Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die...
Transcript of Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die...
Aus dem Institut für Tierschutz und Verhalten
(Heim-, Labortiere und Pferde)
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
und
dem Institut für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie
des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf
Untersuchungen zur Blutdruckregulation
bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der
β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Mareike Kristina Budack
aus Hamburg
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung:
Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth
Univ. Prof. Dr. H. Ehmke
1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. B. Schröder
Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2004
Meinen Eltern
Vorab veröffentlichte Teilergebnisse dieser Arbeit: BUDACK, M., M.E. BLANK, J. FAULHABER u. H. EHMKE (2003): In vitro Untersuchungen zur Aldosteronfreisetzung an isolierten Nebennieren der Maus. Posterpräsentation der kardiovaskulären Forschung am UKE Hamburg, 14.10.2003 Vorab zur Veröffentlichung eingereichte Teilergebnisse dieser Arbeit:
FAULHABER, J., M. BUDACK, M.E. BLANK u. H. EHMKE (2004): In vitro determination of aldosterone secretion in isolated mice adrenal glands. 83. Jahreskongress der Deutschen Physiologischen Gesellschaft Leipzig, 14.-17.03.2004, in prep.
INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung ................................................................................................................ 11
2 Literaturübersicht ................................................................................................ 13 2.1 Blutdruckregulation ..................................................................................................
13 2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ................................................................ 15
2.1.1.1 Aldosteron .............................................................................................................. 17 2.1.1.2 Hyperaldosteronismus ............................................................................................ 22
2.2 Ionenkanäle ................................................................................................................ 24 2.2.1 Kaliumkanäle ............................................................................................................... 24
2.2.1.1 Ca2+-aktivierter K+-Kanal ...................................................................................... 27 2.2.1.1.1 SK-Kanal ....................................................................................................... 27 2.2.1.1.2 IK-Kanal ........................................................................................................ 28 2.2.1.1.3 BK-Kanal ...................................................................................................... 29 2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle
auf die Blutdruckregulation .......................................................................... 37 2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung ............................................................................ 40
3 Material und Methode ........................................................................................ 41 3.1 Material ....................................................................................................................... 41 3.1.1 Lösungen und Puffer .................................................................................................... 41
3.1.1.1 Nebenniereninkubation .......................................................................................... 41 3.1.1.2 Gelelektrophorese .................................................................................................. 42
3.1.2 Chemikalien und Enzyme ............................................................................................ 43 3.2 Versuchstiere .............................................................................................................. 44 3.2.1 Versuchsserien und Stichprobenumfang ...................................................................... 45 3.3 Methoden .................................................................................................................... 47 3.3.1 Genotypisierung der Mäuse ......................................................................................... 47
3.3.1.1 Lysierung der Ohrprobe ......................................................................................... 47 3.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion .................................................................................... 48 3.3.1.3 Gelelektrophorese .................................................................................................. 49
3.3.2 Hämodynamische Untersuchungen an wachen Mäusen .............................................. 50 3.3.2.1 Katheterherstellung ................................................................................................ 50 3.3.2.2 Operative Katheterimplantation ............................................................................. 50 3.3.2.3 Blutdruckmessung .................................................................................................. 53
3.3.3 Spironolactonapplikation ............................................................................................. 55 3.3.4 Bestimmung von Blutparametern ................................................................................ 56
3.3.4.1 Blutabnahme .......................................................................................................... 56 3.3.4.1.1 Blutabnahme für die Elektrolyt-/ Kreatininbestimmung .............................. 56 3.3.4.1.2 Blutabnahme für die Renin-/ Aldosteronbestimmung .................................. 56
3.3.4.2 Analyse .................................................................................................................. 58 3.3.4.2.1 Natrium und Kalium ........................................................................................ 58 3.3.4.2.2 Chlorid ............................................................................................................. 58 3.3.4.2.3 Kreatinin .......................................................................................................... 59 3.3.4.2.4 Renin ............................................................................................................… 59 3.3.4.2.5 Aldosteron ........................................................................................................ 60
3.3.5 Morphometrische Untersuchungen .............................................................................. 62 3.3.6 Inkubation von Nebennieren in vitro ........................................................................... 63
3.3.6.1 Organentnahme und Präparation ............................................................................ 63 3.3.6.2 Inkubation .............................................................................................................. 63
3.3.6.2.1 Vorversuche ..................................................................................................... 64 3.3.6.2.2 Kaliumstimulation ............................................................................................ 65 3.3.6.2.3 ANG II-Stimulation .....................................................................................… 66 3.3.6.2.4 ACTH-Stimulation .......................................................................................... 67
3.3.7 Statistik ........................................................................................................................ 68
4 Ergebnisse ............................................................................................................... 69 4.1 Genotypisierung ......................................................................................................... 69 4.2 Versuchsserie 1 und 2 ................................................................................................ 71 4.2.1 Hämodynamische Daten .............................................................................................. 71 4.2.2 Morphometrische Daten .............................................................................................. 72 4.2.3 Ergebnisse der Blutuntersuchungen ............................................................................ 74
4.2.3.1 Elektrolyte und Kreatinin ...................................................................................... 74 4.2.3.2 Renin ...................................................................................................................... 75 4.2.3.3 Aldosteron .............................................................................................................. 76
4.3 Versuchsserie 3 ........................................................................................................... 77 4.3.1 Hämodynamische Daten .............................................................................................. 77 4.3.2 Morphometrische Daten ............................................................................................... 78 4.4 Versuchsserie 4 ........................................................................................................... 79 4.4.1 Vorversuch ................................................................................................................... 80 4.4.2 Kaliumstimulation ........................................................................................................ 81
4.4.2.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 81 4.4.2.2 Stimulation mit Kalium .......................................................................................... 82
4.4.3 ANG II-Stimulation ..................................................................................................... 84 4.4.3.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 84 4.4.3.2 Stimulation mit ANG II ......................................................................................... 85
4.4.4 ACTH-Stimulation ....................................................................................................... 88 4.4.4.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 88 4.4.4.2 Stimulation mit ATCH ......................................................................................…. 89
5 Diskussion ................................................................................................................ 92
6 Zusammenfassung .............................................................................................. 108
7 Summary ................................................................................................................ 111
8 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 114
9 Anhang ................................................................................................................... 138
VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN A. Arterie
Abb. Abbildung
ACTH Adrenocorticotropeshormon
ANG II Angiotensin II
AT1 Angiotensin-Rezeptor Typ 1
AT2 Angiotensin-Rezeptor Typ 2
BK-Kanal big conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal
bp Basenpaare
BSA Bovines Serumalbumin
BW Körpergewicht
°C Grad Celsius
cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat
cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure
cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat
cm Zentimeter
C-Terminus Carboxyterminus von Proteinen bzw. Peptiden
dl Deziliter
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP 2´-Desoxyribonukleotid-5´-triphosphat
ED50 50% der Effektiven Dosis
EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure
et al. et alii (und weitere)
Fa. Firma
g Gramm
h Stunde
HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino)-ethansulfonsäure
HGW Herzgewicht
H2O Wasser
HZV Herzzeitvolumen
I.D. Innendurchmesser
I.E. Internationale Einheiten
IK-Kanal intermediate conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal
in prep. in preparationem (in Vorbereitung)
i.p. intraperitoneal
Kap. Kapitel
kb Kilobasenpaare
kg Kilogramm
KGW Körpergewicht
Kir einwärts gleichrichtender Kaliumkanal
KO Knockout Maus
Kv spannungsabhängiger Kaliumkanal
l Liter
Lig. Ligamentum
LV linker Ventrikel
M molar
MAD mittlerer arterieller Blutdruck
mg Milligramm
min Minute
MJ Megajoule
ml Milliliter
mm Millimeter
mM millimolar
mosmol Milliosmol
MW Mittelwert
µg Mikrogramm
µl Mikroliter
n Anzahl
ng Nanogramm
nm Nanometer
nM nanomolar
N. Nervus
NO Stickoxid
N-Terminus Aminoterminus von Proteinen bzw. Peptiden
O.D. Aussendurchmessser
PBS phosphatgepufferte Salzlösung
PCR Polymerase-Kettenreaktion
pg Picogramm
PGI2 Prostaglandin I2 (Prostacyclin)
PKA Proteinkinase A (cAMP-abhängig)
PKC Proteinkinase C (Ca2+-abhängig)
PKG Proteinkinase G (cGMP-abhängig)
pmol Picomol
PRC Plasmareninkonzentration
pS Picosiemens
® eingetragenes Warenzeichen
RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
RIA Radioimmunoassay
RT Raumtemperatur
RV rechter Ventrikel
s.c. subkutan
SD Standardabweichung
SEM Standardfehler des Mittelwerts
SK-Kanal small conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal
TAE Tris-Acetat-EDTA
TBE Tris-Borsäure-EDTA
TM Transmembransegment
TPR totaler peripherer Widerstand
Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan
UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
UV-Licht ultraviolettes Licht
V Volt
V. Vene
VIP vasoaktives intestinales Peptid
WT Wildtyp Maus
x g x-fache Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/sec2)
ZVD zentral venöser Druck
Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt.
Einleitung
1 Einleitung
Die arterielle Hypertonie ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem, von dem 25 % der
erwachsenen Bevölkerung der Industrieländer betroffen sind (BURT et al. 1995,
STOWASSER u. GORDON 2003). Trotz der herausragenden Bedeutung des erhöhten
Blutdrucks als Krankheitsursache ist seine Ätiologie weitgehend unbekannt.
Durch die Anwendung genetischer Methoden haben sich für die Analyse von Faktoren, die
an der Entstehung einer Hypertonie beteiligt sind, völlig neue Perspektiven eröffnet. Die
gezielte Ausschaltung identifizierter Gene ermöglicht es, primäre physiologische
Mechanismen auch in vivo zu charakterisieren. Tatsächlich hat die Untersuchung seltener
erblicher Formen von arterieller Hypertonie, bei denen Mutationen einzelner Gene mit
großen Effekten auf den Blutdruck korreliert sind, wichtige neue Einsichten in fundamentale
Wege der Blutdruckregulation beim Menschen aufgezeigt (LIFTON et al 2001). Bislang
konnten mindestens 8 Gene identifiziert werden, bei denen spezifische Fehlfunktionen direkt
zu einer Hypertonie führen. Bemerkenswert ist hierbei, dass in allen Fällen Genprodukte
betroffen waren, welche die renale Salzreabsorbtion und Volumenhomöostase beeinflussen.
Bei einer Reihe von genetischen Veränderungen betraf die pathophysiologische Störung
direkt die Regulation des Blutdrucks und der Salzhomöostase durch das Renin-Angiotensin-
Aldosteron-System, z.B. über eine erhöhte Aldosteronsynthese (PASCOE et al. 1992), eine
gesteigerte Aldosteronsekretionsrate (LIFTON et al. 1992) oder eine veränderte Aldosteron-
Mineralocorticoidrezeptor-Interaktion (GELLER et al. 1998 u. 2000).
