Die Rolle von Nitrilasen in der Herbivor-induzierten ... · β-Cyano-L-alanin, welches als...

Friedrich-Schiller-Universität Jena

Biologisch-Pharmazeutische Fakultät

Max-Planck-Institut für chemische Ökologie Jena

Abteilung Biochemie

Arbeitsgruppe Biosynthese und Funktion flüchtiger Stoffe in

Gehölzpflanzen und Gräsern

Die Rolle von Nitrilasen in der Herbivor-induzierten

Biosynthese von 2-Phenylethanol in Populus trichocarpa

Masterarbeit

zur Erlangung des akademischen Grades

Master of Science (M.Sc.)

vorgelegt von

Jan Günther

Geboren am 27.10.1987 in Hohenmölsen

http://www.ice.mpg.de/ext/782.html?&L=1#header_logo

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Gutachter: 1. Dr. T. G. Köllner

2. Prof. J. Gershenzon

3. Prof. B. Jungnickel

Selbstständigkeitserklärung

I

Selbstständigkeitserklärung

Hiermit erkläre ich, die vorgelegte Masterarbeit mit dem Titel „Die Rolle von Nitrilasen

in der Herbivor-induzierten Biosynthese von 2-Phenylethanol in Populus trichocarpa“

selbstständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und

Hilfsmittel verwendet zu haben.

Jegliche, nicht von mir stammende, Wortlaute habe ich dabei besten Wissens und

Gewissens als solche gekennzeichnet.

Die Arbeit wurde nur bei dem Prüfungsamt der Friedrich-Schiller-Universität Jena

eingereicht und jedes existierende, gebundene Exemplar ist vollständig identisch. Ein

Exemplar verbleibt in meinem persönlichen Besitz.

…………………………………………………………………………………….

Unterschrift: Jan Günther Jena, den

Inhaltsverzeichnis

II

Inhaltsverzeichnis

Selbstständigkeitserklärung ................................................................................................ I

Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................... II

Tabellenverzeichnis ........................................................................................................... IV

Abbildungsverzeichnis ....................................................................................................... V

Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................... VI

Abstract............................................................................................................................. VIII

Zusammenfassung ............................................................................................................. IX

1. Einleitung ...................................................................................................................... 1

1.1. Pflanzliche Sekundärmetabolite .............................................................................. 1

1.2. 2-Phenylethanol-Biosynthese im Reich der Eukaryoten .......................................... 4

1.3. Physiologische Rolle von Nitrilasen in Pflanzen ...................................................... 6

1.4. Struktur und Funktion von Nitrilasen ........................................................................ 7

1.5. Zielstellung .............................................................................................................11

2. Material und Methoden ...............................................................................................12

2.1. Sequenzanalyse (Genom-BLAST) .........................................................................12

2.2. Phylogenetische Analyse .......................................................................................12

2.3. Pflanzenanzucht und Raupenzucht ........................................................................12

2.4. Erstellen einer cDNA-Bibliothek..............................................................................13

2.5. Amplifikation von Nitrilasegenen.............................................................................13

2.6. Ligation ..................................................................................................................14

2.6.1. Zero Blunt® TOPO® und pET101/D-TOPO® .....................................................14

2.6.2. USER™-System .............................................................................................14

2.7. Transformation .......................................................................................................16

2.7.1. Agrobacterium tumefaciens .............................................................................16

2.7.2. Erzeugung transienter N. benthamiana-Pflanzen ............................................16

2.7.3. Escherichia coli-Transformation ......................................................................17

2.8. Kolonie-PCR ..........................................................................................................18

2.9. Plasmidpreparation ................................................................................................18

2.10. Big Dye Terminator 3.1 Sequenzierungsreaktion ................................................19

2.11. Proteinaufreinigung .............................................................................................19

2.12. Bradford Assay ...................................................................................................20

2.13. SDS-PAGE .........................................................................................................20

2.14. Western Blot .......................................................................................................20

2.15. Enzymassay .......................................................................................................21

2.16. Supplementationsexperiment mit P. trichocarpa .................................................22

2.17. Duftstoffsammlung ..............................................................................................22

Inhaltsverzeichnis

III

2.18. Gaschromatografie .............................................................................................23

2.18.1. Extraktion von Blattmaterial .............................................................................24

2.19. LC-MS/MS Analytik .............................................................................................24

2.20. Synthese von Phenyl-d5-acetaldoxim .................................................................26

2.21. qRT-PCR ............................................................................................................26

2.22. Statistik ...............................................................................................................27

3. Ergebnisse ...................................................................................................................28

3.1. Fütterungsexperimente zur Aufklärung der Biosynthese von 2-Phenylethanol in

P. trichocarpa .........................................................................................................28

3.1.1. Jasmonsäure-Induzierte Emission von Duftstoffen abgeschnittener

Pappelblätter ...................................................................................................28

3.1.2. Phenylacetaldoxim ist der Vorläufer diverser aromatischer Duftstoffe .............29

3.1.3. Phenylessigsäure dient als Vorläufer von 2-Phenylethanol .............................31

3.1.4. Fütterung von alternativen Vorläufern der 2-Phenylethanol-Biosynthese .........33

3.2. Identifizierung von Nitrilasen im Genom von P. trichocarpa ....................................34

3.3. Klonierung und heterologe Expression von Nitrilasen aus P. trichocarpa ...............37

3.3.1. Produktspezifität und enzymatische Charakterisierung von

Nitrilasen aus P. trichocarpa ............................................................................37

3.4. Q-PCR ...................................................................................................................40

3.5. Überexpression in N. benthamiana ........................................................................42

3.5.1. Duftstoffsammlung ..........................................................................................42

3.5.2. Analyse von Intermediaten der 2-Phenylethanol-Biosynthese .........................44

4. Diskussion ...................................................................................................................46

4.1. Die Jasmonsäure-abbhängige Biosynthese von Duftstoffen in P. trichocarpa ........46

4.2. Die Biosynthese von 2-Phenylethanol in P. trichocarpa verläuft vermutlich über

Benzylcyanid und Phenylessigsäure ......................................................................46

4.3. NIT1 ist wahrscheinlich in die Biosynthese von 2-Phenylethanol in

P. trichocarpa involviert ..........................................................................................49

4.4. NIT1 und NIT3 scheinen eine Rolle im Blausäuremetabolismus in

P. trichocarpa zu spielen ........................................................................................50

4.5. Die potentielle Bedeutung von Nit2 und Nit3 ..........................................................51

4.6. NIT1 könnte im Metabolismus von Auxinen eine Rolle spielen ...............................52

Ausblick ..............................................................................................................................54

Danksagung ........................................................................................................................55

Referenzen ..........................................................................................................................56

Anhang ................................................................................................................................61

Tabellenverzeichnis

IV

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Komponenten eines PCR Ansatzes. ............................................................................. 13

Tabelle 2: Temperaturprofil der Phusion-PCR. .............................................................................. 13

Tabelle 3: Komponenten eines PCR-Ansatzes mit der PfuTurbo Cx-Polymerase. ................ 16

Tabelle 4: Komponenten eines Kolonie-PCR-Ansatzes mit der GoTaq-Polymerase. ............. 18

Tabelle 5: Temperaturprofil der Kolonie-PCR ................................................................................ 18

Tabelle 6: Elutionsprofil für die Aminosäure Analytik. ................................................................... 25

Tabelle 7: Elutionsprofil für die Analyse von Phenylacetaldoxim, Phenylessigsäure

und Indol-3-essigsäure. .................................................................................................. 25

Tabelle 8: Multiple Reaktionsüberwachung aller analysierten Stoffe (MRM). ........................... 25

Tabelle 9: Komponenten der qRT-PCR. ......................................................................................... 27

Tabelle 10: Temperaturprofil der qRT-PCR. .................................................................................. 27

Tabelle 11: Kinetische Konstanten von NIT1 und NIT3. ............................................................... 39

Tabelle 12: Sequenzen der verwendeten Primer.. ........................................................................ 61

Tabelle 13: Primer, die für die qRT-PCR verwendet wurden. ...................................................... 61

Abbildungsverzeichnis

V

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Die Rolle von volatilen organischen Verbindungen in

Pflanzen-Insekten Interaktionen. ................................................................................ 3

Abbildung 2: Biosynthese von 2-Phenylethanol in Hefe und höheren Pflanzen. ....................... 5

Abbildung 3: Strukturelle Eigenschaften von Nitrilasen. ................................................................. 8

Abbildung 4: Reaktionsmechanismus von Nitrilasen und Nitril-Hydratasen. ............................ 10

Abbildung 5: Das USERTM-System. ................................................................................................. 15

Abbildung 6: Die Duftemission von Jasmonsäure-induzierten Blättern von P. trichocarpa

im Vergleich zu unbehandelten Kontrollblättern. ................................................... 28

Abbildung 7: Emission von Deuterium-markierten Duftstoffen nach Fütterung von

Deuterium-markiertem Phenylacetaldoxim (Phenyl-d5-acetaldoxim)

in P. trichocarpa-Blättern. .......................................................................................... 30

Abbildung 8: Emission von markierten Duftstoffen nach Fütterung von markierter

Phenylessigsäure (1,2-13C2-Phenylessigsäure) in P. trichocarpa-Blättern......... 32

Abbildung 9: Aromatische Duftstoffe von Einzelblättern von P. trichocarpa nach

Supplementation mit putativen Substraten und Intermediaten der

2-Phenylethanol-Biosynthese. ................................................................................... 34

Abbildung 10: Sequenzvergleich der putativen Nitrilasen aus P. trichocarpa........................... 35

Abbildung 11: Phylogenetischer Baum (Chladogramm) von bereits charakterisierten

Nitrilasen aus Angiospermen und putativen Nitrilasen der Westlichen

Balsampappel. ........................................................................................................... 36

Abbildung 12: Enzymatische Aktivität von NIT1 und NIT3. .......................................................... 38

Abbildung 13: Transkriptakkumulation von Nit1, Nit2 und Nit3 in Herbivor-induzierten

und Kontroll-Blättern von P. trichocarpa. ............................................................... 41

Abbildung 14: Konzentration von Phenylessigsäure und Phenylacetaldoxim in N.

benthamiana-Pflanzen nach transienter Transformation mit eGFP, Nit1,

CYP79D6v3 bzw. CYP79D6v3+Nit1. ..................................................................... 43

Abbildung 15: Emittierte VOC´s von transfizierten N. benthamiana-Pflanzen. ......................... 45

Abbildung 16: Putative 2-Phenylethanol Biosynthese in P. trichocarpa. ................................... 48

Abbildung 17: Reaktionsoptima von NIT1. ..................................................................................... 62

Abbildung 18: Standardkurve von BSA für die Bestimmung der Proteinkonzentration nach

der Bradford-Methode. ............................................................................................. 62

Abbildung 19: Substrat-Produkt-Kurven zur Bestimmung der

enzymkinetischen Konstanten. ............................................................................... 63

Abkürzungsverzeichnis

VI


AADC Aromatische L-Aminosäure Decarboxylase

AB Antikörper = „antibody“

ANOVA Varianzanalyse = „analysis of variance“

BLAST „Basic local alignment search tool”

BSA Rinderserum Albumin = „bovine serum albumine“

cDNA komplementäre DNA = „complementary DNA“

CE Kollisionsenergie = „collision energy“

Chr. Chromosom

CYP79D6v3 Cytochrom P450 79D6 version 3

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxynucleotidtriphosphat

DMSO Dimethylsulfoxid

DP Fragmentierungspotential = „declustering potential“

Dpn1 Restriktionsenzym aus Diplococcus pneumoniae G41

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

eGFP verstärktes grün fluoreszierendes Protein = „enhanced green

fluorescent protein“

GC-FID Gaschromatographie gekoppelt mit einem

Flammenionisationsdetektor

GC-MS Gaschromatographie gekoppelt mit einem Massenspektrometer

GLV Duftstoffe der grünen Blätter = „green leaf volatiles“

His6 Peptid aus 6 Histidinresten

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie = „high-performance

liquid chromatography“

HRP Meerettich Peroxidase = “horseradish peroxidase”

IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside

kb Kilobasen

kDa Kilodalton

LB-Medium Luria-Bertani-Medium

LC-MS/MS Flüssigchromatographie gekoppelt mit einem

Massenspektrometer = „liquid chromatography – tandem mass

Spectrometry“

LPI „leaf plastochron index“


VII

m/z Masse-Ladungs-Verhältnis

MES 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure

miRNA mikro RNA

mRNA messenger RNA

NIT Nitrilase (Enzym)

Nit Nitrilase (Gen)

NSB Nitrilase-Lagerungs-Puffer

OD600 Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm

p19 virales Protein, welches pflanzliches „gene silencing“ suprimiert

PAGE Polyacrylamid Gelelektrophorese

PAR Phenylacetaldehydreduktase

pBIN Binärer Agrobakterium Vektor für Pflanzentransformation

PCR Polymerase-Kettenreaktion = „polymerase chain reaction“

psi Pfund pro Quadratzoll = „pounds per square inch“

PVDF Polyvinylidenfluorid

qRT-PCR qualitative Echtzeit-PCR = “quantitative real-time PCR”

RNA Ribonukleinsäure

rpm Rotationen pro Minute

S.O.C. Super Optimal catabolite-repression

SDS Natriumdodecylsulfat = “sodium dodecyl sulfate”

STB Standard-Transferpuffer = “standard transfer buffer”

TBLASTN Durchsuchen einer translatierten Nukleotid Datenbank anhand

einer Proteinvorlage

TBS Tris-gepufferte Saline = “tris buffered saline”

TBSTT TBS Tween Triton-X

TCP teosinte branched 1, cycloidea und PCF-Transkriptionsfaktor

Tm Schmelztemperatur

USER Reagenz zur spezifischen Entfernung von Uracil = “uracil specific

excision reagent”

UV-Vis sichtbares ultraviolettes Licht = „visible ultraviolett“

Abstract

VIII

Abstract

After herbivore feeding western balsam poplar (Populus trichocarpa) emits a complex

volatile blend mainly comprising terpenes and green leaf volatiles. Beside these

major volatile compounds, several minor volatiles like aldoximes, nitriles and alcohols

could be identified. One of the alcohols, 2-phenylethanol, is known from other plant

species as a floral and fruit volatile involved in several plant-insect interactions.

Supplementation experiments with putative precursors of 2-phenylethanol

biosynthesis, known from other species, suggest that the metabolic pathway towards

2-phenylethanol in herbivore-infested P. trichocarpa-leaves starts from L-

phenylalanine and proceeds via phenylacetaldoxime, benzyl cyanide, phenylacetic

acid and phenylacetaldehyde. In my master thesis I tested if a conversion of benzyl

cyanide to phenylacetic acid can be achieved by nitrile degrading enzymes, called

nitrilases.

The genome of P. trichocarpa possesses four genes with high similarity to known

nitrilase genes from other plants. Three of these genes could be amplified from cDNA

attained from herbivore damaged P. trichocarpa leaves and two of them, Nit1 and

Nit3, were heterologously expressed in Escherichia coli and assayed with potential

nitrile substrates. It could be shown that NIT1 converts benzyl cyanide to

phenylacetic acid and thus might play an important role in the formation of 2-

phenylethanol. Another physiologically important nitrile, β-cyano-L-alanine a

byproduct of ethylene biosynthesis, was shown to be converted by NIT1 and NIT3 to

asparagine and aspartic acid. Thus poplar nitrilases also seem to catalyze β-cyano-

L-alanine detoxification in planta.

Gene expression analysis of the three amplified nitrilases showed that Nit1 was

equally expressed in apical and basal leaves and the transcript accumulation of Nit1

did not seem to change upon herbivory. In contrast, Nit2 and Nit3 genes were highly

expressed in apical undamaged leaves and show a decrease of transcript

accumulation upon herbivore attack in these leaves. An increase in ethylene- and

subsequent hydrogen cyanide-emission from apical leaves as well as an

accumulation of β-cyano-L-alanine as a toxic substance in the leaf upon herbivory

could be an explanation for the down regulation of Nit2 and Nit3.

In this work I amplified three nitrilases and characterized NIT1 and NIT3 from P.

trichocarpa. These nitrilases seem to play important roles in volatile formation and

hydrogen cyanide detoxification.

Zusammenfassung

IX

Zusammenfassung

Die Westliche Balsampappel (Populus trichocarpa) hat im Verlaufe ihrer Evolution

eine effektive Abwehrstrategie gegen Fraßfeinde entwickelt. So emittiert P.

trichocarpa nach Herbivorie ein komplexes Duftgemisch, welches natürliche Feinde

der Herbivoren anlocken bzw. die Herbivoren direkt abschrecken kann. Unter

anderem wird 2-Phenylethanol gebildet, das auch in anderen höheren Pflanzen als

Duftstoff von Früchten oder Blüten bekannt ist. In P. trichocarpa könnte 2-

Phenylethanol an der Anlockung von Parasitoiden beteiligt sein.

In dieser Arbeit sollte mittels Fütterungs- und Markierungsexperimenten die

Biosynthese von 2-Phenylethanol in P. trichocarpa aufgeklärt werden. Weiterhin

sollte untersucht werden, ob Nitrilasen in diesem Biosyntheseweg eine Rolle spielen.

Die hier gewonnenen Erkenntnisse legen nahe, dass die Biosynthese von

2-Phenylethanol in der Pappel ausgehend von Phenylalanin über Phenylacetaldoxim,

Benzylcyanid, Phenylessigsäure und Phenylacetaldehyd verläuft und damit einen

alternativen, bisher noch nicht beschriebenen Weg darstellt. Die Umsetzung von

Benzylcyanid zu Phenylessigsäure wird hierbei durch eine Nitrilase katalysiert.

In P. trichocarpa konnten 4 putative Gene identifiziert werden, die Ähnlichkeit zur

Nitrilase 4 aus Arabidopsis aufweisen. Drei dieser Gene, welche alle eine

vollständige Nitrilase-Domäne besitzen, konnten amplifiziert werden. NIT1 und NIT3

wurden im Rahmen dieser Arbeit biochemisch charakterisiert. Es zeigte sich, dass

die konstitutiv im Blatt gebildete NIT1 unter anderem die Reaktion von Benzylcyanid

zu Phenylessigsäure katalysiert. Außerdem zeigten NIT1 und NIT3 eine Aktivität für

β-Cyano-L-alanin, welches als Metabolit in der Entgiftung von Blausäure eine

zentrale Rolle spielt.

In dieser Arbeit wurden drei Nitrilasen aus P. trichocarpa amplifiziert und NIT1 und

NIT3 charakterisiert. Die präsentierten Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass

Nitrilasen sowohl in den Metabolismus diverser aromatischer Duftstoffe involviert

sind, als auch eine Rolle bei der Entgiftung von Blausäure in der Pflanze spielen.

Einleitung

1

1. Einleitung

1.1. Pflanzliche Sekundärmetabolite

Seitdem photosynthetisch-aktive Organismen die Erde bevölkern, formen sie das

Gesicht unseres Planeten. Vor ca. 2,4 Milliarden Jahren begannen Cyanobakterien

Sauerstoff zu produzieren (Flannery und Walter, 2012) und leiteten so die Große

Sauerstoffkatastrophe ein (Sessions et al., 2009). Durch den Anstieg der

Konzentration an Sauerstoff in der Atmosphäre wurden obligat anaerobe

Organismen von der Erdoberfläche verdrängt. Außerdem bildete sich in der oberen

Atmosphäre aus Sauerstoff eine schützende Ozonschicht, die wahrscheinlich die

Entwicklung und Anpassung anderer Spezies auf der Erdoberfläche begünstigte.

