Strukturelle Untersuchungen an der Ribonukleotid Reduktase ... · tronische Struktur (σ- oder...

Strukturelle Untersuchungen an der RibonukleotidReduktase und der Pyruvat : Ferredoxin

Oxidoreduktase mittels ESR und ENDORSpektroskopie

vorgelegt vonDiplom-PhysikerMarcus Galander

Von der Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaftender Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen GradesDoktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat -genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Matthias DriessBerichter: Dr. Friedhelm LendzianBerichter: Prof. Dr. Peter HildebrandtTag der wissenschaftlichen Aussprache: 12. Juli 2005

Berlin 2005D 83

i

Kurzfassung

Marcus Galander:Strukturelle Untersuchungen an der Ribonukleotid Reduktase und der Pyruvat :Ferredoxin Oxidoreduktase mittels ESR und ENDOR SpektroskopieRadikale sind als transiente Intermediate aktive Bestandteile der katalytischen Funktion vieler

Enzyme. Radikalenzyme treiben einen großen Bereich biologischer Reaktionen. Diese Re-

aktionen sind mit spezifischen lokalen und strukturellen Änderungen des jeweiligen Enzyms

verbunden. Deren Kenntnis ist für das Verständnis des Reaktionsmechanismus von entschei-

dender Bedeutung. Aufgrund ihrer kurzen Lebendsdauer und ihrer hohen Reaktivität ist die

Konformation von Radikalintermediaten der Röntgenstrukturanalyse jedoch meist unzugäng-

lich. Im Rahmen dieser Arbeit wird gezeigt, wie durch die Kombination von ESR und ENDOR

Spektroskopie Methoden strukturelle Aussagen über Konformation aktiver Radikalintermedia-

te gewonnen werden können.

Die Reduktion von Ribonukleotid zu Deoxyribonukleotid durch die Ribonukleotid Redukta-

se wird von einem aktiven Tyrosinradikal in unmittelbarer Nähe eines zweikernigen Eisen-

zentrums (FeIII-FeIII) initiiert. Im ersten Teil dieser Arbeit wird das Tyrosinradikal mit einer

Ausbeute von 10% in Einkristallen von der Untereinheit R2 in Escherichia coli und in Salmo-

nella typhimurium erzeugt und untersucht. Die Orientierung des aktiven Tyrosinradikals gegen-

über der inaktiven reduzierten Form der Röntgenstrukturanalyse wird erstmalig mit Hochfeld

Einkristall-ESR bestimmt.

Des weiteren werden gekoppelte Eisenzentren und gekoppelte Eisen-Radikalzentren der Ra-

dikalgenerierungsreaktion in der Ribonukleotid Reduktase mit Hilfe von ESR und 14N, 1H

und 57Fe ENDOR untersucht. In einigen Mutanten von R2 E. coli werden nach der Reaktion

des zweikernigen Eisenzentrums mit molekularem Sauerstoff stabile paramagnetische Zentren

beobachtet, ohne dass es zur Ausbildung des aktiven Tyrosinradikals kommt. Das parama-

gnetische Zentrum “Z” in der Mutante R2-F208Y E. coli wird im Rahmen dieser Arbeit als

gekoppeltes FeIII-FeIII-Radikal Zentrum identifiziert und charakterisiert. In einer neu entdeck-

ten Variante der Klasse I RNR von Chlamydia trachomatis wird ein aktives FeIII-FeIV -Zentrum

charakterisiert, das vermutlich die funktionelle Rolle des Tyrosinradikals übernimmt, welches

in diesem Enzym fehlt.

Die Thiamindiphosphat abhängige Pyruvat : Ferredoxin Oxidoreduktase katalysiert die oxida-

tive Dekarboxilierung des Pyruvates zu Azetyl-Coenzym A und CO2. Die beiden Schlüssel-

schritte dieser Reaktion sind die Bildung und der Zerfall des Azetyl-Thiamindiphosphat (a-

ThDP) Radikalintermediates. Die in der Literatur kontrovers diskutierte und ungeklärte elek-

tronische Struktur (σ- oder π-Radikal) des a-ThDP Radikalintermediates wird im dritten Teil

dieser Arbeit mit ESR, ENDOR, Hochfeld Einkristall ESR und Dichtefunktional Theorie Me-

thoden eindeutig bestimmt.

ii

Teile der Arbeit wurden / werden veröffentlicht:

• Publikationen:

1. M. Högbom, M. Galander, M. Andersson, M. Kolberg, W. Hofbauer, G.Lassmann, P. Nordlund, F. LendzianDisplacement of the tyrosyl radical cofactor in ribonucleotide reductaseobtained by single-crystal high-field EPR and 1.4-Å x-ray dataProceedings of the National Academy of Science of the United States of

America 100: 3209-3214, 2003

2. F. Lendzian, M. Galander, M. Högbom, P. Nordlund, C. Jung, V. Schüne-mann, A.L. BarraTyrosyl radicals in iron enzymes: Structural information from high-fieldEPR on frozen solutions and single crystalsJournal of Inorganic Biochemistry 96: 64-64, 2003

3. M. Högbom, M. Andersson, M. Kolberg, P. Nordlund, M. Galander, F.LendzianConformation of the tyrosyl radical in Escherichia coli ribonucleotide re-ductase R2Journal of Inorganic Biochemistry 96: 149-149, 2003

4. F. Lendzian, M. Galander, M. Högbom, M. Kolberg, B.M. Sjöberg, A.Gräslund, P. NordlundHochfeld-EPR und ENDOR Untersuchungen zur Struktur von Aminosäu-reradikalen in Enzymen mit Eisenzentrenin: Metalloproteine und Metalloidproteine, Wissenschaftschaftliche Ver-lagsgesellschaft mbH Stuttgart, 2004, ISBN: 380472132X

5. N. Voevodskaya, M. Galander, M. Högbom, P. Nordlund, G. McClarty, A.Gräslund, F. LendzianEPR and 57Fe-ENDOR characterization of the high-valent diiron speciesX in ribonucleotide reductase protein R2 of Chlamydia trachomatis

Journal of American Chemical Society: Manuskript in Vorbereitung

6. M. Galander, C. Schulz, B.M. Sjoeberg, A. Gräslund, F.LendzianSpectroscopically characterization of the paramagnetic species in mutantprotein R2-F208Y of Escheria coli Ribonucleotide Reductase by High-Field EPR and 57Fe ENDOR

iii

Biochemical and Biophysical Research Communications: Manuskript inVorbereitung

7. M. Galander, M. Uppsten, U. Uhlin, F. LendzianInvestigations of the orientation of the tyrosyl radical in R2F and R1E/R2Fsingle crystals of Salmonella typhimurium

Journal of American Chemical Society: Manuskript in Vorbereitung

8. M. Galander, C. Cavazza, J. Fontecilla-Camps, F. LendzianThe radical character of the a-ThDP Radikalintermediate in Pyruvate : Fer-redoxin OxidoreductaseJournal of American Chemical Society: Manuskript in Vorbereitung

• Vorträge auf Konferenzen

1. M. GalanderStructural charaterization of radicals and diiron states in ribonucleotidereductase- EPR and ENDOR studiesSPP1071 Workshop: Radicals in enzymatic catalysis, Rauischholzhausen(Marburg), 11-13.04.2005

• Konferenzbeiträge

1. M. Galander, W. Hofbauer, G. Lassmann, M. Högbom, P. Nordlund, F.LendzianEvaluation of High-Field EPR data from Y122* in R2 single crystals ofE.coli: Orientation of the radical in the crystalEnzymes in Deoxyribonucleotide Synthesis 2002, Sånga-Säby, Schweden,8-11.6.2002

2. M.Galander, M. Högbom, M. Andersson, M. Kolberg, W. Hofbauer, G.Lassmann, P. Nordlund, F. LendzianThe Stable Tyrosyl Radical in Ribonucleotide Reductase: Radical Displa-cement Obtained from Single Crystal High-Field EPR and 1.42A X-RayDataEuropean Summer School: Modern EPR spectroscopy, Retie, Belgien, 1-7.12.2002 (European Travel Grant)

3. M. Galander, M. Högbom, M. Andersson, M. Kolberg, P. Nordlund, F.LendzianDisplacement of the tyrosyl radical cofactor in ribonucleotide reductaseobtained by single-crystal EPR and 1.4-Å x-ray data

iv

a) 5th Meeting of the European Federation of EPR Groups, Lissabon, Por-tugal, 7-11.09.2003b) Berichtskolloqium SPP 1051: High-Field EPR in Biology, Chemistry

and Physics, Hirschegg, Östereich, 22-24.9.2003

4. M. Galander, C. Schulz, M. Kolberg, B.M. Sjöberg, A. Gräslund, F. Lend-zianMultifrequency EPR and 57Fe- 14N- 1H-ENDOR on the coupled radicaliron center “Z” in R2-F208Y; Comparison with R2-Y122HEnzymes in Deoxyribonucleotide Synthesis 2004, Hemavan, Schweden, 28-31.03.2004

5. M. Galander, C. Schulz, B.M. Sjöberg, A. Gräslund, F. LendzianHigh-Field EPR and ENDOR spectroscopy on diiron centers in R2 mutantsof E.coli ribonucleotide reductase26th Annual Discussion Meeting of the Magnetic Resonance Group of the

German Chemical Society, Aachen, 27-30.09.2004

6. M. Galander, C. Schulz, N. Voevodskaya, A. Gräslund, B.M. Sjöberg, G.McClarty, F. LendzianSpectroscopic characterization of different diiron centers in ribonucleotidereductase1st German/British Bioenergetics Conference in Cooperation with the GBM

study group Bioenergetics “Mechanism of Bioenergetic Membran Prote-

ins: Structures and Beyond”, Naurod (Wiesbaden), 20-24.03.2005

• weitere Publikationen

1. T. Burgdorf, S. Löscher, P. Liebisch, E. Van der Linden, M. Galander, F.Lendzian, W. Meyer-Klaucke, S.P.J. Albracht, B. Friedrich, H. Dau, M.HaumannStructural and oxidation-state changes at its nonstandard Ni-Fe site duringactivation of the NAD-reducing hydrogenase from Ralstonia eutropha de-tected by X-ray absorption, EPR, and FTIR spectroscopyJournal of American Chemical Society 127: 576-592, 2005

2. C. Jung, F. Lendzian, V. Schünemann, A.X. Trautwein, J. Contzen, M.Richter, M. Galander, D.K. Gosh, S.A. KozinUncoupling of the P450 Reaction Cycle Related to Protein Structural Pro-perties

v

in: 15th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations

Medimond International Proceedings, 2004, ISBN: 88-7587-119-1

3. Jung, F. Lendzian, V. Schünemann, M. Richter, L. H. Böttger, A.X. Traut-wein, J. Contzen, M. Galander, D.K. Ghosh, A.-L. BarraMulti-frequency EPR and Mössbauer Spectroscopic Studies on Freeze-Quenched Reaction Intermediates of Nitric Oxide SynthaseMagnetic Resonance in Chemistry, 2005, submitted

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 11.1 Ribonukleotid Reduktase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.1.1 Ziele dieser Arbeit an der RNR . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.2 Pyruvat : Ferredoxin Oxidoreduktase . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.2.1 Ziele dieser Arbeit an der PFOR . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2 Theorie und Methoden 132.1 Grundlagen der magnetischen Resonanz . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.1.1 Das magnetische Moment des freien Elektrons . . . . . . . . 13

2.1.2 Die Schrödinger-Gleichung im Fall magnetischer Resonanzam freien Elektron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.1.3 Wechselwirkungen des freien Elektrons mit seiner Umgebung 16

2.2 Prinzipien von ESR und ENDOR Spektroskopie . . . . . . . . . . . 20

2.2.1 ESR Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

2.2.2 ENDOR Spektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.3 Probenpräparation und verwendete Messgeräte . . . . . . . . . . . . 25

2.3.1 Probenpräparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.3.2 Verwendete Spektrometer . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.3.3 Montage der Einkristalle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.4 Simulation der ESR Spektren von Radikalen in gefrorener Lösung . . 26

2.5 Simulation der Einkristall ESR Spektren . . . . . . . . . . . . . . . 29

2.6 Fitalgorithmen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.6.1 Mehrdimensionaler Simplex Downhill . . . . . . . . . . . . . 31

2.6.2 Simulated Anealing . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

2.7 Dichtefunktionalmethoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

3 Strukturelle Untersuchungen an der Ribonukleotid Reduktase 393.1 Die Position des Y122• in R2 E.coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

vii

viii INHALTSVERZEICHNIS

3.1.1 Spektroskopie der gefrorenen Lösung . . . . . . . . . . . . . 403.1.2 Spektroskopie am Einkristall . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423.1.3 Diskussion und Zusammenfassung der Ergebnisse . . . . . . 46

3.2 Die Postition des Y105• in R2F und R1E/R2F S. typhimurium . . . . 503.2.1 Spektroskopie der gefrorenen Lösung . . . . . . . . . . . . . 513.2.2 Spektroskopie am R2F Kristall . . . . . . . . . . . . . . . . . 543.2.3 Spektroskopie am R1E/R2F Kristall . . . . . . . . . . . . . . 583.2.4 Diskussion und Zusammenfassung der Ergebnissse . . . . . . 58

3.3 Spektroskopische Charakterisierung verschiedener Oxidationszustän-de des zweikernigen Eisenzentrums . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623.3.1 Das Zentrum “X” in Chlamydia trachomatis . . . . . . . . . 623.3.2 Das Zentrum “Z” in R2-F208Y E. coli . . . . . . . . . . . . 693.3.3 Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83

4 Spektroskopische Charakterisierung des Radikalintermediates in der Py-ruvat : Ferredoxin Oxidoreduktase 854.1 ESR und ENDOR Untersuchungen des a-ThDP Radikals in Lösung . 864.2 Die Orientierung des g-Tensors im a-ThDP Radikal . . . . . . . . . . 944.3 Dichtefunktional Theorie Rechnungen . . . . . . . . . . . . . . . . . 984.4 Diskusssion und Zusammenfassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . 103

5 Anhang 1055.1 Rotationsmatrizen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1055.2 Simulationsprogramm der gefrorenen Lösung . . . . . . . . . . . . . 1065.3 Programm zur Simulation des E. coli Einkristalls . . . . . . . . . . . 1085.4 Fitprogramm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Abkürzungen

A Skalar

~A Vektor

A Tensor

Ai j Elemente des Tensors

A Operator

ESR Elektronen Spin Resonanz

ENDOR Electron Nuclear Double Resonance

PENDOR Pulsed Electron Nuclear Double Resonance

h f -Tensor Hyperfeintensor

E. coli Escherichia coli

S. typhimurium Salmonella typhimurium

C. trachomatis Chlamydia trachomatis

D. africanus Desulfovibrio africanus

RNR Ribonukleotid Reduktase

PFOR Pyruvat Ferredoxin : Oxidoreduktase

a-ThDP Azetyl-Thiamindiphosphat

CoA Coenzym A

Kapitel 1

Einleitung

1.1 Ribonukleotid Reduktase

Die Ribonukleotid Reduktase (RNR) ist ein Radikal-Enzym, das die Ribonuktide zuDeoxyribonukleotiden reduziert und so die Grundbausteine für die DNA liefert. DieseReduktion ist der geschwindigkeitsbestimmende Schritt in der DNA Synthese [1–5].Daher ist die Ribonukleotid Reduktase ein interessantes potenzielles Angriffsziel fürArzneimittel der Krebs- und HIV-Forschung [4–8].

O

H H

O

HO OH

Phosphate

Base O

H H

O

HO

Phosphate

Base

H

RNR

Abbildung 1.1: Die Funktion der Ribonukleotid Reduktase

Es sind drei verschiedene Klassen von Ribonukleotid Reduktasen bekannt. Die Eintei-lung erfolgt anhand der unterschiedlichen, die Reaktion treibenden Radikale [4,8–13].Die Klasse I RNR besitzt ein stabiles Tyrosin-Radikal in der Untereinheit R2. DiesesTyrosinradikal wird durch die Reaktion des zweikernigen Eisenzentrums mit moleku-larem Sauerstoff in der gleichen Untereinheit erzeugt [1–5]. Bei den Klasse II RNREnzymen wird das Radikal aus einer Reaktion mit dem Kofaktor Cobalamin erzeugt.Als aktives Radikal fungiert in den Klasse II Enzymen ein Thiylradikal, das an dasCobalt-Ion des Cobalamin gekoppelt ist [4, 12–14]. Die Klasse III RNR Enzyme sinddie einzigen strikt anaeroben RNR. Hier wird das stabile Glycylradikal durch eine Re-aktion von Eisen-Schwefel Proteinen und S-Adenosyl-Methionin gebildet [9–11, 15].

1

2 Einleitung

In dieser Arbeit werden Klasse I RNR Enzyme untersucht und im Folgenden näherbetrachtet.

Abbildung 1.2: Der Modellkomplex des Holoenzyms aus den Röntgenstrukturdaten für

die einzeln kristallisierten Untereinheiten R1 (gold) und R2 (blau) [16]

Die Klasse I Enzyme sind in nahezu allen eukaryotischen Organismen von Hefen undAlgen bis hin zu Pflanzen und Säugetieren gefunden worden. Sie bestehen aus zweihomodimeren Untereinheiten R1 und R2. Beide Untereinheiten wurden aus verschie-denen Organismen einzeln kristallisiert und die Röntgenstruktur gelöst [15, 17–20].Das am intensivsten studierte System ist die Klasse I RNR aus E. coli, wo nicht nurdie Struktur der einzelnen Untereinheiten sondern auch die Struktur zahlreicher Mu-

Ribonukleotid Reduktase 3

tanten bekannt ist [21–32].Abbildung 1.2 zeigt den Modellkomplex für die beiden Untereinheiten [1, 16]. In derUntereinheit R2 befindet sich das zweikernige Eisenzentrum und das stabile, aktiveTyrosin Radikal an der Postition 122 (E. coli Nummerierung), welches den Reaktions-zyklus startet. In der oxidierten Form sind die beiden FeIII-Ionen im S = 5

2 Zustandund koppeln antiferromagnetisch zu einem S = 0 Grundzustand. An der UntereinheitR1 können alle vier verschiedenen Nukleotide gebunden und reduziert werden.

Abbildung 1.3: Das zweikernige Eisenzentrum mit dem Tyrosinradikal Y122 in R2

E. coli und die Substratbindungsstelle in R1 E. coli mit dem vorgeschlagenen Radikal-

Transferpfad [16]

4 Einleitung

Strukturelle Daten für den Komplex des Holoenzyms R1-R2 gibt es bisher noch nicht,daher basieren die Vorschläge für den katalytischen Mechanismus auf den Kristall-strukturen der einzelnen Untereinheiten bzw. dem Modellkomplex (Abbildung 1.2).Für den katalytischen Mechanismus wird ein gekoppelter Elektron/Proton (H•) Trans-fer vom Tyrosinradikal in der Untereinheit R2 zu einem Cysteinradikal in der Unter-einheit R1 über ein konserviertes, durch Wasserstoffbrücken verbundenes Aminosäu-rennetzwerk angenommen. Der Radikaltransferpfad geht vom Tyrosinradikal Y122•

und den Eisenliganden D84 und H118 über D237 und W48 an der Proteinoberflächein R2 weiter zu Y730 und Y731 bis hin zum C439 in der Untereinheit R1 (E. coli

Nummerierung, siehe Abbildung 1.3 und [3–8,33–36]). Theoretische Modellrechnun-gen zeigen eine nachfolgende Wasserstoffabstraktion vom Substrat durch das transien-te Cysteinradikal C439• [3, 4, 8, 34]. Am Ende des Reduktionszyklus bildet sich eineDisulfid Brücke zwischen C225 und C462 in der Untereinheit R1 (Abbildung 1.3),die vor dem nächsten Substratumsatz wieder reduziert werden muss. Diese Reduktionerfolgt durch Wasserstoffdonatoren (Thioredoxin oder Glutaredoxin) über eine zwei-te Disulfid Brücke an der Oberfläche von R1 [4–8, 8, 36]. Nach der abgeschlossenenReduktion des Ribonukleotides zum Deoxyribonukleotid erfolgt ein Rücktransfer desRadikalcharakters und die Wiederherstellung des Tyrosinradikals Y122• in der Unter-einheit R2.Bisher ist es noch nicht gelungen, eines der transienten Aminosäureradikale der KlasseI RNR während des Radikaltransferzyklus zu beobachten. Ebenso konnte das vorge-schlagene Thiylradikal C439• noch nicht direkt beobachtet werden. Es existieren je-doch indirekte Anhaltspunkte für die Existenz des Thiylradikals. In den Klasse II RNREnzymen kann ein Thiylradikal gekoppelt an ein Cobalamin in direkter Substratnähebeobachtet werden [12,13]. In den Klasse I RNR Enzymen lässt sich bei der Reaktiondes Enzyms mit Substratanalogen ein Verschwinden des Radikalcharakters des Tyros-ins in der Untereinheit R2 und die gleichzeitige Entstehung von Radikalen auf demSubstratanalog beobachten [1, 8]. Für den Radikaltransfer von R2 nach R1 wurdenverschiedene Modelle vorgeschlagen [1–5, 8, 34]. Auf der Basis von experimentellenDaten des Wildtyps und zahlreicher Mutanten wurde die Idee eines simultanen Schal-tens meherer Wasserstoffbrücken diskutiert [37, 38]. Dichtefunktional Theorie Rech-nungen wurden bereits durchgeführt, um die Einzelschritte entlang des Transferpfadszu charakterisieren [34].Die Generierung des Tyrosinradikals in der Untereinheit R2 erfolgt über die Reaktiondes reduzierten zweikernigen Eisenzentrums (FeII-FeII) mit molekularem Sauerstoff.Der Einbau des Eisenzentrums in die Untereinheit R2 in vivo ist noch nicht genauverstanden. Die Rekonstitution in vitro bei isolierten apo-R2 aus E. coli hingegen wur-

Ribonukleotid Reduktase 5

de im Detail studiert. Es wurde gezeigt, dass die Rekonstitutionsreaktion, die Reak-tion des apo-R2 Protein mit einem sechsfachen Überschuss von Eisen(II)-Ascorbat,im Protein zum zweikernigen Eisenzentrum im FeII-FeII Zustand führt [39]. DieserZustand ist unter anaeroben Bedingungen stabil. Die Struktur wurde 1996 mit 1.7 Åaufgeklärt [28]. Wenn molekularer Sauerstoff in das R2 Enzym diffundiert, oxidiertdas Enzym spontan über eine Reihe von Zwischenzuständen zum FeIII-FeIII Zustandmit einem stabilen Tyrosinradikal. Einer dieser Zwischenzustände ist das sogenannteIntermediat “X” (siehe Abbildung 1.4). Im Intermediat “X” ist das zweikernige Eisen-zentrum im FeIII-FeIV Zustand [40,41], welcher letztendlich das Tyrosin zum Radikaloxidiert [40–44]. Der molekulare Sauerstoff spaltet während der Reaktion auf und einSauerstoff bildet eine µ-oxo Brücke zwischen beiden Eisenionen [1].Radikale sind somit an drei Reaktionen der Klasse I RNR Enzyme beteiligt, erstensbei der Generierung des Tyrosinradikals durch die Reaktion des zweikernigen Eisen-zentrums mit molekularem Sauerstoff [1,43,45–50], zweitens bei der Radikaltransfer-reaktion vom Tyrosinradikal der Untereinheit R2 zum Cysteinradikal in der Unterein-heit R1 [1–5, 48, 49, 51] und drittens beim katalytischen Zyklus des Substratumsatzesselbst, wobei intermediäre Radikale am Substrat oder an Substratanalogen und zudemAminosäureradikale beobachtet wurden [3, 8, 52, 53].

1.1.1 Ziele dieser Arbeit an der RNR

Mit dieser Arbeit wurden an der Ribonukleotid Reduktase im Wesentlichen zwei Zie-le verfolgt. Im ersten Teil der Arbeit wurde versucht, die genaue Position des aktivenTyrosinradikals in der Untereinheit R2 der Ribonukleotid Reduktase zu bestimmen.Bisher ist es noch nicht gelungen, die Untereinheit R2 mit dem aktiven Tyrosinradi-kal zu kristallisieren. Alle bisher verfügbaren Röntgenstrukturen zeigen das Tyrosin inder inaktiven met-Form, d.h. das Tyrosin ist am Sauerstoff protoniert [17–19, 25, 26].Die aktive, radikalische Form zeigt Abbildung 3.2. Somit ist die Information über dieOrientierung des aktiven Tyrosinradikals der Röntgenanalyse nicht zugänglich. Da diebisherigen Vorschläge für den Radikaltransfer Mechanismus im Wesentlichen auf denstrukturellen Daten der Röntgenstrukturanalyse beruhen, ist die Kenntnis über die ge-naue Position des aktiven Radikals von großer Bedeutung, um die Radikaltransfer Re-aktion besser zu verstehen. Bisher sind jedoch keinerlei experimentelle Daten über dieReorientierung des Tyrosins nach der Radikalbildung bekannt. In dieser Arbeit werdenerstmals quantitative Daten zur Orientierung des Tyrosinradikals dargestellt.Ein weiterer interessanter Punkt ist die Frage, ob sich die Orientierung des Radikalsin Anwesenheit der zweiten Untereinheit R1 ändert. In den Kapiteln 3.1 und 3.2 wird

6 Einleitung

Abbildung 1.4: Die Generierung des aktiven FeIII-FeIII-Y122• Zustands von R2 aus

der FeII-FeII-Form

beschrieben, wie es in Zusammenarbeit mit M. Högbom et al. und M. Uppsten et al.

nach erfolgreicher Kristallation von R2 E. coli , R2F S. typhimurium und des Holoen-zyms R1E/R2F S. typhimurium das Radikal Y122• bzw. Y105• im Einkristall generiertwurde. Die Position des Radikals konnte dann mit Hilfe von Hochfeld ESR an Einkri-stallen bestimmt werden.Im zweiten Teil der Arbeit an der Ribonukleotid Reduktase wurde die Radikal er-

Pyruvat : Ferredoxin Oxidoreduktase 7

zeugende Reaktion genauer betrachtet. Dazu wurden Systeme untersucht, die an derentsprechenden Stelle des Proteins kein Tyrosin aufwiesen, wie die R2 Untereinheitder neuentdeckten RNR aus C. trachomatis. Die Röntgenstrutur von R2 C. tracho-

matis zeigt an der üblichen Position des Tyrosins Y122 (E. coli Nummerierung) einPhenylalanin [54]. So wurde in dieser Spezies bisher nur ein kurzlebiges paramagneti-sches Zentrum beobachtet, das eine ähnliche Lebensdauer und ein vergleichbares ESRSignal wie das Intermediat “X” aus der Radikalgenerierungsreaktion hat. Es wurde po-stuliert, dass dieses paramagnetische Zentrum in C. trachomatis die funktionelle Rolledes Tyrosinradikals der anderen Klasse I RNR Enzyme spielt [54]. In dieser Arbeitwird das paramagnetische Zentrum in C. trachomatis genau charakterisiert und mitdem Intermediat “X” aus der Rekonstitutionsreaktion von E. coli verglichen.In verschiedenen Mutanten von R2 E. coli wurde nach der Rekonstitutionsreaktioneine Hydroxylierung des Phenylalanins an der Position 208 gefunden [27, 55–57]. Ei-nige dieser Mutanten zeigen das ESR Spektrum eines paramagnetischen Zentrums. ImKapitel 3.3 wird das paramagnetische Zentrum der Mutante R2-F208Y E. coli eindeu-tig mittels Hochfeld ESR und ENDOR charakterisiert. Es wird gezeigt, dass durch dieAnwendung der beiden Methoden eindeutig der Oxidationszustand des zweikernigenEisenzentrums bestimmt werden kann. Im Vergleich mit der Mutante R2-Y122H E. co-

li [55, 56] und dem Intermediat “X” [40] wird eindeutig zwischen einem gekoppeltenFeIII-FeIV und einem gekoppelten FeIII-FeIII-Radikalzentrum unterschieden. Ziel istes, ein besseres Verständnis der Radikalgenerierungsreaktion zu erlangen.

1.2 Pyruvat : Ferredoxin Oxidoreduktase

Die Pyruvate : Ferredoxin Oxidoreduktase (PFOR) katalysiert die oxidative Dekar-boxylierung von Pyruvat zu Azetyl-Coenzym A (Azetyl-CoA) und CO2 nach folgen-der Reaktionsgleichung [58]:

Pyruvate+CoA+Ferredoxinox → Azetyl −CoA+CO2 +Ferredoxinred (1.1)

Die wesentlichen Schritte des Mechanismus sind die Generierung und der Zerfalldes als Hydroxyethyl-Thiaminpyrophosphat (HE-TPP) [58] oder Azetyl-Thiamindi-phosphat (a-ThDP) [59] bezeichneten Radikalintermediats (im Folgenden a-ThDP ge-nannt). Die Reaktion ist strikt ThDP und CoA abhängig. Bei der Oxidation des Py-ruvates kann nicht nur Ferredoxin sondern auch Flavodoxin [60–65] und in einembeschriebenen Fall auch Protonen [66] als Elektronenakzeptor dienen.PFOR ist ein sehr altes Enzym und existierte wahrscheinlich schon vor der Teilung inArchaeen und Eukaryoten. Es kommt in allen Archaeen, sehr vielen Bakterien und in

8 Einleitung

anaeroben Protozoon vor [67]. PFOR ist an katabolen und anabolischen Stoffwech-selprozessen in einer Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen beteiligt. In strikt anae-roben Prokaryoten wird das entstehende Azetyl-CoA zur Substratkettenphosphorylie-rung benutzt [62, 63, 68]. In vielen stickstofffixierenden Bakterien wird das Elektronvom reduzierten Ferredoxin/Flavodoxin direkt auf die Nitrogenase übertragen und zurStickstofffixierung genutzt [64]. In vielen Sulfat-reduzierenden Bakterien ist PFOR einSchlüsselenzym des Energiestoffwechsels. Diese Bakterien nutzen die Oxidation desPyruvates zur Reduktion von SO4 oder Protonen unter Bildung von H2S oder H2 wäh-rend des Metabolismus von Laktat, Fumarat, Malat oder Alanin zu Acetat [69, 70].Dies ist nur eine Auswahl der verschiedenen metabolischen Funktionen der PFOR.Einen umfassenderen Überblick gibt [58].Die Quartärstruktur der PFOR ist sehr variabel. In den meisten Bakterien bildet dasPFOR-Enzym ein Homodimer, während die PFOR-Enzyme der Archebakterien Hete-rotetramere sind, die als gemeinsamer struktureller Ursprung des Enzym vorgeschla-gen sind [63, 71]. Die 1.9 Å Röntgenstruktur der PFOR des Bakteriums Desulfovibrio

africanus zeigt ein Dimer [59, 72]. ThDP und ein proximales [Fe4S4] Eisen-SchwefelZentrum (A) sind in das Protein eingebettet und zwei weitere [Fe4S4] Zentren (B,C)führen zur Oberfläche, wo die Wechselwirkung mit dem Redoxpartner (Ferredoxin)stattfindet [72]. Der Abstand der einzelnen [Fe4S4] Zentren voneinander ist jeweils ca.13 Å (Abbildung 1.6).Den vorgeschlagenen Mechanismus zur Oxidation des Pyruvates nach [58,73,74] fasstdie Abbildung 1.5 zusammen. Nach der Bindung des Pyruvates an das ThDP (1 inAbbildung 1.5) bildet sich ein Hydroxyethyliden-ThDP Intermediat unter Abspaltungvon CO2 (2 in 1.5). Durch die Übertragung eines Elektrons auf das oxidierte [Fe4S4]Zentrum A bildet sich das a-ThDP Radikalintermediat und das [Fe4S4] Zentrum Awird reduziert (3 in 1.5). Im nächsten Schritt wird das CoA gebunden und das zweite[Fe4S4] Zentrum B reduziert (4 in 1.5), gefolgt von der Bildung des Azetyl-CoA (5in 1.5). Nach der Reduktion der externen Elektronenakzeptoren (z.B. Ferredoxin) istder Ausgangszustand wieder erreicht (6 in 1.5). Bei Abwesenheit von CoA erfolgt derRadikalzerfall und die Reduktion des [Fe4S4] Zentrum B deutlich langsamer (unte-rer Abzweig Abbildung 1.5). Die Lebensdauer des a-ThDP Radikalintermediates er-höht sich bei Abwesenheit von CoA um den Faktor 105 in den Bereich einiger Minu-ten [58, 73, 74]Chabriere et al. [59] gelang es 2001, die Röntgenstruktur des PFOR Enzyms mit dema-ThDP Radikalintermediat zu lösen. Die PFOR Kristalle wurden mit Pyruvat Lösungohne CoA getränkt und das Radikalintermediat mit einer angegebenen Ausbeute von80% erzeugt. Die Struktur des Enzyms mit den [Fe4S4] Zentren, dem a-ThDP Ra-


3

5 4

1 2

6

Abbildung 1.5: Der Reaktiosmechanismus für die Pyruvatoxidation und die Bildung

des Azetyl-CoA [73]. Das a-ThDP Radikalintermediat ist mit einem blauen Kreis mar-

kiert

dikalintermediat und dem abgespaltenen CO2 ist in den Abbildungen 1.6 und 1.7 zusehen. Aus der Überlagerung der Strukturen mit [59] und ohne Radikalintermediat [72]wird bei der Radikalbildung eine schaukelartige Bewegung des Thiazolrings in Rich-tung des im Protein gebundenen Pyruvats vorgeschlagen [59]. Die Röntgenstrukturdes a-ThDP Radikalintermediates zeigt einen völlig unerwarteten Verlust der Planari-tät des Thiazolringes und eine ungewöhnlich lange Bindung zwischen dem Thiazolringund der Azetylgruppe (1.9 Å). Für die elektronische Struktur des Radikalintermediateswurde daher in dieser Arbeit ein σ-Kationradikal vorgeschlagen, dessen Spindichte aufder Azetylgruppe lokalisiert ist. Dafür ist eine Protonierung des Thiazolrings an zweiPositionen nötig.Der elektronische Charakter des a-ThDP Radikals ist in der Literatur bisher umstrit-

10 Einleitung

Abbildung 1.6: Sekundärstruktur von PFOR (Chain A in cyan, B in organge) [59] mit

Radikalintermediate, PDB Eintrag: 1KEK

ten. Als mögliche Strukturen wurden bisher ein σ-artiges Azetyl-Radikal mit einemTeil der Spindichte auf dem Thiazolring [75–78], ein neutrales π-Radikal mit delo-kalisierter Spindichte auf dem Thiazolring [73, 75] und das lokalisierte σ-Radikal derRöntgenstruktur [59] vorgeschlagen. Die bisher durchgeführten Proton und DeuteriumENDOR Studien konnten zwischem dem σ-artigen Azetyl-Radikal mit ungepaarterSpindichte auf dem Thiazolring oder dem delokalisierten π-Radikal nicht unterschei-den [75]. Diese Studien wiesen über den Proton/Deuterium Austausch eindeutig Spin-dichte auf der Azetylgruppe nach. So wurden zwei verschiedene CH3 h f -Tensorenbestimmt. Die beiden leicht verschiedenen h f -Tensoren wurden durch leicht unter-schiedliche Konformationen erklärt [58, 75]. Die Autoren erwähnen allerdings, dassdie bestimmten h f -Tensoren für die Azetylgruppe keine befriedigende Simulation des9.5 GHz ESR Spektrums ermöglichen [65, 73, 75, 78, 79].


Azetyl

ThDP

CO2

4 4Fe S

Abbildung 1.7: Das a-ThDP Radikalintermediat, CO2 und die Eisen-Schwefel Zentren

[59], PDB Eintrag: 1KEK

1.2.1 Ziele dieser Arbeit an der PFOR

Die eindeutige Klärung der elektronischen Struktur des a-ThDP Radikalintermediatesin der Pyruvat : Ferredoxin Oxidoreduktase ist das Ziel dieser Arbeit an der PFOR.Das a-ThDP Radikalintermediat in PFOR D. africanus wurde mit 9.5 GHz und 94GHz ESR, 9.1 GHz 1H, 14N und 94 GHz 1H ENDOR in gefrorenen Lösungen sowieHochfeld ESR an PFOR Einkristallen untersucht. Aus der ESR und ENDOR Spektro-skopie konnten sowohl die g-Tensor Hauptwerte als auch die Lage der g-Tensorachsenund sämtliche h f -Tensoren bestimmt werden. Dichtefunktional Rechnungen wurdenfür alle drei vorgeschlagenen verschiedenen Strukturen durchgeführt. Durch die Kom-

12 Einleitung

bination der spektroskopischen Ergebnisse und der Ergebnisse der DichtefunktionalTheorie Rechnungen konnte das a-ThDP Radikalintermediate eindeutig als π-Radikalmit delokalisierter Spindichte im Thiazolring identifiziert werden.

