Funktionelle und strukturelle Untersuchungen der · zyklisch permutierte Genome ... reversible...

Funktionelle und strukturelle Untersuchungen der

β-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4

Dissertation zur Erlangung des Grades

eines Doktors der Naturwissenschaften

der Fakultät für Biologie

der Ruhr-Universität Bochum

Angefertigt im

Lehrstuhl Biologie der Mikroorganismen/

Arbeitsgruppe Molekulare Genetik

Vorgelegt von:

Jürgen Franz Kurzeck aus Dortmund

Bochum

(2002)

Danksagung

Ganz besonderer Dank gilt meinem Betreuer Herrn Prof. Wolfgang Rüger für sein Interesse an meiner Arbeit, seine ständige Diskussionsbereitschaft und für seine nicht nur wissenschaftlichen Anregungen. Herrn Prof. Dr. W. Oettmeier danke ich für die Übernahme des Korreferats. Für die erfolgreiche und gute Zusammenarbeit möchte ich mich bedanken bei:

-Frau Dr. Solange Moréra und Herrn Laurent Lariviére (Laboratoire d’ Enzymologie et de Biochimie Structurales, Paris, Frankreich) -Herrn Dr. Martin de Kort (Leiden Institute of Chemistry, Gorlaeus Laboratories, Universität Leiden, Niederlande) -Herrn Prof. Dr. R. Schmidt und Herrn Dr. Ashisch Bhattacharya (Universität Konstanz, Fachbereich Chemie)

Herrn Prof. E. Weinhold (MPI, Dortmund) danke ich für die Bereitstellung des

Fluoreszenz-Spektrometers.

Bei den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe „Molekulare Genetik“ bedanke ich mich besonders: Bei Frau Ursula Aschke-Sonnenborn für die praktischen Tips, die Hilfsbereitschaft und auch für die Toleranz gegenüber meinem leichten Hang zur Unordnung. Frau Dr. Nicole Sommer und Herrn Dr. Reinhard Depping danke ich für die freundliche Unterstützung in vielen Bereichen, die zu einem angenehmen Arbeitsklima beitrug. Für den orthographischen Beistand während des Schreibens dieser Arbeit bedanke ich mich bei Herrn Dipl.-Umwelt-Wiss. Philip Dammann. Bei Herrn Dipl.-Biol. Alexander Prutsch bedanke ich mich besonders für die freundschaftliche Begleitung während des gesamten Studiums und auch für die hilfreichen Vorschläge bei der Durchsicht dieser Arbeit. Zudem bedanke ich mich dafür, daß er das tägliche „kulinarische“ Leid während des Mittagessens mit mir geteilt hat. Meinen Eltern Josef und Franziska Kurzeck danke ich dafür, daß sie Voraussetzungen geschaffen haben, die mein Studium und meine Dissertation ermöglichten.

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1 1.1 Der Bakteriophage T4 1

1.2 Infektionszyklus des Bakteriophagen T4 2

1.3 DNA-Modifikationen bei geradzahligen T-Phagen 5

1.3.1 Glukosylierung des 5’Hydroxymethylcytosins 5

1.3.2 Funktion der Glukosylierung 8

1.4 Die Klasse der Glykosyltransferasen 9

1.5 Die β-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4 12

1.6 Aufgabenstellung 16

2. Material und Methoden 18 2.1 Biologisches Material 18

2.1.1 Bakterienstämme 18

2.1.2 Plasmide 18

2.2 Chemikalien und Enzyme 19

2.3 Häufig verwendete Puffer und Reagenzien 19

2.4 Verwendete Oligonukleotide 19

2.5 Nährmedien 20

2.6 Geräte 21

2.7 Computer-Software 21

2.8 Arbeiten mit Bakterien 22

2.8.1 Transformation von E.coli mit Plasmid DNA 22

2.8.2 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektrotransformation 22

2.8.3 Elektrotransformation von E.coli mit Plasmid DNA 23

2.8.4 Überexpression des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten

in E. coli BL21DE3 24

2.8.5 Zellaufschluß durch Ultraschall 24

2.9 Isolierung und Analyse von DNA 25

2.9.1 Bestimmung von DNA Konzentrationen 25

2.9.2 DNA-Fällung 25

2.9.3 Enzymatische Modifikationen von DNA 25

2.9.4 Methoden zur Plasmidisolierung 26

2.9.5 Hybridisierung von Oligonukleotiden 26

2.9.6 Ortsspezifische in vitro Mutagenese 26

2.9.7 DNA-Sequenzierung 27

2.9.8 Herstellung von genomischer unglukosylierter T4*-DNA 27

2.9.9 Agarose-Gelelektrophorese von DNA 29

2.9.10 DNA-Extraktion aus Agarosegelen 29

2.10 Präparation und Analyse von Proteinen 29

2.10.1 Bestimmung von Protein-Konzentrationen 29

2.10.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese von Proteinen 30

2.10.3 Reinigung des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten 32

2.10.4 Analyse der Protein-DNA-Interaktion mittels Gel-Mobilitäts Tests 33

2.11 Aktivitätstests des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten 34

2.11.1 Kinetische Messung der BGT-Aktivität 35

2.11.2 Bestimmung der IC50-Werte verschiedener Inhibitoren 35

2.11.3 Bestimmung der Ki-Werte verschiedener Inhibitoren 35

2.11.4 Autoradiographischer Nachweis der BGT-Aktivität mit

Oligonukleotiden 36

2.11.5 Aktivitätstest mit Oligonukleotiden 36

2.11.6 Bestimmung der BGT-Aktivität mittels HPLC 37

2.12 Fluoreszenzmessungen 38

3. Ergebnisse 39

3.1 Ortsspezifische Mutagenese 39

3.2 Überexpression und Reinigung der BGT-Mutanten 40

3.2.1 Überexpression und Reinigung der BGT-Doppelmutante

Glu22Ala/Asp100Ala 43

3.3 BGT-Aktivität 44

3.3.1 Aktivität der BGT in Tris-Puffer 44

3.3.2 BGT-Aktivität in Abhängigkeit verschiedener divalenter Kationen 45

3.4 Protein-DNA-Interaktion mittels Gel-Mobilitäts Tests 47

3.5 Bestimmung der Bindekonstante KD von UDPG und UDP 49

3.6 Charakterisierung der BGT-Wildtyp- und der BGT-Mutanten-Enzyme 50

3.6.1 Kinetische Untersuchungen des BGT-Wildtyps und der

BGT-Mutanten 50

3.6.2 Bestimmung der Aktivität des BGT-Wildtyps und der BGT-

Mutanten ohne DNA-Substrat mittels HPLC 52

3.6.3 DNA-Bindung des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten 54

3.7 Untersuchung der DNA-Bindung und der BGT-Aktivität mit modifizierten

Oligonuleotiden (20bp) 55

3.7.1 Untersuchung der BGT-Aktivität mit HMC und HMU-modifizierten

Oligonukleotiden (20b) 56

3.7.2 Untersuchung der DNA-Bindung der BGT mit HMC- und HMU-

modifizierten Oligonukleotiden 58

3.7.3 Partnerbasen-abhängige Glukosylierung des 5’Hydroxymethyluracils

durch die BGT 59

3.8 Inhibitionsstudien der BGT 60

3.8.1 Hemmung der BGT durch Aryl/Hetary Phosphat- und Phosphonat-

UMP-Derivate 61

3.8.2 Hemmung der BGT durch Glykosyl-Phosphat-UMP-Derivate 63

3.8.3 Hemmung der BGT durch Thiophen-UMP-Derivate 64

4. Diskussion 66

4.1 Herstellung der BGT-Mutanten 66

4.2 Überexpression und Reinigung der BGT-Mutanten 68

4.3 BGT-Aktivität in Abhängigkeit von divalenten Metallionen 69

4.4 Bindestudien der BGT 72

4.5 Mutationsanalyse der BGT 75

4.6 Untersuchungen mit HMC- und HMU-modifizierten Oligonukleotiden 81

4.7 Partnerbasen-abhängig Glukosylierung der BGT 83

4.8 Inhibitionsstudien 87

5. Zusammenfassung 89

6. Literaturverzeichnis 91

7. Anhang 102

1

1. Einleitung

Zur Erhaltung und zur Weitergabe der genetischen Information haben sich im Laufe der

Evolution diverse biologische Systeme unterschiedlicher Komplexität entwickelt. Die

einfachsten Systeme sind bei Viren und Bakteriophagen verwirklicht. Sie zeichnen sich

dadurch aus, daß sie über keinen eigenen Stoffwechsel verfügen und zur Vermehrung

auf den Stoffwechsel der Wirtszelle angewiesen sind. Die Nutzung wirtseigener

Metaboliten und wirtskodierter Funktionen, wie z.B. den Ribosomen und der RNA-

Polymerase erfordert daher ein komplexes Regulationssystem auf allen Ebenen der

Genexpression. So werden beispielsweise bei den T-Phagen nicht nur zahlreiche

Wirtsfunktionen übernommen, sondern sie werden auch durch spezifische

Modifikationen für die Erfordernisse der eigenen Vermehrung optimiert. Aufgrund der

Allgemeingültigkeit molekularbiologischer Grundprinzipien haben sich Viren und

Bakteriophagen als Modellsysteme bewährt. Ihre einfache Handhabbarkeit, die kurzen

Generationszeiten sowie die relativ geringe Genomgröße machen sie besonders geeignet

zur Lösung biochemischer und molekularbiologischer Fragestellungen.

1.1 Der Bakteriophage T4 Der Bakteriophage T4 zählt zusammen mit den Phagen T2 und T6 zu der Gruppe der

geradzahligen T-Phagen. Durch elektronenmikroskopische Aufnahmen wurde gezeigt,

daß der T4-Phage aus einem ikosaedrischen Kopf besteht, an dem ein etwa gleich

langer Infektionsapparat („Schwanz“) sitzt, der aus einer kontraktilen Scheide mit einer

zentralen Röhre besteht (Abb.1). Die Forschung an dem Bakteriophagen T4 lieferte in

den frühen sechziger Jahren grundlegende Erkenntnisse in der Molekularbiologie. So

konnte beispielsweise von Francis Crick und seinen Mitarbeitern anhand der T4-DNA

gezeigt werden, daß der genetische Code degeneriert ist und von einem definierten

Startpunkt aus in Tripletts gelesen wird (Crick et al., 1961; Benzer et al., 1961). Es

gelang auch erstmals die Existenz von mRNA in einem T4 infiziertem E.coli System

nachzuweisen (Brenner et al., 1961). Die aus diesen Ergebnissen postulierte

Kolinearität zwischen der Nukleotidsequenz und der Proteinsequenz konnte ebenfalls

durch die T4-Forschung nachgewiesen werden (Sarabhai et al., 1964).

Einleitung

2

Abb.1: Schematische Darstellung des Bakteriophagen T4.

Die Vermehrung des Bakteriophagen T4 erfordert ein äußerst komplexes

Regulationssystem. Er verläßt sich dabei vorwiegend auf phageneigene Faktoren, die zu

einer bedarfsgerechten Modifikation des Transkriptions- und Translationssystems

führen und zudem die Degradation wirtseigener Makromoleküle wie z.B. DNA, RNA

und Proteine schon nach kurzer Zeit einleiten (Nomura et al., 1962; Cohen, 1968;

Duckworth, 1971). Die Nutzung wirtseigener Funktionen beschränkt sich auf ein

Minimum (z.B. Ribosomen, RNA-Polymerase). Zur Umsetzung dieser Strategie der

Phagenvermehrung ist ein vergleichsweise großes Genom erforderlich. Der Phage T4

besitzt ein lineares doppelsträngiges DNA-Molekül mit einer Länge von 172 kbp, von

denen 3 kbp eine terminale Redundanz aufweisen (Streisinger et al.,1964; Kutter et al.,

1994). Die Replikation erfolgt über die Ausbildung von Konkatemeren, aus denen

zyklisch permutierte Genome ausgeschnitten werden. Aus diesem Grund wird die

genetische Karte von 169 kbp Länge zirkulär dargestellt. Von den insgesamt 300

offenen Leserahmen sind bisher 150 Gene identifiziert worden, die Funktion der

restlichen 150 offenen Leserahmen ist derzeit nicht bekannt (Kutter et al., 1994).

1.2 Infektionszyklus des Bakteriophagen T4 Der Infektionszyklus beginnt mit der Infektion des Wirtsbakteriums E.coli. Die

reversible Adsorption des Phagenpartikels erfolgt über die Enden der Schwanzfäden

Einleitung

3

eines komplexen Infektionsapparates (Abb.1), die je nach Wirt unterschiedliche

Strukturen auf der Zelloberfläche erkennen können (Dawes, 1975; Mutho et al., 1978;

Furukawa et al., 1979; Yu et al., 1982). Dies erlaubt eine Suche nach einem geeigneten

Rezeptor, der eine dauerhafte Bindung an die Zelloberfläche durch die Basisplatte

ermöglicht. Durch diesen Infektionsmechanismus ist gewährleistet, daß nahezu jeder

Phagenpartikel ein Wirtsbakterium infiziert. Die Infektionseffizienz des Phagen T4 liegt

damit deutlich höher als bei anderen Phagen wie z.B. T1, T5, T7 und ΦX174 (Goldberg,

1980). An dem Zusammenbau dieses Infektionssystems sind 22 Gene beteiligt, die

insgesamt 25 kbp des gesamten Genoms beanspruchen (Edgar und Wood, 1966). Die

Injektion der DNA erfolgt durch eine Kontraktion der Scheide, die das Vorschieben

einer geschlossenen zentralen Röhre durch die Basisplatte bis zur inneren Membran

bewirkt. Die Basisplatte besitzt eine Lysozym-Aktivität, die den Durchtritt durch den

Mureinsacculus erleichtert (Kao und McClain, 1980; Mosig et al., 1989), zudem

bewirkt der Kontakt der Röhre mit dem Phosphatidylglycerin der Zellmembran die

Öffnung der Röhre zur Freisetzung der Phagen-DNA. Die zur Translokation der

Phagen-DNA benötigte Energie wird dabei durch das anliegende Membranpotential

(ab 90 mV) bereitgestellt (Labedan et al.,1980; Kalasauskaite et al., 1980; 1983).

Die frühen Gene werden kurz nach der Infektion durch die unmodifizierte

wirtseigene RNA-Polymerase transkribiert. Die Transkription dieser Gene steht unter

der Kontrolle starker Promotoren, die in der Sequenz große Ähnlichkeiten mit der E.coli

Konsensussequenz aufweisen (Wilkens, 1995). Um eine sequenzielle Genexpression zu

ermöglichen, führt die Expression der frühen Gene zu einer bedarfsgerechten

Modifikation des Transkriptionsapparates. Die erste Modifikation erfährt beispielsweise

die RNA-Polymerase durch eine ADP-Ribosylierung einer der α-Untereinheiten durch

das Alt-Protein. Dies führt zu einer Steigerung der Affinität der RNA-Polymerase zu

bestimmten frühen Promotoren (Koch, 1993; Sommer, 2000). Das Alt-Protein wird

gemeinsam mit der DNA aus dem Phagenkopf mit ca. 25-50 Kopien in die Zelle

injiziert (Goff, 1979). Eine weitere Steigerung der phagenspezifischen Transkription

wird durch den Abbau des Wirtsgenoms durch phagenkodierte Nukleasen erreicht. Die

Differenzierung zwischen Phagen- und Wirts-DNA wird durch die Verwendung von

5’-Hydroxymethylcytosin anstelle von Cytosin erreicht (1.3). Zur Beendigung der

frühen Transkription wird die Erkennung der frühen Promotoren durch das Genprodukt

AsiA gehemmt (Ouhammouch et al., 1995). Möglicherweise spielt noch eine weitere

ADP-Ribosylierung der zweiten α-Untereinheit der RNA-Polymerase durch das frühe

Einleitung

4

Genprodukt ModA eine wesentliche Rolle bei der Termination der frühen

Transkriptionsphase (Wilkens et al., 1997).

Im weiteren Verlauf der Infektion kommt es nun zur Ausbildung eines dNTP-

Synthetase Multienzymkomplexes (Übersicht Moen et al., 1988), in dem die

Ribonukleotide und Deoxyribonukleotide aus der Degradation der Wirts-RNA und

–DNA effektiv zur Synthese der Phagen-Nukleinsäure genutzt werden (Berglund, 1972;

Wovcha et al., 1976). Zur Deckung des hohen Bedarfs an Nukleotiden, werden

zusätzlich dNTP’s aus der de novo Synthese bereitgestellt. Die sich anschließende

Replikation des Phagengenoms, die bereits 5 min nach der Infektion einsetzt, wird

maßgeblich durch die Nukleotidzulieferung dieses Enzymkomplexes kontrolliert.

(Chiu et al., 1976). Durch die Assoziation des dNTP-Synthetasekomplexes mit dem

Replikationskomplex und einer größeren Anzahl von Replikationsgabeln (etwa 60) wird

eine sehr hohe DNA Syntheseleistung von ca. 1000 nt/s gewährleistet (Werner, 1968;

Wovcha, 1973; Chiu, 1982; Macdonald et al., 1984; Nossal, 1994). Im weiteren Verlauf

der Replikation kommt es zu einer umfangreichen Rekombination, die zur Ausbildung

verzweigter Konkatemere führt (Frankel, 1966). Bei der Phagenassemblierung werden

diese Konkatemere zu Einheitschromosomen nach dem Mechanismus der „Kopf-Voll-

Verpackung“ zugeschnitten (Rao et al., 1988), was u.a. zur zyklischen Permutation der

Genfolge führt.

Die parallel zur Replikation ablaufende späte Transkription und Translation

liefert 50 Phagenhüllproteine und einige Assemblierungshelferproteine. Eine zeitliche

Koordination während der späten Genexpession besteht nicht. Es werden alle

Strukturproteine des Phagenpartikels parallel synthetisiert, die sich dann zu

vollständigen Phagenpartikeln zusammenlagern (Kozloff und Zoropulos, 1981; Black et

al., 1994; Ward et al., 1970). Nach ca. 25 min endet der Infektionszyklus mit der

Freisetzung von etwa 150 Phagenpartikeln. Die Lyse der Wirtszelle erfolgt durch ein

phagenkodiertes membrandestabilisierendes Protein, das den Zugang des Lysozyms zu

dem Mureinsacculus erleichtert (Mukai et al., 1967; Josslin, 1971; Lu und Henning,

1992).

Einleitung

5

1.3 DNA-Modifikationen bei geradzahligen T-Phagen

Eine optimale Amplifikation des Phagengenoms innerhalb der Wirtszelle setzt

Schutzmechanismen voraus, die eine Degradation der Phagen-DNA durch das

wirtseigene Restriktionssystem verhindern. Dabei müssen bestimmte Modifikationen

der Phagen-DNA eine Differenzierung zwischen eigener und Wirts-DNA ermöglichen.

Bei den geradzahligen T-Phagen wird dies durch den vollständigen Ersatz des Cytosins

durch 5’ Hydroxymethylcytosin (HMC) erreicht (Wyatt und Cohen, 1952). Die

Hydroxymethylierung des Cytosins erlaubt es dem Bakteriophagen, DNA-

Endonukleasen zu synthetisieren, die spezifisch cytosinhaltige Wirts-DNA spalten

können. Die Restriktion der Wirts-DNA wird vorwiegend durch die Endonuklease II

und IV durchgeführt, die durch die Gene denA und denB codiert werden (Warner &

Snudstad et al., 1970; Hercules et al., 1971; Souther et al., 1971). Der Schutz vor der

bakteriellen Restriktion durch die Hydroxymethylierung des Cytosins ist jedoch

unzureichend, da das Wirtsbakterium E.coli über ein Restriktionssystem verfügt,

welches spezifisch HMC-haltige DNA restringieren kann. Durch eine zusätzliche

postreplikative Glukosylierung der 5’ Hydroxymethylcytosin-Reste kann jedoch die

Degradation der Phagen-DNA durch dieses sog. Rgl-Restriktionsystem (restriction of

glucoseless DNA) verhindert werden (Sinsheimer, 1954; Volkin, 1954; Jesaitis, 1956).

1.3.1 Glukosylierung des 5’ Hydroxymethylcytosins

Die Glukosylierung der DNA bei geradzahligen T-Phagen erfolgt nicht auf der Ebene

der Nukleotid-Vorstufen, sondern am DNA-Doppelstrang. Zuständig für diese

Modifikation sind spezifische phagenkodierte Glukosyltransferasen (Kornberg et al.,

1961). Sie übertragen Glukosylgruppen von der bakteriellen Uridin-Diphospho-α-D-

Glukose (UDPG) auf die HMC-Reste doppelsträngiger DNA. Das C1-Atom der

Glukose wird dabei kovalent an die Hydroxymethylgruppe des 5'-Hydroxy-

methylcytosins mit unterschiedlicher anomerer Konfiguration gebunden (Abb.2). Der

Bakteriophage T4 kodiert für zwei Glukosyltransferasen, die α-Glukosyltranferase

(AGT) und die β-Glukosyltransferase (BGT). Den verwandten Phagen T2 und T6 fehlt

das Gen für die β-Glukosyltransferase. Sie kodieren zusätzlich zur α-Glukosyl-

transferase die doppelt glukosylierende β-Glukosyl-HMC-α-Glukosyltransferase

Einleitung

6

(GGT). Die DNA-Sequenzen der drei Glukosyltransferasen sind bekannt, zudem

konnten die Proteine überexprimiert und biochemisch charakterisiert werden (Gram und

Rüger, 1985; Tomaschewski et al.,1985; Winkler und Rüger, 1993). DNA-

Sequenzvergleiche zwischen diesen drei Glukosyltransferasen zeigen nur eine geringe

Homologie (Tomaschewski et al., 1985; Winkler und Rüger, 1993).

In jedem Stamm der geradzahligen T-Phagen bestehen charakteristische

Unterschiede in den Anteilen und der Konfiguration glukosylierter HMC-Reste. Die

DNA der geradzahligen T-Phagen besitzt daher ein spezifisches Glukosylierungsmuster

(Lehmann und Pratt, 1960) (Tab.1). Die DNA der Phagen T2 und T6 ist nur zu 75%

glukosyliert, davon sind bei T2 70% in der α-Konfiguration monoglukosyliert und 5%

durch die GGT diglukosyliert. Der Anteil der T6-DNA an Gentobiosylgruppen beträgt

hingegen 72%, und nur 3% sind in der α-Konfiguration monoglukosyliert. Eine

vollständige Glukosylierung der DNA wird nur bei dem Phagen T4 erreicht. Dort finden

sich nur Monoglukosylierungen in einem Verhältnis von 70:30 zwischen α- und

β-glukosylierten HMC-Resten.

gentiobiosyliert

alpha-glukosyliert

beta-glukosyliertR

N

N

O

O

OH OH

OH

O CH2

NH2

CH2

O

OH OH

OH

O

HOCH2

R

N

N

O

O

OH OH

OH

O

HOCH2

CH2

NH2

R

N

N

O

CH2

NH2

O

OH OH

OH

O

HOCH2

Abb.2: Konfigurationen der Glukosylgruppen in der DNA geradzahliger T-Phagen.

Einleitung

7

Tab.1: Glukosylierungsverhältnisse der HMC-DNA geradzahliger T-Phagen. Angaben in Prozent, bezogen auf die Glukosylierung der Cytosine. (Lehmann und Pratt, 1960; Kuno und Lehmann, 1962; Pratt et al., 1963)

Bakteriophage α-glukosyliert β-glukosyliert gentiobiosyliert

T2 70 0 5 T4 70 30 0 T6 3 0 72

Das konstante Glukosylierungsverhältnis an der DNA des Bakteriophagen T4 ist durch

einen begrenzten Zugang der α-Glukosyltransferase zu einigen HMC-Resten und einer

sowohl zeitlichen als auch räumlichen Kompartimentierung der α- und β-Gluko-

sylierung zu erklären:

Durch in vitro Experimente wurde gezeigt, daß die α-Glukosyltransferase

maximal 75-80% der HMC-Reste glukosyliert (Kornberg et al., 1961, Georgopoulos

und Revel, 1971). Diese Einschränkung der Glukosylierung der HMC-Reste beruht vor

allem darauf, daß eine Glukosylierung durch die AGT unterbleibt, wenn auf der

Phagen-DNA mehrere HMC-Reste hintereinander liegen und diese auf beiden Seiten

von Purinen flankiert werden. In diesem Fall ist die α-Glukosyltransferase nur in der

Lage, den am 5'-Ende liegenden HMC-Rest zu modifizieren (Lunt und Burton, 1962;

Lunt und Newton, 1965; de Waard et al., 1967). Die ß-Glukosyltransferase ist hingegen

in der Lage, in vitro 100% der HMC-Reste zu glukosylieren (Josse und Kornberg,

1962). Dieser Befund konnte durch den Einsatz von T4-Mutanten, die keine

α-Glukosyltransferase-Aktivität besaßen (αgt- ßgt+), auch in vivo von Georgopoulos

und Revel (1971) bestätigt werden. Der in vivo Anteil der β-glukosylierten DNA liegt

jedoch nur bei 30%, so daß man davon ausgehen kann, daß die BGT nur die übrig

gebliebenen, unglukosylierten HMC-Reste modifiziert, da die AGT ihre

Glukosylierungskapazität mit 75 bis 80% nahezu vollständig ausschöpft. Die heute

bevorzugte Erklärung für dieses Glukosylierungsverhältnis geht von einer zeitlich

versetzten α- und β-Glukosylierung aus. McNicol und Goldberg (1973) konnten zeigen,

daß die α-Glukosylierung zeitlich vor der β-Glukosylierung erfolgt. Durch

vergleichende Untersuchungen der Aktivitäten der AGT und der BGT und der

entsprechenden mRNA’s, ist davon auszugehen, daß die neusynthetisierte DNA und die

AGT räumlich getrennt von der BGT vorliegen (Young und Van Houwe, 1970; Black

und Gold, 1971). Es kommt somit unmittelbar nach oder sogar während der DNA-

Einleitung

8

Replikation zur α-Glukosylierung, und erst anschließend erfolgt die β-Glukosylierung

(Revel, 1983). Es liegen erste Hinweise dafür vor, daß die AGT mit dem Replikations-

Multienzymkomplex assoziiert ist. Erst kürzlich konnte die Bindung der AGT an die

„sliding clamp“ (gp45) nachgewiesen werden (Sommer, 2001).