Dies ist nur ein Beispiel eines molekularen Wettstreites, der bis in unsere Tage

andauert. Denn auch heute haben Pflanzen einen großen Einfluss auf die

Zusammensetzung der Atmosphäre über die Produktion flüchtiger organischer Stoffe

(„volatile organic compounds“ = VOC´s; Atkinson und Arey, 2003). Diverse höhere

Pflanzen emittieren diese flüchtigen Naturstoffe und kommunizieren so mit ihrer

Umwelt (Arimura et al., 2000).

Aus dem Reich der grünen Pflanzen sind über 100.000 niedermolekulare Naturstoffe

bekannt (Dixon, 2001). Naturstoffe sind chemische Stoffe, die dem produzierenden

Organismus einen evolutionären Fitnessvorteil verschaffen (Adler, 2000). Diese

Stoffe werden durch den Sekundärmetabolismus produziert, da sie nicht essentiell

zum Überleben benötigt werden. Pflanzen besitzen einen ausgeprägten

Sekundärmetabolismus, wodurch sie besser an ihre Umwelt angepasst sind

(Kroymann, 2011). Fest an ihren Standort gebunden, mussten sie Strategien

entwickeln, um sich vor Fraßfeinden zu schützen. Dies könnte zur Entstehung

volatiler Stoffe als Signalmoleküle geführt haben. Heute sind über 1700 volatile

organische Stoffe aus fast 1000 Spezies innerhalb von 90 Familien von

Samenpflanzen bekannt (Knudsen et al., 2006). Zu den VOC´s gehören Terpene,

Duftstoffe der grünen Blätter, Aromaten und Aminosäure-Derivate (Clavijo

McCormick et al., 2012).

Ein breites Spektrum dieser VOC´s wird auch von der Westlichen Balsampappel

(Populus trichocarpa) emittiert. Aufgrund ihres schnellen Wachstums ist die

Westliche Balsampappel für die weltweite Holzproduktion und für die Gewinnung

Einleitung

2

pharmazeutischer Wirkstoffe eine wirtschaftlich wichtige Spezies (Bradshaw et al.,

2000; Taylor, 2002). Die wirtschaftliche Effizienz des Pappelanbaus, wird jedoch

durch zahlreiche Schädlinge beeinträchtigt (R.L.Furniss, 1977). Die Sequenzierung

des kompletten Genoms im Jahre 2006 (Tuskan et al., 2006) erlaubt nun, die

molekularen Mechanismen der natürlichen Abwehrreaktionen der Pappel zu

erforschen. Dadurch könnte in Zukunft die Resistenz gegen schädliche biotische und

abiotische Faktoren gesteigert werden.

In vielen Fällen wird die Emission von Duftstoffen stimuliert, wenn Herbivore durch

Fraß pflanzliches Gewebe beschädigen (Holopainen und Gershenzon, 2010). Diese

Duftstoffe können auf direkte oder indirekte Art zur Pflanzenverteidigung beitragen

(Abb. 1) (Unsicker et al., 2009). Zum einen wirken Duftstoffe direkt als Repellents

gegen Herbivore. So wurde gezeigt, dass weibliche Motten von Heliothis virescens

bereits beschädigte Tabak-Blätter (Nicotiana tabacum), welche verstärkt Duftstoffe

emittieren, meiden und unbeschädigte Blätter für die Eiablage bevorzugen (De

Moraes et al., 2001). Außerdem wurde gezeigt, dass die Herbivor-induzierte

Emission von Duftstoffen wie Aldehyden und Oxosäuren die Fraßrate von einigen

saugenden Insekten stark vermindert (Vancanneyt et al., 2001). Nach Herbivorie

können aber auch volatile organische Stoffe emittiert werden, durch die natürliche

Feinde der Herbivoren, wie zum Beispiel parasitoide Wespen, angelockt werden

(Turlings et al., 1990; Dicke et al., 1999). Sowohl die anlockende Pflanze als auch die

parasitoide Wespe profitierten von dieser Interaktion, denn die Wespe benötigt den

Herbivoren zum ausbrüten ihrer Eier, die in den Körper des Herbivore gelegt werden.

Letztlich schlüpfen die Larven aus dem Körper der Raupe, wodurch diese stirbt (Pare

und Tumlinson, 1999). Die Produktion von VOC´s stellt damit einen wichtigen

Fitnessfaktor für die Pflanze dar (Holopainen, 2004). Auch die Westliche

Balsampappel emittiert nach Fraß von Raupen des Schwammspinners (Lymantria

dispar) ein komplexes Duftbouquet (Danner et al., 2011). Neben Mono- und

Sesquiterpenen ist 2-Phenylethanol einer der Hauptbestandteile des Herbivor-

induzierten Pappelduftes (Irmisch et al., 2013). 2-Phenylethanol ist außerdem

Bestandteil des Duftes von Rosen (Rosa damascena), Hyazinten (Hyacinthus),

Jasmin (Jasminum), Narzissen (Narcissus) Lilien (Lilium) (Etschmann et al., 2002)

und Tomaten (Solanum lycopersicum; Tieman et al., 2006). Weiterhin wurde 2-

Phenylethanol als Aggregationspheromon für Wanzen (Boisea rubrolineata; Schwarz

und Gries, 2012) sowie als Repellent für den Gemeinen Holzbock (Ixodes ricinus;

Einleitung

3

Tunon et al., 2006; Bissinger und Roe, 2010) und die ägyptische Tigermücke (Aedes

aegypti; Bissinger und Roe, 2010) beschrieben.

Abbildung 1: Die Rolle von volatilen organischen Verbindungen in Pflanzen-Insekten Interaktionen. Das Schema verdeutlicht die Funktionen von volatilen organischen Verbindungen. Wird die Pflanze von einem Fraßfeind attackiert (1), so werden die Abwehrmechanismen und die Produktion bzw. die Emission von Duftstoffen gefördert (2). Emittierte volatile organische Verbindungen können auf direkte (3) Weise abschreckend, oder auf indirekte Weise wirken. Beilspielhaft sind 2-Phenylethanol (a) und Benzylcyanid (b) dargestellt. So fungieren einige Duftstoffe als Synomon indem sie parasitoide Insekten oder sogar Vertebraten anlocken (4), die die Herbivoren fressen oder zur Entwicklung benötigen (5). Dies führt im Weiteren zum Tod der Herbivoren oder zu einer Beeinträchtigung der Fitness der Herbivoren (6). Verändert nach Unsicker et al. 2009

Einleitung

4

1.2. 2-Phenylethanol-Biosynthese im Reich der Eukaryoten

Die Eigenschaften vieler volatiler organischer Stoffe sind nicht nur für Pflanzen von

Bedeutung. Aufgrund des rosigen Duftes zählt 2-Phenylethanol zum Beispiel zu den

meist verwendeten Duftstoffen und findet Anwendung in der Parfüm-, Kosmetik- und

in der Lebensmittelindustrie (Etschmann et al., 2002). Allein 2002 wurden weltweit

0,5 t von natürlich produziertem 2-Phenylethanol in der Lebensmittelindustrie

verbraucht (Schrader et al., 2004). Der Anteil an synthetisch gewonnenem

2-Phenylethanol lag um 1990 bei ca. 10.000 t pro Jahr (Schwab et al., 2008; Hua

und Xu, 2011). 2-Phenylethanol wird als Geschmacksträger in Backwaren,

Getränken und Süßigkeiten verwendet (Burdock, 2005). Ein erster Biosyntheseweg

für 2-Phenylethanol wurde bereits 1907 von Ehrlich beschrieben (Abb. 2 A; Ehrlich,

1907). In der Bäckerhefe (Saccharomyces cerevisiae) wird die Aminosäure

L-Phenylalanin oxidativ desaminiert, wobei die korrespondierende α-Ketosäure

(Phenylpyruvat) entsteht, die durch Decarboxylierung zum Aldehyd umgewandelt

wird. Durch eine finale Reduktion entsteht der entsprechende Alkohol (Ehrlich, 1907).

Dieser sogenannte Ehrlich-Biosyntheseweg wird heutzutage genutzt, um

2-Phenylethanol biotechnologisch aus L-Phenylalanin herzustellen (Hazelwood et al.,

2008). In Pflanzen ist die Biosynthese von 2-Phenylethanol bisher in der Rose und

der Tomate untersucht worden.

In der Tomate trägt 2-Phenylethanol, trotz einer vergleichsweise geringen

Konzentration, einen Großteil zu dem charakteristischen Duft der Frucht bei (Buttery

und Ling, 1993). Durch in vitro-Experimente wurde gezeigt, dass an der Biosynthese

von 2-Phenylethanol in der Tomate vermutlich Enzyme aus der Enzymfamilie der

Decarboxylasen, beteiligt sind. Dabei wird L-Phenylalanin durch die AADC

(Aromatische L-Aminosäure Decarboxylase) decarboxyliert und 2-Phenylethylamin

produziert (Abb. 2 B).

Rosen sind vermutlich in der Lage, 2-Phenylethanol über zwei verschiedene

Wege zu produzieren. Ein möglicher Weg der Biosynthese von

2-Phenylethanol in der Rose verläuft analog zur Biosynthese von 2-Phenylethanol

in Hefen (Hirata et al., 2012). Ein weiterer Weg führt über die direkte Konversion von

L-Phenylalanin über eine AADC, die L-Phenylalanin zu Phenylacetaldehyd

umwandelt (Abb. 2 C; Sakai et al., 2007). Phenylacetaldehyd wird schließlich durch

Einleitung

5

die Phenylacetaldehyd-Reduktase (PAR) zu 2-Phenylethanol umgewandelt (Tieman

et al., 2006).

Abbildung 2: Biosynthese von 2-Phenylethanol in Hefe und höheren Pflanzen. Gezeigt sind potentielle Biosynthesewege für 2-Phenylethanol in der Hefe (Saccharomyces cerevisiae) (A), Tomate (Solanum lycopersium) (B) und der Rose (Rosa damascena) (C). Die Biosynthese von 2-Phenylethanol geht stets von L-Phenylalanin (1) aus. In Hefen führt eine oxidative Desaminierung zu Phenylpyruvat (2), das decarboxyliert wird zu Phenylacetaldehyd (3). Durch eine finale Reduktion entsteht 2-Phenylethanol (4). In Tomaten erfolgt eine initiale Decarboxylierung zu 2-Phenylethylamin (5), welches desaminiert wird zu Phenylacetaldehyd. In Rosen kann Phenylacetaldehyd über ein bifunktionelles Enzym synthetisiert werden, welches L-Phenylalanin decarboxyliert und transaminiert. Sowohl in Rosen als auch in Tomaten wird Phenylacetaldehyd zu 2-Phenylethanol reduziert. ATA - Amin-Transaminase, PDC - Pyruvatdehydrogenase-Komplex, ADH - Alkoholdehydrogenase, 2-PAR - 2-Phenylacetaldehyd Redukase, AADC - Aminosäure Decarboxylase.

Das komplexe Duftspektrum von P. trichocarpa beinhaltet unter anderem 2-

Phenylethanol, Phenylacetaldoxim und Benzylcyanid (Irmisch et al., 2013). Die

Biosynthese von Benzylcyanid wird ausgehend von L-Phenylalanin durch Enzyme

aus der Cytochrom P450 Monooxygenase-Familie katalysiert (Irmisch et al., 2013;

persönliche Kommunikation Sandra Irmisch). Dabei wird Phenylacetaldoxim über

CYP79D-Enzyme aus L-Phenylalanin generiert. Phenylacetaldoxim kann durch ein

CYP71-Enzym zu Benzylcyanid umgewandelt werden (persönliche Kommunikation

Einleitung

6

Sandra Irmisch). Es konnte gezeigt werden, dass die Emission von 2-Phenylethanol

und Benzylcyanid in CYP79 „knock down“-Bäumen der Grau-Pappel (Populus

canescens) nach Herbivorie signifikant reduziert war (Irmisch et al., 2013). Dies lässt

die Vermutung zu, dass 2-Phenylethanol in der Pappel über Phenylacetaldoxim und

Benzylcyanid gebildet werden könnte.

1.3. Physiologische Rolle von Nitrilasen in Pflanzen

Schon 1952 wurden pflanzliche Wachstumshormone, die Auxine, erforscht und

neben Indol-3-essigsäure wurde Indol-3-acetonitril als wirksames Wachstumshormon

aus Weißkohl isoliert (Jones et al., 1952). Im Vergleich zu Indol-3-essigsäure,

welches in vielen Pflanzenarten als Wachstumshormon wirkt, ist dies für Indol-3-

acetonitril nur in manchen Spezies bekannt (Thimann, 1953). Aufgrund der strukturell

engen Verwandtschaft dieser beiden vermeintlichen Auxine wurde vermutet, dass

Pflanzen Indol-3-acetonitril in Indol-3-essigsäure umwandeln können (Stowe und

Thimann, 1954). Die Umwandlung von Nitrilen zu der korrespondierenden Säure

kann durch die Hydrolyse von nicht proteinogenen Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen

erfolgen. Diese Reaktion wird von Nitrilasen (E.C. 3.5.5.1) katalysiert (Thimann und

Mahadevan, 1958).

Seitdem wurden diverse weitere Substrate für Nitrilasen in Pflanzen entdeckt

(Farnden et al., 1973; Lambrix et al., 2001; Danner et al., 2011). Blausäure, als

Beispiel für ein von Pflanzen produziertes Nitril, entsteht als Nebenprodukt der

Biosynthese des Pflanzenhormons Ethylen (Wang et al., 2002). Diese wird zum

Schutz der Pflanze durch die β-Cyano-L-alanin-Synthase auf L-Cystein übertragen.

Das entstehende und weniger toxische Nebenprodukt, β-Cyano-L-alanin (Howden et

al., 2009) kann durch Nitrilasen zu den Produkten Asparagin bzw. Asparaginsäure

Ammoniak umgewandelt werden (Piotrowski et al., 2001).

Nitrile können jedoch auch unter anderen Bedingungen, wie zum Beispiel nach dem

Angriff von Herbivoren in der Pflanze produziert werden (Burow et al., 2009). So

kommen in Süßgräsern (Poaceaen) Nitrile als Zerfallsprodukte von cyanogenen

Glycosiden wie Dhurrin vor. Dhurrin fungiert in Hirse (Sorghum bicolor) einerseits als

Abwehrstoff gegen Fraßfeinde (Tattersall et al., 2001) und dient andererseits als

Speicherstoff. Auch die Glucosinolate der Kreuzblütler (Brassicaceae) wirken auf

ähnliche Weise. Durch Fraß von Herbivoren gelangen Glucosinolate und die

Einleitung

7

Myrosinase in räumliche Nähe und die Glucosinolate werden umgesetzt zu Nitrilen,

Iso- und Thiocyanaten, die als Fraßschutz dienen (Halkier und Gershenzon, 2006).

Nitrilasen detoxifizieren in diesem Fall die toxischen Nitrile und verhindern damit die

Vergiftung der Pflanze (Piotrowski, 2008).

1.4. Struktur und Funktion von Nitrilasen

Die Nitrilase-Superfamilie enthält 12 Familien von Amidasen, putativen Amidasen, N-

Acyltransferasen und Nitrilasen, die in der Lage sind Kohlenstoff-Stickstoff-

Verbindungen zu hydrolysieren (Brenner, 2002). Die Entdeckung der ersten Nitrilase

1964 (Thimann und Mahadevan, 1964) und die Entschlüsselung der ersten

Kristallstruktur einer Nitrilase aus dem Fadenwurm (Caenorhabditis elegans; Pace et

al., 2000) ermöglichten die ersten Einblicke in die Wirkungsweise dieser Enzyme

(Abb. 3). Die Enzyme sind α-, β-, β-, α- Sandwich Proteine (Brenner, 2002), die in der

Lage sind miteinander zu dimerisieren (Abb. 3 A). Alle bisher bekannten Nitrilasen

besitzen eine katalytische Triade, bestehend aus Glutaminsäure, Lysin und Cystein,

die essentiell für die enzymatische Aktivität ist (Brenner, 2002; Abb. 3 D).

Einleitung

8

So wurde beschrieben, dass Glutaminsäure im aktiven Zentrum als Base fungiert,

indem sie das Proton der Thiolgruppe von Cystein akzeptiert und so die Aktivierung

von Cystein ermöglicht (Abb. 4; Kobayashi et al., 1993). Cystein bekommt dadurch

einen stark nukleophilen Charakter und ist in der Lage, den Kohlenstoff der

Kohlenstoff-Stickstoff-Bindung anzugreifen und kovalent zu binden (Stevenson et al.,

1990). Durch einen nukleophilen Angriff von Wasser auf Cyano-Kohlenstoff entsteht

ein tetraedrisches Zwischenprodukt. Nach einer Keto-Enol-Tautomerisierung kann

Ammoniak abgespalten werden. Ein weiterer nukleophiler Angriff von Wasser auf

Abbildung 3: Strukturelle Eigenschaften von Nitrilasen. Gezeigt ist die durch Proteinkristallograpie aufgeklärte Struktur der Nitrilase2 aus der Maus (Mus musculus). Die Nitrilase ist in der Lage Homodimere zu bilden. Die Monomere sind grau oder bunt dargestellt (A). Der N-Terminus (blau) liegt außerhalb des Proteins und der C-Terminus (rot) zeigt in die Dimerisierungsregion. Die Aminosäuren in der Umgebung des aktiven Zentrums sind als Kugel-Stab Modelle dargestellt (B). Das aktive Zentrum liegt in der Nähe der Dimerisierungsregion (C). Die Van-der Waals Abstände zwischen Aminosäureresten der katalytischen Triade sind abgebildet (D). Übernommen aus Barglow et al. 2008

Einleitung

9

den Cyano-Kohlenstoff resultiert in der Entstehung der korrespondierenden Säure.

Dies scheint durch die stabilisierende Wirkung von Lysin möglich zu sein (Nakai et

al., 2000). Zusätzlich wurde gezeigt, dass einige Nitrilasen neben der Säure auch

geringe Mengen des korrespondierenden Amides als Produkt freisetzen können

(Hook und Robinson, 1964). Diese Nebenreaktion kann durch das vorzeitige

Entlassen des Intermediates erklärt werden. Interessanterweise konnte für NIT4 aus

A. thaliana eine Nitril-Hydratase-Aktivität gezeigt werden, welche die Bildung des

Amides als Hauptprodukt (50-80%) zur Folge hat (Piotrowski und Volmer, 2006). In

der Pflanze bedeutet das, dass aus dem physiologischen Substrat β-Cyano-L-alanin

neben Asparagin auch Asparaginsäure und Ammoniak entsteht.