Die Konzentrationen von Aldosteron im Plasma unterliegen einer strengen physiologischen
Regulation. Die Aldosteronsekretion wurde in früheren Studien bereits intensiv an in vitro
kultivierten Zona glomerulosa-Zellen untersucht (HILBERS et al. 1999, LOTSHAW 1997 a,
b u. 2001). Die Resultate legten nahe, dass die Kontrolle der Aldosteronsekretion vor allem
über Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration infolge von Membranpotential-
änderungen erfolgt, wodurch die sekretorische Aktivität der Zona glomerulosa-Zellen
entscheidend beeinflusst wird. Da die Höhe des Membranpotentials eng an die Aktivität von
Kaliumkanälen geknüpft ist (NELSON et al. 1995), wurde bereits seit längerem vermutet,
dass eine Modulation von Kaliumkanälen maßgeblich an der Regulation der
Aldosteronsekretion beteiligt ist. Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Prof. H. Ekmke
11
Einleitung
(2003) konnte an akut dissoziierten Zona glomerulosa-Zellen von Wildtyp Mäusen
tatsächlich ein sehr ausgeprägter spannungs- und calciumabhängiger Kaliumstrom
nachgewiesen werden, der sich durch Zugabe von 100 nM Iberiotoxin vollständig blockieren
ließ. Dieser Befund unterstützt die Vorstellung, dass BK-Kanäle an der Regulation der
Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen beteiligt sein könnten.
In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende
Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielen, indem sie einen negativen
Feedback-Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermitteln (JAGGAR et al.
2000). Diese Interpretation schien in hervorragender Weise durch den Phänotyp von Mäusen
bestätigt zu werden, bei denen die β1−Untereinheit genetisch inaktiviert wurde (BRENNER
et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000). Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde
geschlussfolgert, dass die arterielle Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz
des erhöhten Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b,
STANDEN 2000, PATTERSON et al. 2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher
Mechanismus wäre von größtem wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich
hierbei um den erstmaligen Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie
handeln würde.
Allerdings könnte der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen auch eine alternative
Erklärung finden. In Anbetracht der starken funktionellen Expression von BK-Kanälen in
Zona glomerulosa-Zellen wäre es sehr gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der
BKβ1−Untereinheit zu einer gestörten Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen,
dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für
die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind. Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei
BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten starken linksventrikulären Hypertrophie (BRENNER
et al. 2000 b) beitragen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob BKβ1-/- Mäuse pathologische
Veränderungen des Aldosteronsystems aufweisen, die für die Entstehung der Hypertonie
ursächlich verantwortlich sind. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, soll im Rahmen dieser
Arbeit des Weiteren untersucht werden, ob diese Störung durch eine veränderte Regulation
der Aldosteronsekretion in den Nebennieren unter Beteiligung der BK-Kanäle verursacht
wird.
12
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Blutdruckregulation
Als Blutdruck wird der in den Gefäßen des Körper- und Lungenkreislaufs herrschende Druck
bezeichnet, welcher die treibende hämodynamische Kraft für die Blutzirkulation darstellt. Im
eigentlichen Sinne stellt der mittlere arterielle Blutdruck (MAD) den im arteriellen System
auf Herzhöhe gegen den Atmosphärendruck gemessenen Druck dar. Dieser wird als Produkt
des Herzzeitvolumens (HZV) und des totalen peripheren Widerstandes (TPR) zuzüglich des
zentral venösen Drucks (ZVD) definiert.
MAD = (HZV x TPR) + ZVD
Der totale periphere Widerstand ist abhängig von dem Tonus und der Elastizität der
Gefäßwände, während das Herzzeitvolumen eine Funktion der Herzfrequenz und des
Schlagvolumens ist.
Die Regelung des Blutdrucks erfolgt durch Änderung des peripheren Widerstands durch
Vasodilatation bzw. Vasokonstriktion der Widerstandsgefäße oder durch Veränderung des
Herzzeitvolumens (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).
Eine Vielzahl physiologischer Systeme, die humorale, nervöse und metabolische Faktoren
einschließen, ist an der Blutdruckregulation beteiligt (GUYTON 1991, COWLEY 1992,
PERSSON 1996). Diese Systeme interagieren in komplexer Wechselwirkung, wodurch eine
adäquate Durchblutung der peripheren Gewebe sowie die Aufrechterhaltung des MAD
gewährleistet werden. Anhand des Zeitraums, in welchem die Regulationssysteme wirksam
werden, können kurzfristige, mittelfristige und langfristige Systeme unterschieden werden.
Die kurzfristige Blutdruckregulation basiert vor allem auf der Wirkung des vegetativen
Nervensystems. Die schnellste der nervalen Reaktionen wird durch arterielle
Pressorezeptoren vermittelt, die in der Gefäßwand des Carotissinus sowie des Aortenbogens
lokalisiert sind und den Pressorezeptorenreflex auslösen. Diese Mechanorezeptoren
detektieren den mittleren Blutdruck sowie Schwankungen des systemischen Blutdrucks, der
Herzfrequenz und der Anstiegssteilheit des Druckpulses anhand einer veränderten
13
Literaturübersicht
Wandspannung und senden über Afferenzen der IX. und X. Hirnnerven Signale zum Nucleus
tractus solitarii und Nucleus ambiguus in der dorsalen Medulla oblongata. Über efferente
sympathische Nervenbahnen erfolgt eine Regulation der Herzfrequenz, der Kontraktilität des
Herzens und des TPR, wohingegen parasympathische Efferenzen ausschließlich eine
Reduktion der Herzfrequenz induzieren. Aufgrund dieser Mechanismen werden
Schwankungen des MAD innerhalb von Sekunden abgepuffert (TIMMERS et al. 2003). In
Volumenexpansions-Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch eine Ausschaltung des
Pressorezeptorenreflexes einerseits die schnelle Blutdruckregulation hochgradig gestört war,
sich andererseits der Blutdruck jedoch innerhalb einer Stunde nach Expansion des
Blutvolumens mittels Infusion wieder normalisierte (DOBBS et al. 1971). In weiteren
Experimenten an verschiedenen Säugetierspezies konnte gezeigt werden, dass durch
Denervierung der Pressorezeptoren eine Hypertonie induziert wurde, die jedoch innerhalb
von 7-14 Tagen wieder kompensiert wurde (COWLEY et al. 1973, ITO u. SCHER 1978,
SHADE et al. 1990). Diese Normalisierung des Blutdrucks wurde durch andere, verzögert
wirkende Kontrollmechanismen ausgelöst.
So greift nach einigen Minuten das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) in die
Blutdruckregulation ein und zählt neben der Volumenverschiebung zwischen den Kapillaren
und dem extravasalen Raum, dem Kinin-Kallikrein-System (RHALEB et al. 2001,
TRABOLD et al. 2002) sowie parakrinen Faktoren (RUSKOAHO et al. 1997) zu den
wichtigsten mittel- bis langfristig wirkenden Regulationsmechanismen (GUYTON 1991).
Die dominierende Rolle der Niere bei der langfristigen Blutdruckregulation konnte in
klinischen und experimentellen Studien gezeigt werden (COWLEY u. ROMAN 1996).
Infolge von Schwankungen des Perfusionsdrucks der Niere erfolgt eine Regulation der
Wasser- und Natriumausscheidung, woraus eine Veränderung des Blutvolumens resultiert
(GUYTON 1992). Ebenso bestätigen die Ergebnisse von Nierentransplantationsstudien die
wichtige Rolle der Niere bei der Langzeitregulation des arteriellen Drucks und der
Pathogenese genetischer Formen der arteriellen Hypertonie. So konnte gezeigt werden, dass
es bei der Transplantation der Niere einer genetisch hypertensiven Ratte in eine
histokompatible normotensive Ratte zur Auslösung einer arteriellen Hypertonie kommt
(GRAF et al. 1993, RETTIG 1993). Bei Transplantation der Niere einer normotensiven Ratte
in eine bilateral nephrektomierte spontan hypertensive Ratte (SHR) konnte ein gesenkter
Blutdruck in der Empfängerratte festgestellt werden (PATSCHAN et al. 1997).
14
Literaturübersicht
2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System
Das systemische Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ist von zentraler Bedeutung
für die mittel- bis langfristige Blutdruckregulation und die Homöostase des Wasser- und
Elektrolythaushalts des Organismus. Die Peptidase Renin wird in den Epitheloidzellen des
juxtaglomerulären Apparats der Niere synthetisiert (BARAJAS 1979). Die Sekretion von
Renin aus den Epitheloidzellen wird durch unterschiedliche Stimuli induziert. So wird die
Reninfreisetzung durch Abnahme des Nierenperfusionsdrucks, durch Verringerung der Na+-
Konzentration im proximalen Teil des distalen Tubulus (Macula densa) und durch eine
gesteigerte Sympathikusaktivität stimuliert. Die Reninsekretion unterliegt außerdem der
Kontrolle durch humorale Faktoren einschließlich Angiotensin II (ANG II), NO, Endothelin
und Steroidhormonen (TAUGNER et al. 1984, WAGNER et al. 1998). Spezielle Second
messenger wie cAMP (Steigerung der Reninsekretion), Ca2+ und Proteinkinase C (Hemmung
der Reninsekretion) sowie cGMP (Steigerung/Hemmung der Reninsekretion) vermitteln
unter anderem auf zellulärer Ebene die Signalweiterleitung (FRIIS et al. 2002).
Renin spaltet aus dem von der Leber synthetisierten und ins Plasma freigesetzte
Angiotensinogen das Dekapeptid Angiotensin I ab. Dieses wird unter Abspaltung zweier
Aminosäuren durch das ubiquitär vorkommende Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) in
das stark biologisch aktive Oktapeptid ANG II umgewandelt (siehe Abb. 1).
15
Literaturübersicht
Angiotensinogen (452 AS)
Angiotensin I (10 AS)
Angiotensin II (8 AS)
AT1 AT2
ACE
Renin
• Zelldifferenzierung • Hemmung der
Proliferation • Blutdruckregulation
• Vasokonstriktion • Aldosteronfreisetzung • Kardiale Kontraktilität • Catecholaminfreisetzung • Kardiale u. vaskuläre
Hypertrophie • Aufrechterhaltung der GFR • Steigerung der Na+-Resorption
Abbildung 1: Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). AS: Aminosäure; ACE: Angiotensin-Converting-Enzym; AT1: Angiotensin-Rezeptor Typ 1; AT2: Angiotensin-Rezeptor Typ 2; GFR: glomeruläre Filtrationsrate
Die Wirkungen von ANG II werden über die G-Protein-gekoppelten AT1- und AT2-
Rezeptoren vermittelt. Bei Nagetieren konnten 2 Isoformen des AT1-Rezeptors, AT1a- und
AT1b-Rezeptor, identifiziert werden. Die Rezeptoren sind an der Plasmamembran von Zellen
kardiovaskulärer, endokriner und endothelialer Organe lokalisiert (KASCHINA u. UNGER
2003). Der AT1a-Rezeptor ist unter anderem an der peripheren Vasokonstriktion, der
Hypertrophie glatter Muskulatur, der renalen Salz- und Wasserresorption und an der
zentralen Blutdruckregulation beteiligt. Der AT1b-Rezeptor wird unter anderen in endokrinen
Organen wie der Nebenniere und der Hypophyse sowie in mesangialen und
juxtaglomerulären Zellen exprimiert und ist beispielsweise an der Regulation der
Aldosteronsekretion in den Nebennieren beteiligt (KASCHINA u. UNGER 2003). Der AT2-
16
Literaturübersicht
Rezeptor ist für die fetale Entwicklung, die Zelldifferenzierung, die Apoptose und
Regeneration von Gewebe sowie die Blutdruckregulation wichtig (CAREY et al. 1999).