1.3.2 Funktion der Glukosylierung Die Glukosylierung der HMC-DNA dient in erster Linie als Schutz vor der Restriktion

durch das bakterielle Rgl-System. Das Rgl-System restringiert spezifisch

unglukosylierte HMC-DNA (Hattman und Fukasawa, 1963) und besteht aus zwei

unabhängig voneinander additiv arbeitenden funktionellen Einheiten, RglA und RglB,

die zudem unterschiedlich lokalisiert sind. Durch Experimente mit galU- und

verschiedenen rgl-Mutanten der E. coli-Stämme B und K 12 konnte gezeigt werden,

daß die RglA-Aktivitäten an der Zellmembran und die RglB-Aktivitäten im Cytoplasma

lokalisiert sind (Silverstein und Goldberg, 1976; Dharmalingham und Goldberg, 1979).

Die Hydrolyse von unglukosylierter HMC-DNA durch das bakterielle Rgl-System

erfolgt in zwei Schritten. Zunächst werden einige Brüche in die doppelsträngige DNA

eingeführt, von denen ausgehend dann der Abbau der Nukleinsäure durch die

Exonuklease V fortschreitet (Dharmalingam und Goldberg, 1976). Das Rgl-System, von

dem nur HMC-DNA umgesetzt wird ist für E. coli nicht essentiell. Daher kann die

Entwicklung des Rgl-System evolutionsbiologisch als Antwort auf eine T4-Phagen-

Infektion gesehen werden (Georgopoulos, 1967; Georgopoulos und Revel, 1971;

Krüger und Bickle, 1983). Die Glukosylierung der HMC-DNA der geradzahligen

T-Phagen stellt somit eine Weiterentwicklung des eigenen Restriktions-

Modifikationssystems in der Parasit-Wirts-Beziehung dar. Durch eine T4-Wildtyp

Infektion wird zunächst die membrangebundene RglA-Funktion inaktiviert.

Anschließend wird durch ein frühes Genprodukt, die sog. Ar-Nuklease (antirestriktion

nuclease), die cytoplasmatische RglB-Aktivität inhibiert (Dharmalingam et al., 1982).

Es sind jedoch auch einige Restriktionsendonukleasen bekannt, die glukosylierte HMC-

DNA in vitro spalten können: AhaIII, EcoRV, NdeI, SphI und TaqI.

Neben dem Restriktionsschutz sind noch weitere Funktionen der DNA-

Glukosylierung bekannt. So konnte durch Einsatz einer RNA-Polymerase-Mutante von

E.coli nachgewiesen werden, daß die β-Glukosylierung einen Einfluß auf die

Modifikationen der RNA-Polymerase in der späten Genexpression hat. Die mutierte

Einleitung

9

RNA-Polymerase wird im Gegensatz zur Wildtyp RNA-Polymerase nicht modifiziert,

und verliert dadurch ihre Fähigkeit zur späten Genexpression. Bei T4*-Phagen

(T4-Phagen mit unglukosylierter DNA), bleibt diese Fähigkeit der mutierten RNA-

Polymerase jedoch erhalten. (Montgomery und Snyder, 1973). Ein weiterer Effekt der

Glukosylierung besteht in der Stimulierung der Rekombination definierter Regionen auf

dem T4-Genom. Levi und Goldberg (1980) konnten dies für den Grenzbereich

zwischen den Genen 34 und 35 von T4 nachweisen.

1.4 Die Klasse der Glykosyltransferasen

Die Glykosyltransferasen und ihre Reaktionsprodukte sind sowohl bei Pro- und

Eukaryonten als auch bei Viren zu finden (Schäfer et al., 2001), sie zählen daher zu

einer der größten Enzymklassen in der belebten Natur. Sie katalysieren den Transfer

eines Zuckeranteils von einem aktivierten Donorsubstrat auf ein Akzeptorsubstrat. In

den meisten Fällen handelt es sich bei dem Donorsubstrat um einen

Nukleotiddiphospho-Zucker (NDP-Zucker). Als Akzeptorsubstrate kommen neben den

Kohlenhydraten auch Lipide und Proteine in Frage. In Abhängigkeit von der

Glykosyltransferase kommt es entweder zu einer Retention oder zur Inversion der

glykosidischen Bindung am C1-Atoms des Donorsubstrates im Rahmen einer

nukleophilen Substitution (Davies und Henrissat, 1995).

Die Glukose-übertragenden Enzyme der geradzahligen T-Phagen (AGT, BGT

und GGT) spielen jedoch innerhalb der Enzymklasse der Glykosyltransferasen eine

besondere Rolle, da sie im Gegensatz zu allen bisher identifizierten

Glykosyltransferasen DNA glukosylieren. Außer bei den geradzahligen T-Phagen

konnte bisher nur bei einigen Protozoen der Ordnung Kinetoplastida eine

Glukosylierung der DNA nachgewiesen werden, wobei die entsprechende

Glukosyltransferase noch nicht identifiziert werden konnte (Borst und van Leeuwen,

1997).

Die Biosynthese und die Übertragung von Mono-, Di- bzw. Oligosacchariden

und komplexen Kohlehydraten ist von fundamentaler biologischer Bedeutung. Es

werden dabei Moleküle mit einer hohen Diversität synthetisiert, die zahlreiche wichtige

biologische Funktionen übernehmen. Eine zentrale Rolle spielen sie u.a. im

Energiestoffwechsel, indem sie als Speicherstoffe in Form von Dimeren, Oligomeren

Einleitung

10

und Polymeren bereitgestellt werden. Zudem sind polymere Kohlenhydrate an Aufbau

und Erhaltung von Zellwänden und Exoskeletten beteiligt, wie z.B. dem

Mureinsacculus der Bakterien, der pflanzlichen Zellwand und dem Chitinpanzer der

Arthropoden. Desweiteren übernehmen Glykosylierungen von Proteinen und Lipiden

wichtige Funktionen der zellulären Biochemie, insbesondere beim Aufbau der

Glykokalyx höherer Organismen. Bei vielen pathologischen und immunologischen

Prozessen, wie z.B. der Entwicklung maligner Erkrankungen spielen Glykosylierungen

eine wesentliche Rolle. Das Studium der Katalysemechanismen und der Struktur der

Glykosyltransferasen ist daher von medizinischem Interesse.

Die große Anzahl und Diversität der Glykosyltransferasen spiegelt sich in der

Vielfalt natürlicher glykosylierter Verbindungen wieder und macht eine Klassifizierung

besonders schwierig. Nach Campbell et al. (1998) werden derzeit alle NDP-

Glykosyltransferasen nach ihrer Aminosäuresequenz-Homologie und der Reaktions-

Stereochemie in 51 Familien eingeteilt (http://afmb.cnrs-mrs.fr/~pedro/CAZY/gtf.html).

Dieses System hatte sich bereits für Peptidasen und Glykosidasen bewährt, da die einer

Familie zugeordneten Proteine neben Strukturhomologien auch ähnliche

Reaktionsmechanismen aufwiesen (Davies und Henrissat, 1995). Zur Zeit sind die

3D-Strukturen von insgesamt 9 Glykosyltransferasen bekannt (Tab.2). Die erste

aufgeklärte Struktur einer Glykosyltransferase, war die der β-Glukosyltransferase

(BGT) des Bakteriophagen T4 (Vrielink et al., 1994). Obwohl die BGT bezüglich der

Aminosäuresequenz keiner Glykosyltransferase-Familie zugeordnet werden konnte,

bestehen jedoch ausgeprägte strukturelle Homologien zu den Glukosyltranferasen

MurG von E.coli und Gtfb von Amycolatopsis orientalis (Abb.3), die eine Einteilung in

zusätzliche Superfamilien erlaubt (Unligil und Rini, 2000; Mulichak et al., 2001). Eine

weitere Superfamilie bezüglich der strukturellen Homologie der katalytischen Zentren,

setzt sich aus der β4-Galktosyltransferase (Rind), der Glykosyltransferase SpsA

(B.subtitlis) und der N-acetylglukosaminyltransferase (GnT I) (Hase) zusammen

(Unligil und Rini, 2000). Bei der Glukuronyltransferase I des Menschen, der α1,3-

Galaktosyltransferase des Rindes und der Galaktosyltransferase LgtC aus Neisseria

meningitis finden sich keine Strukturähnlichkeiten.

Einleitung

11

Tab.:2 Liste der Glykosyltransferasen mit bekannter 3D-Struktur mit Angabe des Organismus, der Referenz und ursprünglichen Familie. Die Glykosyltransferasen 1-3 bzw. 4-6 bilden aufgrund der Strukturhomologien jeweils neue Superfamilien. Die Glykosyltransferasen 7-9 konnten noch nicht zugeordnet werden. n.k nicht klassifiziert. * zitiert wurde nur der Erstautor, aus Platzgründen wurde auf et al. verzichtet.

Glykosyltransferase Familie (Campbell) Organismuns Referenz*

1. β-Glukosyltransferase (BGT) n.k Phage T4 Vrielink, 1994 2. MurG 28 E.coli Ha, 2000 3. Glykosyltransferase GtfB 1 Amycolatopsis orientalis Mulichak,2001

4. β4-Galaktosyltransferase 7 Rind Gastinel, 1999 5. Glykosyltransferase SpsA 2 B.subtilis Charnock, 1999 6. GnT I 13 Hase Ünligil, 2000

7. Glukuronyltransferase I 43 Mensch Pedersen, 2000 8. α1,3-Galaktosyltransferase 6 Rind Gastinel, 2001 9. Galaktosyltransferase LgtC 8 Neisseria meningitis Persson, 2001

Abb.3: Vergleichende Darstellung der 3D-Strukturen von der β-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4, der Glykosyltransferase MurG von E.coli und der Glykosyltransferase GtfB von Amycolatopsis orientalis.

Einleitung

12

1.5 Die β-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4

Die β-Glukosyltransferase (BGT) katalysiert die Übertragung von Glukose auf die

Hydroxymethylgruppe des 5’ Hydroxymethylcytosins doppelsträngiger T4-DNA. Als

Glukose–Donor fungiert dabei das bakterielle UDPG. Für die in vivo Transferreaktion

ist Mg2+ essentiell (Volkin, 1954: Jesaits, 1956; Josse und Kornberg, 1962). In der

Abbildung 4 ist der postulierte Reaktionsmechanismus dargestellt (Moréra et al., 1999).

Abb.4: Postulierter Reaktionsmechanismus der β-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4.

Bei der BGT handelt es sich um ein monomeres Protein bestehend aus 351

Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 40,6 kDa. Das Gen für die BGT konnte

bereits sequenziert und in E.coli überexprimiert werden (Gram und Rüger, 1985). Die

3D-Struktur konnte ebenfalls aufgeklärt werden (Vrielink et al., 1994; Moréra et al.,

1999:, Moréra et al, 2001). Danach besteht das Enzym aus zwei Domänen, die eine

ähnliche Topologie aufweisen, wobei die Aminosäuresequenzen beider Domänen keine

signifikanten Homologien zeigen (Abb.5). Die C-terminale Domäne erstreckt sich über

die Reste 182 bis 316 und besteht aus 6 parallelen ß-Strängen, die von 5 α-Helices

umgeben sind. Die N-terminale Domäne (Reste 1-165 und 338-351) wird aus

7 parallelen ß-Strängen gebildet, die von 7 α-Helices umgeben sind. Durch eine

Aminosäurekette (Reste 169-183) und eine α-Helix (Reste 317-335), werden die beiden

Domänen miteinander verbunden, so daß sich zwischen ihnen eine Furche bildet, in der

sich das katalytische Zentrum befindet. Das Donorsubstrat UDPG bindet im Inneren

dieser Furche und interagiert mit 6 Aminosäuren der C-teminalen Domäne. Dabei

werden Wasserstoffbrücken zu der Base Uracil (Ile 238), zur Ribose (Glu272), zum

α-Pohosphat ( Ser189, Arg191, Arg269) und zum β-Phosphat (Arg195) ausgebildet

(Moréra et al., 1999).

Einleitung

13

Abb.5: Dreidimensionale Struktur der β-Glukosyltransferase des Bakteriohagen T4. Auflösung 1,88Ǻ.

Es ist bisher allerdings noch nicht gelungen, die an der Bindung des Zuckeranteils

beteiligten Aminosäuren zu bestimmen. Ein Vergleich der beiden 3D-Strukturen mit

und ohne Donorsubstrat (UDPG) zeigt deutlich, daß die Substratbindung eine

Konformationsänderung im Molekül hervorruft. Die Bindung des Substrates löst eine

Bewegung der C-terminalen Domäne relativ zur statischen N-terminalen Domäne um

14o aus (Moréra, et al., 2001). Dies führt zur einer geschlosseneren Konformation der

BGT durch die Ausbildung von drei Salzbrücken zwischen Aminosäureresten beider

Domänen (Lys28-Asp171; Lys166-Glu272; Asp100-Arg191). Aufgrund der

Strukturähnlichkeiten der BGT mit der Glykogen-Phosphorylase (GP) (Artymiuk et al.,

1995; Holm und Sander, 1995), insbesondere bezüglich der räumlichen Anordnung der

Substrate im katalytischen Zentrum, konnte ein Strukturmodell des katalytischen

Zentrums der BGT mit dem Glukoseanteil entwickelt werden (Abb.6) (Moréra et al.,

1999). Demnach kann die Glukose über die Ausbildung von Wasserstoffbrücken zu den

Aminosäuren Tyr261A, Thr267, Leu268 und Gln137 im katalytischen Zentrum für die

Transferreaktion positioniert werden. Zudem läßt die Distanz der Reste Glu22 und

Asp100 zum anomeren C1-Atom der Glukose von jeweils 4.5Å bzw. 6,7Å und zur

Hydroxymethylgruppe des 5’HMC von jeweils 3 Å bzw. 5 Å auf eine Beteiligung an

der Transferreaktion schließen. In enger Anlehnung an den postulierten

Reaktionsmechanismus der α-1,3-Fukosyltransferase (Look et al., 1993; Murray et al,

Einleitung

14

1997) wird bei der BGT angenommen, daß die Carboxylgruppen des Glutamats (Glu22)

und des Aspartats (Asp100) als H-Akzeptoren die nukleophile Substitution am C1-

Atom der Glukose aktivieren, indem sie die Hydroxymethylgruppe des 5’HMC

deprotonieren und somit als Nukleophil bereitstellen (Abb.4). Die genaue Funktion des

Magnesiums während der Katalyse ist bisher noch nicht geklärt.

Abb.6: Darstellung des UDPG im katalytischen Zentrum und mögliche Interaktionen mit der BGT im

Modell.

Das Akzeptorsubstrat (HMC-DNA) interagiert vermutlich mit der konkaven Oberfläche

der Furche zwischen den beiden Domänen der BGT (Abb.7) Elektrostatische

Untersuchungen der Proteinoberfläche zeigten in diesem Bereich eine Anhäufung

positiver Ladungen, die eine elektrostatische Bindung mit dem Phosphatrückgrad der

DNA ermöglichen. Insgesamt wird diese konkave Oberfläche von 12 positiv geladenen

Aminosäureresten ausgekleidet. Es handelt sich dabei um 9 Lysine und 3 Arginine,

wobei Lys13, Lys43, Arg102, Arg115 Lys149 und Lys150 aus der N-terminalen

Domäne und Arg217, Lys219, Lys222, Lys225, Lys237 und Lys259 aus der

C-terminalen Domäne stammen (Moréra et al., 1999). Es ist wahrscheinlich, daß das

hydroxymethylierte Cytosin zur Übertragung der Glukose aus der DNA herausgeklappt

werden muß, um das katalytische Zentrum im Inneren der Furche zu erreichen. Diese

Einleitung

15

Annahme wird unterstützt, durch die Existenz eines mit hydrophoben Aminosäuren

ausgekleideten Kanals, der sich von der Proteinoberfläche bis zum katalytischen

Zentrum erstreckt. Die Aminosäuren Pro19 und Leu103 innerhalb dieses Kanals

könnten demzufolge die ausgeklappte Base im aktiven Zentrum durch van der Waals-

Kräfte positionieren. Eine weitere wichtige Funktion bei der Translokation der Base

könnte die Aminosäure Phe72 übernehmen; sie könnte in die Lücke des ausgeklappten

Cytosins interkalieren und somit der Destabilisierung der DNA entgegenwirken. Dieser

Basen-Ausklapp-Mechanismus wird bei DNA modifizierenden Enzymen wie z.B. der

Methyltransferase HhaI und der Uracil-DNA Glykosylsase beobachtet (Roberts und

Cheng, 1998).

Abb.7: Darstellung der Oberflächenstruktur der BGT im Komplex mit DNA (im Modell). Positive Ladungen sind blau und negative Ladungen sind rot dargestellt. Das ausgeklappte Cytosin liegt im aktiven Zentrum (rot), Phe72 interkaliert in die entstehende Lücke der ds DNA (Moréra et al., 1999).

Einleitung

16

1.6 Aufgabenstellung

Die Glukosyltransferasen der geradzahligen T-Phagen sind derzeit die einzigen für eine

biochemische Charakterisierung zugänglichen Glykosyltransferasen, die Glukose auf

DNA übertragen. Ausgehend vom bakteriellen UDPG übertragen sie den Zucker-Rest

auf die 5’-hydroxymethylierten Cytosine der Phagen-DNA. Der Bakteriophage T4

besitzt neben einer α-Glukosyltransferase (AGT) eine β-Glukosyltransferase (BGT).

Bisher konnte jedoch nur die drei-dimensionale Struktur der BGT aufgeklärt werden

(Vrielink et al., 1994; Moréra et al., 1999). Ausgehend von dieser Struktur sind bei der

BGT zwei Regionen von besonderem Interesse. Es handelt sich dabei um die

katalytische Region und die DNA-interagierende Region. Bei der Karzinogenese

spielen DNA-Modifikationen eine wesentliche Rolle. Daher stehen Untersuchungen der

DNA-Interaktion (DNA-Bindemotiv, DNA-Erkennung) im Vordergrund.

Durch eine ortsspezifische Mutagenese sollte in dieser Arbeit die postulierte

Funktion einiger Aminosäuren an der DNA-Interaktion (Phe71, Phe72) und an der

Katalyse (Glu22, Asp100, Glu163, Tyr261) verifiziert werden. Zunächst mußte eine

grundlegende biochemische Charakterisierung des BGT-Wildtyps bezüglich der DNA-

Interaktion, der UDPG-Bindung und der in vitro Aktivität erfolgen, um eine

vergleichende Analyse der Enzymkinetiken und der Liganden-Affinitäten zwischen der

BGT und ihrer Mutanten zu ermöglichen.

In enger Kooperation mit Dr. Solange Moréra (Laboratoire d’ Enzymologie et de

Biochimie Structurales, Paris, Frankreich) sollte die Beteiligung des Mg2+-Kofaktors an

der Transferreaktion der Glukose durch Röntgenstrukturanalysen im Detail studiert

werden. Biochemische Untersuchungen der Kofaktor abhängigen in vitro Aktivität der

BGT sollten als Basis und zur Interpretation der Struktur-Daten dienen. Des weiteren

war beabsichtigt, in Zusammenarbeit mit Dr. Martin de Kort (Leiden Institute of

Chemistry, Gorlaeus Laboratories, Universität Leiden, Niederlande), Oligonukleotide

herzustellen, die 5’-Hydroxymethylcytosin-Reste an definierten Positionen enthalten.

Durch Gel-Retardationsanalysen und in vitro Aktivitätstests mit diesen synthetisierten

HMC-Oligonukleotiden sollte geklärt werden, nach welchen Erkennungsmodi die BGT

DNA glukosyliert.

Ein weiteres Ziel dieser Arbeit bestand darin, die inhibitorische Wirkung

verschiedener UMP-Derivate auf die in vitro Aktivität der BGT nachzuweisen. Diese

Inhibitionsstudien sollten gemeinsam mit Prof. Dr. Richard R. Schmidt (Universität

Einleitung

17

Konstanz, Fachbereich Chemie) Zusammenhänge zwischen der chemischen Struktur

der UMP-Derivate und der Aktivität der BGT aufzeigen, um das Wissen in der

Glykosyltransferase-Inhibitor Forschung zu erweitern. Zudem sollten diese

Untersuchungen dazu dienen Inhibitoren zu identifizieren, die im Ko-Kristall mit der

BGT eine detailliertere strukturelle Aufklärung des Reaktionsmechanismus

ermöglichen.

18

2. Material und Methoden

2.1 Biologisches Material

2.1.1 Bakterienstämme

E. coli (K12) XL1-Blue

Genotyp: recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17 (rk-,mk+), supE44, relA1, γ-, lac-,

[F', proAB, lacIqZ∆M15, Tn10 (tetr )]

E. coli K12 ∆H1∆trp

Genotyp: M72, Smr, lacZam, ∆bio-uvrB, ∆trpEA2 (λ-Nam, Nam53, cI 857, ∆H)

E. coli BL 21 DE3

Genotyp: F-, ompT, hsd SB (r -B m -

B ) gal dcm (DE3)

E.coli K12 W4597

Genotyp: gal U-, r+, rgl+

Alle oben aufgeführten Bakterienstämme wurden aus der Stammsammlung des

Institutes bezogen.

2.1.2 Plasmide

Plasmid Referenz pPLc2833 Remaut et al.(1981) pBluescript SK +/- Stratagene (Heidelberg) pET 11d Novagen (Madison, USA)

Material und Methoden

19

2.2 Chemikalien und Enzyme

Es wurden vorwiegend, wenn nicht anders vermerkt, Chemikalien der Firmen Baker

(Groß-Gerau), Merck (Darmstadt), Riedel de Haen (Seelze) und Serva (Heidelberg)

verwendet. Nukleotide und Enzyme wurden von den Firmen Boehringer (Mannheim),

Gibco BRL (Eggenstein), Pharmacia (Freiburg), JenaBioscience (Jena) und Sigma

(Dreisenhofen) bezogen. Zur Plasmidisolation wurde mit Isolationssystemen der Firmen

Qiagen (Hilden) und Machery-Nagel (Düren) gearbeitet. UDPG*-14C lieferte NEN

(Köln).

2.3 Häufig verwendete Puffer und Reagenzien

TE: 10 mM Tris HCl; 1 mM EDTA; pH 8,0

TBE (10x): 900 mM Tris HCl; 900 mM Borsäure; 25 mM EDTA; pH 8,3

SSC (20x): 3 M NaCl; 0,3 M Natriumcitrat; pH 7,4

DNA-Probenpuffer: 25% (w/v) Saccharose; 0,05% (w/v) Bromphenolblau in 3x TBE.

3x SDS-Protein-Probenpuffer: 15 % Glycerin (v/v); 7,5 % (v/v) ß-Mercaptoethanol;

4,5 % SDS (w/v); 93,8 mM Tris/HCl; pH 6,80,3 % Bromphenolblau (w/v)

Acrylamid-Stammlösung: 40% Acrylamid, N, N-Bisacrylamid 29 :1

2.4 Verwendete Oligonukleotide

Primer zur Mutagenese

Glu22Ala/1 5'-CTGTTCCATCTTCTGCAACTATTTATCTTT-3'

Glu22Ala/2 5'-AAAGATAAATAGTTGCAGAAGATGGAACAG-3'

Asp100Ala/1 5'-ATTATTTATTTACAGCTATACGTTTGCCGT-3'

Asp100Ala/2 5'-ACGGCAAACGTATAGCTGTAAATAAATAAT-3'

Phe72Ala/1 5'-GTTAATTCTTCTATTAACTTTGCTGGCGGTAAACC-3'

Phe72Ala/2 5'-GGTTTACCGCCAGCAAAGTTAATAGAAGAATTAAC-3'

Glu163Ala/1 5`-TATTTTCCTATTGCACAATATAAAATTCAT-3`

Glu163Ala/2 5`-ATGAATTTTATATTGTGCAATAGGAAAATA-3`


20

Primer zur Sequenzierung

BGT 1 5`-GAAGTAGATGTTAATGATTATG-3`

BGT 2 5`-TTCATATGAACGATTTTCAATT-3`

BGT 3 5`-GGGAAACAATGGCATCTGATGC-3`

BGT 4 5`-AGCCTACCAAGAAAACTTTGG-3`

Sonstige Oligonukleotide

HMC-Oligomer 5'-GTTTACTTC-X-TCGGTTAGTG-3'.

HMU-Oligomer 5'-GTTTACTTC-Y-TCGGTTAGTG-3'.