Kapitel 2

Theorie und Methoden

2.1 Grundlagen der magnetischen Resonanz

In diesem Kapitel sollen kurz die Grundlagen der Elektronen-Spin-Resonanz (ESR)Spektroskopie und der Elektron-Kern-Doppel-Resonanz (ENDOR) Spektroskopie er-läutert werden. Eine weiterführende Einführung geben [80–84].

2.1.1 Das magnetische Moment des freien Elektrons

Aus der Wechselwirkung des magnetischen Momentes ~M eines beliebigen Teilchensmit einem Magnetfeld ~H ergibt sich die potentielle Energie [85]:

U = −~M~H (2.1)

Klassisch verknüpft sich damit ein Drehmoment ~D=~M× ~H, d.h. das magnetische Mo-ment ~M präzediert in einem homogenen Magnetfeld mit der Lamorfrequenz ω umdie Richtung des Magnetfeldes. Dabei ist das klassische magnetische Moment einerkreisförmig bewegten Ladung q:

~M = − q2m

~L (2.2)

mit~L als Drehimpuls und m als Masse.Sind an solchen Prozessen Elementarteilchen wie Elektronen oder Nukleonen betei-ligt, muss man ihnen einen “inneren” Drehimpuls, auch Spin S, mit dem zugehörigenmagnetischen Moment~µ zuordnen. Der Stern-Gerlach-Versuch zeigt, dass solche ma-gnetischen Momente nur diskrete Werte annehmen. Zu einem solchen Spinzustand ge-hören die beiden Quantenzahlen s und ms, wobei ms=-s, -s+1, ..., s. Der Spinoperator

13

14 Theorie und Methoden

S gehorcht dabei den Drehimpulsrelationen

Sz|s,ms〉 = ms|s,ms〉;S2|s,ms〉 = s(s+1)|s,ms〉 (2.3)

wobei die z-Achse eine beliebige, beispielsweise durch ein äußeres Magnetfeld vorge-gebene Richtung ist.Für ein freies Elektron werden im Magnetfeld nur zwei mögliche Einstellungen desmagnetischen Momentes beobachtet. Das heißt für den Spin muss gelten: s = 1

2 ;ms =

±12 (analog für Protonen und Neutronen). Die zugehörigen Eigenfunktionen sind |α〉=

|12 , 1

2〉 und |β〉 = |12 ,−1

2〉.Das gyromagnetische Verhältnis zwischen Spin und magnetischem Moment wird mitHilfe des Bohrschen Magnetons µB = eh/2me zu

~µ = −gµBS (2.4)

mit dem dimensionslosen Proportionalitätsfaktor (Landè-Faktor) ausgedrückt. Beimfreien Elektron beträgt g=2.0023193.Die Energie des freien Elektrons im Magnetfeld wird nun durch einen Hamiltonopera-tor ausgedrückt, der nur auf den Spinanteil der Wellenfunktion wirkt:

H = gµBHS (2.5)

Damit ergeben sich die beiden Energieeigenwerte E = ± 12gµBH. Ein Umklappen der

Spins entspricht also einem quantenmechanischen Übergang, bei dem ein Energie-quant absorbiert bzw. emittiert wird. Diese Energie entspricht elektromagnetischerStrahlung von

∆E = hν = gµBH (2.6)

2.1.2 Die Schrödinger-Gleichung im Fall magnetischer Resonanzam freien Elektron

Im Fall der magnetischen Resonanz betrachten wir die Wechselwirkung des Elektro-nenspins mit einem Magnetfeld, dem zusätzlich zum statischen Anteil in z-Richtung(H0) ein in der x,y-Ebene rotierender Anteil (H1) überlagert ist.

~H = H0~ez +H1(~excos(ω1t)+~eysin(ω1t)) (2.7)

Grundlagen der magnetischen Resonanz 15

Dieser zusätzliche rotierende Anteil beschreibt das Wechselfeld der eingestrahlten Mi-krowelle. Damit ergibt sich folgender Hamiltonoperator:

H = H0 +H1

= gβH0Sz +gβH1(Sxcos(ω1t)+ Sysin(ω1t)) (2.8)

Die Spinwellenfunktion des Elektrons muss nun die zeitabhängige Schrödinger- Glei-chung H Ψ = ih dΨ

dt erfüllen. Man löst sie störungstheoretisch unter der Annahme,dass die Eigenwerte von H nur geringfügig vom stationären Anteil H0 abweichen[80, 86, 87]. Die Eigenfunktionen Ψ j = | j〉exp(ihE jt) (mit j = α,β,〈|〉 Notation) desstationären Hamiltonoperators liefern dann, als Linearkombination mit zeitabhängigenKoeffizienten, die Eigenfunktion des gesamten Hamiltonoperators.

Ψ(t) = cαΨα + cβΨβ (2.9)

Dabei gibt |c∗j c j| die Wahrscheinlichkeit an, das System im Zustand α bzw. β anzu-treffen [86, 87].In die Schrödinger Gleichung eingesetzt ergibt sich also:

H1(cαΨα + cβΨβ) = ihΨαdcαdt

+ ihΨβdcβ

dt(2.10)

da Ψα,β Eigenfunktionen des stationären Teils sind. Bei Multiplikation der Gleichungmit Ψα von links erhält man:

cα〈ΨαH1Ψα〉+ cβ〈ΨαH1Ψβ〉 = ihdcαdt

〈ΨαΨα〉+ ihdcβ

dt〈ΨαΨβ〉 (2.11)

woraus folgt:

ihdcαdt

= cα〈αH1α〉+ cβ〈αH1β〉exp(iω0t)

= cβgβH1(〈αSxβ〉cos(ω1t)+ 〈αSyβ〉sin(ω1t))exp(iω0t)

= cβgβH1(12〈αα〉cos(ω1t)− i

2〈αα〉sin(ω1t))exp(iω0t)

= cβ12

gβH1 exp(i(ω0 −ω1)t) (2.12)

mit ω0 = (Eα −Eβ)/h = gµBH/h als Lamorfrequenz des freien Elektrons. Eine ent-sprechende Gleichung lässt sich analog für cβ aufstellen. Bei Annahme Ψ(0) = Ψβ,also cβ = 1 erhält man durch Integration über kurze Zeitintervalle [87]:

cα =1

2ihgµBH1

exp(i(ω0 −ω1)t)−1i(ω0 −ω1)

(2.13)


Damit folgt als Übergangswahrscheinlichkeit von |β > nach |α >

Pβα = c∗αcα = (gµBH1

h)2 sin(1

2(ω0 −ω1)t)

(ω0 −ω1)(2.14)

Analog Pαβ, so daß Pαβ = 1−Pβα.Diese Funktion besitzt ein scharfes Maximum bei ω1 = ω0 und lässt sich in diesemFall exakt lösen [87].

cα = isin(gµBH1

2h)

cβ = cos(gµBH1

2h) (2.15)

Das heißt, das System oszilliert mit gµBH1/2h zwischen den beiden Energieniveaus.

2.1.3 Wechselwirkungen des freien Elektrons mit seiner Umgebung

Im allgemeinen beobachtet man jedoch nicht Resonanz an freien Elektronen, sondernan Elektronen in einer komplexeren Umgebung (Atome, Moleküle, Festkörper usw.).Dies führt dazu, dass der Hamiltonoperator eine wesentlich komplexere Gestalt an-nimmt. Die wesentlichen Beiträge werden im folgenden Abschnitt näher beleuchtet.Zunächst einmal betrachten wir die Spin-Bahn-Wechselwirkung die bewirkt, dassSpin und magnetisches Moment nicht mehr unbedingt parallel stehen. Die elektroni-sche Zeeman-Wechselwirkung ist also nicht mehr unabhängig von der Orientierungder Spins im Magnetfeld. Diese Richtungsabhängigkeit lässt sich durch einen Tensorzweiter Ordnung, den g-Tensor, beschreiben:

H = µB Hg S (2.16)

Bei Systemen mit sehr schnellen Richtungsänderungen (Teilchen in Lösungen) tritt anStelle des richtungsabhängigen Tensors sein zeitlicher Mittelwert, d.h. der Tensor re-duziert sich auf seinen richtungsinvarianten Anteil. Dieser isotrope g-Faktor entsprichtder Spur des Tensors.

g =13(gxx +gyy +gzz) (2.17)

Als nächstes muss die Wechselwirkung des Elektronenspins S mit dem Kernspin Iberücksichtigt werden. Sie führt zu einer Aufspaltung der Energie im Feld, der Hy-perfeinaufspaltung, die sich aus einem anisotropen und einem isotropen Anteil zu-sammensetzt. Der anisotrope Anteil kann durch die Energie eines klassischen Dipols


(magnetisches Moment des Elektrons~µs) im Feld eines zweiten Dipols (magnetischesMoment des Kern ~µi) im Abstand r(r 6= 0) integriert über alle Aufenthaltsorte desElektrons beschrieben werden.

Ean(~r) =−3(~µs~r)(~µi~r)

r5 +~µs~µi

r3 (2.18)

Die Größe dieses Beitrags ist abhängig von der Orientierung des Elektronenorbitals re-lativ zum Feld, wobei der Mittelwert über alle möglichen Orientierungen und entspre-chend für eine kugelsymmetrische Aufenthaltswahrscheinlichkeit (s-Orbital) Null be-trägt. Bei einer Aufenthaltswahrscheinlichkeit des Elektrons am Kernort (r = 0) mussdie Fermi-Kontakt-Wechselwirkung berücksichtigt werden.

Eiso =8π3|Ψ(~r = 0)|2~µs~µi (2.19)

Dieser Beitrag ist unabhängig von der Orientierung zum Magnetfeld. Ersetzt man bei-de magnetischen Momente durch ihre entsprechenden Spinoperatoren, ergeben sichdie beiden folgenden Hamiltonoperatoren:

Han = ggNµBµN

∫

|Ψ(~r)|(

3(Sr)(Ir)r5 +

SIr3

)

d~r = SA0I (2.20)

Hiso = aSI (2.21)

Auch hier lässt sich der richtungsabhängige Anteil der Hyperfeinwechselwirkung ineinem Tensor A0 zusammenfassen. Dieser lässt sich mit dem isotropen Kontakttermzum Hyperfeintensor A = A0 +a1 kombinieren. Damit vereinfacht sich der Hamilton-operator zu

H = SAI (2.22)

Die Spur dieses Tensors ist richtungsunabhängig. Sie liefert den isotropen Anteil, dieHyperfein- oder Kopplungskonstante.

a =13(Axx +Ayy +Azz) (2.23)

Bei aromatischen Radikalen ist die ungepaarte Spindichte über das ganze π-Systemdes aromatischen Rings delokalisiert [80,81,88]. Für die isotropen Anteile der Hyper-feinkopplung der α- und β-Protonen am Ring bestehen empirische Beziehungen. Fürein α-Proton am Kohlenstoffatom µ gilt die McConnell Gleichung [89]:

aHµiso = Qρµ (2.24)


wobei ρµ die Spindichte im 2p-Orbital am Atom µ ist und die Konstante Q die er-wartete Hyperfeinaufspaltung für eine Einheitsspindichte im 2p Orbital ist [90]. Derisotrope Anteil der Hyperfeinkopplung für das β-Proton hängt vom Diederwinkel zwi-schen β -CH und dem 2pz Orbital ab. Hier gilt die Heller-McConnell Gleichung [91]:

aHβiso = ρµ(B

′ +B′′cos2θ) (2.25)

wobei ρµ wieder die Spindichte ist. Der Koeffizineten B′′ trägt der Spindichte aus derHyperkonjugation [80, 92] und B′ orientierungsunabhängigen Mechanismen (wie z.B.Spinpolarisation) Rechnung.Zusätzlich tritt nun noch ein weiterer Energieterm, die Kern-Zeeman-Energie, auf.Genau wie bei Elektronen führt die Wechselwirkung der magnetischen Momente derKerne mit dem äußeren Magnetfeld zu einer weiteren Aufspaltung.

H = −gNµNHI (2.26)

Diese Energie ist jedoch aufgrund des kleineren gyromagnetischen Moments sehr vielgeringer als die Elektron-Zeeman-Energie.Für fast alle im Folgenden betrachteten organischen Radikale ergibt sich damit zusam-menfassend folgender Spin-Hamiltonoperator:

H = µBHgS+∑

(−gNµNHIi + SAiIi) (2.27)

Sind die anisotropen Teile des Hyperfeinterms klein gegenüber dem Elektron-ZeemanTerm, lassen sich die Eigenzustände der Energie des Systems durch die EigenwerteS,Ms, Ii,mIi zu den Operatoren S2, Sz, I2

i , Izi charakterisieren. Das Magnetfeld der Mi-krowelle wirkt in erster Näherung nur auf den Elektronenspin, so dass nur Übergängezwischen Niveaus mit ∆Ms = 1 und ∆mI = 0 berücksichtigt werden müssen.Bei Kernen mit I ≥ 1 tritt als zusätzlicher Term die Quadrupolkopplung auf [80,81].Die Quadrupolkopplung beschreibt die Wechselwirkung des skalaren Quadrupolmo-ments eines Kerns mit dem Gradienten des elektrischen Feldes, das durch die Elek-tronen in seiner Umgebung erzeugt wird. Für die hier im Rahmen dieser Arbeit vor-kommenden 14N-Kerne ist die Quadrupolkopplung deutlich kleiner als die Hyperfein-kopplung und kann daher für die Beschreibung der ESR Spektren vernachlässigt wer-den [81].

Mehrspin-Systeme und Spinkopplung

Bei Systemen mit mehr als einem ungepaarten Elektronenspin (z.B. FeIII mit S = 52 )

und damit einem Gesamtspin von S > 12 ist die Entartung der einzelnen ms-Niveaus


schon ohne Magnetfeld aufgehoben. Diese Nullfeldaufspaltung basiert bei Metallenhauptsächlich auf der Spin-Bahn Wechselwirkung und kann durch den Hamiltonope-rator [80, 81]:

HZFS = SDS (2.28)

beschrieben werden. Im Hauptachsensystem kann D diagonalisiert werden:

HZFS = −X S2x −Y S2

y −ZS2z (2.29)

Dieser Tensor ist spurlos und symmetrisch, so dass der Hamiltionoperator meist mitzwei unabhängigen Konstanten beschrieben wird [81].

HZFS = D(S2z −

13

S2)+E(S2x − S2

y) (2.30)

Die beiden Konstanten D und E sind stark von der Symmetrie des Systems abhängig.Bei axialer Symmetrie gilt E=0.Bei Systemen mit zwei oder mehreren Spinzentren in geringer räumlicher Entfernungmuss als weiterer Term die Austauschkopplung berücksichtigt werden (z.B. das FeIII-FeIII-Zentrum der RNR). Die Austauschwechselwirkung ist ein rein quantenmecha-nisches Phänomen und eine direkte Folge des Pauli-Prinzips, der Forderung nach An-tisymmetrie der Wellenfunktion mehrerer Fermionen gegenüber Vertauschung [81].Zwei Austausch-gekoppelte Spins lassen sich durch folgenden Hamiltonoperator be-schreiben [93]:

H = −2JS1S2 +µBH(g1S1 +g2S2)+ S1A1I1 + S2A2I2 + S1D1S1 + S2D2S2 (2.31)

wobei −2JS1S2 die isotrope Austauschwechselwirkung, µBHgiSi den Elektron - Zee-mann Term des jeweiligen Spins, SiAiIi die Hyperfeinkopplung und SiDiSi die jewei-lige Nullfeldaufspaltung beschreibt (i=1,2). Der Hamilton lässt sich unter Benutzungder Vektorprojektionen für Austausch-gekoppelte System [94–97] vereinfachen:

H = µBHGS+ SAk1I1 + SAk2I2 (2.32)

Der G-Tensor des gekoppelten Systems setzt sich aus den g-Tensoren der ungekoppel-ten Systeme wie folgt zusammen [93, 98]:

G = c1g1 + c2g2 +c1c2

5J(g1 −g2)((3c1 +1)D1 − (3c2 +1)D2) (2.33)

c1 =S(S +1)+S1(S1 +1)−S2(S2 +1)

2S(S +1)(2.34)

c2 =S(S +1)−S1(S1 +1)+S2(S2 +1)

2S(S +1)(2.35)


und die h f -Tensoren des gekoppelten Systems [93, 98]:

Ak1 = c1A1 −A1

5Jc1c2((3c1 +1)D1 − (3c2 +1)D2) (2.36)

Ak2 = c2A2 −A2

5Jc1c2((3c1 +1)D1 − (3c2 +1)D2) (2.37)

Häufig sind die Nullfeldtensoren Di deutlich kleiner als die Austauschkopplung J, sodass sich die Gleichungen zu:

G = c1g1 + c2g2 (2.38)

Ak1 = c1A1 (2.39)

Ak2 = c2A2 (2.40)

vereinfachen lassen.Der FeIII-FeIII-Zustand der Ribonukleotid Reduktase koppelt zu einem ESR inaktivenS=0 Gesamtspin. Das im aktiven Wildtyp R2 RNR vorkommende Tyrosinradikal ist≈5 Å vom zweikernigen Eisenzentrum entfernt und koppelt so schwach an die beidenFeIII-Ionen, dass es in guter Näherung als freies Radikal (S = 1

2 ) behandelt werdenkann. Die später beschrieben FeIII-FeIV -Zustände (Intermediat X) und gekoppeltenFeIII-FeIII-Radikal-Zustände sind stark gekoppelt und lassen sich mit den Gleichungen2.38-2.40 beschreiben (J = −108±25cm−1 für FeIII-FeIII in RNR mit S=0 [99]; D =

0.2cm−1 für ein FeIII im S=5 [100]).

2.2 Prinzipien von ESR und ENDOR Spektroskopie

In diesem Abschnitt sollen der grundlegende Aufbau und die grundlegenden Prinzipieneines ESR und ENDOR Experiments beschrieben werden.

2.2.1 ESR Spektroskopie

Durch den im vorangegangenen Kapitel vorgestellten Hamiltonoperator sind die Reso-nanzfrequenzen des Spinsystems festgelegt. Man könnte also durch das Einbringen derProbe in ein Magnetfeld die Absorption in Abhängigkeit von der Frequenz bestimmenund das entsprechende Spektrum detektieren. Da man aber elektronische Schaltungenzur empfindlichen Detektion nur in sehr schmalen Frequenzbereichen aufbauen kann,ist man gezwungen mit Resonatoren zu arbeiten. Daher wird experimentell die Reso-nanzfrequenz festgehalten und das Magnetfeld variiert, was die gleiche Informationliefert.

Prinzipien von ESR und ENDOR Spektroskopie 21

Die thermische Polarisation der Spins im Magnetfeld ist relativ klein. Nach der Boltz-mannverteilung gilt für das Verhältnis der Besetzungszahlen für das Niveau höhererEnergie (Noben) und das Niveau niedrigerer Energie (Nunten):

Noben

Nunten= e

∆EkT (2.41)

Damit erhält man für das Verhältnis∆N

Nunten=

∆E2kT

(2.42)

bei Raumtemperatur (T=273 K) und dem Energieunterschied bei einem Feld von 340mTeinen relativen Unterschied von 7.8*10−4. Hinzu kommt, dass die meisten biologi-schen Proben in sehr verdünnter Form vorliegen, so dass erwartungsgemäß nur einsehr kleiner Teil der Mikrowelle absorbiert wird. Deswegen sind die gängigen ESRSpektrometer so konstruiert, dass sie bei Abwesenheit von Absorption in Balance sind,d.h. ohne die Absorption durch die Spins ist das Signal am Detektor Null, so dass dieStörung durch die Absorption empfindlich detektiert werden kann.

Abbildung 2.1: Der prinzipielle Aufbau eines ESR Spektrometers [101]

Dafür werden sogenannte Reflektionsresonatoren genutzt. Dieser Mikrowellenreso-nator ist ein Hohlraum, dessen Abmessungen in der Größenordnung der Wellenlänge


der Mikrowellen liegt. Die Mikrowellenfrequenz wird exakt auf die Resonanzfrequenzdes Resonators abgestimmt. Die Ankopplung des Resonators an den Hohlleiter wirdso gewählt, dass die zugeführte Mikrowelle gerade die Verluste des Resonators kom-pensiert. In diesem Zustand wird vom Resonator keine Mikrowelle reflektiert. Wirddurch die Veränderung des Magnetfeldes nun die Resonanzbedingung für einen ESRÜbergang erfüllt, wird durch die Probe zusätzlich Mikrowellenleistung absobiert, d.h.die Impedanz des Resonators wird größer und damit wird Mikrowelle vom Resonatorreflektiert. Diese reflektierte Mikrowelle stellt das eigentliche Signal dar, welches übereine Diode detektiert werden kann.Die Detektion über eine Mikrowellen-Diode hat den Nachteil, dass über einen brei-ten Frequenzbereich auch Rauschen detektiert wird. Um dies zu vermeiden, wird dasSignal mit einer Frequenz moduliert, so dass Rauschen anderer Frequenz über eineschmalbandige, phasenempfindliche Detektion ausgeschlossen werden kann. Die Mo-dulation des Signals erreicht man über eine Modulation des Magnetfeldes. Dem stati-schen Magnetfeld wird ein moduliertes kleines Magnetfeld überlagert, üblicherweisedurch Spulen am Resonator. Dies hat zur Folge, dass das Signal nicht mehr in Absorp-tion sondern in der ersten Ableitung detektiert wird.Für quantitative Messungen und für eine verzerrungsfreie Signalform ist die Lineari-tät des Detektors unerlässlich. Eine Diode hat ihren linearen Bereich allerdings nichtum Null sondern in der Umgebung eines sogenannten Arbeitspunktes. Um die Diodein der Nähe ihres Arbeitspunktes zu betreiben wird daher ständig eine Vorbelastungangelegt. Dafür wird ein Teil der Mikrowelle nach der Quelle ausgekoppelt und so ab-geschwächt auf die Diode geleitet, dass sich die Diode an ihrem Arbeitspunkt befindet.Detektiert wird dann im Resonanzfall die Überlagerung des Referenzsignals mit demMesssignal. Das Signal nach der Diode ist immer noch mit der Frequenz der Feldmo-dulation moduliert. Durch einen phasensensitiven Detektor (PSD) wird dieses Signalin eine Gleichspannung verwandelt und nach einem Analog-Digital Wandler an denRechner weitergeleitet.Auf diesem Wege lässt sich unter konstanter Einstrahlung von Mikrowelle bei gleich-zeitiger Variation des statischen Magnetfeldes mit einem kleinen, überlagerten Modu-lationsfeld ein continuous wave-ESR Spektrum aufnehmen. Abbildung 2.1 fasst noch-mal den Aufbau nach den eben beschriebenen Prinzipien zusammen.

2.2.2 ENDOR Spektroskopie

Bei der ENDOR Spektroskopie wird ein NMR Spektrum für alle an den Elektronen-spin gekoppelten Kerne aufgenommen. Dieses NMR Spektrum wird über die Sätti-

Prinzipien von ESR und ENDOR Spektroskopie 23

gung des ESR Übergangs detektiert. Das hat den Vorteil, dass man die höhere Emp-findlichkeit der ESR Spektroskopie nutzen kann und nur die an den Elektronenspingekoppelten Kerne detektiert. So lassen sich Hyperfeinkopplungen, die unterhalb derLinienbreite des ESR Spektrums liegen, detektieren und die Zahl der Linien für meh-rere Kerne gleicher Kopplung reduziert sich gegenüber dem ESR Spektrum drastisch.Das Prinzip der ENDOR Spektroskopie wird nun an dem denkbar einfachsten Fall be-schrieben, der Wechselwirkung eines Elektronenspins S = 1

2 mit einem Kernspin I = 12 .

Als Beispiel betrachten wir den linken ESR Übergang |ββ〉 → |αβ〉 in Abbildung 2.2.Bei genügend hoher Mikrowellenleistung kann das obere Niveau durch Relaxationnicht hinreichend schnell entvölkert werden. Dies führt zu einer verminderten Intensi-

M = +1/2s

M = -1/2s

M = -1/2I

M = +1/2I

M = +1/2I

M =-1/2I

|ba>

|bb>

|aa>

|ab>

E /h = M - M + aM Mn nS S I I S I

Abbildung 2.2: Energieaufspaltung am Beispiel eines Dubletts hervorgerufen durch

ein Proton mit den beiden ESR Übergängen (blau) und den NMR Übergängen (rot)

tät und einer Verbreiterung der ESR Linie. Wird nun simultan der Kernspinübergangzwischen den oberen Niveaus |αβ〉 → |αα〉 in Abbildung 2.2 angeregt, führt dies zueiner Entvölkerung des Niveaus |αβ〉 und damit zu einer Änderung der ESR Amplitu-de. So lässt sich mit statischem Magnetfeld und einem gesättigten ESR Übergang beiparalleler Variation der Radiofrequenz ein NMR Spektrum für die an den Elektronen-spin gekoppelten Kerne aufnehmen und die Hyperfeinkopplungen bestimmen. Nachder Resonanzbedingung dieses Experiments [82]

νENDOR = |νn ±A j/2| (2.43)


erscheinen die ENDOR-Linien für einen Spin 12 Kern als Paare mit dem Abstand der

Kern Zeemann Frequenz νn um die halbe Hyperfeinkopplung oder symmetrisch umdie Kern Zeemann Frequenz, je nachdem welches der größere Wert ist.Bei einem so aufgenommenen cw-ENDOR Spektrum ist daher das doppelte Integralabhängig von den Relaxationsraten und entspricht nicht der Anzahl der Kernspins.Weitgehend unabhängig von Relaxationsraten sind Puls ENDOR Methoden (PEN-DOR), wie von Mims [102] und Davies [103] eingeführt. Die in dieser Arbeit aus-schließlich verwendete Methode von Davies ist in Abbildung 2.3 abgebildet. Das Da-vies ENDOR beruht auf einem Transfer von Spinpolarisationen. Nach einem einge-strahlten Mikrowellen π-Puls wird die Besetzung des entsprechenden ESR Übergangsinvertiert. Danach wird ein Radiofrequenz π-Puls eingestrahlt, der bei Resonanz denentsprechenden NMR Übergang invertiert. Dadurch ändert sich die Intensität des da-nach mittels einer Hahn-Echo Sequenz abgefragten ESR Spinechos, so dass sich wie-derum die Resonanzen der an den Elektronenspin gekoppelten Kerne als Funktion desESR Spinechos detektieren lassen. Eine ausführliche Beschreibung gepulster ESR undENDOR Methoden findet sich in [104].

RF

MW

π/2

π

echo

τ t t

ππ

Abbildung 2.3: Davies ENDOR Pulsfolge

Durch die Detektion der Kernresonanzen über die Intensität des ESR Übergangs ist dieprinzipielle Möglichkeit der Auswahl von Orientierungen gegeben. In einem 9.1 GHzENDOR Experiment tragen bei unaufgelöstem g-Tensor alle Orientierungen zum EN-DOR Signal bei und man erhält ein Pulverspektrum mit den Hauptwerten der h f -Tensoren. Bei einem 94 GHz ENDOR Experiment kann man jedoch durch die Positiondes Magnetfelds orientierungsselektiv Übergänge sättigen und erhält so die Kompo-nenten der h f -Tensoren entlang der jeweiligen Orientierung.

Probenpräparation und verwendete Messgeräte 25

2.3 Probenpräparation und verwendete Messgeräte

2.3.1 Probenpräparation

Die R2 E. coli Proben, sowohl Wildtyp als auch die Mutante R2-F208Y, wurden ausStämmen der AG Sjöberg (Department of Molecular Biology, Arrhenius Laborato-ries, Stockholm University) unter Mitarbeit von C. Schulz (Max-Volmer Laboratoriumfür Biophysikalische Chemie, TU Berlin) angezogen und aufgereinigt. Die Reinigungfolgte der in [105, 106] beschriebenen Prozedur und beeinhaltete das Ausfällen derDNA mit Streptomycin, das Ausfällen des Proteins mit Ammoniumsulfat, eine Gelfil-tration über eine G25 Sephadex Säule und einen Ionenaustausch über eine WhatmanDE52 Säule. Vor der ersten Gelfiltration wurde die R2 Präparation mit einer FeII-Ascorbat Lösung versorgt, um eine vollständige Besetzung mit dem zweikernigen Ei-senzentrum zu gewährleisten [39]. Für die 57Fe markierten Proben wurde die MutanteR2-F208Y in einem eisenhaltigen Minimalmedium präpariert. Das Minimalmediumenthielt [106]: 45mM Kaliumphosphat, 7.6mM Ammoniumsulfat, 0.61mM L-leucin,0.41mM Magnesiumsulfat, 5.9µM Thiaminhydrochlorid (Vitamin B1), 22mM Gluko-se (0.4%), 111µM Carbenicillin (50µg/ml), 85µM Kanamycin (50µg/ml) und 18.5µMEisenchlorid.Die Kristallisation von R2 E. coli und die Generierung des Radikals wurde von M.Högbom et al. in der Gruppe von P. Nordlund (Department of Biochemistry and Bio-physics, Stockholm University) durchgeführt [107]. R2F und R1E/R2F S. typhimuri-

um Kristalle und Lösungen wurden von M. Uppsten in der Gruppe von U.Uhlin (De-partment of Molecular Biology, Swedish University of Agricultural Science, Uppsala)analog zu [18] und Referenzen darin präpariert. Das Radikal Y105• in den R2F undR1E/R2F S. typhimurium Kristallen wurde analog zu [107] generiert.Die Präparation und Rekonstitution des Eisen-Zentrums in C. trachomatis erfolgte inZusammenarbeit mit N. Voevodskaya in der Gruppe von A. Gräslund (Department ofBiophysics, Arrhenius Laboratories, Stockholm University) analog zu [54].Das a-ThDP Radikalintermediat wurde in der AG Fontecilla-Camps (Laboratoire deCristallographie et Cristallogenese des Proteins, Institut de Biologie Structurale Jean-Pierre Ebel, CNRS, Grenoble) aus der Reaktion des PFOR Enzyms mit Pyruvat gene-riert. Die Reaktion wurde unter Abwesenheit von Coenzym A und unter anaerobenBedingungen durchgeführt und nach ca. 2 Minuten eingefroren [59], wobei proto-niertes und deuteriertes Pyruvat benutzt wurde. Das deuterierte Pyruvat wurde vonH. Zimmermann (Max Planck Institut für Medizinische Forschung, Heidelberg) zurVerfügung gestellt. Das Radikalintermediat im PFOR Einkristall wurde durch Badender Einkristalle in Pyruvatlösung unter anaeroben Bedingungen und anschließendem


Schockfrieren, wie in [59] beschrieben, erzeugt.

2.3.2 Verwendete Spektrometer

Für die 9.5 GHz ESR Spektroskopie wurde ein Bruker ESP300E Spektrometer miteinem Standardrechteckresonator in der TM110 Mode benutzt. Zur Probentemperie-rung während der Messung wurde ein Helium-Fluss Kryostat (Oxford ESR 900) ver-wendet, welcher einen Temperaturbereich von 4-200 K erlaubt. Die exakte Mikrowel-lenfrequenz wurde mit einem Frequenzzähler der Firma EIP Microwave, Inc. Modell371 gemessen. Das Magnetfeld wurde mit einer LiLiF-Probe kalibriert. LiLiF hat ei-ne sehr schmale Linienbreite (< 0.01mT ) und einen sehr genau bestimmten g-Wert(g = 2.002293(2) [108]).Die 9.1 GHz cw-ENDOR Spektroskopie wurde mit dem gleichen Aufbau wie zuvorbeschrieben durchgeführt. Als Resonator wurde jedoch ein selbstgebauter zylindri-scher ENDOR Resonator in der TM110 Mode [109] benutzt.Die 94 GHz ESR wurde an einem Bruker Elexsys E680 Hochfeld Spektrometer mitZylinderresonator in der TE011 Mode gemessen. Das statische Magnetfeld wird vonsupraleitenden Spulen erzeugt. Diesen supraleitenden Spulen sind Raumtemperatur-spulen überlagert, die eine Feldvariation in einem Bereich von 80mT erlauben, wasfür die hier gemessenen organischen Radikale ausreichte. Für die Kalibrierung derMagnetfeldachse wurde wieder eine LiLiF-Probe benuzt, die bei zwei verschiedenenFrequenzen gemessen wurde (typischerweise 93.8 GHz und 94.3 GHz). Das beschrie-bene 94 GHz Spektrometer befindet sich in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. R. Bittlund durfte dankenswerter Weise frei genutzt werden.

2.3.3 Montage der Einkristalle

Die Einkristalle wurden mit in der Röntgenkristallografie üblichen Schlingen in dieoffenen EPR Quarzröhrchen eingeklebt. Dies verdeutlicht Abbildung 2.4. Die Rotationerfolgte um die z-Achse des Laborsystems, die senkrecht zur Magnetfeldachse (x-Achse des Laborsystems) steht (siehe ebenfalls Abbildung 2.4).

2.4 Simulation der ESR Spektren von Radikalen in ge-

frorener Lösung

Ausgehend vom Hamiltonoperator in Gleichung 2.27 lässt sich unter der Annahme,dass der Kern-Zeeman Term vernachlässigt werden kann, folgender Spin-Hamilton für

Simulation der ESR Spektren von Radikalen in gefrorener Lösung 27

Abbildung 2.4: Montage der Einkristalle im ESR Röhrchen, die Rotation der Einkri-

stalle erfolgt um die z-Achse (vertikal in der Papierebene) während das Magnetfeld in

Richtung der x-Achse angelegt ist (horizontal in der Papierebene)

ein Elektron mit einem Kernspin I und ESR Übergängen erster Ordnung aufstellen:

H = HEZ +HHF = µBHgS+ SAI (2.44)

D.h. für die Simulation und weitergehende Betrachtung der in dieser Arbeit vorkom-menden Radikale wurden nur der Elektron-Zeeman Term und der Hyperfeinkopp-lungsterm berücksichtigt. Als prinzipielles Achsensystem in allen Simulationsrouti-nen wurde das gTensor Achsensystem gewählt, d.h. sowohl das von aussen angelegteMagnetfeld im Laborachsensystem als auch das h f -Tensor Achsensystem muss in dasg-Tensor Achsensystem transformiert werden. Dazu wurden Euler-Rotationsmatrizenbenutzt, so dass sich zum Beispiel der Hyperfeinkopplungsterm wie folgt ergibt:

HHF = SAgI = SR(φ,θ,ψ)ART (φ,θ,ψ)I (2.45)

Die Eulerwinkel für die Rotationsmatrizen sind dabei wie in Anhang 5.1 bzw. [110]definiert.


Um spektrale Übergänge berechnen zu können, gibt es zwei prinzipielle Möglichkei-ten, entweder eine numerische Matrixdiagonalisierung mit der Berechnung von Über-gangswahrscheinlichkeiten oder die analytische Berechnung von Resonanzpositionenin erster Ordnung Störungstheorie. Die Matrixdiagonalisierung ist zwar die exaktereaber auch die Rechenzeit aufwendigere Methode. Die Berechnung der Resonanzpo-sitionen ist dagegen wesentlich schneller und auch für eine größere Anzahl Kernenoch mit relativ kurzer Rechenzeit auszuführen. Da alle Simulationsprogramme auchin einen Fitalgorithmus eingebunden werden sollten, wurde in dieser Arbeit die Be-rechnung der Resonanzpositionen über die erste Ordnung Störungstheorie gewählt.Die Energiedifferenzen für Übergänge mit ∆MS = 1,∆MI = 0 lassen sich nach [80]wie folgt berechnen:

∆E = ge f f µBB+MI1

ge f f

√

lT ∗g∗A∗A∗g∗ l (2.46)

mit

ge f f =√

lT ∗g∗g∗ l (2.47)

wobei l der Einheitsvektor in Magnetfeldrichtung als Spaltenvektor

l = (cos(φ)∗ sin(θ);sin(φ)∗ sin(θ);cos(θ)) (2.48)

und B die Magnetfeldstärke ist.Die Energiedifferenz ist abhängig von der Orientierung des g-Tensorachsensystemsrelativ zum Laborachsensystem, in dem das Magnetfeld gegeben ist. In flüssigen undgefrorenen Lösungen liegt im Allgemeinen eine isotrope Verteilung von Molekülenund damit eine isotrope Verteilung von g-Tensor Orientierungen (Pulverspektrum) vor.Der einfachste Weg eine solche Raumverteilung zu generieren, wäre eine Variation derbeiden Raumwinkel φ und θ über einen Bereich von 0 bis π in Intervallen von ∆φ bzw.∆θ. Dieses quadratische Raumgitter hätte den Nachteil, dass sich im Bereich des Polseine deutliche Häufung der Punkte gegenüber dem Äquatorbereich ergeben würde.Bei dem von mir implementierten Simulationsprogramm für die mathematische Ober-fläche octave [111] wird eine spiralförmige Winkelrasterung durchgeführt. Dieser Al-gorithmus basiert auf einer Idee von Mombourquette [112] und wurde schon von Geß-ner [113] für die Simulation von ENDOR Pulverspektren benutzt. Dabei werden Ori-entierungen berechnet, die sich auf einer Spirale um die polare Achse (gz) vom Äqua-tor zum Pol bewegen. Die Winkel werden in einem vorgegebenen Abstand δ variiert.Der Abstand zwischen zwei Spiralwindungen beträgt dabei ebenfalls δ. So ergibt sich

Simulation der Einkristall ESR Spektren 29

nach [112, 113] folgende Rekursionsformel für die Winkelinkremente:

φ0 = 0 ; θ0 =π2

θi+1 = θi −δ2

2π∗ sinθi

φi+1 = φi +δ

sinθi+

1√2(

δsinθi+1

− δsinθi

) (2.49)

Für jeden Punkt auf dieser Spirale wurden dann Resonanzpositionen (nach Gleichung2.46) für alle Kernspinpermutationen berechnet:

B = hν−∑

k ae f f ,k ∗MI

µBge f f(2.50)

mit

ge f f =√

lT ∗g∗g∗ l

ae f f ,k =√

lTR(φ,θ,ψ)AkRT(φ,θ,ψ)l (2.51)

Die berechneten Resonanzpositionen wurden dann auf einen Feldvektor entsprechenddem Vektor des gemessenen Spektrums sortiert, wodurch sich ein Strichspektrum derIntensitäten ergibt. Dieses wurde anschließend mit einer abgeleiteten Gausskurve vor-gegebener Halbwertsbreite gefaltet. Der octave-Quelltext des Simulationsprogrammsfür gefrorene Lösungen ist in Anhang 5.2 nochmals aufgeführt.

