCCCAAATCTGCTGCTCCGCAATCAAATCCGCGTCAGAAGCCGTCATGAACCCTTCCCAGCCTTCTGAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTTGTGCACGTTGTAAAAAACCTGAGCATGTGTAGCTCAGATCCTTACCGCCGGTTTCGGTTCATTCTAATGAATATATCACCCGTTACTATCGTATTTTTATGAATAATATTCTCCGTTCAATTTACTGATTGTACCCTACTACTTATATGTACAATATTAAAATGAAAACAATATATTGTGCTGAATAGGTTTATAGCGACATCTATGATAGAGCGCCACATAACAAACAATTGCGTTTTATTATTACAAATCCAAT TTAAAAAAAGCGGCAGAACCGGTCAAACTAAAGACTGATACATAAATCTTATTCAAATTTCAAGTGCCCCAGGGCTAGTTTCTACGACCACGAGCGGCGACTATACGCTCACTGAGGTACCTCGTCCCGGCGCCGCATGGTGGAATCTTGAGTGATATTGGCGCTCGCTCACGAAGTTACGGACATCACGGTTCAGACAGCGCCGTTACGGACACTTGTGCGTGCCCCCGAGAT Darstellung des VEP1-Fragments (reverse) aus Arabidopsis thaliana in pHellsgate8. Grau hinterlegt: VEP1-Sequenz (reverse); Rot hervorgehoben: attB-Sites (reverse)

Digitalis lanata HSD-Fragment

Vektorbezeichnung: pHellsgate8DlHSD_16 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (ME_pH81dir) GTAGGATTCATTTCTTTGGAGAGGACACGCTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCTCGTCGCTTCCGTAAACTCTGACGACAAGATAAGTTACTACCACTGCGACGTCAGAGATGAAAAACAAGTGGCGGCCACCGTCCGCTACGCGGTGGAGAAATACGGGCGCCTCGACATCATGCTGAGCAACGCCGGAGTCTTCGGGGCCTTGATGACGAACGTAATCGATCTCGACATGGTTGACTTTGAAAATGTATTGGCGACTAACGTGCGCGGAGTTGCCAACACTATAAAGCACGCGGCACGAGCCATGGTGGAGGGGAAGGTCAAGGGGTCCATCATTTGAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCTCGAGGAATTCGGTACCCCAGCTTGGTAAGGAAATAATTATTTTCTTTTTTCCTTTTAGTATAAAATAGTTAAGTGATGTTAATTAGTATGATTATAATAATATAGTTGTTATAATTGTGAAAAAATAATTTATAAATATATTGTTTACATAAACAACATAGTAATGTAAAAAAATATGACAAGTGATGTGTAAGACGAAGAAGATAAAAGTTGAGAGTAAGTATATTATTTTTAATGAATTTGATCGAACATGTAAGATGATATACTAGCATTAATATTTGTTTTAATCATAATAGTAATTCTAGCTGGTTTGATGAATTAAATATCAATGATAAAATACTATAGTAAAAATAAGAATAAATAAATTAAAATAATATTTTTTTATGATTAATAGTTTATTATATAATTAAATATCT… Darstellung des HSD-Fragments aus Digitalis lanata in pHellsgate8. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

MWG Senquenzierung (ME_pH82dir) AATGGATTATTTTTCATCACATTCTTATTAATTTCTAAATAATACTTGTAGTTTTATTAACTTCTAAATGGATTGACTATTAATTAAATGAATTAGTCGAACATGAATAAACAAGGTAACATGATAGATCATGTCATTGTGTTATCATTGATCTTACATTTGGATTGATTACAGTTGGGAAGCTGGGTTCGAAATCGATAAGCTTGGATCCTCTAGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTCAAATGATGGACCCCTTGACCTTCCCCTCCACCATGGCTCGTGCCGCGTGCTTTATAGTGTTGGCAACTCCGCGCACGTTAGTCGCCAATACATTTTCAAAGTCAACCATGTCGAGATCGATTACGTTCGTCATCAAGGCCCCGAAGACTCCGGCGTTGCTCAGCATGATGTCGAGGCGCCCGTATTTCTCCACCGCGTAGCGGACGGTGGCCGCCACTTGTTTTTCATCTCTGACGTCGCAGTGGTAGTAACTTATCTTGTCGTCAGAGTTTACGGAAGCGACGAGAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTTGTGCACGTTGTAAAAAACCTGAGCATGTGTAGCTCAGATCCTTACCGCCGGTTTCGGTTCATTCTAATGAATATATCACCCGTTACTATCGTATTTTTATGAATAATATTCTCCGTTCAATTTACTGATTGTACCCTACTACTTATATGTACAATATTAAAATGAAAACAATATATTGTGCTGAATAGGTTTATAGCGACATCTATGATAGAGCGCCACAATAACAAACAATTGC…

Darstellung des HSD-Fragments (reverse) aus Digitalis lanata in pHellsgate8. Grau hinterlegt: HSD-Se-quenz (reverse); Rot hervorgehoben: attB-Sites (reverse)