Anti C 3`-CAAATGAAG-C-AGCCAATCAC-5`

Anti T 3`-CAAATGAAG-T-AGCCAATCAC-5`

Anti A 3`-CAAATGAAG-A-AGCCAATCAC-5`

Anti G 3`-CAAATGAAG-G-AGCCAATCAC-5

Anti ∆ 3`-CAAATGAAG-∆-AGCCAATCAC-5

X = 5´- Hydroxymethylcytosin

Y = 5`- Hydroxymethyluracil

∆ = 1,2-Dideoxy-D-Ribose Spacer 2.5 Nährmedien

LB-Medium: 10 g NaCl, 10 g Pepton (Gibco/BRL), 5 g Hefeextrakt

(Gibco/BRL) in 1 l H2O

2x YT-Medium 10 g NaCl, 16 g Pepton, 10 g Hefeextrakt in 1 l H2O

PAGFe-Medium: 60 ml Lösung P: 1 M Na2HPO4, 0,44 M KH2PO4

12 ml Lösung A: 1,86 M NH4Cl, 0,21 M MgSO4

60 ml Lösung G: 0,55 M Glukose

12 ml Lösung Fe: 0,01 % (w/v)FeCl3

in 1 Liter H2O


21

Für Selektivmedien wurden die Antibiotika Ampicillin und Tetracyclin in den

Konzentrationen 100 µg/ml bzw. 15 µg/ml eingesetzt.

2.6 Geräte

Elektrophoresegeräte: Biometra Elektrophorese-Powersupply

P24; Bio Rad Mini Protein Dual Slab Cell.

Fluoreszenzspektrometer: Aminco, Model SLM AB2

HPLC-Pumpe: Gynkotek, Model 480

HPLC-Detektor: Gynkotek, UVD 320S

Inkubationsschüttler: Innova 3100

Photometer: Philips Spektralphotometer PU 8730; Pharmacia Biotech

Novaspec II

PCR: PTC-150-16 mini cycler CMJ Resaech, Biozym (hess.

Oldendorf)

Szintillationszähler: Beckman, LS 6000 TA

Zentrifugen: Eppendorfzentrifuge Heraeus Biofuge A; Kühlzentrifuge

Sorvall RC2-B und RC5-B; Rotoren: GSA, HB-4

2.7 Computer-Software

Office 2000 Microsoft

Origin 6.0 Microcal

Chromeleon 6.0 Dionex

CorelDraw 9.0 Corel Cooparation

SeqMan 3.0 DNA STAR

PI50-Bestimmung 3.31 Doofi-Software


22

2.8 Arbeiten mit Bakterien

2.8.1 Transformation von E. coli mit Plasmid DNA (Dagert und Ehrlich,

1979; Cohen et al., 1972)

Herstellung CaCl2-kompetenter E.coli Zellen

100 ml LB-Medium wurden mit 500 µl einer ÜK unter Zusatz von Tetracyclin

(Endkonzentration 15µg/ml) angeimpft und bis zu einer OD590 von ca. 0,375 bei 37oC

bebrütet. Durch eine anschließende Zentrifugation (2000 x g, 10 min, 4 oC) wurden die

Zellen sedimentiert und in 10 ml 0,1 M CaCl2-Lösung resuspendiert. Das Resuspendat

wurde 30 min auf Eis inkubiert und erneut durch Zentrifugation (2000 x g, 10 min, 4 oC) sedimentiert. Das Bakterienpellet wurde in 4 ml 0,1 M CaCl2-Lösung

aufgenommen. Die Zellen konnten ca. 3 Tage bei 4oC aufbewahrt werden.

Transformation von CaCl2-kompetenten E.coli Zellen

Zur Transformation wurden 200 µl der kompetenten Zellen mit 10-20 ng Plasmid-DNA

versetzt und mindestens für 30 min auf Eis inkubiert. Im Anschluß erfolgte ein

Hitzschock für 90 s bei 42oC. Nach Zugabe von 200 µl 2x YT-Medium wurden die

Zellen für 45 min bei 37oC inkubiert. Anschließend wurden 50-200 µl des Ansatzes auf

LB- Selektivmedium ausplattiert und 12 h bei 37oC bebrütet. Parallel zu jeder

Transformation wurde eine Positivkontrolle (mit bekannter Plasmid-DNA) und eine

Negativ- Kontrolle durchgeführt.

2.8.2 Herstellung kompetenter Zellen für die Elektrotransformation

Zweimal 200 ml 2 x YT Medium wurden jeweils mit 2 ml einer frischen

Übernachtkultur von E. coli XL 1 angeimpft und auf einem Schüttler (220 upm) bei

37oC bis zu einer OD600 von ca. 0,5-0,8 inkubiert. Die Zellen wurden anschließend in

einem GSA-Rotor bei 4000 x g für 15 min bei 4oC sedimentiert (pro 200 ml Kultur

1 GSA-Röhrchen). Nach Verwerfen des Überstandes wurden die Zellen in 200 ml

eiskaltem A.dest. resuspendiert und erneut unter den oben genannten Bedingungen


23

sedimentiert. Der Überstand wurde verworfen und das Bakterienpellet in 100 ml

eiskaltem A.dest. resuspendiert. Es schloß sich erneut eine Zetrifugation unter den

genannten Bedingungen an. Dieser Waschschritt wurde zweimal wiederholt. Das mit

A. dest. gewaschene Bakterienpellet wurde in 4 ml eiskaltem 10 % (v/v) Glycerin

resuspendiert (pro 200 ml Kultur 2 ml Glycerin) und auf 2 ml-Eppendorfgefäße verteilt.

In einer Tischzentrifuge erfolgte eine Zentrifugation bei 3000 x g für 15 min bei 4oC.

Die Bakterienpellets wurden anschließend in je 125 µl 10 % Glycerin aufgenommen.

Die Zellkonzentration lag bei etwa 1-3 x 1010 Bakterien/ml. Nachdem 40 µl-Aliquots

der kompetenten Zellen hergestellt wurden, wurden diese in flüssigem Stickstoff

schockgefroren und bei –80oC gelagert. Die Bakterien sind ca. 6 Monate für die

Elektrotransformation verwendbar.

2.8.3 Elektrotransformation von E. coli mit Plasmid DNA

Bei der Elektrotransformation ist darauf zu achten, daß die verwendete Plasmid-DNA

salzfrei ist. Dazu wurde die Plasmid-Lösung zuvor für 30 min auf Milliporefilter

(0,025 µm) gegen steriles A. dest. dialysiert. Je nach DNA-Konzentration der salzfreien

Plasmid-Lösung wurden ca. 1-10 µl in eine eisgekühlte Elektroporationküvette gegeben

und mit 40 µl der elektrokompetenten Zellen vorsichtig vermischt. Die Elektro-

transformation erfolgte bei folgender Einstellung: 2,5 kV; 800 Ω, 25 µF.

Nach erfolgter Elektrotransformation wurde der Transformationsansatz zu 1 ml 2x YT-

Medium gegeben und in einem Inkubationsschüttler (220 upm) 60 min bei 37oC

inkubiert. Anschließend wurden je nach Konzentration der eingesetzten Plasmid-DNA

10-100 µl Transformationsansatz auf antibiotikahaltigem LB-Medium ausplattiert und

16 h bebrütet.


24

2.8.4 Überexpression des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten in E.coli

BL21 DE3

Die Leserahmen der verwendeten Expressions-Vektoren stehen unter der Kontrolle des

T7-Promotors (pET 11d; pBSK). Der Leserahmen der T7-Polymerase im Expressions-

stamm BL21 DE3 steht unter der Kontrolle des Lac-Promotors, so daß die Expression

der BGT durch IPTG induziert werden kann.

Die mit einem rekombinanten Expressions-Vektor transformierten BL21 DE3-Zellen

wurden in einem geeigneten Volumen LB-Selektivmedium (Amp.; Endkonzentration:

100 µg/ml) bei 37oC bis zu einer OD590 von 0,8-1,0 angezogen, mit IPTG induziert

(Endkonzentration: 1 mM) und weiter 3 h bei 37oC inkubiert. Die induzierten Zellen

wurden anschließend durch eine 20-minütige Zentrifugation (5000 x g, 4oC)

sedimentiert. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 0-4oC durchgeführt. Zur Kontrolle

der Überexpression wurden die Rohextrakte der Zellen vor und nach der Induktion auf

einem SDS-Polyacrylamid-Gel überprüft. Dazu wurde jeweils 1 ml Kultur

abzentrifugiert (12000 x g ; RT), das Pellet in 50 µl 3 x SDS-Proteinprobenpuffer (2.3)

resupendiert und 5 min im Wasserbad gekocht. Für die SDS-PAGE wurden 5 µl

eingesetzt.

2.8.5 Zellaufschluß durch Ultraschall

Die induzierten Zellen wurden in Aufschlußpuffer A (siehe unten) resuspendiert (pro 1g

Feuchtgewicht 2 ml Aufschlußpuffer) und 6 x 30 s auf Eis bei maximaler Leistung mit

einem Branson-Sonifier B12 beschallt. Die Zelltrümmer wurden anschließend durch

zwei Zetrifugationen sedimentiert (1. 7000 upm; 20 min; 4oC; 2. 19000 upm; 60 min;

4oC; SS34-Rotor). Der Überstand wurde bei 4oC gelagert.

Aufschlußpuffer A: 10 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,9

1 mM DTT

1 mM EDTA

0,02mM PMSF

5 % (v/v)Glycerin


25

2.9 Isolierung und Analyse von DNA

2.9.1 Bestimmung von DNA Konzentrationen

Durch eine photometrische Messung bei 260 nm konnten DNA-Konzentrationen

bestimmt werden. Dabei entspricht eine optische Dichte von 1,0 einer Lösung

doppelsträngiger DNA einer Konzentration von 50 µg/ml bzw. 37 µg/ml für eine

Lösung einzelsträngige DNA. Diese Werte beziehen sich auf die Masse eines

Nukleotidpaares von 660 Dalton (Sambrook et al. 1989).

2.9.2 DNA-Fällung

Die DNA-Lösung wurde mit drei Volumina absolutem und eiskaltem Ethanol und mit

einem Zehntel Volumen 3 M Na-Acetat pH 4,8 versetzt. Nachdem der Ansatz kurz

gemischt wurde, folgte eine 30 minütige Inkubation bei -20oC. Im Anschluß wurde die

DNA durch Zentrifugation (12000 x g; RT; 30 min) pelletiert. Der Überstand wurde

verworfen und das DNA-Pellet mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen. Das durch eine

erneute Zentrifugation (12000 x g; RT; 10 min) erhaltene Pellet wurde getrocknet und

in einem gewünschten Volumen TE- Puffer (2.3) oder sterilem A. dest. resuspendiert.

2.9.3 Enzymatische Modifikationen von DNA

Enzymatische Modifikationen von DNA wie Restriktionsverdau, Ligation,

Phosphorylierungen und Dephospholyrierungen wurden nach Angaben der ent-

sprechenden Enzymhersteller durchgeführt (Gibco BRL, MBI Fermentas).


26

2.9.4 Methoden zur Plasmidisolierung

Zur Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli wurden diverse Plasmid-Isolierungs-Kits der

Firmen Qiagen (Hilden), Macherey Nagel (Düren) und Pharmacia (Freiburg) unter

Befolgung der entsprechenden Protokolle verwendet.

2.9.5 Hybridisierung von Oligonukleotiden

Zur Hybridisierung wurden zunächst jeweils 5µl zweier einzelsträngiger

Oligonukleotide (1µg/µl) in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß (1,5 ml) für 5 min bei

90oC in einem Thermoblock (Techne, Dri-Block DB1) erhitzt. Im Anschluß wurden

5 µl einer ebenfalls auf 90oC erhitzten SSC-Lösung (18x) zu dem Hybridsierungsansatz

gegeben. Nach dem Abkühlen des Thermoblocks auf RT wurde der

Hybridisierungsansatz kurz anzentrifugiert und zur weiteren Verwendung bei –20oC

gelagert.

2.9.6 Ortsspezifische in vitro Mutagenese

Zur Durchführung der in vitro Mutagenese Reaktionen wurde das "QuikChange® Site-

directed Mutagenesis Kit" der Firma Stratagene nach Angaben des Herstellers

verwendet. Als Ausgangsmaterial dieser Mutagenese-Technik dienten 2 komplementäre

mutagene Oligonukleotide und der doppelsträngige DNA-Vektor pBlueScript SK mit

inseriertem βgt-Fragment. Durch die PCR (Polymerase Chain Reaction) konnten die

gewünschten Mutationen eingeführt werden.

Die mutagenen Oligonukleotide wurden so gewählt, daß ihre Länge zwischen 25 und

45 Basen lag. Alle unter 2.4 aufgeführten mutagenen Oligonukleotide wurden von den

Firmen Gibco BRL und Jena Bio Science bezogen. Bei Oligonukleotiden, deren

Schmelztemparatur unter 55oC lag, wurde das PCR-Protokoll wie folgt modifiziert:


27

Zeit Temperatur

1. Denaturierung 30 sec 95oC 2. Annnealing 1 min 40oC 3. Annealing+Extension 0→2 min 400C→680C 4. Extension 10 min 680C 5. Gehe zu 1. 16 Zyklen

Nach erfolgter PCR-Amplifikation wurde die nicht mutagenisierte methylierte

Template-DNA durch einen Dpn1-Verdau hydrolysiert. Die amplifizierte Plasmid DNA

wurde anschließend in E. coli XL1 blue transformiert und auf Selektiv-Medium

ausplattiert. Zur Überprüfung der Mutagenese-Reaktion wurde das Plasmid isoliert und

das βgt Gen sequenziert.

2.9.7 DNA-Sequenzierung

Alle für diese Arbeit erforderlichen DNA-Sequenzierungen wurden an dem Lehrstuhl

für Biochemie der Ruhr-Universität Bochum als Auftragsarbeit durchgeführt.

2.9.8 Herstellung von genomischer unglukosylierter T4*-DNA

Vermehrung von T4*-Phagen

Zur Vermehrung der T4*-Phagen wurde der E.coli-Stamm W4597 eingesetzt. Dieser

Stamm ist UDPG-defizient. Somit kann keine Glukose während der Phagen-

amplifikation auf die Phagen- DNA übertragen werden.

Es wurde zunächst eine ÜK bei 37oC von einer E.coli W4597-Kolonie in LB-Medium

angezogen. Mit einem Alliqot daraus wurde am folgenden Tag erneut eine ÜK

(1%ig angeimpft) bei 37oC in 50 ml Minimalmedium (PAGFe-Medium) hergestellt.

1200 ml PAGFe-Medium (2.5) wurden mit 30ml dieser ÜK angeimpft und unter starker

Belüftung bis zu einem Titer von ca. 5*108 Zellen/ml ( ≅ OD590 von 0,3-0,4) bei 37oC

angezogen. Nach Zugabe von 5 ml einer 0,1% Tryptophan-Lösung als Adsorptions-

faktor wurden die Bakterien anschließend mit einer MOI (multiplicity of infection)


28

von 5 mit T4-Phagen infiziert. Die Vermehrung der Phagen kann anhand der Abnahme

der optischen Dichte der Kultur verfolgt werden. Vier Stunden nach der Infektion wurde

die vollständige Lyse durch Zugabe von 5 ml Chloroform erreicht. Zur Phagenisolation

wurde das Bakterienlysat für 10 min bei 6000 upm zentrifugiert

(4oC, GSA-Rotor). Das Sediment wurde verworfen und der Überstand mit DNase I

(ca.1µg/ml) behandelt, um vorhandene Wirts-DNA abzubauen. Es folgte eine

zweistündige Zentrifugation des Überstandes bei 12000 upm (4oC, GSA-Rotor). Das

erhaltene Phagenpellet wurde in 5ml Waschpuffer (10 mM Tris/HCl, pH 7,4; 1mM

MgCl2; 0,1% (w/v) NaCl) resuspendiert. Die T4*- Phagensuspension wurde bis zur

weiteren Verwendung bei 4oC aufbewahrt.

Isolierung der T4*-DNA

Zur Isolation der viralen DNA wurden in einem sterilen Reagenzglas 3 ml T4*-

Phagensuspension mit dem gleichen Volumen an kaltem, wassergesättigtem Phenol pH

7,5 (Aqua Roti® Phenol) versetzt. Durch vorsichtiges Schwenken bei 4oC für 30 min

wurde die DNA extrahiert. Es folgte eine zehnminütige Zentrifugation bei 13000 upm

(4oC, SS34-Rotor). Anschließend wurde die DNA-haltige wässerige Oberphase

vorsichtig mit einer abgesägten Pasteurpipette abgenommen, in ein steriles Reagenzglas

überführt, mit dem gleichen Volumen Phenol versetzt und wie oben beschrieben

behandelt. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt. Nach der letzten Extraktion

wurde die DNA-Phase in einen Dialyseschlauch gefüllt und über Nacht gegen

2 l Dialysepuffer (0,01 M Tris/HCl, pH 7,5; 0,5 mM EDTA) dialysiert, um restliches

Phenol zu entfernen. Die Konzentration der gewonnenen T4*-DNA wurde

photometrisch bestimmt (2.9.1). Zur Kontrolle des Glukosylierungsgrades wurde eine

Restriktion mit EcoRI durchgeführt (EcoRI schneidet keine glukosylierte HMC-DNA).

Die Vermehrung der T4-Wildtyp-Phagen wurde in dem E.coli-Stamm BA mit einer

MOI von 0,1, nach dem gleichen Protokoll wie bei der Vermehrung von T4*-Phagen

durchgeführt. Die Isolation der T4-Wildtyp DNA erfolgte in gleicher Weise wie die

Isolation der T4*-DNA.


29

2.9.9 Agarose-Gelelektrophorese von DNA

Die gelelektrophoretische Analyse von DNA-Fragmenten wurde in horizontalen

Gelkammern (9 x 10 x 0,5 cm) durchgeführt. Die DNA-Proben wurden vor dem

Auftragen mit einem halben Volumen 3 x Probenpuffer versetzt. Die Elektrophorese

eines 0,8% Gels in 1 x TBE-Laufpuffer wurde bei einer Spannung von 70 V für 1-2 h

durchgeführt. Anschließend wurden die Gele in einer Ethidiumbromid-Lösung

(1 µg/ml) gefärbt, um eine Analyse der DNA unter UV-Licht zu ermöglichen.

1 x TBE-Laufpuffer 90 mM Tris/HCL; pH 8,3

90 mM Borsäure

2,5 mM EDTA

Probenpuffer 25% (w/v) Saccharose

0,05 % (w/v) Bromphenolblau in 3x TBE

2.9.10 DNA-Extraktion aus Agarosegelen

Zur Rückgewinnung von DNA aus Agarosegelen wurde das QIAquick Gel

Extraktionskit (Qiagen, Hilden) nach Angaben des Herstellers verwendet.

2.10. Präparation und Analyse von Proteinen

2.10.1 Bestimmung von Protein-Konzentrationen

Proteinkonzentrationen wurden nach der Methode von Bradford (1976) bestimmt.

Dabei wurde ein Probenvolumen von 0,2 ml mit 1,8 ml Bradford-Reagenz vermischt

und 10 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde die OD595 dieser Lösung bestimmt.

Anhand einer Eichgeraden, die zuvor mit Rinderserumalbumin erstellt wurde, kann auf

die in der Probe enthaltene Proteinmenge geschlossen werden.


30

Bradford-Reagenz: 50 mg Coomassie-Brilliant-Blue

25 ml Ethanol (95 %)

50 ml Phosphorsäure (85 %)

ad 500 ml A.dest

2.10.2 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese von Proteinen (SDS-PAGE)

Die gelelektrophoretische Auftrennung der Proteine erfolgte in 10% SDS-

Polyacrylamidgelen nach der Methode von Laemmli (1970). Vor dem Auftragen wurde

den Proteinproben ein halbes Volumen 3x SDS-Probenpuffer zugesetzt und das

Gemisch für 5 min in einem Wasserbad gekocht. Die Gelelektrophorese wurde mit dem

"Mini-Protean® II Electrophorese Cell"-System der Firma Bio Rad bei einer Spannung

von 200 V für 45 min mit Tris/Glycerinpuffer durchgeführt.

Gelabmessungen: Sammelgel: 13 x 4 x 0,15 cm

Trenngel: 13 x 8 x 0,15 cm

Puffer und Lösungen:

3x SDS-Probenpuffer: 15 % (v/v) Glycerin

7,5 % (v/v) ß-Mercaptoethanol

4,5 % (w/v) SDS

93,8 mM Tris/HCl, pH 6,8

0,3 % (w/v) Bromphenolblau

Laufpuffer: 25 mM Tris/HCl, pH 8,3

250 mM Glycin

0,1 % (w/v) SDS

Upper Tris (Trenngel): 0,5 M Tris/HCl, pH 6,8

Lower Tris (Sammelgel) 1,5 M Tris/HCL, pH 8,8


31

Acrylamid-Stammlösung: 38 g Acrylamid

2 g Bisacrylamid

in 100 ml A.dest.

Zusammensetzung der Gele:

10 % Trenngel: 2 ml Acrylamid-Stammlösung

2 ml Lower Tris

4 ml A.dest.

40 µl APS (10 %)

40 µl SDS (20 %)

20 µl TEMED

4 % Sammelgel: 0,5 ml Acrylamid-Stammlösung

1,25 ml Upper Tris

3,25 ml A.dest.

25 µl APS (10 %)

25 µl SDS (20 %)

10µl TEMED

Nach der Gelelektrophorese wurden die Trenngele in einer Coomassie-Färbelösung für

ca. 20 min gefärbt. Durch anschließende Behandlung mit Entfärberlösung, konnte der

Hintergrund entfärbt werden.

Coomassie-Färbelösung: 0,3% (w/v) Coomassie Brilliant Blue G

30 % (v/v) Isopropanol

10 % (v/v) Essigsäure

Entfärberlösung: 30 % (v/v) Methanol

7,5 % (v/v) Essigsäure


32

2.10.3 Reinigung des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten

Die induzierten Zellen wurden mit Ultraschall aufgeschlossen (2.8.5). Der Überstand

wurde auf eine Bio-Rex 70-Säule (Volumen: 80 ml) gegeben, welche zuvor mit Puffer

B (siehe unten) äquilibriert wurde. Im Anschluß wurde die Säule solange mit Puffer B

gewaschen, bis der OD280-Wert des Durchlaufs unter 0,1 lag. Die Elution der BGT

erfolgte durch einen NaCl-Gradienten (0-1M) in Puffer B. Nach der Vereinigung der

BGT enthaltenden Fraktionen wurde das Enzym durch eine Ammoniumsulfat-Fällung

(80 % Sättigung) ausgefällt und bei 19000 upm für 30 min sedimentiert (SS34-Rotor,

4oC). Das Ammoniumsulfat-Pellet wurde in 1 ml Puffer Bo aufgenommen und gegen

2 l Puffer Bo für ca. 20 h bei dreimaliger Erneuerung von Puffer Bo dialysiert. Das

Dialysat wurde anschließend auf eine Sepharyl-Säule S 200 (25 ml) aufgebracht und

mit Puffer B0 (siehe unten) eluiert. Die BGT enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt

und gegen Puffer C (siehe unten) dialysiert. Nach jedem Reinigungsschritt wurden

Proben zur gelelektrophoretischen Überprüfung und zur Protein-Konzentrations-

bestimmung entnommen.

Puffer B: 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,9

1mM DTT

2 mM EDTA

5 % (v/v) Glycerin

50 mM NaCl

Puffer B0: ohne 50 mM NaCl, sonst gleiche Zusammensetzung wie

Puffer B

Puffer C: 10 mM Kaliumphosphat, pH 7,9

1 mM DTT

2 mM EDTA

50 % (v/v) Glycerin


33

2.10.4 Analyse der Protein–DNA-Interaktion mittels Gel-Mobilitäts Tests

Gel-Mobilitäts Test mit DNA-Fragmenten (700bp)

Als Substrat für die Gel-Mobilitäts Tests wurden unterschiedlich modifizierte DNA-

Fragmente mit einer Länge von ca. 700bp eingesetzt. Durch Restriktion der

genomischen T4*-DNA mit EcoRI und durch Restriktion der genomischen T4-Wildtyp-

DNA mit TaqI konnten HMC-modifizierte bzw. glukosylierte DNA-Fragmente nach

Rückgewinnung aus einem präparativen Agarosegel gewonnen werden (2.9.10). Bei

dem unmodifizierten DNA-Fragment handelte es sich um PCR Produkt. Zur

Elektrophorese wurde 1 bis 2% MetaPhor® Agarose (BIO WHITTAKER, BMA)

eingesetzt. Die elektrophoretischen Bedingungen entsprachen der einer Standard

Agarosegelelektrophorese (2.9.9), mit einem Vorlauf von 45 min. Der zu trennende

Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:

Tris/HCl pH 7,9 100 mM MgCl2 25 mM Β-ME 0,3 mM UDPG 0,25 mM BGT 8 µM DNA-Fragment 0,5 – 0,6 µg Gesamtvolumen 15 µl

Die Inkubation erfolgte bei RT für 30 min. Nach Zugabe von 6µl DNA-Probenpuffer

(3x) wurde der gesamte Reaktionsansatz gelelektrophoretisch getrennt.

Gel-Mobilitäts Tests mit Oligonukleotiden (20bp)

Als Substrat für die Gel-Mobilitäts Untersuchungen wurde ein HMC-modifiziertes

ds-Oligonukleotid verwendet (2.4). Die gelelektrophoretische Trennung erfolgte durch

ein natives Polyacrylamidgel (15%) in einer vertikalen Gelkammer (Bio Rad Mini

Protean® II Dual Slab Cell.) bei einer Spannung von 150V auf Eis für 60 min. Dabei

wurde TBE-Puffer (1x) als Elektrophorese-Puffer verwendet. Anschließend wurden die

Gele in einer Ethidiumbromid-Lösung (1 µg/ml) gefärbt, um eine Detektion der DNA


34

unter UV-Licht zu ermöglichen. Der zu trennende Reaktionsansatz hatte folgende

Zusammensetzung:

Tris/HCl pH 7,9 100 mM MgCl2 25 mM UDPG 0,1 mM BGT 12 µM DNA-Oligomer 4,5 µM Gesamtvolumen 20 µl

Die Inkubation erfolgte bei 30oC für 30 min. Nach Zugabe von 10 µl DNA-

Probenpuffer (3x) wurden 25 µl des Reaktionsansatzes gelelektrophoretisch getrennt.