2.5 Simulation der Einkristall ESR Spektren

Die Simulation der Einkristall ESR Spektren erfolgt ausgehend vom Spin-Hamiltonianund der prinzipiellen Berechnung der Strichspektren im Wesentlichen analog zum Ver-fahren für gefrorenene Lösungen. Hier ist jedoch keine isotrope Verteilung von Mole-külen, sondern eine wohl definierte Verteilung zu erwarten.Dies wird am Beispiel des R2 E. coli Kristalls mit der Raumgruppe P212121 ver-deutlicht. Hier befinden sich in jeder Kristalleinheitszelle zwei verschieden orientierteTyrosinradikale. Aufgrund der Kristallsymmetrieoperationen kommen noch drei malzwei verschiedene Orientierungen hinzu, die jeweils 180◦ Drehungen um die drei Kris-tallachsen entsprechen. So sind für jede beliebige Orientierung des Kristalls im Ma-gnetfeld acht magnetisch inequivalente Orientierungen des Tyrosinradikals zu erwar-ten. Die Resonanzpositionen für eine beliebige Kristallorientierung ergibt sich wiederanalog zu Gleichung 2.50:

B = hν−∑k ae f f ,k ∗MI

µB ∗ge f f(2.52)


x

y

z

Abbildung 2.5: Verdeutlichung der Kristallsymmetrieoperation; beide Dimerhälften

(grün) mit einem eingezeichneten g-Tensor, der 2. wird durch die 180◦ Rotation um die

Protein-Dimerachse (rot) erzeugt, die Kristallsymmetrieoperationen generieren die je-

weils anderen 3 Dimere, das gesamte Kristallachsensystem (a,b,c lila) rotiert um die

z-Achse des Laborsystems (x,y,z schwarz)

allerdings mit:

ge f f = lT ∗R∗Rl ∗Rd ∗Rg ∗g∗RTg ∗RT

d ∗RTl ∗RT ∗ l

ae f f ,k = lT ∗R∗Rl ∗Rd ∗Rg ∗Rk ∗Ak ∗RTk ∗RT

g ∗RTd ∗RT

l ∗RT ∗ l (2.53)

Die gesamte Orientierungsabhängigkeit wurde in einzelne Rotationsmatrizen aufge-teilt, die jeweils durch drei Eulerwinkel beschrieben werden können (siehe Kapitel2.4, Anhang 5.1):

• R beschreibt die Orientierung des Kristalls im Laborsystem, in dem das Magnet-feld in Richtung der x-Achse angelegt ist l=(1;0;0)

• Rl ist die Orientierung durch die jeweilige Kristallsymmetrieoperation

• Rd ist die Orientierung aus der Transformation durch die Protein-Dimersymmetrie

• Rg ist die Orientierung des g-Tensor Achsensystems im Kristallachsensystem

• Rk ist die Orientierung des h f -Tensor Achsensytems im g-Tensor Achsensystem

Fitalgorithmen 31

• RT sind die jeweiligen transponierten Matrizen

Für einen Kristall mit der Raumgruppe P212121 ließe sich die Orientierung des Kri-stalls im Laborachsensystem nicht prinzipiell aus dem ESR Experiment festlegen, dadurch die 180◦ Rotationen um die jeweiligen Kristallachsen (a, b, c) nicht eindeutigzwischen den verschiedenen Kristallachsen unterschieden werden könnte, so dass mandie Orientierung des Kristalls zum Laborsystem durch ein zusätzliches Röntgenstreu-ungsexperiment festlegen müsste. Durch die nichtkristallografische Dimersymmetrie-achse (ebenfalls 180◦ Rotation, bekannt aus der Röntgenstruktur) ist diese Mehrdeu-tigkeit allerdings aufgehoben, wie die Abbildung 2.6 verdeutlicht. Die gefundene Ori-entierung des Kristalls im Laborachsensystem wurde für den R2 Einkristall aus E. coli

zusätzlich durch Röntgenstreuung bestätigt. Alle weiteren in dieser Arbeit untersuch-ten Kristalle (R2F S. typhimurium und PFOR D. africanus) weisen ebenfalls eine nicht-kristallografische c2-Symmetrie auf. Der octave-Quelltext des Simulationsprogrammsfür die Simulation des R2 E. coli Kristall ist in Anhang 5.3 nochmals aufgeführt.

2.6 Fitalgorithmen

Die in den vorangegangenen Kapiteln beschriebenen Simulationen für die gefrorenenLösungen und die Einkristalle wurden über einen “Chi square” Fit an die gemessenenSpektren angepasst.

χ2 =∑

i

(Ysim,i −Yexp,i)2 (2.54)

Bei diesem Verfahren wird die Summe über den quadrierten Unterschied für jeden si-mulierten (Ysim,i) und gemessenen Punkt (Yexp,i) minimiert. Zur Minimierung wurdenzwei verschiedene Algorithmen benutzt und implementiert, die im Folgenden vorge-stellt werden sollen.

2.6.1 Mehrdimensionaler Simplex Downhill

Der Simplex Downhill Algorithmus [114–116] basiert im Wesentlichen auf geometri-schen Überlegungen. Der Simplex ist eine geometrische Figur mit n + 1 Eckpunkten~y1, ...,~yn+1 im n-dimensionalen Parameterraum, wobei die Dimension des Parameter-raums durch die Zahl der zu variierenden Parameter festgelegt wird. Die Startpunktefür den Simplex dürfen nicht entartet sein und keine geringere Dimensionalität als n

haben. Diese Forderung wird im Allgemeinen dadurch realisiert, dass ein Startpunkt


C2−AchseC2−Achse Kristallachse

A

B

Abbildung 2.6: Verdeutlichung der Eindeutigkeit der Zuordnung der Kristallorientie-

rung zum Laborsystem, Im Fall A und B ist jeweils die gleiche Orientierung (grau

schraffierte Ellipse) in verschiedenen Kristallsites. Aufgrund der Unvertauschbarkeit

der Drehungen um die Protein-Dimerachse (C2-Achse, gestrichelt) und der Rotation

um die Kristallsymmetrieachse (durchgezogen) ergeben sich für die anderen drei El-

lipsen völlig andere Orientierungen. Daher kann die Kristallorientierung eindeutig

zugeordnet werden.

~ys vorgegeben wird und die anderen Eckpunkte aus

∀ i ≤ n : ~yi =~ys +∆yi~ei

~yn+1 =~ys (2.55)

berechnet werden, wobei ∆yi vorgegeben wird und~ei der i-te Einheitsvektor im Para-meterraum ist (∀: für alle).Bei jedem nun folgenden Iterationsschritt wird als erstes bestimmt, welcher Eckpunktdes Simplex den größten, den zweitgrößten und den kleinsten Funktionswert hat (imFolgenden ~ymax, ~ymax2 und ~ymin). Dann wird versucht, den Eckpunkt mit dem größtenFunktionswert durch einen neuen Punkt ~y′ zu ersetzen, indem der größte Funktions-wert am Schwerpunkt der restlichen Punkte gespiegelt wird:

~y′ =1+α

n

n+1∑

i6=max

~yi −α~ymax (2.56)

Fitalgorithmen 33

Danach wird eine Fallunterscheidung durchgeführt:

• Ein neues Minimum ist erreicht ( f (~y′) < f (~ymin)): eine zusätzliche Expansionwird versucht.

~y′′ = γ~y′− 1− γn

n+1∑

i6=max

~yi (2.57)

Ist f (~y′′) < f (~y′) wird ~ymax durch ~y′′, andernfalls ~ymax durch ~y′ ersetzt. Danachbeginnt ein neuer Iterationsschritt.

• Der neue Punkt ist zumindest nicht mehr das Maximum, d.h. ~y′ <~ymax2. ~ymax

wird durch~y′ ersetzt und ein neuer Iterationsschritt begonnen.

• Der neue Punkt ist immer noch das Maximum, d.h.~y′ >~ymax2. Dann ist der Sim-plex wahrscheinlich in einem “Talboden” und die Reflektion bildet den Punkt ander anderen Seite des “Tals” ab. Daher wird eine Kontraktion statt einer Spiege-lung versucht, d.h.~ymax wird in Richtung des Schwerpunkts verschoben.

~y′′ = β~ymax +1−β

n

n+1∑

i6=max

~yi (2.58)

Ist die Kontraktion erfolgreich, d.h. f (~y′′) < f (~ymax2), wird der vormals höchstePunkt durch den neuen Punkt ersetzt und der nächste Iterationsschritt begonnen.

• Ist keiner der bisherigen Fälle eingetroffen, kann davon ausgegangen werden,dass der Simplex in der Nähe eines Minimums ist, auf das sich der kompletteSimplex zusammenziehen muss. Der Abstand aller Punkte zum Punkt mit demniedrigsten Funktionswert~ymin wird halbiert:

∀i 6= min :~yi →12(~yi +~ymin) (2.59)

Für den Reflektionskoeffizienten α, den Expansionskoeffizienten γ und den Kontrak-tionskoeffizienten β werden im Allgemeinen folgende Werte verwendet: α = 1, γ = 2und β = 0.5. Der Fit wird abgebrochen, wenn das Verhältnis des Standardfehlers derFunktionswerte an den Simplexeckpunkten zum Mittelwert eine definierte Abbruch-schranke unterschreitet:

ε >

∣

∣

∣

∣

√

1n(∑n+1

i=1 f 2(~yi)− 1n+1(

∑n+1i=1 f (~yi))2)

11+n

∑n+1i=1 f (~yi)

∣

∣

∣

∣

(2.60)


Als Ergebnis wird dann der komplette Simplex ausgegeben. Abbildung 2.7 veran-schaulicht nochmal die möglichen Züge des Simplex im Fall eines zweidimensionalenParameterraums. Der Simplex Downhill Algorithmus funktioniert für die Spektren dergefrorenen Lösung sehr gut. Bei den Fits der Kristallspektren dagegen endeten dieFits oft in lokalen Minima, so dass der Algorithmus um die Methode des SimulatedAnealings erweitert wurde, welche im folgenden Abschnitt beschrieben werden soll.

2.6.2 Simulated Anealing

Bei der eben beschriebenen Methode des Simplex Downhill Algorithmus werden neuePunkte nur dann akzeptiert, wenn sie kleiner als der bisher größte Funktionswert sind.Dies führt dazu, dass der Algorithmus geradewegs in das nächste Minimum läuft. Diesmuss aber in einem mehrdimensionalen Parameterraum nicht zwangsläufig das glo-bale Minimum sein. Bei der gefrorenen Lösung lässt sich dies relativ einfach durchdie Wahl verschiedener Startpunkte prüfen. Bei den Einkristall ESR Spektren dagegenwird als χ2 der Unterschied zwischen den gemessenen und simulierten Spektren füralle Orientierungen gleichzeitig gebildet. Da zum Beispiel im Fall des R2 E. coli Kri-stalls zu jeder Orientierung acht magnetisch inequivalente Orientierungen beitragen,die jeweils noch Hyperfeinaufspaltung zeigen, ist die Potentiallandschaft sehr “zer-klüftet”. Daher terminiert der Simplex Downhill Algorithmus sehr schnell in einemMinimum, welches aber nicht das globale Minimum ist.Um die ungewollte Terminierung des Algorithmus in lokalen Minima zu vermeiden,wurde der Algorithmus um die Methode des Simulated Anealing [114, 116] erweitert.Wie der Name andeutet, wurde die Methode in Analogie zum Ausglühen von Metal-len entwickelt. Beim Ausglühen soll eine möglichst fehlerfreie Kristallstruktur, d.h.der Zustand niedrigster Energie erreicht werden. Dazu wird das Metall bis nahe anseine Schmelztemperatur erhitzt und dann langsam wieder abgekühlt. Bei sehr hohenTemperaturen haben die Moleküle auch eine sehr hohe Beweglichkeit, die sie beim Ab-kühlen verlieren. Wird das Metall nun sehr schnell abgekühlt, können sich die Mole-küle nur lokal ordnen und man erhält einen polykristallinen Zustand. Beim langsamenAbkühlen ist genügend Zeit vorhanden, um eine große Anzahl verschiedener Zuständezu durchlaufen. Dabei existiert auch eine nichtverschwindende Wahrscheinlichkeit fürdas System, Zustände einzunehmen, deren Energie höher als die der Boltzmannver-teilung bei dieser Temperatur entsprechenden Energie ist. So existiert für das Systemeine Chance, aus einem lokalen energetischen Minimum wieder herauszufinden undam Ende einen Zustand minimaler Energie, die einkristalline Struktur, einzunehmen.Die Erweiterung des Simplex Downhill Algorithmus um diese Methode ist einfach.

Fitalgorithmen 35

Abbildung 2.7: Verdeutlichung der Simplexzüge im Falle eines zweidimensionalen Pa-

rameterraums, aus [114]

Dafür werden nur ein Zufallsgenerator und eine Kontrollvariable T benötigt. Bei je-dem Iterationsschritt wird nun jeweils zum maximalen bzw. zweitgrößten Funktions-wert eine Zufallsvariable addiert, bzw. vom Funktionswert der durch Reflektion, Ex-


pansion oder Kontraktion gefundenen Punkte wird eine Zufallsvariable abgezogen.Dadurch werden die Punkte, bei denen ein niedrigerer Funktionswert erreicht wird,immer akzeptiert und Punkte mit einem größeren Funktionswert werden mit einer ge-wissen Wahrscheinlichkeit akzeptiert. Als addierte bzw. subtrahierte Zufallsvariablefungierte eine vom Computer jeweils generierte Zufallszahl im Bereich von 0...1, diemit dem Kontrollparameter T multipliziert wurde. Nach einer bestimmten Anzahl vonIterationsschritten wurde der Kontrollparameter (die “Temperatur”) gesenkt.

T = (1−κ)T (2.61)

Dabei ist κ ein beim Start vorgegebener kleiner Wert. So geht die Temperatur mit derZeit gegen Null und der kombinierte Simplex Downhill Simulated Anealing Algorith-mus in einen reinen Simplexalgorithmus über.Bei der praktischen Durchführung sind drei Größen relevant: die Temperatur T, dasIntervall, in dem die Temperatur jeweils abgesenkt wird und die “Absenkgeschwin-digkeit” κ. Für die Anfangstemperatur wurde dabei in dieser Arbeit meist die doppel-te oder einfache Differenz zwischen minimalem und maximalem Funktionswert desStartsimplexes genommen. Das Absenken erfolgte nach jedem Iterationsschritt bei ei-nem Wert von κ = 0.5∗10−2.Die Methode des kombinierten Simplex Downhill Simulated Anealing erwies sich alssehr wirkungsvoll beim Auffinden des globalen Minimums. Es wurden Fits mit ver-schiedenen Startpunkten, mit verschiedenen Größen des Startsimplexes, verschiedenenTemperaturwerten und Absenkgeschwindigkeiten durchgeführt. Im Extremfall wurdeeine Temperatur vom Vierfachen der Differenz zwischen minimalem und maximalemFunktionswert des Startsimplexes und ein Absinken aller 50 Iterationsschritte gewählt,was nach einer Programmlaufzeit von zwei Wochen zum gleichen Minimum führte.

2.7 Dichtefunktionalmethoden

In diesem Abschnitt soll eine kurze Skizzierung der Prinzipien von DichtefunktionalTheorie Methoden (zur ausführlicheren Darstellung siehe [117–120]) und die in dieserArbeit verwendeten Ansätze geben.Die Grundidee der Dichtefunktionaltheorie, alle verschiedenen Energiebeiträge (kine-tische sowie elektrostatische) durch ein Funktional der Elektronendichte (ρ(r)) auszu-drücken, wurde schon zu den Anfängen der Quantenmechanik entwickelt ( [120] undReferenzen darin). Diese Theorie wurde 1964 formal durch Hohenberg und Kohn be-wiesen [121]. Beide zeigten, dass die Grundzustandsenergie eines elektronischen Sy-stems eindeutig durch Dichtefunktional ausgedrückt werden kann, auch wenn der ex-

Dichtefunktionalmethoden 37

akte funktionelle Zusammenhang zwischen Elektronendichte und Energie unbekanntbleibt. Im Allgemeinen setzt sich das Funktional E für die elektronische Energie wiefolgt zusammen:

E[ρ(r)] = ET +EV +EJ +EX +EC (2.62)

Dabei ist ET die kinetische Energie der Elektronen, EV die Elektron-Kern Anziehung,EJ die Elektron-Elektron Abstoßung, EX die Austauschenergie als Folge des Antisym-metrieprinzips für Fermionen und EC die Korrelationsenergie als Differenz zwischender exakten Energie und der Hartree-Fock Energie [122].Eine etwas weitere Interpretation von Dichtefunktionalmethoden schließt auch Metho-den ein, wo ET , EX und/oder EC Orbitalfunktionale E(χi(x)) sind (χi(x): Spinorbitaleals Funktionen von Raum- und Spinkoordinate x). Diese Interpretation schließt Dich-tefunktional Hartree-Fock Hybridmethoden, Kohn-Sham Methoden und reine Dichte-funktionale ein.In dieser Arbeit wurden für die Dichtefunktional Berechnungen ausschließlich Dich-tefunktional Hartree-Fock Hybridmethoden und dabei im speziellen die B3LYP Me-thode verwendet. Bei den Hybridmethoden wird EX und EC zusammengefasst undEX + EC als Linearkombination von Orbitalfunktionalen und Dichtefunktionalen aus-gedrückt. Diesem Ansatz liegt das Konzept der adiabatischen Verknüpfung zugrunde,wo ein Parameter λ im Integranden F die Elektron-Elektron Wechselwirkung einschal-tet (λ = 0 keine Wechselwirkung und λ = 1 vollständige Wechselwirkung)

EX +EC =

∫ 1

λ=0F(λ)dλ (2.63)

B3LYP ist dabei ein sehr erfolgreiches Drei-Parameter Hybridpotential [123]. DiesesFunktional ist im Programmpaket Gaussian 03 bereits implementiert und wurde sobenutzt [124]. Die NMR Parameter (g-Tensor, h f -Tensoren und Spindichten) wurdenebenfalls durch das Programmpaket Gaussian 03 nach den in [125–128] beschriebenenVerfahren berechnet.

Kapitel 3

Strukturelle Untersuchungen an derRibonukleotid Reduktase

Um ein besseres Verständnis der in Kapitel 1.1 beschriebenen Radikaltransferreaktionin der Ribonukleotid Reduktase zu erlangen, wurde die Position des TyrosinradikalsY122• in R2 E. coli und die Position des Tyrosinradikals Y105• in R2F und R1E/R2FS. typhimurium untersucht. Im ersten Teil dieses Kapitels wird gezeigt, wie es mit-tels Hochfeld Einkristall ESR Spektroskopie möglich ist, die Position der Radikale imEinkristall zu bestimmen, die durch eine Röntgenstrukturanalyse unzugänglich sind.

3.1 Die Position des Y122• in R2 E.coli

Das Tyrosinradikal der Untereinheit R2 wird aus der Reaktion des zweikernigen Ei-senzentrums mit molekularem Sauerstoff generiert (siehe Kapitel 1.2). StrukturelleDaten sind bisher nur für den reduzierten FeIIFeII-Y122-OH [28] und für die inaktivesogenannte Met-Form FeIIIFeIII-Y122-OH [26] vorhanden, während für die radika-lische Form FeIIIFeIII-Y122•, dem Ausgangspunkt des Enzymmechanismus im akti-ven Zustand, noch keine Röntgenstrukturdaten vorliegen. Diese Strukturdaten wur-den zusammen mit theoretischen Berechnungen als Basis für den postulierten Me-chanismus der Radikalgenerierung und des Radikaltransfers im aktiven Enzym be-nutzt [1, 3, 4, 8, 33–35]. Das Radikal war schon Gegenstand zahlreicher W-Band ESRUntersuchungen [129–133]. Es wurde sowohl experimentell als auch theoretisch ge-zeigt [130–139], dass der gx Wert des Tyrosinradikal sensitiv auf die elektrostati-sche Wechselwirkung und im Speziellen auf Wasserstoffbrücken zwischen der C = O

Gruppe des Tyrosinradikals und der Umgebung ist. Dies wird qualitativ von der g-Tensor Theorie nach Stone beschrieben [140]. Für ein planares π-Radikal ist die g-

39

40 Strukturelle Untersuchungen an der Ribonukleotid Reduktase

Tensor Komponente senkrecht zur Ebene (gz) nahe dem Wert des freien Elektrons(ge = 2.002319). Die Komponenten in der Ringebene sind um ∆gx,y = gx,y−ge zu hö-heren Werten verschoben. Diese Verschiebung resultiert hauptsächlich aus den Über-gängen des nicht bindenden Lone-Pair Orbitals (am Tyrosinsauerstoff) in das halbge-füllte π-Orbital [140].Es gilt:

∆gx = 2ξρπc2y/∆Enπ∗ (3.1)

mit ξ als Spin-Bahn Kopplung, ρπ die π Spindichte, cy das Bahnmoment vom py

Beitrag zum Lone-Pair Orbital an den jeweiligen Kernen [133, 140, 141]. ∆Enπ∗ istdie Energiedifferenz zwischen dem Lone-Pair und dem π-Orbital. Die elektrostatischeWechselwirkung durch eine Wasserstoffbrücke oder eine polare Umgebung stabilisiertnun das Lone-Pair Orbital, wodurch sich der Energieunterschied zwischen dem Lone-Pair Orbital und dem π- Orbital vergrößert. Dies hat eine Verkleinerung des gx Werteszur Folge. So wurde zum Beispiel nachgewiesen, dass das Tyrosinradikal aus der RNRder Maus und im Herpes simplex virus Wasserstoffbrücken gebunden ist, im Gegen-satz zum Tyrosin in E. coli.In der gefrorenen Lösung konnte die in vivo Aktivierung (die Reaktion des reduziertenEisenzentrums mit molekularem Sauerstoff) und die Reaktivierung des Radikals undsomit katalytische Aktivität aus der inaktiven Met-Form (Y122-OH) durch die Reak-tion mit H2O2 (dem sogenannten shunt-Mechanismus) nachgewiesen werden.R2 Kristalle sind nach erfolgreicher Kristallisation in der Met-Form. In diesem Kapitelwird beschrieben, wie in Kooperation mit M. Högbom, M. Andersson und P. Nordlundvon der Universität Stockholm das Radikal in R2-Einkristallen mit einer Ausbeute voncirca 10 % generiert wurde. Dies ist für eine Röntgenstrukturanalyse nicht ausreichend,aber durch Kombination von Röntgenstrukturanalyse der inaktiven Y122-OH Form (M.Högbom et al. (PDB Eintrag: 1RIB)) und Hochfeld ESR des Y122• Radikals gelanges, die Orientierung des stabilen Tyrosin Radikals in der Untereinheit R2 aus E. coli

zu bestimmen.

3.1.1 Spektroskopie der gefrorenen Lösung

Die Hauptwerte des g-Tensors und der h f -Tensoren des Tyrosinradikals Y122• wur-den aus der Messung der gefrorenen Lösung bestimmt (siehe Abbildung 3.1). Die dreig-Hauptwerte und die Hyperfeinstruktur sind sehr gut aufgelöst, was einen g- undHyperfein-strain ausschließt. Solch ein Strain wäre im Fall einer inhomogenen Umge-bung zu erwarten [144]. Die g- und Hyperfeinhauptwerte des Tyrosins (siehe Tabelle

Die Position des Y122• in R2 E.coli 41

B [T] 3.33 3.335 3.34 3.345 3.35 3.355 3.36 3.365 3.37

Abbildung 3.1: ESR Spektrum der gefrorenen Lösung von Y122• in R2 E. coli

(blau) und Simulation (rot); Mikrowellenfrequenz 94 GHz, Mikrowellenleistung 2

µW, Modulationsfrequenz 100 kHz, Modulationsamplitude 0.2mT, Temperatur 80K;

Simulationsparameter:Ax,y,z=[-27.2(1.7) -7.8(1.7) -20.7(1.7)]MHz für die Protonen

an den Positionen 3 und 5 (Nummerierung siehe Abbildung 3.2) mit einer Rotati-

on von +24◦ bzw -24◦ um gz; Ax,y,z=[58.8(1.7) 51.8(1.7) 54.9(1.7)]MHz für ein β-

Proton; Linienbreite 0.5mT (1mT ⇔ 28MHz); simulierte Werte in guter Übereinstim-

mung mit [132, 142, 143]

3.1 und Legende in Abbildung 3.1) nebst ihrer relativen Orientierung wurden durcheine Simulation bestimmt und zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit bereits pu-blizierten Werten [129–133, 142]. Der bestimmte gx Wert zeigt auch klar, dass dasTyrosinradikal nicht Wasserstoffbrücken gebunden und in einer unpolaren Umgebungist (siehe Tabelle 3.1).Die Simulation wurde mit dem in Kapitel 2.4 beschriebenen Programm erzeugt. Dieg-Tensor Achsen des Tyrosins sind kollinear mit den Molekülachsen [145]. Ihre Lageund die Zuordnung der Protonen h f -Tensoren zeigt Abbildung 3.2. Die Zuordnung derh f -Tensoren erfolgte durch den Vergleich mit eigenen DFT Rechnungen und früherenspektroskopischen Arbeiten, die ein sehr detailiertes Bild der Spindichteverteilung desRadikals Y122• lieferten [142, 143, 146, 147].


β1

β2H

��

��

2H

3

4 O

H56

H

g

xC

RH

zg

y

g

H

1

Abbildung 3.2: Das Tyrosinradikal mit dem g-Tensor Achsensystem [139, 144, 145].

Die in der Simulation benutzten Protonen h f -Tensoren wurden den blau markierten

Positionen zugeordnet (siehe Text)

3.1.2 Spektroskopie am Einkristall

Von einem H2O2 behandelten Einkristall (0.7*0.3*0.2 mm3) wurden orientierungs-abhängige cw-EPR Spektren im Abstand von 7.5◦ aufgenommen. Abbildung 3.3 zeigtdas Rotationsmuster der gemessenen Spektren über einen gesamten Winkelbereich von180◦ mit den zugehörigen Simulationen. Die Spektren zeigen eine Überlagerung derg-Verschiebung und der Hyperfeinaufspaltungen der acht magnetisch inäquivalentenTyrosine im Einkristall, wie in Kapitel 2.5 Abbildung 2.5 verdeutlicht wurde.Die Analyse des gesamten Rotationsmusters erfolgte mittels eines simultanen Fits al-ler gemessenen Orientierungen durch ein selbst entwickeltes Simulationsprogramm,welches auf folgendem Hamiltonoperator basiert (siehe auch Kapitel 2.5):

H =∑

l

{B0(µBRRlRdRggRTg RT

d RTl RTS−

∑

k

µNgNIk)

+∑

k

SRRlRdRgRkAkRTk RT

g RTd RT

l RTIk} (3.2)

Dieses Simulationsprogramm ist mit einem Fitalgorithmus verbunden, welcher aufeinem kombinierten Simplex-Downhill und Simulated Anealing Algorithmus basiert(siehe ebenfalls Kapitel 2.6). Zur Analyse wurden anfangs der g-Tensor (g), die h f -Tensoren (Ak) für die Protonen an den Positionen 3 und 5 und für das β-Proton so-wie ihre jeweiligen Orientierungen in Bezug auf das g-Tensor-Achsensystem (Rk).Ri bezeichnet jeweils die Orientierung als Euler’sche Drehmatrix (siehe auch Kapitel2.4,2.5, Anhang 5.1)) und wurde aus der Simulation der gefrorenen Lösung übernom-men. Die Orientierung der beiden Dimere (Rd) und die Kristallsymmetrieoperation(Rl) für den P212121 Kristall wurden durch die hochauflösende Röntgenstruktur von


Tyrosin Radikal/Organismus gx gy gz Referenz

Y122•/RNR E. coli ∗† R2 Einkristall 2.00912 2.00455 2.00219 hier

Y122•/RNR E. coli ∗† gef. Lösung 2.00912 2.00454 2.00219 hier

Y122•/RNR E. coli † 2.00912 2.00457 2.00225 [129, 142]

Y122•/RNR E. coli † 2.0091 2.0046 2.0021 [132]

Y105•/RNR Salmonella typhimurium† 2.0089 2.0043 2.0021 [131]

Y177•/RNR Maus‡ 2.0076 2.0044 2.0021 [132]

Y177•/RNR Maus‡ 2.0076 2.0043 2.0022 [130]

Y132•/RNR herpes simplex Virus 1‡ 2.0076 2.0043 2.0022 [130]

Tabelle 3.1: Die g-Tensor Hauptwerte für Y122• RNR E. coli Einkristall und gefrorene

Lösung im Vergleich mit den Tyrosinradikalen der RNR anderer Organismen; ∗ aus

den Simulationen Abbildung 3.1 und 3.3, Fehler ± 0.00004; † unpolare Umgebung,

keine Wasserstoffbrückenbindung; ‡ polare Umgebung, Wasserstoffbrückenbindung

Martin Högbom et al. [107] bestimmt. Damit reduziert sich die Anzahl der Fitpara-meter auf drei Eulerwinkel für die Orientierung des g-Tensors (Rg) im Kristallachsen-system und die drei Eulerwinkel für die Orientierung des Kristalls im Laborachsen-system (R). Diese beiden Orientierungen konnten durch das in Kapitel 2.6 beschrie-bene, selbstentwickelte Simulations-Fit-Programm, basierend auf einem kombiniertenSimplex-Downhill und Simulated Anealing Algorithmus, bestimmt werden. Danachwurden nochmals die g-Tensor Werte, die Hyperfeinwerte und die Orientierungen derHyperfeintensoren als Fitparameter freigegeben, wobei sich aber keinerlei Änderungzu den aus der gefrorenen Lösung bestimmten Werten ergab (innerhalb der Fehler-grenzen, siehe Tabelle 3.1 und Legende Abbildung 3.1). Die Wiederholung mehrererFits von unterschiedlichen Startpunkten führte ebenfalls jeweils zur gleichen g-Tensorbzw. Kristall-Laborsystem Orientierung innerhalb einer Fehlergrenze von ±1◦. Dieszeigt deutlich, dass von dem Fitprogramm das globale und nicht ein lokales Minimumgefunden wurde. Die so erhaltenen besten Simultationsparameter führten zu den inAbbildung 3.3 erhaltenen Simulationen.Tabelle 3.2 zeigt die Gegenüberstellung der Orientierung des g-Tensors im Kristallach-sensystem aus der Simulation der ESR Spektren und die Orientierung der Achsen desreduzierten Tyrosins Y122-OH, wie man sie aus der hochauflösenden Röntgenstruk-turanalyse mit der bekannten Verknüpfung von Molekülachsen und g-Tensor Achsen(siehe Abbildung 3.2) erhält. Die eigentlich in P212121 Kristallen enthaltene vierfacheMehrdeutigkeit bezüglich der Orientierung des g-Tensors wird hier durch die Dimer-


symmetrie aufgehoben. Die Symmetrieoperation zwischen den beiden Dimerhälftenist aus der Röntgenstruktur bekannt und entspricht einer Rotation um 180◦ um eineNichtkristallachse, die aufgrund der Unvertauschbarkeit von Drehungen die Mehrdeu-tigkeit aufhebt [148] (siehe Kapitel 2.5). Insgesamt erhält man eine klare Rotation derg-Tensor Achsen, welche mit den Molekülachsen des Tyrosinradikals verknüpft sind,gegenüber den Molekülachsen des reduzierten Tyrosinmoleküls. So weist die gx Achseden größten Winkel mit 10◦±1◦ auf. Die gy-Achse und die gz Achse sind um 8◦±1◦

bzw. 5◦±1◦ verdreht (siehe Tabelle 3.2).Es lässt sich eine gute Übereinstimmung zwischen dem simulierten und dem gemesse-nen Simulationsmuster erreichen, wenn nur die Dimerhälfte A simuliert wird. In die-sem Fall würden nur die schwachen Linien auf der Hochfeldseite im Rotationsmusterzwischen 120◦ und 150◦ fehlen (siehe Abbildung 3.3). Die beste Übereinstimmungzwischen Simulation und Experiment wurde allerdings bei einer Verteilung des Ra-dikalcharakters von 60-70% in der Dimerhälfte A und 30-40% in der Dimerhälfte Berreicht. Die totale Spinausbeute des Radikals wurde mit 0.1 Radikal pro Monomerabgeschätzt.

Röntgenstruktur ESR Simulation

X Y Z X Y z

A -0.461508 +0.252048 -0.841926 -0.5742(57) +0.1993(45) -0.7940(35)

B +0.273024 -0.858617 -0.413263 +0.3642(23) -0.8078(25) -0.4649(37)

C -0.837094 -0.433026 +0.329380 -0.7341(51) -0.5547(45) +0.3917(49)

Winkel(gxray,gsim) in ◦ 10(1) 8(1) 5(1)

Tabelle 3.2: Die Richtungskosines der Achsen des Tyrosinmoleküls ermittelt aus der

hochauflösenden Röntgenstruktur und der Achsen des g-Tensors des Tyrosinradikals

ermittelt aus der Orientierung zur Simulation des Rotationsmusters; A, B und C sind

die kristallografischen Achsen; die Zahlen in Klammern geben den Fehler des Rich-

tungskosinus an, der durch die Streuung der Ergebnisse von unterschiedlichen Start-

parametern bestimmt wurde; in der letzten Zeile ist der Winkel zwischen den jeweiligen

g-Tensorachsen angegeben, wobei der Fehler hier dem Fehler der Simulationen und

dem Fehler der Struktur Rechnung trägt.


180

90

0

3.34 3.345 3.35 3.355 3.36

deg.