Neben dem klassischen systemischen, endokrinen System, bei dem alle Komponenten des
RAA-Systems in der Blutbahn zirkulieren und so zu den Zielorganen transportiert werden,
sind in den letzten Jahren lokale Systeme in verschiedenen Organen einschließlich Gehirn,
Herz, Gefäße, Fettgewebe, Niere und Nebenniere beschrieben worden (PHILLIPS et al.
1993). Die physiologische Bedeutung und die gewebsspezifische Regulation dieser lokalen
Renin-Angiotensin-Systeme ist derzeit nur unvollständig bekannt. Untersuchungen stützen
jedoch die Hypothese, dass diese lokalen Systeme unter anderem eine pathogenetische Rolle
bei der Entwicklung bestimmter Hypertonieformen und Nephropathien spielen sowie an den
Hypertonie-assoziierten Endorganschäden beteiligt sind (PINTO et al. 1997, LUFT et al.
1999, PARK et al. 2003).
2.1.1.1 Aldosteron
Aldosteron gehört zu den Steroidhormonen mit 21 C-Atomen und wird aufgrund seiner
speziellen Wirkung auf den Elektrolythaushalt als Mineralocorticoid bezeichnet.
Aldosteron wird in den Nebennieren synthetisiert, welche morphologisch in die
Rindenschicht (cortex) und das Mark (medulla) unterteilt werden. In der Rindenschicht
lassen sich histologisch drei Zonen differenzieren: die äußere Zona glomerulosa, in der
Aldosteron produziert wird, die Zona fasciculata als Produktionsregion der Glucocorticoide
sowie die innen gelegene Zona reticularis, in der vor allem Androgene synthetisiert werden.
In der einheitlich strukturierten Medulla werden die Catecholamine Adrenalin und
Noradrenalin produziert (DUNN 1970, BLAND et al. 2003).
Wie alle Steroidhormone wird Aldosteron über Zwischenprodukte aus Cholesterol als
Ausgangssubstrat synthetisiert (siehe Abb. 2). Über die Substrate Pregnenolon und
Progesteron entsteht 11-Desoxycorticosteron, aus welchem sowohl Corticosteron als auch
Aldosteron gebildet werden kann. Entscheidend für die Differenzierung in Corticosteron
bzw. Aldosteron sind zwei Enzyme, welche die letzten Syntheseschritte katalysieren und
eine spezifische Lokalisation in der Nebenniere aufweisen. Die 11β-Hydroxylase
CYP11B1 (auch P450c11 genannt) wird in Zellen der Zona fasciculata exprimiert und
17
Literaturübersicht
vermittelt die Bildung der wichtigsten Glucocorticoide Corticosteron und Cortisol. Im
Gegensatz dazu kommt die Aldosteronsynthase CYP11B2 (auch P450aldo genannt)
ausschließlich in Zona glomerulosa-Zellen vor und katalysiert die drei letzten
Aldosteronsyntheseschritte (MULLER 1998).
Cholesterol
11-Desoxycorticosteron (DOC)
17-OH-PregnonolonPregnenolon
Side chaincleavage enzyme
(CYP11A)
17α−Hydroxylase
17-OH-ProgesteronProgesteron
11-Desoxycortisol
3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (CYP17)
21-Hydroxylase (CYP21)
Aldosteron Corticosteron Cortisol
Corticosteron
11β-Hydroxylation
18-Hydroxylation
18-Oxidation
Corticosteron
18-Hydroxy-corticosteron
Ald
oste
rons
ynth
ase
(CY
P11B
2)(P
450a
ldo)
11β-Hydroxylase (C
YP11B
1)(P450c11)
11β-Hydroxylation
ACTH (kurzfristig), ANG II, K +
ANG II, K +
ACTH (langfristig)
Abbildung 2: Syntheseschritte und Regulatoren der Aldosteronproduktion.
Die Aldosteronproduktion unterliegt einem multifaktoriellen Kontrollsystem, durch
welches die Plasmaaldosteronkonzentration an akute und chronische Veränderungen des
Wasser- und Elektrolythaushalts angepasst wird. Neben den wichtigen Regulatoren ANG II
18
Literaturübersicht
und der extrazellulären Kaliumkonzentration (VINSON et al. 1985, LOTSHAW 2001,
PEARCE et al. 2003) kontrollieren zahlreiche weitere Substanzen einschließlich
Adrenomedullin (NUSSDORFER et al. 1997), Vasopressin (GALLO-PAYET u.
GUILLON 1998) und Prolactin (GLASOW et al. 1996) die Aldosteronproduktion. In
diversen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass ergänzend zu dem systemischen
ANG II das lokale Renin-Angiotensin-System der Nebennierenrinde einen bedeutenden
Stimulus der Aldosteronproduktion darstellt (HILBERS et al. 1999, MAZZOCCHI et al.
2000). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnten alle Komponenten des Renin-
Angiotensin-Systems in den Zellen der Zona glomerulosa nachgewiesen werden
(MULROW 1999).
ACTH, der dominierende Regulator der Glucocorticoidproduktion, bewirkt hingegen nur
eine zeitlich begrenzte Stimulation und wirkt über längeren Zeitraum inhibierend auf die
Aldosteronproduktion (LUMBERS 1999, SEWER u. WATERMAN 2003). In zahlreichen
Experimenten an isolierten Nebennierenzellen und Nebennierenstücken konnten weitere
Faktoren identifiziert werden, die einen modulierenden Einfluss auf die
Aldosteronsekretion ausüben. Hierzu gehören unter anderem Endothelin (ROSOLOWSKY
u. CAMPBELL 1990), Stickoxid (HANKE u. CAMPBELL 2000), das atriale natriuretische
Peptid (ATARASHI et al. 1985) und Veränderungen der extrazellulären Osmolalität
(MAKARA et al. 2000).
Die Regulation der Aldosteronsekretion auf zellulärer Ebene erfolgt über verschiedene
Signalkaskaden. So wird die ACTH-Wirkung über cAMP und die Stimulierung mittels
ANG II unter anderem durch den Phosphatidylinositolmechanismus vermittelt (SPÄT
1988, SPÄT et al. 1991). Intensive in vitro Untersuchungen unterstreichen jedoch die große
Bedeutung der intrazellulären Ca2+-Konzentration (siehe Abb. 3). So wird durch einen
Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration die Aldosteronsekretion stimuliert (SPÄT et
al. 1991, ROSSIER et al. 1996 a). Der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration
erfolgt aufgrund einer Aktivierung von T- und L-Typ Ca2+-Kanälen (ROSSIER et al. 1996
b) und nichtselektiven Kationenkanälen (LOTSHAW u. LI 1996) sowie durch Freisetzung
von Ca2+ aus intrazellulären Calciumspeichern (BARRETT et al. 1989). Die
spannungsabhängigen T- und L-Typ Ca2+-Kanäle werden durch Membrandepolarisation
unter anderem infolge eines Anstiegs der extrazellulären K+-Konzentration aktiviert und,
wie Untersuchungen zeigten, durch ANG II in ihrer Funktion moduliert (CHEN et al. 1999
19
Literaturübersicht
b). Da die Höhe des Membranpotentials eng mit der Aktivität von Kaliumkanälen
korreliert, wurde bereits seit längerem vermutet, dass eine Modulation von Kaliumkanälen
durch Änderung der extrazellulären Kaliumkonzentration und/oder ANG II maßgeblich an
der Regulation der Aldosteronsekretion beteiligt sein könnte. Trotz zahlreicher
Untersuchungen und des Nachweises einer Reihe von Kaliumkanaluntereinheiten in Zellen
der Zona glomerulosa konnte jedoch bis heute kein Konsens hinsichtlich ihrer Relevanz für
die Aldosteronsekretion herbeigeführt werden (BRAUNEIS et al. 1991, VASSILEV et al.
1992, PAYET et al. 1995, LOTSHAW 1997 a, b).
ANG II
ACTHCa 2+
(AT1b-Rezeptor)
IP3
Ca2+Ca2+ Ca2+Ca 2+
K+Ca 2+
Ca 2+
DAG
PKCCalmodulin
CaMK
(ACTH-Rezeptor)
Ca 2+ATPcAMP
Aldosteronsynthese
Ca 2+
(T-typCa2+-Kanal)
PKA
(G-Protein)
(NSCC)
Abbildung 3: Schematische Darstellung der zellulären Signalkaskade bei
Stimulation der Aldosteronsekretion durch K+, ANG II und ACTH. NSCC: nichtselektiver Kationenkanal; PKA: Proteinkinase A; PKC: Proteinkinase C; IP3: Inositoltriphosphat; DAG: Diacylglycerol; ATP: Adenosintriphosphat; cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; CaMK: Ca2+/Calmodulinabhängige Proteinkinase.
20
Literaturübersicht
Seit langem ist die essentielle Bedeutung von Aldosteron für die Homöostase des Wasser-
und Elektrolythaushaltes bekannt, welche in neueren Untersuchungen an transgenen
Mäusen eindrucksvoll bestätigt wurde (BERGER et al. 1998). So besteht die wichtigste
systemische Funktion des Aldosterons in der Steigerung des transepithelialen
Ionentransports (insbesondere für Na+, K+ und Cl-) vor allem in der Niere, jedoch auch dem
Kolon, den Speicheldrüsen und den Schweißdrüsen. Hieraus resultiert eine Veränderung
der Ionenkonzentration im Plasma sowie des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens und des
Blutdrucks (PEARCE et al. 2003). In der Niere führt Aldosteron in den distalen
Tubulusabschnitten zu einer funktionellen Aktivierung des Epithelialen Natriumkanals
„ENaC“ (CHEN et al. 1999 a, ROSSIER et al. 2002, KAMYNINA u. STAUB 2002), der
Na+/K+-ATPase (VERREY et al. 2003), des Na+/Cl--Cotransporter (ABDALLAH et al.
2001) und des Cl-/Anionen-Austauscher „Pendrin“ (VERLANDER et al. 2003).
Durch zahlreiche Untersuchungen konnten darüber hinaus Mineralocorticoidrezeptoren in
nicht-epithelialen Geweben einschließlich Blutgefäßen und Herz identifiziert werden
(MOGUILEWSKY u. RAYNAUD 1980, COIRINI et al. 1983, GOMEZ-SANCHEZ 1997,
BARBATO et al. 2002). Durch verschiedene Arbeitsgruppen wurde die Hypothese
gefestigt, dass Aldosteron auch in den Blutgefäßen regulierend an dem zellulären
Elektrolyttransport beteiligt ist (ALZAMORA et al. 2003, JIANG et al. 2003). Die
Wirkung von Aldosteron auf kardiale Zellen unter physiologischen Bedingungen ist bis
heute jedoch nicht zweifelsfrei geklärt. Im Gegensatz hierzu konnte deutlich gezeigt
werden, dass Aldosteron in die Pathogenese von kardialen Erkrankungen einschließlich
Herzhypertrophie und –fibrose sowie Arrhythmien involviert ist und auch ein lokales,
kardiales Aldosteronsystem an dem Krankheitsgeschehen beteiligt ist (DELCAYRE et al.