Zusammensetzung des Polyacrylamid-Gels: 5,6 ml Acrylamid-Stammlösung

1,5 ml TBE (10x)

7,9 ml H2O

70µl APS

35µl TEMED

2.11 Aktivitätstests des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten

Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität der BGT erfolgte durch die Verwendung

von UDPG-14C (spezifische Aktivität: 330 mCi/mmol) als Donorsubstrat. Der

enzymatische Umsatz läßt sich dabei durch die Übertragung von 14C markierter Glukose

auf T4*-DNA nachweisen. Der Standard-Reaktionsansatz hatte folgende Zusammen-

setzung:

Tris/HCl pH 7,9 100 mM MgCl2 25 mM UDPG 0,2 mM UDPG-14C 4,4 µM Enzym 0,12 µM T4*-DNA 9,5 µg Gesamtvolumen: 100 µl


35

Die Inkubation erfolgte bei 30oC für 15 min. Anschließend wurden die

Reaktionsansätze mittels einer Vakuum-Pumpe durch Anionentauscher-Filter DE81

(Whatman) gesaugt. Die Filter wurden dreimal mit jeweils 5 ml 0,5 M NaH2PO4

(pH 7,0) für 5 min gewaschen und in einem Trockenofen getrocknet. Zur Bestimmung

der eingebauten Radioaktivität wurden die getrockneten Filter in einem

Szintillationsgefäß mit 8 ml Szintillationsflüssigkeit überschichtet und anschließend in

einem Szintillationszähler gezählt. Je nach Art der durchgeführten Aktivitäts-

bestimmungen wurden bestimmte Parameter der Reaktionsbedingungen geändert.

Bei der Bestimmung der BGT-Aktivität in Abhängigkeit von der MgCl2- und CaCl2-

Konzentration wurden jeweils 12 Salzkonzentrationen von 10-6 bis 2*10-1 M eingesetzt.

2.11.1 Kinetische Messung der BGT-Aktivität

Zur Bestimmung der kinetischen Daten Vmax, KM und kcat wurde die UDPG-

Konzentration schrittweise von 200 µM bis 0,8 µM in 8-10 Einzelmessungen erniedrigt.

Dazu wurde ein Mix, bestehend aus UDPG und UDPG-14C in einem Verhältnis von

22,7 : 1 entsprechend verdünnt. Die Auswertung der kinetischen Daten erfolgte mit der

Software ORIGIN 6.0.

2.11.2 Bestimmung der IC50-Werte verschiedener Inhibitoren

Zur Bestimmung der IC50-Werte wurde die Konzentration der untersuchten Inhibitoren

in dem Standard-Reaktionsansatz (2.11) in zehn Einzelmessungen stufenweise von

0,1 mM bis 4 mM erhöht und wie oben beschrieben behandelt (2.11).

2.11.3 Bestimmung der Ki-Werte verschiedener Inhibitoren

Zur Bestimmung der Ki-Werte wurde, wie oben beschrieben, die UDPG-Konzentration

im Standard-Reaktionsansatz bei konstant gehaltener Inhibitor Konzentration variiert

(2.10.6). Aus den in drei kinetischen Messungen, jeweils mit einer Inhibitor-


36

Konzentration von 0,5 mM, 1 mM und 2 mM (bzw. 2,5 mM), ermittelten KM und

Vmax-Werten wurde der Ki-Wert eines Inhibitors ermittelt.

2.11.4 Autoradiographischer Nachweis der BGT-Aktivität mit

Oligonukleotiden

Als Substrat für die autoradiographische Untersuchung der BGT-Aktivität wurde ein

HMC- bzw. ein HMU-modifiziertes ds-Oligonukleotid (20 bp) verwendet (2.4). Die

gelelektrophoretische Trennung erfolgte durch ein natives Polyacrylamidgel (15%) in

einer vertikalen Gelkammer (Bio Rad Mini Protean® II Dual Slab Cell) bei einer

Spannung von 150 V für 60 min. Dabei wurde TBE-Puffer (1x) als Elektrophorese-

Puffer verwendet. Anschließend wurde das Gel mit 5% (v/v) Glycerin-Lösung.

überschichtet und getrocknet. Die Auswertung erfolgte mit Hilfe eines Phosphor-

imagers. Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:

Tris/HCl pH 7,9 100 mM MgCl2 25 mM UDPG-14C 22 µM BGT 12 µM DNA-Oligomer 4,5 µM Gesamtvolumen 20 µl

Die Inkubation erfolgte bei 30oC für 30 min. Nach Zugabe von 10 µl DNA-

Probenpuffer (3x) wurden 25 µl des Reaktionsansatzes aufgetragen.

2.11.5 Aktivitätstest mit Oligonukleotiden

Zur Bestimmung der BGT Aktivität mit ds-Oligonukleotiden (20 bp) als Akzeptor-

Substrat wurde der unten stehende Reaktionsansatz verwendet. Nach einer Inkubation

von 30 min bei 30oC, wurde der Reaktionsansatz zur Isolierung der DNA-

Oligonukleotide anschließend mit dem Qiaquick® Nukleotid Removel Kit nach dem

Protokoll des Herstellers bis zum Elutionsschritt behandelt. Nach dem Waschschritt


37

wurde die Säule in einem Trockenofen getrocknet, um anschließend mit Hilfe einer

Pinzette die Membran, an der die DNA gebunden ist, herauszupräparieren. Die

getrocknete Membran wurde in einem Szintillationsgefäß mit 8 ml Szintillations-

flüssigkeit überschichtet und im Szintillationszähler gezählt.

Reaktionsansatz: Tris/HCl pH 7,9 100 mM MgCl2 25 mM UDPG-14C 8,8 µM BGT 1 µM DNA-Oligomer 4,5 µM Gesamtvolumen 50 µl

2.11.6 Bestimmung der BGT–Aktivität mittels HPLC

Die Aktivität der BGT ohne Akzeptor-DNA-Substrat konnte durch eine analytische

HPLC ermittelt werden. Die Trennung des Reaktionsansatzes erfolgte isokratisch durch

eine reverse phase C18 Säule der Firma Phenomenex (Nucleosil 5 C18 100A) bei einer

Flußgeschwindigkeit von 1 ml/min und einer Wellenlänge von 264 nm über einen

Zeitraum von 6 min. Als mobile Phase wurde ein Phosphatpuffer mit einem Ionenpaar-

Bildner folgender Zusammensetzung verwendet:

25 mM Phosphat-Puffer pH 6,4

2 mM 11-Aminoundecan-Säure

in H2O / Methanol (92 : 8 v/v)

Der Reaktionsansatz hatte folgende Zusammensetzung:

Tris/HCl pH 7,9 100 mM MgCl2 25 mM UDPG 1 mM Enzym 24,5 µ Gesamtvolumen 100 µl


38

Nach der Inkubation bei 30oC für 16 h wurde der Reaktionsansatz auf Zellulose-Misch-

Ester Filter (0,025 µm) der Firma Millipore aufgebracht und für 30–40 min gegen

steriles A.dest dialysiert, um das MgCl2 aus dem Reaktionsansatz zu entfernen. Zur

Analyse wurden 20 µl des Dialysats in die Probenschleife injiziert.

2.12 Fluoreszenzmessungen

Die Fluoreszenzmessungen wurden durchgeführt, um die Bindekonstanten von UDPG

und UDP zu ermitteln. Dabei wurde die Tryptophan-Fluoreszenz der BGT untersucht,

deren Intensität durch die Bindung von UDPG und UDP abnimmt. Die Messungen

wurden an einem Fluoreszenzspektrometer SLM, AB2 (Aminco) mit folgenden

Einstellungen durchgeführt:

Anregung: 295 nm Bandbreite: 2 nm

Emission: 340 nm Bandbreite: 16 nm

Integrationszeit: 1,9 sec.

Während der Messung wurde die Temperatur in der Küvette konstant bei 25oC gehalten.

Vor der Titration wurde die Lösung A mehrmals mit einem Spatel solange gemischt, bis

sich das Fluoreszenzsignal stabilisiert hatte. Anschließend wurde Lösung B in kleinen

Portionen zugegeben und die jeweilige Fluoreszenzintensität bestimmt. Die Zeit-

intervalle zwischen den einzelnen Messpunkten betrugen 300–400 sec. Die Auswertung

der Daten erfolgte mit dem Graphikprogramm GRAPHIT 3.0.

Lösung A: 800 µl Lösung B: 300 µl

Tris/HCl pH 7,9 100 mM Tris/HCl pH 7,9 100 mM

MgCl2 25 mM MgCl2 25 mM

BGT 1 µM BGT 1 µM

Triton X100 0,01% Triton X100 0,01%

UDPG/UDP 1 mM

67

3. Ergebnisse

3.1 Ortsspezifische Mutagenese

Die ortsspezifische Mutagenese ist in der Molekularbiologie ein sehr wichtiges

Hilfsmittel zur Untersuchung der Regulation, der Expression und der Funktion von

Genen und Proteinen. Eine der meist verwendeten Methoden ist die Oligonukleotid-

gesteuerte Mutagenese (Zoller und Smith, 1982, 1983). Dabei dient der zu mutierende

DNA-Abschnitt als Matrize zur Synthese eines mutagenisierten DNA-Stranges durch

eine DNA-Polymerase. Als Primer werden synthetisch hergestellte Oligonukleotide

verwendet, die zu dem zu mutierenden Bereich der Matrize komplementär sind und die

gewünschte Mutation tragen. In dieser Arbeit wurde ausschließlich mit dem

Mutagenese System Quick Change® der Firma Stratagene gearbeitet (2.9.6). Als DNA-

Matrize diente dabei der Vektor PBS-SK, in dem zuvor das βgt-Gen über die BamHI

Restriktionsschnittstelle einkloniert wurde (Abb.8) Durch zwei komplementäre

mutagene Primer (2.4) konnte über eine PCR die gewünschte Mutation eingeführt

werden. Die Überprüfung der eingeführten Mutation erfolgte durch eine DNA-

Sequenzierung des gesamten βgt-Gens. Die Mutationseffizienz lag dabei zwischen 80

und 100 %. Aufgrund der zur Verfügung stehenden Strukturdaten wurden Aminosäuren

des katalytischen Zentrums und der DNA-interagierenden Region gegen Alanine

ausgetauscht. In Tabelle 3 sind die in dieser Arbeit untersuchten BGT-Mutanten mit

ihrer entsprechenden Mutationseffizienz und die postulierten Funktion der substituierten

Reste dargestellt.

Ergebnisse

40

Tab.3: Mutationseffizienzen der BGT-Mutanten und die postulierte Funktion der substituierten Aminosäuren.

Mutations- BGT-Mutante postulierte Funktion der substituierten Reste effizienz/(%)

Glu22Ala Protonenakzeptor 100 Phe71Ala DNA-Interkalierung 100 Phe72Ala DNA-Interkalierung 100

Asp100Ala Protonenakzeptor 100 Tyr261Ala Stabilisierung des Kofaktors 83 Glu163Ala Stabilisierung des Kofaktors 95

Glu22Ala/Asp100Ala s.o 90 Phe71Ala/Phe72Ala s.o 95 Glu22Ala/Glu163Ala s.o 100

Abb.8: Schematische Darstellung des Vektors pBluescript II SK (+/-).

3.2 Überexpression und Reinigung der BGT-Mutanten

Zur Überexpression der BGT-Mutanten wurde der entsprechend mutagenisierte Vektor

PBS-SK-βgt in den E.coli Expressionsstamm BL21DE3 transformiert (2.8.1). In der

DNA dieses Expressionsstamms befindet sich ein lysogener Anteil des Phagen Lambda

(λDE3), der unter der Kontrolle des Lac-Promotors und des Lac-Operators T7-RNA-

Polymerase transkribiert.

Ergebnisse

41

Abb.9: SDS-Gel der Rohextrakte der BGT-Mutante Asp100Ala vor bzw. nach Induktion. Spur 1: Marker (gereinigter BGT-wt), Spur 2: Rohextrakt vor Induktion, Spur 3: Rohextrakt nach Induktion.

Das βgt-Gen wurde zuvor in entgegengesetzter Orientierung zum LacZ-Gen in den

Vektor PBS-SK einkloniert, so daß die Transkription des ßgt-Gens unter der Kontrolle

des T7-Promotors steht. Das Expressionssystem ist somit durch IPTG induzierbar.

Stellvertretend für alle sechs Enzymaufarbeitungen werden nur die Ergebnisse der

Reinigung der BGT-Mutante Asp100Ala dargestellt. Durch eine SDS- PAGE (Abb.9)

wurde die Überexpression überprüft. Es ist eine deutliche überexprimierte Proteinbande

bei 40kDa in Spur3 zu erkennen, die der BGT zugeordnet werden konnte.

Insgesamt wurden aus 4 l induzierter Bakterienkultur 10,5 g Zellmasse

gewonnen. Nach dem Zellaufschluß (2.8.5) wurde das erhaltene Rohextrakt mit Puffer

B auf eine Proteinkonzentration von 5mg/ml eingestellt und anschließend einer NaCl-

Gradienten Ionentauscherchromatographie (Bio Rex 70) unterzogen (Abb. 10). Die

Elution erfolgte bei einer NaCl-Konzentration von 0,35M. Die BGT enthaltenden

Fraktionen (5-10) wurden vereinigt, durch eine Ammoniumsulfat-Fällung (80%-

Sättigung) konzentriert und anschließend gegen Puffer Bo dialysiert. Um ein hochreines

Protein zu erhalten, wurde in dem letzten Reinigungsschritt das Dialysat durch eine

Molekularsieb-Säule (Sepharyl S200) aufgetrennt (Abb.11), die BGT enthaltenden

Fraktionen (7-10) vereinigt und gegen Puffer C dialysiert (2.10.3). Nach jedem

Reinigungsschritt wurden Aliquots zur Bestimmung der Proteinkonzentration

entnommen und zu deren Analyse eine SDS-PAGE durchgeführt.

Ergebnisse

42

Abb.10: SDS-Gel der aufgefangenen Fraktionen der Ionentauscherchromatographie (Bio Rex-70) (BGT-Mutante Asp100Ala). Spur 1: Marker ( gereinigter BGT-wt) Spur 5-10: BGT-haltige Fraktionen.

Abb.11: SDS-Gel der aufgefangenen Faktionen des Molekularsiebs Sepharyl S200 (BGT-Mutante Asp100Ala). Spur 1: Marker ( gereinigter BGT-wt), Spur 7-10: BGT-haltige Fraktionen.

Der Reinheitsgrad der gereinigten BGT-Mutante Asp100Ala wurde durch eine

densitometrische Auswertung eines silbergefärbten Polyacrylamidgels bestimmt

(Abb.12). Die Integration der Hauptbande ergab einen Flächenanteil von 97,5% der

Gesamtfläche. Dieser Wert entspricht dem Reinheitsgrad der gereinigten Proteinprobe.

Ergebnisse

43

Abb.12: SDS-Gel (silbergefärbt) der gereinigten BGT-Mutante Asp100Ala. Links: Spur 1: Marker (10 kDa-Leiter), Spur 2: gereinigte BGT-Mutante D100A. Rechts: Profil der densitometrischen Auswertung der Spur 2.

In Tabelle 4 ist die Ausbeute an Proteinmasse aus 10,5 g Zellmasse nach jedem

Reinigungsschritt der BGT-Mutante D100A dargestellt.

Tab.4: Ausbeute an Proteinmasse nach jedem Reinigungsschritt der BGT-Mutante Asp100Ala.

Reinigungsschritt Gesamtprotein/(mg)

Rohextrakt 525 Bio Rex70 212 AS-Fällung 89

Sepharyl S200 43 Gereinigtes Protein 14,1

Die Proteinausbeuten der übrigen BGT-Mutanten lagen zwischen 19 und 45 mg. Eine

Ausnahme bildeten die BGT-Mutanten Phe71Ala und Tyr261Ala, deren Ausbeuten nur

bei 2,4 bzw.1,25 mg lagen. Die Reinheitsgrade lagen zwischen 95 und 99%, und waren

somit ausreichend für biochemische und strukturelle Charakterisierungen. Die BGT-

Mutanten Glu22Ala und Asp100Ala wurden zur Kristallisation und zur

Strukturaufklärung an Solange Moréra weitergeleitet.

Ergebnisse

44

3.2.1 Überexpression und Reinigung der BGT-Doppelmutante

Glu22Ala/Asp100Ala

Zur Überexpression (2.8.4) wurde das Plasmid PBS-Sk-ßgt (Glu22Ala/Asp100Ala) in

den Expressionsstamm BL21DE3 transformiert (2.8.3). Nach dem Zellaufschluß (2.8.5)

zeigte sich jedoch, daß es während der Überexpression zur Bildung von

Einschlußkörpern gekommen ist (Abb.13). Es ist zu erkennen, daß sich das

überexprimierte Protein in dem Resuspendat der unlöslichen Fraktion (Abb.13: Spur 2)

befand. In dem Überstand, der die löslichen Proteine enthielt, war nur ein sehr geringer

Anteil des Proteins vorhanden (Abb.13: Spur 3), dessen Reinigung zu geringe

Proteinausbeuten für weitere Untersuchungen erbrachte.

Abb13.: SDS-Gel der löslichen und unlöslichen Fraktion nach dem Zellaufschluß der BGT-Doppelmutante Glu22Ala/Asp100Ala. Spur 1: Marker (10kDa-Leiter), Spur 2: Resuspendat der unlöslichen Fraktion, Spur 3: lösliche Fraktion.

Trotz der Durchführung von zwei Protokollen zur Reinigung von Einschlußkörpern

(Müller, 1991 und Tiemann, 1999), konnten die beiden BGT-Doppelmutanten

Glu22Ala/Glu163Ala und Phe71Ala/Phe72Ala, die ebenfalls Einschlußkörper

ausbildeten, nicht gereinigt werden.

Ergebnisse

45

3.3 BGT-Aktivität

Um einen in vitro Aktivitätstest zur kinetischen Analyse des BGT-Wildtyps und der

BGT-Mutanten zu entwickeln, ist es notwendig einige Parameter des Reaktionsansatzes

zu optimieren. Dazu zählt u.a. die Wahl eines geeigneten Puffersystems und die

Bestimmung der optimalen Konzentration des Mg2+-Kofaktors. Zudem muß

gewährleistet sein, daß es während der Reaktion zu keiner Limitierung der Substrate

kommt. Von Interesse ist auch die Frage, ob andere divalente Kationen zur Aktivierung

der BGT führen können.

3.3.1 Aktivität der BGT in Tris-Puffer

Zur Durchführung der Aktivitätstests wurde unglukosylierte genomische T4*-DNA

eingesetzt. Aufgrund der häufig auftretenden Präzipitation der T4*-DNA in hohen

Konzentrationen bei der Verwendung von Kaliumphosphat-Puffer innerhalb des

ursprünglichen Aktivitätstests (Kornberg, 1961) wurde alternativ die Verwendbarkeit

von Tris/HCl–Puffer untersucht. Entgegen der Aussage von Kornberg (1961), daß die

Aktivität der BGT in Tris/HCl-Puffer gehemmt wird, ließ sich kein Aktivitätsverlust im

Vergleich zum Kaliumphosphat-Puffer feststellen. Der lineare Zusammenhang

zwischen der BGT-Aktivität und der eingesetzten Enzymmenge zeigt außerdem, daß es

unter diesen Reaktionsbedingungen zu keiner Substrat-Limitierung kam (Abb.14) Für

die Aktivitätsbestimmungen wurde daher Tris/HCl-Puffer verwendet.

Ergebnisse

46

0,0 0,5 1,0 1,5 2,00

10000

20000

30000

40000

50000

Aktiv

ität /

(cpm

)

BGT / (µg)

Abb.14: BGT-Aktivität in 100mM Tris/HCl-Puffer (pH7,9) in Abhängigkeit von der Proteinmenge (BGT) im Bereich von 0,05-1,5µg. UDPG 0,2mM; T4*-DNA 9,5µg; MgCl2 25mM. 3.3.2 BGT-Aktivität in Abhängigkeit verschiedener divalenter Kationen

Unter in vivo Bedingungen ist für die BGT-Aktivität das divalente Magnesiumion

essentiell (Kornberg et al., 1961). Zur genaueren Aufklärung der Funktion des

Magnesiums während der Katalyse und zur strukturellen Aufklärung der an der

Metallbindung beteiligten Aminosäuren wurde der Einfluß verschiedener divalenter

Ionen auf die BGT-Aktivität untersucht. Es wurden jeweils Aktivitätstests mit den

Chlorid-Salzen von Mg, Ca, Mn, Ba, Co, Zn, und Cu bei einer Konzentration von 25

mM durchgeführt (Abb.15). In Anwesenheit von 25 mM Mg2+ wurde die BGT-

Aktivität, im Vergleich zur Aktivität ohne divalentes Metall um den Faktor 10

gesteigert. Bei den Ionen Ca2+, Mn2+ und Ba2+ war eine Steigerung der Aktivität um den

Faktor 8 zu bebachten. ZnCl2 und CuCl2 hingegen aktivierten die BGT nicht.

Ergebnisse

47

0

2

4

6

8

10

ohne MetallCuCl2ZnCl2

CoCl2BaCl2MnCl2CaCl2MgCl2

Aktiv

ität /

(nm

ol/h

)

Abb.15: BGT-Aktivität in Abhängigkeit verschiedener divalenter Kationen (25 mM). UDPG 0,2mM; BGT 0,12µM; T4*-DNA 9,5µg.

Zur Bestimmung der optimalen Salzkonzentration wurde die BGT-Aktivität jeweils in

Anwesenheit steigender Konzentrationen von MgCl2 und CaCl2 untersucht (Abb.16).

Das Optimum der Salzkonzentration liegt zwischen 20 und 50 mM sowohl für MgCl2

als auch für CaCl2.

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

22

2*10-110-15*10-24*10-23*10-22*10-210-25*10-310-310-410-510-6

Aktiv

ität /

(nm

ol/h

)

Konzentration / (mol/l)

CaCl2MgCl2

Abb.16: BGT-Aktivität in Abhängigkeit steigender MgCl2-und CaCl2-Konzentration. Gemessen wurde in einem Bereich von 10-6 bis 0,21 M. UDPG 0,2µM; BGT 0,12µM; T4*-DNA 9,5µg.

Ergebnisse

48

Die Tatsache, daß Ca2+ und Mn2+ neben Mg2+ zu einer starken Aktivierung der BGT

führten, machte eine strukturelle Analyse interessant. Im Labor von Solange Moréra

konnten daraufhin drei BGT-Strukturen jeweils mit gebundenem Ca2+, Mn2+ und Mg2+

untersucht werden (4.3).

3.4 Protein-DNA-Interaktion mittels Gel-Mobilitäts Tests

Zur Untersuchung der DNA-Bindung der BGT wurden Gel-Mobilitäts-Tests

durchgeführt. Diese Methode basiert auf der Verringerung der elektrophoretischen

Mobilität von DNA in Polyacrylamidgelen oder hochauflösenden Agarosegelen

(METAPHOR-Agarose®), bedingt durch die Bindung eines Proteins an die DNA

(Bertin et al., 1999).

Abb.17: Gel-Mobilitäts-Test in 2%-METAPHOR-Agarose® mit unterschiedlich modifizierten DNA-Fragmenten (ca. 700bp) in Abhängigkeit von UDPG (EtBr.-gefärbt, invertierte Darstellung). Spur 1: Marker (100bp-Leiter), Spur 2: HMC-DNA-Kontrolle ohne BGT, Spur 3: HMC-DNA mit UDPG + BGT, Spur 4: HMC-DNA ohne UDPG + BGT, Spur 5: unmodifizierte DNA-Kontrolle ohne BGT, Spur 6: unmodifizierte DNA mit UDPG + BGT, Spur 7: unmodifizierte DNA ohne UDPG + BGT, Spur 8: glukosylierte DNA-Kontrolle ohne BGT, Spur 9: glukosylierte DNA mit UDPG +BGT, Spur 10: glukosylierte DNA ohne UDPG + BGT. DNA-Fragmente 0,5-0,6 µg; BGT 8µM; UDPG 250µM; Mg2Cl 25mM.

Ergebnisse

49

Um die Spezifität der DNA-Bindung der BGT zu ermitteln, wurden unterschiedlich

modifizierte DNA-Fragmente (ca. 700bp) eingesetzt. Es handelte sich dabei um

unglukosylierte HMC-DNA als natürliches Akzeptor-Substrat, glukosylierte HMC-

DNA, als Produkt der enzymatischen Reaktion, und um unmodifizierte DNA. Zudem

wurde der Einfluß des Donorsubstrates UDPG auf die DNA-Bindung in Anwesenheit

dieser unterschiedlich modifizierten DNA-Fragmente untersucht (Abb.17). Als Gel-

Matrix wurde METAPHOR-Agarose® unter nativen Elektrophorese Bedingungen

eingesetzt (2.10.4).

Bei allen drei verwendeten DNA-Fragmenten war ein deutlicher

Mobilitätsunterschied, bedingt durch Bindung der BGT an die DNA, zu erkennen (Spur

3, 6, 9). Die Tatsache, daß neben der DNA-Bindung an das natürliche Akzeptor-

Substrat HMC-DNA sowohl das Produkt (glukosylierte HMC-DNA) als auch

unmodifizierte DNA gebunden wird, belegt die Unspezifität der DNA-Bindung durch

die BGT. Ein Einfluß des UDPG auf die DNA-Bindung der BGT konnte unter diesen

Bedingungen nicht nachgewiesen werden (Spur 4, 7, 10).