Anhang

157

Digitalis lanata P5βR-Fragment

Vektorbezeichnung: pHellsgate8DlP5βR_6 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (ME_pH81dir) GGGAAAGTTCTTCCTTTGGAGAGGACACGCTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGAGCTGGTGGTGGGCTGGAGCGATAGGCGCTGCAAAGAAAAGGTTGGAAGAAGATGACGCACAGCCAAAGCATTCGAGCGTGGCGTTGATAGTTGGGGTAACCGGAATCATCGGCAACAGCCTGGCGGAGATCCTGCCACTGGCCGACACCCCCGGCGGTCCGTGGAAGGTATACGGCGTCGCCCGCCGCACCAGACCCGCCTGGCATGAGGATAATCCGATCAATTAAAACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCTAGAGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCAGCTTCCCAACTGTAATCAATCCAAATGTAAGATCAATGATAACACAATGACATGATCTATCATGTTACCTTGTTTATTCATGTTCGACTAATTCATTTAATTAATAGTCAATCCATTTAGAAGTTAATAAAACTACAAGTATTATTTAGAAATTAATAAGAATGTTGATTGAAAAATAATACTATATAAAATTGATAGATCTTGCGCTTTGTTATATTAGCATTAGATTATGTTTTGTTACATTAGATTACTGTTTCTATTAGTTTGATATTATTTGTTACTTTAGCTTGTTATTTAATATTTTGTTTATTGATAAATTACAAGCAGATTGGAATTTCTAACAAAATATTTATTAACTTTTAAACTAAAATATTTAGTAATGGTATAGATATTTAATTATATAATAAACTATTAATCATAAAAAAATATTATTTTAATTTATTTATTCTTATTTTTACTATAG… Darstellung des P5βR-Fragments aus Digitalis lanata in pHellsgate8. Grau hinterlegt: P5βR-Sequenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

MWG Sequenzierung (ME_pH82dir) TATGGCATTTATTTTTCATCACATTCTTATTAATTTCTAAATAATACTTGTAGTTTTATTAACTTCTAAATGGATTGACTATTAATTAAATGAATTAGTCGAACATGAATAAACAAGGTAACATGATAGATCATGTCATTGTGTTATCATTGATCTTACATTTGGATTGATTACAGTTGGGAAGCTGGGTTCGAAATCGATAAGCTTGGATCCTCTAGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTAATTGATCGGATTATCCTCATGCCAGGCGGGTCTGGTGCGGCGGGCGACGCCGTATACCTTCCACGGACCGCCGGGGGTGTCGGCCAGTGGCAGGATCTCCGCCAGGCTGTTGCCGATGATTCCGGTTACCCCAACTATCAACGCCACGCTCGAATGCTTTGGCTGTGCGTCATCTTCTTCCAACCTTTTCTTTGCAGCGCCTATCGCTCCAGCCCACCACCAGCTCATGAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCTCGAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATCAATCCACTTGCTTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGGACCACTGTCGGCAGAGAGATCTTGAATGATAGCCTTTCCTTTATCGCAATGATGGCATTTGTAGGAGCCACCTTCCTTTTCTACTGTCCTTTCGATGAAGTGACAGATAGCTGGGCAATGGAATCCGAGGAGGTTTCCCGAAATTATCCTTTGTTGAAAAGTCTCAATAGCCCTTTGGTCTTCTGAGACTGTATCTTTGACATTTTTGGAGTAGACCAGAGTGTCGTGCTCCACCATGTTGACGAAGAATTTTCTTCTTGTCATTGAGTCGTAAAAGACTCTGTATGAACTGTTCGCCAGTCTCACGGC Darstellung des P5βR-Fragments (reverse) aus Digitalis lanata in pHellsgate8. Grau hinterlegt: P5βR-Se-quenz (reverse); Rot hervorgehoben: attB-Sites (reverse)

Erysimum crepidifolium HSD-Fragment

Vektorbezeichnung: pHellsgate8 EcHSD_2 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (ME_pH81dir) GCTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCATGTCTGGAAAAAGATTGGATGGCAAAATCGTTATTATCACCGGTGGAGCAAGCGGGATTGGTGCTGAGTCCGTCAGGCTATTTACCGACCATGGCGCTCGAGTCGTCATAGTTGACATACAAGACGAGCTCGGTCAAAACGTTGCCGTTTCGGTCGGAGAAAACAAGGCGACTTACTATCATTGCGATGTTACCAACGAGACGGAAGTTGAAAACGCCGTTAAGTTCACCGTCAAAAAACACGGGAAGCTTGACGTTCTGTTCAGTAACGCCGGCGTTATAGAAACATTTACGAGCATCCTCGACTTAAATCTGGACGAATTCGACCGAGTGGTCACCGTTAACCTCCGTGGCGCAGCCGCATTTATCAAATATGCTGCACGTGCCATGGTCGAGAAAGGCACGCGCGGCTCCATCGTTTGCACGACCAGCGTCTCAGGTGAGGTCGCCGGCACCGGACCACACGGGTACACGGCGGCTAAGCATGGGCTAGTGGGTTTGATCAAAACAGCTTCTGGTGGATAGACCCAGCTTTCTTGTACAAAGTGGTCTAGAGGATCCAAGCTTATCGATTTCGAACCCAGCTTCCCAACTGTAATCAATCCAAATGTAAGATCAATGATAACACAATGACATGATCTATCATGTTACCTTGTTTATTCATGTTCGACTAATTCATTTAATTAATAGTCAATCCATTTAGAAGTTAATAAAACTACAAGTATTATTTAGAAATTAATAAGAATGTTGATTGAAAAATAATACTATATAAAATTGATAGATCTTGCGCTTTGTTATATTAGCATTAGATTATGTTTTGTTACATTAGATTACTGTTTCTATTAGTTTGATATTATTTGTTACTTTAGCTTGTTAT Darstellung des HSD-Fragments aus Erysimum crepidifolium in pHellsgate8. Grau hinterlegt: HSD-Se-quenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