2000, WEBER et al. 2003). Durch pharmakologische Untersuchungen mit
Aldosteronrezeptor-Antagonisten wie Spironolacton und Eplerenon sowie durch
experimentelle Studien an transgenen Mausmodellen konnte diese Hypothese untermauert
werden (ROCHA et al. 2000, DELYANI et al. 2001, OESTREICHER et al. 2003, STIER
et al. 2003).
21
Literaturübersicht
2.1.1.2 Hyperaldosteronismus
Hyperaldosteronismus ist eine Erkrankung, die durch eine gesteigerte Sekretion des
Mineralocorticoids Aldosteron verursacht wird und mit spezifischen Symptomen
einhergeht. Anhand der Ätiologie werden ein primärer (adrenaler) und ein sekundärer
(extraadrenaler) Hyperaldosteronismus unterschieden.
Der primäre Hyperaldosteronismus wird neben der erhöhten Aldosteronproduktion in der
Regel durch Hypertonie, Hypokaliämie und in vielen Fällen durch eine Hypernatriämie
charakterisiert (EDER u. GEDIGK 1990). Die Hypokaliämie kann klinische Symptome wie
Muskelschwäche, Muskelkrämpfe, Obstipation und EKG-Veränderungen verursachen.
Weiterhin kann sich infolge der Hypokaliämie eine metabolische Alkalose entwickeln
(NUSSBERGER 2003, MELBY 1989).
Auf zellulärer Ebene werden die Folgen des Hyperaldosteronismus in erster Linie durch
eine Funktionssteigerung des Epithelialen Natriumkanals im distalen Tubulussystem
hervorgerufen (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Durch zahlreiche Arbeitsgruppen
konnte nachgewiesen werden, dass Aldosteron sowohl eine Aktivierung der vorhandenen
Kanäle bewirkt als auch eine Steigerung der Expression des Epithelialen Natriumkanals in
der apikalen Plasmamembran induziert (ROTIN et al. 2001, VERREY et al. 2003).
Hierdurch erfolgt primär eine verstärkte Reabsorption von Na+ und sekundär, durch
Zunahme des transepithelialen Potentials, eine Steigerung der transepithelialen Diffusion
von Cl-. Auf der basolateralen Seite wird durch Aldosteron die Aktivität der Na+/K+-
ATPase gesteigert, so dass die Natriumionen vermehrt aus den Zellen ins Blut transportiert
werden. Durch die Aktivität der Na+/K+-ATPase steigt intrazellulär die
Kaliumkonzentration, wodurch eine erhöhte Sekretion von Kaliumionen durch
Kaliumkanäle der apikalen Plasmamembran, die ebenfalls direkt durch Aldosteron
hochreguliert werden, in das Lumen erfolgt (FRINDT et al. 2002). Durch sekundäre
Steuerungsprozesse erfolgt aufgrund der Elektrolytverschiebung eine Wasserretention,
welche zu einem erhöhten Blutvolumen und damit verbundener Hypertonie führt.
In den letzten Jahren konnte durch verschiedene Arbeitsgruppen demonstriert werden, dass
Hyperaldosteronismus neben den beschriebenen systemischen auch organische
Veränderungen induzieren kann. So wurde die Beteiligung von Aldosteron bei der
Entstehung kardialer Hypertrophie und Fibrose, welche unabhängig vom Blutdruckanstieg
22
Literaturübersicht
entstehen, nachgewiesen (NICOLETTI et al. 1995, FIEBELER et al. 2001, MIHAILIDOU
et al. 2002). BROWN et al. (2000) stellten des Weiteren einen ätiologischen
Zusammenhang zwischen der Wirkung von Aldosteron und der Entwicklung von
Nephrosklerosen fest.
Das Krankheitsbild des primären Hyperaldosteronismus wurde erstmals von CONN (1955)
beschrieben und hat als Conn-Syndrom Eingang in die Literatur gefunden. Aktuell gewinnt
der primäre Aldosteronismus im Zusammenhang mit der Erforschung primärer Hypertonien
an Bedeutung. Neueren Untersuchungen zufolge soll seine Prävalenz 2,6 bis 11 Prozent in
Spezialambulanzen betragen und somit eine häufige Ursache arterieller Hypertonien sein
(REINCKE et al. 2003). Der primäre Hyperaldosteronismus entsteht durch eine gesteigerte
Aldosteronfreisetzung, die auf pathologische Veränderungen der Nebennieren
zurückzuführen ist (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Als Folge des erhöhten
Plasmaaldosteronspiegels wird die Produktion von Renin durch negativen Feedback
reduziert. Ursachen der gesteigerten Aldosteronfreisetzung können beispielsweise
aldosteronproduzierende Nebennierenrindentumore, Nebennierenhyperplasien sowie
verschiedene genetische Defekte sein. In den letzten Jahren konnte eine Reihe von
genetischen Mutationen identifiziert werden, die zu einem Hyperaldosteronismus führen
(LIFTON et al. 1992, PASCOE et al. 1992, STOWASSER u. GORDON 2000).
Die Ätiologie des sekundären Hyperaldosteronismus ist sehr umfangreich. Verschiedene
Erkrankungen wie Nierenarterienstenosen, chronische Nierenerkrankungen,
reninproduzierende Tumore, Herzinsuffizienzen und autosomal-rezessiv vererbte renale
Tubulusstörungen mit Kaliumverlust, das sogenannte „Bartter-Syndrom“, können einem
sekundären Hyperaldosteronismus zu Grunde liegen (DeGROOT 1989).
Als Folge der primären Erkrankung kommt es zu einer Stimulation des Renin-Angiotensin-
Aldosteron-Systems, welche durch eine Steigerung der Plasmarenin- und
Aldosteronkonzentrationen charakterisiert ist.
23
Literaturübersicht
2.2 Ionenkanäle
Alle Zellen des Organismus werden von ihrer Umgebung sowie anderen Zellen durch
hydrophobe Diffusionsbarrieren, den Membranen, abgegrenzt, durch welche jedoch eine
Kommunikation mit der Umgebung erfolgen kann. So werden aufgrund von
Ionenbewegungen durch die Membran wichtige zelluläre Mechanismen wie beispielsweise
Membranpotentialänderungen und daran gekoppelte physiologische Prozesse vermittelt. Die
Lipiddoppelschicht der Zellmembran ist jedoch für geladene Teilchen quasi nicht permeabel,
und so erfolgt der zelluläre Ionenaustausch über verschiedene integrale
Transmembranproteine. Zu diesen Transportproteinen gehören neben Ionenpumpen, die unter
Energieverbrauch Ionen entgegen ihres Konzentrationsgefälles transportieren, sogenannte
Ionenkanäle, welche Ionen entlang ihres Konzentrationsgefälles den Durchtritt durch die
Plasmamembran per Diffusion ermöglichen. Die meisten dieser Kanäle besitzen aufgrund
von sogenannten Selektivitätsfiltern extrem unterschiedliche Leitfähigkeiten für spezifische
Ionen, so dass sie wegen ihrer Selektivität unter anderem in Ca2+-, K+-, Na+- sowie Cl--
Kanäle eingeteilt werden können. Differenzierte physikalische Eigenschaften ermöglichen
eine weitere Spezifizierung der Kanäle. So lassen sich mit Hilfe biophysikalischer
Untersuchungsmethoden die Aktivierungs- und Inaktivierungskinetiken bestimmen sowie
Regulatoren des Schaltverhaltens und pharmakologische Sensitivitäten identifizieren
(ASHCROFT 1999, HILLE 2001).
2.2.1 Kaliumkanäle
Kaliumselektive Ionenkanäle wurden bis heute in allen Zelltypen nachgewiesen. So werden
Kaliumkanäle sowohl in erregbaren als auch in nicht-erregbaren Zellen exprimiert und sind
an zahlreichen physiologischen Mechanismen beteiligt. Dazu gehören unter anderem die
Kontraktion und Relaxation glatter Muskelzellen, die Weiterleitung von Aktionspotentialen,
die Sekretion von Insulin, die Homöostase des Salz- und Wasserhaushalts in Nierenzellen,
die Zellproliferation und in Neuronen die Steuerung elektrischer Erregbarkeit und
synaptischer Plastizität. Einige Kaliumkanäle sind von Natur aus aktiv, wohingegen jedoch
die Mehrzahl der Kaliumkanäle durch physiologische Signale (z.B.
24
Literaturübersicht
Membranpotentialänderung, Second messenger) aktiviert werden (JAN u. JAN 1994).
Darüber hinaus wird die Sensitivität der Kaliumkanäle gegenüber dem physiologischen
Signal in vielen Fällen durch Proteinphosphorylierung bzw. -dephosphorylierung moduliert
(LEVITAN 1999).
Die meisten Kaliumkanäle setzen sich aus mindestens zwei verschiedenen Untereinheiten
zusammen, den porenbildenden α-Untereinheiten und β-Untereinheiten, die regulatorische
Eigenschaften aufweisen. Durch Interaktion von vier α-Untereinheiten entsteht ein tetrameres
integrales Membranprotein, welches den lipophilen Kanal bildet (ASHCROFT 1999).
Die Kaliumkanäle werden aufgrund der unterschiedlichen Anzahl von hydrophoben
Transmembransegmenten (TM) der α-Untereinheiten in zwei umfassende Strukturklassen
eingeteilt. Die erste Klasse umfasst die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus sechs
transmembranen Helices besteht (6TM-Klasse). Zu dieser Klasse gehören unter anderem die
Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanäle (Kv), die KCNQ Kanäle, die Familie der
Eag Kanäle und die calciumaktivierten Kaliumkanäle (Ca2+-aktivierte K+-Kanäle). Das S4
Segment der spannungsgesteuerten Kanäle dieser Klasse enthält in regelmäßiger Abfolge
basische Aminosäuren (v.a. Arginin und Lysin) und fungiert als Spannungsmesser (HILLE
2001). Bei allen Mitgliedern der 6TM-Klasse befindet sich die Porenregion zwischen den
Transmembransegmenten S5 und S6 (siehe Abb. 4).
Zur zweiten großen Klasse gehören die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus zwei
transmembranen Helices gebildet werden (2TM-Klasse). Der einwärts gleichrichtende
Kaliumkanal (Kir) ist ein Vertreter dieser Gruppe (ASHCROFT 1999, MILLER 2000).