Neben der Mg2+-Abhängigkeit der BGT-Transferreaktion (3.3.2) konnte auch

ein Einfluß des Mg2+ auf die DNA-Bindung durch einen Gel-Mobilitäts-Test

nachgewiesen werden (Abb.18). Dabei wurde die DNA-Bindung des

Akzeptorsubstrates (HMC-DNA, ca. 700bp) mit der, des Produktes (glukosylierte

HMC-DNA, ca. 700bp) jeweils mit und ohne MgCl2 qualitativ verglichen. Die

Konzentration der Metaphor-Agarose wurde dabei auf 1,5% erniedrigt, um den sog.

„Käfig Effekt“ der Gel Matrix herabzusetzen. Dies erhöht die Diffusionsrate eines

instabileren Protein/DNA-Komplexes und ermöglicht dadurch eine sensiblere Detektion

geringfügiger Mobilitätsunterschiede (Fried und Daugherty, 1998). In Abwesenheit von

Mg2+ war der BGT-HMC-DNA-Komplex deutlich stabiler (Spur 4), als in Anwesenheit

von Mg2+ (Spur 3). Die diffuse DNA-Bande in Spur 3 deutet auf einen instabilen

Protein/DNA-Komplex. Bei der glukosylierten DNA (Spur 6, 7) läßt sich hingegen kein

Einfluß des Mg2+ auf die DNA-Bindung nachweisen.

Ergebnisse

50

Abb.18: Gel-Mobilitäts-Test in 1,5%-METAPHOR-Agarose® mit HMC-DNA und glukosylierter HMC-DNA (ca. 700bp) in An- und Abwesenheit von Mg2+ (EtBr.-gefärbt, invertierte Darstellung). Spur 1: Marker (Lambda.EcoRI/HindIII), Spur 2: HMC-DNA Kontrolle ohne BGT, Spur 3: HMC-DNA mit Mg2+ + BGT, Spur 4: HMC-DNA ohne Mg2+ + BGT, Spur 5: glukosylierte HMC-DNA Kontrolle ohne BGT, Spur 6: glukosylierte HMC-DNA mit Mg2+ + BGT, Spur 7: glukosylierte HMC-DNA ohne Mg2+ + BGT. DNA-Fragmente 0,5-0,6 µg, BGT 8µM, UDPG 250µM.

3.5 Bestimmung der Bindungskonstante KD von UDPG und UDP

Die Bestimmung der Bindungskonstante KD der BGT für die Liganden UDPG und UDP

erfolgte durch Tryptophan-Fluoreszenz Messungen (2.12). Die BGT besitzt insgesamt

5 Tryptophane, die auf beiden Domänen lokalisiert sind. Tryptophane können zur

Fluoreszenz angeregt werden, wobei die relative Intensität von der direkten Umgebung

des Tryptophans abhängig ist. Die Bindung eines Liganden führt daher zur Änderung

der Tryptophan-Fluoreszenz-Intensität. Bei der Bindung von UDPG oder UDP an die

BGT kommt es zur Abnahme der Fluoreszenz-Intensität. Aus der Änderung der

Fluoreszenz in Abhängigkeit von der UDPG (UDP)-Konzentration läßt sich die

Bindungskonstante ermitteln. Sie ist ein Maß für die Affinität des Enzyms zu seinem

Substrat UDPG (UDP). Ein hoher KD-Wert entspricht einer schwächeren, ein niedriger

KD-Wert einer stärkeren Bindung. In der Abb.19. ist beispielhaft die Bindungskurve zur

Bestimmung des KDUDPG-Wertes für die BGT dargestellt.

Ergebnisse

51

0 2 4 6 8 10 12 14 16 181700

1800

1900

2000

2100

2200

rel.

W-F

lour

esze

nz

UDPG/(µM)

Abb.19: Titrationskurve zur Bestimmung der Bindekonstante KD

UDPG für die BGT mit Hilfe der

Tryptophan-Fluoreszenz. BGT 1µM; MgCl2 25mM.

Tab.5: Bindekonstanten der BGT für die Liganden UDPG und UDP.

Ligand KD/(µM)

UDPG 2,16 UDP 22,9

Aus den ermittelten Bindungskonstanten (Tab.5) ist zu erkennen, daß die Affinität der

BGT zum Donorsubstrat UDPG etwa 11mal höher war, als zum Produkt UDP.

3.6 Charakterisierung der BGT-Wildtyp- und der BGT-Mutanten

Enzyme

3.6.1 Kinetische Untersuchungen des BGT-Wildtyps und der BGT-

Mutanten

Die Bestimmung der kinetischen Konstanten für die Glukosylierung durch die BGT und

die BGT-Mutanten wurde nach 2.11.1 durchgeführt. Aufgrund der bereits aufgeklärten

3D-Struktur der BGT wurden bestimmte Aminosäuren des katalytischen Zentrums und

Ergebnisse

52

der DNA interagierenden Region durch eine in vitro Mutagenese gegen Alanine

ausgetauscht (2.9.6). Durch den Vergleich der kinetischen Konstanten des Wildtyps und

der BGT-Mutanten sollte geklärt werden, ob sich die katalytische Aktivität oder die

Substratspezifität durch die Einführung der Punktmutation ändert. Die Meßwerte

wurden nach Michaelis-Menten aufgetragen und mit der Software ORIGIN 6.0

ausgewertet. In Abb.20 ist beispielhaft das Michaelis-Menten Diagramm des BGT-

Wildtyps dargestellt. Die kinetischen Konstanten des BGT-Wildtyps und der BGT-

Mutanten sind in der Tabelle 6 zusammengefaßt. Die angegebenen Werte sind jeweils

Mittelwerte aus Dreifachbestimmungen.

0 50 100 150 2000

2

4

6

8

10

12

Akt

ivitä

t/(nm

ol/h

)

UDPG/(µM)

Abb.20: Darstellung der Reaktionsgeschwindigkeit des BGT-Wildtyps in Abhängigkeit von der Substrat-Konzentration (UDPG). Der Graph wurde nach der Michaelis-Menten-Gleichung gefittet (Software ORIGIN 6.0). Tab.6: Kinetische Konstanten und Vmax des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten.

Mutante KM/(µM) Vmax/(nmol/h) kcat/(min-1) rel.Vmax/(%)

BGT-wt 23,4 12,7 17,6 100

Glu22Ala 47,01 6,1 8,4 47,9 Phe71Ala 28,9 6,8 9,4 53,5 Phe72Ala 15,7 5,8 8,1 45,6

Asp100Ala 13,1 2,1 2,9 16,5 Glu163Ala 22,8 12,4 17,1 97,6 Tyr261Ala 23,5 9,4 13,1 73,1

Ergebnisse

53

Der BGT-Wildtyp hatte einen KM-Wert von 23,4µM und einen enzymatischen Umsatz

von 17,6 UDPG-Molekülen pro Minute. Bei den BGT-Mutanten zeigte die Mutante

Asp100Ala die niedrigste Restaktivität mit 16,5% und mit 13,1µM den niedrigsten KM-

Wert. Die Mutante Glu22Ala (KM 47,1µM) und Phe72Ala (KM 15,7µM) mit einer

Restaktivität von jeweils rund 50% zeigten jedoch Schwankungen bezüglich ihrer

Michaelis-Menten Konstante im Vergleich zum Wildtyp. Mit ebenfalls rund 50%

Restaktivität führte die Substitution des Phe71 zu Alanin zu keiner Änderung des KM-

Wertes. Der Austausch des Glutamats 163 durch Alanin hatte keinen Einfluß auf die

BGT-Aktivität. Die Mutante Tyr261Ala zeigte nur eine geringe Hemmung, rund ¼

gegenüber dem Wildtyp, bei unverändertem KM-Wert.

3.6.2 Bestimmung der Aktivität des BGT-Wildtyps und der BGT-

Mutanten ohne DNA-Substrat mittels HPLC

Die BGT ist auch in Abwesenheit von DNA in der Lage UDPG in UDP und Glukose zu

spalten. Neben der Möglichkeit, den UDPG-Umsatz ohne DNA-Substrat anhand freier

Glukose durch einen gekoppelten enzymatischen Test (Hexokinase-Reaktion)

photometrisch nachzuweisen, wurde in dieser Arbeit eine chromatographische Methode

zur Bestimmung des UDPG-Umsatzes entwickelt (2.11.6). Dabei wird mit Hilfe einer

analytischen HPLC das Substrat UDPG und das entstandene Produkt UDP in dem

Reaktionsansatz getrennt (2.11.6) Der gemessene UDP-Anteil konnte als Maß für den

UDPG-Umsatz herangezogen werden. Zur quantitativen Bestimmung des UDPG-

Umsatzes wurde der relative Flächeninhalt in Prozent des UDP-Peaks durch die

Software CHROMELEON® 6.0 ermittelt. Die Fläche des UDP-Peaks des BGT-

Wildtyps diente als Referenz. Durch den Vergleich der kinetischen Daten (3.6.1) mit

den UDPG-Umsätzen ohne DNA-Substrat des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten

war es möglich, zwischen einer Beteiligung der untersuchten Aminosäuren an der

DNA-Interaktion und der UDPG-Spaltung zu unterscheiden. In der Abbildung 21A ist

das 3D-Absoptionsspektrum des über eine C18-Säule aufgetrennten UDPG/UDP-

Kontrollansatzes in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 300 nm dargestellt. Bei

210 nm und 265 nm erscheinen jeweils zwei Maxima, die dem UDPG- bzw. dem UDP-

Anteil entsprechen. Die Retentionszeiten für das UDPG und das UDP lagen bei 2,5 ±

0,1 min bzw. 3,0 ± 0,25 min (Abb.21B). Die Chromatogramme des BGT-Wildtyps und

Ergebnisse

54

der BGT-Mutanten sind in den Abbildungen 21C und 21D vergleichend dargestellt. Die

ermittelten relativen UDPG-Umsätze des Wildtyps und der Mutanten zeigt Tabelle 7.

Abb.21: Bestimmung des UDPG-Umsatzes des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten durch die HPLC. A: 3D-Absorptionsspektrum des Kontrollansatzes (UDPG 1mM, UDP 1mM). B: Chromatogramm des Kontrollansatzes ( UDPG 1mM, UDP 1mM).C: Vergleich der Chromatogramme vom BGT-Wiltyp (WT) und den BGT-Mutanten Glu163Ala und Phe72Ala. D: Vergleich der Chromatogramme vom BGT-Wildtyp und den BGT-Mutanten Asp100Ala und Glu22Ala. Als Substrat wurden jeweils 1mM UDPG eingesetzt, die Konzentration der BGT entsprach 24,5µM.

0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00

min

0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00

min

0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00

min

UDPGUDP

WTE163AF72A

WTD100AE22A

-0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00

min

200 nm

mAU

UDPGUDP

265 nm

A

B

C

D

Ergebnisse

55

Tab.7: Relative UDPG-Umsätze in Prozent des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten ermittelt durch die HPLC. Der Umsatz des BGT-Wildtyps wurde als Referenz gleich 100% gesetzt. Die Prozent-Werte entsprechen den relativen Flächeninhalten der UDP-Peaks.

Mutante rel. UDPG-Umsatz/(%)

BGT-wt 100 Glu22Ala 18 Phe72Ala 98 Asp100Ala 12 Glu163Ala 105

Aus den ermittelten UDPG-Umsätzen zeigt sich, daß der Austausch des Phenylalanins

72 und des Glutamats 163 durch Alanin keinen Einfluß auf die UDPG-Spaltung ohne

DNA-Akzeptorsubstrat hat. Es wurden Umsätze von 98 bzw. 105% erreicht. Bei der

kinetischen Untersuchung der Mutante Phe72Ala (3.6.1) konnte allerdings eine

Hemmung von ca. 45,6% in Anwesenheit von DNA ermittelt werden. Dies deutet auf

eine Beteiligung des Phenylalanins 72 an der DNA-Interaktion. Mit 18 bzw. 9% zeigten

die BGT-Mutanten Glu22Ala und Asp100Ala den geringsten UDPG-Umsatz. Der

Vergleich mit den niedrigen Restaktivitäten aus den kinetischen Untersuchungen (3.6.1)

spricht für eine Beteiligung des Glu22 und des Asp100 an der UDPG-Spaltung. Man

kann jedoch mutationsbedingte Struktur-änderungen nicht ausschließen.

3.6.3 DNA-Bindung des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten

Um zu überprüfen, ob die eingeführten Punktmutationen die DNA-Bindung

beeinflussen, wurden Gel-Mobilitäts Tests jeweils in An- und Abwesenheit von UDPG

durchgeführt (Abb.22). Ein HMC-modifiziertes Oligonukleotid (3.7) mit einer Länge

von 20bp diente als Akzeptorsubstrat. Als Gel-Matrix wurde Polyacryamid (15%) unter

nativen Elektrophorese-Bedingungen eingesetzt (2.10.4).

Ergebnisse

56

Abb.22: Gel-Mobilitäts-Test des BGT-Wildtyps und der BGT-Mutanten (15% Polyacrylamid, EtBr.-gefärbt, invertierte Darstellung) mit einem HMC-modifizierten Oligonukleotid (20bp). Spur 1: Kontrolle (20bp Oligonukleotid ohne BGT), Spur 2 und 3: BGT-wt mit (+) und ohne (-) UDPG; Spur 4 und 5: Glu22Ala mit (+) und ohne (-) UDPG; Spur 6 und 7: Asp100Ala mit (+) und ohne (-) UDPG; Spur 8 und 9: Phe72Ala mit (+) und ohne (-) UDPG; Spur 10 und 11: Glu163Ala mit (+) und ohne (-) UDPG. Oligonukleotid 4,5µM, BGT 12µM, UDPG 0,2 mM.

Die untersuchten BGT-Mutanten-Enzyme Glu22Ala, Phe72Ala, und Glu163Ala zeigten

keinen Unterschied in der DNA-Bindung im Vergleich zum Wildtyp-Enzym. Die

Anwesenheit von UDPG führte sowohl bei dem nativen Protein als auch bei diesen

Enzymmutanten zu einer Steigerung der Affinität zur DNA (Spur 2, 4, 8, 10). Es kann

daher davon ausgegangen werden kann, daß die eingeführten Punktmutationen keinen

Einfluß auf den Mechanismus der DNA-Bindung haben. Bei der Mutante Asp100Ala

blieb jedoch die vollständige Bindung an die DNA in Anwesenheit von UDPG aus

(Spur 6). Eine Beteiligung des Asp100 an den durch die Bindung des UDPG

ausgelösten strukturellen Veränderungen, die zu einer stärkeren Bindung an die DNA

führen, ist daher sehr wahrscheinlich.

Ergebnisse

57

3.7. Untersuchung der DNA-Bindung und der BGT-Aktivität mit

modifizierten Oligonukleotiden (20bp)

Im Hinblick auf die Aufklärung der 3D-Struktur eines ternären Komplexes zwischen

DNA, UDPG und BGT und zur Untersuchung der eventuellen Nachbar- oder

Partnerbasen abhängigen Glukosylierung der BGT, wurden 5’Hydroxymethylcytosin-

Phosphoramidite in dem Labor von Martin de Kort (Leiden Institute of Chemistry,

Gorlaeus Laboratories, Universität Leiden, Niederlande) synthetisiert. Mit Hilfe dieser

Phosphoamidite konnten HMC-modifizierte Oligonukleotide mit einer Länge von 20bp

zur Untersuchung der DNA-Bindung und der BGT-Aktivität synthetisiert werden.

3.7.1 Untersuchung der BGT-Aktivität mit HMC- und HMU-modifizierten

Oligonukleotiden (20bp)

Zunächst wurde geprüft, ob sich das HMC-modifizierte ds-Oligonukleotid als

Akzeptorsubstrat eignet. Dazu wurde die Übertragung des Glukosylrestes, ausgehend

von radioaktivem UDPG-14C, auf die 5’-Hydroxymethylgruppe des Cytosins durch die

BGT autoradiographisch untersucht (2.11.4). Da die Synthese der 5’HMC-

Phosphoramidite äußerst schwierig ist, standen nur sehr geringe Mengen des HMC-

modifizierten Oligonukleotids zur Verfügung. Alternativ wurde die Verwendbarkeit

eines 5’-Hydroxymethyluracil modifizierten ds-Oligonukleotids (HMU-Oligo,

JenaBioscience) gleicher Sequenz als Akzeptorsubstrat getestet

Ergebnisse

58

Abb.23: Autoradiogramm zum qualitativen Nachweis der Glukosylierung des HMC- und HMU-modifizierten Oligonukleotids. Spur 1: Negativ-Kontrolle (HMC-Oligomer ohne BGT), Spur 2: Positiv-Kontrolle (T4*-DNA + BGT), Spur 3: HMC-modifiziertes Oligomer + BGT, Spur 4: HMU-modifiziertes Oligomer + BGT, Spur 5: unmodifiziertes Oligomer gleicher Sequenz (20bp) + BGT. Oligomer 6,8 µM; UDPG-14C 22 µM; BGT 12 µM; MgCl2 25mM.

Aus dem Autoradiogramm in Abbildung 23 ist zu erkennen, daß sowohl das HMC-

modifizierte Oligonukleotid (Spur 3) als auch das HMU-modifizierte Oligonukleotid

(Spur 4) durch die BGT glukosyliert wurden. Das bedeutet, daß neben dem natürlichen

Akzeptorsubstrat 5’-Hydroxymethylcytosin auch 5’-Hydroxymethyluracil akzeptiert

wird. Als Positiv-Kontrolle wurde unglukosylierte genomische T4*-DNA (Spur 2)

eingesetzt.

Um die Glukosylierung des HMC-bzw. HMU-modifizierten ds-Oligonukleotids

auch in quantitativer Hinsicht zu vergleichen, wurden in vitro Aktivitätstests

durchgeführt, die es ermöglichten, die Transferrate von eingebauter radioaktiver

Glukose auf die HMC-bzw. HMU-modifizierten Oligonukleotide zu bestimmen

(2.11.5). Die gemessenen Transferraten der beiden Akzeptorsubstrate zeigten dabei

lediglich einen Unterschied von ca. 5% (Abb.24). Die Akzeptanz des 5’-

Hydroxymethyluracils als Akzeptor neben dem natürlichen Substrat 5’-

Hydroxymethylcytosin konnte somit auch quantitativ bestätigt werden. Die

angegebenen Meßwerte sind jeweils Mittelwerte aus Doppelbestimmungen.

Ergebnisse

59

HMC-ds Oligomer

5'-GTTTACTTC-X-TCGGTTAGTG-3'.

3`-CAAATGAAG-G-AGCCAATCAC-5

HMU-ds Oligomer

5'-GTTTACTTC-Y-TCGGTTAGTG-3'.

3`-CAAATGAAG-G-AGCCAATCAC-5

Y = 5`- Hydroxymethyluracil X = 5´- Hydroxymethylcytosin

Abb.24: Vergleich der BGT-Aktivitäten bei Verwendung eines HMC-modifizierten bzw. eines HMU-modifizierten ds-Oligonukleotids als Akzeptorsubstrat (links). UDPG-14C 8,8µM; MgCl2 25mM; Oligomer 4,5µM; BGT 1µM. Rechts: DNA-Sequenzen der verwendeten Oligonukleotide.

3.7.2 Untersuchung der DNA-Bindung der BGT mit HMC- und HMU-

modifizierten Oligonukleotiden.

Nachdem das HMC-modifizierte Oligonukleotid bereits qualitativ und quantitativ mit

dem HMU-modifizierten Oligonukleotid verglichen wurde, sollte abschließend die

Affinität zur BGT untersucht werden. Dazu wurde die Bindung der BGT an das HMC-

modifizierte bzw. an das HMU-modifizierte ds-Oligonukleotid in An- und Abwesenheit

des Donorsubstrates UDPG mittels Gel-Mobilitäts Tests analysiert (Abb.25). Darüber

hinaus waren diese Untersuchungen notwendig, um die Ko-Kristallisationsexperimente

mit DNA-Oligonukleotiden und der BGT, die eine dauerhafte Bindung zwischen DNA

und BGT voraussetzen, zu ermöglichen. Als Gelmatrix wurde Polyacrylamid unter

nativen Elektrophorese-Bedingungen eingesetzt (2.10.4). Unter diesen

Versuchsbedingungen konnte sowohl eine Bindung an das HMC-Oligonukleotid als

auch an das HMU-Oligonukleotid nachgewiesen werden (Spur2 und 4). Die

Anwesenheit von UDPG führte zu einer stärkeren Bindung beider Oligonukleotide an

die DNA (Spur 3 und 5). Zur Zeit wird in dem Labor von Solange Moréra daran

gearbeitet die 3D-Struktur des ternären Komplexes mit dem HMC-Oligonukleotid

aufzuklären.

HMC-Oligo HMU-Oligo0

5000

10000

15000

20000

25000

30000Ak

tivitä

t / c

pm

Oligonukleotid

Ergebnisse

60

Abb.25: Gel-Mobilitäts-Test mit 15% Polyacrylamid (EtBr.-gefärbt) mit einem HMC-modifizierten und einem HMU-modifizierten ds Oligonukleotid (20bp) in Ab- und Anwesenheit von UDPG. Spur 1: Kontrolle ( HMC-Oligomer ohne BGT), Spur 2: HMC-Oligomer ohne UDPG + BGT, Spur 3: HMC-Oligomer mit UDPG + BGT, Spur 4: HMU-Oligomer ohne UDPG + BGT, Spur 5: HMU- Oligomer mit UDPG + BGT. Oligomer 4,5µM, BGT 12µM, UDPG 250µM. 3.7.3 Partnerbasen-abhängige Glukosylierung des 5’-Hydroxymethyl-

uracils durch die BGT

Aufgrund der Erkennungssequenz-unabhängigen Glukosylierung der DNA durch die

BGT und der Akzeptorsubstrat-Unspezifität der BGT wurde untersucht, welche

Wirkung der Austausch der Partnerbasen des Akzeptorsubstrates auf die Aktivität der

BGT hat. In Analogie zu dem natürlichen Akzeptorsubstrat 5’-Hydroxymethylcytosin

konnte aufgrund der vergleichbaren Aktivität und DNA-Bindung ein 5’-

Hydroxymethyluracil für dieses Experiment verwendet werden. Dazu wurde die

Aktivität in Anwesenheit HMU-modifizierter ds-Oligonukleotide mit verschiedenen

Partnerbasen gemessen (2.11.5). Insgesamt wurden 5 Basen-Paarungen getestet: HMU-

G, HMU-C, HMU-A, HMU-T und HMU mit einer „abasic-site“ an der Partnerposition

(Tab.8). Das Balkendiagramm in Abbildung 26 zeigt die gemessenen Aktivitäten in

cpm der verschiedenen ds-HMU-Oligonukleotide.

Ergebnisse

61

Tab.8: DNA-Sequenz der getesteten ds HMU-Oligonukleotide. U*: 5’ Hydroxymethyluracil. ∆ : 1,2-Dideoxy-D-RiboseSpacer.

5'-GTTTACTTCU*TCGGTTAGTG-3'. 3`-CAAATGAAGXAGCCAATCAC-5`

X ds Oligonukleotid

G HMU-G A HMU-A C HMU-C T HMU-T ∆ HMU-“abasic“

Die Glukosylierung des 5’ Hydroxymethyluracil durch die BGT ist abhängig von der

Partnerbase. Mit den „mismatch“-Partnern Thymin und Cytosin, der Watson und Crick-

Paarung mit Adenin und einer „abasic site“ an der Partnerposition, wurden nur relative

Aktivitäten von 0,05 bis 3,2% im Vergleich zur Paarung HMU-Guanin erreicht

(Abb.26). Dies zeigt deutlich, daß zur Übertragung eines Glukosylrestes auf die

5’-Hydroxymethylgruppe der Akzeptorbase ein Guanin an der Partnerposition essentiell

ist.

HMU-G HMU-A HMU-C HMU-T HMU-ab0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

Aktiv

ität /

(cpm

)

Oligonukleotid

Abb.26: Vergleich der BGT-Aktivität (cpm) bei Verwendung von HMU-modifizierten ds-Oligonukleotiden mit verschiedenen Basen an der Partnerposition des 5’-Hydroxymethyluracils.

Ergebnisse

62

3.8 Inhibitionsstudien der BGT

Ziel dieser Inhibitionsstudien war es, Substratanaloga zu finden, die zu einer drastischen

Reduzierung der Transferreaktion führen, um eventuell. durch den Vergleich mit

potentiellen Inhibitoren anderer Glykosyltransferasen zu einem besseren Verständnis

des Katalysemechanismus der BGT zu gelangen. Zudem würde eine Ko-Kristallisation

des Inhibitors mit der BGT genauere Aussagen über die Vorgänge im katalytischen

Zentrum der BGT ermöglichen. Besonders interessant ist dabei die Identifikation der an

der Fixierung des Zuckeranteils beteiligten Aminosäuren, weil darüber bisher noch

keine genauen Daten vorliegen (Moréra et al, 1999). In Zusammenarbeit mit dem Labor

von Prof. Dr. R. R. Schmidt, Fachbereich Chemie der Universität Konstanz, wurden

Inhibitoren synthetisiert die den Übergangszustand der Zuckertransferreaktion der BGT

imitieren (4.8) (Bhattacharya et al., 2001). Es handelt sich um Aryl/Hetaryl Phosphonat

und Phosphat UMP-Derivate (Abb.27).