Einleitung

10

Abbildung 4: Reaktionsmechanismus von Nitrilasen und Nitril-Hydratasen. Gezeigt ist die Reaktion der Nitrilase, welche von der katalytischen Triade (Lysin, Glutaminsäure und Cystein) katalysiert wird. Glutaminsäure fungiert hierbei als Lewis-Base und akzeptiert das Wasserstoffatom der Thiolgruppe des Cysteins, wodurch dieses aktiviert wird. Das aktivierte Cystein vollzieht einen nukleophilen Angriff auf das Kohlenstoffatom des Nitrils, wodurch das Substrat kovalent an das Enzym gebunden wird. Ein weiterer nukleophiler Angriff von Wasser resultiert in der Generierung eines tetraedralen Intermediates, welches über Lysin stabilisiert wird. Durch die Übertragung eines Protons auf den gebundenen Schwefel kann Cystein regeneriert werden und das Acetamid wird frei (Nitril-Hydratase). Geht das Proton auf Stickstoff über, so wird Ammoniak frei. Ein weiterer nukleophiler Angriff auf Kohlenstoff generiert ein zweites tetrahedrales Intermediat. Die Regeneration des Cysteins hat zur Folge, dass die Säure frei wird. Verändert nach Jandhyala et al., 2005

Einleitung

11

Generell konnten Nitrilasen in Monokotyledonen und Dikotyledonen der

Angiospermen, aber auch in Gymnospermen und im kleinen Blasenmützenmoos

(Physcomitrella patens) identifiziert werden (Piotrowski, 2008). Alle bis jetzt in planta

funktionell charakterisierten Nitrilasen lassen sich in zwei Gruppen einteilen. Die

erste Gruppe, der NIT4-Homologen wurde nach der A. thaliana Nitrilase 4 benannt.

NIT4-Homologe wurden in diversen untersuchten Pflanzen gefunden und sind

vermutlich für die Detoxifizierung von β-Cyano-L-alanin verantwortlich (Piotrowski et

al., 2001). Eine zweite Gruppe von Nitrilasen, die zu A. thaliana Nitrilase 1 homolog

sind (NIT1-Homologen), sind bisher nur aus der Familie der Kreuzblütler bekannt

(Piotrowski, 2008). Generell sind Nitrilasen an der Entgiftung von Nitrilen und dem

Abbau von cyanogenen Glykosiden und Glucosinolaten beteiligt und vermutlich eng

verknüpft mit der Biosynthese von Phytohormonen (Piotrowski, 2008).

1.5. Zielstellung

Aus bisherigen Arbeiten ist bekannt, dass eine Verminderung der Genexpression von

CYP79D6/D7 in P. trichocarpa (RNAi-vermittelte „knock down“-Bäume) nicht nur zu

einer Verminderung der Emission stickstoffhaltiger organischer Duftstoffe führt,

sondern dass auch die Emission von 2-Phenylethanol im Vergleich zum Wildtyp

eingeschränkt ist (Irmisch et al., 2013).

Im Rahmen dieser Arbeit sollte mittels Fütterungsexperimenten untersucht werden,

ob die Biosynthese dieses Alkohols in der Pappel ausgehend von Phenylacetaldoxim

über Benzylcyanid und Phenylessigsäure verläuft. Da die Reaktion von Benzylcyanid

zu Phenylessigsäure durch eine Nitrilase katalysiert werden könnte, war weiterhin

geplant, die Enzymklasse der Nitrilasen in der Westlichen Balsampappel zu

charakterisieren und ihren Anteil am Nitrilmetabolismus zu untersuchen.

Material und Methoden

12

2. Material und Methoden

2.1. Sequenzanalyse (Genom-BLAST)

Die Proteinsequenz der NIT4 aus der Ackerschmalwand (Arabidopsis thaliana)

wurde als Sequenz verwendet (Piotrowski et al., 2001), um Nitrilase-Gene im Genom

der Westlichen Balsampappel (Populus trichocarpa) (Tuskan et al., 2006) durch

TBLASTN zu identifizieren (http://www.phytozome.net/poplar). Es ließen sich vier

Nitrilase-ähnliche Gene finden. Das jeweils längste Haupttranskript aller

identifizierten putativen Nitrilase-Sequenzen wurde verwendet, um PCR-Primer

anhand dieser kodierenden Sequenzen zu entwerfen (Tab. 12 und 13).

2.2. Phylogenetische Analyse

Die erhaltenen Aminosäure-Sequenzen aus 2.1 und die Sequenzen bereits

charakterisierter Nitrilasen aus ausgewählten anderen Pflanzenarten wurden durch

einen ClustalW Algorithmus alignt und visualisiert. Dafür wurde das Programm

BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html) verwendet. Für das Erstellen

eines phylogenetischen Baumes wurde der MUSCLE Algorithmus (Lückenöffnung, -

2.9; Lückenerweiterung, 0; Hydrophobizitätsfaktor, 1.5; Gruppierungsmethode,

upgmb) des Programms MEGA5 (Tamura et al., 2011) verwendet. Die

Rekonstruktion des phylogenetischen Baumes erfolgte mittels der „neighbor-joining“

Methode (Poissonverteilung) und 1000 Bootstrap-Replikaten in MEGA5.

2.3. Pflanzenanzucht und Raupenzucht

Tabakpflanzen (Nicotiana benthamiana) wurden 3 bis 4 Wochen im Gewächshaus

herangezogen (Tag, 22°C; Nacht, 18°C; 65% relative Luftfeuchtigkeit; 16 h/8 h

Licht/Dunkel Zyklus) und anschließend für die Transfektion verwendet.

Monoklonale Stecklinge von P. trichocarpa (Genotyp 625, NW-FVA, Hann. Münden,

Deutschland) wuchsen unter Sommerverhältnissen im Gewächshaus (24°C, 60%

relative Luftfeuchtigkeit, 16 h/8 h Licht/Dunkel Zyklus) in einer 1:1 Mixtur Sand und

Erde (Klasmann Pflanzsubstrat, Geeste, Deutschland) bis zu einer Höhe von einem

Meter. Für die RNA-Extraktion wurde vom Betreuer induziertes und unbehandeltes

Blattmaterial von P. trichocarpa gestellt. Raupen des Schwammspinners (Lymantria

dispar; 3. – 4. Larvenstadium) kamen für die Herbivoriebehandlung zum Einsatz.

http://www.phytozome.net/poplar


13

2.4. Erstellen einer cDNA-Bibliothek

Die Isolation der RNA erfolgte aus 100 mg Herbivorie-induziertem Blattmaterial von

P. trichocarpa, wofür das RNA InviTrap® Spin Plant RNA Mini Kit (STRATEC

Molecular, Berlin, Deutschland) nach Herstellerangaben benutzt wurde. Ein µg der

RNA wurde verwendet und einem DNase-Verdau mit 1U DNase (Thermo Fisher

Scientific Inc., Schwerte, Deutschland) unterzogen. Anschließend wurde die DNase-

verdaute RNA mittels SuperScript™ III Reverse Transkriptase nach

Herstellerangaben (InvitrogenTM, Darmstadt, Deutschland) in cDNA umgeschrieben.

2.5. Amplifikation von Nitrilasegenen

Die Amplifikation der Zielgene erfolgte durch eine PCR. Als Template wurde cDNA

aus Herbivorie-induzierten P. trichocarpa-Blattmaterial oder ein verdünnter (1:100)

TOPO-blunt Vektor, der das gewünschte Template enthielt, eingesetzt. Die Phusion®

High-Fidelity DNA-Polymerase (New England BioLabs®) wurde hierfür verwendet.

Die PCR setzte sich aus 7 Komponenten zusammen (Tab. 1). Das Programm lief in

einem Thermocycler (Primus 96 Thermocycler System, Clemens GmbH,

Waldbüttelbrunn, Deutschland) ab (Tab. 2).

Tabelle 1: Komponenten eines PCR Ansatzes.

Volumen [µL]

Komponente

31,5 steriles Wasser

10 Polymerase-Puffer

2,5 3´- Primer

2,5 5´- Primer

1 dNTP

2 DNA-Vorlage

0,5 Polymerase

Tabelle 2: Temperaturprofil der Phusion-PCR.

Schritt Dauer

[min:sec] Temperatur

[°C] Zyklus

Initiale Denaturierung 0:30 98

Denaturierung 0:10 98

35 x Primer Anlagerung 0:30 Tm

Elongation 0:45 72

Finale Elongation 5:00 72


14

Während dieses Programmes wurde die doppelsträngige DNA zuerst bei 98 °C

denaturiert, wodurch sie in Einzelsträngen vorlag. Anschließend sollten sich die

Primer an den DNA-Einzelsträngen anlagern. Die Anlagerungstemperatur (Tm) der

Primer wird hauptsächlich durch deren Basenzusammensetzung definiert, weshalb

diese für jedes Primerpaar angepasst werden muss. Die Bestimmung der Werte

erfolgte über das Programm PrimerAnalyser (Kalendar et al., 2011). Dann erfolgte

die Synthese des Tochterstrangs. Dieser Zyklus wurde 35mal wiederholt. Die

Analyse des Amplikons erfolgte über ein 1,5% w/v Agarosegel (TAE (20 mM Tris, 10

mM Essigsäure, und 0,5 mM EDTA) mit 0,25 µg mL-1 Ethidiumbromid). Als Referenz

diente ein „1kb Plus Marker“ für DNA-Fragmente, wodurch sich die relative

Fragmentlänge ermitteln ließ. Fragmente der gewünschten Größe wurden weiter

prozessiert.

2.6. Ligation

2.6.1. Zero Blunt® TOPO® und pET101/D-TOPO®

Das PCR-Fragment, welches die erwartete Größe besaß, wurde unter UV-Licht

ausgeschnitten und aus dem Gel nach dem vom Hersteller beschriebenem Verfahren

aufgereinigt (QIAquick Gel Extraktions Kit, QIAGEN). Das Fragment wurde in den

Zero Blunt TOPO-Sequenzierungsvektor (TOPO®TA Cloning® Kit für Sequenzierung,

Invitogen) bzw. in den Expressionsvektor pET101/D-TOPO-Vektor (Champion™ pET

Directional TOPO® Expressions Kit, InvitrogenTM) inseriert. Die Primerpaare 1-3

wurden für die Erzeugung der Fragmente für die Zero Blunt Ligation verwendet. Die

durch Primerpaar 5-7 (Tab. 12) amplifizierten Konstrukte wurden in den pET101/D-

TOPO-Vektor kloniert.

2.6.2. USER™-System

Zur Expression in N. benthamiana wurde das Zielgen in den pCAMBiA2300U-Vektor,

welcher freundlicherweise von Daniele Werck-Reichardt (Straßburg, Frankreich) zur

Verfügung gestellt wurde, ligiert. Der Vektor besitzt einen 35S-Promotor, der eine

Überexpression in N. benthamiana ermöglicht. Das Gen wurde durch eine PCR mit

der PfuTurbo® Cx Hotstart DNA-Polymerase (Stratagene) und dem Primerpaar 4

(Tab. 12) amplifiziert (Pippetierschema siehe Tab. 3, Temperaturprofil Tab. 2).

Dieses Primerpaar enthält jeweils ein Uracil in der Sequenz und durch die PfuTurbo®


15

Cx Hotstart DNA-Polymerase, die keine Proofreading-Funktion für Uracil besitzt,

verbleibt Uracil in der Sequenz. Das Amplikon wurde über ein 1,5% Agarosegel

aufgereinigt und mit 1 U Dpn1 (Thermo Fisher Scientific Inc., Schwerte, Deutschland)

für eine Stunde bei 37°C inkubiert, um den methylierten Ursprungsvektor zu

entfernen. Diese Reaktion wurde durch Erhitzen auf 80°C für 20 Minuten gestoppt.

Die Ligation in den pCAMBiA2300U-Vector erfolgte durch das Versetzten von 10 µL

des Reaktionsansatzes mit 0,75 U USER-Enzym („uracil specific excision reagent“,

NEB) und 1 µL des linearisierten Vektors. Es folgte eine Inkubation bei 37°C für 20

Minuten, gefolgt von einer Inkubation bei 25°C für 20 Minuten. Das USER-Enzym

schneidet die Uracil-Reste aus dem amplifizierten DNA-Fragment und produziert so

klebrige Enden, die in den linearen pCAMBiA2300U-Vektor ligierten (Abb. 5). Dann

wurde das Plasmid in E. coli-Zellen inseriert, auf eine Agarplatte mit Antibiotikum (50

µg mL-1 Kanamycin, 25 µg mL-1 Rifampicin und 25 µg mL-1 Gentamicin) ausplattiert

und über Nacht bei 37°C inkubiert. Einzelne Kolonien wuchsen in einer Flüssigkultur

und die Plasmide wurden aufgereinigt und sequenziert (Siehe 2.9. und 2.10.). Mit ca.

1 µg des Plasmides fand die Transformation von Agrobakterien-Zellen

(Agrobacterium tumefaciens) statt (siehe 2.7.1.).

Abbildung 5: Das USERTM

-System. Das zu klonierende Gen wird über eine PCR amplifiziert, wobei die Uracil-Reste in den Primer Regionen bestehen bleiben. Das USER-Enzym entfernt Uracil-Reste, wodurch klebrige Enden produziert werden. Das entstehende Fragment ligiert in den pCAMBiA2300U-Vektor. Verändert nach Hussam H. Nour-Eldin et al., 2006


16

Tabelle 3: Komponenten eines PCR-Ansatzes mit der PfuTurbo Cx-Polymerase.

Volumen [µL]

Komponente


5 Polymerase-Puffer

1,25 3´- Primer

1,25 5´- Primer

1 dNTP

1 DNA-Vorlage

1 PfuTurbo Cx-Polymerase

2.7. Transformation

2.7.1. Agrobacterium tumefaciens

Zur Transformation von A. tumefaciens-Zellen (Strang LBA4404) wurden ca. 1 µg

des pCAMBiA2300U-Vektors, der das Konstukt enthielt, (2.6.2.) auf 100 µL

kompetente A. tumefaciens Zellen gegeben, für 20 Minuten auf Eis inkubiert und

anschließend einmal für 5 Minuten in flüssigem Stickstoff gefroren und bei 37°C

wieder aufgetaut. Anschließend inkubierten die Zellen unter zeitweisem Invertieren

für 30 Minuten auf Eis. Anschließend wurden die Zellen in 1 mL LB-Medium

aufgenommen und für 2 Stunden bei 28°C und 220 rpm (Innova 4230

Schüttelinkubator, New Brunswick Scientific) inkubiert. Anschließend erfolgte eine

Pelletierung bei 11.000 rpm (Mikrozentrifuge 5415R, Eppendorf). Der Überstand

wurde abgenommen und das Pellet in 100 µL LB-Medium aufgenommen und auf

eine Agarplatte mit Antibiotikum (50 µg mL-1 Kanamycin, 25 µg mL-1 Rifampicin und

25 µg mL-1 Gentamicin) ausplattiert und über Nacht bei 28°C inkubiert.

2.7.2. Erzeugung transienter N. benthamiana-Pflanzen

Eine Kolonie des transformierten A. tumefaciens-Stammes wurde in 4 mL LB-

Medium mit Antibiotikum (50 µg mL-1 Kanamycin, 25 µg mL-1 Rifampicin und 25 µg

mL-1 Gentamicin) aufgenommen und über Nacht bei 28°C und 220 rpm inkubuiert.

Am darauffolgenden Tag wurde 1 mL der Agrobakterium-Vorkultur in 10 mL frischem

LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum aufgenommen und bei bei 28°C und

220 rpm über Nacht inkubiert. Die Zellen wurden am nächsten Tag bei 4.000 g für 5


17

Minuten pelletiert, in Infiltrationspuffer (10 mM MES, 10 mM MgCl2, 100 µM

Acetosyringon, pH 5.6) resuspendiert und mit Infiltrationspuffer auf eine OD600 von

0,5 eingestellt (ca. 50 mL). Danach folgte eine Inkubation für 3 Stunde bei 25°C und

220 rpm. Die Kulturen, die die Plasmide mit den Genen für eGFP, CYP79D6v3 und

NIT1 enthielten, wurden mit dem gleichen Volumen an pBIN:p19-Kulturen gemischt,

um die Agrobakteriensuspension für die Infiltration der Tabak-Pflanzen zu erzeugen.

Für die Coinfiltration von CYP79D6 und NIT1 wurden gleiche Teile der Lösung mit

p19 gemischt (1:1:1). Das Gen p19 wirkt als Suppressor des „Gensilencing“ in

Pflanzen und erhöht so die Expression des rekombinanten Proteins (Voinnet et al.,

2003). Zur Transfektion wurden drei bis vier Wochen alte N. benthamiana-Pflanzen

kopfüber in einem Exsikkator in 100 mL Agrobakterien-Suspension (eGFP + p19,

CYP79D6 + p19, NIT1 + p19 oder CYP79D6 + NIT1 + p19) getaucht und für ca. 5

Minuten ein Vakuum angelegt. Durch das Lösen des Vakuums wurden die

Agrobakterien in die Pflanze infiltriert. Nach 3 Tagen, bei beschriebenen

Wachstumsverhältnissen (Siehe 2.3.), wurde der Transfektionserfolg unter dem

Fluoreszenzmikroskop (Axiovert 200,Carl Zeiss) überprüft und daraufhin die

Duftstoffsammlung der transformierten Pflanzen durchgeführt.

2.7.3. Escherichia coli-Transformation

Chemisch-kompetente Zellen wurden auf Eis aufgetaut und anschließend mit 1 µL

Ligationsansatz versetzt und für 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Es folgte ein

Hitzeschock bei 42°C für 45 Sekunden (One Shot® Top 10-Zellen, InvitrogenTM) oder

eine Minute (One Shot® BL21(DE3)-Zellen, InvitrogenTM). Anschließend inkubierten

die Zellen für eine Minute bei 4°C. Daraufhin erfolgte die Zugabe von 100 µL S.O.C.

Medium (InvitrogenTM) und eine Inkubation für 45 Minuten bei 37°C und 220 rpm. Der

Ansatz wurde auf einer LB-Agarplatte mit entsprechendem Antibiotikum (50 µg mL-1

Kanamycin für TOPO Zero Blunt 2 und 100 µg mL-1 Ampicilin für pET101) ausplattiert

und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Während des Hitzeschocks gelangt die fremde DNA in die chemisch-kompetenten E.

coli-Zellen, da das Calciumchlorid in der Zellsuspension die Ladungsabstoßung

zwischen der negativ geladenen Zellmembran und der negativ geladenen DNA

verringerte.


18

2.8. Kolonie-PCR

Um zu überprüfen, ob die E. coli-Zellen erfolgreich mit dem Plasmid, auf welchem

das Zielgen liegt, transformiert wurden, erfolgte eine Kolonie-PCR mit Vektor-

spezifischen Primern. Dafür wurden Für die Reaktion kam die GoTaq® DNA-

Polymerase (Promega) zum Einsatz (Tab. 4). Das Temperaturprofil wurde an die

Anlagerungstemperatur (Tm) der Primer angepasst (Tab. 5). Die Amplifikation des

Fragmentes wurde über ein 1,5%iges Agarosegel analysiert (siehe 2.5.).

Tabelle 4: Komponenten eines Kolonie-PCR-Ansatzes mit der GoTaq-Polymerase.

Volumen [µL]

Komponente


5 Polymerase-Puffer

0,5 3´- Primer

0,5 5´- Primer

0,5 dNTP

0,125 GoTaq-Polymerase

gepickte Kolonie

Tabelle 5: Temperaturprofil der Kolonie-PCR

Schritt Dauer

[min:sec] Temperatur

[°C] Zyklus

Initiale Denaturierung 10:00 95

Denaturierung 0:30 95

36 x Primer Anlagerung 0:30 Tm

Elongation 1:30 72

Finale Elongation 10:00 72

2.9. Plasmidpreparation

Die Kultivierung von positiven Transformanten erfolgte in 4 mL LB-Medium mit dem

jeweiligen Resistenzantibiotikum und einer Inkubation über Nacht bei 37°C und 220

rpm. Aus diesen Kulturen wurden die Plasmide aufgereinigt. Dafür wurde das

NucleoSpin® Plasmid-Kit (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) nach

Herstellerangaben verwendet. Die Analyse der Plasmidkonzentration erfolgte am

Spektrophotometer (NanoDrop 2000c UV-Vis Spektrophotometer, Thermo Scientific).