Alle bisher bekannten α-Untereinheiten von Kaliumkanälen besitzen mit kleinen Variationen
die sogenannte Signatursequenz (S) in der Porenregion. Diese Signatursequenz umfasst einen
Bereich von 21 Aminosäuren und zeigt eine sehr starke Homologie innerhalb der Mitglieder
der Kaliumkanäle. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Bereich innerhalb der Kanalpore
einen Selektivitätsfilter für Kaliumionen darstellt (HARTMANN et al. 1991,
HEGINBOTHAM et al. 1994).
25
Literaturübersicht
Abbildung 4: Membrantopologie und wichtigste Bestandteile der α-Untereinheit von Kv und Kir. Nummerierung der transmembranen Helices: Kv S1-S6 u. Kir; M1-M2; P = Pore; S = Signatursequenz; N = Aminoterminus; C = Carboxyterminus; T1 = T1 Domäne; die extrazelluläre Seite befindet sich oberhalb der einzelnen Abbildungen.
In der Regel sind bei den Vertretern beider Klassen sowohl der N-Terminus als auch der C-
Terminus cytoplasmatisch lokalisiert. Eine Ausnahme bildet der spannungsgesteuerte und
calciumaktivierte Kaliumkanal großer Leitfähigkeit (BK-Kanal), der ein zusätzliches
Transmembransegment S0 besitzt, aufgrund dessen der N-Terminus extrazellulär lokalisiert
ist (MEERA et al. 1997).
26
Literaturübersicht
2.2.1.1 Ca2+-aktivierter K+-Kanal
GARDOS demonstrierte an Erythrozyten 1958 als Erster, dass durch Änderung der
intrazellulären Ca2+-Konzentration der Kaliumfluss durch die Zellmembran reguliert wird.
Bis heute wurden der Familie der Ca2+-aktivierten K+-Kanälen drei strukturell
unterschiedliche Kaliumkanäle, die SK-, IK- und BK-Kanäle, zugeordnet, die alle durch
einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert werden. Anhand ihrer
Einzelkanalleitfähigkeit lassen sich die drei Subfamilien elektrophysiologisch
differenzieren (VERGARA et al. 1998). Darüber hinaus besitzen sie unterschiedliche
Spannungssensitivitäten und reagieren differenziert auf pharmakologisch wirksame
Substanzen.
2.2.1.1.1 SK-Kanal (small conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)
SK-Kanäle besitzen sehr kleine Einzelkanalleitfähigkeiten ≤ 20 pS (in 140 mM
symmetrischer KCl-Lösung). Im Gegensatz zu den BK-Kanälen werden die SK-Kanäle
bereits durch nanomolare Ca2+-Konzentrationen spannungsunabhängig aktiviert (Vergara et
al. 1998, LATORRE et al. 1989). Ca2+ interagiert jedoch nicht direkt mit dem SK-Kanal,
vielmehr wird die Aktivierung durch Calmodulin vermittelt, welches einen heteromeren
Komplex mit der α-Untereinheit des Kanals bildet (XIA et al. 1998).
Mittels Klonierung konnten drei Typen von SK-Kanälen (SK1, SK2 und SK3) identifiziert
werden, die alle eine große strukturelle Ähnlichkeit mit den Kv-Kanälen aufweisen
(KÖHLER et al. 1996). Die Unterscheidung der drei SK-Kanäle ist pharmakologisch
aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber dem Bienengift Apamin möglich
(GRUNNET et al. 2001).
SK-Kanäle konnten in zahlreichen erregbaren und nicht-erregbaren Zellen
(Skelettmuskelzellen, glatte Muskelzellen, Zentrales Nervensystem, chromaffine Zellen der
Nebenniere, T-Lymphozyten etc.) nachgewiesen werden (GRUNNET et al. 2001). In
erregbaren Zellen fällt den SK-Kanälen eine fundamentale Rolle bei der Hyperpolarisation
des Membranpotentials zu. So werden sie durch den Anstieg der intrazellulären Ca2+-
Konzentration während eines Aktionspotentials aktiviert, was zu einer
27
Literaturübersicht
Membranhyperpolarisation und damit zu einer Hemmung der Erregbarkeit der Zellen führt
(VERGARA et al. 1998).
2.2.1.1.2 IK-Kanal (intermediate conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)
IK-Kanäle besitzen eine mittlere Einzelkanalleitfähigkeit zwischen 20 und 80 pS. Die IK-
Kanäle werden genau wie die SK-Kanäle bereits durch nanomolare Ca2+-Konzentration
spannungsunabhängig aktiviert (LATORRE et al. 1989, VERGARA et al. 1998). Ebenfalls
vermittelt auch bei den IK-Kanälen Calmodulin die Ca2+-abhängige Aktivierung der Kanäle
(JOINER et al. 2001).
IK-Kanäle werden hauptsächlich in nicht-erregbaren Zellen (wie Blut-, Endothel- und
Epithelzellen) exprimiert, konnten jedoch auch in glatten Muskelzellen nachgewiesen
werden. In nicht-erregbaren Zellen wird die Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern
durch verschiedene Substanzen wie beispielsweise Bradykinin, ATP und Histamin,
induziert (GRYGORCZYK u. SCHWARZ 1983, JENSEN et al. 1998).
Pharmakologisch lassen sich die IK-Kanäle eindeutig von den SK- und BK-Kanälen
unterscheiden. So können die IK-Kanäle durch das Skorpiongift Charybdotoxin und das
Antimykotikum Clotrimazol reversibel blockiert werden. Im Gegensatz zu den BK-
Kanälen sind sie jedoch insensitiv gegenüber dem Skorpiongift Iberiotoxin. Von den SK-
Kanälen können sie durch ihre Insensivität gegenüber Apamin differenziert werden (ISHII
et al. 1997).
28
Literaturübersicht
2.2.1.1.3 BK-Kanal (big conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)
Vorkommen und Funktion
BK-Kanäle (auch als KCNM1, Slo (slowpoke) oder MaxiK+-Kanal bezeichnet) werden
ubiquitär in Zellen und Geweben mit Ausnahme der Myozyten des Herzens exprimiert
(TORO et al. 1998). So konnten bis heute BK-Kanäle aus zahlreichen Geweben
einschließlich Neuronen des zentralen Nervensystems (TSENG-CRANK et al. 1994),
glatten Muskelzellen (SCORNIK et al. 1993, KNAUS et al. 1994) und renalen
Tubuluszellen (KNAUS et al. 1995) isoliert und mittels molekularbiologischer Nachweise
identifiziert werden.
Die ubiquitäre Verteilung legt nahe, dass die BK-Kanäle an zahlreichen physiologischen
Mechanismen beteiligt sind. So konnte gezeigt werden, dass die BK-Kanäle unter anderem
in die Regulation der Sekretion exokriner Drüsen (TRAUTMANN u. MARTY 1984), die
Regulation des Elektrolyt- und Wasserhaushalts in der Niere und im Kolon (GRUNNET et
al. 1999, BRAVO-ZEHNDER et al. 2000, HAY-SCHMIDT et al. 2003, PLUZNICK et al.
2003), die Regulation der Magenmotilität (CARL et al. 1990) und der
Neurotransmitterfreisetzung in Neuronen (TSENG-CRANK et al. 1996) involviert sind. In
glatten Muskelzellen übernehmen die BK-Kanäle eine Schlüsselrolle bei der Regulation
der myogenen Kontraktilität (NELSON et al. 1995).
Ferner konnte nachgewiesen werden, dass die BK-Kanäle in unmittelbarer Nachbarschaft
von L-Typ Calciumkanälen und sarkoplasmatischen Calciumspeichern lokalisiert sind und
als Rückkopplungsmodulatoren dieser Calciumkanäle fungieren. Durch Aktivierung der
BK-Kanäle erfolgt ein Kaliumauswärtsstrom, infolgedessen eine Hyperpolarisation der
Plasmamembran mit Inaktivierung der L-Typ Ca2+-Kanäle erfolgt. Dadurch werden die
zellulären Mechanismen gedämpft, die durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-
Konzentration und/oder Membrandepolarisation eingeleitet wurden (NELSON et al. 1995).
29
Literaturübersicht
Molekulare Struktur
BK-Kanäle bestehen aus hetero-oligomeren Komplexen von Poren-bildenden α-
Untereinheiten (neue Nomenklatur: KCNM1) sowie assoziierten β-Untereinheiten (neue
Nomenklatur: KCNMB1-4) mit regulatorischen Eigenschaften (GARCIA-CALVO et al.
1994, BEHRENS et al. 2000). Essentiell für die Bildung eines funktionellen Kanals ist die
Assoziation von 4 α-Untereinheiten zu einem tetrameren Proteinkomplex.
α-Untereinheit
Die α-Untereinheit wurde zuerst aus der Fliege Drosophila melanogaster (ATKINSON et
al. 1991) und später aus verschiedenen anderen Spezies einschließlich Mensch kloniert
(BUTLER et al. 1993, TSENG-CRANK et al. 1994, VOGALIS et al. 1996). Sie wird von
nur einem Gen kodiert, das jedoch mehrere Splicestellen aufweist (TSENG-CRANK et al.
1994, KNAUS et al. 1995). Die Splicestellen sind auf dem C-Terminus lokalisiert, welcher
2/3 der gesamten Länge der Untereinheit einnimmt (ORIO et al. 2002). Die verschiedenen
Splicevarianten unterscheiden sich hinsichtlich ihrer biophysikalischen und biochemischen
Eigenschaften, wodurch gewebespezifische Unterschiede in der Regulation und in der
physiologischen Funktion der BK-Kanäle erklärt werden können (KNAUS et al. 1995).
Die α-Untereinheit weist eine große Homologie zu der α-Untereinheit der Kv-Kanäle auf.
Zusätzlich zu den 6 Transmembransegmenten besitzt sie jedoch ein 7.
Transmembransegment (S0), das dem S1-Segment vorgeschaltet ist. Durch dieses
zusätzliche Segment verlagert sich der N-Terminus der α-Untereinheiten auf die
extrazelluläre Seite. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl diese extrazelluläre
Lokalisation als auch das S0-Segment entscheidend für die Interaktion mit der
regulatorischen β-Untereinheit ist (WALLNER et al. 1996, MEERA et al. 1997).
Die α-Untereinheit wird in zwei große Abschnitte unterteilt (siehe Abb. 5): einerseits den
Kern (core), welcher sich vom N-Terminus bis zur Verbindung zwischen dem S8 und dem
S9 Segment erstreckt, und anderseits den sich anschließenden Schwanz (tail). Der Kern
umfasst unter anderem den N-Terminus, den Spannungssensor im S4-Segment und die
Pore. Im Schwanz sind ein wichtiger Ca2+-Sensor und das Ende des C-Terminus lokalisiert.
30
Literaturübersicht
Abbildung 5 (ORIO et al. 2002): Molekulare Struktur des BK-Kanals. Topologie der α- und β-Untereinheit.