Abb.27: Strukturen der untersuchten Aryl/Hetaryl Phosphonat und Phosphat UMP-Derivate

Ergebnisse

63

3.8.1 Hemmung der BGT durch Aryl/Hetaryl Phosphonat- und Phosphat-

UMP-Derivate

Zur biochemischen Charakterisierung der inhibitorischen Wirkung der Phosphonat- und

Phosphat-UMP-Derivate wurden neben der Bestimmung der IC50-Werte (Inhibitor-

Konzentration bei 50% Hemmung) kinetische Messung zur Bestimmung der Ki-Werte

durchgeführt (2.11.2, 2.11.3). Der Ki-Wert ist die Dissoziationskonstante des Enzym-

Inhibitor Komplexes. Bei kompetitiver Hemmung ist der Ki-Wert ein Maß für die

Affinität des Inhibitors zu dem Enzym. Die Berechnung der Ki-Werte aus den

kinetischen Daten erfolgte durch die Gleichungen (1) und (2).

[ ]

ionKonzentrat-Inhibitor I

Konstante MentenMichaelisK M

i

MM

KI1 (2)

αK K (1) (app)

=

−=

+=α

=

-0,04 -0,02 0,00 0,02 0,04 0,06

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0 2 mM M4

1 mM M4

0,5 mM M4

0 mM M4

1/S (µM)

1/V

max

(nm

ol/h

)

Abb.28: Hemmung der BGT-Aktivität durch den Inhibitor M4. Lineweaver-Burk Darstellung bei

verschiedenen Inhibitor Konzentrationen.

Ergebnisse

64

In der Abbildung 28 ist die Hemmung der BGT-Aktivität durch den Inhibitor M4 in der

Lineweaver Burk-Auftragung stellvertretend für alle getesteten Phosphonat und

Phosphat Inhibitoren dargestellt. Die ermittelten Ki- und IC50-Werte sind in der Tabelle

9 zusammengefaßt.

Tab.9: IC50- und Ki-Werte der untersuchten Aryl/Hetaryl Phosphonat und Phosphat UMP-Derivate .n.b. nicht bestimmt.

Inhibitor IC50 / (M) Ki / (M)

UDP 1,7*10-3 n.b. M4 0,96*10-3 0,32*10-3 H8 0,78*10-3 0,64*10-3 RB3 0,71*10-3 0,91*10-3

RA3 1,58*10-3 0,8*10-3 AX6 1,9*10-3 1,23*10-3 AXP4 1,6*10-3 0,62*10-3 Q3 1,25*10-3 0,84*10-3

AB4 >4*10-3 n.b. ABP4 >4*10-3 n.b. A7 >5*10-3 n.b. AH7 >3,5*10-3 n.b AL6 >3,2*10-3 n.b.

Alle kinetisch untersuchten Inhibitoren zeigten einen kompetitven Hemmungstyp. Der

Inhibitor M4 zeigte mit einem Ki-Wert von 0,32*10-3 M ( IC50 0,96*10-3 M) die höchste

Affinität zur BGT, gefolgt von den Inhibitoren H8 und AXP4 mit einem Ki-Wert von

0,64*10-3 M bzw. 0,62*10-3 M. Der IC50-Wert des Produktes der Glukosylierung UDP

liegt bei 1,7 mM. Die Hemmung der BGT-Aktivität bei den übrigen Inhibitoren RB3,

RA3, AX6 und Q3 liegt zwischen 0,71 und 1,9 mM (IC50). Die Inhibitoren AB4, ABP4,

A7, AH7 und AL6 hemmen die BGT Aktivität mit IC50-Werten von weit über 3 mM

nur sehr gering. Dies zeigt, daß die Hetaryl-UMP-Derivate und die fehlende

Substitution an der Aryl-Gruppe zu keiner signifikanten Inhibierung der BGT führen.

Insgesamt werden durch die Phosphat-UMP-Derivate größere Hemmungen erzielt als

durch die Phosphonat-UMP-Derivate. In dem Labor von Solange Moréra, konnte bisher

die 3D-Struktur der BGT im Komplex mit dem Inhibitor M4 aufgeklärt werden

(Abb.34).

Ergebnisse

65

3.8.2 Hemmung der BGT durch Glykosyl-Phosphat UMP Derivate

Die beiden untersuchten Glykosyl-Phosphat-UMP-Derivate FS713 und ACP5 (Abb.29)

haben nur einen sehr geringen inhibitorischen Effekt auf die BGT-Aktivität. Die

Messungen ergaben bei einer Inhibitor-Konzentration von jeweils 3 mM nur eine

Hemmung von 20% (FS713) und 8% (ACP5).

Abb.29: Strukturen der untersuchten Glykosyl Phosphat UMP-Derivate.

3.8.3 Hemmung der BGT durch Thiophen-UMP-Derivate

Zur Analyse des inhibitorischen Potentials der vier Thiophen-UMP-Derivate (Abb.30)

wurden ihre IC50-Werte bestimmt (2.11.2). In der Tabelle 10 sind die IC50-Werte der

Inhibitoren zusammengefaßt.

Tab.10: IC50-Werte der untersuchten Thiophen UMP Derivate.

Inhibitor IC50 / M

ATC3a >4*10-3 ATC3b >6*10-3 AKB3 2,75*10-3 ATCP3 1,05*10-3

Ergebnisse

66

Abb.30: Strukturen der untersuchten Thiophen UMP-Derivate

Der Inhibitor ATCP3 zeigt in dieser Gruppe die größte Hemmung mit einem IC50-Wert

von 1,05 mM. Die restlichen Thiophen-Derivate haben keinen nennenswerten Einfluß

auf die BGT-Aktivität mit Ausnahme der geringen Hemmung durch den Inhibitor

AKB3 ( IC50 2,75 mM). Zur Zeit wird in dem Labor von Solange Moréra an der

Aufklärung der 3D-Struktur der BGT mit dem Thiophen Derivat ATCP3 gearbeitet.

67

4. Diskussion

Die Kristallisation mit einer anschließenden Röntgenstrukturanalyse ist derzeit eine der

wichtigsten Methode zur Aufklärung von Strukturen großer Biomoleküle (Ollis et al.,

1990). Durch die Aufklärung drei-dimensionaler Strukturen von Proteinen ist es

möglich, die an der Katalyse beteiligten Regionen eines Enzyms zu lokalisieren.

Detaillierte Informationen liefern Strukturdaten über den Enzym-Substrat- und/oder

einen Enzym-Inhibitor-Komplex. Diese binären oder ternären Strukturkomplexe

ermöglichen die Identifikation von Aminosäuren, die direkt oder indirekt an der

Katalyse oder der Substratbindung beteiligt sind. Dadurch besteht die Möglichkeit,

einen Reaktionsmechanismus zu postulieren. Zur endgültigen Aufklärung der

spezifischen Funktionen der postulierten katalytischen Aminosäuren ist eine

Mutantenerzeugung mit anschließender biochemischer Charakterisierung unerläßlich.

Eine der effizientesten Methoden, die einen zielgerichteten Austausch von

ausgewählten Aminosäuren ermöglicht, ist die ortsspezifische Mutagenese. Sie erlaubt

eine genaue Funktionsanalyse der substituierten Aminosäuren.

Die Struktur der BGT konnte sowohl mit als auch ohne Donorsubstrat aufgeklärt

werden (Moréra et al., 1999). Ausgehend von den Strukturinformationen wurde in

dieser Arbeit der gezielte Austausch der Aminosäuren des katalytischen Zentrums und

der DNA interagierenden-Region durch Alanine vorgenommen, um deren postulierte

katalytische Funktion durch biochemische Untersuchungen zu bestätigen.

4.1 Herstellung der BGT-Mutanten

Eine häufige Anwendung zur Herstellung von Enzymmutanten findet die

Oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese (Zoller und Smith, 1982; 1983). Bei dieser

Methode dient das zu mutierende Gen als Matrize für die Synthese des mutagenisierten

DNA-Stranges durch eine DNA-Polymerase. Als Primer werden synthetisch

hergestellte Oligonukleotide verwendet, die zu dem mutierenden Bereich der Matrize

komplementär sind und die gewünschte Mutation tragen. Die Möglichkeit einer PCR-

Amplifikation macht diese Methode sehr effizient. Durch den Einsatz thermostabiler

DNA-Polymerasen wie z.B. der Pfu-Polymerase aus Pyrcoccus furiosus ist es möglich,

DNA-Abschnitte von über 30kbp Länge mit einer geringen Fehlerrate zu

Diskussion

68

polymerisieren (Barnes, 1994). Dadurch kann auf eventuelle Umklonierungen in einen

Zielvektor verzichtet werden, weil rekombinante Plasmide zur Oligonukleotid-

gesteuerten PCR-Mutagenese eingesetzt werden können.

In dieser Arbeit wurde das QuickChange® Mutagenese System der Firma

Stratagene eingesetzt. Dieses System basiert auf der PCR-Amplifikation eines

doppelsträngigen DNA-Vektors durch die Pfu-Polymerase, der das zu mutierende

DNA-Fragment enthält. Der Einsatz von zwei zueinander komplementären mutagenen

Oligonukleotiden ermöglicht die Einführung der Mutation an der gewünschten Position

(2.9.6). Ein Vorteil dieses Mutagenese-Systems im Vergleich zu anderen

Oligonukleotid-gesteuerten Mutagenesen ist der relativ geringe Zeitaufwand, der zur

Durchführung benötigt wird. In der Regel kann die PCR-Amplifikation, der

anschließende DpnI-Verdau und die Transformation an einem Tag erfolgen. Der relativ

geringe Zeitaufwand beruht maßgeblich auf dem Selektionssystem zur Differenzierung

zwischen der mutagenisierten DNA und der parentalen DNA. Ermöglicht wird diese

Selektion durch das Restriktionsenzym DpnI (Zielsequenz 5’-Gm6ATC-3’), welches

nach der PCR-Amplifikation den Verdau der parentalen DNA katalysiert. Dieses

Enzym restringiert spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA (Nelson et al.,

1992). Im Vergleich zu anderen Oligonukeotid-gesteuerten Mutagenesen wie z.B. der

Kunkel-Methode, bei der zur Selektion der parentalen und der mutagenisierten DNA

zahlreiche Transformationen in verschiedene Bakterienstämme notwendig sind (Kunkel

et al., 1985), ist das QuickChange® Mutagenese System deutlich effizienter. Es

entfallen auch sehr zeitaufwendige und fehleranfällige Zwischenschritte, z.B.

Restriktionen, parallele PCR-Reaktionen und Ligationen, wie sie beispielsweise bei der

„overlap extension“-PCR-Mutagenese (Ho et al., 1989) und der „ Megapriming“-

Mutagenese (Baowei et al., 1994) benötigt werden. Zudem ist der Einsatz der

Pfu-Polymerase bei PCR Mutagenesen besonders geeignet. Im Vergleich zu anderen

thermostabilen DNA-Polymerasen besitzt sie die höchste Thermostabilität, selbst bei

einer einstündigen Inkubation bei 95oC verliert sie nur 5% ihrer Aktivität (Lundberg et

al., 1991). Eine 3’- 5’- Exonuklease-Aktivität ermöglicht zusätzlich eine Amplifikation

mit einer sehr geringen Fehlerrate. Mit einer Fehlerrate von 6,2*10-6 ist die

Pfu-Polymerase etwa 10 mal genauer als die üblich verwendete Taq-Polymerase aus

Thermus aquaticus mit einer Fehlerrate von 2,2*10-5 (Lundberg et al., 1991; Flaman et

al., 1994).

Diskussion

69

Durch gezielte Basenaustausche in den entsprechenden Kodons wurde die jeweilige

Substitution der Aminosäuren durch Alanine erreicht. Dabei wurden bemerkenswert

hohe Mutationseffizienzen von 80-100% erzielt (Tab.3).

4.2 Überexpression und Reinigung der BGT-Mutanten

Die Überexpression aller in dieser Arbeit hergestellten Mutantenproteine wurde mit

dem entsprechenden rekombinanten Vektor PBS in dem E.coli-Expressionsstamm

BL21DE3 erfolgreich durchgeführt (3.2). In diesem System steht die Expression des

βgt-Gens unter der Kontrolle des T7-Promotors, der eine effiziente Transkription durch

die T7-RNA Polymerase ermöglicht (Studier et al., 1990). Der Expressionsstamm

besitzt einen in das Genom integrierten lysogenen Anteil des Phagen Lambda (λ DE3),

der das Gen für die T7-RNA-Polymerase trägt. Die Expression der T7-RNA-

Polymerase wird dabei durch einen Lac-Promotor kontrolliert, so daß dieses System

durch IPTG induzierbar ist. Eine Erhöhung der Stringenz der Expression wird durch

eine dem Zielgen vorgeschaltete, 25 bp lange Lac-Operator Region erreicht. Durch

einen zusätzlich auf dem bakteriellen Genom kodierten Lac-Repressor wird

sichergestellt, daß genügend Repressor-Moleküle in der Zelle vorhanden sind, um die

basale Expression des Zielgens zu minimieren. Zusätzlich fehlen dem

Expressionsstamm die Gene lon und ompT, die für die Lon-Protease bzw. die äußere

Membran Protease OmpT kodieren, welche die Proteine während der Reinigung

degradieren könnten (Grodberg und Dunn, 1988).

Die Reinigung der BGT-Mutanten erfolgte durch zwei Chromatographie-

Schritte. Nach einer Ionentausch-Chromatographie mit anschließender Ammonium-

sulfatfällung wurde abschließend durch eine Gelfiltrations-Chromatographie hochreines

Protein erhalten (3.2). Die Proteinausbeuten lagen bei den Mutanten Glu22Ala,

Asp100Ala, Phe72Ala und Glu163Ala zwischen 2,6 und 5,3% im Vergleich zum

Gesamtprotein (3.2). Die gewonnenen Proteinmengen dieser Mutanten waren

ausreichend für biochemische und strukturelle Analysen. Trotz ähnlicher

Expressionsraten im Vergleich zu den übrigen Mutanten, konnten die Mutanten

Phe71Ala und Tyr261Ala mit einer nur geringen Ausbeute von 0,3 bzw. 0,5% gereinigt

werden. Für kinetische Analysen der Enzymaktivitäten waren die Proteinmengen jedoch

ausreichend. Die Möglichkeit, daß die Substitution einer Aminosäure zu einer

Diskussion

70

Veränderung der oberflächlichen Ladungseigenschaften des Proteins führt und es

dadurch zu einer Herabsetzung der Affinität zum Ionentauschermaterial BioRex 70

kommt, konnte ausgeschlossen werden. Durch eine vergleichende computergestützte

Vorhersage der Verteilung hydrophober und hydrophiler Bereiche des Proteins ließ sich

kein Unterschied zum Wildtyp-Protein und den übrigen Mutanten feststellen. Eine

Erklärung für die geringen Proteinausbeuten der BGT-Mutanten Phe71Ala und

Tyr261Ala ist daher schwierig. Bei den Doppelmutanten Glu22Ala/Asp100Ala,

Glu163Ala/Glu22Ala und Phe71Ala/Phe72Ala kam es während der Überexpression zur

Ausbildung von Zelleinschlußkörpern. Dabei handelt sich um dichte, unlösliche

Proteinaggregate, die mikroskopisch sichtbar sind (Williams et al., 1982; Hoess et al.,

1988) und das überexprimierte Protein in einem nicht-nativen Zustand enthalten

(Mitraki, 1989). Die intra- und intermolekularen Wechselwirkungen, durch die Proteine

zu Einschlußkörpern aggregieren und ihre Löslichkeit verlieren, sind noch weitgehend

unbekannt. Als ursächliche Parameter werden mehrere Faktoren diskutiert. So kann

beispielsweise die mittlere Ladung der Aminosäuren (Nettoladung/Anzahl der Amino-

säuren), der Cysteingehalt, die Gesamtanzahl der Aminosäuren und die Hydrophobizität

eines Proteins unter bestimmten Bedingungen die Bildung von Einschlußkörpern

begünstigen (Wilkinson und Harrison, 1991). Es besteht ebenfalls die Möglichkeit, daß

Enzymmutanten durch veränderte strukturelle Eigenschaften und Änderungen der

Hydrophobizität dazu neigen, unlösliche Aggregate zu bilden (Hlodan et al., 1991).

Dies könnte eine Erklärung für die Bildung der Zelleinschlußkörper der BGT-

Doppelmutanten sein. Möglicherweise bewirkt der Austausch zweier Aminosäuren

durch Alanin kleine strukturelle Veränderungen, die zu einer anderen Hydrophobizitäts-

Verteilung führen und dadurch das cytosolische Löslichkeitsverhalten des

Mutantenproteins herabsetzten.

4.3 BGT-Aktivität in Abhängigkeit von divalenten Metallionen

Bei vielen NDP-Glykosyltransferasen werden divalente Kationen zur Glykosyl-

gruppenübertragung benötigt. Meistens handelt es sich dabei um Mn2+ oder Mg2+

(Murray et al., 1996; Unligil et al., 2000). Für die BGT ist Mg2+ unter in vivo

Bedingungen essentiell (Kornberg et al., 1961). Es stellte sich die Frage, ob auch andere

divalente Kationen als Kofaktoren zur Aktivierung der BGT beitragen. Dazu wurde

Diskussion

71

unter in vitro Bedingungen die BGT-Aktivität in Anwesenheit verschiedener Chlorid-

Salze untersucht. Es handelte sich dabei um CaCl2, MnCl2, BaCl2, CoCl2, ZnCl2 und

CuCl2 (3.3.2). Die Ergebnisse belegen deutlich eine Unspezifität der BGT bezüglich des

Metall-Kofaktors. Im Vergleich zur Aktivität ohne Metall läßt sich die Aktivität in

Anwesenheit von Ca2+, Mn2+ und Ba2+ noch um das 8-fache steigern. Die Ionen Zn2+

und Cu2+ führen dagegen zu keiner Aktivierung der BGT. Das Optimum der

Konzentration der divalenten Kationen Ca2+ und Mg2+ liegt zwischen 25 und 50 mM.

Aufgrund dieser biochemischen Untersuchungen konnten in enger

Zusammenarbeit mit Dr. Solange Moréra 3D-Strukturen der BGT mit den Metallen

Ca2+, Mg2+ und Mn2+ in Anwesenheit von UDP aufgeklärt werden (Moréra et al., 2001).

Die Analyse der Strukturdaten erbrachten dabei neue Erkenntnisse zur Aufklärung der

Funktion des Magnesiums während der Katalyse. Bei den meisten Enzymen, die NDP-

oder NTP-substratspezifisch sind, dient Mg2+ oder Mn2+ dazu, die negativen Ladungen

der Phosphatgruppen während der Katalyse zu neutralisieren. Die gleiche Funktion wird

für viele NDP-Glykosyltransferasen angenommen (Charnock et al., 1999; Unligil et al.,

2000). Dort dient der Metall-Kofaktor dazu die negativen Ladungen des Substrates zu

stabilisieren (Murray et al., 1996; Murray et al., 1997). Für die BGT muß eine andere

Funktion des Mg2+ angenommen werden. Die Neutralisierung des Pyrophosphat-Anteils

des UDPG findet dort durch die Interaktion mit drei Argininen (Arg191, Arg195,

Arg269) statt (Moréra et al., 1999). Es ist jedoch denkbar, daß das Magnesiumion zur

Neutralisierung der nach der Zuckerabspaltung neu entstehenden negativen Ladung

betragen könnte, um somit die Entlassung des Produktes UDP aus dem Enzym zu

erleichtern. Bestätigt wird dies durch die Ligation des Magnesiumions mit dem

O7-Atom des β-Phosphats im BGT-UDP-Mg2+-Strukturkomplex (Abb.31).Weitere

Kontakte des Magnesiumions zur BGT werden über Wassermoleküle zu den

Aminosäuren Glu163, Thr99 und Tyr 261 ausgebildet, was auf eine katalytische und

Mg2+-stabilisierende Funktion dieser Reste deutet. Die aus der Mutationsanalyse

erhaltenen Daten der BGT Mutanten Glu163A und Tyr261A werden an andere Stelle

diskutiert (4.5).

Diskussion

72

Abb.31: Vergrößerte Darstellung der katalytischen Region der BGT im Komplex mit UDP und Mg2+. Die Metall-Koordination ist durch schwarze Linien dargestellt. Die Aminosäure-Reste und die Wasser-Moleküle sind rot, das UDP ist gelb und das Mg2+-Ion ist grün dargestellt. Auflösung 2,5Ǻ. (Moréra et al., 2001).

Die oben postulierte Funktion des Mg2+ steht jedoch im Widerspruch zu den

Daten, die sich aus dem Strukturmodell des katalytischen Zentrums mit dem

Glukoseanteil ergeben (Abb.6). Aus dem Vergleich des Mg2+-Komplexes mit dem

Strukturmodell ergibt sich, daß das Magnesiumion die Position des Glukoseanteils

einnimmt, was unter in vivo Bedingungen nicht möglich wäre. Diese Inkompatibilität

der Position des Magnesiums mit der Position des Substrates ist ähnlich zu der, die bei

vergleichenden strukturellen Untersuchungen an der Glykosyltransferase SpsA

gefunden wurde (Campbell et al., 1997; Charnock et al., 1999). Es wird bei der

Glykosyltransferase SpsA vermutet, daß die Position des Magnesiums dem Bereich

entspricht, der von der positiven Ladung des Oxokarbonium-Intermediats während der

nukleophilen Substitution eingenommen wird. Diese Interpretation könnte auch für die

BGT zutreffen. Es ist jedoch anzumerken, daß diese Hypothese nur bestätigt werden

kann, wenn Struktudaten über einen BGT-UDPG-Mg2+-Komplex vorliegen.

Möglicherweise könnte eine Ko-Kristallisation mit UDP-Thio-Glukose-Derivaten als

Inhibitoren die Zuckerabspaltung unterbinden und eine Bestimmung der räumlichen

Anordnung im katalytischen Zentrum unter annähernden in vivo Bedingungen zu

ermöglichen.

Diskussion

73

4.4 Bindestudien der BGT

Die röntgenkristallographische Untersuchung der BGT zeigt, daß sich das DNA-

Bindemotiv deutlich von den bisher bekannten Helix-Turn-Helix, Zinkfinger und

Leucinzipper-Motiven unterscheidet (Vrielink et al., 1994; Moréra et al., 1999). Die

DNA-Bindung der BGT findet vermutlich durch elektrostatische Wechselwirkungen

mit neun positiv geladenen Resten der konkaven Oberfläche zwischen den beiden

Domänen der BGT statt (Abb.7). Durch Gel-Mobilitäts Tests konnte die Bindung der

BGT an verschieden modifizierte DNA-Fragmente qualitativ nachgewiesen werden

(3.4). Die Tatsache, daß neben dem natürlichen Akzeptorsubstrat (HMC-DNA) sowohl

glukosylierte DNA als auch unmodifizierte DNA unterschiedlicher Sequenzen

gebunden wird, weist auf eine sequenzunspezifische DNA-Bindung hin und schließt

eine Beteiligung des natürlichen Akzeptorsubstrates 5’-Hydroxymethylcytosin an der

DNA-Bindung aus. Im Hinblick auf die postulierte Reparaturfunktion der BGT ist

dieser Befund interessant. Bei der Betrachtung der Glukosylierungsverhältnisse in der

T4 DNA fällt auf, daß unter in vivo Bedingungen die DNA zu 100% glukosyliert ist. Sie

liegt zu 70% α- und zu 30% β-glukosyliert vor. Erstaunlich ist dabei, daß die BGT in

vitro in der Lage ist, 100% der DNA zu glukosylieren, während die in vitro

Glykosylierungskapazität der AGT mit 70% fast ausgeschöpft ist. Es stellt sich die

Frage, warum der T4 Phage für zwei Glukosyltransferasen kodiert, obwohl die BGT

allein in der Lage ist die DNA vollständig zu modifizieren. Vieles spricht dafür, daß die

BGT im Laufe der Evolution als zusätzliches Enzym entwickelt wurde, um

Reparaturfunktionen zu übernehmen. Untersuchungen zeigten, daß die AGT mit dem

Replikationskomplex assoziiert ist (Sommer, 2001) und, daß unmittelbar nach oder

sogar während der Replikation mit der α-Glukosylierung begonnen wird. Die

β-Glukosylierung erfolgt jedoch zu einem späteren Zeitpunkt. Diese zeitliche

Verzögerung der β-Glukosylierung und die Tatsache, daß bisher keine Interaktionen der

BGT mit anderen Proteinkomplexen nachgewiesen wurden, bestätigt die Vermutung,

daß die BGT vermutlich diffusionskontrolliert die übriggebliebenen unglukosylierten

HMC-Reste modifiziert. Durch die nachgewiesene, sequenzunspezifische Bindung an

das natürliche Akzeptorsubstrat, und an unmodifizierte DNA, vor allem aber durch die

Bindung an die glukosylierte DNA, dem Produkt der enzymatischen Reaktion, wird die

Reparaturfunktion der BGT bestätigt. Da die Phagen-DNA während der Replikation

durch rekombinative Prozesse zahlreichen Umordnungen unterworfen ist, kommt es

Diskussion

74

möglicherweise in einigen Bereichen der DNA zu einer lückenhaften Glukosylierung,

deren Vervollständigung durch die Bindung an teilweise glukosylierte DNA erst

ermöglicht wird. Zusätzlich sprechen einige Gemeinsamkeiten zu DNA-Reparatur-

enzymen, wie beispielsweise den Uracil DNA-Glykosylasen MUG und UDG für eine

Reparaturfunktion. Zum einen handelt es sich dabei um die sequenzunspezifische DNA-

Bindung mit einer Modifikation nach dem Basen-Ausklappmechanismus, der für die

BGT postuliert wird, zum anderen ist bei beiden Enzymen die Katalyse abhängig von

der Partnerbase (Barret et al., 1998; diese Arbeit, 4.7). Die Existenz eines

Reparaturenzyms zur Sicherstellung der vollständigen Glukosylierung ist zudem

evolutionsbiologisch für den Phagen vorteilhaft, um zu einer Erweiterung des

Wirtsspekrums beizutragen.