19

2.10. Big Dye Terminator 3.1 Sequenzierungsreaktion

Das Insert des aufgereinigten Plasmids wurde durch das „BigDye® Terminator v3.1

Cycle Sequencing Kit“ nach Herstellerangaben mit dem ABI Prism®-Gen-Analysator

3100 mit 16-Kapillaren (Applied Biosystems) sequenziert. Für die

Sequenzierungsreaktionen kam Primerpaar 8 (für den „Zero Blunt TOPO“-Vektor)

oder Primerpaar 9 (für den „pET101/D-TOPO“-Vektor) zum Einsatz (Tab. 12). Die

Auswertung erfolgte mit dem Programm DNASTAR 10 (Lasergene®). Plasmide mit

dem Insert, welches mit der Datenbank übereinstimmte (Anhang), wurden weiter

verwendet.

2.11. Proteinaufreinigung

Transformierte E. coli BL21(DE3)-Zellen wurden in 50 mL TB-Medium („Terrific

Broth“-Medium = 24 g L-1 Hefeextrakt, 12 g L-1 Trypton, 12,54 g L-1

Dikaliumhydrogenphosphat, 2,31g L-1 Kaliumdihydrogenphosphat ) mit 100 µg mL-1

Ampicillin für 8 Stunden bei 37 °C und 220 rpm inkubiert. Die angewachsene

Vorkultur wurde zur Inokulation einer Hauptkultur verwendet und bei 37 °C und 220

rpm bis zu einer optischen Dichte von OD600 = 0,4-0,6 inkubiert. Darauf erfolgte die

Induktion der Proteinbiosynthese mit 0,3 mM IPTG. Die Kulturen wuchsen über

Nacht bis zu einer OD600 = 4 - 5 bei 30 °C und 220 rpm. Am darauffolgenden Tag

wurden die E. coli-Zellen bei 5.000 g pelletiert. Das Pellet wurde in 10 mL g-1

Lysepuffer (50 mM Tris/HCl (pH = 7,4), 100 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 2% Glycerol,

0,3 mg mL-1 Lysozym, 10 mM MgCl2, 0,1 U mL-1 Benzonase (Novagen), 0,127 mg

mL-1 Protease Inhibitor Mix HP (SERVA)) resuspendiert. Der Zellaufschluss erfolgte

durch abwechselndes Einfrieren und Auftauen, wobei die Zellsuspension fünfmal in

flüssigem Stickstoff eingefroren und anschließend in einem Wasserbad bei 25 °C

aufgetaut wurde. Die unlöslichen Zellbestandteile ließen sich durch Zentrifugation bei

11.000 g entfernen und der Überstand wurde für die Aufreinigung verwendet. Eine

mit 500 µL HisPur™ Cobalt Resin (Thermo Scientific) beladene

Schwerkraftflusssäule (12,5 mL Bio-Rad®) wurde mit Resuspensionspuffer (50 mM

Tris/HCl (pH = 7,4), 100 mM NaCl, 20 mM Imidazol, 2% Glycerol) equilibriert. Der

Überstand mit dem heterolog exprimierten Protein wurde auf die Säule aufgetragen.

Der Durchfluss wurde ein weiteres Mal auf die Säule aufgetragen. Anschließend

erfolgte ein Waschschritt mit 5 mL Resuspensionspuffer und die Elution mit zweimal

500 µL Elutionspuffer (50 mM Tris/HCl (pH = 7,4), 150 mM Imidazol, 100 mM NaCl,


20

2% Glycerol). Zum Entfernen des Imidazols wurde die Elutionsfraktion über eine

NAP-10 Säule (Illustra, GE Healthcare life science) nach Herstellerangaben in NSB

(100 mM NaCl, 50 mM Tris/HCl (pH = 7,2), 5% Glycerol) umgepuffert.

2.12. Bradford Assay

Zur Konzentrationsbestimmung des aufgereinigten Proteins wurden 100 µL der

Proteinlösung mit 900 µL Bradford-Lösung für 30 Minuten inkubiert und die

Absorbtion bei 595 nm über das Spektrophotometer bestimmt. Das Erstellen einer

Standardkurve von verschiedenen Konzentrationen (Konzentration von 1; 0,8; 0,6;

0,4; 0,2 und 0,1 mg mL-1) an Rinderserumalbumin („bovine serum albumin“ = BSA)

diente der Bestimmung der relativen Proteinkonzentration in der Proteinlösung über

die Absorbtion der BSA-Standardlösungen (Abb. 18). Zum Erstellen der Lösungen

wurde je 100 µL der BSA-Lösung auf 1 mL mit Bradford-Reagenz aufgefüllt, für 30

Minuten inkubiert und am Spektrophotometer bei 595 nm vermessen. Als Referenz

dienten 100 µL NSB.

2.13. SDS-PAGE

Die Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen erfolgte

nach Lämmli (Laemmli, 1970). Es kamen Polyacrylamidgele zum Einsatz (Any kDTM

Mini-PROTEAN® TGXTM Precast Gel, Bio Rad). Die zu analysierenden

Proteinlösungen wurden mit 6-Fachen Probenpuffern versetzt und für 5 Minuten bei

95°C denaturiert. Dadurch ließen sich die Proteine denaturieren. Als Referenz wurde

ein Marker (PageRuler™ Prestained Protein Ladder (10 – 170 kDa), Fermentas) auf

das Gel aufgetragen, um das Molekulargewicht der Proteine abzuschätzen. Als

Elekrtophoresepuffer kam ein SDS-Puffer (200 mM Glycin, 25 mM Tris/HCl, 0,1% w/v

SDS) zum Einsatz. Das Visualisieren der Proteinbanden auf den Gelen erfolgte mit

5xRoti R®Blue (Carl Roth, Kahrlsruhe, Deutschland). Dazu wurde das Gel mit 10 mL

Coomassie-Färbelösung (60% v/v deionisiertes Wasser, 20% v/v Methanol, 20% v/v

Roti R®Blue) versetzt, über Nacht inkubiert und in Wasser entfärbt.

2.14. Western Blot

Zur Überprüfung der Proteinexpression wurden während der Expression, nach der

Induktion, dem Zellaufschluss und der Proteinaufreinigung Proben entnommen und

über SDS-PAGE ihrer Größe nach aufgetrennt. Das Gel diente zum Transfer der


21

Proteine auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran. Dafür wurde die Membran

für 2 Minuten in Methanol aktiviert. Das Gel, die Membran und „Whatman“ - Papiere

equilibrierten in STB (192 mM Glycin, 25 mM Tris/HCl, 20% Methanol, pH = 8,0) und

wurden auf die Blotting-Maschine („Trans-Blot® SD Semi-Dry“ - Transferzelle)

aufgetragen. Das Blotten des Gels erfolgte für 25 Minuten bei 13 V. Nach 2-maligem

waschen der Membran für je 10 Minuten in TBS (150 mM NaCl, 10 mM Tris/HCl, pH

= 7,5) inkubierte diese mit 10 mL Blockierlösung (5% Alkali-lösliches Casein) für eine

Stunde bei 4°C. Durch zweimaliges Waschen mit TBSTT (500 mM NaCl, 20 mM

Tris/HCl, 0,2% v/v Triton X-100, 0,05% v/v Tween-20, pH = 7,5) für 10 Minuten

wurde überschüssige Blockierlösung entfernt. Danach wurde einmal mit TBS

gewaschen und die Membran mit 10 mL Blockierlösung mit 5 µL Antikörperlösung

(His-Tag ® Antibody HRP Conjugate Kit, Novagen) für eine Stunde inkubiert.

Anschließend wurde nochmals zweimal für 10 Minuten mit TBSTT und einmal für 10

Minuten mit TBS gewaschen. Nun wurde 1 mL Detektionslösung (1-Step TMB-

Blotting Lösung, Thermo Scientific) auf die Proteinseite des Blots getropft. Die

Lösung enthält das Substrat der Meerrettichperoxidase („horse raddish peroxidase“ =

HRP), welche an der AB-Region des His6-Antikörpers gebunden ist. Die

Enzymatische Reaktion führt zu einer Blaufärbung und damit einer Visualisierung der

entsprechenden Proteinbande.

2.15. Enzymassay

Nach der Bestimmung der Konzentration des aufgereinigten Proteins erfolgte die

Untersuchung der Enzymaktivität. Assays mit einem Volumen von 305 µL enthielten

10 - 5000 µM Substrat, aufgereinigtes Enzym (1,8 µg NIT1 bzw. 0,3 µg NIT3) und die

Reaktion wurde in einem Natriumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,2

durchgeführt. Der Enzymassay wurde für 20 Minuten bei einer Temperatur von 35°C

und 500 rpm inkubiert (Eppendorf Thermomixer® comfort). Zum Ermitteln des

optimalen pH-Wertes für die enzymatische Reaktion wurden Enzymassays mit

variablen pH-Werten (5,5; 6,0; 6,6; 7,0; 7,2; 7,6; 8,0 und 8,5) erstellt und bei 35 °C

und 500 rpm für 30 Minuten inkubiert. Um den optimalen Temperaturbereich

festzustellen, wurde Natriumphosphatpuffer mit dem pH-Wert 7,2 als

Reaktionsmedium verwendet. Die Proben wurden für je eine Stunde bei variabler

Temperatur (15°C, 20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C und 50°C) und 500 rpm

inkubiert. Für die Bestimmung der optimalen Substratkonzentration wurden


22

Enzymassays wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen des Substrates (10 -

5000 µM) bei einem pH-Wert von 7,2 und einer Temperatur von 35 °C für 20 Minuten

inkubiert. Die als Substrat eingesetzten Stoffe Benzylcyanid und Indol-3-acetonitril

wurden stets in DMSO gelöst und in einem maximalen Volumen von 3 µL zu dem

Assay zugefügt. β-Cyano-L-alanin wurde immer in deionisiertem Wasser gelöst. Das

Abstoppen der Reaktion nach der Inkubation erfolgte durch Zugabe des äquivalenten

Volumens an Methanol. Die Analyse der Proben erfolgte mittels

Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung („liquid

chromatography–tandem mass Spectrometry“ = LC-MS/MS). Es wurden stets

Triplikate erstellt und gemessen. Als negative Kontrolle diente eine

Proteinaufreinigung aus E. coli-Kulturen, die einen Leervektor enthielten.

2.16. Supplementationsexperiment mit P. trichocarpa

Putative Ausgangsstoffe der 2-Phenylethanolsynthese (2 mM Phenylessigsäure, 2

mM Phenylpyruvat und 2,5 mM 2-Phenylethylamin) dienten der Supplementation von

Einzelblättern (September 2012). In weiteren Experimenten kamen markierte

Derivate wie 5 mM 1,2-13C2-Phenylessigsäure (Juni 2013) und 1 mM Phenyl-d5-

acetaldoxim (Juli 2013) zum Einsatz. Die in Leitungswasser gelösten Stoffe wurden

mit dem gleichen Volumen (20 mL) Leitungswasser oder 500 µM Jasmonsäure

gemischt. Als Kontrollen dienten je 40 mL Lösung von Leitungswasser oder

Jasmonsäure. Einzelne Blätter von P. trichocarpa wurden nachmittags abgeschnitten

und über Nacht in je 40 mL der jeweiligen Lösungen in einer Klimakammer unter

kontrollierten Bedingungen (Siehe 2.3.) inkubiert. Die Blätter wurden von

verschiedenen Bäumen jedoch aus vergleichbaren Höhen abgeschnitten, um eine

Vergleichbarkeit des physiologischen Zustandes zu gewährleisten.

2.17. Duftstoffsammlung

Nach 18 Stunden Inkubation in der Supplementationslösung wurden P. trichocarpa

Blätter in einen 3 L Exsikkator transferiert. Die Frischluftversorgung der Blätter

erfolgte mit 0,3 L min-1 durch einen Aktivkohlefilter. Vor der Druckausgleichsöffnung

befand sich ein Super-Q-Silicafilter, in welchem die organischen Stoffe der Abluft

während der Duftsammlung über 6 Stunden adsorbierten. Die Bestimmung des

Frischgewichtes des Blattmaterials erfolgte direkt nach dem jeweiligen


23

Duftsammelexperiment. Das Material wurde umgehend in flüssigem Stickstoff

tiefgefroren und bis zur weiteren Analyse bei -80°C aufbewahrt.

Transformierte N. benthamiana-Pflanzen wurden in einen Bratschlauch (Toppits®)

eingehüllt und mit einem Luftstrom versorgt. Pro Minute strömten 0,3 L Luft in den

Bratschlauch und flossen über einen Super-Q Silicafilter zurück. Die an die Matrix

dieses Filters gebundenen organischen Stoffe wurden mit 200 µL Dichlormethan (10

µg mL-1 n-Nonylacetat als internem Standard) eluiert. Die Analyse der Eluate erfolgte

mittels Gaschromatografie (Siehe 2.18.).

2.18. Gaschromatografie

Für die Analyse von flüchtigen organischen Stoffen aus den Duftsammlungen von P.

trichocarpa und N. benthamiana kam ein Gaschromatograph der Serie Agilent 6890

(Agilent, Santa Clara, Kalifornien, USA), verbunden mit einem Agilent 5973

Quadrupol Massenselektionsdetektor (Schnittstellentemperatur, 270 °C;

Quadrupoltemperatur, 150 °C; Quellentemperatur, 230°C; Elektronenenergie, 70 eV),

zum Einsatz (Trägergas: Helium). Die chromatographische Auftrennung erfolgte mit

einer ZB-WAX-Säule (Phenomenex, 60 m x 0.25 mm x 0.15 µm). Bei einer

Ofentemperatur von 40°C wurde ein µL der jeweiligen Probe injiziert. Nach 2 Minuten

bei 40°C erhöhte sich die Temperatur schrittweise um 5°C pro Minute auf 225°C und

verweilte für weitere 2 Minuten bei 225°C. Daraufhin stieg die Temperatur mit 100°C

pro Minute auf 250°C und blieb für 1 Minute konstant. Für die quantitative Analyse

wurde der baugleiche Gaschromatograph, verbunden mit einem

Flammenionisationsdetektor (FID), verwendet. Die Arbeitstemperatur betrug 250 °C.

Als Trägergas kam Wasserstoff zum Einsatz. Die Quantifizierung erfolgte durch den

Vergleich der in der FID und MS erhaltenen Peakflächen der jeweiligen Stoffe mit der

Peakfläche des internen Standards.

Beim Einspritzen der Probe in die Säule werden die organischen Moleküle durch das

Trägergas verteilt und am Säulenmaterial adsorbiert. Durch die stetige

Temperatursteigerung in der Säule, dissoziieren die organischen Moleküle je nach

ihrer Siedetemperatur zu spezifischen Zeitpunkten. Der Detektor signalisiert, bei

welcher Retentionszeit welcher Stoff eluiert. Das Massenspektrometer misst das

Verhältnis der Masse zu Ladung des Analyten. Der Flammenionisationsdetektor

bestimmt die Menge des Analyten durch thermische Ionisation.


24

2.18.1. Extraktion von Blattmaterial

Eine Suspension aus 100 mg zerkleinerten Blattmaterial und 1 mL Methanol wurde

für 3 Minuten stark geschüttelt. Die Abtrennung der unlöslichen Reste erfolgte durch

eine Zentrifugation für 5 Minuten bei 4300 rpm (Avanti® J-20XP; Rotor JS 4.3,

Beckman Coulter). Für die Analyse des Überstandes kam die LC-MS/MS zum

Einsatz.

2.19. LC-MS/MS Analytik

Die Chromatografie wurde auf einem Agilent 1200 HPLC System (Agilent

Technologies) mit einer Zorbax Eclipse XDB-C18 Säule (50 * 4.6 mm, 1.8 µm,

Agilent Technologies) und einem API 3200 Tandem Massenspektrometer (Applied

Biosystems) bei konstant 25°C durchgeführt. Das Massenspektrometer war mit einer

Turbospray Ionisierungsquelle ausgerüstet. Die mobilen Phasen setzten sich aus

einem Gemisch aus 0,05% v/v Ameisensäure in Wasser (Puffer A) und Acetonitril

(Puffer B) oder 0,2% v/v Essigsäure (Puffer C) und Acetonitril zusammen. Die

Flussrate betrug 1,1 mL min-1 bei 25°C. Die elektrische Spannung betrug 5500 eV.

Die Gastemperatur betrug 700°C, die Injektion des inneren Schutzgas erfolgte mit 70

psi und des Hüllgases mit 35 psi. Die LC-MS/MS Messungen für Aminosäuren und

Phenylacetaldoxim erfolgten im positiven Modus und die Messungen für

Phenylessigsäure und Indol-3-essigsäure wurden im negativen Modus durchgeführt.

Die Elution der Analyten erfolgte nach unterschiedlichen Elutionsprofilen (Tab. 6 und

7). Für die Aldoximanalyse wurde 0,2% v/v Ameisensäure in Wasser als Puffer A

verwendet. Multiple Reaktionsüberwachung kam zum Einsatz um das Mutterion und

das ausgewählte entstandene Fragment zu analysieren (Tab. 8). Zur Auswertung der

Daten kam die Analyst 1,5 Software zum Einsatz.

Die Derivatisierung der Aminosäuren mit Fluorenylmethoxycarbonyl geschah wie von

Docimo et al. 2012 beschrieben. Die Optimierung für die Analyse der Aminosäuren

wurde durchgeführt, indem ein Aminosäure Standard (13C, 15N markierter

Aminosäure Mix, Isotec) manuell in die Ionenquelle eingespritzt und das

Massenspektrometer auf die Masse des Mutterions und eines Fragmentes des

Mutterions kalibriert wurde.

Für die Konzentrationsbestimmung von Phenylacetaldoxim, Phenylessigsäure und

Indol-3-essigsäure kamen externe Standardkurven zum Einsatz (Phenylacetaldoxim:


25

50 - 1000 ng mL-1; Phenylessigsäure: 1 - 4000 ng mL-1; Indol-3-essigsäure: 1 - 8000

ng mL-1). Die Konzentrationsbestimmung der Aminosäuren erfolgte durch einen

internen Standard von markierten Aminosäuren (10 µg mL-1 13C,15N markierter

Aminosäure Mix, Isotec).

Tabelle 6: Elutionsprofil für die Aminosäure Analytik.

Zeit [min] Puffer A [%] Puffer B [%]

0 - 0,5 90 10

0,5 - 4,5 90 - 10 10 - 90

4,51 - 5 10 - 0 90 - 100

5,1 - 8 0 100

Tabelle 7: Elutionsprofil für die Analyse von Phenylacetaldoxim, Phenylessigsäure und Indol-3-essigsäure.