Anhang

158

MWG Sequenzierung (ME_pH82dir) CATCACATTCTTATTATTTCTAAATAATACTTGTAGTTTTATTAACTTCTAAATGGATTGACTATTAATTAAATGAATTAGTCGAACATGAATAAACAAGGTAACATGATAGATCATGTCATTGTGTTATCATTGATCTTACATTTGGATTGATTACAGTTGGGAAGCTGGGTTCGAAATCGATAAGCTTGGATCCTCTAGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTATCCACCAGAAGCTGTTTTGATCAAACCCACTAGCCCATGCTTAGCCGCCGTGTACCCGTGTGGTCCGGTGCCGGCGACCTCACCTGAGACGCTGGTCGTGCAAACGATGGAGCCGCGCGTGCCTTTCTCGACCATGGCACGTGCAGCATATTTGATAAATGCGGCTGCGCCACGGAGGTTAACGGTGACCACTCGGTCGAATTCGTCCAGATCTAAGTCGAGGATGCTCGTAAATGTTTCTATAACGCCGGCGTTACTGAACAGAACGTCAAGCTTCCCGTGTTTTTCGACGGTGAACTTAACGGCGTTTTCAACTTCCGTCTCGTTGGTAACATCGCAATGATAGTAAGTCGCCTTGTCTTCTCCGACCGAAACGGCAACGTTTTGACCGAGCTCGTCTTGTATGTCAACTATGACGACTCGAGCGCCATGGTCGGTAAATAGCCTGACGGACTCAGCACCAATCCCGCTTGCTCCACCGGTGATAATAACGATTTTGCCATCCAATCTTTTTCCAGACATGAAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCTCGAGCGTGTCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTCTTGCGAAGGATAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTTACGTCAGTGGAGATGTCACATCAATCCACTTGCTTGAAGACGTGGTTGGAACGTCTTCTTTTTCCACGATGCTCCTCGTGGGTGGGGGTCCATCTTTGGACCAC Darstellung des HSD-Fragments (reverse) aus Erysimum crepidifolium in pHellsgate8. Grau hinterlegt: HSD-Sequenz (reverse); Rot hervorgehoben: attB-Sites (reverse)

Erysimum crepidifolium P5βR- Fragment

Vektorbezeichnung: pHellsgate8EcP5βR_3 (s. Tabelle 7)

MWG Sequenzierung (ME_pH81dir) CAGAATTCATTTCTTTGGAGAGGACACGCTCGAGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCAAAAGGCTGGGAAGGGTTCACGACGGCTTCGGACGCGGACCTGATCGCTGAGCAGCAGATTTGGGCTGCGGTTGATCCGTATGCTAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAACGCGGATATCTTCAAGTGGAAACATCTGTGGAAGATTCTGGCTGAGCAGTTTGGGATTGAGGAGTATGGATTTGAGGAAGGGAAGAATTTGGGGTTAGTGGAGATGATGAAGGGGAAAGAGAGAGTGTGGCAGGAATCGGTTAACACTAATCTTTACCCGGATAAGAATCTCGACCCAAAAGCATTGAGAAGGATTACGATATGTTTTTTTGTATTCTAATGTTCGCACGTACCGCTCTCTCGCACCTCGGCTCTATCCTGCTCAGT Darstellung des P5βR-Fragments aus Erysimum crepidifolium in pHellsgate8. Grau hinterlegt: P5βR-Se-quenz; Rot hervorgehoben: attB-Sites