Die β-Untereinheit
Die β-Untereinheiten der BK-Kanäle sind im Gegensatz zu den cytosolisch lokalisierten β-
Untereinheiten der Kv-Kanäle membranständige Proteine (KNAUS et al. 1994, WALLNER
et al. 1999, XIA et al. 1999). Sie wurden zuerst von KNAUS et al. (1994) aus Gewebe von
Rindertracheen isoliert. Bis heute konnten 4 Varianten der β-Untereinheit (β1–β4)
identifiziert werden, die in chronologischer Reihenfolge nach ihrer Entdeckung nummeriert
wurden. Die β-Untereinheiten weisen untereinander eine große Homologie auf. Sie besitzen
zwei homologe membranspannende Segmente, intrazellulär lokalisierte N- und C- Termini
(siehe Abb. 5) und eine große extrazelluläre Schleife mit zwei Glycosylierungsstellen und
vier Cysteinloci, welche Disulfidbrücken ausbilden (BRENNER et al. 2000 a, JIANG et al.
1998). Am N-Terminus befindet sich eine Phosphorylierungsregion für die cAMP-
abhängige Proteinkinase PKA (CHANG et al. 1997).
Die vier β-Untereinheiten werden gewebespezifisch unterschiedlich stark exprimiert:
o Die β1-Untereinheit kommt hauptsächlich in glatten Muskelzellen vor (KNAUS et al.
1994, VOGALIS et al. 1996), konnte jedoch auch im Gehirn (TSENG-CRANK et al.
31
Literaturübersicht
1996, CHANG et al. 1997) und in Haarzellen von Vögeln (RAMANATHAN et al.
1999 u. 2000) detektiert werden.
o Die β2-Untereinheit konnte unter anderem in humanen chromaffinen Zellen und in
humanem Hirngewebe nachgewiesen werden (WALLNER et al. 1999, BRENNER et
al. 2000 b).
o Die β3-Untereinheit wird in zahlreichen Geweben relativ schwach exprimiert und
konnte von BRENNER et al. (2000 a) bei Menschen nur im Hodengewebe in größeren
Mengen nachgewiesen werden.
o Die β4-Untereinheit ist die β-Untereinheit mit der geringsten Homologie und wird vor
allem im Gehirn in verschiedenen Regionen exprimiert (MEERA et al. 2000).
Die β-Untereinheiten variieren außerdem in ihrem stoichometrischen Verhalten gegenüber
der α-Untereinheit. In der Regel wird die β1-Untereinheit in den glatten Muskelzellen im
Verhältnis 1:1 zu der α-Untereinheit exprimiert (KNAUS et al. 1994), wohingegen im
Gehirn die α-Untereinheit deutlich häufiger als die β4-Untereinheit vorkommt (CHANG et
al. 1996, WANNER et al. 1999).
Durch die β-Untereinheiten wird in außerordentlichem Masse die Ca2+-Sensitivität und die
Öffnungskinetik der BK-Kanäle moduliert. So konnte mittels elektrophysiologischer
Untersuchungen gezeigt werden, dass durch die Koexpression der β-Untereinheiten die
Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der BK-Kanäle verlangsamt und deren Ca2+-
Sensitivität erhöht wurde (VOGALIS et al. 1996, ORIO et al. 2002, QIAN u. MAGLEBY
2003). Nur die β2-Untereinheit, welche die Aktivierungszeit des Kanals verkürzt, stellt eine
Ausnahme dar. Diese Inaktivierung wird durch einen Inaktivierungsball am N-Terminus
der β2-Untereinheit vermittelt, welcher mit der α-Untereinheit interagiert (WALLNER et
al. 1999).
Durch die Koexpression der α- und β-Untereinheit werden außerdem die
pharmakologischen und biochemischen Eigenschaften sowie die Toxinbindung der BK-
Kanäle moduliert (HANNER et al. 1997 u. 1998, ORIO et al. 2002, PATTERSON et al.
2002).
32
Literaturübersicht
Aktivierung
BK-Kanäle lassen sich elektrophysiologisch anhand ihrer hohen Einzelkanalleitfähigkeit
von den vorher beschriebenen SK- und IK-Kanälen unterscheiden. So werden in der
Literatur Einzelkanalleitfähigkeiten zwischen 100 und 250 pS in symmetrischer KCl-
Lösung beschrieben (LATORRE et al. 1989). Im Gegensatz zu den IK- und SK-Kanälen
werden die BK-Kanäle spannungsabhängig durch Membranpotentialänderungen aktiviert.
Der Spannungssensor ist bei den BK-Kanälen wie bei den KV-Kanälen im S4-Segment
lokalisiert (DIAZ et al. 1998, SMITH-MAXWELL et al. 1998).
Durch lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration über 1µM wird die
Spannungssensitivität moduliert (STEFANI et al. 1997, TORO et al. 1998). So zeigten
HORRIGAN u. ALDRICH (2002) in sehr umfangreichen Experimenten, dass durch
Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen die Offenwahrscheinlichkeit der BK-
Kanäle in Abhängigkeit von dem Membranpotential deutlich vergrößert wird. Bei extrem
hohen intrazellulären Ca2+-Konzentrationen werden die BK-Kanäle schon bei normalen
Ruhemembranpotentialen aktiviert (BUTLER et al. 1993). Zwei auf dem C-Terminus
gelegene Regionen konnten als Bindungsstellen für Ca2+ identifiziert werden: Zum einen
der sogenannte „Calcium-bowl“, welcher kurz vor dem S10-Segment liegt, und zum
anderen die Regulatorenregion „RCK“ (regulator of conductance for K+), die zwischen S6
und S7 lokalisiert wurde. Diese Region dient neben Ca2+ noch weiteren Liganden (z.B.
Kationen, Nucleotiden) als Bindungsstelle (XIA et al. 2002). Durch PISKOROWSKI u.
ALDRICH (2002) werden diese Lokalisationen jedoch sehr kontrovers diskutiert, da sie in
ihren Experimenten zeigen konnten, dass auch nach Entfernung dieser beiden Regionen, die
Ca2+-Sensitivität des Kanals nicht verändert war, sondern nur das Schaltverhalten
modifiziert wurde.
33
Literaturübersicht
Blockade
Die BK-Kanäle lassen sich von den anderen Mitgliedern der Familie der Ca2+-aktivierten
K+-Kanäle aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften differenzieren. So sind sie im
Gegensatz zu den IK-Kanälen durch Iberiotoxin hemmbar. Die Unterscheidung der β-
Untereinheiten ist pharmakologisch aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber
Iberiotoxin möglich (MEERA et al. 2000). Zusätzlich blockieren Charybdotoxin,
Tetraethylammonium und Tertrapentylammonium (CARL et al. 1993, GARCIA et al.
1997) und, wie neueste Untersuchungen zeigten, auch das Skorpiongift Slotoxin
(GARCIA-VALDES et al. 2001) die BK-Kanäle. Im Gegensatz zu den SK-Kanälen
verhalten sich die BK-Kanäle jedoch insensitiv gegenüber Apamin.
Modulation
Wie bereits unter dem Abschnitt „Vorkommen und Funktion“ (Seite 29) aufgeführt, sind
die BK-Kanäle in den verschiedensten Geweben an zahlreichen Funktionen beteiligt. Diese
gewebespezifische Funktionalität des Kanals wird durch diverse Modulatoren
gewährleistet, welche die Eigenschaften der BK-Kanäle verändern. Neben den zahlreichen
Splicevarianten tragen, wie vorher beschrieben, die β-Untereinheiten in überragender
Weise zu dieser gewebespezifischen Diversität der BK-Kanäle bei. Zusätzlich werden
jedoch die Aktivität und Aktivierbarkeit der Kanäle durch zahlreiche körpereigene
Substanzen und Second messenger Systeme maßgeblich beeinflusst und somit die
Zellfunktion an akute Stoffwechselbedürfnisse und spezifische Leistungen angepasst
(TORO et al. 1998).
So konnte in den letzten Jahren durch zahlreiche Arbeitsgruppen nachgewiesen werden,
dass die Aktivität der BK-Kanäle durch die Phosphorylierung der α- und β-Untereinheiten
mittels Proteinkinasen verändert wird (SCHUBERT u. NELSON 2001). In Abhängigkeit
von der Lokalisation und der Proteinkinase erfolgt eine Aktivierung bzw. Inhibierung der
Kanäle. An der Aktivierung der Proteinkinasen sind wiederum zahlreiche Substanzen als
Second messenger beteiligt.
34
Literaturübersicht
PKA
Die cAMP-abhängige Proteinkinase A aktiviert die BK-Kanäle in glatten Muskelzellen und
Neuronen, inhibiert sie jedoch in endokrinen Zellen und in der Hypophyse (TIAN et al.
1998 u. 2001). Die PKA induziert v.a. eine N-terminale Phosphorylierung der β-
Untereinheit. Die aktivierende Wirkung unterschiedlichster Substanzen wird über PKA
durch Second messenger vermittelt. So zeigten SCORNIK et al. bereits 1993, dass durch β-
adrenerge Substanzen wie Isoproterenol eine Aktivierung der BK-Kanäle über PKA
vermittelt werden kann. Ebenso ist die Relaxation von Gefäßen infolge einer Behandlung
mit dem PGI2-Analogon Beraprost unter anderem cAMP vermittelt (YAMAKI et al. 2001).
Auch die vasodilatorische Wirkung von VIP wird neben anderen Mechanismen durch eine
Aktivierung von cAMP und nachfolgender Aktivierung der PKA erzielt (TANAKA et al.
1999).
PKG
ROBERTSON et al. (1993) zeigten in Patch clamp Untersuchungen an glatten
Muskelzellen von Cerebralarterien der Ratte eine Aktivierung der BK-Kanäle durch die
cGMP-abhängige Proteinkinase G. Sie konnten weiterhin nachweisen, dass durch NO und
Nitroprussid eine Aktivierung der PKG erfolgt, wodurch eine Vasodilatation der Gefäße
vermittelt wird.
ALIOUA et al. (1998) konnten in heterologen Expressionsexperimenten in Xenopus
Oozyten nachweisen, dass die PKG aktivierend auf humane BK-Kanäle wirkt. Die Befunde
ergaben, dass durch die Phosphorylierung der α-Untereinheit die Offenwahrscheinlichkeit
der BK-Kanäle signifikant erhöht wird. Infolgedessen erfolgt eine längere und stärkere
Hyperpolarisation der Zellen und der myogene Tonus der Gefäße wird reduziert. So ist eine
Aktivierung der BK-Kanäle mittels PKG ebenfalls entscheidend an der Vasorelaxation
durch das atriale natriuretische Peptid beteiligt (TANAKA et al. 1998).
PKC
Die Ca2+-abhängige Proteinkinase C führt in glatten Muskelzellen zu einer verminderten
Aktivität der BK-Kanäle unter der Voraussetzung einer Koexpression der α- und β1-
Untereinheit. So zeigten HAGEN et al. (2003) in elektrophysiologischen Untersuchungen
35
Literaturübersicht
an Myozyten des Kolons von Mäusen, dass die Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle
sowie die Amplitude und die Frequenz des Kaliumauswärtsstroms durch eine Aktivierung
der PKC reduziert werden konnten. Die Aktivierung der PKC erfolgt sowohl über den
Einstrom von Ca2+ durch nichtselektive Ca2+-Kanäle, als auch über die Bindung von
Acetylcholin an muskarinerge Rezeptoren und ATP mit nachgeschalteter Aktivierung des
Phosphatidylinositolmechanismus und direkter Wirkung des freigesetzten Diacylglycerols
auf die Aktivität der Proteinkinase C (BAYGUINOV et al. 2001). Als Ergänzung zu diesen
Befunden zeigten BAYGUINOV et al. (2003) eine Aktivierung der BK-Kanäle durch
Substanz P, welche ebenfalls indirekt über eine Aktivierung der PKC vermittelt wird. In
diesem Fall ist die aktivierende Wirkung der PKC auf L-Typ Calciumkanäle jedoch von
entscheidender Bedeutung, und erst sekundär erfolgt eine Aktivierung der BK-Kanäle
durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration.