Zeit [min] Puffer C [%] Puffer B [%]

0 - 0,5 90 10

0,5 - 4 90 - 55 10 - 90

4,01 - 5 0 100

5,1 - 7 90 10

Tabelle 8: Multiple Reaktionsüberwachung aller analysierten Stoffe (MRM).

m/z CE [V] DP [V]

Asparagin 353 → 157 12 35

Aspartat 354 → 157,8 16 40

Phenylacetaldoxim 136 → 119 17 56

Phenylessigsäure 134 → 91 12 15

Indol-3-essigsäure 175 → 158 17 56


26

2.20. Synthese von Phenyl-d5-acetaldoxim

Die Synthese von Phenyl-d5-acetaldoxim wurde wie von Hofmann und Mitarbeitern

beschrieben durchgeführt (Hofmann et al., 1981). Der Ausgangsstoff L-Phenyl-d5-

alanin (10 µM) wurde mit 500 µL Reaktionsmedium versetzt. Als Reaktionsmedium

diente eine 1 Molare Natriumcarbonat-Lösung die mit Mannitol und Natriumchlorid

gesättigt und mit 2 molaren Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 10 eingestellt

wurde. Die Reaktion verlief bei konstant 45 °C unter ständigem mischen

durchgeführt. Die wässrige Phase des Reaktionsmediums wurde mit 4 mL Toluol

überschichtet. Die Reaktion lief für eine Stunde wobei jede Minute 8 µL einer

0,5%ige Natriumhypochlorit-Lösung, die mit Natriumchlorid gesättigt wurde,

zugegeben. Alle 10 Minuten erfolgte die Entfernung der Toluol-Phase und die

Überschichtung mit frischem Toluol. Die gesammelte Toluol-Phase wurde mit

Kalziumchlorid getrocknet. Das Lösungsmittel wurde durch einen

Rotationsverdampfer entfernt. Das getrocknete Phenylacetaldehyd wurde in 1 mL

einer 100 mM Hydroxylamin-Lösung (pH = 7,0) aufgenommen und mit 4 mL Toluol

überschichtet und bei dem gleichem Versuchsaufbau bei 25 °C über eine Stunde

gerührt. Die Toluol-Phase wurde mit Kalziumchlorid getrocknet und das

Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Ein Teil des Feststoffes wurde in

Dichlormethan aufgenommen und über GC-MS auf Identität geprüft. Der

verbleibende Feststoff wurde in Methanol gelöst. Anschließend erfolgte das

Verdampfen des Methanols unter dem Stickstoffstrom und restliches Wasser wurde

über Gefriertrocknung entfernt (Christ Laborgefriertrockner ALPHA 1-4 LDplus,

Osterode am Harz, Deutschland). Der verbleibende Feststoff wurde gewogen und die

Ausbeute bestimmt.

2.21. qRT-PCR

Zur Quantifizierung der Genexpression wurde eine qualitative „real time“- PCR

durchgeführt. Die Durchführung der cDNA-Synthese erfolgte wie in 1.4 beschrieben.

Die Primer wurden so entworfen, dass sie spezifisch an die Ausgangs-DNA in der

Probe binden (Anhang Tab. 13), um nur dieses spezielle Gen zu amplifizieren. Die

PCR (Brilliant III Ultra-Fast SYBR® Green QPCR Master Mix, Agilent) lief für 45

Zyklen (Mx3000P Stratagene, Agilent). Am Ende der Amplifikationsphase wurde eine

Schmelzkurve erstellt. Die Zugabe eines Referenzfarbstoffs (ROX) diente dazu, jede

PCR (Tab. 10) untereinander zu vergleichen. Die Durchführung des PCR-Programms


27

erfolgte wie in Tabelle 10 gezeigt. Die synthetisierten Fragmente eines biologischen

Replikates wurden über ein 1,5% Agarosegel aufgereinigt, in einen Zero Blunt

TOPO-Sequenzierungsvektor ligiert, Transformiert und Sequenziert (siehe 2.6 –

2.10), um festzustellen, ob das Amplikon dem Zielgen entsprach.

Tabelle 9: Komponenten der qRT-PCR.

Tabelle 10: Temperaturprofil der qRT-PCR.

2.22. Statistik

Soweit nicht anders angegeben wurden die Daten als Mittelwerte mit Standardfehlern

abgebildet. Für die Auswertung der Duftstoffsammlungen wurde eine logarithmische

Transformation angewandt und anschließend eine einfaktorielle Analyse der Varianz

(„one-way ANOVA“) gefolgt von einen Turkey-Test durchgeführt. Aufgrund des

experimentellen Aufbaus der Daten der qRT-PCR wurden jeweils zwei Gruppen

durch einen t-Test verglichen. Für die statistische Analyse wurde das Programm

Sigma Plot 11 verwendet (Systat Software).

Volumen [µL]

Komponente

10 SYBR Green Brilliant 3 Ultra-fast

1 3´- Primer

1 5´- Primer

0,3 ROX (1:500 verdünnt)

6,7 Steriles Wasser

1 cDNA-Vorlage

Temperatur

[°C] Zeit [s]

Zyklen

Denaturierung 95 180 1

Denaturierung/Elongation 95 20 45

Primerhybridisierung 60 20

Denaturierung 95 60

1 Hybridisierung 55 30

Denaturierung 95 30

Ergebnisse

28

3. Ergebnisse

3.1. Fütterungsexperimente zur Aufklärung der Biosynthese von 2-

Phenylethanol in P. trichocarpa

3.1.1. Jasmonsäure-Induzierte Emission von Duftstoffen abgeschnittener

Pappelblätter

Es ist bekannt, dass P. trichocarpa nach Herbivorie ein breites Duftspektrum emittiert

(Irmisch et al., 2013). 2-Phenylethanol gehört hierbei zu den Duftstoffen, welche von

unbehandelten Blättern nur in Spuren, nach Raupenfraß jedoch in größeren Mengen

abgegeben werden. Um zu testen, ob eine Duftstoffinduktion auch durch

Jasmonsäure verursacht werden kann, wurden P. trichocarpa-Einzelblätter in einer

Lösung mit Jasmonsäure inkubiert und anschließend erfolgte eine Duftsammlung.

Als Kontrolle dienten in Wasser inkubierte Blätter. Die emittierten VOC´s wurden über

GC-MS/FID analysiert (Abb. 7).

Abbildung 6: Die Duftemission von Jasmonsäure-induzierten Blättern von P. trichocarpa im Vergleich zu unbehandelten Kontrollblättern. Abgeschnittene Einzelblätter inkubierten über Nacht in 0,25 mM Jasmonsäure (JA) oder Leitungswasser (H2O). Die Duftsammlung erfolgte am Folgetag für 6 Stunden. Die Duftproben wurden mittels GC-MS analysiert. 1, (Z)-β-Ocimen; 2, (E)-β-Ocimen; 3, Hexylacetat; 4, (Z)-3-Hexenylacetat; 5, 1-Hexanol; 6, (Z)-Epoxyocimen; 7, (E)-2-Methylbutyraldoxim; 8, (E)-Methylbutyraldoxim; 9, (Z)-2-Methylbutyraldoxim; 10, Phenylmethanal; 11, (E)-β-Caryophyllen; 12, Germacren-D; 13, (Z,E)-α-Farnesen; 14, (E,E)-α-Farnesen; 15, 2-Phenylethylacetat; 16, Phenylmethanol; 17, 2-Phenylethanol; 18, Benzylcyanid; 19, 2-Phenylnitroethan; 20, Indol; IS = interner Standard, n-Nonylacetat.

Ergebnisse

29

Abgeschnittene Kontrollblätter emittierten geringe Mengen an Duftstoffen wie

Sesquiterpenen und Aromaten, wogegen Jasmonsäure-behandelte Blätter ein

deutlich breiteres Duftspektrum emittierten. Zu den Hauptkomponenten des

Jasmonsäure-induzierten Duftes gehörten, wie bereits nach Herbivorie beschrieben,

Mono- und Sesquiterpene (Danner et al., 2011). Neben Terpenen emittierten

induzierte Blätter auch Duftstoffe der grünen Blätter („green leaf volatiles“ = GLV´s),

wie z.B. (Z)-3-Hexenylacetat und 1-Hexanol, sowie aromatische Duftstoffe wie z.B.

Benzylcyanid und 2-Phenylnitroethan. Auch die Bildung von 2-Phenylethanol,

welches von Kontrollblättern nicht emittiert wurde, konnte durch die Zugabe von

Jasmonsäure induziert werden.

3.1.2. Phenylacetaldoxim ist der Vorläufer diverser aromatischer Duftstoffe

Durch Fütterungsexperimente mit Deuterium-markiertem L-Phenylalanin, welches 5

Deuteriumreste am Benzenring besitzt (L-Phenyl-d5-alanin), konnte bereits gezeigt

werden, dass diese Aminosäure der Ausgangsstoff für die Biosynthese von 2-

Phenylethanol in P. trichocarpa ist (persönliches Gespräch Sandra Irmisch). Um zu

klären, ob die Bildung von 2-Phenylethanol über Phenylacetaldoxim erfolgen kann,

wurden abgeschnittene Einzelblätter in Lösung mit Phenyl-d5-aldoxim jeweils mit

oder ohne Jasmonsäure inkubiert. Das vermeintliche Intermediat Phenyl-d5-aldoxim

wurde im Rahmen dieser Arbeit aus L-Phenyl-d5-alanin synthetisiert. Die Duftstoffe

der Einzelblätter wurden mittels GC-MS analysiert (Abb. 7). Es zeigte sich, dass

sowohl mit Jasmonsäure induzierte Blätter, als auch mit Phenyl-d5-acetaldoxim

induzierte Blätter Phenylacetaldehyd, 2-Phenylethylacetat, 2-Phenylethanol,

Benzylcyanid und 2-Phenylnitroethan emittierten. Dabei wiesen Massenspektren der

Duftstoffe von Phenyl-d5-acetaldoxim-supplementierten Blättern eine

Massenzunahme des Molekülions und des Phenyl-Fragmentes von 5

Masseneinheiten bei Phenylacetaldehyd (m/z 91 96; m/z 120 125), 2-

Phenylethylacetat (m/z 91 96; m/z 104 109), 2-Phenylethanol (m/z 91 96;

m/z 122 127), Benzylcyanid (m/z 90 94; m/z 117 122), und 2-

Phenylnitroethan (m/z 77 82; m/z 104 109). In Blättern, die mit Jasmonsäure

und Phenyl-d5-acetaldoxim gefüttert wurden, zeigte sich eine erhöhte Emission von

2-Phenyl-d5-ethanol, Benzyl-d5-cyanid und Phenyl-d5-acetaldehyd im Vergleich zu

Blättern, die ausschließlich mit Phenyl-d5-acetaldoxim gefüttert wurden.

Ergebnisse

30

Abbildung 7: Emission von Deuterium-markierten Duftstoffen nach Fütterung von Deuterium-markiertem Phenylacetaldoxim (Phenyl-d5-acetaldoxim) in P. trichocarpa-Blättern. Einzelblätter wurden mit je 1 mM Phenyl-d5-acetaldoxim supplementiert und über Nacht inkubiert. Als Kontrollen dienten Blätter, die in 0,25 mM Jasmonsäure (JA) bzw. Leitungswasser (H2O) inkubiert wurden. Nach 16 Stunden wurde eine Duftsammlung durchgeführt. Die Duftproben wurden mittels GC-MS analysiert. 1, Phenylacetaldehyd; 2, 2-Phenylethylacetat; 3, 2-Phenylethanol; 4, Benzylcyanid; 5, 2-Phenylnitroethan; 6, Phenyl-d5-acetaldehyd; 7, 2-Phenyl-d5-ethylacetat; 8, 2-Phenyl-d5-ethanol; 9, Benzyl-d5-cyanid; 10, 2-Phenyl-d5-nitroethan. IS = interner Standard, n-Nonylacetat

Ergebnisse

31

3.1.3. Phenylessigsäure dient als Vorläufer von 2-Phenylethanol

Phenylacetaldoxim könnte über Benzylcyanid und Phenylessigsäure zu 2-

Phenylethanol umgewandelt werden. Um zu testen, ob eine Reaktion von dem

Intermediat Phenylessigsäure zum Endprodukt 2-Phenylethanol möglich ist, erfolgte

eine Fütterung mit markierter Phenylessigsäure, deren α- und β-Kohlenstoffatom als

stabiles Isotop vorlagen (1,2-13C2-Phenylessigsäure). Die von den P. trichocarpa-

Einzelblättern emittierten Duftstoffe wurden mittels GC-MS analysiert und über GC-

FID quantifiziert. So zeigte sich, dass mit Jasmonsäure induzierte Blätter, als auch

mit markierter Phenylessigsäure induzierte Blätter unter anderem

Phenylacetaldehyd, 2-Phenylethylacetat und 2-Phenylethanol emittierten (Abb. 8).

Dabei zeigte sich in den Massenspektren der Duftstoffe von 1,2-13C2-

Phenylessigsäure-supplementierten Blättern eine Massenzunahme des Molekülions

und des Phenyl-Fragmentes von 2 Masseneinheiten bei Phenylacetaldehyd (m/z 91

93; m/z 120 122), 2-Phenylethylacetat (m/z 91 93; m/z 104 106), 2-

Phenylethanol (m/z 91 93; m/z 122 124).

Ergebnisse

32

Abbildung 8: Emission von markierten Duftstoffen nach Fütterung von markierter Phenylessigsäure (1,2-

13C2-Phenylessigsäure) in P. trichocarpa-Blättern. Einzelblätter wurden mit

je 5 mM markierter Phenylessigsäure supplementiert und über Nacht inkubiert. Als Kontrollen dienten Blätter, die in 0,25 mM Jasmonsäure (JA) bzw. Leitungswasser (H2O) inkubiert wurden. Nach 16 Stunden wurde eine Duftsammlung durchgeführt. Die Duftproben wurden mittels GC-MS analysiert. 1, Phenylacetaldehyd; 2, 2-Phenylethylacetat; 3, 2-Phenylethanol; 4, 1,2-

13C2-Phenylacetaldehyd; 5, 1,2-

13C2-Phenylethylacetat; 6, 1,2-

13C2-2-Phenylethanol. IS = interner Standard, n-Nonylacetat

Ergebnisse

33

3.1.4. Fütterung von alternativen Vorläufern der 2-Phenylethanol-

Biosynthese

Kürzlich wurde die 2-Phenylethanol-Biosynthese über Phenylpyruvat und

Phenylactaldehyd auch in der Damaszener-Rose (Rosa damascena) nachgewiesen

(Hirata et al., 2012). Neben diesem Biosyntheseweg ist auch 2-Phenylethylamin als

Zwischenprodukt der 2-Phenylethanol-Biosynthese in der Tomate bekannt (Tieman

et al., 2006). Ein Vergleich der 2-Phenylethanol-Emission von Pappelblättern, welche

mit den putativen Intermediaten Phenylessigsäure, Phenylpyruvat und 2-

Phenylethylamin supplementiert wurden, sollte zeigen, ob 2-Phenylethanol auch über

die bereits beschriebenen Biosynthesewege in P. trichocarpa produziert werden

kann (Abb. 9). Dazu wurden abgeschnittene Blätter von P. trichocarpa wie unter 2.16

beschrieben in Leitungswasser, in Phenylessigsäure, Phenylpyruvat oder 2-

Phenylethylamin, jeweils mit oder ohne Jasmonsäure, inkubiert. Die

Duftstoffsammlung wurde mittels GC-MS analysiert und über GC-FID quantifiziert.

Die Supplementation von Phenylessigsäure oder 2-Phenlyethylamin resultierte in

einer signifikanten Steigerung der Emission von 2-Phenylethanol im Vergleich zu

unbehandelten Blättern. Dabei ließ sich die Emission von 2-Phenylethanol durch die

zusätzliche Behandlung mit Jasmonsäure nicht weiter steigern. Die Supplementation

von Phenylessigsäure mit und ohne Jasmonsäure oder Phenylpyruvat und

Jasmonsäure resultierte in einer signifikanten Steigerung der Emission von

Phenylacetaldehyd, im Vergleich zu unbehandelten Blättern und in mit 2-

Phenylethylamin supplementierten Blättern. Die Emission von Phenylacetaldehyd in

Blättern, die mit Phenylpyruvat und Jasmonsäure supplementiert wurden,

unterschied sich signifikant von Blättern, die ausschließlich mit Jasmonsäure

gefüttert wurden. Die Menge an emittiertem 2-Phenylethanol überstieg die Menge an

Phenylacetaldehyd und 2-Phenylethylacetat der jeweiligen Behandlung um ein

Vielfaches.

Ergebnisse

34

Abbildung 9: Aromatische Duftstoffe von Einzelblättern von P. trichocarpa nach Supplementation mit putativen Substraten und Intermediaten der 2-Phenylethanol-Biosynthese. Einzelblätter wurden mit je 2,5 mM Phenylessigsäure (PAA), Phenylpyruvat (PPA), Phenylethylamin (PEA) oder keinem der genannten supplementiert und in 0,25 mM Jasmonsäure (JA) bzw. Leitungswasser (H2O) über Nacht inkubiert. Am Folgetag wurde für 6 Stunden Duft gesammelt. Die Analyse der Duftproben erfolgte mittels GC-MS/FID. Mithilfe von ANOVA wurde auf Signifikanz getestet. Unterscheidliche Buchstaben repräsentieren signifikante Unterschiede (p<0,05, n(H2O) = 9, n(JA) = 9, n(PAA) = 11, n(PPA) = 8, n(PEA) = 4).

3.2. Identifizierung von Nitrilasen im Genom von P. trichocarpa

Um putative Nitrilasen aus P. trichocarpa zu identifizieren, wurde ein Genom-BLAST

durchgeführt (www.phytozome.de), bei der die Aminosäuresequenz von Nit4 von A.

thaliana (AT5G22300) als Vorlage verwendet wurde. Die Suche ergab, dass im

Genom von P. trichocarpa (Tuskan et al., 2006) vier vermeintliche Nitrilasen codiert

sind. Drei dieser Gene wiesen und wurden als Nit1 (Potri.004G199600), Nit2

(Potri.006G207700) und Nit3 (Potri.016G074200) bezeichnet (Nit1 = 1134 kb, Nit2 =

1236 kb, Nit3 = 1338 kb). Alle drei Nitrilasegene waren jeweils auf unterschiedlichen

Chromosomen lokalisiert (Nit1 = Chr. 4, Nit2 = Chr. 6 und Nit3 = Chr. 16). Die Gene

Nit2 und Nit3 sind auf dem Nukleotidlevel zu 87%, Nit2 und Nit1 60% und Nit1 und

Nit3 64% ähnlich zueinander (DNA-Sequenzen siehe Anhang). Das vierte

identifizierte Gen mit hoher Sequenzähnlichkeit zu Nit4 von A. thaliana besaß keine

annotierte Nitrilasedomäne und wurde daher bei weiteren Analysen vernachlässigt.

Bemerkenswerterweise besaßen Nit2 und Nit3 zusätzlich zur Nitrilasedomäne (Punta

et al., 2012) eine Transkriptionsfaktordomäne aus der Familie der TCP (benannt

nach teosinte branched 1, cycloidea und PCF-Transkriptionsfaktoren aus A. thaliana

(Cubas et al., 1999)) (Abb. 10). TCP-Transkriptionsfaktordomänen können auf

mRNA-Ebene durch miRNA-Interaktion die Transkriptakkumulation regulierten

Ergebnisse

35

(Palatnik et al., 2003). Mit einer Größe von 40-50 kDa besitzen die Nitrilasen der

Pappel eine ähnliches Molekulargewicht (NIT1 = 40,5 kDa; NIT2 = 44 kDa; NIT3 =

47,6 kDa) im Vergleich zu bereits beschriebenen Nitrilasen aus A. thaliana und S.

bicolor (Piotrowski und Volmer, 2006; Jenrich et al., 2007; Piotrowski, 2008).