MWG Sequenzierung (ME_pH82dir) AATGCATTATTTTTCATCAACATTCTTATTAATTTCTAAATAATACTTGTAGTTTTATTAACTTCTAAATGGATTGACTATTAATTAAATGAATTAGTCGAACATGAATAAACAAGGTAACATGATAGATCATGTCATTGTGTTATCATTGATCTTACATTTGGATTGATTACAGTTGGGAAGCTGGGTTCGAAATCGATAAGCTTGGATCCTCTAGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTTGTACTTGTCAATCCAAGAGATAAAAGAGTTGTTGGAGTTCCTAAAACCAAGGAAGCCATGTTCCTTACTCTTGTTCATACTATCAATCATTCCTTCAACTCCAAGTATAACATCCGCAAACCACCACACACCAACTTCCTCAAGCTTCTTCTCCTGCAGCTGATTCTCCTTCACCATTTCCTCCCACACTCTCTCTTTCCCCTTCATCATCTCCACTAACCCCAAATTCTTCCCTTCCTCAAATCCATACTCCTCAATCCCAAACTGCTCAGCCAGAATCTTCCACAGATGTTTCCACTTGAAGATATCCGCGTTGTTGCAGTTAAACGCCTCGTTCTTAGCATACGGATCAACCGCAGCCCAAATCTGCTGCTCAGCGATCAGGTCCGCGTCCGAAGCCGTCGTGAACCCTTCCCAGCCTTCTGAAGCCTGCTTTTTTGTACAAACTTGTCTAGAGTCCTGCTTTAATGAGATATGCGAGACGCCTATGATCGCATGATATTTGCTTTCAATTCTGTTGTGCACGTTGTAAAAAACCTGAGCATGTGTAGCTCAGATCCTTACCGCCGGTTTCGGTTCATTCTAATGAATATATCACCCGTTACTATCGTATTTTTATGAATAATATTCTCCGTTCAATTTACTGATTGTACCCTACTACTTATATGTACAATATTAAAATGAAACATATATTGTGCTGAATAGGTTTATAGCGACATCTATGATAGAGCGCCACAATTAACAAACATTGCGTTTTATTATTACAATCCAATTTAAAAAAAGGCGGCAGAACCGTCAAACCTAAAGACTGATTAATAAATCTTATTCAAATTTCAAAAGTGC Darstellung des P5βR-Fragments (reverse) aus Erysimum crepidifolium in pHellsgate8. Grau hinterlegt: P5βR-Sequenz (reverse); Rot hervorgehoben: attB-Sites (reverse)

Anhang

159

1.3. cDNA Sequenz von At5g58750

MWG Sequenzierung (M13uni) ATAGGGCGATTGGGCCCTCTAGATGCATGCTCGAGCGGCCGCCAGTGTGATGGATATCTGCAGAATTCGCCCTTATGGGGTCTGAAAATGGCAGCTTGATGAGAAGAAACGAAGTAGACGAGAATGTAGCGTTAATCTTTGGCGTCACCGGGCTTGTGGGTCGAGAGATTGTTAAGACGCTATTAATGTCTAAACCAGGATGGAGAATCTACGGCGTAGCGCGTAACCCGGAGATCAATTCCATGACGAAGATGTACAACTTCATCTCCTGCGATCTGCTTAACGCATCTGAGACTAAAC AGAGGTTGTCTCCATTACAAGACATCGTGAGTCACGTGTTTTGGGTCACGTGGTCTGGTGAGTTTCCATTGGATACCGACGAATGTTGCGTACAGAACAAGACGATGCTGATGAACGCTTTGGACGCGATTCTCCCAAACGCTAAGAGGTTAAAGCATTTCTCGCTTCAAACGGGGATGAAGCATTATGTGTCTTTGGTGGAAGAGACAATGGCTCGTGGAGAAGGTTCGAGTTTGTATTATTACAGCGAGGAGTGTCCAAGAAAGAGCTCTGGGAAGAATTTCTACTATGTTTTGGAGG ACTTGCTGAAGGAGAAGATCACTCGTAGTTCCGTTGTTTGGTCGGTTCAAAGACCTGGTTTGCTAATGGGAAGCTCTTCAAGAACTCTGTACAACTTCATGGGAAGTCTTTGTGTTTATGGAGCGATGTGTAAGTATTTGAATCTTCCTTTTGTGTTTGGAGGAACAAGAGAATGTTGGGAAGAGAGTTACATAGATGGCTCTGATTCGAATTTAGTCGCGGAGCAGCATATATTCGCTGCAACAAGTGGGAAAGTACGCGAGAAAGGGGAAGCTTTTAACGCCATTAATGGAGTAG

MWG Sequenzierung (M13rev) CATGATTACGCCAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTTTACAAAGGAATGAGTTTTTCATCTCTCATCACATCAATCCAATACAAAACCGAATCTAGGGTTCTATATTTCCTCTTAAACCCAAACCTATCTACTTTTTCTCTTTTCCCAAGAAGCTTAAACGGACATCTAAACAGAGCATCCAAGAAATACCAATTCGCCAAATCCTCAATCTCTGTCCTAACAAGCTTCTCCTTCACAACAATCTCATCCCACACATGTTTTCTCTCAACCATCTCTCTCCCAAACCAGAAACCTTCATCAAACATGGTTGTTTCGTTAACTTGTACACCAAGTTTCTTCCCTATTTCCGGCCAAATCTCCTTCCAAGTAAACCCTACTCCATTAATGGCGTTAAAAGCTTCCCCTTTCTCGCGTACTTTCCCACTTGTTGCAGCGAATATATGCTGCTCCGCGACTAAATTCGAATCAGAGCCATCTATGTAACTCTCTTCCCAACATTCTCTTGTTCCTCCAAACACAAAAGGAAGATTCAAATACTTACACATCGCTCCATAAACACAAAGACTTCCCATGAAGTTGTACAGAGTTCTTGAAGAGCTTCCCATTAGCAAACCAGGTCTTTGAACCGACCAAACAACGGAACTACGAGTGATCTTCTCCTTCAGCAAGTCCTCCAAAACATAGTAGAAATTCTTCCCAGAGCTCTTTCTTGGACACTCCTCGCTGTAATAATACAAACTCGAACCTTCTCCACGAGCCATTGTCTCTTCCACCAAAGACACATAATGCTTCATCCCCGTTTGAAGCGAGAAATGCTTTAACCTCTTAGCGTTTGGGAGAATCGCGTCCAAAGCGTTCATCAGCATCGTCTTGTTCTGTACGCAACATTCGTCGGTATCCAATGA Darstellung der cDNA At5g58750 (P5βR2) aus Arabidopsis thaliana in pGEMT Vektor. Grau hinterlegt: P5βR2-Sequenz (direkt und reverse Sequenz)

