V1: Methoden der Proteinbestimmung

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Methodik:

• Proteinkonzentrationsbestimmung mittels Bradford sowie der Korrekturverfahren nach Warburg & Christian sowie Kalb & Bernlohr

• UV-Spektren von Protein- und Nukleinsäurelösungen

Photometrie (altgr. φῶς phos ‚Licht‘ und μετρεῖν metrein ‚messen‘) Messverfahren im Wellenlängenbereich des sichtbaren Lichtes mit Hilfe eines Photometers (Wikipedia)

Spektroskopie (klassisch) (lat. spectrum ‚Erscheinung‘ und altgr. σκοπεύω‚ „sehen“) Die Untersuchung der Lichtemission bzw. -absorption von Molekülen und Atomen mit Hilfe von Gitter- und Prismenspektrometern.

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Anwendungsbereiche der Photometrie

• Direkte Konzentrationsbestimmung von Chromophoren(Proteine, Nukleinsäuren, Coenzyme ...)

Versuche 1 und 4• Indirekte Konzentrationsbestimmung nach Bindung farbiger Liganden:

Eichkurve notwendig (Proteinbestimmung nach Bradford)Versuch 1

• Abschätzung der Partikeldichte einer Suspension: Eichkurve bzw. Erfahrungswert notwendig (Bakteriendichte)

Versuch 6• Enzymkinetik (farbiges oder chromogenes Substrat, evtl. Hilfsreaktion)

Versuche 2 und 3Nutzen der quantitativen Proteinbestimmung:

• Beurteilung von Zellaufschlüssen• Beurteilung von Proteinreinigungsverfahren• Bestimmung von Enzymaktivitäten

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Aufbau eines (Spektro)-Photometers

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Proteinbestimmungsmethoden

• Trübungsmessungen (z.B. optische Dichte 600nm)

• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay

• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit

• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)

• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)

Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse

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Proteinbestimmungsmethoden

• Trübungsmessungen

• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay

• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit

• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)

• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)

Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse

BCA assay – Pierce Chemical Company

The bicinchoninic acid (BCA) assay procedure. Addition of copper (II) ions to a protein solution in an alkaline medium reduces the copper (II) ions to copper (I). BCA added to the solution chelates copper (I) in a 2:1 stoichiometry. The BCA-Cu+ complex produces a strong purple color.

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Proteinbestimmungsmethoden

• Trübungsmessungen

• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay

• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit

• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)

• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)

Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse

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Proteinbestimmung nach Bradford

Spektrum des Protein-Farbstoff-Komplexes (595 nm)

Farbstoff allein (465 nm)

Bindung an positiv geladeneSeitenketten

Struktur des FarbstoffsCoomassie Brilliant Blue G-250

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Proteinkonzentration über Komplexbildung

Komplexbildung bei Farbreaktionen• Spezifität und Nachweisempfindlichkeit können durch Komplexbildung

und/oder Farbstoffbindung erhöht werden • Darstellung: Extinktion gegen Konzentration (M oder mg/ml)• Messung nicht über den gesamten Konzentrationsbereich linear: Eichkurve notwendig !• Als Eichprotein wird meist Rinderserumalbumin (bovine serum albumin, BSA) verwendet

E

c

linearer Bereich

SättigungKomplexzerfall

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Proteinbestimmungsmethoden

• Trübungsmessungen

• Biuret-Methode (Farbreaktion mit Peptidbindung)Nachteil: großer Substanzbedarf see BCA assay

• Lowry-Methode (Reaktivität einzelner Aminosäureseitenketten, Tyr, Trp, Cys) Nachteil: große Störanfälligkeit

• Bradford-Methode (Ligandenbindungsvermögen)

• UV-Messungen (Proteinnachweis bei 230 und 280 nm: Lambert-Beer‘sches Gesetz, Korrekturverfahren)

Vor- und Nachteile: Zeitaufwand, Empfindlichkeit, Störfaktoren etc.Wahl der Methode abhängig von Zielstellung / Genauigkeit der Analyse

Beer-Lambert Gesetz

II0

Sample, conc c

l

𝐼 𝐼𝐼

∆𝐼𝐼

I is the light transmittedby the strip l

∆𝐼𝐼 · 𝑐 · ∆𝑙

The amount of light transmitted depends

on the sample lengthand concentrationconstant

of proportionality

𝑑𝐼𝐼 𝑐 𝑑𝑙 ln

𝐼𝐼 𝑐𝑙

log10𝐼𝐼 𝜀𝑐𝑙

Estinktionskoeffizient

From http://www.iorodeo.com/content/determining-molar-extinction-coefficient-erythrosin-b

log10𝐼𝐼 𝜀 𝑐 𝑙

E 𝜀 𝑐 𝑙

Extinktion

spezifischeExtinktionskoeffizient

Die gängige Einheit des Extinktionskoeffizienten ist L·mol−1·cm−1.