Abbildung 10: Sequenzvergleich der putativen Nitrilasen aus P. trichocarpa. Die Gensequenzen wurden aus der cDNA von Hebivor-induzierten Blättern amplifiziert und sequenziert. Das Proteinsequenzalignment wurde mit dem Programm MegAlign

TM (DNASTAR Lasergene

® 10) und dem

MUSCLE-Algorithmus (MEGA5) erstellt. Identische Aminosäuren sind grau unterlegt. Die Transkriptionsfaktordomäne ist gewellt und die Kohlenstoff-Stickstoff-Hydrolase-Domäne ist gerade unterstrichen. Essentielle Aminosäuren der katalytischen Triade sind mit * markiert.

Um zu erfahren, in welche Klasse sich die identifizierten Nitrilasen einordnen, wurde

eine phylogenetische Analyse der Nitrilasen der Pappel mit den

Aminosäuresequenzen von diversen bereits charakterisierten Nitrilasen im

Pflanzenreich durchgeführt (Abb. 11). Die Nitrilase NIT1 aus P. trichocarpa bildet

eine Gruppe mit NIT4 von A. thaliana, die in die Detoxifizierung von β-Cyano-L-alanin

involviert ist (Piotrowski und Volmer, 2006). NIT2 und NIT3 bilden eine

monophyletische Gruppe. Alle Nitrilasen der Pappel wiesen die beschriebene

katalytische Triade auf (Brenner, 2002).

Ergebnisse

36

Abbildung 11: Phylogenetischer Baum (Chladogramm) von bereits charakterisierten Nitrilasen aus Angiospermen und putativen Nitrilasen der Westlichen Balsampappel. Zur Rekonstruktion der Beziehung wurde die Neighborhood-joining Methode angewandt. Als phylogenetischer Test wurde die Bootstrap Methode angewandt (n=1000). Die Werte an den Verzweigungen geben die prozentuale Wahrscheinlichkeit für die Aufteilung zweier Gruppen an. Substrate, die von den jeweiligen Nitrilasen akzeptiert werden, sind aufgelistet (Box). Die Nitrilase 1 des Bakteriums (Rhodococcus jostii) wurde als „outgroup“ gezeigt. BCA = β-Cyano-L-alanin, IAN = Indol-3-acetonitril, BC= Benzylcyanid, AN = Acrylonitril, BN = Benzonitril. GenBank Zuordnungsnummern: Sorghum bicolor: SbNIT4B2: XM_002452452.1; SbNIT4B1: XM_002452452.1; SbNIT4A: XM_002452453.1, Zea mays: ZmNIT1: NM_001112112.1; ZmNIT2: NM_001111726.1, Oryza sativa: OsNIT4B: NM_001054052.1; OsNIT4A: NM_001054053.1, Populus trichocarpa: PtNIT1: XM_002328201.1; PtNIT2: XM_002308419.1; PtNIT3: XM_002322771.1, Arabidopsis thaliana: AtNIT1: NM_180680.2; AtNIT2: NM_114298.1; AtNIT3: NM_114300.3; AtNIT4: NM_122135.5, Rhodococcus jostii: RHA1: NC_008268.1

Ergebnisse

37

3.3. Klonierung und heterologe Expression von Nitrilasen aus P.

trichocarpa

Um die biochemischen Charakteristiken der Nitrilasen aus P. trichocarpa zu

untersuchen wurden Nit1 und Nit3 aus Herbivorie-induzierten Pflanzenmaterial

amplifiziert und die codierende Sequenz aus der Datenbank bestätigt. Die

amplifizierten Gene wurden heterolog in E. coli exprimiert. Dabei erfolgte die

Expression unter Konditionen die als optimal für Nitrilasen beschrieben wurden

(persönliche Kommunikation mit Markus Piotrowski, Ruhr-Universität Bochum). Die

mit einem His6-Tag konjugierten Enzyme wurden über Affinitätschromatographie und

Größenausschlusschromatographie aufgereinigt. Die Aktivität der heterolog

exprimierten Fusionsproteine wurde für drei putative Substrate getestet. Aus

zeitlichen Gründen konnte NIT2 im Laufe dieser Arbeit nicht heterolog exprimiert und

biochemisch charakterisiert werden.

3.3.1. Produktspezifität und enzymatische Charakterisierung von Nitrilasen

aus P. trichocarpa

Der phylogenetische Vergleich zeigte eine nahe Verwandtschaft der P. trichocarpa

Nitrilasen zu Nitrilasen aus A. thaliana (Abb. 11). Es wurde beschrieben, dass

Nitrilasen aus A. thaliana diverse Nitrile wie Indol-3-acetonitril, β-Cyano-L-alanin und

Benzylcyanid als Substrat akzeptieren (Brenner, 2002). Um zu zeigen, ob Nitrilasen

aus P. trichocarpa diese Substrate umsetzten, wurden heterolog exprimierte Enzyme

mit den oben erwähnten putativen Substraten inkubiert. Die optimalen

Reaktionsbedingungen für die Katalyse wurden über Enzymassays unter

verschiedensten pH-Werten und variierender Temperatur ermittelt (Abb. 17). Die

Analyse der Reaktionsprodukte erfolgte über LC-MS/MS. Als Standard diente das

jeweilige erwartete Produkt. NIT1 setzte Benzylcyanid sowie Indol-3-acetonitril zu

Phenylessigsäure beziehungsweise Indol-3-Essigsäure um. Des Weiteren setzte

NIT1 β-Cyano-L-alanin zu Asparagin und Aspartat um. Auch NIT3 setzte β-Cyano-L-

alanin zu Asparagin und Aspartat um, zeigte jedoch keine Aktivität mit Benzylcyanid

oder Indol-3-essigsäure. Außerdem wurde getestet, ob NIT1 oder NIT3 Benzylcyanid

in das korrespondierende Amid, 2-Phenylacetamid, umsetzten. Es zeigte sich jedoch,

dass 2-Phenylacetamid nicht produziert wurde. Enzymassays, die mit gereinigtem

Protein aus einer Kultur, die den leeren Vektor exprimierte, durchgeführt wurden,

zeigten unabhängig vom eingesetzten Substrat, keine Aktivität (Abb. 12).

Ergebnisse

38

Abbildung 12: Enzymatische Aktivität von NIT1 und NIT3. Die Nitrilasen wurden heterolog in E. coli exprimiert und über Affinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie aufgereinigt. Die Enzymassays mit NIT1 oder NIT3 wurden jeweils mit den Substraten Benzylcyanid (A und B) oder Indol-3-acetonitril (C) versetzt. Die Produkte Phenylessigsäure (A), 2-Phenylacetamid (B) und Indol-3-essigsäure (C) aus in vitro Reaktionen wurden mittels LC-MS/MS detektiert. Als Referenz ist jeweils ein externer Standard des Analyten einer Konzentration von 1 µg mL

-1 (linke

Spalte) gegeben. Zum Vergleich sind die Retentionszeiten der Analyten über den Peaks abgebildet.

Die enzymatischen Charakteristiken von NIT1 für die Umwandlung von Benzylcyanid

zu Phenylessigsäure wurden durch Substrat-Produkt-Kurven bestimmt (Abb. 19;

Tab. 11). Außerdem wurde für NIT1 und NIT3 die Umwandlung von β-Cyano-L-

alanin zu Asparagin und Asparaginsäure bestimmt. NIT1 besitzt eine geringere

Affinität (1 Km-1) für Benzylcyanid als zu β-Cyano-L-alanin. Die Maximale

Umsatzgeschwindigkeit von NIT1 für die Umsetzung von Benzylcyanid ist geringer

als die Maximale Umsatzgeschwindigkeit (Vmax) von β-Cyano-L-alanin zu Asparagin

(12,4 µmol min-1) und Asparaginsäure (1115 µmol min-1). Der Substratumsatz pro

Minute (kcat) liegt bei 1*105 für Benzylcyanid, bei 4*105 für die Biosynthese von

Asparagin und bei 4*107 für die Biosynthese von Asparaginsäure. So zeigte NIT1 für

Ergebnisse

39

Benzylcyanid im Vergleich zu β-Cyano-L-alanin eine weitaus geringere katalytische

Effizienz.

Die Auftragung des eingesetzten Substrates gegen das analysierte Produkt ergab für

NIT3 eine Gerade. Dabei liegt der Standardfehler für die enzymkinetischen

Konstanten bei 50 – 100 % und ist somit nicht aussagekräftig. Die Affinität von NIT1

für β-Cyano-L-alanin war deutlich geringer als die Affinität von NIT1 zu Benzylcyanid.

Die Maximale Umsatzgeschwindigkeit von NIT3 ist für die Biosynthese von

Asparagin scheinbar höher als für die Biosynthese von Asparaginsäure. Der

Substratumsatz für β-Cyano-L-alanin ist für das Produkt Asparagin um ein 10-Faches

höher als für Asparaginsäure. So würde sich für die Entstehung von Asparaginsäure

eine doppelt so hohe katalytische Effizienz ergeben als für die Entstehung von

Asparagin aus β-Cyano-L-alanin.

Tabelle 11: Kinetische Konstanten von NIT1 und NIT3. Gezeigt sind die Enzymkinetischen Werte

von NIT1 und NIT3 die Umsetzung des jeweiligen Substrates zum korrespondierenden Produkt.

Ergebnisse

40

3.4. Q-PCR

Nach Verwundung kann die Transkription von Genen zum Beispiel in A. thaliana

(Cheong et al., 2002) und auch in P. trichocarpa (Danner et al., 2011; Irmisch et al.,

2013) reguliert werden. Um zu untersuchen, ob sich die Transkriptakkumulation der

in dieser Arbeit untersuchten Nitrilasegene nach Herbivorie verändert, wurde eine

qRT-PCR durchgeführt (Abb. 13). Es wurde RNA von apikal Herbivorie-induzierten

(leaf plastochron index 3 = LPI 3; (Frost et al., 2007)), basal Herbivorie-induzierten

(LPI 10) und LPI 3 sowie LPI 10 Kontrollblättern von P. trichocarpa in cDNA

umgeschrieben (Abb. 13 A). Mittels spezifischer Primer wurde die relative

Genexpression von Nit1, Nit2 und Nit3 ermittelt. Als „housekeeping“ Gen diente

Ubiquitin (Ramirez-Carvajal et al., 2008). Die Expression von Nit1 unterschied sich

nach Herbivorie nicht von der Expression im Kontrollblatt. Zudem gab es keinen

Unterschied zwischen der Transkriptakkumulation in LPI 3 und LPI 10 Blättern. Die

Genexpression von Nit2 und Nit3 zeigte keine Unterschiede zwischen Herbivorie-

induzierten- und Kontrollblättern. Im Gegensatz dazu, zeigte die Genexpression in

jüngeren LPI 3 Blättern eine signifikant geringere Nit2 und Nit3

Transkriptakkumulation in Herbivor-induzierten Blättern im Vergleich zu

Kontrollblättern. Dabei wiesen jüngere Kontrollblätter (LPI 3) im Vergleich zu älteren

Kontrollblättern (LPI 10) eine höhere Transkriptakkumulation von Nit2 und Nit3 auf

(Abb. 13 C und D).

Ergebnisse

41

Abbildung 13: Transkriptakkumulation von Nit1, Nit2 und Nit3 in Herbivor-induzierten und Kontroll-Blättern von P. trichocarpa. (A) apikale (3) und basale Blätter (10) wurden durch Fraß von L. dispar-Raupen induziert (H). Uninduzierte apikale und basale Blätter des jeweiligen Stadiums dienten als Kontrollen (K3, K10). RNA dieser Blätter (n = 5) wurde extrahiert, in cDNA umgeschrieben und als Vorlage für eine qRT-PCR verwendet. Die relative Genexpression von (B) Nit1, (C) Nit2 und (D) Nit3 wurde gegen das Haushaltsgen Ubi1 normalisiert und bestimmt. Mithilfe von (B und C) ANOVA und (D) t-Test wurde auf Signifikanz getestet. Unterscheidliche Buchstaben repräsentieren signifikante Unterschiede.

Ergebnisse

42

3.5. Überexpression in N. benthamiana

3.5.1. Duftstoffsammlung

Kürzlich wurde gezeigt, dass CYP79D6v3-transfizierte N. benthamiana-Pflanzen

neben Aldoximen und Nitrilen auch 2-Phenylethanol emittieren (Irmisch et al., 2013).

Die Co-Transfektion von CYP79D6v3 und Nit1 sollte zeigen, ob sich das

Duftspektrum durch die Coexpression der Nitrilase verändert. Zusätzlich sollten N.

benthamiana-Pflanzen produziert werden, die ausschließlich Nit1 oder CYP79D6v3

transient exprimieren. Als Kontrollpflanzen dienten 35S:eGFP N. benthamiana-

Pflanzen. Zudem ermöglichten diese Pflanzen eine zusätzliche Kontrolle der

erfolgreichen Transfektion durch Fluoreszenzmessung. Die Fluoreszenz wurde unter

dem Fluoreszenzmikroskop getestet (Abb. 14). Da diese nach 3 Tagen gut zu sehen

war, wurde auch der Duft der Pflanzen 3 Tage nach der Transformation gemessen.

Abbildung 14 zeigt, dass eGFP- und Nit1-exprimierende Pflanzen nur geringe

Mengen an volatilen organischen Stoffen emittierten. CYP79D6v3-exprimierende

Pflanzen emittierten, wie von Irmisch und Kollegen beschrieben (Irmisch et al., 2013),

ein breites Spektrum an stickstoffhaltigen Duftstoffen und Alkoholen wie

Benzylcyanid und 2-Phenylethanol. Durch eine Co-Transfektion von CYP79D6v3 und

Nit1 änderte sich die Emission keiner der Duftstoffe signifikant.

Ergebnisse

43

Abbildung 14: Konzentration von Phenylessigsäure und Phenylacetaldoxim in N. benthamiana-Pflanzen nach transienter Transformation mit eGFP, Nit1, CYP79D6v3 bzw. CYP79D6v3+Nit1. Die Blätter der Pflanzen wurden in flüssigem Stickstoff gemörsert, Pflanzenmaterial mit Methanol extrahiert und Metabolite per LC-MS/MS analysiert. (A) Der Transfektionserfolg wurde durch die Fluoreszenz von eGFP unter dem Mikroskop kontrolliert. Zu sehen ist das Cytosol der Epidermiszellen einer mit eGFP-transfizierten Pflanze. (B) Die Konzentration von Phenylacetaldoxim aus dem Pflanzenextrakt (n=3-5). (C) Die Konzentration von Phenylessigsäure aus dem Pflanzenextrakt (n=3-5).

Ergebnisse

44

3.5.2. Analyse von Intermediaten der 2-Phenylethanol-Biosynthese

Mit CYP79D6v3-transformierte Pflanzen wiesen eine Emission von Benzylcyanid auf,

welches vermutlich aus Phenylacetaldoxim synthetisiert wird (Abb. 15; Irmisch et al.,

2013). Außerdem wurde aufgrund vorhergehender Ergebnisse vermutet, dass

Phenylessigsäure ein Intermediat der 2-Phenylethanol-Biosynthese ist. In transienten

N. benthamiana-Pflanzen wurde daher Phenylessigsäure und Phenylacetaldoxim

mittels LC-MS/MS gemessen. In Pflanzen, die eGFP oder Nit1 überexprimierten, ließ

sich keine Akkumulation von Phenylacetaldoxim nachweisen. Die Überexpression

von CYP79D6v3 und CYP79D6v3+Nit1 hatte eine Akkumulation von

Phenylacetaldoxim im Blatt zur Folge, welche für beide bei ca. 40 µg g-1

Frischgewicht lag. Die Pflanzen, die eine erhöhte Konzentration von

Phenylacetaldoxim aufwiesen, zeigten zudem eine erhöhte Konzentration von

Phenylessigsäure. Im Vergleich zu Tabakpflanzen, die ausschließlich eGFP oder

Nit1 transient exprimierten, stieg die Konzentration von Phenylessigsäure in mit

CYP79D6v3 transfizierten Pflanzen auf bis zu 4 mg g-1 Frischgewicht an. Die

Coexpression von Nit1 bewirkt jedoch keine zusätzliche Veränderung der

Konzentration an Phenylessigsäure. Die Konzentration an Phenylessigsäure von

Pflanzen, welche Nit1 oder eGFP transient exprimierten, unterschiedet sich nicht

signifikant voneinander.

Ergebnisse

45

Abbildung 15: Emittierte VOC´s von transfizierten N. benthamiana-Pflanzen. Pflanzen (n=3-5) wurden mit Agrobakterien, die 35S:eGFP, 35S:Nit1, 35S:CYP79D6v3 und 35S:CYP79D6v3+Nit1 enthielten, infiltriert und der Duft wurde für 6 Stunden gesammelt. Die Identifikation der emittierten Stoffe erfolgte durch GC-MS. Die Quantifizierung wurde mit GC-FID durchgeführt. Pflanzen die CYP79D6v3 und CYP79D6v3+Nit1 transient exprimierten, emittieren volatile organische Duftstoffe, wie Nitrile (2-Methyl-butannitril, 3-Methyl-butannitril, Tert-butyl-2-cyanoacetat, Benzylcyanid), Aldoximen ((Z)-2-Methylbutyraldoxim, (E)-2-Methylbutyraldoxim, 2-Methyl-syn-butylaldoxim, 2-Methyl-anti-butylaldoxim), Alkohole (3-Methyl-1-butanol, 3-Pentanol, 2-Phenylethanol) und Nitro-Verbindungen (1-Nitro-3-bethylbutan, 2-Phenylnitroethan).

Diskussion

46

4. Diskussion

4.1. Die Jasmonsäure-abbhängige Biosynthese von Duftstoffen in P.

trichocarpa

Diverse Pflanzen emittieren zu ihrer Verteidigung gegen biotische und abiotische

Faktoren Duftstoffe (Creelman und Mullet, 1995; Dicke et al., 1999; Ament et al.,

2004). So steigt die Emission von Duftstoffen nach Herbivorie von L. dispar-Raupen

an P. trichocarpa dramatisch (Danner et al., 2011). Es wurde gezeigt, dass eine

ähnlich erhöhte Produktion von Duftstoffen in Tabak durch Jasmonsäure vermittelt

wird (Boland et al., 1995). Jasmonsäure wirkt als Signalstoff, der in der Pflanze als

Reaktion auf biotischen und abiotischen Stress gebildet wird (Creelman und Mullet,

1995). Durch Duftsammlung von in Jasmonsäure-inkubierten Einzelblättern von P.

trichocarpa im Vergleich zu Blättern, die in Wasser inkubiert wurden, ließ sich eine

Duftstoffemission hervorrufen (Abb. 6), die ähnlich zur Herbivorie-induzierten

Emission von Pappelbäumen ist (Irmisch et al., 2013). So ließen sich diverse

Vertreter der Herbivorie-induzierten Duftstoffe wie Terpene, Duftstoffe der grünen

Blätter, Aromaten und Aminosäure-Derivate (Clavijo McCormick et al., 2012) auch im

Einzelblatt von P. trichocarpa nachweisen.