Zusammengesetzte cDNA Sequenz At5g58750 ATGGGGTCTGAAAATGGCAGCTTGATGAGAAGAAACGAAGTAGACGAGAATGTAGCGTTAATCTTTGGCGTCACCGGGCTTGTGGGTCGAGAGATTGTTAAGACGCTATTAATGTCTAAACCAGGATGGAGAATCTACGGCGTAGCGCGTAACCCGGAGATCAATTCCATGACGAAGATGTACAACTTCATCTCCTGCGATCTGCTTAACGCATCTGAGACTAAACAGAGGTTGTCTCCATTACAAGACATCGTGAGTCACGTGTTTTGGGTCACGTGGTCTGGTGAGTTTCCATTGGATACCGACGAATGTTGCGTACAGAACAAGACGATGCTGATGAACGCTTTGGACGCGATTCTCCCAAACGCTAAGAGGTTAAAGCATTTCTCGCTTCAAACGGGGATGAAGCATTATGTGTCTTTGGTGGAAGAGACAATGGCTCGTGGAGAAGGTTCGAGTTTGTATTATTACAGCGAGGAGTGTCCAAGAAAGAGCTCTGGGAAGAATTTCTACTATGTTTTGGAGGACTTGCTGAAGGAGAAGATCACTCGTAGTTCCGTTGTTTGGTCGGTTCAAAGACCTGGTTTGCTAATGGGAAGC TCTTCAAGAACTCTGTACAACTTCATGGGAAGTCTTTGTGTTTATGGAGCGATGTGTAAGTATTTGAATCTTCCTTTTGTGTTTGGAGGAACAAGAGAATGTTGGGAAGAGAGTTACATAGATGGCTCTGATTCGAATTTAGTCGCGGAGCAGCATATATTCGCTGCAACAAGTGGGAAAGTACGCGAGAAAGGGGAAGCTTTTAACGCCATTAATGGAGTAGGGTTTACTTGGAAGGAGATTTGGCCGGAAATAGGGAAGAAACTTGGTGTACAAGTTAACGAAACAACCATGTTTGAT GAAGGTTTCTGGTTTGGGAGAGAGATGGTTGAGAGAAAACATGTGTGGGATGAGATTGTTGTGAAGGAGAAGCTTGTTAGGACAGAGATTGAGGATTTGGCGAATTGGTATTTCTTGGATGCTCTGTTTAGATGTCCGTTTAAGCTTCTTGGGAAAAGAGAAAAAGTAGATAGGTTTGGGTTTAAGAGGAAATATAGAACCCTAGATTCGGTTTTGTATTGGATTGATGTGATGAGAGATGAAAAACTCATTCCTTTGTAA Proteinsequenz von At5g58750 MGSENGSLMRRNEVDENVALIFGVTGLVGREIVKTLLMSKPGWRIYGVARNPEINSMTKMYNFISCDLLNASETKQRLSPLQDIVSHVFWVTWSGEFPLDTDECCVQNKTMLMNALDAILPNAKRLKHFSLQTGMKHYVSLVEETMARGEGSSLYYYSEECPRKSSGKNFYYVLEDLLKEKITRSSVVWSVQRPGLLMGSSSRTLYNFMGSLCVYGAMCKYLNLPFVFGGTRECWEESYIDGSDSNLVAEQHIFAATSGKVREKGEAFNAINGVGFTWKEIWPEIGKKLGVQVNETTMFDEGFWFGREMVERKHVWDEIVVKEKLVRTEIEDLANWYFLDALFRCPFKLLGKREKVDRFGFKRKYRTLDSVLYWIDVMRDEKLIPL*