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UV-Messungen zur Proteinbestimmung

E = -log10 (I / I0) = ε ꞏ c ꞏ d

Extinktionsmessung bei 280 nm zur Quantifizierung von Proteinen• Aromatische Verbindungen (Aminosäuren, Nukleotide)

absorbieren wegen der leichten Anregbarkeit der -Elektronensysteme im UV-Bereich ( = 250-280 nm)

• In Proteinen wird die Absorption überwiegend durch Tryptophan und Tyrosin bestimmt; dafür wird eine Messung bei 280 nmdurchgeführt

Nukleinsäuren

Aminosäuren

Aminosäuren

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Korrekturverfahren zur Proteinbestimmung

Vermeidung von Fehlmessungen bei Rohextrakten• Problem: Nukleinsäuren, Nukleotide und Coenzyme absorbieren

im selben Spektralbereich wie die aromatischen Aminosäuren

• Korrekturmöglichkeit: Rechnerische Berücksichtigung eines möglichen Nukleinsäurebeitrags (E260), oder Einbeziehung der Absorption der Peptidbindung zur Quantifizierung (E230)

• Warburg & Christian: cProtein (mg/ml) = 1,55•E280 – 0,76•E260

• Kalb & Bernlohr: cProtein (µg/ ml) = 183•E230 – 75,8•E260

260 nm

280 nm

230 nm

Protein

DNA

Molekularbiologie 06/15

DNA Konzentrationsbestimmung

DNA Konzentration: -> E260 (möglich um E320 zu korrigieren (Trübung der Lösung)

-> dabei entspricht E260 von 1.0 = 50µg/ml pure dsDNA.

-> Konzentration (µg/ml) = (E260) × dilution factor × 50µg/ml

DNA Reinheit wird bestimmt durch (A260/A280) = (E260) ÷ (E280)

-> saubere DNA hat ein E260/E280 Verhältnis zwischen 1.7–2.0.

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Messungen am Photometer

• Messküvetten müssen absolut sauber und fettfrei sein (Fingerabdrücke!)

• Blindwert (Photometer-Nullpunkt) ist das im Versuch benutzte Verdünnungsmittel

• Messprobe und Verdünnungsmittel bzw. Farbstoffreagenz werden in einem geeigneten Reaktionsgefäß gründlich gemischt und anschließend in die Küvette pipettiert

• Glas- bzw. Quarzküvetten sind sehr empfindlich, werden nur für den jeweiligen Versuch ausgegeben und müssen nach Versuchsende sorgfältig gereinigt zurückgegeben werden.

• Nur Messbereich zwischen 0,1 und 1 ist verlässlich!

Versuch 1 - Methoden der Proteinbestimmung

1. Erstellen einer Eichkurve nach der Bradford-Methode8 Konzentrationen RSA, Eichkurve durch Millimeterpapier

Tip: GUT MISCHEN!!!!2. Proteinbestimmung anhand der Bradford-Eichkurve

ADH, Lysozym, RSA - je 3 x Note: alle nach der gleichen Reaktionszeit messen!

3. UV-Spektren ausgewählter Proteinlösungen – Bestimmung von Messung von 1:10 UND 1:20 verdünnten Lösungen + VergleichNote: Direkt in die Küvette pipettieren

Nach jedem Spektrum Name von dem File gleich merken!!!4. UV-Spektrum einer Nukleinsäurelösung

DNA Probe, Konzentration und Reinheit bestimmenDNA-Spektren mit Protein-Spektren überlagernNote: Nach jedem Spektrum Name von dem File gleich merken!!!

Um Überraschungen zu vermeiden  Gleich am Tag der Messung rechnen !!!!