4.2. Die Biosynthese von 2-Phenylethanol in P. trichocarpa verläuft

vermutlich über Benzylcyanid und Phenylessigsäure

In der vorliegenden Arbeit sollte die Bildung von 2-Phenylethanol in der Pappel

untersucht werden. Sakai und Mitarbeiter postulierten bereits 2007 einen

Biosyntheseweg in der Rose, der von Phenylalanin über Phenylacetaldoxim zum 2-

Phenylethanol führt (Sakai et al., 2007). Die Fütterung von Pappelblättern mit Phenyl-

d5-acetaldoxim resultierte im Einbau der Markierung in, unter anderem Benzylcyanid

und 2-Phenylethanol (Abb. 7). Dies deutet darauf hin, dass Phenyl-d5-acetaldoxim

nicht nur in das Blatt aufgenommen, sondern auch in volatile organische Stoffe

umgewandelt wird. Damit wird die Vermutung unterstützt, dass Benzylcyanid und 2-

Phenylethanol in der Pappel aus Phenylacetaldoxim produziert werden. Die mögliche

Funktion von Phenylacetaldoxim als Ausgangsstoff für die Produktion von

Benzylcyanid in der Pappel wurde kürzlich beschrieben (Irmisch et al., 2013). Die

Umwandlung von Benzylcyanid zu Phenylessigsäure wurde bereits vermutet

(Steiner, 1948). Zwar ist das Vorkommen von Phenylessigsäure in Pflanzen ist

Diskussion

47

bereits bekannt (Wightman und Lighty, 1982), wurde bisher jedoch nicht in direkte

Verbindung mit der Duftstoffbiosynthese gebracht.

Daher sollte untersucht werden, ob Phenylessigsäure zu 2-Phenylethanol

umgewandelt werden kann. Es zeigte sich, dass die Fütterung von Pappelblättern mit

einem 1,2-13C-Isotop der Phenylessigsäure die Emission von 2-Phenylethanol

erhöhte. Ein Einbau der Markierung konnte nicht nur für 2-Phenylethanol, sondern

auch für das vermutliche Intermediat Phenylacetaldehyd und für einen strukturell

verwandten Ester, 2-Phenylethylacetat, nachgewiesen werden (Abb. 8). Diese

Ergebnisse demonstrieren, dass Phenylessigsäure als Intermediat der Biosynthese

von 2-Phenylethanol in höheren Pflanzen fungieren kann.

Außerdem sollte untersucht werden, ob 2-Phenylethanol neben der Biosynthese über

Phenylessigsäure in der Pappel auch über die Vorläufer der 2-Phenylethanol-

Biosynthese der Tomate (Tieman et al., 2006) oder der Hefe (Ehrlich, 1907)

verlaufen kann (Abb. 2). In Supplementationsexperimenten mit den Intermediaten

Phenylethylamin und Phenylpyruvat zeigte sich, dass die Fütterung von

Pappelblättern mit 2-Phenylethylamin unabhängig von der Induktion mit

Jasmonsäure in einer erhöhten Emission von 2-Phenylethanol resultierte (Abb. 9).

Daher könnte ein über 2-Phenylethylamin führender Biosyntheseweg zur Bildung von

2-Phenylethanol in P. trichocarpa beitragen. Die Fütterung von Phenylpyruvat

erhöhte die Emission von 2-Phenylethanol nicht, jedoch zeigte sich eine

vermeintliche Jasmonsäure-induzierte Emission von Phenylacetaldehyd nach der

Fütterung von Phenylpyruvat. Phenylacetaldehyd wird hier wahrscheinlich nicht, wie

nach der Fütterung von Phenylessigsäure dem 2-Phenylethanol-Metabolismus

zugeführt. Um jedoch ausschließen zu können, dass Phenylpyruvat und

Jasmonsäure nicht allein schon für die Emission von Phenylacetaldehyd

verantwortlich sind, muss die Emission einer Lösung mit Phenylpyruvat und

Jasmonsäure ohne Blatt in beschriebenen Konzentrationen (siehe 2.16.) gemessen

werden.

Zusammengenommen unterstützen die erhaltenen Ergebnisse den postulierten

Biosyntheseweg von 2-Phenylethanol über Phenylacetaldoxim, Benzylcyanid,

Phenylessigsäure und Phenylacetaldehyd in P. trichocarpa (Abb. 16). Die Beteiligung

eines weiteren Biosyntheseweges mit 2-Phenylethylamin als Intermediat in Analogie

zur Tomate (Tieman et al., 2006) kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, denn

Diskussion

48

interessanterweise zeigte sich durch die Zugabe von Phenylessigsäure und

Phenylethylamin eine Jasmonsäure-unabhängige Emission von 2-Phenylethanol. In

hier gezeigten Experimenten wurde zum Teil mit unphysiologischen Konzentrationen

der zu untersuchenden Stoffe gearbeitet. Daher kann nicht ausgeschlossen werden,

dass die Abwehrreaktion der Pflanze durch diesen abiotischen Stress selbst

ausgelöst und daraufhin Jasmonsäure biosynthetisiert wurde. Denn auch diese

pflanzliche Biosynthese von Jasmonsäure könnte die Emission der hier untersuchten

Duftstoffe steigern.

Abbildung 16: Putative 2-Phenylethanol Biosynthese in P. trichocarpa. Die Biosynthese von 2-Phenylethanol in der Pappel verläuft vermutlich über Phenylacetaldoxim, welches aus dem Primärmetaboliten L-Phenylalanin synthetisiert wird. Durch ein CYP71-Enzym wird Benzylcyanid generiert, welches durch NIT1 zu Phenylessigsäure umgewandelt wird und als Ausgangsstoff für die Produktion von Phenylacetaldehyd, 2-Phenylethanol und 2-Phenylethylacetat dient. Die Emission von aromatischen volatilen organischen Stoffen (Kasten) kann durch die Induktion der Expression von CYP79D6v3 induziert werden (Herbivor, grün). Phenylessigsäure als Zwischenprodukt der Duftstoffsynthese kann als Auxin weitere wichtige Funktionen wie Signalübertragung wahrnehmen.

Diskussion

49

4.3. NIT1 ist wahrscheinlich in die Biosynthese von 2-Phenylethanol in P.

trichocarpa involviert

Nitrilasen wurden als Enzyme beschrieben, die Nitrile in die entsprechende Säure

umwandeln (Thimann und Mahadevan, 1958). Die identifizierten Nitrilasen aus dem

Genom von P. trichocarpa wurden aus Herbivorie-induzierten Blättern amplifiziert

und Nit1 und Nit3 wurden heterolog in E. coli exprimiert. Die heterolog exprimierten

Enzyme wurden mit verschiedenen Substraten inkubiert und die Produkte wurden

per LC-MS/MS analysiert. Phenylessigsäure als Intermediat der Biosynthese von 2-

Phenylethanol, kann über die in dieser Arbeit charakterisierte NIT1 aus Benzylcyanid

gebildet werden. Die heterolog exprimierte NIT1 weist dabei eine geringe Affinität (1

Km-1) für Benzylcyanid als Substrat auf (Tab. 11) und besitzt eine geringe Aktivität

(Vmax) für dieses Substrat. Daher liegt die katalytische Effizienz von NIT1 mit kcat Km-1

= 17,7 im unteren Bereich enzymatischer Effizienz. Die Substrataffinität von NIT1 für

Benzylcyanid ist vergleichbar mit der Substrataffinität von NIT2 von Mais (Zea mays)

für das aromatische Molekül Indol-3-acetonitril, die bei 0,9 mM liegt (Kriechbaumer et

al., 2007). Dabei weist NIT1 von P. trichocarpa eine höhere Affinität für Benzylcyanid

auf als NIT2 aus Z. mays für Indol-3-acetonitril. Die aus der durch NIT1-katalysierten

Reaktion entstehende Phenylessigsäure kann, wie oben beschrieben, als

Ausgangsstoff für die Biosynthese von 2-Phenylethanol dienen. Die Ergebnisse der

biochemischen Charakterisierung der NIT1 aus P. trichocarpa lassen vermuten, dass

die Umsetzung von Benzylcyanid zu Phenylessigsäure in der Pflanze über NIT1

katalysiert werden kann. Damit ist es wahrscheinlich, dass NIT1 in der Pappel eine

zentrale Rolle für die induzierte Biosynthese von 2-Phenlyethanol und anderen

aromatischen Duftstoffen, wie Phenylacetaldehyd und 2-Phenylethylacetat einnimmt.

Dabei ist die Induzierbarkeit der Biosynthese von 2-Phenylethanol jedoch nicht auf

eine Genregulation von Nit1 zurückzuführen (Abb. 13). Irmisch und Kollegen

beschrieben, dass nach Herbivorie die Expression von CYP79D6v3 hochreguliert ist

und dass Phenylacetaldoxim infolgedessen in der Pappel akkumuliert (Irmisch et al.,

2013). So kann vermutet werden, dass die Induktion der Genexpression von

CYP79D6v3 ausreicht, um die erhöhte Verfügbarkeit des Substrates Benzylcyanid

nach Herbivorie zu gewährleisten. Dadurch könnte die Biosynthese von 2-

Phenylethanol in P. trichocarpa reguliert werden.

Diskussion

50

4.4. NIT1 und NIT3 scheinen eine Rolle im Blausäuremetabolismus in P.

trichocarpa zu spielen

Aus der Literatur ist bekannt, dass Homologe der NIT4 von A. thaliana ubiquitär im

Reich der Pflanzen vorkommen (Jenrich et al., 2007). Es wurde gezeigt, dass NIT4

eine Rolle in der Detoxifizierung von β-Cyano-L-alanin in A. thaliana spielt

(Piotrowski et al., 2001). In Pflanzen entsteht β-Cyano-L-alanin durch die

Übertragung von Blausäure, einem Nebenprodukt der Ethylen-Biosynthese, auf L-

Cystein. Da NIT1 der Pappel ein Homologes zu NIT4 von A. thaliana darstellt (Abb.

11) wurde auch β-Cyano-L-alanin als Substrat getestet. Heterolog exprimierte NIT1

von P. trichocarpa zeigte mit 0,1 mM eine höhere Affinität für β-Cyano-L-alanin im

Vergleich zu der nahe verwandten NIT4 aus A. thaliana, die Km-Werte von 0,7 mM

für β-Cyano-L-alanin aufweist (Piotrowski et al., 2001). Eine Umsetzung dieses

Substrates durch NIT1 resultierte in der Entstehung von Asparagin einerseits und

Asparaginsäure und Ammoniak andererseits. Diese Charakteristiken stimmten

überein mit Erkenntnissen von Piotrowski und Mitarbeitern (Piotrowski und Volmer,

2006), wonach die Nitrilasen der blauen Lupine (Lupinus angustifolius) eine Nitrilase-

und eine Nitril-Hydratase-Aktivität aufweisen. Die Maximalgeschwindigkeit für die

Umsetzung von β-Cyano-L-alanin zu Asparagin ist wesentlich geringer als die

Maximalgeschwindigkeit von NIT1 für die Umsetzung zu Asparaginsäure. Dies

spricht dafür, dass Asparaginsäure möglicherweise das Hauptprodukt der

Umsetzung von β-Cyano-L-alanin in P. trichocarpa ist. Im Gegensatz dazu setzt die

phylogenetisch mit NIT1 aus P. trichocarpa nah verwandte NIT4 aus A. thaliana β-

Cyano-L-alanin zu Asparagin und Asparaginsäure um, wobei Asparagin das

Hauptprodukt zu sein scheint (Piotrowski et al., 2001). Die katalytische Effizienz von

NIT1 für die Umsetzung von β-Cyano-L-alanin ist um ein Vielfaches höher als die

katalytische Effizienz von NIT1 für die Umsetzung von Benzylcyanid. Auch NIT3 aus

P. trichocarpa ist in der Lage, β-Cyano-L-alanin zu Asparagin und Asparaginsäure

umzusetzen (Tabelle 10). Dabei produziert NIT3 überwiegend Asparaginsäure aus β-

Cyano-L-alanin. Die zugrundeliegenden Mechanismen dieser dualen

Produktgeneration sind nicht geklärt, es wurde jedoch vermutet, dass das Amid

durch einen unvollständigen Reaktionszyklus der Nitrilase entlassen werden kann

(Hook und Robinson, 1964). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NIT1 aus P.

trichocarpa 2-Phenylacetamid nicht als Intermediat entlässt, wenn Benzylcyanid als

Substrat angeboten wird (Abb. 12). Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass NIT1

Diskussion

51

Nitrilase-Aktivität und keine Nitril-Hydratase-Aktivität für Aromatische Substrate wie

Benzylcyanid aufweist. Da NIT1 und NIT3 jeweils Nitrilase- und Nitril-Hydratase-

Aktivität für β-Cyano-L-alanin zeigten, kann darauf geschlossen werden, dass beide

Enzyme sowohl Nitrilase- als auch Nitril-Hydratase-Aktivität für kleinere aliphatische

Moleküle aufweisen könnten. Über die physiologische Funktion der Produktion

zweier Produkte nach der Hydrolyse von β-Cyano-L-alanin kann spekuliert werden,

dass das Enzym in vitro ungenügend stabilisiert wird und in vivo durch Dimerisierung

mit einem anderen Protein eine spezifischere Aktivität aufweisen könnte. Jenrich und

Kollegen entdeckten 2007, dass Nitrilasen aus S. bicolor durch die Bildung von

Heterodimeren eine Aktivität für β-Cyano-L-alanin zeigten, wobei heterolog-

exprimierte Monomere β-Cyano-L-alanin nicht umsetzten (Jenrich et al., 2007). Alle

hier untersuchten heterolog-exprimierten Enzyme wurden als Monomer bzw.

Homodimer auf enzymatische Aktivität getestet. Daher kann durchaus vermutet

werden, dass die Nitrilasen aus P. trichocarpa Heterodimere bilden könnten. Die

Bildung von Heteromeren könnte im Vergleich zu Monomeren eine höhere Affinität

für Substrate wie β-Cyano-L-alanin aufweisen, wodurch die Detoxifizierung

entsprechend reguliert werden könnte.

4.5. Die potentielle Bedeutung von Nit2 und Nit3

Interessanterweise zeigten die Gene Nit2 und Nit3 ein im Vergleich zu Nit1

verändertes Expressionsmuster nach Herbivorie. Die Expression von Nit2 und Nit3

war in apikalen Blättern von P. trichocarpa nach Herbivorie herunterreguliert

(Abb.13). In basalen Blättern hingegen zeigte sich nach Herbivorie keine signifikante

Veränderung der Genexpression im Vergleich zu unbefallenen Kontrollblättern. Wie

bereits oben diskutiert, spielt NIT3 vermutlich eine Rolle bei der Entgiftung von

Blausäure, indem sie β-Cyano-L-alanin zu Asparagin und Asparaginsäure umsetzt.

Da in apikalen Blättern von N. tabacum mehr Ethylen produziert (Aharoni et al.,

1979). Auf P. trichocarpa übertragen, könnte die erhöhte Produktion von Ethylen in

apikalen Blättern zu einer resultierenden gesteigerten Entstehung von Blausäure

bedeuten, die weiter zu β-Cyano-L-alanin entgiftet werden kann. Apikale Blätter

stellen einen äußerst wertvollen Teil der Pflanze dar (Stamp, 2003) und

unterscheiden sich metabolisch von basalen Blättern. So könnte die hohe

Trankriptakkumulation von Nit2 und Nit3 in apikalen Blättern erklären, dass die

effizientere Detoxifizierung das „wertvolle“ Blatt schützen sollte. Kahl und Kollegen

Diskussion

52

zeigten, dass Tabak-Pflanzen (Nicotiana attenuata) die von Raupen des

Tabakschwärmers (Manduca sexta) befallen waren, eine stark erhöhte Ethylen-

Emission aufwiesen (Kahl et al., 2000). Nach Herbivorie könnte die Pappel ebenfalls

verstärkt Ethylen bilden und die dabei entstehende Blausäure würde zu β -Cyano-L-

alanin umgewandelt werden. Eine verminderte Expression von Nit3 könnte dabei zu

einer weiteren Steigerung der Akkumulation von β -Cyano-L-alanin führen. β -Cyano-

L-alanin ist bereits als toxische Verbindung beschrieben wurden und die verringerte

Nit3-Genexpression könnte daher eine aktive Schutzreaktion der Pflanze darstellen

(Ressler et al., 1961).

4.6. NIT1 könnte im Metabolismus von Auxinen eine Rolle spielen

Eine weitere putative Funktion der Nitrilasen in P. trichocarpa könnte die Biosynthese

von Auxinen, wie Indol-3-essigsäure und Phenylessigsäure, sein. Eine katalytische

Aktivität von Nitrilasen für Indol-3-acetonitril ist bereits seit 1964 bekannt (Mahadevan

und Thimann, 1964). NIT1 aus P. trichocarpa wurde daher auf die Aktivität für Indol-

3-acetonitril getestet. Enzymassays zeigten, dass die NIT1 die Umsetzung von Indol-

3-acetonitril zu Indol-3-essigsäure katalysiert (Abb. 12), jedoch ließ sich diese

Umsetzung von Indol-3-acetonitril zu Indol-3-essigsäure nicht konsistent

reproduzieren, weshalb keine kinetische Charakterisierung für Indol-3-acetonitril

erfolgte.

Das Hauptprodukt von NIT1, Phenylessigsäure, wirkt ebenfalls als potentes Auxin

(Husain et al., 1999) und könnte eine Rolle in der Verteidigung der Pflanze spielen.

Phenylessigsäure dient zusätzlich als Intermediat volatiler organischer Stoffe wie

Phenylacetaldehyd, 2-Phenylethanol und 2-Phenylethylacetat (diese Arbeit; Abb. 8).

Diese Stoffe werden nach Herbivorie verstärkt emittiert (Irmisch et al., 2013). Nach

Herbivorie erhöht sich auch die Konzentration von Auxinen wie Indol-3-essigsäure in

A. thaliana (Celenza et al., 2005) und auch in der Pappel (Persönliche

Kommunikation Sandra Irmisch). Liegen Auxine in der Pflanze in hohen

Konzentrationen vor, so stimulieren sie die Biosynthese von Ethylen (Abeles und

Rubinstein, 1964). Im Fall der Phenylessigsäure, die eng verbunden ist mit der

Biosynthese von volatilen organischen Stoffen, könnte dies einen Signal-

verstärkenden Mechanismus für die Pflanzenabwehr darstellen. Denn erhöht sich die

Biosyntheserate von Ethylen, so steigt auch die Produktion der Blausäure, als

toxisches Nebenprodukt der Ethylen-Biosynthese, die wiederum eine abweisende

Diskussion

53

Wirkung auf Fraßfeinde besitzt (Nahrstedt, 1989) und zusätzlich verstärkt werden

könnte durch die Herrunterregulation der β-Cyano-L-alanin-Synthase. Zudem wurde

beschrieben, dass Auxine verantwortlich sein könnten für die Zelldifferenzierung und

Regeneration des Gefäßsystems, wodurch das Wachstum stimuliert werden könnte,

um Verluste auszugleichen (Machado et al., 20013). So wäre die NIT1 in der Lage

eine essentielle Funktion als Phytohormon-produzierendes Enzym auszuüben und

demnach die Physiologie zwischen Verteidigung oder Wachstum regulieren zu

können.