Anhang

160

1.4. Insertionssequenz der T-DNA Pflanzenlinie SALK_568840

MWG Sequenzierung (M13uni) TTGGGATTGAGGAGTATGGATTTGAGGAAGGGAAGAATTTGGGGTTGGTGGAGATGATGAAAGGGAAAGAGAGAGTGTGGGAGGAGATGGTTAAGGAGAATCAATTGCAAGAGAAGAAGCTTGAGGAAGTTGGTGTGTGGTGGTTTGCTGATGTTATACTTGGAGTTGAAGGAATGATTGATAGTATGAACAAGAGTAAGGAATATGGCTTCCTTGGTTTCAGGAACTCCAACAACTCTTTTATCTCTTGGATTGACAAGTGATGGGCTGCCTGTATCGAGTGGTGATTTTGTGCCGAGCTGCCGGTCGGGGAGCTGTTGGCTGGCTGGTGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACAAATTGACGCTTAGACAACTTAATAACACATTGCGGACGTTTTTAATGTACTGGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGCCCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCA Darstellung der Insertionssequenz von T-DNA Pflanzenlinie SALK_568840 in pGEMT Vektor. Rot = #1103 Primer; Blau = flankierende VEP1 Sequenz, Weiß hinterlegt: VEP1 Gen, Grau hinterlegt: T-DNA Sequenz LB-Abschnitt von pROK2 Vektor; Grün = #220 Primer

1.5. Sequenzen der klonierten DNA-Fragmente für qPCR

Arabidopsis thaliana cDNA VEP1-Fragment

MWG Sequenzierung (M13uni) ATAGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTAGAAGGCTTGGGAAGGGTTCATGACGGCTTCTGACGCGGATTTGATTGCGGAGCAGCAGATTTGGGCGGCGGTTGATCCGTATGCGAAGAACGAGGCGTTTAACTGCAACAATGCTGATATCTTCAAGTGGAAGCATCTGTGGAAGATTCTAGCTGAGCAGTTTGGGATTGAGGAGTATGGATTTGAGGAAGGGAAGAATTTGGGGTTGGTGGAGATGATGAAAGGGAAAGGGAGAGTGTGGGAGGAGATGGTTAAGGAGAATCAATTGCAAGAGAAGAAGCTTGAGGAAGTTGGTGTGTGGTGGTTTGCTGATGTTATACTTGGAGTTGAAGGAATGATTGATAGTATGAACAAGAGTAAGGAATATGGCTA Darstellung des cDNA VEP1-Fragments für qPCR aus Arabidopsis thaliana in pGEMT Vektor. Grau hin-terlegt: VEP1-Sequenz

Arabidopsis thaliana cDNA HEL (PR4)-Fragment MWG Sequenzierung (M13uni) TAGGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTTCAAACGCGATTAATGGCCGAAACAAGCATGTTTCTGGAATCAGGCTGCCCAATGAGCTCATTGCCACAGTCGACAAATTGGTAGTCAACAATGAGATGGCCTTGTTGATAGCCAAAACCATCGGTGTCTATTTGATTGAACATTGCTACATCCAAATCCAAGCCTCCGTTGCTGCATTGGTCCACTATTCTCACAGTTACTGCAGCATTTGTTCTTGTGTTCTTCACCCTTAAACACTTGCAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGAAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGT Darstellung des cDNA HEL(PR4)-Fragments für qPCR aus Arabidopsis thaliana in pGEMT Vektor. Grau hinterlegt: HEL (PR4)-Sequenz

Arabidopsis thaliana cDNA Actin-Fragment MWG Sequenzierung (M13uni) TAGGGGCGATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTATTCAGATGCCCAGAAGTCTTGTTCCAGCCTTCTTTGATCGGAATGGAATCTGCTGGAATTCACGAGACCACCTACAACTCCATCATGAAGTGTGATGTTGATATCAGAAAGGATCTTTATGGGAACATCGTTCTCAGTGGTGGTTCAACCATGTTCCCTGGCATTGCTGA

Anhang

161

CCGTATGAGCAAGGAAATTACAGCCTTGGCTCCCAGCAGCATGAAGATTAAGGTTGTTGCACCACCAGAGAGAAAATACAGTGTCTGGATTGGAGGATCTATTCTTGCATCCCTCAGCACATTCCAGCAGATGTGGATCTCCAATCACTAGTGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAAC Darstellung des cDNA Actin-Fragments für qPCR aus Arabidopsis thaliana in pGEMT Vektor. Grau hin-terlegt: Actin-Sequenz