B [T]

g_x g_zg_y

2.0018

AB A B

B A

BA

2.0108 2.0078 2.0048

Abbildung 3.3: 94 GHz ESR Spektren (Experiment blau, Simulation rot) für Y122•

generiert im H2O2 behandelten R2-Einkristall und Y122• gefrorener R2-Lösung zum

Vergleich (oberste Spur); der Kristall wurde um eine zu den Kristallachsen beliebigen

Achse senkrecht zum Magnetfeld in 7.5◦ Schritten gedreht; die farbigen Kosinuslinien

zeigen die Winkelabhängigkeit des effektiven g-Wertes für die 4 Kristallsites und die

beiden Dimerhälften A und B; simulierter g-Tensor siehe Tabelle 3.1, hf-Tensoren und

Messbedingungen Legende Abbildung 3.1; Akkumulationszeit pro Orientierung: 6min


3.1.3 Diskussion und Zusammenfassung der Ergebnisse

Die hier dargestellte Untersuchung des R2-Kristalls aus E. coli zeigt, dass es mög-lich ist, das funktionelle Tyrosinradikal im Einkristall über den sogenannten Shunt-Mechanismus zu generieren. Der nachgewiesene unterschiedliche relative Radikalan-teil in Hälfte A (60-70%) und Hälfte B (30-40%) entsteht höchstwahrscheinlich auf-grund der unterschiedlichen Zugänglichkeit von H2O2 für die beiden unterschiedlichenDimerhälften A und B, was auch schon in früheren Arbeiten beobachtet wurde [149].Dies ist mit der früher beobachteten Radikalausbeute durch Rekonstitution in gefrore-nen Lösungen in Einklang zu bringen, die ein nichtstochiometrisches Verhältnis von1.2 pro Dimer hatte [150].Die Übereinstimmung der g-Tensor Hauptwerte für den Einkristall und die gefroreneLösung zeigt, dass die H2O2 Behandlung des Einkristalls die Umgebung des Radi-kals Y122• nicht verändert. Wie in Tabelle 3.1 bereits gezeigt, ist der gx Wert sehrsensibel gegenüber hydrophober Umgebung (gx ≈ 2.0091 E. coli [139, 143]) oder po-larer Umgebung (gx ≈ 2.0076 [130, 132, 139]). Ebenso zeigt die Simulation des ESR-Rotationsmusters, dass sich die Kopplung des β-Protons im Einkristall nicht von derKopplung des β-Protons in frisch präparierter gefrorener Lösung unterscheidet, d.h esgibt keine Strukturunterschiede in der Seitenkette von Y122 zwischen dem Einkristallund der gefrorenen Lösung. Der isotrope Anteil dieser Kopplung hängt stark von derGeometrie der Seitenkette ab. Es gilt (siehe auch Kapitel 2.1, [80, 91]):

Aiso(Hβ) = ρCπ(B′ +B′′cos2θ) (3.3)

wobei ρCπ die Spindichte am nächsten π-Kohlenstoffatom, B’ und B” empirische Kon-

stanten und θ der Diederwinkel des β-Protons ist. Unter Verwendung dieser Formelund Spindichten von 0.38 − 0.39 am C1 (siehe Abbildung 3.2 und [143, 151]), B”von 5.24 mT − 5.7 mT (siehe ebenfalls [143, 151], B’ nahezu 0) und der simuliertenHyperfeinkopplung von Aiso ≈ 2.0mT erhält man einen Diederwinkel θ von 12◦ bis16◦, was in sehr guter Übereinstimmung mit dem Diederwinkel von 17◦ ist, den diehochauflösende Röntgenstruktur für die nichtradikalische Y122-OH Form zeigt. DerDiederwinkel für das zweite β-Proton ist so groß (θ = 77◦), dass die daraus resultie-rende Kopplung unter der Linienbreite verschwindet.Das Hauptergebnis dieser Studie ist die Umorientierung des Radikals Y122• von 10◦,8◦ bzw. 5◦ gegenüber der hochauflösenden Röntgenstruktur der nichtradikalischenY122-OH Form. Durch die Messung der ESR Spektren kann nur die Orientierungdes Moleküls bezüglich der Kristallachsen bestimmt werden. Eine lineare Verschie-bung ist durch die ESR nicht zu beobachten. Die Umorientierung des g-Tensors kannprinzipiell durch drei verscheidene Bewegungen erreicht werden. Die erste Möglich-


keit wäre eine Verformung der Kopfgruppe, was aber aufgrund der rigiden Strukturdes Rings ausgeschlossen werden kann. Als zweites käme eine Drehung in der Sei-tenkette oder eine Translation des gesamten Backbones in Betracht, was jedoch sehrenergieaufwändig wäre. Die dritte und energetisch wahrscheinlichste Möglichkeit dieUmorientierung zu erreichen, ist die Kombination einer Rotation um die Cα-Cβ und ei-ner Rotation um die Cβ-C1 Bindung der Seitenkette. Und tatsächlich reproduziert eineRotation um Cα-Cβ um 11◦ und eine Rotation um Cβ-C1 um −3◦ die Orientierung desg-Tensors mit einer Abweichung von weniger als 2◦ für jede Achse (siehe Abbildung3.4). Dabei ändert die Rotation um die Cα-Cβ Bindung den Diederwinkel nicht unddie Rotation um Cβ-C1 von −3◦ ist zu klein für eine messbare Änderung. Dies ist inÜbereinstimmung mit der oben erwähnten Folgerung, dass sich die Seitenkettengeo-metrie des Radikals nicht wesentlich von der Röntgenstruktur unterscheidet. Die mitdiesem Modell erhaltene Position des Tyrosinradikals Y122• zeigt Abbildung 3.4.Im Vergleich zum reduzierten Tyrosin ist das Radikal Y122• vom zweikernigen Ei-

senzentrum weggedreht. In der reduzierten Form hat der Sauerstoff des Tyrosins einenAbstand von 3.2 Å zum Sauerstoff am Aspartat D84 und bildet somit wahrschein-lich eine schwache Wasserstoffbrücke aus [107]. Die Rotation des Radikals vergrößertdiese Distanz auf über 4 Å, was außerhalb der Reichweite einer Wasserstoffbrücken-bindung ist. Dies ist in sehr guter Übereinstimmung mit dem gefundenen gx Wert ingefrorener Lösung und im Kristall. Der Wert gx=2.00912 weist deutlich auf eine un-polare und wasserstoffbrückenfreie Umgebung hin (Tabelle 3.1, [129–133]).Die hier vorgestellte Arbeit ist nach unserem Kenntnisstand die erste Untersuchungder Konformationsänderung eines Radikals in einem Protein. In einer früheren ESREinkristallstudie am Y•

D des Photosystems II konnte die Orientierung des Radikals le-diglich relativ zur Membranebene bestimmt werden [148]. Die Voraussetzung für dieBestimmung der Umorientierung des Radikals ist jedoch eine hochauflösende Rönt-genstruktur. Die Umorientierung des Tyrosinradikals Y122• ist in dem hier beschrie-benen Modell hauptsächlich auf die Rotation um die Cα-Cβ Bindung zurückzuführen.Trotz der relativ kleinen Drehung von ≈10◦ ergibt sich eine signifikante Änderung derSauerstoffposition des Y122•. Dieser Sauerstoff hat aufgrund seiner Möglichkeit, einProton zu tragen, eine Schlüsselrolle beim induzierten Radikaltransfer. Da das Tyrosin-radikal Y122• und das Aspartat D84 deprotoniert vorliegen, ergibt sich zwischen denbeiden Sauerstoffen (Y122•-D84) eine elektrostatische Abstoßung, die wahrscheinlichder Hauptantrieb für die Umorientierung des Radikals ist. Dadurch ist das Tyrosinra-dikal auch nicht mehr mit dem zweikernigen Eisenzentrum verbunden, was einer derGründe für seine ungewöhnliche Stabilität sein kann.Der Radikaltransfer in der Ribonukleotid Reduktase erfolgt wahrscheinlich über ein


Wasserstoffbrückennetzwerk von der Untereinheit R2 zum aktiven Cystein C439 (E. co-

li Nummerierung) in der Untereinheit R1. Der vorgeschlagene Transferpfad führt überdie Aminosäuren W48 und Y356 in der Untereinheit R2 zu Y730,Y731 und C439 inder Untereinheit R1 (siehe Abbildung 1.3 im Kapitel 1.2). In der Untereinheit R2 istdas Tryptophan W48 über das Aspartat D237 mit dem an das Eisenzentrum ligandier-ten Histidin H118 verknüpft. In der Untereinheit R1 bilden die beiden Tyrosine einWasserstoffbrückennetzwerk mit dem aktiven Cystein C439. Auf diesen Beobachtun-gen basieren die mechanistischen Vorschläge für den gekoppelten Radikaltransfer vomY122• zum C439 [1, 3, 4, 8, 33–35, 48]. Eine dieser Arbeiten [35] schlägt als erstenSchritt dieser langen Elektron/Proton Transferkette die transiente Abstraktion einesWasserstoffatoms vom Fe1 koordinierten Wasser durch das Radikal Y122• bei gleich-zeitiger Radikalisierung des Trypthophans W48 vor. In diesem Fall würde die Rönt-genstruktur, die ein protoniertes Tyrosin zeigt (siehe Abbildung 3.4), diesen transientenZustand widerspiegeln. Die Möglichkeit der Wasserstoffbrückenverbindung zwischenY122 und dem terminalen Wasser wurde bereits gezeigt [29]. Das Radikal Y122• in-duziert einen Protonenmangel in der Umgebung des zweikernigen Eisenzentrums, wasein Vorteil in Hinblick auf die Reversibiltät des Mechanismus sein könnte. Das zu-rückbleibende, an das Eisen koordinierte Hydroxid könnte als Ausgangsbasis für dieProtonabstraktion bei der Rückoxidation des Y122 dienen. Die beobachtete Kopplungbzw. Nicht-Kopplung des Y122 an den Elektron/Proton Transferpfad könnte eine Rollebei der Kontrolle der Reversibilität des Elektron/Proton Transfer Prozesses spielen. DieBewegung des Tyrosins in die hydrophobische Tasche und hinaus könnte als Schalterder Elektron/Proton Transferkette fungieren. Die Ergebnisse dieses Abschnitts wurdenbereits in M. Högbom und M. Galander et al. PNAS 100: 3209-3214, 2003 publiziert.


Cβ

Cα −3°

11°

Abbildung 3.4: OBEN: Das Tyrosin Y122-OH aus der Röngtenstruktur mit Elektro-

nendichteverteilung und Y122• (grün) aus der ESR Messung (nach 11◦ Rotation um

Cα-Cβ und -3◦ um Cβ-C1, Übereinstimmung mit der g-Tensor Orientierung (gelb) für

alle drei Achsen ≤ 2◦); UNTEN: Das zweikernige Eisenzentrum mit der µ-oxo und

der Karboxylat-Brücke, Liganden an Fe1 und teilweise an Fe2, rote gestrichelte Linie:

Wasserstoffbrücken des vorgeschlagenen Radikaltransfer Pfades


3.2 Die Postition des Y105• in R2F und R1E/R2F S. ty-

phimurium

Neben den bekannten Klasse I RNR Enzymen (wie die im letzten Kapitel beschriebeneKlasse I R2 E. coli Untereinheit) wurden in einigen Bakterien wie S. typhimurium undE. coli eine zweite RNR gefunden [152–154]. Die Gensequenz wurde mit nrdE undnrdF gekennzeichnet. Diese zweite RNR hat eine signifikante Übereinstimmung derGensequenz und die gleiche strukturelle Komposition wie die Klasse I Enzyme. Eben-so wie die Klasse I Enzyme besteht sie aus zwei homodimeren Untereinheiten, wobeidie Untereinheit R2F ein stabiles Tyrosinradikal Y105• (S. typhimurium Nummerie-rung) [131] und das zweikernige Eisenzentrum enthält, während die Untereinheit R1Edas aktive Cystein und die Substratbindungsstelle aufweist. Im Unterschied zu denKlasse I Enzymen fehlt hier die ATP-Bindungsstelle. ATP fungiert bei den Klasse IaEnzymen als An/Aus Schalter für die Proteinaktivität, wobei ATP den Substratumsatztreibt und dATP den Substratumsatz blockiert. Daher wurden die Klasse I RNR En-zyme in die Klassen Ia und Ib unterteilt, wobei die beiden Untereinheiten der KlasseIb mit R1E und R2F (entsprechend der Gensequenzen) bezeichnet werden. Die KlasseIb RNR ist in beiden Bakterien E. coli und S. typhimurium voll funktionsfähig abernicht essentiell für beide Organismen [155]. Diese Klasse Ib Enzyme wurden ebensowie die entsprechende Klasse Ia Enzyme noch in Mycobacterium tubercolosis [156],Lactococcus lactis [157] und Bacillus subtilis [158] gefunden.Die Struktur der Untereinheit R2F von S. typhimurium wurde bereits 1998 gelöst [18].Die Umgebung des zweikernigen Eisenzentrums im oxidierten FeIII-FeIII Zustand mitdem Tyrosin Y105 zeigt Abbildung 3.5. Analog zu R2 E. coli gibt es auch hier imzweikernigen Eisenzentrum einen verbrückenden Sauerstoff und eine verbrückendeCarboxylatgruppe. Das Aspartat D67 ist hier weiter vom Tyrosin Y105 entfernt (4.7 Åin R2F S. typhimurium anstatt 3.2 Å in R2 E. coli ), so dass sich hier auch in der re-duzierten Form des Tyrosins Y105-OH keine Wasserstoffbrücke ausbilden kann. DieEntfernung von Tyrosin Y105 zum Eisenzentrum (7.0 Å) ist im Vergleich zu R2 E. co-

li (4.7 Å) ebenfalls erhöht. Die ebenfalls in [18] gezeigte Struktur für das reduzier-te zweikernige Eisenzentrum in R2F schließt diese Lücke zwischen Tyrosin-Aspartatbzw. Tyrosin-Eisenzentrum teilweise durch ein zusätzliches Wasser, für welches dieStruktur des oxidierten Eisenzentrums keine Elektronendichte aufweist. In der Struk-tur des reduzierten Eisenzentrums ist das Tyrosin Y105 durch eine Wasserstoffbrückean dieses Wasser gebunden, welches wieder eine Wasserstoffbrücke mit dem AspartatD67 aufweist.In Zusammenarbeit mit Malin Uppsten und Ulla Uhlin wird im Folgenden die Orien-

Die Postition des Y105• in R2F und R1E/R2F S. typhimurium 51

Y105

L63

D67

H101 E98

H195

E158E192

F166

Abbildung 3.5: Das zweikernige Eisenzentrum von R2F S. typhimurium im FeIII-FeIII

Zustand mit dem Tyrosin Y105 und seinen nächsten Nachbarn [18]

tierung des Radikals Y105• im R2F Kristall untersucht. Ebenso wird versucht, die Po-sition von Y105• in dem von Malin Uppsten et al erstmals kristallisierten HoloenzymR1E/R2F zu bestimmen [159]. Ziel ist es, herauszufinden ob die in der UntereinheitR2 aus E. coli gefundene Umorientierung des Radikals ein Merkmal von generellerFunktionalität ist und ob die Anbindung der zweiten Untereinheit die Orientierung desRadikals beeinflusst.

3.2.1 Spektroskopie der gefrorenen Lösung

Zunächst wurde analog zum Abschnitt 3.1.1 die gefrorene Lösung der UntereinheitR2F S. typhimurium und des Holoenzyms R1E/R2F aus S. typhimurium untersucht.Die 94 GHz ESR Spektren sind in Abbildung 3.6 abgebildet. Hier ist deutlich zu se-hen, dass das ESR Spektrum des Tyrosinradikals Y105• nicht durch die Anwesenheitder zweiten Untereinheit R1E beeinflusst wird und damit das Radikal auch in Anwe-senheit der substratbindenden Untereinheit stabil und strukturell unverändert ist. BeideSpektren sind absolut identisch und lassen sich auch mit den exakt gleichen g- und h f -Tensoren simulieren. Ebenso weisen sie keinerlei g-Strain oder Hyperfeinstrain auf,


B [T] 3.335 3.34 3.345 3.35 3.355 3.36

Abbildung 3.6: 94 GHz cwESR Spektrum von R2F gef. Lösung (oben,grün) und dem

Holoenzym R1ER2F (unten,blau) mit den zugehörigen Simulationen; Messbedingun-

gen: Mikrowellenfrequenz 94 GHz, Mikrowellenleistung 0.25 µW, Modulationsfre-

qunenz 10 kHz, Modulationsamplitude 0.2 mT, Temperatur 40K; Simulationsparame-

ter: Axx,yy,zz=[-27.2(1.7) -7.8(1.7) -20.7(1.7)]MHz für die Protonen an den Positionen

3 und 5 (Nummerierung siehe Abbildung 3.2) mit einer Rotation von +24◦ bzw -24◦

um gz; Axx,yy,zz=[35.4(1.7) 27.6(1.7) 25.5(1.7)]MHz für das β-Proton,gx=2.00917(4)

gy=2.00447(4) gz=2.00214(4),Linienbreite 0.35mT;

was eine Heterogenität der Radikalumgebung und der Seitenkettenorientierung aus-schließt. Die aus der Simulation beider Spektren bestimmten g- und h f -Tensor Haupt-werte sind nochmal in Tabelle 3.3 zusammengefasst und mit dem Tyrosin Y122• ausR2 E. coli verglichen. Wie man deutlich im Vergleich der g-Tensor Hauptwerte für diebeiden Tyrosinradikale Y105• und Y122• sieht (die g-Tensoren sind im Rahmen desFehlers identisch), sind beide Radikale in einer nicht polaren Umgebung ohne Was-serstoffbrückenbindung (siehe auch Tabelle 3.1). Dies stimmt mit der 2.5 Å Röntgen-struktur [18] überein. Die Abstände zwischen dem Sauerstoff von Y105, dem Sauer-stoff von D67 bzw. dem Sauerstoff von L63 sind deutlich über Wasserstoffbrückenent-fernung (Abbildung 3.5).Der einzige Unterschied zwischen Y122• und Y105• liegt in der Kopplung des β-


Y105• in R2F und R1E/R2F Y122• aus R2

S. typhimurium E. coli

gx,gy,gz 2.00917 2.00447 2.00214 2.00912 2.00454 2.00219

Axx,Ayy,Azz -27.2(1.7) -7.8(1.7) -20.7(1.7) -27.2(1.7) -7.8(1.7) -20.7(1.7)

H3,5 [MHz]

Axx,Ayy,Azz 35.5(1.7) 27.6(1.7) 25.5(1.7) 58.8(1.7) 51.8(1.7) 54.9(1.7)

Hβ [MHz]

Tabelle 3.3: g- und Hyperfeintensorhauptwerte aus den Simulationen der gefrorenen

Lösung (vergleiche auch Abbildung 3.1 und 3.6), Fehler der g-Tensor Hauptwerte

±0.00004, Nummerierung der Protonen siehe Abbildung 3.2, hf-Tensor an den Po-

sitionen 3 und 5 sind jeweils (sowohl R2F, R1E/R2F als auch R2) +24◦ bzw. -24◦ um

gz gedreht

Protons. Bestimmt man für Y105• den Diederwinkel aus der simulierten Hβ-Kopplungnach Gleichung 3.3 erhält man 43-46◦. Dies stimmt relativ gut mit dem in der 2.25 ÅRöntgenstruktur des R2F Kristalls [18] in der Dimerhälfte A gemessenen Diederwin-kel von 41◦ überein. Interessanter Weise hat das Tyrosin Y105 in der DimerhälfteB einen Diederwinkel von 31.5◦, was einer isotropen Hyperfeinkopplung von 42-45MHz entsprechen würde. Dies scheidet aber durch die Simulation der gefrorenen Lö-sung klar aus. Eine derartig große Kopplung wie man sie für den Diederwinkel inDimerhälfte B erhalten würde, würde nicht nur zu einer deutlichen Aufspaltung auf gy

führen, sondern das gesamte Aufspaltungsmuster ändern. Die Kopplung des zweitenβ-Protons wäre nicht mehr vernachlässigbar klein (15-16 MHz).Für die nicht vorhandene β-Kopplung, wie sie durch den Diederwinkel in der Röntgen-struktur für die Dimerhälfte B impliziert wird, kann es zwei mögliche Ursachen geben.Entweder könnte das Radikal nur in der Dimerhälfte A entstehen und das Tyrosin in derDimerhälfte B im reduzierten Zustand Y105-OH verbleiben. Oder die Röntgenstrukturgibt nicht den korrekten Diederwinkel für das Radikal Y105 in der Dimerhälfte B wie-der. Diese Frage sollte durch die Analyse der Hochfeld Einkristall ESR beantwortetwerden können (siehe Zuordnung des unterschiedlichen Radikalgehalts in die beidenDimerhälften für Y122• im R2 E. coli Einkristall im vorangegangenen Kapitel).Die hier bestimmten g-Tensor Hauptwerte stimmen mit den in einer kombinierten 9.45und 245 GHz ESR Arbeit [131] bestimmten Hauptwerten überein. Ebenso sind dieh f -Tensor Hauptwerte übereinstimmend bzw. vergleichbar. Auch in dieser Arbeit fin-det sich kein Hinweis auf die Kopplung eines zweites β-Protons. Eine Bestimmung


des Diederwinkels im R1E/R2F Kristall ist leider nicht möglich, da die von MalinUppsten et al. gelöste Röntgenstruktur nur eine Auflösung von 4 Å hat, was keinerleiDiederwinkelbestimmung erlaubt [159].

3.2.2 Spektroskopie am R2F Kristall

Analog zu dem im letzten Kapitel behandelten R2 Kristall von E. coli wurden nun ori-entierungsabhängige cw-ESR Spektren für den R2F Kristall aufgenommen. Die Abbil-dungen 3.7 und 3.8 zeigen die rotationsabhängigen ESR Spektren von zwei verschie-denen Kristallen über einen Winkelbereich von 180◦. Beide Kristalle hatten ungefähreine Dimension von 0.1*0.1*0.4 mm3.Die Analyse der rotationsabhängigen Spektren erfolgte analog zum letzten Kapitel,lediglich die unterschiedlichen Raumgruppe der R2F P21 Kristalle wurde im Simula-tionsprogramm berücksichtigt. Die unterschiedliche Raumgruppe führt hier nur zu viermagnetisch inäquivalenten Orientierungen, wobei die Eindeutigkeit aber wieder durchdie nichtkristallografische Dimersymmetrie gewährleistet ist. Die simultanen Simula-tionen für alle Sites und Orientierungen sind als rote Spuren in Abbildung 3.7 und 3.8dargestellt.Wie für Y122• im R2-Einkristall von E. coli konnten die rotationsabhängigen Spektrendes Kristalls mit exakt den gleichen Hauptwerten für die g- und h f -Tensoren wie inder gefrorenen Lösung simuliert werden. Ebenso konnte für beide Kristalle die Orien-tierung des g-Tensors relativ zu den Kristallachsen bestimmt werden. Die Orientierungder g-Tensor Achsen in beiden Kristallen war innerhalb einer Abweichung von ±1◦

identisch. Danach wurde versucht, die Orientierung des g-Tensors in beiden Kristallengleichzeitig zu variieren, das heißt es wurde eine g-Tensor Orientierung an beide Rota-tionsmuster gleichzeitig angefittet. Auch dies lag innerhalb der 1◦ Fehlergrenze. Daherkann der Fehler der Orientierung des g-Tensors, die man aus der Simulation der rich-tungsabhängigen ESR Spektren erhält, mit ±1◦ abgeschätzt werden. Den Vergleichder Richtungskosini der aus der Röntgenstruktur [18] ermittelten g-Tensor Orientie-rung und der aus den Simulationen bestimmten Orientierung (gleichzeitige Bestim-mung des g-Tensors für beide Kristalle) zeigt Tabelle 3.4.Einen Fehler für die Orientierung des reduzierten Tyrosins Y105-OH aus der 2.25 ÅRöntgenstruktur [18] abzuschätzen, war hier wesentlich schwieriger. Als Maß für denFehler wurde der Diederwinkel benutzt, der sich für das Tyrosin Y105-OH für die bei-den Dimerhälften um 10◦ unterscheidet. Damit wurde der Fehler der Orientierung desY105-OH mit 5◦ angenommen und der Fehler der Simulation dagegen vernachlässigt.Im Unterschied zum R2 E. coli Kristall ist hier kein unterschiedlicher Radikalgehalt


Röntgenstruktur ESR Simulation

X Y Z X Y Z

A +0.927139 -0.359116 -0.087078 +0.9189(27) -0.3946(63) -0.0035(20)

B -0.254461 -0.464213 -0.839910 -0.1877(49) -0.4449(50) 0.8757(53)

C +0.253423 0.802559 -0.524782 +0.3471(44) 0.8040(23) 0.4828(61)

Winkel(gxray,gsim) in ◦ 7(5) 2(5) 6(5)

Tabelle 3.4: Die Richtungskosini für die g-Tensorachsen bestimmt aus der Röntgen-

struktur 2R2F.pdb und aus den Simulationen Abbildung 3.7,3.8; Fehlerbestimmung

siehe Text

für die beiden Dimerhälften feststellbar. Eine unterschiedliche Verteilung des Radikal-anteils auf die beiden Dimerhälften führte immer zu einer Verschlechterung der Simu-lation. D.h. aber auch, dass die Röntgenstruktur in der Dimerhälfte B nicht die exaktePosition des Tyrosins Y105-OH wiedergibt. Wie im vorangegangen Abschnitt erläu-tert, ist ein Diederwinkel von 32◦, wie ihn die Röntgenstruktur in der DimerhälfteB zeigt, durch gemessenen h f -Tensor ausgeschlossen. Bei einer Gleichverteilung desRadikals in beiden Dimerhälften muss also die Röntgenstruktur den falschen Dieder-winkel zeigen. Dies verdeutlichen auch die um Faktor zwei größeren Temperaturfak-toren des Y105-OH in der Dimerhälfte B gegenüber dem Y105-OH in der DimerhälfteA [18].


180

90

0

3.34 3.345 3.35 3.355 3.36

deg.

B [T]

g_x g_y g_z

2.0108 2.0078 2.0048 2.0018

B A

A B

Abbildung 3.7: orientierunsabhängige ESR Spektren des R2F Kristalls 1 (blau) über

180◦, Simulation (rot) und der Verlauf der effektiven g-Werte für die verschiedenen Kri-

stallsites (grün, cyan); Messbedingungen: 94 GHz Mikrowellenfrequenz, 0.05 µW Mi-

krowellenleistung, 10 kHz Modulationsfrequenz, 0.2 mT Modulationsamplitude, 40K,

Akkumulationszeit pro Orientierung: 45min; Simulationsparameter siehe Legende in

Abbildung 3.6 und Tabelle 3.3, Simulationslinienbreite 0.45 mT


180

90

0

3.34 3.345 3.35 3.355 3.36

deg.

B [T]

g_x g_y g_z

2.0108 2.0078 2.0048 2.0018

AB

A

B

Abbildung 3.8: orientierunsabhängige ESR Spektren des R2F Kristalls 2 (blau) über

180◦, Simulation (rot) und der Verlauf der effektiven g-Werte für die verschiedenen Kri-

stallsites (grün, cyan); Messbedingungen: 94 GHz Mikrowellenfrequenz, 0.15 µW Mi-

krowellenleistung, 10 kHz Modulationsfrequenz, 0.2 mT Modulationsamplitude, 40K,

Akkumulationszeit pro Orientierung: 45min; Simulationsparameter siehe Legende in

Abbildung 3.6 und Tabelle 3.3, Simulationslinienbreite 0.45 mT


3.2.3 Spektroskopie am R1E/R2F Kristall

Die vorhandenen Kristalle des Holoenzyms waren deutlich kleiner (0.1*0.1*0.1 mm3)als die R2F-Einkristalle. Trotzdem konnte auch hier ein Signal des TyrosinradikalsY105• detektiert werden. Rotationsabhängige Spektren des Holoenzyms zeigt Abbil-dung 3.9. Hier ist eine deutlich geringere Winkelabhängigkeit als bei den vorangegan-genen Kristalle zu beobachten. Es ist quasi der gesamte Bereich der gefrorenen Lösungsichtbar, d.h. es tragen sehr viele Orientierungen zum ESR Spektrum bei. Dies liegt ander komplizierten Raumgruppe P4132, welche zu 48 magnetisch inäquivalenten Sitesführt [159]. Trotzdem ist deutlich im Bereich von 3.345−3.5T eine Winkelabhängig-keit erkennbar. Daraus folgt, dass auch im Kristall des Protein R1E/R2F das Radikalstabil ist. Für eine Analyse der Winkelabhängigkeit ist das Signal allerdings deutlichzu schwach und zu schlecht aufgelöst.Eine erfolgreiche Analyse der Radikalorientierung in den R1E/R2F-Einkristallen wä-re unter zwei Voraussetzung möglich. Zum einen müssten die Einkristalle größer sein,um mehr Volumen und somit eine höhere Radikalzahl zu erzielen. Zum anderen müs-ste versucht werden, den Einkristall mit einer anderen Raumgruppe herzustellen, diedie Zahl der magnetisch inequivalenten Sites deutlich reduziert. Entsprechende Expe-rimente sind zukünftig geplant. Unseren Kooperationspartnern M. Uppsten et al. istes schon gelungen, einen Kristall mit der Raumgruppe P41212 herzustellen, der abereine nicht-isomorphe P4132 Untergruppe hat [159]. Die Raumgruppe P41212 führt zu16 magnetisch inäquivalenten Orientierungen des Radikals, so dass eine Analyse derRadikalorientierung im Einkristall des Holoenzyms in Zukunft möglich wäre.

3.2.4 Diskussion und Zusammenfassung der Ergebnissse

Die, durch die Analyse der rotationsabhängigen ESR Spektren der R2F Untereinheitvon S. typhimurium erhaltene, Umorientierung des g-Tensors und damit des RadikalsY105• im Vergleich zum reduzierten Y105-OH stimmt im Rahmen des Fehlers mitder Reorientierung des Radikals Y122• R2 aus E. coli überein. Die Winkel für dengefundenen Orientierungsunterschied besitzen jedoch einen deutlich größeren Fehler.Dieser Fehler setzt sich aus dem Fehler der Simulation und dem Fehler der Röntgen-struktur zusammen. Der Fehler der Simulation ist, wie auch beim R2 Kristall aus E.

coli, ungefähr ±1◦. Der deutlich größere Fehler wird hier durch die deutlich schlech-tere Röntgenstruktur bestimmt (1.4 Å E. coli, 2.25 Å S. typhimurium ). Der Fehler ausder Röntgenstruktur wurde mit ±5◦ abgeschätzt (siehe letzter Abschnitt).Die Orientierung des Radikals Y105• ist im Gegensatz zu Y122• nicht so gut durcheine Rotation um die Cα −Cβ und die Cβ −C1 Bindung reproduzierbar. Für Y122•


in E. coli ließ sich die Orientierung des Radikals mit einer Abweichung von 2◦ fürdie gx-Achse durch die Rotation um die Bindungsachsen erreichen. Die beste Repro-duktion der simulierten g-Tensor Orientierung von Y105• liefert bei einer Rotationvon −5◦ um die Cα −Cβ Bindungsachse und −1◦ um Cβ −C1 Bindungsachse eineAbweichung von 4.5◦ in allen drei Achsen. Daher wurden in Abbildung 3.10 nur dieg-Tensorachsen eingezeichnet. Das Zentrum des Achsensystems wurde in die Mittedes Rings gelegt und die Länge der Achsen entsprach dem Abstand Ringzentrum -Sauerstoff von Y105-OH. Würde man nun als Position des Sauerstoffs von Y105• dasEnde der gx-Achse annehmen, würde sich eine Positionsänderung von 0.2 Å ergeben,was sicherlich unter der Genauigkeit des Experiments liegt.Zusammenfassend lässt sich aufgrund der größeren Fehlergrenzen keine deutliche Re-orientierung des Radikals Y105• gegenüber Y105-OH erkennen. Die Reorientierungdes Tyrosinradikals Y122• in R2 E. coli vergrößerte die Distanz zwischen dem Sauer-stoff am Y122• und dem Sauerstoff am Aspartat D87 und somit die Distanz zwischendem Radikal und den Aminosäuren des postulierten Radikaltransferpfades auf über 4Å. Das Radikal Y122• befindet sich in einer hydrophoben Tasche, was die Ursachefür die ungewöhnliche Stabilität des Radikals sein könnte. Es wurde spekuliert, dassdie elektrostatische Abstoßung zwischen dem Sauerstoff am Radikal Y122• und demAspartat D87 die treibende Kraft für die Umorientierung des Radikals Y122• ist.In der Röntgenstruktur von R2F S. typhimurium [18] ist der Abstand zwischen denSauerstoff des reduzierten Tyrosins Y105-OH und dem Sauerstoff am Aspart D67schon 4.7Å, daher ist hier auch die elekrostatische Abstoßung zwischen den beidenSauerstoffen kleiner als in der R2 Untereinheit in E. coli . Ebenso zeigt die Röntgen-struktur das reduzierte Tyrosin Y105-OH in einer hydrophoben Umgebung.Ein sehr interessantes Ergebnis der ESR Spektroskopie der Ribonukleotid Reduktaseaus S. typhimurium ist das Spektrum des Tyrosinradikals Y105• in der gefrorenen Lö-sung des Holoenzymes. Überraschender Weise hat die Präsenz der Untereinheit R1Ekeinen Einfluss auf das Spektrum des Tyrosinradikals und damit auch auf den Dieder-winkel. Die Analyse der Hochfeld Einkristall ESR Spektren ist ein hochinteressantesProjekt für die Zukunft.


60

30

0

3.34 3.345 3.35 3.355 3.36

deg.

B [T]

2.00182.0108 2.0078 2.0048

g_x g_y g_z

R1E/R2F

R2F

Abbildung 3.9: 94 GHz ESR 60◦ Rotationsmuster von R1E/R2F(blau) und 94 GHz

ESR Spektrum der gefrorenen Lösung R1E/R2F (blau, oberste Spur) mit Simulation

(rot); Messbedingungen: Mikrowellenfrequenz 94 GHz, Mikrowellenleistung 0.15 µW,

Modulationsfrequnenz 10 kHz, Modulationsamplitude 0.25 mT, Temperatur 40K, Ak-

kumulationszeit pro Orientierung: 45min


Y105

L63

D67

H101

H195

E98

E192

F166

E158

Abbildung 3.10: Das zweikernige Eisenzentrum aus R2F S. typhimurium mit

den Eisenliganden und dem reduzierten Tyrosin Y105-OH [18]. Gemessene g-

Tensororientierung des Radikals Y105• in grün


3.3 Spektroskopische Charakterisierung verschiedener

Oxidationszustände des zweikernigen Eisenzentrums

Im folgenden Abschnitt werden Ribonukleotid Reduktasen untersucht, die kein Tyro-sinradikalsignal aufweisen. Es wird gezeigt, dass es mittels 57Fe ENDOR möglich ist,den Oxidationszustand des zweikernigen Eisenzentrums in der Ribonukleotid Reduk-tase zu bestimmen.

3.3.1 Das Zentrum “X” in Chlamydia trachomatis

Vor einigen Jahren wurde eine neue Variante der Klasse I Ribonukleotid Redukta-se Enzyme im Krankheitserreger C. trachomatis entdeckt [54, 160–162]. Wie die gutcharakterisierte RNR aus E. coli besteht das Enzym aus C. trachomatis aus zwei homo-dimeren Untereinheit R1 und R2. Die Röntgenstruktur [54] von C. trachomatis zeigteinige Unterschiede zu den bisher beobachteten Klasse I Molekülen. Das zweikernigeEisenzentrum von C. trachomatis ist von zwei Histidinen und vier Glutamaten koor-diniert im Gegensatz zu den zwei Histidinen, drei Glutamaten und dem einen Aspartatin E. coli [107]. Ebenso ungewöhnlich sind die zwei verbrückenden Hydroxide undein terminales Wasser am Eisen 1 (siehe Abbildung 3.11, [54]) im Gegensatz zu dereinen µ-oxo Brücke der anderen Klasse I Enzyme [107]. Diese Struktur ist ähnlich deroxidierten Methane Monooxygenase, welche ebenfalls zwei verbrückende Hydroxideund kein ligandiertes Aspartat aufweist ( [163] und Referenzen darin).Der größte Unterschied ist allerdings das Fehlen des Tyrosins. Diese Position ist bei

C. trachomatis durch ein Phenylalanin besetzt. Das dem Eisenzentrum nächstgelege-ne Tyrosin ist an Position 129 und zeigt zur Außenseite des Proteins, was ein sehrungewöhnlicher Platz für ein stabiles Tyrosin Radikal ist. Einen Vergleich der beidenStrukturen zeigt Abbildung 3.11.Trotz des fehlenden Tyrosinradikals in der Untereinheit R2 gibt es eine Vielzahl vonHinweisen, dass die RNR in C. trachomatis aktiv ist. Chlamydien können keine Deoxy-ribonukleotide importieren [160, 161]. Das komplette Genom von Chlamydia wurdesequenziert und es wurden keine anderen RNR Proteine außer dem beschriebenengefunden. Das Protein zeigt Aktivität in vitro und ist sensitiv gegenüber Harnstoff,einem Radikalquencher [162]. Die für den Substratumsatz bedeutenden Residuen inR1, inklusive den aktiven Cysteinen und die am vorgeschlagenen Radikaltransferpfadbeteiligten Aminosäuren, sind in der Untereinheit R1 von Chlamydia ebenfalls vor-handen [54].