Ausblick

54

Ausblick

Ein möglicher Biosyntheseweg von 2-Phenylethanol konnte im Zuge dieser Arbeit

aufgeklärt werden. Die Biosynthese erfolgt über Phenylessigsäure als zentrales

Intermediat. Es zeigte sich jedoch, dass auch eine Fütterung mit 2-Phenylethylamin

zu einer erhöhten Emission von 2-Phenylethanol führte. Daher soll in zukünftigen

Experimenten untersucht werden, ob die Umwandlung von 2-Phenylethylamin zu

Phenylacetaldehyd stattfinden kann und damit einen zweiten Biosyntheseweg für 2-

Phenylethanol in P. trichocarpa darstellt.

Phenylessigsäure stellt nicht nur ein Intermediat in der Duftstoffbiosynthese dar,

sondern es fungiert, zu den Auxinen gehörend, auch als Phytohormon in der Pflanze.

Es bleibt daher zu untersuchen, welche Funktionen die veränderte Konzentration von

Phenylessigsäure haben könnte. Da bekannt ist, dass eine erhöhte Konzentration an

Auxinen die Biosynthese von Ethylen steigert, könnten neue Ergebnisse gewonnen

werden, indem die Ethylen-Produktion unter Normalbedingungen und nach Induktion

durch Herbivorie getestet wird.

Für diverse Nitrilasen im Reich der Pflanzen wurde eine Bildung von aktiven Homo-

und Heterodimeren beschrieben. Hier wurde bisher nur die Aktivität von Mono- oder

Homomeren untersucht. Um zu erfahren, ob auch die Nitrilasen der Pappel Homo-

oder Heterodimere bilden, müssen alle identifizierten Nitrilasen heterolog exprimiert,

charakterisiert und auf die Bildung von Dimeren miteinander untersucht werden.

Die TCP Transkriptionsfaktordomäne von Nit2 und Nit3 stellt einen Ansatzpunkt für

eine Genregulation dar. Diese Domäne wurde in Verbindung gebracht mit der

Regulation der Morphogenese von Blättern. Außerdem können miRNA´s auf mRNA-

Ebene mit der TCP-Region interferieren und so den Abbau der mRNA einzuleiten.

Für die Verifizierung der in vitro erlangten Ergebnisse sollten die Gene der

charakterisierten Enzyme in vivo ausgeschaltet werden. Ein bereits gut etabliertes

System dafür stellt das Stilllegen von Genen in P. canescens dar.

Danksagung

55

Danksagung

Ich möchte allen Danken, die in jeglicher Weise bei der Entstehung dieser Arbeit Teil

hatten. Besonderer Dank gebührt Dr. Tobias G. Köllner und Sandra Irmisch für die

Bereitstellung des Themas und für die kompetente und freundliche Betreuung. Dabei

gilt Ihnen besonderer Dank für die unerschütterliche Geduld und Zielstrebigkeit.

Ich danke vielmals Prof. Jonathan Gershenzon für die Möglichkeit, die Masterarbeit

in der Abteilung „Biochemie“ des „Max-Planck-Instituts für Chemische Ökologie“ zu

absolvieren.

Mein herzlicher Dank ist an alle Mitglieder der Abteilung für „Biochemie“ gerichtet, für

stets anregende Diskussionen, sowie die freundschaftliche Aufnahme in die Gruppe

und für die uneingeschränkte Hilfsbereitschaft. Besonderer Dank gilt Dr. Christelle

Robert, Dr. Daniel Giddings Vassão, Vinzenz Handrick und Philipp Zeltner für

hilfreiche Diskussionen. Außerdem möchte ich mich für die vielen Lacher bei meinen

„office mates“ und meinen Laborkollegen bedanken.

Zudem danke ich Andreas Böckler für die geduldige Zusammenarbeit und die große

Hilfe bei der Synthese des Phenyl-d5-acetaldoxims.

Bei meinen Gutachtern, Dr. Tobias G. Köllner, Prof. Jonathan Gershenzon und Prof.

Berit Jungnickel möchte ich mich für das Erstellen eines Gutachtens bedanken.

Außerdem danke ich meinen Eltern und meiner Schwester von ganzem Herzen für

die bedingungslose Unterstützung während des gesamten Studiums.

Ich danke Hartmut Bocker für die Hilfe beim Formatieren des Manuskriptes.

Besonderer Dank gebührt Hartmut Bocker, Enrico Fischer, Konrad Bogsch, Benjamin

Kürth und Agnieszka Litomska auf die ich in allen Lebenslagen stets bauen konnte

und ohne die das Studium weniger erlebenswert gewesen wäre.

Vielen Dank,

Jan Günther

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Anhang

61

Anhang

Tabelle 12: Sequenzen der verwendeten Primer. Gezeigt ist die Benennung der Primer und die zugehörige Sequenz (5´-3´). Für die Erstellung der Primer wurde mit dem Genom Version 3.0 gearbeitet (www.Phytozome.net) oder die Vektorspezifischen Primer des Herstellers verwendet (Invitrogen). Die Schmelztemperatur (Tm) in °C ist angegeben. Zur besseren Zuordnung wurden die Primerpaare fortlaufend nummeriert.

Name Sequenz 5'-3' Gen (P.trichocarpa

V3.0)/ Vektor Tm

[°C] Nr.

Pt-NIT-4-fwd ATGCAAGCAACTGTACCAGTTTCATCATC Potri.004G199600.1 59,4 1

Pt-NIT-4-rev CTATTTACGAGAGGCTTCAGTTTTTGCTG Potri.004G199600.1 57,9 1

Pt-NIT-6-fwd2 ATGGAGGAATCAACAAAAAATGCGG Potri.006G207700.1 56,7 2

Pt-NIT-6-rev3 TCACCTGACATGGTTCTAATTCCGCC Potri.006G207700.1 60,6 2

Pt-NIT-16-fwd2 ATGGAGGAAGAATTCGCAAA Potri.016G074200.1 52,2 3

Pt-NIT-16-rev2 TCACCCTGAAAGCTCTTCAAGA Potri.016G074200.1 56,0 3

Pt-NIT4-N.ben-fwd GGCTTAAUATGCAAGCAACT Potri.004G199600.1 51 4

Pt-NIT4-N.ben-rev GGTTTAAUCTATTTACGAGA Potri.004G199600.1 44,2 4

Pt-NIT-4-pET101-fwd

CACCATGCAAGCAACTGTACCAG Potri.004G199600.1 58,7

5

Pt-NIT-4-pET101-rev

CTCTTTACGAGAGGCTTCAGTTTTTGCTG Potri.004G199600.1 59,5

5

Pt-NIT-6-pET101-rev3

TCCCCCTGACATGGTTCTAATTCCGCCA Potri.006G207700.1 64,7

6

Pt-NIT-6-pET101-fwd2

CACCATGGAGGAATCAACAAAAAATGCG Potri.006G207700.1 59,1

6

Pt-NIT-16-pET101-fwd2

CACCATGGAGGAAGAATTCGC Potri.016G074200.1 56,1

7

Pt-NIT-16-pET101-rev

TCGCCCTGAAAGCTCTTCAAGAGCTTTAG Potri.016G074200.1 61,8

7

M13 fwd GTAAAACGACGGCCAG Zero Blunt TOPO 51,9 8

M13 rev CAGGAAACAGCTATGAC Zero Blunt TOPO 50,1 8

T7 fwd TAATACGACTCACTATAGGG pET101/D-TOPO 51,9 9

T7rev TAGTTATTGCTCAGCGGTGG pET101/D-TOPO 56,0 9

Tabelle 13: Primer, die für die qRT-PCR verwendet wurden. Gezeigt ist die Benennung der Primer und die zugehörige Sequenz (5´-3´). Für die Erstellung der Primer wurde mit dem Genom Version 3.0 gearbeitet (www.Phytozome.net) verwendet. Die Fragmentgröße die durch die Reaktion entstehen sollte ist in bp angegeben. Die Schmelztemperatur (Tm) in °C ist angegeben.

Name Sequenz 5'-3' Fragment-Größe [bp]

Gen (P.tri. V3.0) Tm

[°C]

NIT4fwd-1 CTGCCACTCTAGATAAGGCTGAGA 204 Potri.004G199600.1 57,6

NIT4rev-2 CAACTTCTGGACCAGGAACATCAA 204 Potri.004G199600.1 57,1

NIT6fwd-1 CGGCAACATTGGATAAAGCAGAGA 201 Potri.006G207700.1 57,6

NIT6rev-2 GTCTCTCAACTTCAGGACCAGGCA 201 Potri.006G207700.1 60,5

NIT16fwd-1 TTGATGTGCCTGGTCCTGAAGTTG 372 Potri.016G074200.1 59,5

NIT16rev-2 TGTGGGTCATTGATGCTCTCCA 372 Potri.016G074200.1 58,5

Anhang

62

Abbildung 17: Reaktionsoptima von NIT1. NIT1 wurde heterolog exprimiert und mit Substrat versetzt. Gezeigt ist die Umsetzung von BC zu PAA durch NIT1 unter variierenden (A) pH-Wert, (B) eingesetzen Konzentrationen an BC und (C) Temperatur. Als Kontrolle wurde die Produktgeneration des Substrates unter variierendem (A) pH-Wert und (C) unterschiedlicher Temperatur getestet. Das Produkt wurde über LC-MS/MS analysiert. PAA = Phenylessigsäure, BC = Benzylcyanid.

Abbildung 18: Standardkurve von BSA für die Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Bradford-Methode. Die Absorbtion im UV-Vis-Bereich von 595 nm von BSA-Lösung unterschiedlicher Konzentrationen wurde gemessen. BSA = „bovine serum albumin“ - Rinderserumalbumin

Anhang

63

Abbildung 19: Substrat-Produkt-Kurven zur Bestimmung der enzymkinetischen Konstanten. Gezeigt sind die Substrat-Produkt-Kurven von NIT1 für die Umsetzung von (B) Benzylcyanid zu Phenylessigsäure, (C) β-Cyano-L-alanin zu Asparaginsäure und (D) β-Cyano-L-alanin zu Asparagin und die Substrat-Produkt-Kurven von NIT3 zur Umsetzung von (E) β-Cyano-L-alanin zu Asparaginsäure und (F) β-Cyano-L-alanin zu Asparagin. Zur Quantifizierung der entstehenden Phenylessigsäure wurde eine Standardkurve mit definierten Konzentrationen an Phenylessigsäure erstellt, die Ergebnisse der linearen Regression sind gezeigt (A). Die Werte in B-F wurden durch hyperbole Regression angepasst.

Anhang

64

DNA-Sequenzen

Nit1, Populus trichocarpa, kodierende Sequenz nach Phytozome

ATGGAGGAAGAATTCGCAAAAAATGCAGAGGCTAAGCAAGTAAAGAAGCGAGGACCCCGTCCTCTC

ATCGTAGCACAGTCACAGGCTAAAAAGGTTCGTATCCGTATGCCCGCCATCTGTAGCCCTGCCATTTA

CCGCATCAAAGATGAACTAGGTCTCGGCTCCTGCGATGAAGCCATTCATTGGCTCGTCCGCCATGTCC

GACCCGATCTTATTCCCGCCCCCGAGACACCCACTAAAACTAAATCGTCCAAGACTGGCCCCATTCCC

AAAACGGGCTCCGTTGATCATGACTCGGTTCCAAAACCCGCTTGCATGGCGAGCCCAGATGGTGATA

TGCCTGCTTATGATTTTCTCCCAACCGCAGGTGGTGTTCCGGCAGCGAGGTCTCCGGTGAAGGCAAC

GGTGGTTCAGGCATCGACAGTGTTTTTTGACACTCCGGCAACATTGGAAAAAGCAGAAAGATTGATT

GCTGGTGCGGCTTCATATGGGTCACAATTACTTGTGTTTCCAGAGGCATTTGTAGGTGGTTATCCTAC

GTGTGTGAAGCTTGATGCTACAAATTCACCTGAAACAGATGGTGATTTGCAGAAGTACTATGCCTCA

GCTATTGATGTGCCTGGTCCTGAAGTTGACAGACTTGCAAAATTTGCTGGTAAATATAAAGTCCACTT

AGTAATGGGAGTGGTGGAGAGAGCTGGATGTTATCTCTATAGTACAATGCTGTTCTTTAATTCCCTG

GGAAAGTGTCTTGGACAGCACCGCAAGCTAATACAAACGGCATCAGAAAGTGCACTGTGGCGTTCT

GGAGAGAAATCCACACTGCCAACATATGAGACCTCAATTGGAAAAATTGGTGGCCTCATCTGTTGGG

ACAATAGATTACCACTTCTGAGAACAGAGTTGTATGATAAAGGTGTGGAAATATATTGTGCACCTAC

AGCTGATGCAGGAGAAATATGGAGAGCATCAATGACCCACATTGCCCTAGAAGGTAGTTGCTTTGTT

CTTTCTGCAAATCAATTTTGTAGGAGGAGAGATTATCCTTTGCCACCTGGGAATATAAATGGTGATGC

ATCCTTAGATGACATCACATGCGCTGGAGGTAGTGTTATCATTTCACCATCAGGGACCATCCTGGCTG

GTCCTGATTACCAAGGAGAATGCCTTATCTCAGCTGATCTAGACCTTGGACATATCATTCTAGCAAAG

ACACAATATGGCGGAATTGAGAGTGGTGTCGATAAGAACCATGTCAGTGTGGCTGCAAACGGATCA

GAACCCAGTTTGTTTGCAGCAGAAATGACAACTAAAGCTCTTGAAGAGCTTTCAGGGTGA


ATGGAGGAATCAACAAAAAATGCGGAGGCTAAGAAAGAAAAGAAGAGAGGACATCGTCCTCTCATC

GTAGCACAATCACCGGCCGAAAAGGCCCACATCATGGTCCCTGCCATGTGTAGCACTGCCATTTACC

GCCTCAGAGGTGAACTGGGTCTCGGCTCCTGCGGTGCAGCCATTCACTGGCTCGTCCACCATGCCCG

GCCTGATCTCATTCCCGCCCCCGAACCACCCACTAAGACTAAATCGGCTAAGACTTGCCCCAGTCGCA

AAACGGACTCCGTTGATCATGACCCAATTCCAAAACCCGCTTGCATGGCGAGGGCAGATGGTGATAC

GCCTGTTTCTGATTTTCCGGCTACCGCCCGGGCAGCGAGGTCTCCGGTGAGAGCCACGGTGGTGCAG

GCTTCGACGGTGGTTTTTGACACTCCGGCAACATTGGATAAAGCAGAGAGATTGATTGCTGGTGCAG

CAGCATATGGGTCACAATTAGTTGTGTTTCCAGAAGCTTTTGTTGGTGGTTATCCTAGGAGTGTGAG

GTTTGATGCTACAAATCCAACTGAAGGAGATGATGGTTTGCAGAGGTACTATGCCTCAGCTATTGAT

GTGCCTGGTCCTGAAGTTGAGAGACTTGCGAAAATTGCTGGTAAATATAAAGTACACTTAGTAATGG

GAGTGGTGGAGAGAGCTGGATTTTATCTCTACAGTACAATGCTGTTCTTTGATTCCCAGGGACAGCA

TCTCGGACAGCATCGCAAGATAACACTAGTGGCATCAGAGAGTGCAGTGTGGAATTCTGGAGGGAA

ATCAACATTGCCAATATATGAGACCTCGATTGGGAAAATTGGTGGCCTTACCTGTTGGGACAATAAA

Anhang

65

TGGCCACTTCTAAGAACTGAGTTATATGATAAAGGTGTAGAAATATATTGTGCGCCTACGGCTGATG

CAGGGGAAATATGGAAAGCATCCATGATCCATATTGCCCTCGAAGGTGGTTGCTTTGTTCTTTCTGCA

AATCAATTTTGCAGGAGGAGAGATTATCCATTTCCACCTGGAGATTCAAATGGTGATGCATCATTAG

ATGCCATCACATGCGCTGGAGGTAGTGTTATCATTTCACCATCAGGGACCATCTTGGCTGGTCCTAGT

TACCATGGAGAATGTCTTATCTCAGCTGATCTAGACCTTGGAGATATCATTCTAGCAAAGACAAAATA

TGGCGGAATTAGAACCATGTCAGGGTGA


ATGGAGGAAGAATTCGCAAAAAATGCAGAGGCTAAGCAAGTAAAGAAGCGAGGACCCCGTCCTCTC

ATCGTAGCACAGTCACAGGCTAAAAAGGTTCGTATCCGTATGCCCGCCATCTGTAGCCCTGCCATTTA

CCGCATCAAAGATGAACTAGGTCTCGGCTCCTGCGATGAAGCCATTCATTGGCTCGTCCGCCATGTCC

GACCCGATCTTATTCCCGCCCCCGAGACACCCACTAAAACTAAATCGTCCAAGACTGGCCCCATTCCC

AAAACGGGCTCCGTTGATCATGACTCGGTTCCAAAACCCGCTTGCATGGCGAGCCCAGATGGTGATA

TGCCTGCTTATGATTTTCTCCCAACCGCAGGTGGTGTTCCGGCAGCGAGGTCTCCGGTGAAGGCAAC

GGTGGTTCAGGCATCGACAGTGTTTTTTGACACTCCGGCAACATTGGAAAAAGCAGAAAGATTGATT

GCTGGTGCGGCTTCATATGGGTCACAATTACTTGTGTTTCCAGAGGCATTTGTAGGTGGTTATCCTAC

GTGTGTGAAGCTTGATGCTACAAATTCACCTGAAACAGATGGTGATTTGCAGAAGTACTATGCCTCA

GCTATTGATGTGCCTGGTCCTGAAGTTGACAGACTTGCAAAATTTGCTGGTAAATATAAAGTCCACTT

AGTAATGGGAGTGGTGGAGAGAGCTGGATGTTATCTCTATAGTACAATGCTGTTCTTTAATTCCCTG

GGAAAGTGTCTTGGACAGCACCGCAAGCTAATACAAACGGCATCAGAAAGTGCACTGTGGCGTTCT

GGAGAGAAATCCACACTGCCAACATATGAGACCTCAATTGGAAAAATTGGTGGCCTCATCTGTTGGG

ACAATAGATTACCACTTCTGAGAACAGAGTTGTATGATAAAGGTGTGGAAATATATTGTGCACCTAC

AGCTGATGCAGGAGAAATATGGAGAGCATCAATGACCCACATTGCCCTAGAAGGTAGTTGCTTTGTT

CTTTCTGCAAATCAATTTTGTAGGAGGAGAGATTATCCTTTGCCACCTGGGAATATAAATGGTGATGC

ATCCTTAGATGACATCACATGCGCTGGAGGTAGTGTTATCATTTCACCATCAGGGACCATCCTGGCTG

GTCCTGATTACCAAGGAGAATGCCTTATCTCAGCTGATCTAGACCTTGGACATATCATTCTAGCAAAG

ACACAATATGGCGGAATTGAGAGTGGTGTCGATAAGAACCATGTCAGTGTGGCTGCAAACGGATCA

GAACCCAGTTTGTTTGCAGCAGAAATGACAACTAAAGCTCTTGAAGAGCTTTCAGGGTGA

Die Rolle von Nitrilasen in der Herbivor-induzierten ... · β-Cyano-L-alanin, welches als...

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