1.6. cDNA Sequenz von Vitis vinifera P5βR

MWG Sequenzierung (M13uni) GTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCCGCGGGATTATGAGTTGGTGGTGGGCTGGAGCTATTGGCGCTGCCAAGAAGAAATTCGATGAGGATGATGCTCCGCGTGGCTTTCAAAACGTGGGTTTGGTGATTGGCGTCACCGGCATCGTCGGCGACAGCCTCGCTGAAATTCTCCCGCTCTCCGACACTCCCGGCGGTCCATGGAAGGTTTACGGCGTGGCTCGCCGACCACGTCCCGATTGGAACGCCGATCATCCCGTCGAGTACACCCAATGCGACATCTCCGATTCAGAGGATGCCCTCGCCAAGCTCTCGCCTCTCACCGACGTTACCCACGTCTTCTACGTCACCTGGACCAATCGGGCCACCGAGATTGAGAACTGCGAGGCCAACGGCACCATGCTGAGGAACGTTCTCCGAGCGTTGATCCCCAACGCCCCCAATCTCCGCCACATCTGCCTCCAAACCGGCGGCAAACACTACATCGGACCTTTCGAGGCCTTTGGCAAGATCAAACCCCACGATCCCCCATACCACGAAGATCTACCTAGATTGGACGCCCCTAATTTCTACTACACTCTGGAAGACATCCTGTTCGAAGAGTGTGAGAAGAAGGATGATTTGACTTGGTCCGTGCATCGCCCCGTCATCATTTTCGGGTTTTCCCCATATAGCATGATGAACATACTGGGGGACTCTCTGCATCTACGCAGCAATCTGCAAGCACGAGGGAATCCCCTTGAAGTTCCCTGGAAGCAAGGCGGCGTGGGACTGTTACTCAGACGCATCGGATGCAGATCTAATTTGCAGAGCAACAGATATGGGCTACGGTTGAT MWG Sequenzierung (M13rev) CTCGGATCCACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCCTTTCAGGGAGGAATGAGTTTGTGACCTCTCATCTTGTCAATCCACCAAACAAAGGAATTCCGGGAGTTCCTGAAACCCAAGAAGCCGTGTTCCTTGCTCTTGTTCATGCAGTTCAATAAAGACTCTCCACCCAGGACAAGGTCTATAAACCACCACTGCGCAACATCTTCCAGTTTGGTTGGAAGCAACTCCTTCTCCCTCACAATCTCTTCCCACACCGGACCCTTGTCTTTCATCATCTCTACCATGCTTTGCTTCTCTTCACCCTCCTCAAATTCTGCATATTCCATGTCAAATTGCTCAGCCAACACCTTCCACAAATGCTTCCACTTGAACAAATCTCCATTTGTGATGTTAAAGGCTTCGTTTCTAGCATAGGGATCAACCGTAGCCCATATCTGTTGCTCTGCAATTAGATCTGCATCCGATGCGTCTGAGTAACAGTCCCACGCCGCCTTGCTTCCAGGGAACTTCAAGGGGATTCCCTCGTGCTTGCAGATTGCTGCGTAAATGCAGAGAGTCCCCAGTATGTTCATCATGCTATATGGGGAAAACCCGAAAATGATGACGGGGCGATGCACGGACCAAGTCAAATCATCCTTCTTCTCACACTCTTCGAACAGGATGTCTTCCAGAGTGTAGTAGAAATTAGGGGCGTCCAATCTAGGTAGATCTTCGTGGTATGGGGGATCGTGGGGTTTGATCTTGCCAAAGGCCTCGAAAGGTCCGATGTAGTGTTTGCCGCCGGTTTGGAGGCAGATGTGGCGGAGATTGGGGGCGTTGGGGATCAACGCTCGGAGAACGTTCCTCAGCATGGTGCCGTTGGCCTCGCAGTTCTCAATCTCGGTGGCCCGATTGGTTCCAG Darstellung der cDNA P5βR aus Vitis vinifera in pGEMT Vektor. Grau hinterlegt: P5βR-Sequenz (direkt und reverse Sequenz) Zusammengesetzte cDNA Sequenz VvP5βR ATGAGTTGGTGGTGGGCTGGAGCTATTGGCGCTGCCAAGAAGAAATTCGATGAGGATGATGCTCCGCGTGGCTTTCAAAACGTGGGTTTGGTGATTGGCGTCACCGGCATCGTCGGCGACAGCCTCGCTGAAATTCTCCCGCTCTCCGACACTCCCGGCGGTCCATGGAAGGTTTACGGCGTGGCTCGCCGACCACGTCCCGATTGGAACGCCGATCATCCCGTCGAGTACACCCAATGCGACATCTCCGATTCAGAGGATGCCCTCGCCAAGCTCTCGCCTCTCACCGACGTTACCCACGTCTTCTACGTCACCTGGACCAATCGGGCCACCGAGATTGAGAACTGCGAGGCCAACGGCACCATGCTGAGGAACGTTCTCCGAGCGTTGATCCCCAACGCCCCCAATCTCCGCCACATCTGCCTCCAAACCGGCGGCAAACACTACATCGGACCTTTCGAGGCCTTTGGCAAGATCAAACCCCACGATCCCCCATACCACGAAGATCTACCTAGATTGGACGCCCCTAATTTCTACTACACTCTGGAAGACATCCTGTTCGAAGAGTGTGAGAAGAAGGATGATTTGACTTGGTCCGTGCATCGCCCCGTCATCATTTTCGGGTTTTCCCCATATAGCATGATGAACATACTGGGGACTCTCTGCATTTACGCAGCAATCTGCAAGCACGAGGGAATCCCCTTGAAGTTCCCTGGAAGCAAGGCGGCGTGGGACTGTTACTCAGACGCATCGGATGCAGATCTAATTGCAGAGCAACAGATATGGGCTACGGTTGATCCCTATGCTAGAAACGAAGCCTTTAACATCACAAATGGAGATTTGTTCAAGTGGAAGCATTTGTGGAAGGTGTTGGCTGAGCAATTTGACATGGAATATGCAGAATTTGAGGAGGGTGAAGAGAAGCAAAGCATGGTAGAGATGATGAAAGACAAGGGTCCGGT