Von großer Bedeutung ist auch die Frage, ob die BGT nach der Glukosylierung

von der DNA dissoziiert oder ob sie mit der DNA assoziiert den DNA-Strang entlang

wandert, um unglukosylierte HMC-Reste zu modifizieren. Die Mg2+-Abhängigkeit der

DNA-Bindung an das natürliche Substrat deutet eher darauf hin, daß die BGT nach

jedem Glukose-Transfer von der DNA dissoziiert und diffusionskontrolliert durch

erneute Bindung an die DNA weitere HMC-Reste glukosyliert. In den Gel-Mobilitäts

Tests wird dies durch die Instabilität des BGT-HMC-DNA-Komplexes in Anwesenheit

des aktivierenden Mg2+ deutlich (3.4). Die Stabilität des BGT-HMC-DNA-Komplexes

ohne aktivierenden Kofaktors ist hingegen deutlich höher, weil dort die

Transferreaktion auf ein Minimum beschränkt ist. Die stärkere Bindung an die DNA bei

fehlender katalytischer Aktivität wird ebenfalls durch die Mg2+-unabhängige DNA-

Bindung an glukosylierte DNA belegt. Für die Dissoziation der BGT nach der

Glukosylierung spricht ebenfalls der Umstand, daß eine dauerhafte Bindung an die

DNA den Zugang zum aktiven Zentrum zur Freisetzung des Produktes UDP und zur

erneuten Bindung des Substrates UDPG versperren würde.

Des weiteren wurde untersucht, ob die Ligation des Donorsubstrates notwenig

ist, um die DNA zu binden. Dazu wurde die DNA-Bindung der BGT im Gel-Mobilitäts

Test jeweils in An- und Abwesenheit von UDPG untersucht. Entgegen der

ursprünglichen Annahme, daß die durch die UDPG-Bindung induzierte geschlossene

Konformation der BGT für die DNA-Bindung essentiell ist, zeigte sich, daß die DNA

auch in Abwesenheit von UDPG gebunden wird. Die Bindung ist allerdings instabiler

als in Gegenwart von UDPG. Dies konnte in DNA-Retardationsanalysen mit HMC- und

HMU-modifizierten Oligonukleotiden einer Länge von 20bp nachgewiesen werden

Diskussion

75

(3.7.2). Bemerkenswert ist allerdings, daß bei dem Einsatz von längeren DNA-

Fragmenten (700bp) als Akzeptorsubstrat kein Einfluß der UDPG-Bindung auf die

Stabilität des BGT-DNA Komplexes nachgewiesen werden konnte. Dies hängt

vermutlich mit der unterschiedlichen Sensitivität der beiden Gel-Mobilitäts Tests

zusammen. Eine hohe Sensitivität bei Gel-Mobilitäts Tests wird u.a. dadurch erreicht,

daß das DNA-Substrat nur von einem Enzymmolekül gebunden werden kann, so wie es

bei kurzen Oligonukleotiden der Fall ist (Garner et al., 1981). Bei DNA-

Akzeptorsubstraten mit einer Länge von 700bp können gleichzeitig mehrere BGT-

Moleküle binden. Dies hat zur Folge, daß eine fehlende DNA-Bindung eines BGT-

Moleküls zum betrachteten Zeitpunkt, die Ladungszustände des Protein/DNA-

Komplexes nicht maßgeblich beeinflussen, so daß geringfügige Unterschiede der DNA-

Bindungsaffinität nicht nachgewiesen werden können. Es ist daher anzunehmen, daß die

stärkere Bindung der BGT an die DNA bedingt durch die UDPG-Bindung dadurch zu

erklären ist, daß die ausgelöste Konformationsänderung dabei hilft den ternären

Komplex aus UDPG, BGT und der vermutlich ausgeklappten Base zu stabilisieren.

Die in dieser Arbeit eingesetzten Gel-Mobilitäts Tests erlaubten jedoch nur

qualitative Aussagen über die DNA-Bindung der BGT. Versuche zur Bestimmung der

Bindekonstante KDDNA anhand des Verhältnisses zwischen gebundener und freier DNA

in Abhängigkeit von der Enzymkonzentration lieferten keine auswertbaren Ergebnisse.

Der Grund hierfür liegt in dem zu geringen Auflösungsvermögen beider eingesetzten

Verfahren. DNA Bindestudien zur quantitativen Bestimmung der Bindungsstärke

mittels intrinsischer Tryptophan Fluoreszenz waren ebenfalls problematisch. Da die

DNA als sog. „Quencher“ die Messung der Tryptophan-Fluoreszenz-Intensität

beeinflußt (Seidel et al., 1996), konnten auch hierbei keine reproduzierbaren Ergebnisse

ermittelt werden. Zur weiteren biochemischen Charakterisierung der Liganden Bindung

der BGT wurde die Bindekonstante des Donorsubstrat UDPG (KDUDPG) und des

Produktes UDP (KDUDP) mittels Tryptophan Fluoreszenz bestimmt. Es zeigte sich dabei,

daß die Bindungsaffinität des UDPG mit einem KD-Wert von 2,16µM etwa 11 mal

höher ist als zu dem Produkt UDP mit einem KD-Wert von 22,9µM.

Diskussion

76

4.5 Mutationsanalyse der BGT

Die Röntgenstruktur eines Proteins stellt nur eine rigide Zustandsform des Proteins dar,

die zwar Interaktionen einzelner Aminosäuren untereinander und mit dem Substrat

aufzeigen kann, jedoch keine genaue Aussage über den katalytischen Mechanismus

zuläßt (Moréra et al., 1999). Die sich aus den Strukturdaten ergebende hypothetische

Reaktionsweise eines Proteins läßt sich daher nur durch eine umfangreiche

vergleichende biochemische Charakterisierung des Wildtypproteins und ausgewählter

Enzymmutanten verifizieren. Die Auswertung der 3D-Struktur der BGT und der

Vergleich mit anderen gut charakterisierten DNA-modifizierenden Enzymen und

Glykosyltransferasen ermöglichte es eine Vorstellung über den Katalysemechanismus

zu entwickeln und für einige Aminosäuren eine katalytische Funktion zu postulieren.

Die angenommenen Katalysemechanismen der Glykosyltransferasen basieren

auf den Reaktionsmechanismen vieler Glykosidasen. Danach verläuft die Hydrolyse

über eine generelle Säure/Base-Katalyse im Rahmen einer nukleophilen Substitution am

anomeren Kohlenstoff (Davies und Henrissat, 1995). Dabei kommt es entweder zu einer

Retention oder Inversion der anomeren Konfiguration (Sinnott, 1991). Bei vielen

Glykosidasen wird die katalytische Funktion als Protonendonor und Protonenakzeptor

ausschließlich von Aspartat und/oder Glutamat übernommen (Davies und Henrissat,

1995). Durch die Aufklärung des Reaktionsmechanismus der α-1-3-Fukosyltransferase

(Murray et al., 1996, 1997) standen erstmals detaillierte Informationen über die

Reaktionsweise von Glykosyltranferasen zur Verfügung. In enger Anlehnung an die

α-1-3-Fukosyltransferase wurde für die BGT ein ähnlicher Reaktionsmechanismus

postuliert (Abb.4). Danach verläuft die Übertragung der Glukose ausgehend vom

UDPG auf die 5’-Hydroxymethylgruppe des Cytosins ebenfalls durch eine nukleophile

Substitution mit einer Inversion zur β-glykosidischen Bindung. Die Bereitstellung des

Nukleophils erfolgt durch eine Deprotonierung der Hydroxylgruppe des Akzeptor-

substrates 5’-Hydroxymethylcytosin, wahrscheinlich durch die Aminosäure Glu22 oder

Asp100. Der Übergangszustand der Transferreaktion hat, wie auch bei den

Glykosidasen, den Charakter eines Oxokarbonium-Ions (Abb.33).

Das aktive Zentrum der BGT liegt verborgen im Inneren der Furche zwischen

den beiden Domänen. Um zu gewährleisten, daß das 5’-Hydroxymethylcytosin im

katalytischen Zentrum zur Transferreaktion positioniert werden kann, müßte die Base

aus dem DNA-Doppelstrang herausgeklappt werden. Dies deckt sich mit der Situation

Diskussion

77

vieler DNA-modifizierender Enzyme, deren aktive Seite verborgen im Zentrum des

Enzyms liegt (Roberts und Cheng, 1998). Für die DNA-Methyltransferasen HhaI,

HeaIII, und TaqI konnte dieser Basenausklappmechanismus kristallographisch und

durch Fluoreszenz-Spektroskopie nachgewiesen werden (Klimasauskas et al., 1994;

Reinisch et al., 1995; Holz et al., 1998). Interessant ist auch, bezüglich der postulierten

Reparaturfunktion der BGT, daß bei vielen DNA-Reparaturenzymen dieser

Basenausklappmechanismus vermutet wird. Bei der Endonuklease V und der Uracil-

Glykosylase konnte die extrahelikale Position der Zielbase während der Katalyse bereits

strukturell nachgewiesen werden (Vassylyev et al., 1995; Slupphaug et al., 1996)

Basierend auf der Struktur des aus dem DNA-Doppelstrang ausgeklappten Cytosins im

Komplex mit der Methyltransferase HhaI (Klimasauskas et al., 1994) konnte ein Modell

des ternären BGT-UDPG-DNA Komplexes entwickelt werden (Abb.32).

Abb.32: Model des ternären BGT-Komplexes mit DNA und UDPG. UDPG ist gelb, die DNA ist rot und die Reste der Aminosäuren Phe72, Asp100 und Glu22 sind grün dargestellt. Das 5’-Hydroxymethylcytosin wird zur Positionierung im katalytischen Zentrum aus der DNA herausgeklappt. Phe72 interkaliert in die entstehende Lücke. Glu22 oder Asp100 kommen als generelle Basen zur Deprotonierung des 5’-Hydroxymethylcytosins in Frage. Die Proteinschleifen 3 und 4 interagieren zur Stabilisierung des Komplexes mit der DNA (verändert nach Moréra et al., 1999).

Diskussion

78

Aus diesem Modell ist zu erkennen, daß insgesamt 4 exponierte Proteinschleifen

mit dem Phosphatrückgrad der Nukleinsäure interagieren, um vermutlich zu einer

Stabilisierung des Komplexes beizutragen. Vergleichbare Interaktionen zur

Stabilisierung und zur Erkennung der DNA über Proteinschleifen sind durchaus bekannt

bei DNA-modifizierenden Enzymen, wie beispielsweise der DNA-Methyltransferase

TaqI und der Glykosylase MUG von E.coli (Barrett et al., 1998; Goedecke et al., 2001).

Bei der BGT handelt es sich dabei um zwei Proteinschleifen aus der C-terminalen

Domäne (Schleife 1: Reste 222-232 und Schleife 2: Reste 190-194) und zwei

Proteinschleifen aus der N-terminalen Domäne (Schleife 3: Reste 66-77 und Schleife 4:

Reste 105-122) (Abb.32). Um einer Destabilisierung der DNA durch das Ausklappen

des 5’-Hydroxymethylcytosins entgegenzuwirken, könnte die Aminosäure Phe72

(Schleife 3) in die entstehende Lücke interkalieren, ähnlich zu der Funktion des Gln237

bei der Methyltransferase HhaI, des Tyr162 in der menschlichen AAG und des Leu144

bei der Glykosylase MUG von E.coli (Klimasauskas et al., 1994; Lau et al., 1998;

Barett et al., 1998). Es ist auch denkbar, daß diese Funktion in der BGT auch von dem

Phe71 übernommen wird oder daß Phe72 und Phe71 gemeinsam die DNA stabilisieren.

Aufgrund der BGT-Struktur konnten bereits spezifische Interaktionen der BGT

mit dem UDP-Anteil des Substrates nachgewiesen werden. Bezüglich der an der

Katalyse und der DNA-Interaktion beteiligten Positionen sind allerdings nur

hypothetische Aussagen möglich. Aus diesem Grund konzentrierte sich die

Mutationsanalyse der BGT auf die Glukose-Transferreaktion und die

Wechselwirkungen mit der DNA. Insgesamt wurden durch eine in vitro Mutagenese

sechs Aminosäuren jeweils einzeln durch Alanine substituiert; zwei von ihnen sollten an

der DNA-Interaktion (Phe71, Phe72), zwei an der Katalyse (Glu22, Asp100) und zwei

an der Mg2+-Ligation (E163, Tyr261) beteiligt sein (Abb.31). In vitro kann die

Transferreaktion der BGT anhand der Übertragung radioaktiver Glukose (UDPG-14C)

auf HMC-haltige DNA gemessen werden. Mit dieser Methode ist es möglich, die

Gesamtaktivitäten des Wildtyps und der Mutanten miteinander zu vergleichen.

Zusätzlich kann die Bestimmung des KM-Wertes im Rahmen einer kinetischen

Untersuchung veränderte Substrataffinitäten aufzeigen. Es ist allerdings keine Aussage

darüber möglich, ob die durch die eingeführten Mutationen veränderte Aktivität auf

eine verminderte UDPG-Spaltung oder DNA-Wechselwirkung zurückzuführen ist. Zur

differenzierteren Betrachtung boten sich zusätzlich Gel-Mobilitäts Tests an, mit denen

Protein/DNA Interaktionen analysiert werden können (Kerr, 1995; Goyard und Bertin,

Diskussion

79

1997). Ferner bestand die Möglichkeit, die UDPG-Spaltung isoliert zu betrachten, da

die BGT in der Lage ist UDPG auch ohne das DNA Akzeptorsubstrat zu spalten,

allerdings mit einer niedrigeren Reaktionsgeschwindigkeit. In Analogie zur α-1-3-

Fukosyltransferase könnte dabei die Hydroxylgruppe eines Wassermoleküls als

Akzeptor fungieren (Murray et al., 1996; Moréra et al., 1999). In dieser Arbeit konnte

eine chromatographische Methode zur Trennung von UDPG und seinem Produkt UDP

entwickelt werden, die eine quantitative Bestimmung des UDPG-Umsatzes zuläßt

(3.6.2). Zur biochemischen Charakterisierung der BGT und ihrer Mutanten Glu22Ala,

Phe72Ala, Asp100Ala und Glu163Ala wurden diese drei Methoden vergleichend

analysiert. Aufgrund der bereits erwähnten Problematik bei der Reinigung der BGT-

Mutanten Phe71Ala und Tyr261Ala standen hier nur kinetische Daten zur Verfügung

(4.2). Zur Übersicht sind die Ergebnisse hinsichtlich der Substrataffinität, der

Gesamtaktivität und der UDPG-Spaltung bzw. der DNA-Bindung in der Tabelle 11

zusammengefaßt.

Tab.11: Zusammenfassung der Ergebnisse der Mutationsanalyse der β-Glukosyltransferase und ihrer Mutanten bezüglich der Gesamtaktivität, der UDPG-Spaltung und der DNA-Bindung. .n.b.: nicht bestimmt. ++: vollständige Bindung; +:unvollständige Bindung.

Mutante Restaktivität/(%) UDPG-Umsatz/(%) DNA-Bindung mit UDPG ohne UDPG

BGT-Wildtyp 100 100 ++ +

Glu22Ala 47,9 18 ++ +

Phe71Ala 53,5 n.b. n.b. n.b.

Phe72Ala 55,8 98 ++ +

Asp100Ala 16,5 12 + +

Glu163Ala 97,6 105 ++ +

Tyr261Ala 73,1 n.b. n.b. n.b.

Die Veränderungen der KM-Werte der Mutanten Glu22A, Phe72A und D100A um den

Faktor 2 sind nicht signifikant (Pues et al., 1999; Song und Jacques, 1999). So daß

davon ausgegangen werden kann, daß die eingeführten Mutationen aller getesteten

BGT-Mutanten keinen relevanten Einfluß auf die UDPG-Bindung haben. Dies

Diskussion

80

entspricht auch den Erwartungen, da in der Struktur der BGT keine direkten Kontakte

zu dem Donorsubstrat nachgewiesen wurden (Vrielink et al., 1994; Moréra et al., 1999).

Für die Aminosäure Glu22 wurde keine essentielle Funktion nachgewiesen, so

daß eine Funktion als generelle Base zur Deprotonierung der Hydroxylgruppe des

5’-Hydroxymethylcytosins ausgeschlossen werden kann. Die relativ hohe Restaktivität

von 47,9% spricht für eine sekundäre Beteiligung an der Katalyse. Interaktionen mit der

DNA konnten erwartungsgemäß durch Gel-Mobilitäts Tests ausgeschlossen werden.

Der isoliert betrachtete UDPG-Umsatz der Mutante Glu22Ala von nur 18% im

Vergleich zum Wildtyp schließt ebenfalls Interaktionen mit dem DNA-Akzeptorsubstrat

aus und deutet eher auf eine Beteiligung des Glu22 an der Substratspaltung.

Möglicherweise fungiert das Glu22 als Säure Katalysator um durch eine Protonierung

des UDP-Anteil die Freisetzung des Produktes aus dem katalytischen Zentrum zu

erleichtern, zusätzlich zu der Funktion des Mg2+. Eine ähnliche Funktion wird dem

Glu518 der menschlichen Glykogen-Synthase des Muskels zugeschrieben (Cid et al.,

2000). Die BGT Mutante Asp100Ala zeigte mit 16,5% die niedrigste Restaktivität. Es

ist jedoch auch hier eine essentielle Funktion des Asp100 als generelle Base

auszuschließen. Durch die DNA-Bindestudien konnte allerdings deutlich gezeigt

werden, daß die Affinität der Mutante Asp100Ala zur DNA in Anwesenheit von UDPG

herabgesetzt ist. Durch die Ausbildung von insgesamt 3 Salzbrücken (Vrielink et al.,

1994) führt die Bindung des Substrates UDPG bei der BGT zur Ausbildung einer

geschlossenen Konformation, die eine stärkere Bindung an die DNA zur Folge hat (4.4).

An einer dieser Salzbrücken ist Asp100 beteiligt, indem es mit Arg191 der C-terminalen

Domäne interagiert. Das Fehlen einer der stabilisierenden Salzbrücken führt daher zu

einer schwächeren Bindung an die DNA. Zudem weist der geringe UDPG-Umsatz von

12% darauf hin, daß neben der strukturgebenden Funktion des Asp100 eine katalytische

Beteiligung sehr wahrscheinlich ist, da durch die veränderten Enzymeigenschaften der

Mutante die Substratspaltung maßgeblich beeinflußt wird. Diese Ergebnisse der BGT

Mutanten Glu22Ala und Asp100Ala stehen im Einklang mit der Mutationsanalyse der

Strukturanaloga Asp13Ala und His125Ala in der UDP-Glukosyltransferase GtfB

(Mulichak et al., 2001), die zusammen mit der BGT und der MurG eine strukturelle

Superfamilie bildet (1.4). Dort wird eine essentielle Funktion beider Reste als Säure

oder Basen Katalysator ebenfalls ausgeschlossen. Mulichak und Mitarbeiter (2001)

konnten hingegen für das Asp332 in der GtfB aufgrund einer Restaktivität der Alanin

Diskussion

81

Mutante von 0,4% eine wichtige katalytische Funktion nachweisen. Möglicherweise

trifft dies auch für die entsprechende Aminosäure Asp258 in der BGT zu.

Die Alanin Mutanten der vermutlich in die DNA interkalierenden Aminosäuren

Phe71 und Phe72 zeigten beide Restaktivitäten von rund 50%, die allerdings nur auf

eine geringe Beteiligung an der Zuckertransferreaktion schließen läßt. Es könnte jedoch

möglich sein, daß beide Reste zur Interkalierung in der Lage sind und daß die jeweils

Alanin-substituierte Position durch das benachbarte Phenylalanin teilweise kompensiert

werden kann. Aus den bereits erwähnten Gründen (4.2) war es nicht möglich, diese

Hypothese durch biochemische Charakterisierungen der entsprechenden Doppelmutante

zu bekräftigen. Die Tatsache, daß die BGT-Mutante Phe72Ala bei einer Hemmung der

Gesamtaktivität von rund 50% in Abwesenheit des DNA-Akzeptorsubstrates das UDPG

vollständig umsetzt (rel. UDPG-Umsatz: 98%) läßt den Schluß zu, daß das Phe72 der

Proteinschleife 3 mit der DNA in Wechselwirkung tritt. Es ist daher sehr

wahrscheinlich, daß sie in die Lücke der ausgeklappten Base interkaliert, um in gleicher

Weise wie die strukturanalogen Aminosäuren in der Methyltransferase HhaI oder der

Glykosylase MUG, die DNA zu stabilisieren.(Klimasauskas et al., 1994; Lau et al.,

1998; Barett et al., 1998). Dies entspricht auch den Vorstellungen, die sich aus dem

Modell des ternären Komplexes aus DNA, UDPG und der BGT ergeben (Abb.32)

Entgegen den Erwartungen ließen sich keine Veränderungen der Phe72 Mutante

bezüglich der DNA-Bindung im Vergleich zum Wildtyp-Protein feststellen (3.6.3). Das

Phe72 scheint demnach nur zur Stabilisierung des durch das Ausklappen der Base

deletierten DNA-Abschnittes zu dienen, ohne jedoch gravierenden Einfluß auf die DNA

Bindungsstärke zu haben.

Ein weiterer wichtiger Aspekt der Mutationsanalyse war die Untersuchung der

Ligation des Kofaktors. Durch die strukturelle Aufklärung des BGT-UDP-Mg2+-

Komplexes (Abb.31) konnten für die Reste Glu163 und Tyr261 Interaktionen mit dem

Magnesium-Ion nachgewiesen werden, die auf eine wichtige katalytische Funktion

schließen lassen. Die vergleichende biochemische Charakterisierung der BGT-Mutante

Glu163Ala lieferte jedoch keine Hinweise auf eine katalytische Funktion. Sowohl die

Gesamtaktivität mit 95,1% als auch der isoliert betrachtete UDPG-Umsatz von 105%

waren im Vergleich zum BGT-Wildtyp unverändert. Ein Einfluß auf die DNA-Bindung

konnte ebenfalls ausgeschlossen werden (3.6.2). Es ist daher anzunehmen, daß das

Glu163 keine katalytische Funktion übernimmt und nicht an der Positionierung des

Mg2+ im katalytischen Zentrum beteiligt ist. Dieses Ergebnis stützt die Vermutung, daß

Diskussion

82

die BGT-Struktur im Komplex mit UDP und Mg2+ nicht die in vivo Verhältnisse im

aktiven Zentrum widerspiegelt (4.3). Durch die Abwesenheit des Glukoseanteils in

diesem Strukturkomplex werden sterische Verhältnisse vorgetäuscht, die nicht den

nativen Bedingungen entsprechen und fälschlicherweise zu einer Ligation des Mg2+ mit

dem Glu163 führen. Die Mutante Tyr261Ala zeigte nur einen sehr geringen

Aktivitätsverlust von 27% bei einer unveränderten Substrataffinität. So daß auch hier

keine essentielle katalytische Beteiligung vorliegt. Es kann jedoch eine sekundäre

Beteiligung nicht ausgeschlossen werden, wobei auch hier eine Interaktion mit dem

Mg2+ aus den genannten Gründen fragwürdig ist. Aus dem Strukturmodell mit dem

Glukose-Anteil ergibt sich, daß die Hydroxylgruppe des Tyr261 über eine

Wasserstoffbrücke mit dem O2-Atom des Glukoseanteils interagiert (Abb.6). Es ist

daher wahrscheinlich, daß sie zur Positionierung der Glukose im aktiven Zentrum

beiträgt, jedoch nur in einer untergeordneten Weise. Zudem könnte das Tyr261 auch

indirekt dazu beitagen, die ausgeklappten Base durch hydrophobe Wechselwirkungen

zu positionieren, als Unterstützung zur postulierten Funktion der Reste Pro19, Leu103

(Moréra et al., 1999). Diese Aussagen bleiben jedoch spekulativ, solange keine

Strukturdaten über einen ternären Komplex aus BGT, UDPG und DNA vorliegen.

4.6 Untersuchungen mit HMC- und HMU- modifizierten Oligo-

nukleotiden

In Zusammenarbeit mit Dr. Martin de Kort (Leiden Institute of chemistry, Gorlaeus

Laboratorie, Universität Leiden, Niederlande) konnten 5’-Hydroxymethylcytosin-

Phosphoamidite synthetisiert werden, die es erstmals ermöglichten, Oligonukleotide

(20bp) herzustellen, die das natürliche Akzeptorsubstrat der BGT an genau definierter

Position enthalten (de Kort et al., 2001). Zur Funktionsprüfung des HMC-modifizierten

Oligonukleotids wurden autoradiographische Untersuchungen, in vitro Aktivitäts-Tests

und DNA-Bindestudien durchgeführt (3.7). Durch diese Experimente konnte die

Funktion des HMC-modifizierten Oligomers als Akzeptorsubstrat sowohl qualitativ als

auch quantitativ nachgewiesen werden. Aufgrund unerwarteter Schwierigkeiten bei der

Synthese der 5’-HMC-Phosphoamidite standen nur sehr geringe Mengen des HMC-

Oligomers zur Verfügung. Daher wurde alternativ die Verwendbarkeit eines

5’-Hydroxymethyluracils (HMU) als Akzeptorsubstrat untersucht. Bei dieser

Diskussion

83

Modifikation bestand der Vorteil darin, daß die Synthese entsprechender

Phosphoamidite zur Herstellung von HMU-modifizierten Oligonukleotiden

standardisiert ist (Jena Bioscience). Die Funktionsprüfung des HMU-modifizierten

Oligonukleotids ergab keinen Unterschied bezüglich der DNA-Bindung und einen nicht

signifikanten Unterschied von 5% bezüglich der in vitro Aktivität im Vergleich zum

natürlichen Akzeptorsubstrat (3.7.1). Für weitere Experimente zur Untersuchung einer

eventuell vorliegenden Nachbar– oder Partnerbasen-abhängigen Glukosylierung der

BGT ist daher der Einsatz von 5’ Hydroxymethyluracil-modifizierten ds-

Oligonukleotiden als Substratanalogon gerechtfertigt.