Spektroskopische Charakterisierung verschiedener Oxidationszustände deszweikernigen Eisenzentrums 63

Escherichia coli

Y122

H118

E115

H241

D84E238

E204

H230

Chlamydia trachomatis

Y129

H123

F127

E89

E120

E227

F197

E193

Abbildung 3.11: Das Eisenzentrum mit Liganden in E.coli [107] und C.trachomatis

[54]

Bei der Rekonstitution des apo-Proteins von C. trachomatis mit Eisen und molekula-rem Sauerstoff wurde von [54] eine EPR-aktive Spezies mit einer sehr kurzen Lebens-dauer (Zerfallsrate von 0.2s−1) gefunden, welche vergleichbare spektroskopische Ei-genschaften wie das FeIII-FeIV Intermediate “X” in der Rekonstitutionsreaktion in R2E.coli aufweist [54]. In Kooperation mit N. Voevodskaya und A. Gräslund wurde dieRekonstitution des Eisenzentrums in C. trachomatis WT sowie den Mutanten F127Y


und F129Y durchgeführt. Die ESR aktiven Spezies wurden mittels X-band ESR und57Fe ENDOR charakterisiert. Die Ergebnisse werden im Folgenden dargestellt.

cw-ESR und 57Fe cw-ENDOR an “X” in C. trachomatis

Zur Untersuchung der Spezies “X” wurde die Reaktion von apo-R2 C. trachomatis

mit normaler und 57Fe angereicherter Lösung nach 1-2 s in einem flüssigen Isopen-tan Bad (T=150K) eingefroren. Das X-Band Spektrum der so erhaltenen Spezies “X”zeigt eine unaufgelöste Linie mit einer Linienbreite von 1.8 mT ohne jegliche Hy-perfeinauflösung bei einem isotropen g-Wert von 1.9980 (siehe Abbildung 3.12). Au-ßerdem lässt sich eine Aufspaltung des 57Fe angereicherten Spektrums analog zu denfrüheren Beobachtungen für Intermediat “X” in R2 E. coli [40, 164] und in C. tracho-

matis [54] beobachten (siehe Abbildung 3.12). Die ESR Spektren für die Mutanten(F127Y und Y192F) waren dabei identisch mit dem WT (nicht abgebildet). Aufgrundder Verbreiterung durch die 1H und 14N Kerne lassen sich die Hyperfeintensoren von57Fe nicht direkt aus der Simulation der ESR Spektren ermitteln. Schon in früheren Ar-beiten [40, 55] wurde gezeigt, dass 57Fe ENDOR eine geeignete Methode ist, um dieh f -Tensoren und den Oxidationszustand von 57Fe zu bestimmen. Nach der ENDORResonanzbedingung (siehe auch Kapitel 2.2)

νENDOR = |νn ±A j/2| (3.4)

erscheinen die ENDOR-Linien für einen Spin 12 Kern als Paare mit dem Abstand der

Kern Zeemann Frequenz νn um die halbe Hyperfeinkopplung oder symmetrisch umdie Kern Zeemann Frequenz, je nachdem welches der größere Wert ist. Bei moderaterg-Anisotropie wie für das Intermediat “X” (gx = 2.007,gy = 1.999,gz = 1.994 [40]),was man an der isotropen Linienform sehen kann (Abbildung 3.12), und moderater Hy-perfeinanisotropie tragen alle molekularen Orientierungen zum ENDOR Experimentbei und man erhält ein typisches Pulverspektrum der Kernresonanzen.Die ENDOR Spektren für die normale und 57Fe angereicherte WT-Probe von R2C. trachomatis zeigt Abbildung 3.13. Aufgrund der bekannten Kernfrequenzen lassensich die Linien in Abbildung 3.13 um 5-8 MHz eindeutig 14N Kernen und die sym-metrischen Linien zwischen 9-19 MHz eindeutig 1H Kernen zuordnen. Ein Vergleichder beiden Spektren in Abbildung 3.13 zeigt 57Fe ENDOR Linien von zwei Kernen.Eine Gruppe von 57Fe Linien ist klar getrennt vom Rest des Spektrums im Bereichum 36 MHz. Nach Gleichung 3.4 erwartet man hier drei Paare von Linien für die dreiHyperfeintensorkomponenten, wobei jedes Paar eine Aufspaltung von cirka 0.9 MHz(die Kern Zeemann Frequenz für 57Fe) aufweisen sollte. 5 Linien sind im ENDORSpektrum klar aufgelöst. Der zweite 57Fe Tensor liegt im Bereich zwischen 14 und 19


B [mT]

56 Fe

56 Fe

57 Fe

57 FeE.coli

C.trachomatis

328 330 332 334 336 338 340 342 344

Abbildung 3.12: 9.4GHz ESR Spektren der FeIII-FeIV -Zentren “X” aus E. coli (grün)

und C. trachomatis (blau) nach Rekonstitution mit normaler (56Fe) und 57Fe ange-

reicherter FeII-Lösung, Mikrowellenleistung 0.2mW, Modulation 0.2mT, Modulations-

frequenz 12.5kHz, 30K, E. coli ”X” aus [164], Simulation (rot) für eine 90% 57Fe

Anreicherung

MHz und ist nur durch den Vergleich mit der 56Fe Probe klar zu erkennen (Abbildung3.13).Die Hyperfeinwerte für die beiden ENDOR Spektren können durch eine Simulationder 57Fe Tensoren eindeutig bestimmt werden. Abbildung 3.14 zeigt die 57Fe ENDORSpektren von “X” aus C. trachomatis WT, F127Y, Y129F und E. coli Y122F mit ihrenzugehörigen Simulationen im Vergleich. Die aus den Simulationen ermittelten Hyper-feinwerte zeigt Tabelle 3.5.

Die Vorzeichen der Komponenten des größeren h f -Tensors und die Werte für den klei-neren 57Fe h f -Tensor basieren auf der kombinierten Q-Band ENDOR und MössbauerSpektroskopie Arbeit von Sturgeon et al. [40] für das Intermediat “X” in der E. co-

li Mutante R2-Y122F. Der Vergleich der 56Fe und 57Fe ENDOR Spektren zeigt hiernur eindeutig, dass die größte Komponente des kleineren 57Fe Tensors einen Wert von36.8 MHz hat. Im Vergleich zu [40] wurde eine leichte Rhombizität des kleineren 57FeTensors eingeführt, um der geringen Intensität und dem flachen negativen Plateau imBereich von 14-19 MHz Rechnung zu tragen.


Fe257

H1

[MHz]

Fe157

N14

0 10 20 30 40 50

Abbildung 3.13: 9.1 GHz ENDOR Spektren von “X” aus C. trachomatis nach Rekon-

stitution mit normaler (56Fe) und 57Fe angereicherter FeII-Lösung, Mikrowellenlei-

stung 5 mW, Modulationsfrequenz 12.5 kHz, Modulationsamplitude ± 100 kHz, 20K,

jeweils 4h Akkumulationszeit

Protein A11, A22, A33 in [MHz]

C.trachomatis WT Fe1 -74.75(5) -71.70(5) -73.45(5)

Fe2 27.5 37.0(5) 35(1)

C.trachomatis Y129F Fe1 -74.75(5) -71.70(5) -73.45(5)

Fe2 27.5 37.0(5) 35(1)

C.trachomatis F127Y Fe1 -74.80(5) -71.80(5) -73.70(5)

Fe2 27.5 37(5) 35(1)

E.coli WT FeIII -74.75(5) -71.70(5) -73.65(5)

FeIV 27.5 38.1(5) 36(1)

Tabelle 3.5: Hyperfeinwerte der beiden 57Fe Tensoren aus den Simulationen mit easy-

spin [165], Vorzeichen des großen Hyperfeintensors und Werte des kleineren Fe-

Tensors basierend auf [40]


[MHz]

E.coli Y122F

C.tm. F127Y

C.tm. Y129F

C.tm. WT

10 15 20 25 30 35 40 45 50 5

Abbildung 3.14: 9.1 GHz 57Fe ENDOR Spektren (blau) von “X” aus C. trachomatis

WT, F127Y, Y129F und E. coli Y122F (grün), Mikrowellenleistung 5 mW, Modulations-

frequenz 12.5 kHz, Modulationsamplitude ±100 kHz, 4h Akkumulation, E. coli Y122F

aus [164], Simulationen mit easyspin [165] (rot), simulierte h f -Tensoren in Tabelle

3.5


Diskussion der Eisenoxidationszustände und funktionelle Folgerungen für C. tra-

chomatis

Beide 57Fe-Tensoren lassen sich eindeutig einem gemischt valenten FeIII-FeIV Zu-stand zuordnen. Ausgehend von einem Spinkopplungsmodell wie in Abbildung 3.15,d.h. ein FeIII mit einem Spin von 5

2 und einem FeIV mit einem Spin von 2, erhältman bei antiferromagnetischer Kopplung einen Gesamtspin von 1

2 . Nach [40,166] und

O

Fe III Fe IV

S=1/2

S(1)=5/2 (Fe III)

S(2)=2 (Fe IV)

Abbildung 3.15: Kopplungsmodell für einen FeIII -FeIV Zustand

Referenzen darin sind die h f -Tensoren der gekoppelten 57Fe-Ionen (Aiso) mit den int-rinsischen h f -Tensoren (aiso) der ungekoppelten 57Fe-Ionen, z.B. in einem einkernigenKomplex, über die folgenden Spinprojektionsfaktoren verknüpft (siehe Kapitel 2.1.3):

Aiso(FeIII) =73

aiso(FeIII)

Aiso(FeIV ) = −43

aiso(FeIV ) (3.5)

wobei Aiso = (A11 +A22 +A33)/3 und aiso = (a11 +a22 +a33)/3. Berechnet man nundie intrinsischen Hyperfeinkopplungen aus dem isotropen Teil der 57Fe h f -Tensoren,erhält man intrinsische Kopplungen von aiso(FeIII) = −31.4 MHz und aiso(FeIV ) =

−24.8 MHz, was in sehr guter Übereinstimmung mit den Daten aus [40,166,167] vonaiso = −28 bis −30 MHz für ein FeIII [167] und aiso = −23.2 MHz für ein FeIV [40]ist. Ebenso weist die größere Anisotropie des kleineren 57Fe-Tensors auf einen FeIV -Zustand hin [40].Der Vergleich der 57Fe ENDOR Spektren zeigt auch, dass die Spektren vom WT undden Mutanten Y129F und F127Y C. trachomatis praktisch identisch sind und sehr gutmit dem 57Fe ENDOR Spektrum des Intermediates “X” E. coli übereinstimmen. Dieh f -Tensoren für die Proben aus C. trachomatis stimmen im Rahmen der Fehler prak-tisch überein, während sich für die Komponenten A22 und A33 des Intermediates “X”


E. coli marginale Unterschiede zeigen. Dies zeigt, dass das Intermediat in C. tracho-

matis ein FeIII-FeIV -Zentrum wie das Intermediat “X” E. coli ist. Beide FeIII-FeIV -Zentren müssen eine nahezu identische Ligandenstruktur besitzen, da die h f -Tensorender 57Fe-Ionen empfindlich gegenüber strukturellen Veränderungen in der Umgebungder Eisen sind.Die mechanistischen Modelle für das Intermediat “X” schlagen eine doppelte Sauer-stoffverbrückung für das zweikernige Eisenzentrum analog zu synthetisierten Modell-komplexen [149,168] vor. Im Modell des Intermediates “X” kommt ein verbrückenderSauerstoff aus der Reaktion des Eisenzentrums mit molekularem Sauerstoff und derzweite verbrückende Sauerstoff vom Glutamat an der Position 238. Die Sauerstoff-brücke aus dem Glutamat geht im FeIII-Fe Zustand wieder verloren [149]. Aufgrundder Analogie der experimentellen Spektren wird hier ebenfalls ein doppelt sauerstoff-verbrücktes Eisenzentrum für das Intermediate “X” in C. trachomatis vorgeschlagen.Da die Mutation F127Y C. trachomatis fähig wäre aus dem Intermediat “X” analogzum Intermediat “X” in E. coli ein stabiles Tyrosinradikal zu bilden, es aber nichttut und trotzdem katalytische Aktivität zeigt, liegt die Vermutung nahe, dass hier dasFeIII-FeIV Intermediat “X” am Radikaltransfer beteiligt ist. Die Tatsache, dass das In-termediate “X” hier aktiv am Radikaltransfer teilnimmt, legt die Vermutung nahe, dassdies auch in der Radikaltransfer Reaktion der anderer Klasse Ia RNR der Fall seinkönnte, auch wenn dort der Radikalcharakter vor dem Transfer am Tyrosin stabilisiertist.

3.3.2 Das Zentrum “Z” in R2-F208Y E. coli

Die Untersuchung von Mutanten und das Abfangen von paramagnetischen Zwischen-zuständen der Rekonstitutionsreaktion des apo-Proteins mit FeII und molekularemSauerstoff ist von großem Intresse für das Verständnis der Redoxchemie und der funk-tionellen Fähigkeiten des zweikernigen Eisenzentrums. So lässt sich durch die ziel-gerichtete Mutation des Tyrosins Y122 prüfen, ob ein anderes Aminosäureradikal indiesem Residum die Funktion des Tyrosinradikals Y122• übernehmen kann, oder obdas Wegfallen des normalen Ziels der Oxidation durch das zweikernige Eisenzentrumzu einem chemisch anderen Verhalten des Proteins führt. Auf diese Weise könnte esgelingen, die Funktion von Proteinen mit vergleichbaren zweikernigen Eisenzentrenwie die Methan Monooxygenase zu verstehen, wo das zweikernige Eisenzentrum ähn-lich koordiniert ist. Dort spielt es eine völlig andere biologische Rolle. In der MethanMonooxygenase ist das zweikernige Eisenzentrum an der substratbindenden Seite unddirekt verantwortlich für die Hydroxilierung des Methans.


E204

R2−Y122H

H118H241

E204

R2−F208Y

Y122

D84

E238

E115

Dopa

F208

H241H118

H122D84

E238

E115

Abbildung 3.16: Vergleich der Eisenzentren und Umgebung für die Mutanten R2-

Y122H [56] und R2-F208Y [27] E. coli

Bisher wurden einige Y122 Mutationen untersucht. In R2-Y122F wurde eine erhöhteLebenszeit des Intermediates “X” beobachtet, welchem transiente Tryptophanradikalean der Stelle W111 und W107 folgen [46,51,132]. Im R2 Protein der Maus führte dieMutation Y177W (Y177 in R2 Maus entspricht Y122 in R2 E. coli ) zu einem stabilenTryptophanradikal im Residuum W177 [47, 132]. In der Mutante R2-Y122H wurdedas aktive Tyrosin durch ein Histidin ersetzt. In dieser Mutante bildete sich das para-


magnetische Zentrum “H”, welches 2000 erstmalig beobachtet wurde [55] und späterals gekoppeltes FeIII-FeIII-Radikal Zentrum charakterisiert wurde [56]. Der Radikal-charakter wurde auf dem oxidierten Phenylalanin im Residuum 208 lokalisiert [56].So können offensichtlich schon kleinere strukturelle Änderungen in der Umgebungdes zweikernigen Eisenzentrums die Sauerstoffreaktion umlenken und andere aroma-tische Aminosäuren oxidieren.Zur weiteren Prüfung der Radikalbildung an der Position 208 wurde die Mutante R2-F208Y untersucht, wo eben jenes Phenylalanin durch ein leicht zu radikalisierendesTyrosin ersetzt wurde. Die Röntgenstruktur dieser Mutante zeigt eine Doppeloxidati-on des Tyrosins an der Position 208 zur sogenannten “Dopa”-Form. Ein geringer An-teil des Proteins (ca. 3-5%) ist im paramagnetischen Zustand “Z”. Für “Z” wurde einOxo-Ferryl Zentrum vorgeschlagen [138], was sich möglicherweise im Gleichgewichtmit einem Radikal Y208• befinden sollte. Allerdings wurde in [138] kein signifikanter57Fe Effekt beobachtet, der diese Beschreibung unterstützen würde.Im nun folgenden Abschnitt wird eine detaillierte Charakterisierung des Zentrums “Z”mittels ESR, 1H und 57Fe ENDOR vorgenommen. Ebenso wird der Radikalcharak-ter hier im Residuum 208 lokalisiert werden. Für diese Untersuchungen wurden dieaus der AG Sjöberg erhaltenen E. coli Stämme von R2-F208Y unter Mitarbeit vonC. Schulz selbst angezogen und aufgereinigt. Das 57Fe angereicherte Protein wurdeaus einer Anzucht im Minimalmedium unter Ausschluss aller Eisenquellen und unterZugabe von 57FeIII-Cl3 präpariert (siehe Kapitel 2.3).

cw-ESR und cw-ENDOR am Zentrum “Z” R2-F208Y E.coli

Nach der Expression und Aufreinigung der Mutante nach [105] können in der Mu-tante R2-F208Y drei verschiedene paramagnetische Spezies detektiert werden. Zumeinen die schon früher beobachtete Spezies “Z” in 3-5% des Proteins und zum ande-ren das typische Tyrosinradikal Y122• und ein breites schon im X-Band aufgelöstesrhombisches Signal. Das Tyrosinsignal hat die geringste Ausbeute und ist in der Grö-ßenordung des restlichen Wildtyp Proteins, dass der E. coli Stamm ebenfalls mit ca.1% expremiert. Dieses Signal kann mit Hilfe von Harnstoff unterdrückt werden, ohnedie anderen beiden Signale zu beeinflussen. Das breite rhombische Signal gehört zumEisenzentrum im FeII-FeIII-Zustand und wurde ähnlich schon früher in dem R2 Proteinder Maus unter leicht reduzierenden Bedingungen beobachtet [169]. Dieses bekannteSignal war nicht Gegenstand der Untersuchung und wurde durch Oxidation mit Was-serstoffperoxid unterdrückt.Das X-Band Spektrum der Spezies “Z” zeigt Abbildung 3.17. Die 56Fe Mutante zeigtein symmetrisches und unaufgelöstes ESR-Signal von 0.24mT Linienbreite. Bei der


57Fe markierten Probe ist eine klare Verbreiterung zu sehen, aber nicht die charak-teristische Aufspaltung des 57Fe markierten Intermediates “X”. Die 56Fe als auch die57Fe markierten Proben des Zentrums “H” in R2-Y122H weisen identische ESR Spek-tren wie das Zentrum “Z” in R2-F208Y auf. Die charakteristische Verbreitung durchdas 57Fe Labeling zeigt, dass es eine signifikante Spindichte am Eisenzentrum gebenmuss. Im 94GHz ESR Spektrum des Zentrums “Z” sieht man alle drei Komponentendes g-Tensors in guter Auflösung (Abbildung 3.18). Das Spektrum konnte mit einerisotropen Linienbreite simuliert und die g-Komponenten bestimmt werden (siehe Ta-belle 3.6). Auch hier zeigt die 57Fe Probe eine klare Verbreiterung auf allen g-Werten.Ein Vergleich mit dem Zentrum “H” (Abbildung 3.18) zeigt wieder eine sehr guteÜbereinstimmung bis auf eine kleine Veränderung des gz-Wertes. Die g-Werte aus derSimulation sind zusammen mit den g-Werten des FeII-FeIII-Zustands aus R2-F208YE. coli und R2 der Maus, dem Intermediat “X” und dem Zentrum “H” in Tabelle 3.6angegeben.Um eine klare Aussage über den Oxidationszustand des Eisenzentrums (entwederFeIII-FeIV wie im Intermediat “X” oder FeIII-FeIII-Radikal wie Zentrum “H” [56])zu erhalten, wurde wieder das 57Fe Spektrum gemessen und simuliert (siehe Abbil-dung 3.19). Hier sieht man deutlich zwei Gruppen von 57Fe ENDOR Linien um 25MHz und um 35 MHz, die erst in der 57Fe-Probe auftauchen (ENDOR der 56Fe nichtabgebildet). Ebenso sieht man in beiden ENDOR Spektren Resonanzen von 14N- und1H-Kernen, wobei hier die Resonanzpositionen für die beiden Zentren sichtbar über-einstimmen. Die Simulation der 57Fe ENDOR Spektren ergab alle drei Komponentender beiden h f -Tensoren. Die erhaltenen Werte für R2-F208Y stimmen sehr gut mit denWerten von R2-Y122H überein (siehe auch Tabelle 3.6).


57Fe

57Fe

R2−Y122F

56Fe

R2−Y122F

R2−Y122H

R2−Y122H

57Fe

R2−F208Y

56Fe

R2−F208Y

57Fe

"X"

"H"

"Z"

a

b

c

d

e

f

[G] 3280 3360 3400 3440 3320

Abbildung 3.17: Vergleich der X-band ESR Spektren des Intermediates “X” E. co-

li [164], Zentrum “H” [55] und dem Zentrum “Z”, Mikrowellenleistung 0.004mW,

Modulationsfrequenz 12.5 kHz, Modulationsamplitude 0.5mT, 8K


Paramagnetisches Zentrum g-Tensor 57Fe Hyperfeintensor [MHz]

Zentrum “H” in R2-Y122H 2.0088(2) 72.5(1) 52.1(1)

hier und [56] 2.0042(2) 69.9(1) Fe2 47.4(1) Fe1

1.9965(2) 66.6(1) 45.2(1)

Zentrum “Z” in R2-F208Y 2.0088(2) 74.7(1) 51.7(1)

2.0042(2) 70.1(1) Fe2 49.0(1) Fe1

1.9954(2) 66.4(1) 44.5(1)

Zentrum “X” in R2-Y122F 2.007 -74.75(5) 27.5

1.999 -71.70(5) FeIII 38.5(5) FeIV

1.994 -73.65(5) 36(1)

FeII/FeIII Zentrum in M. 1.95 62 36

capsulatus MMO + 1.87 68 FeIII 38 FeII

dimethyl sulfoxide [170] 1.82 76 <20

FeII/FeIII Zentrum 1.93

E. coli [56] 1.84

1.80

FeII/FeIII Zentrum in 1.990(1)

R2-F208Y 1.675(1)

1.495(1)

Tabelle 3.6: g- und h f -Tensoren für “Z” in R2-F208Y und “H” in R2-Y122H

im Vergleich mit FeIII/FeIV -Zentrum E. coli und FeII/FeIII-Zentren in E. coli und

M.capsulatus, Werte in Klammern geben die jeweiligen Fehler an


B [T]

"H"

"Z"

3.39 3.32 3.33 3.34 3.35 3.36 3.37 3.38

Abbildung 3.18: Vergleich der 94 GHz ESR Spektren des Zentrums “H” in R2-Y122H

[55](grün), dem Zentrum “Z” in R2-F208Y (blau, überlagert von Spuren von unspe-

zifisch gebundenen Mn2+ (die 6 schmalen Linien mit sich ändernder Linienform)) und

Simulation (rot), Mikrowellenfrequenz 94 GHz, Mikrowellenleistung 0.5mW, Modula-

tionsfrequenz 12.5 kHz, Modulationsamplitude 0.5mT, 20K


[MHz]

N

HFe1 Fe214

1

57 57

"H"

"Z"

5 10 15 20 25 30 35 40

Abbildung 3.19: Vergleich der 57Fe-ENDOR Spektren des Zentrums “H” [55] (grün)

und des Zentrums “Z” (blau), Mikrowellenfrequenz 9.1 GHz, Mikrowellenleistung

10mW, Modulationsfrequenz 12.5 kHz, Modulationsamplitude ±100kHz, RF Leistung

100W, 8K, Akkumulationszeit 2.5h, Simulationen (rot) mit easyspin [165], erhaltene

h f -Tensoren siehe Tabelle 3.6


Diskussion der Eisenoxidationszustände und Identifiaktion des gekoppelten Ra-dikals

Vergleicht man die h f -Tensoren der beiden 57Fe-Ionen in den Zentren “H” in R2-Y122H und “Z” in R2-F208Y mit den beiden h f -Tensoren der beiden 57Fe-Ionen imIntermediate “X” in E. coli und C. trachomatis (siehe letzter Abschnitt), stellt manfest, dass der h f -Tensor des FeIII im Intermediat “X” vergleichbare Werte aufweist,während der h f -Tensor des FeIV im Intermediate “X” axial statt rhombisch ist undeinen deutlich kleineren isotropen Wert (Aiso=33.5MHz in “X” und Aiso=48.4MHzbzw. 70.4MHz in “Z”) aufweist. Das Zentrum “H” wurde bereits eindeutig als gekop-peltes FeIII-FeIII-Radikal System nachgewiesen [56]. Aufgrund der guten Überein-stimmung der h f -Tensoren für das Zentrum “Z” in R2-F208Y und “H” in R2-Y122Hwird hier das gleiche Spinkopplungsmodell wie für das Zentrum “H” angewendet [56]:

S(2,3)= 2 or 3

S=1/2

S(1)=5/2 (Fe III)

S(2)=5/2 (Fe III)

S(3)=1/2 (R*)

R*O

Fe III Fe III

Abbildung 3.20: Kopplungsmodell für einen FeIII-FeIII-Radikal Zustand

Das Radikal koppelt zunächst an ein FeIII zu einem intermediären Spin S(2,3) von 2(antiferromagnetisch) oder 3 (ferromagnetisch)und dieser resultierende Spin koppeltdas zweite FeIII. Für diesen Fall ergeben sich folgende Beziehungen zwischen dengemessenen Hyperfeintensoren und den intrinsischen Hyperfeintensoren (siehe auchKapitel 2.1.3):bei S(2,3)=2:

Aiso(FeIII) =73

aiso(FeIII);Aiso(FeIII) = −149

aiso(FeIII);Aiso(R) =29

aiso(R) (3.6)

bei S(2,3)=3:

Aiso(FeIII) = −53

aiso(FeIII);Aiso(FeIII) =209

aiso(FeIII);Aiso(R) =29

aiso(R) (3.7)


Dies führt im ersten Kopplungsfall zu intrinsischen Kopplungen von aiso(FeIII) = 30.2MHz und 31 MHz bzw. im zweiten Kopplungsfall zu intrinsischen Kopplungen vonaiso(FeIII) = 28.9MHz und 31.7 MHz. D.h. beide Fälle stimmen sehr gut mit denzuvor zitierten Werten für ein FeIII von 28-30 MHz [40, 166, 167] überein und dasZentrum “Z” ist ebenso wie Zentrum “H” als gekoppeltes FeIII-FeIII-Radikal Zentrumzu beschreiben. Das Radikal wurde im Zentrum “H” als oxidiertes Phenylalanin an derStelle 208 postuliert und nachgewiesen [56]. Daher liegt die Vermutung nahe, dass derRadikalcharakter im Zentrum “Z” R2-F208Y ebenfalls am Tyrosin im Residuum 208lokalisiert ist. Diese Hypothese lässt sich durch die Analyse des 1H ENDOR Spek-trums prüfen.Nach [84] lässt sich der anisotrope Anteil der Hyperfeinkopplung eines Protons imFalle eines lokalisierten Elektronenspins mit einem einfachen Punkt-Dipol Modell aus-rechnen.

A(θ) =µ0

4πhgeβegnβn

ρr3 (3cos2 θ−1) (3.8)

wobei r der Abstand zwischen Elektron und Proton, ρ die Spindichte und θ der Win-kel zwischen Elektron-Proton-Verbindungsvektor und dem Magnetfeld ist. Dies führtzu axialen Tensoren mit den Hauptwerten A11,22 bei θ = π

2 und A33 = 0. Nach [171]und Referenzen darin lässt sich dieses Modell im Fall dreier gekoppelter magnetischerKerne erweitern. Aus der Linearkombination (siehe auch Kapitel 2.1):

ASN = c1A1 + c2A2 (3.9)

der beiden dipolaren Hyperfeintensoren A1 (Kopplung zum FeIII1 ) und A2 (Kopplung

zum FeIII2 ) in einem gemeinsamen Achsensystem zum Hyperfeintensor AS

N des gekop-pelten Spinsystems H = INAS

NSeff, wobei ci die Spinprojektionsfaktoren sind, lassensich die einzelen Komponenten des Hyperfeintensors AS

N unter Ausnutzung der Sy-stemsymmetrie wie folgt berechnen [171]:

ASN =

µ0

4πhgeβegnβn[−δ;−Γ+δ/2;Γ+δ/2]

δ = c1r−31 + c2r−3

2 ;

Γ =32

√

c21r−6

1 +2c1c2r−31 r−3

2 cos2φ+ c22r−6

2 (3.10)

Für die Bestimmung der Abstände und Winkel für die Berechnung der dipolaren Kopp-lungen durch das erweiterte Punkt-Dipol Modell wurde die Röntgenstruktur der Mu-tante R2-F208Y benutzt [27]. Aufgrund der starken Kopplung des Radikals an dasFeIII-FeIII-Zentrum wird sowohl für das Zentrum “H” in R2-Y122H als auch für das


Abbildung 3.21: Definition der Parameter für das erweiterte Dipol Modell einer Kopp-

lung an zwei elektronische Spinzentren

Zentrum “Z” in R2-F208Y eine Ligandierung zum FeIII angenommen. Für diese Li-gandierung liefert die Röntgenstruktur von R2-F208Y das beste Strukturmodell. DieRöntgenstruktur zeigt das an das Eisen ligandierte Dopa (der zweite Pfad der Oxidati-onsreaktion, siehe vorn).Basierend auf dieser Struktur wurden für das Zentrum “Z” an das Tyrosin 208 und diebeiden an die Eisen ligandierten Histidine Protonen durch das Programm Molden [172]ergänzt. Für die Protonen an den Histidinen (siehe Abbildung 3.22, rot markiert) wur-den mit dem erweiterten Punkt-Dipol Modell die h f -Tensoren nach der Gleichung3.10 berechnet. Für das Tyrosin 208 wurden die bekannten h f -Tensoren für die Ring-protonen an den Positionen 2, 3, 5 und 6 aus Kapitel 3.1., [107] und [142] mit demSpinprojektionsfaktor 2

9 für das Radikal im Spinsystem FeIII-FeIII-Radikal skaliert.Zu diesen h f -Tensoren wurden danach die anisotropen Anteile aus dem erweitertenPunkt-Dipol Modell addiert. Das verwendete Strukturmodell zeigt Abbildung 3.22.Die daraus berechneten Werte sind mit den in der Simulation verwandten Werte in Ta-belle 3.7 aufgeführt.Ganz analog wurde mit der Simulation für das Zentrum “H” verfahren. Aus der Rönt-genstruktur der Mutante R2-Y122H [56] wurden die Abstände und Winkel für dieProtonen der Histidine bestimmt und damit die anisotropen h f -Tensoren berechnet.Da das Radikal hier am oxidierten Phenylalanin 208 sitzen soll, ist hier sicherlich einegrössere Umorientierung des Phenylalanins nötig, so dass für das Radikal die gleichenh f -Tensoren wie für das an das FeIII ligandierte Tyrosin des Zentrums “Z” benutzt


H118 H241

Y208

Fe Fe

H5

H3

H2

H6β2

β1

H2

H1

β2

H2

H1

H5

β2

β1

β1

H5

Abbildung 3.22: Das Strukturmodell für die gekoppelte Radikal-FeIII-FeIII-Spezies ba-

sierend auf der Röntgenstruktur von R2-F208Y mit dem doppelt oxdierten, ligandierte

Dopa [27], die Protonen für die, die anisotropen h f -Tensoren mit dem erweiterten

Punkt-Dipol Modell berechnet wurden, sind mit roten Kreisen markiert

wurden.Die 1H-ENDOR Spektren des Zentrums “Z”, des Zentrums “H” und die Simulationenzeigt Abbildung 3.23. Dabei zeigt die Simulation eine erstaunlich gute Übereinstim-mung mit den experimentellen Spektren für beide Zentren. Sichtbar sind für beideZentren die Resonanzpositionen im 1H-ENDOR Spektrum getroffen. Für die Güte derSimulation ist die Linienposition ausschlaggebend, da die Intensitäten durch unter-schiedliche Messtemperaturen und Relaxationen beeinflusst werden. Die in der Si-mulation sichtbaren Resonanzen der größten Kopplungen der Protonen H3-Y208 undH2-H241 sind im Experiment nicht klar aufzulösen, was an einer möglichen Verbrei-


[MHz]

"Z"

"H"

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Abbildung 3.23: 1H-ENDOR Spektrum des Zentrums “H” (grün) aus [56], des Zen-

trums “Z” (blau) und Simulationen der 1H ENDOR Spektren mit den h f -Tensoren der

Protonen aus Tabelle 3.7(rot), Simulationen mit spleen [113], Mikrowellenfrequenz

9.1 GHz, Mikrowellenleistung 10mW, Modulationsamplitude +/- 70 kHz, RF Leistung

100W, 8K, 2h Akkumulation

terung aufgrund der enormen Anisotropie liegen kann, die bei den kleinen Signalen zueinem Intensitätsverlust in die Größenordnung des Rauschens führen. Trotzdem bleibtfestzuhalten, dass die Simulationen der 1H-ENDOR Spektren ausgezeichnet mit dengemessenen Spektren übereinstimmen, was für die Richtigkeit des Strukturmodells,des Radikalcharakters an einem Tyrosin im Residuum 208, spricht.


amino acid Hyperfeintensoren [MHz]

R2-F208Y R2-Y122H R2-F208Y R2-Y122H

berechnet simuliert

AXX AYY AZZ AXX AYY AZZ AXX AYY AZZ AXX AYY AZZ

H118

H2 +0.1,-5.8,+5.7 +1.2,-9.5,+8.3 +0.1,-5.5,+5.5 +1.7,-9.5,+8.3

H1 +0.2,-1.2,+1.0 +0.3,-1.6,+1.3 +0.2,-1.2,+1.0 +0.3,-1.5,+1.0

H5 -0.1,-0.9,+1.0 +0.4,-1.1,+0.7 -0.1,-0.9,+1.0 +0.4,-1.0,+0.6

β1 +2.5,-5.2,+2.7 +2.3,-4.7,+2.4 +2.1,-5.2,+2.7 +2.0,-4.8,+2.1

β2 +1.9,-3.9,+2.0 +2.5,-5.2,+2.7 +1.7,-3.7,+1.8 +2.3,-5.4,+2.4

H241

H2 -2.8,-6.1,+8.9 -3.1,-7.9,+11.0 -2.8,-6.1,+8.9 -2.5,-7.7,+11.0

H1 -0.8,-1.3,+2.1 -0.8,-1.3,+2.1 -0.8,-1.3,+2.1 -0.6,-1.3,+2.1

H5 -0.9,-1.0,+1.9 -0.9,-1.0,+1.9 -0.9,-1.0,+1.9 -0.7,-0.8,+1.5

β1 -4.0,-4.0,+7.9 -3.6,-3.6,+7.2 -4.2,-4.3,+8.0 -3.8,-4.1,+6.9

β2 -3.9,-4.0,+7.9 -3.9,-4.0,+7.9 -3.7,-3.7,+7.9 -4.0,-4.3,+7.9

Y208

H2 +1.3,-0.5,+2.4 +1.3,-0.5,+2.4 +1.3,-0.5,+2.4

H6 +0.4,+0.4,+2.4 +0.4,+0.4,+2.4 +0.4,+0.4,+2.4

H3 +3.1,-25.3,10.0 +3.5,-25.3,10.0 +3.5,-25.3,10.0

H5 -7.5,-5.5,0.9 -6.8,-5.9,0.9 -6.8,-5.9,0.9

β1 -4.3,-2.3,-2.2 -4.5,-2.1,-2.3

β2 -3.6,-3.4,-1.9 -3.6,-3.5,-1.8

Tabelle 3.7: Die Proton Hyperfeinwerte für das Zentrum “Z” aus R2-F208Y und für

das Zentrum “H” aus R2-Y122H, berechnet aus dem erweiterten Dipol Modell und den

Tyrosin Hyperfeinkopplungen aus [107], [142] und die in der Simulation verwendeten

Werte


3.3.3 Zusammenfassung

In diesem Abschnitt wurde gezeigt, dass mittels 57Fe-ENDOR eindeutig zwischen denverschiedenen Oxidationszuständen des Eisenzentrums unterschieden werden kann.Der FeIII-FeIV -Zustand des Intermediates “X” und der FeIII-FeIII-Radikal Zustandder Zentren “Z” und “H” sind eindeutig zu unterscheiden. Für die beiden FeIII-FeIV -Zustände, den katalytisch aktiven Zustand in C. trachomatis und dem Intermediat “X”in E. coli , konnte aufgrund der großen spektroskopischen Übereinstimmung eine ähn-liche Struktur postuliert werden.Die beiden hier untersuchten Spezies (“X” aus C. trachomatis und “Z” in R2-F208YE. coli ) konnten eindeutig spektroskopisch charakterisiert werden. Ebenfalls konnteder Radikalcharakter in den gekoppelten FeIII-FeIII-Radikal Zentren “Z” und “H” ein-deutig am Tyrosin an der Position 208 lokalisiert werden.Die in diesem Abschnitt durchgeführten Untersuchungen haben außerdem gezeigt,dass bereits minimale Änderungen in der Ligandensphäre des zweikernigen Eisenzen-trums den Reaktionspfad der Radikalgenerierungsreaktion entscheidend beeinflussen.In den Mutanten R2-Y122H und R2-F208Y wird ein zweiter Reaktionspfad geöff-net, der zur Oxidation von F208 und einem ligandierten Radikalsystem FeIII-FeIII-Radikal führt. Die in dieser Reaktion entstehenden gekoppelten FeIII-FeIII-RadikalZentren “Z” und “H” besitzen eine bemerkenswerte Stabilität aber keinerlei kataly-tische Aktivität. Dieser zweite Reaktionspfad, die Bildung der stabilen gekoppeltenRadikal-Eisenzentren, ist also unbedingt zu vermeiden, wenn die eigentliche Funktionder Reaktion, die Bildung des katalytisch aktiven Tyrosinradikals im Residuum 122,erhalten werden soll.