Anhang

162

GTGGGAAGAGATTGTGAGGGAGAAGGAGTTGCTTCCAACCAAACTGGAAGATGTTGCGCAGTGGTGGTTTATAGACCTTGTCCTGGGTGGAGAGTCTTTATTGAACTGCATGAACAAGAGCAAGGAACACGGCTTCTTGGGTTTCAGGAACTCCCGGAATTCCTTTGTTTGGTGGATTGACAAGATGAGAGGTCACAAACTCATTCCTCCCTGA Proteinsequenz von VvP5βR MSWWWAGAIGAAKKKFDEDDAPRGFQNVGLVIGVTGIVGDSLAEILPLSDTPGGPWKVYGVARRPRPDWNADHPVEYTQCDISDSEDALAKLSPLTDVTHVFYVTWTNRATEIENCEANGTMLRNVLRALIPNAPNLRHICLQTGGKHYIGPFEAFGKIKPHDPPYHEDLPRLDAPNFYYTLEDILFEECEKKDDLTWSVHRPVIIFGFSPYSMMNILGTLCIYAAICKHEGIPLKFPGSKAAWDCYSDASDADLIAEQQIWATVDPYARNEAFNITNGDLFKWKHLWKVLAEQFDMEYAEFEEGEEKQSMVEMMKDKGPVWEEIVREKELLPTKLEDVAQWWFIDLVLGGESLLNCMNKSKEHGFLGFRNSRNSFVWWIDKMRGHKLIPP

2. GC-Chromatogramme

Abbildung 58: GC-MS Chromatogramm von Arabidopsis thaliana Überexpressionslinie AthVvP5βR Rohextraktassay A Negativkontrolle von AthVvP5βR Rohextrakt (100 °C, 10 min) mit 0,3 mM Progesteron, B aktiver Assay aus AthVvP5βR Rohextrakt mit 0,3 mM Progesteron; 1- 5β-Pregnan-3α-ol-20-on (Rt = 9,71), 2- 3-Hydroxy-5-Pregnen-20-on (Rt= 9,75), 3- 5β-Pregnan-3,20-dion (Rt = 9,91), 4- Progesteron (Rt = 10,61), 5- Interner Standard 21-Hydroxypregnenolon (Rt = 12,42)

Anhang

163

Abbildung 59: GC-MS Chromatogramm von Arabidopsis thaliana „knock down” SALK_597798 Rohextraktassay A Negativkontrolle von SALK_597798 Rohextrakt (100 °C, 10 min) mit 0,3 mM Progesteron, B aktiver Assay aus SALK_597798 Rohextrakt mit 0,3 mM Progesteron; 1- Progesteron ( Rt= 10,61), 2- Interner Standard 21-Hydroxypregnenolon ( Rt= 12,42)

Abbildung 60: GC-MS Analyse der Reaktion von rVvP5βR mit Citral Negativkontrolle Negativkontrolle: 100 °C, 10 min, Inkubationsdauer 2 h, Substrat Citral 0,2 mM, rVvP5βR 0,2 mg/mL, 1- Citral B/Neral (Rt = 11,47 min), 2- Citral A/Geranial (Rt = 12,26)

1 2

Anhang

164

Abbildung 61: GC-MS Analyse der Reaktion von rVvP5βR mit β-Ionon Negativkontrolle Negativkontrolle: 100 °C, 10 min, Inkubationsdauer 2 h, Substrat β-Ionon 0,2 mM, rVvP5βR 0,2 mg/mL, 1- β-Ionone (Rt = 15,55 min)

1

Kongressbeiträge und Publikationen

165

Kongressbeiträge und Publikationen

Kongressbeiträge:

Mona Ernst, Vanessa Herl, Frieder Müller-Uri, Wolfgang Kreis (2009) Expression of proges-

terone 5β-reductase (5β-POR) and ∆5-3β-hydroxysteroiddehydrogenase (3β-HSD) in leaves

and cell cultures of Digitalis lanata, Poster Präsentation, Botaniker Tagung, Plants for the Fu-

ture, Leipzig

Mona Ernst, Vanessa Herl, Jan-Henrik Petersen, Frieder Müller-Uri, Wolfgang Kreis (2010)

Expression of 3β-HSD and P5βR, genes coding for ∆5-3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-

HSD) and progesterone 5β-reductase (P5βR), in leaves and cell cultures of Digitalis lanata

EHRH, Poster Präsentation, GA 58th International Congress and Annual Meeting of the Society

for Medicinal Plant and Natural Product Research, Berlin

Publikationen:

Ernst, de Pádua, Herl, Müller-Uri, Kreis (2010) Expression of 3β-HSD und P5βR, genes encod-

ing for ∆5-3β-hydroxisteroid dehydrogenase (3β-HSD) and progesterone 5β-reductase (P5βR)

in leaves and cell cultures of Digitalis lanata Ehrh. Planta Med. 76 (9): S. 923-927.

Munkert, Ernst, Müller-Uri, Kreis (2014) Identification and stress-induced expression of three

3β-hydroxysteroiddehydrogenases from Erysimum crepidifolium Rchb. and their putative role

in cardenolide biosynthesis, Phytochemistry, 100, S. 26-33.

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