Zur Aufklärung der 3D-Struktur eines ternären Komplexes aus DNA, UDPG

und BGT ist eine vollständige und dauerhafte Bindung an die DNA notwendig. In den

durchgeführten Gel-Mobilitäts Tests konnte eine vollständige Bindung der BGT an die

DNA sowohl für das HMC-Oligomer als auch für das HMU-Oligomer in Anwesenheit

von UDPG nachgewiesen werden (3.7.2). Es gelang allerdings noch nicht einen

Komplex aus HMC- bzw. HMU-modifizierten Oligomeren, der BGT und dem

Donorsubstrat UDPG zu kristallisieren (Solange Moréra, pers. Mitteilung). Hierbei ist

zu bedenken, daß die Stabilität des HMC-Oligomer/BGT-Komplexes in den Gel-

Mobilitäts Tests nur vorgetäuscht wird, da damit zu rechnen ist, daß in Anwesenheit des

natürlichen Akzeptorsubstrates die DNA nach der Übertragung des Zuckers wieder aus

dem ternären Komplex entlassen wird (4.4). Zudem ist bekannt, daß es mit Gel-

Mobilität Tests nicht möglich ist die Stabilität eines Protein/DNA-Komplexes genau zu

quantifizieren, weil die Dissoziation des Proteins von der DNA durch den sog. “Käfig-

Effekt“ der Gelmatrix beeinflußt wird (Fried und Crothers, 1981; Garner und Revzin,

1981). Eine erfolgversprechende Alternative zur Erlangung eines ternären Komplexes

wäre der Einsatz von Thiomethylcytosin-Derivaten. In Analogie zur Situation der

β-Galaktosidase könnten schwefelhaltige Substratanaloga die Zuckertransferreaktion

unterbinden. Möglicherweise führt der Einsatz solcher Verbindungen zu einer höheren

Stabilität des BGT-Komplexes mit der DNA.

Der Befund, daß das 5’-Hydroxymethyluracil, neben dem natürlichen Substrat

5’-Hydroymethylcytosin als Akzeptorsubstrat der BGT fungieren kann, ist in zweierlei

Hinsicht besonders interessant. Zum einen belegt es die Akzeptorsubstrat-Unspezifität

der BGT, und zum anderen könnte dieses Ergebnis für die molekulare Parasitologie von

Bedeutung sein. Wie bereits erwähnt spielen Glykosylierungen in der belebten Natur

u.a. im Energiestoffwechsel und an dem Aufbau von Zelloberflächen eine wesentliche

Diskussion

84

Rolle. Die Glykosylierung von DNA scheint allerdings selten, nach bisherigen

Erkenntnissen ist sie nur auf zwei biologische Systeme beschränkt: die geradzahligen

T-Phagen und die Protozoen der Ordnung Kinetoplastida. In der DNA der

Kinetoplastiden ist die Base Thymin teilweise durch ein 5’-Hydroxymethyluracil

ersetzt, welches durch eine bisher noch nicht identifizierte β-Glukosyltransferase zu

β-D-Glukosyl-Hydroxymethyluracil (J) glukosyliert wird (Borst und van Leeuwen,

1997). Bei dem Erreger der Schlafkrankheit Trypanosoma brucei sind 0,3 bis 1% der

Thymine in der DNA der Blutstadien durch β-D-Glukosyl-Hydroxymethyluracil ersetzt,

vor allem in den repititiven Sequenzen der telomeren Bereiche, in denen die Gene für

variablen Oberflächen-Glykoproteine (VSG) lokalisiert sind (van Leeuwen et al., 1998).

Es wurde der Nachweis erbracht, daß die Glukosylierung der Trypanosomen-DNA die

Expression der variablen Oberflächen-Glykoproteine reguliert (Cross et al.,1999).

Welche regulatorischen Proteine im einzelnen daran beteiligt sind, ist noch nicht

umfassend geklärt. Daher ist die Identifikation von Proteinen, die glukosylierte DNA

binden, von großem medizinischen Interesse (Cross et al.,1999). Mit Hilfe von HMU-

Oligonukleotiden, die durch die BGT glukosyliert werden können, besteht erstmals die

Möglichkeit einer sequenzspezifischen Untersuchung der DNA-Bindung, um Proteine

zu identifizieren, die maßgeblich an der Regulation der Antigenvarianz der

Trypanosomen beteiligt sind. In bezug auf eine zukünftige Therapie der Schlafkrankheit

könnten solche Untersuchungen sehr hilfreich sein.

4.7 Partnerbasen-abhängige Glukosylierung der BGT

Die Verwendung von genau definierten Oligonukleotiden als Akzeptorsubstrat bietet

die Möglichkeit einer detaillierten Analyse der Protein/DNA-Wechselwirkung,

insbesondere bei DNA-modifizierenden Enzymen. Durch gezielte

Sequenzveränderungen der Oligonukleotid-Substrate ist es möglich, die

Sequenzspezifität sowohl der DNA-Bindung (Erkennung) als auch der enzymatischen

Aktivität genauer zu untersuchen (Stivers et al., 1999). So konnte beispielsweise durch

DNA-Bindestudien und kinetische Analysen mit Oligonukleotiden verschiedener

Sequenzen bei der Methyltransferase HhaI und der Uracil DNA-Glykosylase des

Herpes Simplex Virus (HSV-1 UDG) ein Einfluß auf der Aktivität bzw. die DNA-

Diskussion

85

Bindung durch die der Zielbase benachbarten Nukleotide nachgewiesen werden

(Klimasauskas und Roberts, 1995; Bellamy und Baldwin, 2001).

Die Glukosylierung der BGT ist von einer Erkennungssequenz-unabhängig.

Durch DNA-Retardationsanalysen konnte außerdem nachgewiesen werden, daß die

DNA-Bindung auch von dem natürlichen Akzeptorsubstrat unabhängig ist (3.4).

Entgegen der ursprünglichen Annahme ist es daher auszuschließen, daß zur Bindung an

die DNA ein 5’-Hydroxymethylcytosin essentiell ist. Zudem konnte gezeigt werden,

daß die BGT auch in der Lage ist, das Substratanalogon 5-Hydroxymethyuracil zu

glukosylieren. Aufgrund der Akzeptorsubstrat-Unspezifität bezüglich der DNA-

Bindung und der Zuckertransferreaktion stellte sich die Frage, welcher

Erkennungsmechanismus bei der BGT zur Modifikation der Base in der

doppelsträngigen DNA zugrunde liegt. Eine Möglichkeit wäre, daß die BGT die zu

modifizierende Base durch spezifische Interaktionen mit dem komplementären DNA-

Strang erkennt, in Analogie zur Situation der „mismatch“ spezifischen Uracil DNA-

Glykosylase (MUG) aus E.coli (Barrett et al., 1998). Einige Gemeinsamkeiten mit

dieser Glykosylase sprechen für diesen Erkennungsmechanismus: Bei der MUG von

E.coli handelt es sich um ein DNA-Reparaturenzym, das spezifisch Thymin und Uracil

innerhalb der Basenfehlpaarungen G:U und G:T aus der DNA entfernt (Barrett et al.,

1998). Wie bei der BGT wird auch bei der MUG nur doppelsträngige DNA modifiziert.

Die Fähigkeit, einzelsträngige DNA zu modifizieren, die die entsprechende

Akzeptorbase enthält fehlt beiden (Barrett et al., 1998; eigene Arbeit, Daten nicht

gezeigt). Dies spricht möglicherweise auch bei der BGT für eine Substraterkennung

durch Interaktionen mit dem komplementären DNA-Strang. Außerdem können beide

Enzyme verschiedene Pyrimidine als Substrate verwenden. Zudem liegen bei der BGT

und der MUG die aktiven Zentren verborgen im Inneren des Enzyms, so daß die Base

zur Modifikation aus der DNA herausgeklappt werden muß. Für die MUG konnte dies

auch strukturell nachgewiesen werden (Barrett et al., 1998), für die BGT wird dieser

Basenausklapp-Mechanismus postuliert (Vrielink, et al., 1994; Moréra et al., 1999). Bei

der MUG verläuft die Interaktion des Proteins mit dem komplementären DNA-Strang

über eine Proteinschleife (Reste 149-150) aus der insgesamt drei Aminosäuren (Gly143,

Leu144, Arg146) zu der Partnerbase Guanin des fehlgepaarten Thymin bzw. Uracil

Wasserstoffbrücken ausbilden. Durch DNA-Bindestudien und in vitro Aktivitäts Tests

konnte die spezifische Erkennung des komplementären Guanins zusätzlich biochemisch

bestätigt werden (Barrett et al., 1998). Um zu überprüfen, ob die Transferreaktion der

Diskussion

86

BGT ebenfalls von der Partnerbase abhängig ist, wurde die Aktivität in Anwesenheit

von HMU-modifizierten Oligonukleotiden mit verschiedenen Partnerbasen untersucht.

Insgesamt wurden 5 Basen-Paarungen getestet: HMU-G, HMU-A, HMU-C, HMU-T

und HMU mit einem 1,2-Dideoxy-D-Ribose-Spacer an der Partnerposition (3.7.3). Die

gemessenen Aktivitäten mit den Partnern Thymin, Cytosin, Adenin und dem

1,2-Dideoxy-D-Ribose-Spacer sind mit 0,05 bis 3,2 % im Vergleich zur Paarung

HMU-G nicht signifikant. Diese Ergebnisse belegen, daß eine Partnerbasen-abhängige

Glukosylierung vorliegt. Es kann davon ausgegangen werden, daß die BGT in Analogie

zur MUG von E.coli ebenfalls die Partnerbase Guanin spezifisch erkennt.

Möglicherweise spielen bei diesem Erkennungsmechanismus der BGT die

Proteinschleifen 3 und 4 (Abb.32) eine wesentliche Rolle. Analog zu den mit dem

Guanin interagierenden Aminosäuren der „mismatch“-spezifischen Uracil DNA-

Glykosylase (MUG) aus E.coli könnten bei der BGT die Reste Gly73 und Gly74 der

Proteinschleife 3 und das Arg115 und Leu120 der Proteinschleife 4 diese Funktion

übernehmen. Im Rahmen einer Mutationsanalyse und einer strukturellen Untersuchung

des Komplexes aus DNA und BGT könnte diese Vermutung bestätigt werden.

4.8 Inhibitionsstudien

Die Biosynthese von komplexen Kohlenhydraten, Oligosacchariden und anderen

glykosylierten Zell-Metaboliten ist von fundamentaler biologischer Bedeutung. Neben

der Funktion als Speicherstoffe im Energiestoffwechsel spielen glykosylierte

Verbindungen u.a. eine wichtige Rolle bei molekularen Erkennungsprozessen. Dazu

zählen intra- und interzelluläre Kommunikationsprozesse, die der Zelldifferenzierung

und -entwicklung oder der Immunantwort zugrunde liegen. Viele pathologische

Vorgänge wie beispielsweise bakterielle oder virale Infektionen oder allgemeine

Entzündungsprozesse sowie die Metastasen-Entwicklung bei malignen Erkrankungen,

werden maßgeblich von glykosylierten Proteine und Lipiden gesteuert (Varki, 1993).

Die selektive Inhibition der Glykosyltransferasen, die an der Synthese und der

Übertragung von Kohlenhydrat-Verbindung beteiligt sind, ist daher von großem

medizinischem Interesse. Bei der Suche nach geeigneten Inhibitoren für die BGT steht

vor allem die Möglichkeit einer Kristallisation eines ternären Komplexes aus Inhibitor,

DNA und BGT im Vordergrund, um strukturelle Details der Interaktion zwischen

Donor- bzw. Akzeptorsubstrates und der BGT aufzuklären. Die Ergebnisse aus den

Diskussion

87

strukturellen Untersuchungen und der biochemischen Charakterisierung der potentiellen

Inhibitoren der BGT könnten auch auf medizinisch relevante Glykosyltransferasen

übertragbar sein.

Die Entwicklung von potentiellen Inhibitoren für die Glykosyltransferasen auf

struktureller Basis ist allerdings schwierig, da derzeit nur neun Glykosyltransferasen

strukturell charakterisiert wurden (1.4). Zudem ist die Imitation der Übergangszustände

der Zuckertransferreaktionen zur Entwicklung von Inhibitoren sehr aufwendig, da es

sich dabei um äußerst komplexe chemische Strukturen handelt, die aus zahlreichen

Komponenten (Nukleotid, Metall, Akzeptor- und Donorsubstrat) bestehen und diese bei

dem Design des Inhibitors mit berücksichtigt werden müssen (Takayama et al., 1999).

Abb.33: Postulierter Übergangszustand der von der BGT katalysierten Glukose-Transferreaktion.

Durch strukturelle und funktionelle Vergleiche der BGT mit anderen gut

charakterisierten Glykosyltransferasen, insbesondere mit dem Reaktionsmechanismus

der α-1-3 Fukosyltransferase, konnte für die BGT ein Übergangszustand postuliert

werden (Abb.33), der als Vorlage zur Synthese potentieller Inhibitoren der BGT diente

(Bhattacharya et al., 2001 A.; Bhattacharya et al., 2001 B.). Aufgrund von empirischen

Erkenntnissen zahlreicher Inhibitionsstudien mit Galaktosyltransferasen und

Sialyltransferasen wurden Aryl/Hetaryl–Phospat- und Phosphonat-UMP-Derivate

synthetisiert (Abb.27). Des weiteren standen Glykosyl-Phosphat-UMP-Derivate und

Thiophen-UMP-Derivate für Inhibitionsstudien mit der BGT zur Verfügung (Abb.29

und 30). Die biochemische Charakterisierung der inhibitorischen Wirkung dieser

Verbindungen erfolgte durch in vitro Aktivitätstests mit der Bestimmung der jeweiligen

Diskussion

88

IC50-Werte. Bei IC50-Werten von unter 2 mM wurde zusätzlich die Dissoziations-

konstante Ki des Enzym/Inhibitor-Komplexes durch kinetische Untersuchungen

ermittelt (3.8).

Es stellte sich heraus, daß alle kinetisch charakterisierten Aryl-Phosphonat- und

Phosphat-UMP-Derivate die Aktivität der BGT kompetitiv hemmen (3.8.1). Bei einer

kompetitiven Hemmung ist der Ki-Wert ein Maß für die Affinität des Inhibitors zu dem

Enzym: ein niedriger Ki-Wert entspricht dabei einer stärkeren und ein höherer Ki- Wert

einer schwächeren Affinität. Die höchste Affinität zur BGT mit einem Ki-Wert von

0,32*10-3 M zeigt der Aryl-Phosphat-Inhibitor M4, gefolgt von den Aryl-Phosphat-

Inhibitoren H8 und AXP4 mit Ki-Werten von 0,64*10-3 M bzw. 0,62*10-3 M (Tab.9).

Die gemessenen Ki-Werte der übrigen Aryl-Phosphat-Derivate RB3, RA3 und des Aryl-

Phosphonat-Derivats AX6 liegen zwischen 0,8*10-3 M und 1,23*10-3M. Durch den

direkten Vergleich der Ki-Werte des Phosphat-UMP-Derivats AXP4 mit seinem

Phosphonat-Analogon AX6, bei dem die Affinität zur BGT um ca. die Hälfte

herabgesetzt ist, wird deutlich, daß die Phosphat-UMP-Derivate einer höhere Affinität

zur BGT zeigen als die Phosphonat-UMP-Derivate. Bestätigt wird dieser Befund zudem

durch die Bestimmung der entsprechenden IC50-Werte, die eine quantitative Aussage

der enzymatischen Hemmung ermöglichen. Im Vergleich zu den IC50-Werten der

untersuchten Phosphonat-UMP-Derivate AB4, A7, AH7 und AL6 von über 3,2*10-3 M

wird die BGT durch die oben genannten Phosphat-UMP-Derivate deutlich stärker

gehemmt (Tab.9). Die verlängerte Phosphat-Kette bei den Phosphat-UMP-Derivaten,

die durch die Bindung des Aromaten über ein Sauerstoffatom zustande kommt,

entspricht auch eher den strukturellen Verhältnissen im postulierten Übergangszustand

(Abb. 33).

Dr. Solange Moréra ist es gelungen einen Komplex aus BGT und dem Inhibitor

M4 zu kristallisieren und röntgenkristallographisch aufzulösen. Durch eine computer-

gestützte Modellierung wurde die Position des UDP und des Inhibitors M4 in der

katalytischen Region überlagert (Abb.34). Es zeigt sich, daß die Base und der Ribose-

Anteil, sowohl des Inhibotors als auch des UDP identische Positionen einnehmen und

auch mit den gleichen Aminosäuren der BGT interagieren. Ein wesentlicher

Unterschied besteht jedoch in der räumlichen Orientierung der beiden Phosphat-Anteile.

Bei dem Inhibitor M4 weicht die Position des β-Phosphats mit der Aryl-Gruppe um ca.

180o von der des β-Phosphats des UDP ab. Die kompetitive Hemmung von M4 kommt

daher nicht durch identische Interaktionen mit der katalytischen Region zustande,

Diskussion

89

sondern eher durch hydrophobe Wechselwirkungen der Arylgruppe mit der BGT, die

den Zugang des natürlichen Akzeptorsubstrates UDPG zum katalytischen Zentrum

versperren (Solange Moréra, persönliche Mitteilung).

Abb.34: Vergrößerter Ausschnitt aus der katalytischen Region der BGT im Komplex mit UDP und dem Inhibitor M4 (überlagert). UDP ist grün und M4 ist gelb dargestellt. Auflösung 2,4Å.

Diese Inhibitionsstudien lieferten noch weitere wichtige Erkenntnisse, die hinsichtlich

der Entwicklung von Inhibitoren für andere Glykosyltransferasen hilfreich sein könnten:

1) Die Substitution der Aryl-Gruppe verbessert die Inhibitor-Aktivität. Im Gegensatz zu

den Aryl-substituierten Derivaten führen die Derivate AB4 und ABP4 zu keiner

nennenswerten Hemmung der BGT (Tab.9).

2) Der Einsatz von Stickstoff-heterozyklischen Aromaten in den UMP-Derivaten (AH7,

AL6) hat keinen Einfluß auf die Glukosyltransferase-Aktivität.

3) Die Glykosyl-Phosphat UMP-Derivate (FS713, ACP5) zeigen keine Inhibitor-

Aktivität. Dies deckt sich mit Ergebnissen aus Inhibitionsstudien mit diesen Derivaten

an Galaktosyltransferasen und Sialyltransferasen (Prof. Schmidt, persönliche

Mitteilung).

Bei der Untersuchung der Thiophen UMP-Derivate zeigt nur der Inhibitor

ACTP3 mit einem IC50-Wert von 1,05*10-3 M eine relevante Hemmung der BGT-

Aktivität. Die Hemmung seines am Thiopen-Ring methylierten Strukturanalogons

AKB3 ist um die Hälfte geringer. Die strereoisomeren Derivate ATC3a und ATC3b

zeigen keine Inhibitor-Aktivität.

90

5. Zusammenfassung

Die Glykosyltransferasen sind aufgrund ihrer Beteiligung an der Glykosylierung von

Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren von großer biologischer Bedeutung. Aus medizinischer

Sicht sind vor allem die intra-, extra- und interzellulären Funktion der Glykosylierungen im

Rahmen einer Pathogenese von besonderem Interesse. Die Aufklärung der Struktur und der

Reaktionsweise der Glykosyltransferasen liefert daher wichtige Erkenntnisse zum besseren

Verständnis der molekularen Zusammenhänge und ermöglicht gezielte Therapieansätze,

beispielsweise durch die Synthese geeigneter Inhibitoren der Zuckertransferreaktion. In dieser

Arbeit wurde die DNA-glukosylierende β-Glukosyltransferase des Bakteriophagen T4,

ausgehend von ihrer drei-dimensionalen Struktur, biochemisch charakterisiert. Im

Vordergrund standen dabei grundlegende Untersuchungen der DNA-Interaktion, des DNA-

Erkennungsmechanismus, der kinetischen Eigenschaften, der Funktion des Mg2+-Kofaktors

und der Hemmung der BGT-Aktivität. Zudem wurde eine Mutationsanalyse zur Bestätigung

der postulierten Funktion einiger Aminosäuren durchgeführt.

Durch Gel-Retardationsanalysen wurde nachgewiesen, daß die DNA-Bindung der

BGT unabhängig von der DNA-Sequenz und der DNA-Modifikation ist. Zudem wird die

Affinität der BGT zur DNA durch die Bindung des Donorsubstrates UDPG gesteigert.

Das Substrat-Analogon 5’-Hydroxymethyluracil (5’-HMU) wird in gleicher weise

glykosyliert, wie das natürliche Akzeptorsubstrat 5’-Hydroxymethylcytosin (5’HMC). Dies

spricht für eine unspezifische Übertragung der Glukose auf das Akzeptorsubstrat.

Vergleichende Aktivitätstests mit 5’-HMU-modifizierten Oligonukleotiden mit verschiedenen

Basen an der komplementären Position der Akzeptorbase, belegen eine Partnerbasen-

abhängige Glykosylierung der BGT. Die BGT erkennt spezifisch ein Guanin an der

Partnerposition, vermutlich über Interaktionen zweier exponierter Proteinschleifen.

Eine Spezifität der BGT bezüglich des Metall-Kofaktors besteht nicht. Neben dem

natürlichen Kofaktor Mg2+ führen auch die divalenten Kationen Ca2+, Mn2+ und Ba2+ zu einer

vergleichbaren Aktivierung der BGT. Der natürliche Kofaktor Mg2+ dient nicht zur

Neutralisierung der negativen Ladung des Pyrophosphat-Anteils des Donorsubstrates UDPG,

wie es für zahlreiche NDP-Glykosyltransferasen nachgewiesen wurde. Die strukturelle

Analyse des BGT-Komplexes mit UDP und Mg2+ deutet darauf hin, daß das Mg2+ durch den

Ausgleich einer während der Produktentlassung neu entstehenden negativen Ladung, die

Freisetzung des UDP fördert.

Zusammenfassung

91

Im Rahmen der Mutationsanalyse wurden die enzymkinetischen Daten, die DNA-

Bindung und der isoliert betrachtete UDPG-Umsatz des BGT-Wildtyps und der BGT-

Mutanten miteinander verglichen. Dadurch konnte die Funktion des Phe72 als DNA-

interagierende Aminosäure bestätigt werden. Es ist davon auszugehen, daß das Phe72 in die

Lücke der ausgeklappten Base interkaliert, um einer Destabilisierung der DNA

entgegenzuwirken. Analog zu einigen Methyltransferasen und DNA-Glykosylasen katalysiert

die BGT die Modifikation der DNA über einen Basenausklappmechanismus. Die Funktion

der Aminosäuren Asp100 und Glu22 als generelle Basen zur Bereitstellung des 5’-

Hydroxymethylcytosins als Nukleophil kann ausgeschlossen werden. Eine sekundäre

Beteiligung an der Reaktion ist jedoch wahrscheinlich. Asp100 übernimmt dabei eine

strukturgebende Funktion, da es an der Ausbildung einer von insgesamt drei Salzbrücken

beteiligt ist, die maßgeblich zur Stabilisierung der aktiven geschlossen Konformation der

BGT beitragen. Glu22 unterstützt gemeinsam mit dem Kofaktor Mg2+ als Säure-Katalysator

die Freisetzung des Produktes UDP nach der Transferreaktion. Die postulierte Funktion des

Glu163 zur Positionierung des Kofaktors in der katalytischen Region wurde nicht bestätigt, da

die Substitution durch Alanin keinen Einfluß auf die BGT-Aktivität hat. Die Aminosäure

Tyr261 spielt nur eine untergeordnete Rolle bei der Fixierung des Zuckeranteils während der

Transferreaktion.

Durch Inhibitionstudien mit verschiedenen UMP-Derivaten, konnten insgesamt fünf

Aryl-Phosphat-UMP-Derivate gefunden werden, die mit Ki-Werten im mikromolaren Bereich

potentielle Inhibitoren der BGT darstellen. Es handelt sich um die Inhibitoren M4, H8, RB3,

RA3 und AXP4.

Unmittelbar vor der Fertigstellung dieser Dissertation konnte ein ternärer Komplex aus

BGT, DNA und UDPG kristallisiert werden (Dr. Solange Moréra). Durch die

röntgenkristallographische Untersuchung dieses Komplexes werden die Resultate dieser

Arbeit, bezüglich der DNA-Interaktion und der Zucker-Transferreaktion im wesentlichen

bestätigt. Insbesondere kann die DNA-Interkalierung des Phenyalanins 72 aufgrund des

Basenausklappmechanismus der BGT strukturell nachgewiesen werden.

92

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Funktionelle und strukturelle Untersuchungen der · zyklisch permutierte Genome ... reversible...

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