Andere körpereigene Botenstoffe modulieren die Aktivität der BK-Kanäle direkt durch
Interaktion mit der α- und/oder β-Untereinheit ohne die Zwischenschaltung eines Second
messengers. So erhöhen Östrogene und Tamoxifen (ein Östrogenantagonist) die
Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle und bewirken eine Steigerung der
Spannungssensitivität der Kanäle, infolgedessen die Einzelkanäle bei geringeren
Membranpotentialen aktiviert werden. Diese Wirkung wird jedoch nur in Anwesenheit der
β-Untereinheit beobachtet, wobei die Östrogene und Tamoxifen von der extrazellulären
Seite mit den BK-Kanälen interagieren (VALVERDE et al. 1999, DICK u. SANDERS
2001, DICK et al. 2002). Zusätzlich wird durch Östrogene die Einzelkanalleitfähigkeit
reduziert, was jedoch unabhängig von der β-Untereinheit geschieht und somit auf eine
direkte Interaktion mit der α-Untereinheit hinweist (DICK u. SANDERS 2001).
Die Aktivität der BK-Kanäle wird weiterhin durch H2O2 (SOTO et al. 2002), Angiotensin II
(TORO et al. 1990, ABOULAFIA et al. 2002) und durch einen Anstieg des intrazellulären
Magnesiumgehalts in Anwesenheit der β-Untereinheit moduliert. In Abwesenheit der β-
Untereinheit wirkt Magnesium aktivierend auf die BK-Kanäle (SHI et al. 2002, QIAN u.
MAGLEBY 2003).
36
Literaturübersicht
2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle auf die Blutdruckregulation
Wie bereits beschrieben, werden BK-Kanäle mit der regulatorischen β1-Untereinheit
(BKβ1) in hohem Maße in glatten Muskelzellen verschiedener Organe einschließlich
Blutgefäßen exprimiert (PEREZ et al. 1993, GARCIA-CALVO et al. 1994,
GIANGIACOMO et al. 1995, PETKOV et al. 2001). Glatte Muskulatur ist an der Funktion
vieler Organe einschließlich Magen, Darm, Uterus und Blase beteiligt. In Blutgefäßen
tragen glatte Muskelzellen wesentlich zur Regulation des peripheren Widerstands bei,
indem sie den Durchmesser der Gefäße mittels Kontraktion oder Relaxation verändern.
Gesteuert wird das Kontraktionsverhalten glatter Muskelzellen über
Membranpotentialänderungen, die durch die Transmitter Acetylcholin und Noradrenalin
sowie durch diverse Hormone induziert werden (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).
Das Membranpotential glatter Muskelzellen wird hauptsächlich durch den
Kaliumgradienten bestimmt. So werden in glatten Muskelzellen neben BK-Kanälen noch
weitere Kaliumkanäle (Kv-Kanäle, Kir, KATP-Kanäle) exprimiert (NELSON u. QUAYLE
1995). Die durch Transmitter oder mechanischen Druck induzierte Depolarisation des
Membranpotentials führt zu einer Öffnung spannungsabhängiger L-Typ Calciumkanäle.
Durch das einströmende Calcium wird eine Muskelkontraktion ausgelöst (KLINKE u.
SILBERNAGEL 1996). In der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) werden
durch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration Ryanodin-sensitive
Calciumkanäle aktiviert, durch die aus diesem intrazellulären Calciumspeicher lokal
begrenzt Calcium freigesetzt wird. Diese spontanen und lokal begrenzten Calciumausstösse
aus dem SR werden Calcium-Sparks genannt (NELSON et al. 1995). Durch diese Sparks
werden die in der benachbarten Plasmamembran lokalisierten calciumabhängigen BK-
Kanäle aktiviert. Der dadurch entstehende spontane transiente Kaliumauswärtsstrom wird
auch als STOC (spontaneus transient outward current) bezeichnet (NELSON et al. 1995).
Die Membrandepolarisation hat ebenfalls eine Öffnung von spannungsabhängigen und
auswärts gleichrichtenden Kaliumkanälen zur Folge. Der durch diese Kanäle vermittelte
Kaliumausstrom aus den Zellen führt zu einer Membranhyperpolarisation und nachfolgend
zum Schließen der spannungsabhängigen Calciumkanäle. Die intrazelluläre Ca2+-
Konzentration nimmt wieder ab und die Zellen relaxieren.
37
Literaturübersicht
In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass die Aktivierung der BK-Kanäle
durch einen lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration eine entscheidende
Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielt, indem sie einen negativen Feedback
Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermittelt (BRAYDEN u. NELSON
1992). Die regulatorische β1-Untereinheit erhöht, wie bereits beschrieben, die Ca2+-
Sensitivität der BK-Kanäle maßgeblich und trägt somit fundamental zu einer
Funktionssteigerung der BK-Kanäle und damit auch des negativen Feedback zur
Limitierung der Vasokonstriktion bei. Diese Hypothese wurde durch verschiedene
Arbeitsgruppen vor allem in pharmakologischen Experimenten an isolierten Gefäßen
bestätigt. In diesen Untersuchungen wurde durch die Gabe von Iberiotoxin eine ausgeprägte
Membrandepolarisation ausgelöst, die zu einer Vasokonstriktion führte (JAGGAR et al.
2000, LÖHN et al. 2001).
Druck und Vasokonstriktoren
Membrandepolarisation
Öffnung spannungsabhängigerL-Typ Calciumkanäle
Anstieg des intrazellulären Calciums
+
Zunahme des arteriellen Tonus
SR Ryanodin Rezeptor
Öffnung von BK-Kanälen
- IberiotoxinCharybdotoxinTEA
+
+
++
+
+
Calciumkanal-blocker
Abbildung 6: Modell für die Rolle der BK-Kanäle als Teil des negativen
Feedback Mechanismus bei der Regulation des arteriellen Tonus. Modifiziert nach NELSON u. QUAYLE (1995).
Diese Ergebnisse wurden durch den Phänotyp von Mäusen, bei denen die β1-Untereinheit
genetisch inaktiviert wurde, grundlegend bestätigt (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et
38
Literaturübersicht
al. 2000). Die BKβ1-/- Mäuse zeigten einen erhöhten arteriellen Tonus in isolierten
Gefäßen, welcher mit einer verminderten Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle und einer
gestörten Kopplung von Calcium-Sparks und STOC`s vergesellschaftet war. Diese
molekularen und zellulären Störungen gingen mit einem erhöhten systemischen Blutdruck
und einer Herzhypertrophie einher. Eine verminderte Expression der β1-Untereinheit,
verbunden mit einer geringeren Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle, wurde auch in glatten
Gefäßmuskelzellen von Ratten mit einer genetisch bedingten Hypertonie beobachtet
(WELLMANN et al. 2001, AMBERG et al. 2003, AMBBERG u. SANTANA 2003). Im
Widerspruch zu diesen Ergebnissen stehen allerdings die Befunde von LIU et al. (1997,
1998), die in Cerebralarterien von spontan hypertensiven Ratten einen Anstieg der BK-
Kanal Expression nachweisen konnten, welche einen verstärkten Kaliumauswärtsstrom
durch die BK-Kanäle verursachte. Die Autoren interpretieren dies als Versuch des Körpers,
die Ausprägung einer Hypertonie einzuschränken.
Auf der Basis der beschriebenen Beobachtungen wurde geschlussfolgert, dass die arterielle
Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz des erhöhten Tonus in arteriellen
Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b, STANDEN 2000, PATTERSON et al.
2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher Mechanismus ist von größtem
wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich hierbei um den erstmaligen
Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie handeln würde.
39
Literaturübersicht
2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung
Der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen könnte im Gegensatz zu der im
vorherigen Abschnitt beschriebenen Hypothese eine alternative Erklärung finden. In
Anbetracht der starken Expression von BK-Kanälen in Zona glomerulosa-Zellen ist es sehr
gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der β1-Untereinheit zu einer gestörten
Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen, dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen
im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind.
Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten
ausgeprägten linksventrikulären Hypertrophie beitragen.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob die BKβ1-/- Mäuse tatsächlich
pathologisch erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut aufweisen, die für die Entstehung
der Hypertonie ursächlich verantwortlich sind. Weiterhin soll untersucht werden, ob es durch
pharmakologische Blockierung des zirkulierenden Plasmaaldosterons mit Hilfe des
Aldosteronantagonisten Spironolacton möglich ist, bei BKβ1-/- Mäusen eine Normalisierung
des arteriellen Blutdrucks und eine Beeinflussung der linksventrikulären Hypertrophie zu
bewirken.
Sollte sich die Hypothese eines Hyperaldosteronismus bestätigen, soll im Rahmen dieser
Arbeit des Weiteren an Nebennieren von BKβ1-/- Mäusen untersucht werden, ob der
Hyperaldosteronismus durch eine veränderte Regulation der Aldosteronsekretion in den
Nebennieren unter Beteiligung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle verursacht wird.
40
Material und Methode
3 Material und Methode
3.1 Material
3.1.1 Lösungen und Puffer
3.1.1.1 Nebenniereninkubation
Die Inkubationen erfolgten in einem durch Krebs-HEPES Puffer modifizierten Medium
199 der Firma Sigma (M 2154).
Modifiziertes Medium M199 (K+: 3,5 mmol/l)
Endkonzentration
Medium 199 (5,36 mmol/l K+) 653 ml
Krebs-HEPES Puffer, modifiziert 347 ml
L-Glutamin (200 mmol/l Stock, 1:294) 0,68 mmol/l
BSA, Fraktion V (w/v) 0,1%
D-Glucose 11,1 mmol/l
NaCl (kompensiert variable [K+]) ≤ 25 mmol/l
pH: 7,4 // 290 mosmol/kg
Krebs-HEPES Puffer, modifiziert
Endkonzentration
NaCl 75 mmol/l
CaCl2 1,8 mmol/l
MgSO4 0,8 mmol/l
NaHCO3 25 mmol/l
Na2HPO4 1,0 mmol/l
HEPES (20 ml 1,0 mol/l Stock, pH: 7,4) 20 mmol/l
41
Material und Methode
dazu benötigte Lösungen:
HEPES Puffer, Stocklösung (pH: 7,4) 1,0 mol/l
NaCl Lösung 1,0 mol/l
KCl Lösung 1,0 mol/l
Für Versuche in Gegenwart erhöhter Kaliumkonzentrationen wurden die Osmolalitäten der
Inkubationslösungen durch entsprechende Verringerung der variablen NaCl Konzentration
konstant gehalten.