Kapitel 4

Spektroskopische Charakterisierungdes Radikalintermediates in derPyruvat : Ferredoxin Oxidoreduktase

Bei der oxidativen Dekarboxylierung des Pyruvates durch die Pyruvat : FerredoxinOxidoreduktase (PFOR) entsteht Azetyl-Coenzym A (Azetyl-CoA) und CO2. Die Ent-stehung und der Zerfall des Azetyl-Thiamindiphosphat (a-ThDP) Radikalintermedia-tes sind die Schlüsselschritte des Reaktionsmechanismus [58]. Eine ausführliche Dar-stellung des Reaktionsmechanismus wurde in Kapitel 1.2 gegeben.Die elektronische Struktur des a-ThDP Radikalintermediates ist eine offene und in derLiteratur diskutierte Frage [58, 59, 73, 76–78, 173]. Die drei Vorschläge: neutrales π-Radikal mit auf dem Thiazolring delokalisierter Spindichte [73,75], σ-Azetyl-Radikalmit ungepaarter Spindichte auf dem Thiazolring [75–78] und auf dem Azetyl lokali-siertes σ-Kation Radikal [59] werden im Folgenden als π-Neutralradikal (A in Abbil-dung 4.1), σ/π-Kationradikal (B in Abbildung 4.1) und σ Radikal (C in Abbildung4.1) bezeichnet und in Abbildung 4.1 zusammengefasst.ESR- Methoden können genau diese offenen Frage beantworten. Der g-Tensor spiegeltden elektronischen Zustand des Radikals wieder. Hyperfeinkopplungen geben Aus-kunft über die Spindichteverteilung im Radikal. In Zusammenarbeit mit J. Fontecilla-Camps et. al wurde das a-ThDP Radikalintermediat durch die Reaktion von PFORmit Pyruvat ohne CoA generiert und mit Freeze-Quench Methoden stabilisiert (Reak-tion nach Abbildung 1.5, Kapitel 1.2). In diesem Kapitel wird das Radikal mit ESR,Hochfeld ESR und ENDOR an gefrorenen Lösungen und schockgefrorenen Einkristal-len analysiert. Die experimentellen Daten werden in Bezug auf die vorgeschlagenenStrukturen des Radikalintermediates diskutiert. Zur genauen Identifikation der Struktur

85

86Spektroskopische Charakterisierung des Radikalintermediates in der Pyruvat :

Ferredoxin Oxidoreduktase

CH3

H3C H3C

CH2

CS N

R

R

C C

OC

S N

R

R

C C

CO

CHC

S N

R

R

C C

COH

CH3

H3C

H

+

+

3α 3α 3α

2α2α2α

4α 4α4α

22

3

45

11

5 45 4

1 32

B CA

3

Abbildung 4.1: π-Neutralradikal (A), σ/π-Kationradikal mit delokalisierter Spindich-

te (B), σ-Kationradikal mit auf der Azetylgruppe lokalisierter Spindichte (C)

des Radikalintermediates wurden Dichtefunktional Theorie Rechnungen an den vor-geschlagenen Modellstrukturen durchgeführt und mit den experimentellen Resultatenverglichen.

4.1 ESR und ENDOR Untersuchungen des a-ThDP Ra-

dikals in Lösung

Das bei der Reaktion des PFOR Enzyms mit dem Pyruvat entstehende Radikalinter-mediat wurde bisher ausschließlich im X-Band beobachtet [65, 73, 75, 78, 79]. Dasbeobachtete Radikalsignal weist in PFOR von Halobacterium halobium [65], Metha-

nosarcina barkeri [78], Desulfovibrio africanus [79] sowie in Clostridium thermoa-

cetium [75] jeweils die gleichen spektroskopischen Chrakteristika auf. Die Spektrenwerden als g=2.008 zentriertes anisotropes Signal mit einer Peak-to-Peak Breite von1.5-1.8mT mit jeweils gleichem Hyperfeinstrukturmuster beschrieben [75]. Bouchevet al. [75] untersuchte das nach zwei Minuten Reaktionszeit eingefrorene Intermediataus der Reaktion mit protonierten und deuterierten Pyruvat mit ESR und cw-ENDORSpektroskopie. Dadurch konnte eindeutig Spindichte auf am C2α-Atom der Azetyl-gruppe (siehe Nummerierung Abbildung 4.1) nachgewiesen werden. Dieses Ergeb-nis ist konsistent mit der Röntgenstruktur des a-ThDP Radikalintermediates, wo beideSpaltprodukte des Pyruvates (die an das Radikalintermediat gebundene Azetylgruppeund CO2) zu sehen sind. Mit X-Band ENDOR wurden von Bouchev et al. [75] zwei

ESR und ENDOR Untersuchungen des a-ThDP Radikals in Lösung 87

Kopplungen bestimmt, die durch den CD3 Austausch am Pyruvat auf eine rotierendeMethylgruppe zweier strukturell verschiedener Radikalkonformationen zurückgeführtwurden.In diesem Kapitel werden nun gefrorene Lösungen des Radikalintermediats unter-sucht. Die Reaktion des PFOR Enzyms aus Desulfovibrio africanus und Pyruvat wurdenach einer Reaktionszeit von zwei Minuten eingefroren, wobei analog zu [75] proto-niertes und deuteriertes Pyruvat verwendet wurde (siehe auch Kapitel 2.3), was nachdem Mechanismus (Abbildung 1.5, Kapitel 1.2) zu einer protonierten bzw. deuteriertenAzetylgruppe des a-ThDP Radikalintermediates führt (Position C3α Abbildung 4.1).Das X-Band Spektrum Abbildung 4.2 zeigt das charakteristische Spektrum des a-ThDP Radikals, eine anisotrope Linie mit einer Peak-to-Peak Breite von ca 2.0 mTund dem charakteristischen Hyperfeinmuster, wie auch schon zuvor beobachtet [65,73,75,78,79]. Deutlich ist der Unterschied zwischen deuterierter und protonierter Pro-be zu erkennen. Das komplizierte Hyperfeinaufspaltungsmuster ist nicht allein durchzwei Methylgruppen simulierbar.Im 94 GHz Spektrum des protonierten a-ThDP Radikals (Abbildung 4.3) zeigt sich einvoll aufgelöster g-Tensor ohne Hyperfeinauflösung, wobei die gz-Komponente deut-lich gegenüber der gx und gy Komponente verbreitert ist (Abbildung 4.3). Im 94 GHzSpektrum des deuterierten Radikals zeigt sich hier eine deutliche Hyperfeinauflösungauf der gz-Komponente. Diese aufgelöste Triplettstruktur auf gz ist typisch für die Azz-Komponente einer anisotropen Stickstoffkopplung in einem π-Radikal. Aus den 94GHz Spektren können erstmals die g-Tensor Komponenten des a-ThDP-Radikals be-stimmt werden (siehe Tabelle 4.1). Der Vergleich der beiden Proben zeigt eine leichteVerschiebung der g-Werte in beiden Proben, wobei der Unterschied im gx-Wert amgrößten ist. Dies könnte auf leichte strukturelle Unterschiede des Radikalintermedia-tes hindeuten, wie schon in der ENDOR Arbeit von Bouchev et al. [75] angedeutet.Die Verschiebungen sind aber sehr klein und innerhalb des Fehlerrahmens.

Probe gx gy gz

CH3 Azetyl 2.00813 2.00544 2.00229

CD3 Azetyl 2.00795 2.00534 2.00217

Tabelle 4.1: g-Tensorhauptwerte aus der Simulation der 94 GHz Spektren, der Fehler

ist jeweils ±10 in der letzten Stelle

Um die Hyperfeinkopplungen des Radikalintermediates eindeutig zu bestimmen, wur-den zusätzlich zu den ESR Experimenten noch 9.1 GHz und 94 GHz ENDOR Ex-perimente an den gefrorenen Lösungen durchgeführt. In den 9.1 GHz ENDOR der



CD3

CH3

337 338 339 340 341 342 343 344 345B [mT]

Abbildung 4.2: 9.5GHz cw-ESR Spektren des a-ThDP Radikals in gefrorener PFOR-

Lösung mit protonierter CH3 Azetylgruppe (blau) und deuterierter CD3 Azetyl-

gruppe (grün) nebst Simulationen (rot), 80 K, 0.125 mW Mikrowellenleistung,

0.05 mT Modulationsamplitude, 12.5 kHz Modulationsfrequenz, Simulationspara-

meter: CH3: A(β1)=[9.5 0 0;0 5.8 0;0 0 6.8]MHz,A(β2)=[12.0 0 0;0 18.5 0;0

0 14.5]MHz,A(CH3)=[14.8 0 0;0 16.9 0;0 0 11.3]MHz, A(N)=[6.5 0 0;0 8.5

0;0 0 33]MHz, Orientierung(Eulerwinkel)=(7.5◦,-15◦,-6◦), Linienbreite 0.22mT; CD3

A(β1)=[12.5 0 0;0 18.5 0;0 0 14.5]MHz, A(β2) und A(N) analog, Linienbreite 0.28mT

mit 50% Anteil CH3, g-Tensor wie in Tabelle 4.1

protonierten und deuterierten Probe lassen sich jeweils Resonanzen von Protonen und31P Kernen beobachten. Die beobachteten Linien zwischen 20 und 23 MHz sind in La-ge und Form vergleichbar mit dem Spektrum der Probe mit protonierter Azetylgruppeaus [75]. Das 9.1 GHz ENDOR Spektrum der Probe mit der deuterierten Azetylgrup-pe unterscheidet sich vom 9.1 GHz ENDOR Spektrum vor allem durch die einzelneanisotrope Linie bei 3MHz, die der Resonanz eines Deuteriumkerns entspricht. DieseDeuteriumlinie und die Simulation der ESR und ENDOR Spektren erlaubt eine ein-deutige Zuordnung der CH3-Gruppe zur Position C3α der Azetylgruppe des a-ThDPRadikalintermediates, da diese aus der Aufspaltung des Pyruvates in CO2 und Azetylentsteht. Im Unterschied zu [75] sind aber auch im Spektrum der deuterierten Probenoch Resonanzen zwischen 17 und 23 MHz sichtbar. Diese Resonanzen wurden, in


CH3

gx gy gz

CD3

3.34 3.345 3.35 3.355 3.36B [T]

Abbildung 4.3: 94 GHz ESR Spektren des a-ThDP Radikals in gefrorener PFOR-

Lösung mit protonierter CH3 Azetylgruppe (blau), 80 K, 0.126 µW Mikrowellenlei-

stung, 10kHz Modulationsfrequenz und 0.15 mT Modulationsamplitude) und pseu-

domoduliertes p-ESR Spektrum des a-ThDP Radikals mit deuterierter CD3 Aze-

tylgruppe (grün, 20K, pseudomoduliert mit 0.45 mT) nebst Simulationen:CH3:

A(β1)=[10.2 0 0;0 7.9 0;0 0 7.6] MHz, A(β2)=[12.2 0 0;0 18.7 0;0 0 11.8] MHz,

A(CH3)=[14.2 0 0;0 17.3 0;0 0 13.3] MHz, A(N)=[6.5 0 0;0 8.5 0;0 0 33] MHz,

Orientierung(Eulerwinkel)=(7.5◦,-15◦,-6◦), CD3: A(β1)=[9.5 0 0;0 5.8 0;0 0 6.8]

MHz,Linienbreite 0.22mT; CD3 A(β2)=[12.5 0 0;0 18.5 0;0 0 14.5]MHz, A(N) ana-

log, Linienbreite 0.28mT, g-Tensor siehe Tabelle 4.1)

Übereinstimmung mit der Simulation der ESR Spektren der gefrorenen Lösung, zweiβ-Protonen zugeordnet. Aus der Simulation des 9.5 GHz ESR Spektrums lässt sich dieZahl und Multiplizität der h f -Tensoren eindeutig bestimmen. Der Deuterierungsgradder Azetylgruppe wurde aufgrund des H2O-Rücktauschs mit 50% angenommen undzeigt sich auch in der Simulation des ESR Spektrums.Die 94 GHz PENDOR Spektren wurden entlang der g-Tensor Hauptachsen aufgenom-men (äußere Flanken von gx, gz und entlang gy in Abbildung 4.3), so dass die Lage der



Hyperfeintensorachsen relativ zu den g-Tensorachsen bestimmt werden konnte. Diesimulierten h f -Tensoren für die 94 GHz PENDOR Spektren waren vergleichbar mitden aus der Simulation der 9.1 GHz ENDOR Spektren erhaltenen h f -Tensoren. Das 94GHz PENDOR Spektrum der Probe mit deuterierter Azetylgruppe lässt sich mit dengleichen h f -Tensoren wie das 9.1 GHz Spektrum simulieren. Bei der Probe mit derprotonierten Azetylgruppe war dies nicht möglich. Hier ist vor allem der kleinere β-Proton h f -Tensor deutlich zu höheren Werten verschoben, was man gut im Vergleichmit dem 94 GHz PENDOR Spektrum der Probe mit der deuterierten Azetylgruppesieht. Dieser Unterschied in den h f -Tensoren deutet ebenso wie der beobachtete Un-terschied der g-Tensorwerte und die Ergebnisse der ENDOR-Arbeit von Bouchev et

al. [75] auf eine leicht unterschiedliche Konformation des Radikals hin. Die 9.5 GHzProbe mit protonierter Azetylgruppe und die 94 GHz Probe mit protonierter Azetyl-gruppe entstammen jeweils getrennten Präparationen, während die 94 GHz Probe mitdeuterierter Azetylgruppe anaerob aus der 9.5 GHz Probe umgefüllt wurde.Zusammenfassend lassen sich die ESR Spektren mit den, aus den jeweiligen ENDORExperimenten bestimmten, h f -Tensoren simulieren. Der ebenfalls simulierte Stick-stoff h f -Tensor wurde in der Azz-Komponente aus der 94 GHz ESR der deuteriertenProbe bestimmt. Die aus diesen Messungen nicht direkt bestimmbaren Axx und Ayy

Komponenten des Stickstoff h f -Tensors in den ESR Simulationen wurden aus derAnalyse der 94 GHz ESR Messungen am PFOR-Einkristall (siehe folgendes Kapitel)bestimmt.Die Simulation der ESR und ENDOR Spektren ergab alle Hauptwerte der vier h f -Tensoren, wobei die CH3 Kopplung durch die selektive Deuterierung der Methylgrup-pe des Pyruvates eindeutig zugeordnet werden kann. Ebenso können aus der Simu-lation der ENDOR Spektren zwei weitere β-Proton h f -Tensoren bestimmt werden.Aus der Simulation der Multiplizität des Hyperfeinmusters der 9.5 GHz ESR Spektrenund der Simulation der 94 GHz ESR Spektren lässt sich die Zahl der β-Protonen aufzwei festlegen und die große Anisotropie des Stickstofftensors bestimmen. Die Grö-ße des CH3 hf-Tensors impliziert eine große Spindichte am C2α Atom. Daher ist eswahrscheinlich, dass der Stickstoff h f -Tensor zum N3-Atom im Thiazolring und dieβ-Protonen zu den Protonen, der von N3 und C5 abgehenden, Seitenketten gehören(Nummerierung analog Abbildung 4.1). Abbildung 4.6 fasst noch einmal die Positio-nen der Kopplungen zusammen.Der am a-ThDP Radikalintermediat beobachtete große anisotrope Stickstoff h f -Tensorund der rhombische g-Tensor speziell die große Azz-Komponente entlang gz ist auchein charakteristisches Merkmal der ESR Spektren von Nitroxid Spinlabeln mit π-Spindichte am Stickstoff ( [174, 175] und Referenzen darin). Diese Spinlabel sind


planare Radikale, die gx und gy Achsen des g-Tensors sind in der Ringebene und diegz Achse senkrecht zur Ringebene orientiert. Im Fall eines planaren π-Neutralradikalsmüssten also auch die gx und gy Achsen des g-Tensor in der Thiazolring Ebene des a-ThDP Radikals liegen, während die gz Achse senkrecht auf der Ebene des Thiazolringsstehen sollte. Die Orientierung des g-Tensors bezüglich der molekularen Achsen des a-ThDP Radikals wird im folgenden Kapitel mittels Hochfeld Einkristall ESR bestimmt.

Hβ1

Axx,yy,zz [MHz] 9.5(5) 5.8(5) 6.8(5)∗

10.2(5) 7.9(5) 7.6(5)‡

Hβ2

Axx,yy,zz [MHz] 12.5(5) 18.5(5) 14.5(5)∗

12.8(5) 18.7(5) 11.8(5)‡

CH3

Axx,yy,zz [MHz] 14.8(5) 16.9(5) 11.3(5)∗

14.2(5) 17.3(5) 13.3(5)‡

N

Axx,yy,zz [MHz] 6.5(1.5) 8.5(1.5) 33.0(1.0)

Eulerwinkel in ◦ 7.5(1.0) -15.0(1.0) -6.0(1.0)

Tabelle 4.2: Mittelwerte der h f -Tensoren des a-ThDP Radikalintermediates,∗ für die

Probe mit deuterierter Azetylgruppe 9.1 GHz ESR, ENDOR und 94 GHz ESR, PEN-

DOR, die Probe mit protonierter Azetylgruppe 9.1 GHz ESR, ENDOR und Hochfeld

Einkristall-ESR (siehe nächstes Kapitel); ‡ für die zweite Probe mit protonierter Aze-

tylgruppe 94 GHz ESR und PENDOR; Eulerwinkel für Hβ1,Hβ2 und CH3 jeweils

(0◦,0◦,0◦), Postionen: N3,C3αH3,β an von N3 bzw. C5 abgehenden Seitenketten (sie-

he Abbildungen 4.1,4.6)



CH 3

H

P

H

β1 β2

1

2

31

3

CH3

CD

5 10 15 20 25[MHz]

Abbildung 4.4: 9.1 GHz ENDOR Spektren des a-ThDP Radikals in gefrorener PFOR-

Lösung mit protonierter (CH3) Azetylgruppe (blau) und deuterierter (CD3) Azetyl-

gruppe (grün) nebst Simulationen (rot, Parameter Tabelle 4.2), 35 K, 1mW Mi-

krowellenleistung, 12.5kHz Modulationsfrequenz, ±70 kHz Modulationsamplitude,

100 W RF Leistung, Simulationsparameter: CH3: A(β1)=[9.5 0 0;0 5.8 0;0 0 6.8]

MHz,A(β2)=[12.0 0 0;0 18.5 0;0 0 14.5] MHz,A(CH3)=[14.8 0 0;0 16.9 0;0 0 11.3]

MHz; CD3: A(β1)=[12.5 0 0;0 18.5 0;0 0 14.5] MHz, A(β2)=[9.5 0 0;0 5.8 0;0 0 6.8]

MHz, Simulationen mit spleen [113]


CH3

CD3

Hν−ν [MHz]

B || g_x

B || g_y

B || g_z

B || g_x

B || g_y

B || g_z

−10 −5 0 5 10

Abbildung 4.5: 94 GHz PENDOR Spektren des a-ThDP Radikals mit protonierter CH3

Azetylgruppe entlang gx,gy und gz (blau), deuterierter Azetylgruppe entlang gx,gy und

gz (grün) mit Simulationen (rot); 20K, freie Protonenfrequenz bei 3.35T: 142.63 MHz;

CH3: A(β1)=[10.2 0 0;0 7.9 0;0 0 7.6] MHz,A(β2)=[12.2 0 0;0 18.7 0;0 0 11.8]

MHz,A(CH3)=[14.2 0 0;0 17.3 0;0 0 13.3] MHz; CD3 A(β1)=[13.0 0 0;0 18.5 0;0 0

14.5] MHz, A(β2)=[9.5 0 0;0 5.8 0;0 0 6.8] MHz, Simulationen mit spleen [113]



4.2 Die Orientierung des g-Tensors im a-ThDP Radi-

kal

H(β )

H(β )

CH

N

1

2

33α

2α

32

4

1

5

Abbildung 4.6: Die Röntgenstruktur des a-ThDP Radikalintermediates nach [59]. Die

hier vorgeschlagenen Kerne, die zur Hyperfeinstruktur der ESR und ENDOR Spektren

beitragen, sind mit roten Kreisen markiert, Nummerierung analog Abbildung 4.1

Im Jahr 2001 konnte von der Gruppe unseres Kooperationspartners J. Fontecilla-Campset al. das Radikalintermediat im Reaktionszyklus von PFOR und Pyruvat im Einkri-stall erzeugt werden. Die Röntgenstruktur wurde mit einer Auflösung von 1.87 Å ge-löst [59]. Die Radikalausbeute wurde mit 80% angegeben. Abbildung 4.6 zeigt dieStruktur des Radikalintermediates. Die Stuktur zeigt deutliche Abweichungen von derPlanarität des Thiazolrings. In der Darstellung von Abbildung 4.6 erscheint das Schwe-felatom nach unten abgeknickt. Die Bindung zwischen Thiazolring und der Azetyl-gruppe ist mit 1.9 Å ungewöhnlich lang. Aufgrund der strukturellen Daten (unplana-rer Ring) wurde als elektronische Struktur des a-ThDP Radikals ein σ-Radikal mitlokalisierter Spindichte an der Azetylgruppe vorgeschlagen und ein Radikal mit delo-kalisierter Spindichte (neutrales π-Radikal, σ/π-Kationradikal) ausgeschlossen (sieheAbbildung 4.1). Die hier durchgeführten Hochfeld ESR und ENDOR Arbeiten (sie-he letztes Kapitel) legen jedoch ein planares π-Radikal nahe. Die Positionen der imletzten Kapitel vorgeschlagenen Kerne, deren h f -Tensoren zu den ESR und ENDOR

Die Orientierung des g-Tensors im a-ThDP Radikal 95

Spektren beitragen, sind mit roten Kreisen markiert.Um weiteren Aufschluss über den Charakter des Radikals (vor allem die Orientierungdes g-Tensors im Molekül) zu erhalten, wurde nun der Kristall mit dem Radikalinter-mediat von Fontecilla-Camps et al. mittels Hochfeld Einkristall-EPR untersucht.Der Kristall hat die gleiche Raumgruppe P212121 wie der R2 E. coli Kristall (sieheKapitel 3.1) und das Protein ist ebenfalls ein Dimer. In Abbildung 4.7 sind die orien-tierungsabhängigen 94 GHz ESR Spektren für eine volle 180◦ Drehung im Abstandvon 7.5◦ abgebildet. Die Analyse wurde mit den in Kapitel 2.5, 2.6 beschriebenenProgrammen analog zur Analyse der R2 E. coli Einkristalle (Kapitel 3.1) durchge-führt. Die im vorangegangen Kapitel bestimmten Kopplungen wurden eingesetzt undüber einen Fit nochmals bestätigt. Die aus den gefrorenen Lösungsspektren nicht zubestimmenden Axx und Ayy Stickstoffkomponenten wurden über die Analyse der Kri-stallspektren bestimmt. Ebenso wurden die g-Werte nochmal aus dem Rotationsmusterbestimmt (siehe Bildunterschrift 4.7). Die aus der Analyse der Hochfeld Einkristall-ESR bestimmten g- und h f -Tensoren stimmten jeweils im Rahmen der Fehlergrenzenmit den Daten aus der Spektroskopie der gefrorenen Lösung überein.Als wichtigstes Ergebnis wurde die Orientierung des g-Tensors erhalten. Wie die Ab-

gx gy gz

a -0.54723 -0.10029 0.83095

b 0.70586 0.47820 0.52257

c -0.44977 0.87250 -0.19089

Tabelle 4.3: Richtungskonsini der g-Tensor Hauptachsen aus der Simulation der Hoch-

feld Einkristall-ESR Spektren in Bezug zu den kristallografischen Achsen a,b,c; Fehler

der Orientierungen ±1◦

bildungen 4.8 und 4.9 zeigen, ist der g-Tensor in der “Ebene” des verbogenen Ringsorientiert. Die gx-Achse zeigt ungefähr in die Richtung der C2-C2α Bindung zwischendem Thiazolring und der Azetylgruppe. Die gy-Achse liegt in der mittleren Ebenedes verbogenen Rings. Schaut man seitlich aus der Richtung der Azetylgruppe auf dieRingebene, sieht man, dass der Schwefel leicht unterhalb und der Kohlenstoff C5 leichtoberhalb der Ebene aus den restlichen drei Ringatomen liegt. Die gy-Achse kreuzt dieSchwefel-Kohlenstoff (S1-C5) Bindung genau auf der Höhe der anderen drei Ringato-me. Die gz-Achse steht nahezu senkrecht auf der verbogenen Ringebene.



180

90

0

3.343 3.347 3.351 3.355

deg.

B [T]

g_x g_y g_z

2.0090 2.0066 2.0042 2.0018

B

A B

A

B

AB

A

Abbildung 4.7: 180◦ Rotationsmuster des PFOR Kristalls, 94 GHz Spektren (blau) und

Simulationen (rot), gefrorene Lösung ganz oben (blau) nebst Simulation (rot), Messbe-

dingungen: 80K, 0.5µW Mikrowellenleistung, 10 kHz Modulationsfrequenz, 0.15 mT

Modualtionsamplitude, Akkumulationszeit pro Orientierung: 25min; Simulationspara-

meter: hf-Tensoren siehe Tabelle 4.2, g-Tensor Hauptwerte: 2.00808 2.00546 2.00223

Die Orientierung des g-Tensors im a-ThDP Radikal 97

z

x y

Abbildung 4.8: Die Orientierung des g-Tensors aus der Simulation der ESR Spektren

in der Röntgenstruktur schräg von oben gesehen

z

yx

Abbildung 4.9: Die Orientierung des g-Tensors aus der Simulation der ESR Spektren

in der Röntgenstruktur von der Azetylgruppe aus gesehen



4.3 Dichtefunktional Theorie Rechnungen

Für eine eindeutigere Zuordnung der h f -Tensoren zu den Kernen und eine eindeuti-ge Identifikation der elektronischen Struktur des a-ThDP Radikalintermediates als π-Neutralradikal, σ/π Kationradikal mit delokalisierter Spindichte oder σ-Kationradikalmit lokalisierter Spindichte wurden Dichtefunktional Theorie Rechnungen für alle vor-geschlagenen elektronischen Strukturen des Radikalintermediates durchgeführt. Umden Rechenaufwand in einem angemessenen Rahmen zu halten, wurde nur jeweilsdas ThDP Radikal allein berechnet, wobei die von C5 abgehende Phosphatseitenkettedurch eine CCH2CH3-Seitenkette ersetzt wurde.Zur Berechnung wurden jeweils Dichtefunktional Hartree-Fock Hybridmethoden ver-wendet (B3LYP / UB3LYP des Programms Gaussian 03 [124], siehe auch Kapitel 2.7).Alle drei vorgeschlagenen Strukturmodelle wurden in der Konformation der Röntgen-strukturanalyse und als geometrieoptimierte Konformationen gerechnet. Um die bei-den bekannten Wasserstoffbrücken der Röntgenstruktur zu erhalten (vom O der Aze-tylgruppe zum N im Sechserring an N1 und zum R114), wurde für die Geometrieop-timierungen ein zusätzliches Wasser an die Position von R114 eingebracht. Für dieGeometrieoptimierung wurde der 6-31G (2d,2p)-Basissatz von Gaussian 03 [124] be-nutzt. Die Berechnung der NMR Parameter (g-Tensoren, h f -Tensoren und MullikenSpindichten) erfolgte mit dem TZVP Basissatz [176, 177].Die berechneten Orientierungen des g-Tensors für das jeweilige strukturelle Radikal-modell zeigt Abbildung 4.11, die berechneten g-Tensor Hauptwerte sind in Tabelle 4.4zusammengefasst. Abbildung 4.12 zeigt die berechneten Mulliken Spindichten für dieverschiedenen Modelle.Vergleicht man die berechneten g-Tensoren für die möglichen Strukturen des ThDPRadikalintermediates mit dem im Kristall und der gefrorenen Lösung gemessenen g-Tensor, zeigt sich ein deutlicher Unterschied für das in [59] vorgeschlagene σ-Kation-radikal mit lokalisierter Spindichte auf der Azetylgruppe (Modell C in Abbildung 4.1).Das σ/π-Kationradikal mit delokalisierter Spindichte (Modell B, Abbildung 4.1) zeigteine sehr gute Übereinstimmung der berechneten mit den gemessenen g-Tensor Wer-ten. Hier ist allerdings die Orientierung des g-Tensors abweichend von der aus derEinkristall Hochfeld ESR bestimmten Orientierung des g-Tensors. Deutlich ist die gx-Achse gegenüber der C2-C2α Bindungsachse, sowohl in der Konformation der Rönt-genstruktur als auch in der geometrieoptimierten Konformation, verschoben. Ebensoist in beiden Konformationen die gz Achse gegenüber der Ringnormalen verkippt.Die beste Übereinstimmung zeigt das geometrieoptimierte π-Neutralradikal, sowohlvon der Orientierung als auch von den Hauptwerten des g-Tensors. Die berechneten

Dichtefunktional Theorie Rechnungen 99

π-Neutralradikal σ/π-Kationradikal σ-Kationradikal gemessen

X-ray

gx 2.01114 2.00859 2.00580 2.00808

gy 2.00864 2.00614 2.00398 2.00546

gz 2.00062 2.00163 2.00224 2.00223

optimiert

gx 2.00903 2.00750 2.00393

gy 2.00593 2.00555 2.00326

gz 2.00205 2.00223 2.00200

Tabelle 4.4: berechnete g-Tensoren der verschiedenen Modelle des a-ThDP Radikal-

intermediates (siehe Abbildung 4.1) in der Konformation der Röntgenstruktur (X-ray)

und in der geometrieoptimierten Konformation (optimiert), fett: beste Übereinstim-

mung

g-Tensor Werte stimmen sehr gut überein. Die Orientierung des g-Tensors der opti-mierten Struktur des π-Neutralradikals zeigt eine Rotation von ≈20◦ um die gz-Achseim Vergleich zur gemessenen Orientierung des g-Tensors. Eine ähnlich gute Überein-stimmung zeigt auch die Orientierung des g-Tensors für das π-Neutralradikal aus denRechnungen mit der Röntgenstruktur, jedoch ist hier die g-Anisotropie ein wenig zugroß.Bei Betrachtung der berechneten Spindichteverteilungen für die unterschiedlichen Mo-delle (siehe Abbildung 4.12) und den daraus resultierenden berechneten h f -Tensoren(siehe Tabelle 4.5) lässt sich wieder das σ-Kationradikal mit lokalisierter Spindich-te (Modell C) ausschließen. In dieser Konformation ist keinerlei Spindichte auf derAzetylgruppe. Hier ist die Spindichte aber eindeutig durch die selektive Deuterierungnachgewiesen. Die berechneten h f -Tensoren zeigen auch hier für die optimierte π-Neutralradikalstruktur die beste Übereinstimmung mit dem Experiment.Beim Vergleich der berechneten und gemessenen h f -Tensoren werden im folgendenausschließlich die h f -Tensoren der Methylgruppe des Azetyls und des Stickstoffes N1

betrachtet, da die h f -Tensoren der β-Protonen vom Diederwinkel abhängig sind (sieheKapitel 2.1.3), welcher für die gemessenen und berechneten Strukturen Unterschiedeaufweisen kann. Beim Vergleich der berechneten h f -Tensoren für das π-Neutralradikalin der Röntgenkonformation und für das σ/π-Kationradikal in der Röntgenkonforma-tion ist festzustellen, dass der Stickstoff h f -Tensor (π-Neutralradikal) bzw. der CH3

h f -Tensor (σ/π-Kationradikal) jeweils zu groß ist. Für die optimierten Konformatio-



nen wurde der h f -Tensor der CH3-Gruppe des σ/π-Kationradikals immer noch zugroß berechnet, während der Stickstoff h f -Tensor des π-Neutralradikals hier sehr gutmit dem gemessenen h f -Tensor übereinstimmt. Auch die Orientierung des Stickstoffh f -Tensors des π-Neutralradikals relativ zum g-Tensor in der geometrieoptimiertenStruktur stimmt ziemlich gut mit der Orientierung des gemessenen h f -Tensors über-ein (ESR: Winkel(gz,Azz)=15◦; DFT: Winkel(gz,A33)=30◦).

Hyperfeintensor A11,22,33 in MHz Axx,yy,zz in MHz

π-Neutralradikal σ/π-Kationradikal gemessen

Röntgenstruktur

A(Hβ1) 4.1, 5.2, 9.4 14.8, 15.2, 20.1 9.5, 5.8, 6.8

A(Hβ2) 7.2, 9.7, 11.2 5.4, 6.0, 7.2 12.5, 18.5, 14.5

A(CH3) -0.1, 2.1, 4.8 34.1, 35.6, 44.4 14.8, 16.9, 11.3

A(N) 26.4, 26.7, 40.0 10.2, 11.1, 21.6 6.5, 8.0, 33.0

geometrieoptimiert

A(Hβ1) 6.7, 7.0, 10.3 11.6, 12.2, 15.8

A(Hβ2) 11.5, 12.4, 17.5 12.0, 13.2, 17.4

A(CH3) 10.3, 11.7, 16.7 32.1, 33.3, 40.7

A(N) -0.2, -0.2, 32.8 1.2, 1.4, 34.3

Tabelle 4.5: Berechnete hf-Tensoren des a-ThDP Radikalintermediates für die ver-

schiedenen elektronischen Modelle ohne das σ-Kationradikal (Modell C), da es kei-

nerlei Spindichte auf der Azetylgruppe hat, die Zuordnung der hf-Tensoren analog

Abbildungen 4.6, 4.10

H(β )

H(β )

CH

N

1

2

33α

2α

32

4

1

5

Abbildung 4.10: Zuordnung der Kopplungen zur Struktur

Dichtefunktional Theorie Rechnungen 101

experimenteller g−TensorRöntgenstruktur

x y

G1

z

x y

z

E

zR1

x

y

x

y

zR2x

G2

y

z

xy

z

G3z

R3x

y

Röntgenstruktur

Röntgenstruktur geometrieoptimiert

geometrieoptimiert

geometrieoptimiert Neutralradikal π−Neutralradikalπ−

σ/π−Kationradikal σ/π−Kationradikal

σ−Kationradikal σ−Kationradikal

Röntgenstruktur

Abbildung 4.11: Mit Gaussian 03 berechnete g-Tensor Achsen für das a-ThDP Radi-

kalintermediat und der Vergleich mit dem Experiment; E: mit Hochfeld ESR bestimmte

g-Tensor Orientierung in der Röntgenstruktur; R1-R3 berechnete g-Tensor Orientie-

rung für das π-Neutralradikal, σ/π-Kationradikal und σ-Kationradikal in der Rönt-

genstruktur; G1-G3 berechnete g-Tensor Orientierung für das π-Neutralradikal, σ/π-

Kationradikal und σ-Kationradikal in der geometrieoptimierten Struktur



geometrieoptimiertπ−Neutralradikal

G1

G2

Röntgenstruktur

Röntgenstruktur Kationradikalσ−

geometrieoptimiert

geometrieoptimiert Kationradikalσ/π− σ/π−Kationradikal

Kationradikalσ−

Röntgenstruktur Neutralradikalπ−

R1

R2

R3 G3

Abbildung 4.12: Mit Gaussian 03 berechnete Spindichten für das a-ThDP Ra-

dikalintermediat; R1-R3 berechneter Spindichten für das π-Neutralradikal, σ/π-

Kationradikal und σ-Kationradikal in der Röntgenstruktur; G1-G3 berechnete Spin-

dichten für das π-Neutralradikal, σ/π-Kationradikal und σ-Kationradikal in der

geometrieoptimierten Struktur; Spindichtedarstellung mit Molden [172], Konturwert

0.008

Diskusssion und Zusammenfassung 103

4.4 Diskusssion und Zusammenfassung

Die gesamten gewonnen spektroskopischen Daten für das a-ThDP Radikalintermediatsprechen für ein neutrales π-Radikal. Der g-Tensor weist eine starke Rhombizität auf,der gz Wert ist nahe dem Wert des freien Elektrons und die gz-Achse des g-Tensorssteht senkrecht auf der Ringebene. Ebenso ist Azz-Achse nahezu parallel zur gz-Achseorientiert, wie es für ein neutrales π-Radikal mit einer Spindichteverteilung auf einemplanaren Ring und π-Spindichte am Stickstoff typisch ist. Für eine auf dem Ring de-lokalisierte π-Spindichte sprechen auch die bestimmten und lokalisierten h f -Tensorenvon der CH3-Gruppe des Azetyls und den beiden β-Protonen der Seitenkette.Die mit Hilfe der Dichtefunktional Theorie berechneten g-Tensor Hauptwerte undAchsen, Spindichten und h f -Tensoren zeigen für das π-Neutralradikal die größte Über-einstimmung mit den gemessenen Werten. Die durchgeführten Geometrieoptimierun-gen zeigen im Widerspruch zu den kristallografischen Daten der Röntgenstrukturana-lyse [59] für alle Modelle die Bevorzugung der planaren Ringstruktur. Dies kann ver-schiedene Ursachen haben. Einerseits ist es möglich, dass die Röntgenstruktur eineÜberlagerung mehrerer Konformationen des Radikals zeigt. Dafür würden die in denunterschiedlichen Präparationen (die beiden X-Band Proben und der Kristall im Ver-gleich zu der W-Band Probe) gemessenen h f -Tensoren und die leicht unterschiedli-chen g-Tensoren sprechen. Unterschiedliche Konformationen für das a-ThDP Radikalwurden schon in der früheren 9.1 GHz ENDOR Arbeit von Bouchev et al. [75] po-stuliert. Andererseits ist es vorstellbar, dass die in der Röntgenstruktur gezeigte Kon-formation eine Überlagerung verschiedener Konformationen unterschiedlicher Reak-tionszeiten ist, d.h. eine Überlagerung von radikalischen und nicht-radikalischen Zu-ständen zeigt. In der Arbeit von Chabriere et al. [59] wird vorgeschlagen, dass dasPyruvat während der Reaktion festgehalten wird und das Thiamindiphosphat wie eineSchaukel zum Pyruvat schwingt. Dieser Mechanismus könnte durch eine Reihe in-teressanter, neuer Experimente weiter untersucht werden. Man könnte versuchen, dieReaktion mit schnellen Misch- und Freeze-Quench Techniken bei unterschiedlichenZeiten abzufangen und das Radikalintermediat jeweils spektroskopisch untersuchen.Zusammenfassend bleibt festzustellen, dass die Struktur des a-ThDP Radikalinterme-diates eindeutig geklärt werden konnte. Das a-ThDP Radikalintermediat ist ein neutra-les π-Radikal.

Kapitel 5

Anhang

5.1 Rotationsmatrizen

Jede beliebige Orientierung oder Rotation im dreidimensionalen Raum kann durchdrei Parameter beschrieben werden. Jede beliebige Rotation kann durch drei Rotatio-nen um drei kanonische Achsen beschrieben werden. Die Rotationswinkel heißen Eu-lerwinkel. Für die Festlegung der Eulerwinkel existieren verschiedene Konventionen.In dieser Arbeit wurde die Definition der Eulerwinkel nach Goldstein benutzt [110](aber in umgekehrter Reihenfolge von [110], daher erfolgen die Drehungen nicht umZwischenachsen). Die Rotationen erfolgen in einem festen rechtshändigen Koordina-tensystem in folgender Reihenfolge:

1. Drehung um die z-Achse mit dem Winkel ψ

2. Drehung um die x-Achse mit dem Winkel θ

3. Drehung um die z-Achse mit dem Winkel φ

Die Drehungen sind im mathematischen Sinn positiv definiert. Die gesamte Rotations-matrix überführt die Koordinaten eines lokalen Koordinatensystems x′y′z′ in xyz:

R(φ,θ,ψ) = R(φ)∗R(θ)∗R(ψ) (5.1)

Die entsprechende octave Funktion:

function y = euler(phi,theta,psi)

#Generierung einer Drehmatrix um die 3

#Eulerwinkel

#3 Drehungen um kartesische Axen --> psi

#um z, theta um x und nochmals phi um z

105

106 Anhang

e_phi=[cos(phi) -sin(phi) 0; sin(phi) cos(phi) 0; 0 0 1];

#phi Drehung

e_theta=[1 0 0; 0 cos(theta) -sin(theta); 0 sin(theta) cos(theta)];

#theta Drehung

e_psi=[cos(psi) -sin(psi) 0; sin(psi) cos(psi) 0; 0 0 1];

#psi Drehung

y=e_phi*e_theta*e_psi;

#Gesamtmatrix

endfunction

5.2 Simulationsprogramm der gefrorenen Lösung

Simulationsprogramm für ESR Spektren gefrorener Lösungen mit vier Kernen, wobeiA4 die Multiplizität drei hat:

function y=powder_sim_4Nuc(g,A_1,A_2,A_3,A_4,a1_or_grad,a2_or_grad,a3_or_grad,

a4_or_grad,kern,Spektrum,iter,sigma,Frequenz)

#Simulation eines Pulverspektrums

#Parameter: g:[g_x g_y g_z]

# A_i=[A_i_x 0 0;0 A_i_y 0;0 0 A_i_z]

# a_i_or_grad=[a_i_1 a_i_2 a_i_3]

#Frequenz in GHz; Spektrum Feldachse,sigma in T

# iter Schrittweite, kern Matrix mit Kernspinzustaenden

delta=rad(iter);

h=6.62620755e-34 ;

mue_bohr=927.40154e-26;

nue=Frequenz*1e9;

#Konstanten

feld=Spektrum(:,1);

feldanstieg=(feld(1)-feld(length(feld)))/(1-length(feld));

feldabschnitt=feld(1)-feldanstieg;

intensitaet(length(feld))=0;

#Bestimmung der Beziehung zwischen gemessenen Feldpunkten und Vektorindex

a_or_1=rad(a1_or_grad);




R_1=euler(a_or_1(1),a_or_1(2),a_or_1(3));




j=0;

k=0;

Simulationsprogramm der gefrorenen Lösung 107

phi=0;

theta=0;

g_tensor=[g(1) 0 0 ; 0 g(2) 0 ; 0 0 g(3)];

n=1;

theta=pi/2;

phi=0;

while(theta >= 0)

trigo=sin(theta);

theta=theta-delta*delta/(2*pi*trigo);

phi=phi+delta/trigo+1/sqrt(2)*(delta/sin(theta)-delta/trigo);

l=[cos(phi)*sin(theta);sin(phi)*sin(theta);cos(theta)];

g_eff=(l’*g_tensor*g_tensor*l)^(.5);

a1_eff=(l’*R_1*A_1*A_1*R_1’*l)^(.5);

a2_eff=(l’*R_2*A_2*A_2*R_2’*l)^(.5);

a3_eff=(l’*R_3*A_3*A_3*R_3’*l)^(.5);

a4_eff=(l’*R_4*A_4*A_4*R_4’*l)^(.5);

for i=1:length(kern(:,1))

H_res=h*(nue-(a1_eff*kern(i,1)+a2_eff*kern(i,2)+a3_eff*kern

(i,3)+a4_eff*sum(kern(i,4:6))))/(mue_bohr*g_eff);

H_res1=h*nue/mue_bohr/sqrt(l’*g_tensor*g_tensor*l);

#Bestimmung des Resonanzfeldes in Abhaengigkeit der

# Winkel, die von 0 bis pi/2 in iter-Schritten

#durchgesteppt werden

index=round((H_res-feldabschnitt)/feldanstieg);

#Bestimmung der Stelle fuer Eintrag im Strichspektrum

if ((index < 1) | (index > 1024))

index

A_2

A_3

A_4

error("Indexueberlauf!")

else

intensitaet((index))=intensitaet((index))+1;

#Erhoehung der Intensitaet des Strichspektrums

#entsprechend der Groesse des Raumwinkels (sin(theta))

endif

endfor

endwhile

#*************************************************************************

#Faltungssektion aus Kristallsimulationsprogrammen

l=length(intensitaet);

for i=1:l

dg(i)=-(feld(i)-feld(l/2))/sqrt(2*pi)/sigma^3*exp(-(feld(i)-feld(l/2))^2/

sigma^2);

endfor

#Generierung einer Ableitung(Gausskurve) mit

#Zentrum auf der Feldmitte und gleicher

108 Anhang

#Vektorlaenge

zw(1:l/2)=dg(l/2+1:l);

zw(l/2+1:l)=dg(1:l/2);

#symmetrisches Aufspalten der

#abgeleiteten Gausskurve wegen math.

#Bedingung fuer Faltung

sim=real(ifft(fft(zw) .* fft(intensitaet)));

sim=Normierung(sim); #Normierung

#***************************************************************************

y(:,1)=feld;

y(:,2)=sim;

endfunction

5.3 Programm zur Simulation des E. coli Einkristalls

Das folgende Funktion “kristallsim_ver”

function sim = kristallsim_ver(g,g_or_grad,A_1,A_2,A_3,a1_or_grad,a2_or_grad,

a3_or_grad,kris_or_grad,Orientierung,korSpektren,sigma,verteilung);

#Erstellt eine Matrix der simulierten

#Spektren der Struktur

#B(or1) I(or1) B(or2) I(or2) ...

#0<verteilung<1 laesst eine

#Spinverteilung in den beiden

#Dimerhaelften zu, heisst Linien der

#einen Haelfte werden mit Verteilung und

#die andere Haelfte mit 1-Verteilung

#"besetzt"

#****************************************************************

erg = spektrum_di(g,g_or_grad,A_1,A_2,A_3,a1_or_grad,a2_or_grad,a3_or_grad,

kris_or_grad,Orientierung,korSpektren);

#erste Ergebnissmatrix der Struktur

#Winkel B1 B2 ...

#Spektrum als Fkt. extra definiert

#******************************************************************

Strichspek=0;

Strichspek(length(korSpektren(:,1)),length(Orientierung)*2)=0;

for i=1:length(Orientierung)

an=(korSpektren(1024,2*i-1)-korSpektren(1,2*i-1))/(length(korSpektren(:,2))-1);

ab=korSpektren(1,2*i-1)-an;

#Bestimmung des Zusammenhangs

#Matrixindex - Feldwert des jeweils

#gemessenen Spektrums

Strichspek(:,2*i-1)=korSpektren(:,2*i-1);

#Uebernahme des jeweiligen gemessenen

#Feldes

for j=2:floor(length(erg(1,:))/2)+1

Programm zur Simulation des E. coli Einkristalls 109

#1.Dimerhaelfte

index=(erg(i,j)-ab)/an;

if ((index<1) | (index>length(korSpektren(:,2*i-1))))

error("Scheisse, Scheisse, Fehler!!! Indexueberlauf!");

else

if (((index-floor(index))>0.3)&&((index-floor(index))<0.6))

Strichspek(floor(index),2*i)=Strichspek(floor(index),2*i)+verteilung/2;

Strichspek(floor(index)+1,2*i)=Strichspek(floor(index)+1,2*i)+verteilung/2;

#if-Abfrage drittelt den Bereich

#zwischen 2 Indizes, liegt der Wert im

#mittleren zwischen den beiden Indizes

#wird die Intesitaet zwischen beiden

#geteilt

else

Strichspek(index,2*i)=Strichspek(index,2*i)+verteilung;

endif

endif

endfor

#laeuft Ergebnismatrix aus Spektrum

#(fuer eine Dimerhaelfte) ab

#und setzt Verteilung an entsprechende

#Feldposition

for j=floor(length(erg(1,:))/2)+2:length(erg(1,:))

#2.Dimerhaelfte

index=(erg(i,j)-ab)/an;

if ((index<1) | (index>length(korSpektren(:,2*i-1))))

error("Scheisse, Scheisse, Fehler!!! Indexueberlauf!");

else

if (((index-floor(index))>0.3)&&((index-floor(index))<0.6))

Strichspek(floor(index),2*i)=Strichspek(floor(index),2*i)+(1-verteilung)/2;

Strichspek(floor(index)+1,2*i)=Strichspek(floor(index)+1,2*i)+(1-verteilung)/2;

#if-Abfrage drittelt den Bereich

#zwischen 2 Indizes, liegt der Wert im

#mittleren zwischen den beiden Indizes

#wird die Intesitaet zwischen beiden

#geteilt

else

Strichspek(index,2*i)=Strichspek(index,2*i)+(1-verteilung);

endif

endif

endfor

#laeuft Ergebnismatrix aus Spektrum

#(fuer die andere Dimerhaelfte) ab

#und setzt 1-Verteilung an entsprechende

#Feldposition

endfor

#ist alle Orientierungen durchgelaufen

#und hat eine Matrix der Struktur

#Feld(or1) Int(or1) Feld(or2) Int(or2)

110 Anhang

#... als Strichspektrum generiert

#*************************************************************************

l=length(Strichspek(:,1));

for i=1:l

dg(i)=-(Strichspek(i,1)-Strichspek(l/2,1))/sqrt(2*pi)/sigma^3*exp(-(Strichspek(i,1)

-Strichspek(l/2,1))^2/sigma^2);

endfor

#Generierung einer Ableitung(Gausskurve) mit

#Zentrum auf der Feldmitte und gleicher

#Vektorlaenge

#ACHTUNG!!!! Gausskurve liegt ueber den

#Feldbereich der O Grad Aufnahme und

#wird aus Rechenzeitgruenden fuer alle

#Spektren benutzt --> Fehler durch

#unterschiedliche B=B(i), aber nur 0.1%

zw(1:l/2)=dg(l/2:l-1);

zw(l/2+1:l)=dg(1:l/2);

#symmetrisches Aufspalten der

#abgeleiteten Gausskurve wegen math.

#Bedingung fuer Faltung

for i=1:length(Orientierung)

sim(:,2*i-1)=Strichspek(:,2*i-1);

sim(:,2*i)=real(ifft(fft(zw) .* fft(Strichspek(:,2*i))));

sim(:,2*i)=sim(:,2*i)/(sum(cumsum(sim(:,2*i)))/length(cumsum(sim(:,2*i)))); #Normierung

endfor

#Erzeugung der endgueltigen Spektren

#durch Faltung einer Gausskurve mit den

#jeweiligem Strichspektrum in einer

#Matrix der Struktur

#B(or) Int(or1) B(or2) Int(or2) ..

#(Gaussfaltung als Fkt. extra def)

#************************************************************************

endfunction

ruft “spektrum_di” auf:

unction B = spektrum_di(g,g_or_grad,A_1,A_2,A_3,a1_or_grad,a2_or_grad,

a3_or_grad,kris_or_grad,Orientierung,korSpektren);

#***************************************************************

#Initialisierung der Konstanten

R_sym_1_grad=[0;0;0];

R_sym_2_grad=[0;0;180];

R_sym_3_grad=[0;180;0];

R_sym_4_grad=[0;180;180];

#Kristallsymetrieorientierung in

#Notation wie oben

nue=94.e9;

#Mikrowelle

h=6.62620755e-34 ;

mue_bohr=927.40154e-26;

#Planck’sche Konstante und Bohr’sches Magneton

#***************************************************************

g_or=rad(g_or_grad);

kris_or=rad(kris_or_grad);

Programm zur Simulation des E. coli Einkristalls 111




R_sym_1=rad(R_sym_1_grad);




#Umwandlung der Winkel in rad, weil

#Bedingung fuer trigonometrische Fkt’en

#in octave ; rad extra definiert

R_g=euler(g_or(1),g_or(2),g_or(3));




#Generierung der Drehmatrizen ; euler

#extra definiert

R_zu=[-0.81459 0.56081 0.14810;

0.55749 0.68647 0.46687;

0.16015 0.46287 -0.87184];

#selbst berechnete Transformationsmatrix

#von Tyrosin A zu Tyrosin B aus Roengten

#struktur

R_l_1=euler(R_sym_1(1),R_sym_1(2),R_sym_1(3));




#Drehmatrizen fuer Kristallsymmetrie

#und die verschiedenen Sites

n=[1;0;0];

#Richtung des Magnetfeldes im

#Laborsystem

B=rand(length(Orientierung),33);

#Generierung einer Matrix fuer

#Drehwinkel1 B1 B2 ...

#Drehwinkel2 B1* B2* ...

for j=1:length(Orientierung)

#Begin der Magnetfeldberechnung fuer

#gegebene Orientierung

R=euler(kris_or(1)+rad(Orientierung(j)),kris_or(2),kris_or(3));

g_zu(1,1)=g(1,1)-2;

g_zu(2,2)=g(2,2)-2;

g_zu(3,3)=g(3,3)-2;

g_eff_1=n’*R*R_l_1*R_g*g_zu*R_g’*R_l_1’*R’*n+2;

a1_eff_1=n’*R*R_l_1*R_g*R_1*A_1*R_1’*R_g’*R_l_1’*R’*n;



112 Anhang













#Berechnung der effektiven Hyperfein- und

#g-Werte fuer jede Site fuer Monomer

#********************************************************************

g_eff_1_zu=n’*R*R_l_1*R_zu*R_g*g_zu*R_g’*R_zu’*R_l_1’*R’*n+2;

a1_eff_1_zu=n’*R*R_l_1*R_zu*R_g*R_1*A_1*R_1’*R_g’*R_zu’*R_l_1’*R’*n;















#Berechnung der effektiven Hyperfein- und

#g-Werte fuer zusaetzliche Site fuer Dimer

#********************************************************************

kernspin=[0.5 0.5 0.5;0.5 0.5 -0.5;0.5 -0.5 0.5;-0.5 0.5 0.5;-0.5 \

-0.5 0.5;-0.5 0.5 -0.5;0.5 -0.5 -0.5; -0.5 -0.5 -0.5];

#Matrix mit allen moeglichen

#Einstellungen der 3 Kernspins

for i=1:8

B(j,i+1)=1e4*h*(nue-(a1_eff_1*kernspin(i,1)+a2_eff_1*kernspin(i,2)+

a3_eff_1*kernspin(i,3)))/(mue_bohr*g_eff_1);

endfor

for i=1:8


Fitprogramm 113


endfor

for i=1:8



endfor

for i=1:8



endfor

for i=1:8

B(j,i+33)=1e4*h*(nue-(a1_eff_1_zu*kernspin(i,1)+a2_eff_1_zu*kernspin(i,2)

+a3_eff_1_zu*kernspin(i,3)))/(mue_bohr*g_eff_1_zu);

endfor

for i=1:8



endfor

for i=1:8



endfor

for i=1:8



endfor

#Berechnung der Magnetfeldwerte der

#Linien als Eintraege in Matrix B

#fuer jede Site, Faktor 1e4 fuer [Gauss]

B(j,1)=Orientierung(j); #Orientierung als erster Matrixeintrag

endfor

#Ende der Schleife fuer eine Orientierung

endfunction

5.4 Fitprogrammfunction fitparameter = anealing_int(g,g_or_grad,A_1,A_2,A_3,a1_or_grad,

a2_or_grad,a3_or_grad,kris_or_grad,Orientierung,korSpektren,sigma,wahl5,abbruch);

#*****************************************************************

epsilon=0.5e-2;

iter=20; #Kontrollparameter fuer

#Abkuehlgeschwindigkeit fuer anealing

114 Anhang

p=g_or_grad;

p(4:6)=kris_or_grad;

start(7,6)=0;

#for i=1:6 Umstellung auf

#ausschliessliche Variation der

#g-Tensor-orientierung

for i=1:6

start(i,:)=p’;

start(i,i)=20+p(i);

endfor

start(7,:)=p’;

#Generierung des Startsimplex, der nur

#die Parameter enthaelt die anzupassen

#sind; BEACHTE: kristallsim muessen

#immer alle Parameter uebergeben werden

#fuer die einheitliche Steuerung -->

#daher leider scheisselesbar, aber nur

#Parameter an Stelle von start bzw. pneu

#werden variiert

#******************************************************************

for i=1:7

y=kristallsim(g,start(i,1:3),A_1,A_2,A_3,a1_or_grad,a2_or_grad,a3_or_grad,

start(i,4:6),Orientierung,korSpektren,sigma,wahl5);

chi=sum(sumsq(cumsum(korSpektren(200:900,2:2:50).-y(200:900,2:2:50))))/1024;

f_p(i,1)=chi;

f_p(i,2:7)=start(i,:);

endfor

f_p

#Generierung des Startsimplex mit

#Funktionswerten der Struktur

#f(Start) Start

zwischen=sort(f_p(:,1));

T=2*(zwischen(length(zwischen))-zwischen(1));

#Entspricht der Rolle einer

#Anfangstemperatur und wird aus der

#Doppelten Differenz zwischen max und

#min Funktionswert bestimmt

#******************************************************************

delta=j=1;

while ((delta>abbruch) && (j<80000))

#Anpassung bis Aenderung im

#Toleranzbereich oder Maximale

#Iterationszahl erreicht

zwischen=sort(f_p(:,1));

for k=1:7

if (f_p(k,1) == zwischen(length(zwischen)))

Fitprogramm 115

maxi=k;

elseif (f_p(k,1) == zwischen(length(zwischen)-1))

zweitmax=k;

elseif (f_p(k,1) == zwischen(1))

mini=k;

endif

endfor

#Bestimmung des groessten und kleinsten

#Fkt’swertes

#log. mit T skalierte Zufallszahl, wird

#an Simplexecken addiert bzw. bei neuen

#Werten substraiert

psum=f_p(mini,2:7);

for n=1:4

if ((n <> maxi) && (n <> mini))

psum=psum+f_p(n,2:7);

endif

endfor

#Bestimmung des Quasischwerpunktvektors

#fuer den Simplexzug

pneu=simplexzug(-1,f_p(maxi,2:7),psum);

pneu=winkelgrenzen(pneu);

#winkelgrenzen sorgt dafuer, dass die

#Winkel immer im Bereich zwischen -180

#und 180 bleibt und damit das gesamte

#relevante Parametergebiet durchlaufen

#wird

y=kristallsim(g,pneu(1:3),A_1,A_2,A_3,a1_or_grad,a2_or_grad,a3_or_grad,

pneu(4:6),Orientierung,korSpektren,sigma,wahl5);

f_pneu=sum(sumsq(cumsum(korSpektren(200:900,2:2:50)-y(200:900,2:2:50))))/1024;

#sprintf("1:Zug")

#Punkt des groessten Fkt’swertes durch

#die Ebene und Bestimmung des neuen

#Fkt’wertes, simplexzug ist extern

#definiert weil nur 1 function moeglich,

#kristallsim muessen leider immer alle

#Parameter uebergeben werden, aber nur

#pneu wird variiert

if ((f_pneu-(-log(rand)*T)) <= (f_p(mini,1)+(-log(rand)*T)))

#log(rand)*T wird nur fuer die anealing

#Komponenente benoetigt, gewaehrleistet

#das manchmal auch ein schlechter Zug

#genommen wird

pneu2=simplexzug(2,pneu,psum);

pneu2=winkelgrenzen(pneu2);

y=kristallsim(g,pneu(1:3),A_1,A_2,A_3,a1_or_grad,a2_or_grad,

a3_or_grad,pneu(4:6),Orientierung,korSpektren,sigma,wahl5);

f_pneu2=sum(sumsq(cumsum(korSpektren(200:900,2:2:50)-y(200:900,2:2:50))))/1024;

#sprintf("Expansionsversuch")

#ist der neue Wert kleiner als der

#kleinste wird der Schritt verdoppelt

if ((f_pneu2-(-log(rand)*T)) < (f_pneu+(-log(rand)*T)))

116 Anhang

pneu=pneu2;

f_pneu=f_pneu2;

#sprintf("genommen")

endif

elseif ((f_pneu-(-log(rand)*T)) >= (f_p(zweitmax,1)+(-log(rand)*T)))

pneu=simplexzug(0.5,f_p(maxi,2:7),psum);



f_pneu=sum(sumsq(cumsum(korSpektren(200:900,2:2:50)-y(200:900,2:2:50))))/1024;

#ist der neue Wert groesser als der

#2.groesste versuchen wir Kontraktion in

#eine Richtung

#sprintf("1dim Kontraktion")

if ((f_pneu-(-log(rand)*T)) > (f_p(zweitmax,1)+(-log(rand)*T)))

for k=1:length(f_p(:,1))

if (k <> mini)

f_p(k,2:7)=0.5*(f_p(k,2:7)+f_p(mini,2:7));



f_p(k,1)=sum(sumsq(cumsum(korSpektren(200:900,2:2:50)-y(200:900,2:2:50))))/1024;

endif

endfor

# f_p

# sprintf("Gesamtkontraktion")

endif

#wenn die Kontraktion in einer Richtung

#immer noch nicht erfolgreich war, wird

#der gesamte Simplex in Richtung des

#niedrigsten Funktionswertes zusammengezogen

endif

delta=sqrt((length(psum))^-1*(sumsq(f_p(:,1))-(length(psum)+1)^-1*(sum(f_p(:,1)))^2))/

((length(psum)+1)^-1*sum(f_p(:,1)));

#Berechnung des Unterschieds durch

#Minimierungsschritt

if ((f_p(maxi,1)+(-log(rand)*T)) > (f_pneu-(-log(rand)*T)))

f_p(maxi,2:7)=pneu;

f_p(maxi,1)=f_pneu;

#sprintf("in ersetze gesprungen mit %f %f \n",pneu, f_pneu)

endif

#f_p

j++;

T=(1-epsilon)*T;

#sprintf("Schleifenende")

#Reinitialisierung der Fkt’s und

#Punktmatrix und Hochzaehlen der

#Iterationsvariablen

endwhile

fitparameter=f_p;

fitparameter(length(f_p(:,1))+1,length(f_p(1,:))+1)=j;

fitparameter(length(f_p(:,1))+1,1)=delta;

fitparameter(length(f_p(:,1))+1,2)=T;

endfunction

Literaturverzeichnis

[1] B.-M. Sjöberg. Ribonucleotide reductase- a group of enzymes with differentmetallosites and a similar reaction mechanism. Structural Bonding, 88:139–173, 1997.

[2] B.-M. Sjöberg. The ribonucleotide reductase jigsaw puzzle - a large piece fallsinto parts. Structure, 2:793–796, 1994.

[3] J. Stubbe and P. Riggs-Gelasco. Harnessing free radicals: formation and func-tion of the tyrosyl radical in ribonucleotide reductase. Trends in Biochemical

Science, 23:438–443, 1998.

[4] H. Eklund, U. Uhlin, M. Färnegardh, D.T. Logan, and P. Nordlund. Structureand function of the radical enzyme ribonucleotide reductase. Progress in Bio-

physics and Molecular Biology, 77:177–268, 2001.

[5] J. Stubbe, D.G. Nocera, C.S. Yee, and M.C.Y. Chang. Radical initiation in theclass i ribonucleotide reductase: lang-range proton-coupled electron transfer.Chemical Reviews, 103:2167–2201, 2003.

[6] M. Pellegrini, S. Liehr, A.L. Fisher, P.B. Laub, B.S. Cooperman, and D.F.Mierke. Structure-based optimization of peptide inhibitors of mammalian ri-bonucleotide reductase. Biochemistry, 39:12210–12215, 2000.

[7] B.A. Pender, X. Wu, P.H. Axelsen, and B.S. Cooperman. Towards a rationaldesign of peptide inhibitors of ribonucleotide reductase: structure-function andmodeling studies. Journal of Medical Chemistry, 44:36–46, 2001.

[8] J. Stubbe and W.A. van der Donk. Protein radicals in enzyme catalysis. Chemi-

cal Review, 98:705–762, 1998.

[9] X.Y. Sun, S. Ollagnier, P.P. Schmidt, M. Atta, E. Mulliez, L. Lepape, R. Eli-asson, A. Gräslund, M. Fontecave, P. Reichard, and B.-M. Sjöberg. The free

117

118 LITERATURVERZEICHNIS

radical of anaerobic ribonucleotide reductase form escherichia coli is at glycine681. Journal of Biological Chemistry, 271:6827–6831, 1996.

[10] M. Fontecave, E. Mulliez, and D.T. Logan. Deoxyribonucleotide synthesis inanaerobic microorganisms: the class iii ribonucleotide reductase. Progress in

Nucleic Acid Research and Molecular Biology, 72:95–127, 2002.

[11] C. Duboc-Toia, A.K. Hassan, E. Mulliez, S. Ollagnier de Choudens, M. Fonte-cave, M.C. Leutwein, and J. Heider. Very high field epr study of glycyl radicalenzymes. Journal of American Chemical Society, 125:38–39, 2003.

[12] S. Licht, G.J. Gerfen, and J. Stubbe. Thiyl radicals in ribonucleotide reductase.Science, 271:477–481, 1996.

[13] G.J. Gerfen, S. Licht, J.P. Willems, B.M. Hoffman, and J. Stubbe. Electronparamagnetic resonance investigation of a kinetically competent intermediateformed in ribonucleotide reductase: evidence for a thiyl radical-cob(ii) alamininteraction. Journal of American Chemical Society, 118:8192–8197, 1996.

[14] M.D. Sintchak, G. Arjara, B.A. Kellogg, J. Stubbe, and C.L. Drennan. Thecrystal structure of class ii ribonucleotide reductase reveals how an allostericallyregulated monomer mimics a dimer. Nature Structural Biology, 9:293–300,2002.

[15] D.T. Logan, J. Andersson, B.-M. Sjöberg, and P. Nordlund. A glycyl radicalsite in the crystal structure of a class iii ribonucleotide reductase. Science,283:1499–1504, 1999.

[16] F. Lendzian. Structure and interactions of amino acid radicals in class i ribo-nucleotide reductase studied by endor adn high-field epr spectroscopy. Biochi-

mica et Biophysica Acta, 1707:67–90, 2004.

[17] B. Kauppi, B.A. Nielsen, S. Ramaswamy, I.K. Larsen, M. Thelander, L. The-lander, and H. Eklund. Journal of Molecular Biology, 262:706–720, 1996.

[18] M. Eriksson, A. Jordan, and H. Eklund. Structure of salmonella typhimurium

nrdf ribonucleotide reductase in its oxidized and reduced form.

[19] Y. Huque. Radical generation and transfer in ribonucleotide reductase. PhDthesis, Stockholm University, 2001.

LITERATURVERZEICHNIS 119

[20] K.M. Larsson, J. Andersson, B.-M. Sjöberg, P. Nordlund, and D.T. Logan.Structural basis for allosteric substrate specificity regulation in anaerobic ribo-nucleotide reductase. Structure, 9:739–750, 2001.

[21] U. Uhlin and H. Eklund. Nature, 370:533–539, 1994.

[22] M. Eriksson, U. Uhlin, S. Ramaswany, M. Ekberg, K. Regnström, B.-M. Sjö-berg, and H. Eklund. Binding of allosteric effectors to ribonucleotide reductaseprotein r1: reduction of active-site cysteines promotes substrate binding. Struc-

ture, 5:1077–1092, 1997.

[23] M. Ekberg, S. Pötsch, E. Sandin, M. Thunnissen, P. Nordlund, M. Sahlin, andB.-M. Sjöberg. Preserved catalytic activity in an engineered ribonucleotide re-ductase r2 protein with a nonphysiological radical transfer pathway. the import-ance of hydrogen bond connections between the participating residues. Journal

of Biological Chemistry, 273:21003–21008, 1998.

[24] A.L. Persson, M. Eriksson, B. Katterle, S. Pötsch, M. Sahlin, and B.-M. Sjöberg.In new mechanism-based radical intermediate in a mutant r1 protein affectingthe catalytically essential glu441 in escherichia coli ribonucleotide reductase.Journal of Biological Chemistry, 273:31016–31020, 1997.

[25] P. Nordlund, B.M. Sjöberg, and H. Eklund. Nature, 345:593–598, 1990.

[26] P. Nordlund and H. Eklund. Structure and function of the escherichia coli ribo-nucleotide reductase protein r2. Journal of Molecular Biology, 232:123–164,1993.

[27] A. Årberg, M. Ormo, P. Nordlund, and B.M. Sjöberg. Biochemistry, 39, 1993.

[28] D.T. Logan, X.D. Xu, A. Åberg, K. Regenström, J. Hajdu, H. Eklund, andP. Nordlund. Structure, 4:1053–1064, 1996.

[29] M. Högbohm, M.E. Andersson, and P. Nordlund. Crystal structures of oxidizeddinuclear manganese centres in mn-substituted class i ribonucleotide reducta-se from escherichia coli: carboxylate shifts with implications for o2 activationand radical generation. Journal of Biological Inorganic Chemistry, 6:315–323,2001.

[30] W. Tong, D. Burdi, P. Riggs-Gelasco, S. Chen, D. Edmondson, B.H. Huynh,J. Stubbe, S. Han, A. Arvai, and J. Tainer. Characterization of y122f r2 of


escherichia coli ribonucleotide reductase by time-resolved physical biochemicalmethods and x-ray crystallography. Biochemistry, 37:5840–5848, 1998.

[31] M. Atta, P. Nordlund, A. Årberg, H. Eklund, and M. Fontacave. Substituti-on of manganese for iron in ribonucleotide reductase form escherichia coli-spectroscopic and crystallographic characterization. Journal of Biological Che-

mistry, 267:20682–20688, 1992.

[32] J. Baldwin, W.C. Voegtli, N. Khidekel, P. Moenne-Loccoz, C. Krebs, A.S. Per-reira, B.A. Ley, B.H. Huynh, T.M. Loehr, P.J. Riggs-Gelasco, A.C. Rosenzweig,and J.M. Bollinger Jr. Rational reprogramming of the r2 subunit of escherichia

coli ribonucleotide reductase into a self-hydroxylating monooxygenase. Jour-

nal of American Chemical Society, 123:7017–7030, 2001.

[33] S.S. Mao, T.P. Holler, G.X. Yu, J.M.Jr. Bollinger, S. Brocker, M.I. Johnston,and J. Stubbe. A model for the role of multiple cysteine residues involved inribonucleotide reduction: amazing and still confusing. Biochemistry, 31:9733–9743, 1992.

[34] P.E.M. Siegbahn. Theoretical study of the substrate mechanism of ribonucleo-tide reductase. Journal of American Chemical Society, 120:8417–8429, 1998.

[35] P.E.M. Siegbahn, L. Eriksson, F. Himo, and M. Pavlov. Hydrogen atom transferin ribonucleotide reductase (rnr). Journal of Physical Chemistry B, 102:10622–10629, 1998.

[36] B.-M. Sjöberg and M. Sahlin. Thiols in redox mechanism of ribonucleotidereductase. Mehtods of Enzymology, 348:1–21, 2002.

[37] A. Ehrenberg. Free radical transfer, fluctuating structure and reaction cycle ofribonucleotide reductase. Biosystems, 62:9–12, 2001.

[38] A. Ehrenberg. Protein dynamics, free radical transfer and recaction cycle of ri-bonucleotide reductase. In H. Frauenfelder, G. Hummer, and R. Garcia, editors,Biological Physics: third International Symposium, pages 163–174, 1999.

[39] C.L. Atkin, L. Thelander, P. Reichard, and G. Lang. Iron and free radical inribonucleotide reductase. exchange of iron and mössbauer spectroscopy of theprotein b2 subunit of the escherichia coli enzyme. Journal of Biological Che-

mistry, 248:7464–7472, 1973.


[40] B.E. Sturgeon, D. Burdi, S. Chen, B.-H. Huynh, D.E. Edmondson, J. Stubbe,and B.M. Hoffmann. Reconsideration of x, the diiron intermediate formed du-ring cofactor assembly in e.coli ribonucleotide reductase. Journal of American

Chemical Society, 118:7551–7557, 1996.

[41] J.P. Willems, H.I. Lee, D. Burdi, P.E. Doan, J. Stubbe, and B.M. Hoffman. Iden-tification of the protonated oxygenic ligands of ribonucleotide reductase inter-mediate x by q-band h-1, h-2 cw and pulsed endor. Journal of American Che-

mical Society, 32:7551–7557, 1997.

[42] J.M. Bollinger, W.H. Tong, N. Ravi, B.H. Huynh, D.E. Edmondson, and J. Stub-be. Use of rapid kinetic methods to study the assembly of the diferric tyrosylradical cofactor of escherichia coli ribonucleotide reductase. Methods in Enzy-

mology, 258:278–303, 1995.

[43] W.H. Tong, S. Chen, S.G. Lloyd, D.E. Edmondson, B.H. Huynh, and J. Stubbe.Mechanism of assembly of the diferric cluster-tyrosyl radical cofactor of esche-

richia coli ribonucleotide reductase from the diferrous form of the r2 subunit.Journal of American Chemistry Society, 118:2107–2108, 1996.

[44] W.C. Voegtli, N. Kidekel, J. Baldwin, B.A. Ley, J.M. Bollinger, and A.C. Ro-senzweig. Crystal structure of ribonucleotide reductase r2 mutant that accumu-lates a µ-1,2-peroxodiiron(iii) intermediat during oxygen activation. Journal of

American Chemical Society, 122:3255–3261, 2000.

[45] A. Gräslund. Ribonucleotide reductase: kinetic methods for demonstrating ra-dical transfer pathway in protein r2 of mouse enzyme in generation of tyrosylfree radical. Methods in Enzymology, 354:399–414, 2002.

[46] F. Lendzian, M. Sahlin, F. MacMillan, R. Bittl, R. Fiege, S. Pötsch, B.M. Sjö-berg, A. Gräslund, W. Lubitz, and G. Lassmann. Electronic structure of neutraltryptophan radicals in ribonucleotide reductase studied by epr and endor spec-troscopy. Journal of American Chemical Society, 118:8111–8120, 1996.

[47] S. Pötsch, F. Lendzian, R. Ingemarson, A. Hornberg, L. Thelander, W. Lubitz,G. Lassmann, and A. Gräslund. The iron-oxygen reconstitution reaction in pro-tein r2 tyr-177 mutants of mouse ribonucleotide reductase- epr adn electronnuclear double resonance studies on a new transient tryptophan radical. Journal



[48] J. Baldwin, K. Krebs, B.A. Ley, D.E. Edmondson, B.H. Huynh, and J.M.Jr. Bol-linger. Mechanism of rapid electron transfer during oxygen activation in the r2subunit of escherichia coli ribonucleotide reductase. 1. evidence for a transienttryptophan radical. Journal of American Chemical Society, 122:12195–12206,2000.

[49] C. Krebs, S.X. Chen, G.P. Gupta, D.F. Iwig, B.H. Huynh, and J.M. Bollinger.Facile electron transfer during formation of cluster x and kinetic competence ofx for tyrosyl radical production in protein r2 of ribonucleotide reductase frommouse. Biochemistry, 2000.

[50] P.P. Schmidt, U. Rova, B. Katterle, L. Thelander, and A. Gräslund. Kineticevidence that a radical transfer pathway in protein r2 of mouse ribonucleoti-de reductase is involved in generation of the tyrosyl free radical. Journal of

Biological Chemistry, 273:21463–21472, 1998.

[51] M. Sahlin, G. Lassmann, S. Pötsch, B.-M. Sjöberg, and A. Gräslund. Transientfree radicals in iron/oxygen reconstitution of mutant protein r2 y122f. Journal


[52] A.L. Persson, M. Sahlin, and B.-M. Sjöberg. Cysteinyl and substrate radicalformation in active site mutant e441q of escherichia coli class i ribonucleotidereductase. Journal of Biological Chemistry, 273:31016–31020, 1998.

[53] C.C. Lawrence, M. Bennati, H.V. Obias, G. Bar, R.G. Griffin, and J. Stubbe.High-field epr detection of a disulfide radical anion in the reduction of cyti-dine 5’-diphosphate by the e441q r1 mutant of escherichia coli ribonucleotidereductase. Proceedings of the National Academy of Sciense, 1999.

[54] M. Högbohm, P. Stenmark, N. Voevodskaya, G. McClarthy, A. Gräslund, andP. Nordlund. The radical site in chlamydial ribonucleotide reductase defines anew r2 subclass. Science, 305:245–248, 204.

[55] M. Kolberg, G. Bleifuss, S. Pötsch, A. Gräslund, W. Lubitz, G. Lassmann, andF. Lendzian. A new stable high-valent diiron center in r2 mutant y122h of e.coliribonucleotide reductase studied by high-field epr and 57fe-endor. Journal of

American Chemical Society, 122:9856–9857, 2000.

[56] M. Kolberg, D.T. Logan, G. Bleifuss, S. Pötsch, B.M. Sjöberg, W. Lubitz,G. Lassmann, and F. Lendzian. A new tyrosyl radical on f208 as ligand to


the diiron center in e.coli ribonucleotide reductase, mutant r2-y122h: Combi-ned x-ray diffraction and epr/endor studies. Journal of Biological Chemistry,280:11233–11246, 2005.

[57] D.T. Logan, F. deMare, B.O. Persson, A. Slaby, B.-M. Sjöberg, and P. Nordlund.Crystal structures of two self-hydroxylating ribonucleotide reductase protein r2mutants: structural basis for the oxygen-insertion step of hydroxylation reacti-ons catalyzed by diiron proteins. Biochemistry, 37:10798–10807, 1998.

[58] S.W. Ragsdale. Pyruvate ferredoxin oxidoreductase and its radical intermediat.Chemical Reviews, 103:2333–2346, 2003.

[59] E. Chrabriere, X. Vernede, B. Guigliarelli, M.-H. Charon, E.C. Hatchikan, andJ.C. Fontechilla-Camps. Crystal structure of the free radical intermediate ofpyruvate:ferredoxin oxidoreductase. Science, 294:2559–2563, 2001.

[60] N.J. Hughes, P.A. chalk, C.L. Clayton, and D. Kelly. Identification of carboxyla-tion enzymes and characterization of a novel 4-subunit pyruvate-flavodoxin oxi-doreductase from helicobacter-pylor. Journal of Bacteriology, 177:3953–3959,1995.

[61] L. Kerscher and D. Oesterhelt. Pyruvate - ferredoxin oxidoreductase new fin-dings on an ancient enzyme. Trends in Biochemical Science, 7:371–374, 1982.

[62] R.C. Wahl and W.H. Orme-Johnson. Clostridial pyruvate oxidoreductaseand the pyruvate-oxidizing enzyme specific to nitrogen-fixation in klebsiella-pneumoniae are similar enzymes. Journal of Biological Chemistry, 1987.

[63] A. Kletzin and M.W.W. Adams. Molecular and phylogenetic characterizati-on of pyruvate and 2-ketoisovalerate ferredoxin oxidoreductases from pyrococ-cus furiosus and pyruvate ferredoxin oxidoreductase from thermotoga maritima.Journal of Bacteriology, 178:248–257, 1996.

[64] E. Brostedt and S. Nordlund. Purification and partial characterization of a pyru-vate oxidoreductase from the photosynthetic bacterium rhodospirillum-rubrumgrown under nitrogen-fixing conditions. Biochemical Journal, 279:155–158,1991.

[65] R. Cammack, L. Kerscher, and D. Oesterhelt. A stable free radical interme-diate in the reaction of 2-oxoacid:ferredoxin oxidoreductase of halobacterium

halobium. FEBS Letters, 118:271–273, 1980.


[66] S. Menon and S.W. Ragsdale. Unleashing hydrogenase activity in carbon mon-oxide dehydrogenase/acetyl-coa synthase and pyruvate:ferredoxin oxidoreduc-tase. Biochemistry, 35:15814–15821, 1996.

[67] D.S. Horner, R.P. Hirt, and T.M. Embley. A single eubacterial origin of eukaryo-tic pyruvate : ferredoxin oxidoreductase genes: Implications for the evolution ofanaerobic eukaryotes. Molecular Biology and Evolution, 16:1280–1291, 1999.

[68] A.K. Bock, J. Kunow, J. Glasemacher, and P. Schonheit. Catalytic properties,molecular composition and sequence alignment of pyruvate:ferredoxin oxidore-ductase from methanogenic archeon methanosarcina bakeri. European Journal

of Biochemistry, 237:34–44, 1996.

[69] H.D.Jr. Peck. The Sulfate Reducing Bacteria: Contemporary Perspectives.Springer: Berlin, 1993.

[70] J.R. Postgate. The Sulfate Reducing Bacteria. Cambridge University Press:Cambridge, 1984.

[71] Q. Zhang, T. Iwasaki, T. Wakagi, and T. Oshima. 2-oxoacid:ferredoxin oxido-reductase from the thermoacidophilic archaeon, sulfolobus sp strain 7. Journal

of Biochemistry, 120:587–599, 1996.

[72] E. Chabriere, M.-H. Charon, A. Volbeda, L. Pieulle, E.C. Hatchikian, and J.C.Fontecilla-Camps. Crystal structures of the key anaerobic enzyme pyruvate :ferredoxin oxidoreductase, free and in complex with pyruvate. Nature Structu-

ral Biology, 6:182–190, 1999.

[73] S. Menon and S.W. Ragsdale. Mechanism of the clostridium thermoaceticumpyruvate:ferredoxin oxidoreductase: Evidence for the common catalytic inter-mediacy of the hydroxyethylthiamine pyropyrosphate radical. Biochemistry,36:8484–8494, 1997.

[74] C. Furdui and S.W. Ragsdale. The roles of coenzyme a in the pyruva-te:ferredoxin oxidoreductase reaktion mechanism: Rate enhancement of elec-tron transfer from a radical intermediat to an iron-sulfur cluster. Biochemistry,41:9921–9937, 2002.

[75] V.F. Bouchev, C.M. Furdui, S. Menon, R.B. Muthukumaran, S.W. Ragsdale, andJ. McCracken. Endor studies of pyruvate:ferredoxin oxidoreductase reactionintermediates. Journal of American Chemical Society, 121:3724–3729, 1999.


[76] G. Barletta, A.C. Chung, C.B. Rios, F. Jordan, and S.J. Schlegel. Electrochemi-cal oxidation of enamines related to the key intermediate on thiamin diphosphatedependent enzymic pathways: evidence for one-electron oxidation via a thiazo-lium cation radical. Journal of American Chemical Society, 112:8144–8149,1990.

[77] R. Docampo, S. Moreno, and R. Mason. Free radical intermediates in the reac-tion of pyruvate:ferredoxin oxidoreductase in tritrichomonas foetus hydrogeno-somes. Journal of Biological Chemistry, 262:12417–12420, 1987.

[78] A.K. Bock, P. Schonheit, and M. Texeira. The iron-sulfur centers of the py-ruvate:ferredoxin oxidoreductase form methanosarcina barkeri (fusaro). FEBS

Letters, 414:209–212, 1997.

[79] L. Pieulle, B. Guigliarelli, M. Asso, F. Dole, A. Bernadac, and E.C. Hatchikan.Isolation and characterization of the pyruvate-ferredoxin oxidoreductase fromthe sulfate-reducing bacterium desulfovibrio africanus. Biochimica et Biophy-

sica Acta, 1250:49–59, 1995.

[80] N.M. Atherton. Principles of Electron Spin Resonance. Ellis Horwood Limited,1993.

[81] A. Carrington and A. D. McLachlan. Introduction to Magnetic Resonance. Har-per and Row, Publishers, Inc.: New York, Evanston, London, 1967.

[82] C.P. Poole and A. Farach. Theory of Magnetic Resonance. John Willey andSons, Inc.: New York, 1987.

[83] A. J. Hoff. Advanced EPR. Elsevier: Amsterdam, 1987.

[84] J.E. Wertz and J.R. Bolton. Electron Spin Resonance. Chapman and Hall N.Y.London, 1986.

[85] C. Gerthsen, H.O. Kneser, and H. Vogel. Physik. Springer Verlag: Berlin Hei-delberg New York, 1974.

[86] D.I. Blochinzew. Grundlagen der Quantenmechanik. Verlag Harri Deutsch:Thun und Frankfurt am Main, 1988.

[87] B.H. Bransden and C.J. Joachain. Physics of Atoms and Molecules. Ellis Hor-wood Limited: New York, 1993.


[88] S. I. Weissman, J. Townsend, D. E. Paul, and G. E. Pake. Hyperfine splittingsin the paramagnetic resonances of free radicals. Journal of Chemical Physics,21:2227–2228, 1953.

[89] H. M. McConnell. Indirect hyperfine interactions in the paramagnetic resonancespectra of aromatic free radicals. Journal of Chemical Physics, 24:764–766,1956.

[90] S. I. Weissman. Isotropic hyperfine interactions in aromatic free radicals. Jour-

nal of Chemical Physics, 21:890–891, 1956.

[91] C. Heller and H.M. McConnell. radiation damage in organic crystals. ii.electronspin resonance of (co2h)ch2ch(co2 j) in β-succinic acid. Journal of Chemical

Physics, 32:1535–1539, 1960.

[92] R. Bersohn. Proton hyperfine interactions in semiquinone ions. Journal of

Chemical Physics, 24:1066–1070, 1956.

[93] K. O. Schäfer, R. Bittl, W. Zweygart, F. Lendzian, G. Haselhorst, T. Weyher-mülller, K. Wieghardt, and W. Lubitz. Electronic structure of antiferromagneti-cally coupled dinuclear manganese (mnIIImnIV ) complexes studied by magne-tic resonance techniques. Journal of American Chemical Society, 120:13104–13120, 1998.

[94] A. Bencinin and D. Gattechi. Electron Paramagnetic Resonance of Exchange

Coupled Systems. Springer-Verlag: Berlin Heidelberg New-York, 1990.

[95] P. Bertrand and B. Guigliarelli. The mixed-valence [fe(iii), fe(ii)] binuclearcenters of biological molecules viewed through epr spectroscopy. New Journal

of Chemistry, 1991.

[96] R.H. Sands and W.R. Dunham. Spectroscopic studies on 2-iron ferredoxins.Quaterly Reviews of Biophysics, 7:443–504, 1974.

[97] G. Blondin and J.J. Girerd. Interplay of electron exchange and electron-transferin metal polynuclear complexes in proteins or chemical-models. Chemical Re-

view, 90:1359–1376, 1990.

[98] M. Zheng, S.V. Khangulov, G.C. Dismukes, and V.V. Barynin. Electronic-structure of dimanganese(ii,iii) and dimanganese(iii,iv) complexes and diman-ganese catalase enzyme - a general epr spectral simulation approach. Inorganic

Chemistry, 33:382–387, 1994.


[99] L. Petersson, A. Gräslund, A. Ehrenberg, B.M. Sjöberg, and P. Reichard. Theiron center in ribonucleotide reductase from escherichia-coli. Journal of Biolo-

gical Chemistry, 255:6706–6709, 1980.

[100] A.L. Barra, A. Caneschi, A. Cornia, F.F. de Biani, D. Gatteschi, C. Sangregorio,R. Sessoli, and L. Sorace. Single-molecule magnet behavior of a tetranucleariron(iii) complex. the origin of slow magnetic relaxation in iron(iii) clusters.Journal of American Chemical Society, 121:5302–5310, 1999.

[101] G. Jeschke. Einführung in die esr spektroskopie. www.mpip-mainz.mpg.de/jeschke, 1998.

[102] W. B. Mims. Proceedings of the Royal Society London, 283:452, 1965.

[103] E.R. Davies. A new pulse endor technique. Physics Letters A, 47:1–2, 1974.

[104] A. Schweiger and G. Jeschke. Principles of Pulse Electron Paramagnetic Re-

sonance. Oxford University Press, 2001.

[105] B.M. Sjöberg, S. Hahne, M. Karlsson, H. Jörnvalland M. Göransson, and B.E.Uhlin. Overproduction and purification of the b2 subunit of ribonucleotide re-ductase from escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry, 261:5658–5662.

[106] M. Kolberg. Generation and characterization of free and metal associated ami-

no acid radicals in Ribonucleotide Reductase using epr techniques. PhD thesis,TU Berlin, 2001.

[107] M. Högbohm, M. Galander, M. Andersson, M. Kolberg, W. Hofbauer, G. Lass-mann, P. Nordlund, and F. Lendzian. Displacement of the tyrosyl radical co-factor in ribonucleotide reductase obtained by single-crystal high-field epr and1.4 a x-ray data. Proceedings of National Academy of Science, 100:3209–3214,2003.

[108] A. Stesmanns and G. VanGorp. Novel method for accurate g measurements inelectron-spin resonance. Review of Scientific Instruments, 60:2949–2952, 1989.

[109] F. Lendzian. Elektron-Kern-Mehrfachresonanz an Primärprodukten der Photo-

synthese. PhD thesis, FU Berlin, 1982.

[110] H. Goldstein. Klassische Mechanik, chapter 4. Akademische Verlagsgesell-schaft Wiesbaden, 1983.


[111] J.W. Eaton. Gnu octave. www.octave.org.

[112] M.J. Mombourquette and J.A. Weil. Simulation of magnetic resonance powderspectra. Journal of Magnetic Resonance, 99:37, 1992.

[113] C. Gessner. NiFe-Hydrogenasen: Beiträge der EPR-Spektroskopie zur Struk-

turaufklärung des aktiven Zentrums. PhD thesis, TU Berlin, 1996.

[114] W.H. Press, S.A. Teukolsky, W.T. Vetterlind, and B.P. Flannery. Numerical Re-

cipies in C++, chapter 10. Cambridge University Press, 2002.

[115] J.A. Nelder and R. Mead. A simplex method for function minimization. Com-

puter Journal, 7:308–313, 1965.

[116] J.T. Törring. Untersuchungen zum g-Tensor des primären Donors in bakteriel-

len Reaktionszentren. PhD thesis, FU Berlin, 1995.

[117] R. Parr and W. Yang. Density Functional Theory of Atoms and Molecules.Oxford University Press: New York, 1989.

[118] L.J. Bartolotti and K. Flurchick. Reviews in Computational Chemistry. VCHPublishers: New York, 1996.

[119] P. M. W. Gill. Encyclopedia of Computational Chemistry,. Eds, Wiley-VCH:Chichester, 1998.

[120] T. Ziegler. Approximate density functional theory as a practical tool in molecu-lar energetics and dynamics. Chemical Reviews, 91:651–667, 1991.

[121] P. Hohenberg and W. Kohn. Inhomogenous electron-gas. Physical Review,136:864–871, 1964.

[122] G. H. Wagniere. Introduction to Elementary Molecular Orbital Theory and to

Semiempirical Methods. Springer-Verlag: Berlin,Heidelberg, New York, 1976.

[123] A. D. Becke. Density-functional thermochemistry. iii. the role of exact ex-change. Journal of Chemical Physics, 98:5648–5652, 1993.

[124] M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R.Cheeseman, J. A. Montgomery, Jr., T. Vreven, K. N. Kudin, J. C. Burant, J. M.Millam, S. S. Iyengar, J. Tomasi, V. Barone, B. Mennucci, M. Cossi, G. Scal-mani, N. Rega, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota,R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai,


M. Klene, X. Li, J. E. Knox, H. P. Hratchian, J. B. Cross, V. Bakken, C. Adamo,J. Jaramillo, R. Gomperts, R. E. Stratmann, O. Yazyev, A. J. Austin, R. Cammi,C. Pomelli, J. W. Ochterski, P. Y. Ayala, K. Morokuma, G. A. Voth, P. Salva-dor, J. J. Dannenberg, V. G. Zakrzewski, S. Dapprich, A. D. Daniels, M. C.Strain, O. Farkas, D. K. Malick, A. D. Rabuck, K. Raghavachari, J. B. Fores-man, J. V. Ortiz, Q. Cui, A. G. Baboul, S. Clifford, J. Cioslowski, B. B. Stefanov,G. Liu, A. Liashenko, P. Piskorz, I. Komaromi, R. L. Martin, D. J. Fox, T. Keith,M. A. Al-Laham, C. Y. Peng, A. Nanayakkara, M. Challacombe, P. M. W. Gill,B. Johnson, W. Chen, M. W. Wong, C. Gonzalez, and J. A. Pople. Gaussian 03,Revision C.02. Gaussian, Inc., Wallingford, CT, 2004.

[125] R.F. Curl. Relationship between electron spin rotation coupling constants andg-tensor components. Molecular Physics, 9:585, 1965.

[126] J.Gauss, K. Ruud, and T. Helgaker. Perturbation-dependent atomic orbitals forthe calculation of spin-rotation constants and rotational g tensors. Journal of

Chemical Physics, 105:2804–2812, 1996.

[127] V. Barone. Electronic, vibrational and environmental effects on the hyperfinecoupling constants of nitroside radicals. h2no as a case study. Chemical Physics

Letters, 262:201–206, 1996.

[128] F. Neese. Prediction of electron paramagnetic resonance g values using coupledperturbed hartree-fock and kohn-sham theory. Journal of Chemical Physics,115:11080–11096, 2001.

[129] G.S. Gerfen, B.F. Bellew, S. Un, J.M.Jr. Bollinger, J. Stubbe, and R.G. Griffin.High-frequency (139.5 ghz) epr spectroscopy of the tyrosyl radical in esche-richia coli ribonucleotide reductase. Journal of American Chemical Society,115:6420–6421, 1993.

[130] P.J. vanDam, J.-P. Willems, P.P. Schmidt, S. Pötsch, A.-L. Barra, W.R. Hagen,B.M. Hoffmann, K.K. Andersson, and A. Gräslund. High-frequency epr andpulsed q-band endor studies on the origin of the hydrogen bond in tyrosyl ra-dicals of ribonucleotide reductase r2 proteins from mouse and herpes simplexvirus type 1. Journal of American Chemical Society, 120:5080–5085, 1998.

[131] P. Allard, A.-L. Barra, K.K. Andersson, P.P. Schmidt, M. Atta, and A. Gräs-lund. Characterization of a new tyrosyl free radical in salmonella typhimuriumribonucleotide reductase with epr at 9.45 and 245 ghz. Journal of American



[132] G. Bleifuss, M. Kolberg, S. Pötsch, W. Hofbauer, R. Bittl, W. Lubitz, A. Gräs-lund, G. Lassmann, and F. Lendzian. Tryptophan and tyrosine radicals in ri-bonucleotide reductase: A comparative high-field epr study at 94 ghz. Bioche-

mistry, 40:15362–15368, 2001.

[133] S. Un, C. Gerez, E. Elleingand, and M. Fontecave. Sensitivity of tyrosyl radicalg-values to changes in protein structure: A high-field epr study of mutants ofribonucleotide reductase. Journal of American Chemical Society, 123:3048–3054, 2001.

[134] K.K. Andersson, P.P. Schmidt, B. Katterle, K.R. Strand, A.E. Palmer, S.K. Lee,E.I. Solomon, A. Gräslund, and A.L. Barra. Examples of high frequency eprstudies in bioinorganic chemistry. Journal of Biological Inorganic Chemistry,pages 235–247, 2003.

[135] G. Bar, M. Bennati, H.H.T. Nguyen, J. Stubbe, and R.G. Griffin. High frequence(140 ghz) time domain epr and endor spectroscopy: the tyrosyl radical-diironcofactor in ribonucleotide reductase from yeast. Journal of American Chemical

Society, 123:3569–3576, 2001.

[136] A.M. Liu, A.L. Barra, H. Rubin, G.Z.Luz, and A. Gräslund. Heterogeneity ofthe local electrostatic enviroment of the tyrosyl radical in myobacterium tuber-

culosis ribonucleotide reductase observed by high-field electron paramagneticresonance. Journal of American Chemical Society, pages 1974–1978, 2000.

[137] P.P. Schmidt, K.K. Andersson, A.L. Barra, L. Thelander, and A. Gräslund. Highfield epr studies of mouse ribonucleotide reductase indicate hydrogen bondingof the tyrosyl radical. Journal of Biological Chemistry, 271:23518–23615,1996.

[138] A. Liu, M. Sahlin, S. Pötsch, B.M. Sjöberg, and A. Gräslund. Biochemical

Biophysical Research Communication, 246:740–745, 1998.

[139] M. Engström, F. Himo, A. Gräslund, B. Minaev, O. Vahtras, and H. Agren.Hydrogen bonding to tyrosyl radical analyzed by ab initio g-tensor calculations.Journal of Physical Chemistry A, 104:5149–5153, 2000.

[140] A.J. Stone. Proceedings of the Royal Society London A, A271:424, 1963.


[141] O. Burghaus, M. Plato, M. Rohrer, K. Möbius, F. MacMillan, and W. Lubitz.3-mm high-field epr on semiquinone radical-anions q.- related to photosyn-thesis and on the primary donor p.+ and acceptor qa.- in reaction centers ofrhodobacter-sphaeroides r-26. Journal of Physical Chemistry, 1993.

[142] M. Bennati, C.T. Farrar, J.A. Bryant, S.J. Inati, V. Weis, G.J. Gerfen, P. Riggs-Gelasco, J. Stubbe, and R.G. Griffin. Pulsed electron-nuclear double resonance(endor) at 140 ghz. Journal of Magnetic Resonance, 138:232–243, 1999.

[143] C.W. Hoganson, M. Sahlin, B.-M. Sjöberg, and G.T. Babcock. Electron magne-tic resonance of the tyrosyl radical in ribonucleotide reductase from escherichiacoli. Journal of Amercican Chemical Society, 118:4672–4679, 1996.

[144] A. Mezzetti, A.L. Maniero, M. Brustolon, G. Giacometti, and L.C. Brunel. Atyrosyl radical in an irradiated single crystal of n-acetyl-l-tyrosine studied by x-band cw-epr, high-frequency epr, and endor spectroscopies. Journal of Physical

Chemistry A, 103:9636–9643, 1999.

[145] E.L. Fasanella and W. Grody. Electron spin resonance of an irradiated singlecrystal of l-tyrosine-hcl*. Proceedings of the National Academy of Science,62:299–304, 1969.

[146] M. Bennati, J. Stubbe, and R.G. Griffin. High frequency epr and endor: time-domain spectroscopy of ribonucleotide reductase. Applied Magnetic Reso-

nance, 21:389–410.

[147] C.J. Bender, M. Sahlin, G.T. Babcock, B.A. Barry, T.K. Chandrashekar, S.P.Salowe, J. Stubbe, B. Lindstrom, L. Petersson, A. Ehrenberg, and B.-M. Sjö-berg. An endor study of the tyrosyl free radical in ribonucleotide reductasefrom escherichia coli. Journal of American Chemical Society, 111:8076–8083,1989.

[148] W. Hofbauer, A. Zouni, R. Bittl, J. Kern, P. Orth, F. Lendzian, P. Fromme, H.T.Witt, and W. Lubitz. Photosystem ii single crystals studied by epr spectroscopyat 94 ghz: The tyrosine radical yds*. Proceedings of the National Academy of

Science, 98:6623–6628, 2001.

[149] M. E. Andersson, M. Högbohm, A. Rinaldo-Matthis, K.K. Andersson, B-M.Sjöberg, and P. Nordlund. The crystal structure of an azide complex of the di-ferrous r2 subunit of ribonucleotide reductase displays a novel carboxylate shift


with important mechanistic implications for diiron-catalyzed oxygen activation.Journal of American Chemical Society, 121:2346–2352, 1999.

[150] M.A. Miller, F.T. Gobena, K. Kaufmann, F. Münck, T.Jr. Que, and M.T. Stan-kovich. Differing roles for the diiron clusters of ribonucleotide reductase fromaerobically grown escherichia coli in the generation of the y122 radical. Journal

of American Chemical Society, 121:1096–1097, 1999.

[151] F. Himo, A. Gräslund, and L.A. Eriksson. Density functional calculations onmodel tyrosyl radicals. Biophysical Journal, 72:1556–1567, 1997.

[152] A. Jordan, I. Gilbert, and J.Barbe. Cloning and sequencing of the genes from sal-monella typhimurium encoding a new bacterial ribonucleotide reductase. Jour-

nal of Bacteriology, 176:3420–3427, 1994.

[153] A. Jordan, E. Pontis, M. Atta, M. Krook, I. Gilbert, J. Barbe, and P. Reichard. Asecond class i ribonucleotide reductase in enterobacteriaceae: Characterizationof the salmonella typhimurium enzyme. Proceedings of the National Academy

of Science, 91:12892–12896, 1994.

[154] A. Jordan, E. Aragall, I. Gilbert, and J. Barbe. Promoter identification and ex-pression analysis of salmonella typhimurium and escherichia coli nrdef operonsencoding one of two class i ribonucleotide reductases present in both bacteria.Molecular Microbiology, 19:777–790, 1996.

[155] A. Jordan, I. Gilbert, and J. Barbe. Two different operons for the same functi-on: comparison of the salmonella typhimurium nrd ab and nrdef genes. Gene,167:75–79, 1995.

[156] F.D. Yang, G.Z. Lu, and H. Rubin. Isolation of ribonucleotide reductase frommycobacterium tuberculosis and cloning, expression, and purification of the lar-ge subunit. Journal of Bacteriology, 176:6738–6743, 1994.

[157] A. Jordan, E. Pontis, F. Åslund, U. Hellmann, I. Gilbert, and P. Reichard. Theribonucleotide reductase system of lactococcus lactis. Journal of Biological

Chemistry, 271:8779–8785, 1996.

[158] C. Scotti, A. Valbuzzi, M. Perego, A. Galizzi, and A.M. Albertini. The bacillussubtilis genes for ribonucleotide reductase are similar to the genes for the secondclass i nrde/nrdf enzymes of enterobacteriaceae. Microbiology, 142:2995–3004,1996.


[159] M. Uppsten. priv. Mitteilung, 2005.

[160] G. McClarty and G. Triples. Insitu studies on incorporation of nucleic-acidprecursors into chlamydia-trachomatis dna. Journal of Bacteriology, 173:4922–493.

[161] G. Tipples and G. McClarty. The obligate intracellular bacterium chlamydia-trachomatis is auxotrophic for 3 of the 4 ribonucleoside triphosphates. Molecu-

lar Microbiology, 8:1105–1114, 1993.

[162] C. Roshick, E.R. Iliffe-Lee, and G. McClarty. Cloning and characterizationof ribonucleotide reductase fromchlamydia trachomatis. Journal of Biological

Chemistry, 275:38111–38119, 2000.

[163] M.-H. Baik, M. Newcomb, R.A. Friesner, and S.J. Lippard. Mechanistic stu-dies on the hydroxaltion of methane by methane monooxygenase. Chemical

Reviews, 103:2385–2419, 2003.

[164] G. Bleifuss. High-Field EPR and ENDOR Investigations on Radicals and Metal

Centers in Subunit R2 Wild Type and Mutant Class Ia Ribonucliotide Reductase.PhD thesis, TU Berlin, 2001.

[165] Stefan Stoll. Spectral Simulations in Solid-State EPR. PhD thesis, ETH Zürich.

[166] N. Ravi, J.M. Bollinger, B.H. Huynh, D.E. Edmondson, and J. Stubbe. Journal

of American Chemical Society, 116:8007–8014, 1994.

[167] J.T. Sage, Y.M. Xia, P.G. Debrunner, D.T. Keough, J. deJersey, and B. Zerner.Mössbauer analysis of the binuclear iron site in purple acid phosphatase frompig allantoic fluid. Journal of American Chemical Society, 111:7239–7247,1989.

[168] V.L. Macmurdo, H. Zheng, and L.Jr. Que. Inorganic Chemistry, 39:2254–2255,2000.

[169] M. Atta, K.K. Andersson, R. Ingemarson, L. Thelander, and A. Gräslund. Eprstudies of mixed-valent [feIIfeIII] clusters formed in the r2 subunit of ribo-nucleotide reductase from mouse of herpes simplex virus: Mild chemical reduc-tion of the diferric centers. Journal of American Chemical Society, 116:6429–6430, 1994.


[170] V.J. DeRose, K.E. Liu, S.J. Lippard, and B.M. Hoffmann. Journal of American


[171] M. Kammel. Cofactors on the Donor Site of Photosystem II Investigated with

EPR Techniques. PhD thesis, TU Berlin, 2003.

[172] G.Schaftenaar and J.H. Noordik. Molden: a pre- and post-processing programfor molecular and electronic structures. J. Comput.-Aided Mol. Desig, 2000.

[173] P.A. Frey. Coenzymes and radicals. Science, 294:2489–2490, 2001.

[174] D. Kurad, G. Jeschke, and D. Marsh. Lipid membrane polarity profiles by high-field epr. Biophysical Journal, 85:1025–1033, 2003.

[175] R. Owenius, M. Engström, and M. Lindgren. Influence of solvent polarity andhydrogen bonding on the epr parameters of a nitroxide spin label studied by9-ghz and 95-ghz epr spectroscopy and dft calculations. Journal of Physical

Chemistry, 105:10967–10977, 2001.

[176] A. Schäfer, H. Horn, and R. Ahlrichs. Fully optimized contracted gaussian basissets for atoms li to kr. Journal of Chemical Physics, 97:2571–2577, 1993.

[177] A. Schäfer, C. Huber, and R. Ahlrichs. Fully optimized contracted gaussianbasis sets of triple zeta valence quality for atoms li to kr. Journal of Chemical

Physics, 100:5829–5835, 1994.

Danksagung

Ganz herzlich möchte ich meinem Betreuer Dr. Friedhelm Lendzian für die Möglich-keit danken, während meiner Promotion an vielen interessanten und verschiedenenProjekten zu arbeiten, die stete, interessierte Diskussionsbereitschaft und die angeneh-me Zusammenarbeit. Deine positive, motivierte Herangehensweise an wissenschaftli-che Fragestellungen und deine Neugier ist für mich beispielhaft. Danke für vier Jahre,von denen ich nicht nur wissenschaftlich enorm profitiert habe.Herrn Prof. Dr. Peter Hildebrandt danke ich dafür, dass er die Aufgabe des Mitberich-ters dieser Arbeit übernommen hat und die aufmunternden Worte am Saisonanfang.Martin Högbom aus der Gruppe von Prof. P. Nordlund danke ich für die R2-Einkristalleaus E. coli und die Radikalgenerierung. Für die Bestimmung der Reorientierung desRadikals Y122• war die hochaufgelöste 1.4 Å Röntgenstruktur unerlässlich.Die Messungen an den Einkristallen und Lösungen von R2F und R1E/R2F S. typhi-

murium wurde durch die Kooperation mit Malin Uppsten aus der Gruppe von Prof. U.Uhlin möglich. Danke für die Proben und die Erweiterung meines Wissens über Kri-stallsymmetriegruppen und die Wirkung von ESR Spektroskopikern auf Biochemiker.Für die Proben aus C. trachomatis danke ich Nina Voevodskaya aus der Gruppe vonProf. A. Gräslund. Prof. G. McClarty gebührt der Dank für diese ungewöhnliche Klas-se RNR Enzyme.Christine Cavazza aus der Gruppe von Prof. J. Fontecilla-Camps gilt der Dank für diegefrorenen Lösungen und die Einkristalle der PFOR D. africanus.Prof. B.M. Sjöberg danke ich für die vielen verschiedenen E. coli Stämme.Ich weiss nicht, ob ich ohne die Mithilfe von Claudia Schulz einen der E. coli Stämmein eine ESR Probe verwandelt hätte. Danke für die Beantwortung meiner “komischenPhysikerfragen” und die Entdeckung der HPLC.Ein besonderer Dank gilt Prof. Robert Bittl nicht nur für die nahezu unbeschränktenNutzungsrechte des W-Band Spektrometers. Die Diskussionen über das erweiterte Di-pol Modell waren mir eine große Hilfe.Meinem ehemaligen Schreibtischnachbarn Christian Teutloff danke ich für seine Ge-sprächsbereitschaft zu nahezu jedem Thema. Deine längere Erfahrung in der ESR undden Dingen des Lebens war immer spürbar. Celine Elsäßer, die Meisterin der Pulse,danke für Rat und Tat bei diesen Experimenten.Allen Mitarbeitern der AG Hildebrandt (David, Ingo, Anja, Hendrik, ...) danke ich fürsehr angenehme Atmosphäre.Der DFG danke ich für die Finanzierung meiner Dissertation (SPP 1021, Projekt: Le812/1-2,3)

Den Korrekturlesern Volker, Georg, Christian, Celine, Ute und Nicola sei herzlichstgedankt.Meiner Familie und meiner bezaubernden Freundin Nicola Moebius danke ich für ihreUnterstüzung, ohne die die Arbeit nicht möglich gewesen wäre.

Lebenslauf

Name Marcus Galander

Geburtsdatum 19.02.1975

Geburtsort Merseburg

Eltern Uli Galander und Marion Galander, geb. Steinbrück

Ausbildung

1983-1993 Johann-Gottfried Herder Gymnasium, Merseburg,

1993 Abitur

10/1994 Beginn des Physikstudiums, Freie Universität Berlin

04/1997 Vordiplom in Physik

05/1999- 12/2000 Diplomarbeit an der FU Berlin in der AG von Prof. Dr. K. Mö-bius: “Erste Continuous-Flow ESR-Experimente im Hochfeld(95 GHz)”

04/2001 Diplom in Physik

seit 06/2001 Beginn der vorliegenden Dissertation in der Arbeitsgruppe vonDr. F. Lendzian am Max-Volmer Laboratorium für Biophysikali-sche Chemie der TU Berlin

10/2001- 10/2004 Aufbaustudium Medizinische Physik

10/2004 erfolgreicher Abschluss des Aufbaustudiums

Tätigkeiten

10/1993- 09/1994 Wehrdienst

1997 - 2001 Tutor im Physikalischen Praktikum für Mediziner, Pharmazeutenund Geologen

1997 - 2000 Sportbetreuer/Leitung in Ferienlagern für Kinder und Jugendliche

seit 06/2001 wissenschaftlicher Mitarbeiter in der Arbeitsgruppe von Dr. F.Lendzian am Max-Volmer Laboratorium für BiophysikalischeChemie der TU Berlin

Strukturelle Untersuchungen an der Ribonukleotid Reduktase ... · tronische Struktur (σ- oder...

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