Einstellung verschiedener Kaliumkonzentrationen
Bezogen auf 1 Liter Inkubationslösung resultierte die Zugabe von 500 µl KCl Lösung (1,0
mol/l) in einer Erhöhung der Kaliumkonzentration um 0,5 mmol/l. Das Volumen der 1,0
mol/l NaCl Lösung wurde entsprechend um 500 µl reduziert: von 8,675 ml auf 8,175 ml.
PBS (10x)
NaCl 1,54 mol/l
Na2HPO4 0,70 mol/l
KH2PO4 0,30 mol/l
pH: 6,8 ± 0,1
3.1.1.2 Gelelektrophorese
Loading-Buffer
Glycerol 50%
Bromphenolblau, gesättigt 1%
Xylenecyanol (10%ig) 1%
50 x TAE 2%
H2O, steril ad 100 ml
42
Material und Methode
TAE (50x)
Tris 242 g
Eisessig 57,1 g
EDTA (0,5 M), pH 8,0 100 ml
H2O, destilliert ad 1000 ml
TBE (0,5x)
Tris 242 g
Borsäure 27,5 g
EDTA (0,5 M), pH 8,0 20 ml
H2O, destilliert ad 1000 ml
1:10 verdünnt
3.1.2 Chemikalien und Enzyme
Falls nicht anders angegeben, wurden sämtliche Chemikalien von den Firmen Sigma,
Invitrogen, Serva, Calbiochem, Braun und Merck in p.a. oder reinst-Qualität bezogen.
Nukleinsäuren und Nukleotidtriphosphate wurden bei der Firma Invitrogen, Pharmacia
Biotech und MWG Biotech erworben.
43
Material und Methode
3.2 Versuchstiere
Die Versuche wurden an männlichen, 3 bis 7 Monate alten C57/BL6 Inzuchtmäusen mit
genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals (Knockout
Mäuse: BKβ1-/-) durchgeführt. Als Kontrolltiere dienten männliche ingezüchtete C57/BL6
Mäuse (Wildtyp Mäuse: BKβ1+/+).
Der BKβ1-Knockout wurde 1999/2000 von der Arbeitsgruppe um Prof. O. Pongs (Zentrum
für molekulare Neurobiologie Hamburg) generiert (PLÜGER et al. 2000). Der Arbeitsgruppe
um Prof. H. Ehmke wurden Zuchttiere zur Verfügung gestellt, deren weitere Vermehrung
und Aufzucht von der Versuchstierhaltung des Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf
übernommen wurde.
Die Tiere wurden bei Raumtemperatur 22 ± 2°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 ±
5% und einem 12-stündigen Tag-Nacht-Rhythmus (Licht: 7.00-19.00 Uhr) in durchsichtigen
Polycarbonatkäfigen (Fa. Techniplast) des Types II long (365 x 207 x 140 mm) auf
staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Zur Beschäftigung der Tiere wurden die Käfige
zusätzlich mit einigen Blättern Zellstoff und Häusern aus Kunststoff (Fa. Techniplast)
ausgestattet.
Die Ernährung der Tiere erfolgte mit standardisiertem, pelletierten Trockenfutter (Ssniff
R/M-H, extrudiert) und Leitungswasser ad libitum. Das Futter war wie folgt
zusammengesetzt: Rohprotein 22,7%, Rohfett 4,0%, Rohfaser 5,6%, Rohasche 7,6%,
umsetzbare Energie 12,5 MJ/kg (Angaben in % des Trockengewichts). Die Tiere wurden auf
das Freisein von Erregern entsprechend der Liste GV-SOLAS 1998 kontrolliert.
Eine Woche vor Beginn der Versuche wurden die Mäuse aus der zentralen Tierhaltung in
ihren Käfigen in das Physiologische Institut transportiert, um durch eine vollständige
Erholung von dem Transport und Eingewöhnung an die Laborumgebung eine stressbedingte
Beeinflussung der Messergebnisse auszuschließen. Die Haltung und Fütterung der Tiere im
Mäuselabor erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie vorher beschrieben. Hervorgerufen
durch Tätigkeiten im Labor, mussten sich die Tiere jedoch an eine geänderte Geräuschkulisse
adaptieren.
Die Tierversuchsgenehmigungen wurden von der Behörde für Umwelt und Gesundheit,
Hamburg, mit den Aktenzeichen A6/218 und 35/02 erteilt.
44
Material und Methode
3.2.1 Versuchsserien und Stichprobenumfang
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit basieren auf den in der nachfolgenden Tabelle
dargestellten Versuchsserien.
Tabelle 1: Übersicht über die Versuchsserien mit durchgeführten Bestimmungen
Untersuchungen
Versuchsserie 1 Basisuntersuchungen
• hämodynamische / morphometrische Untersuchungen
• Bestimmung von Blutparametern
Versuchsserie 2 Aldosteronbestimmung
• hämodynamische / morphometrische Untersuchungen
• Bestimmung der Plasmaaldosteronkonzentration
Versuchsserie 3 Spironolactonbehandlung
• hämodynamische / morphometrische Untersuchungen
Versuchsserie 4 Nebennieren – Inkubationsversuche
• basale und stimulierte Aldosteronsekretion
Die Untersuchungen der Versuchsserien 1-3 sollen pro Serie und Genotyp an 13 Tieren
durchgeführt werden. Ergebnisse in der Literatur haben eine mittlere interindividuelle
Variabilität des Blutdrucks mit einen Variationskoeffizient von ~5-8% bei wachen Mäusen
gezeigt (Plüger et al. 2000). Hinzu kommt, dass aus nicht vermeidbaren methodischen
Gründen (Operationskomplikationen, Katheterverschluss) etwa 10-20% der operierten Tiere
nicht in den Versuch aufgenommen werden können. Die eingeplante Zahl von Tieren reicht
45
Material und Methode
aus, um bei dieser Varianz einen Blutdruckunterschied von 10 mmHg statistisch auf dem 5%
Signifikanzniveau zu identifizieren.
Die Untersuchungen der Versuchsserie 4 sollen pro Versuchsgruppe (Stimulus und Genotyp)
an Nebennieren von jeweils 10 Tieren durchgeführt werden, um mögliche Unterschiede
statistisch beurteilen zu können.
46
Material und Methode
3.3 Methoden
3.3.1 Genotypisierung der Mäuse
Zur Bestimmung des Genotyps wurde den Zuchttieren durch die Tierpfleger der
Versuchstierhaltung im Alter von ca. 6 Wochen und den Mäusen, an denen Versuche
durchgeführt wurden, zum Abschluss der Experimente eine Ohrbiopsie entnommen. Die
Entnahme der Ohrprobe erfolgte mit einer speziellen Lochzange.
Nach Lysierung der Ohrprobe wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain
reaction = PCR) überprüft, ob der Genlocus, der die β1-Untereinheit des Ca+-aktivierten
Kaliumkanals codiert, bei den Tieren vorhanden war bzw. fehlte.
3.3.1.1 Lysierung der Ohrprobe
Folgender Ansatz wurde für den Verdau einer Ohrprobe verwendet:
NP- 40 (0,5%) 0,5 µl
Tween® 20 (0,5%) 0,5 µl
10x PCR RXN Puffer (-Mg2+) 10 µl
Proteinase K 0,03 mg
H2O, steril ad 100 µl
Der Verdau erfolgte mit Hilfe eines Thermomixers (Eppendorf Gerätebau) auf Stufe 11
(11x100/min) bei 65°C für 2 h 50 min und wurde abgeschlossen bei 95°C für 10 min. Falls
die Polymerase-Kettenreaktion nicht direkt angeschlossen wurde, fand eine Lagerung des
Lysats bei –20°C statt.
47
Material und Methode
3.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion
(SAIKI et al. 1988, PLÜGER et al. 2000)
Folgender Standardansatz (50 µl Gesamtvolumen) wurde für die Amplifikation von DNA
durch die PCR verwendet:
Ohrprobenlysat 3 µl
10x PCR RXN-Puffer (-Mg2+) 5 µl
50 mM MgCl2 1,5 µl
20 mM dNTP`s 0,5 µl
Primer 1 (100 pmol/µl) 1 µl
Primer 2 (100 pmol/µl) 0,5 µl
Primer 3 (100 pmol/µl) 0,125 µl
Taq-Polymerase (5 Units/µl) 0,5 µl
H2O, steril ad 50 µl
Die Primer wurden von der Firma MWG-Biotech GmbH bezogen und hatten folgende
Sequenzen:
Primer 1 (BKMB 11s) 5`-GCT GAA ACT CTG AAG CTA CTC-3`
Primer 2 (BKMB 17s) 5`-GCT ATG AGG CAA CTA AAC AGG-3`
Primer 3 (BKMB 3a) 5`-CAC AGC TGA TAC ATT GAC CC-3`
Die Polymerase-Kettenreaktion wurde in einem GeneAmp PCR System 9700 (Applied
Biosystems) durchgeführt. Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 93°C für 2 Minuten
erfolgte die PCR in 35 Amplifikationszyklen mit folgenden Temperaturschritten:
30`` 93°C (Denaturierung)
30`` 58°C (Primerhybridisierung)
45`` 72°C (Extension)
48
Material und Methode
Im Anschluss an die 35 Zyklen wurde der Amplifikationsprozess mit einer 10-minütigen
Extensionsphase bei 72°C beendet und die Proben nachfolgend auf 4°C abgekühlt. Die
Lagerung bis zur Analyse des Produktes durch Gelelektrophorese erfolgte bei –20°C. Um
Kontaminationen auszuschließen, wurde für jeden PCR-Ansatz eine Negativkontrolle
mitamplifiziert, die bis auf die cDNA sämtliche für die PCR notwendigen Reagenzien
enthielt.
3.3.1.3 Gelelektrophorese
Die präparative Trennung und Analyse der DNA-Fragmente wurde in 1,2%igen
horizontalen Agaroseflachbett-Gelen in EPS 600 –Kammern (Pharmacia Biotech) in 0,5x
TBE mit 6 µl/100 ml Ethidiumbromid durchgeführt.
10 µl des zu analysierenden Ansatzes wurden mit 1,5 µl DNA-Loading-Buffer versetzt und
davon 11 µl in die Probentaschen des Agarose-Gels pipettiert.
Die Trennung erfolgte innerhalb von 45 min bei einer konstanten Spannung von 110 V. Zur
Anfärbung der DNA wurde Ethidiumbromid (Sigma) in einer Konzentration von 0,5 µg/ml
in das Agarose-Gel einpolymerisiert. Die mit Ethidiumbromid angefärbten DNA-
Amplifikate wurden mit Hilfe von UV-Licht der Wellenlänge 254 nm (UV-
Transilluminator KAISER RS 1, Biometra) sichtbar gemacht und zur Dokumentation mit
einer CCD-Kamera (Computar) fotografiert. Die Identifizierung der Fragmente erfolgte
anhand ihrer Länge nach Anzahl von Basenpaaren. Als Größenstandard wurde eine „1 kb
Plus DNA-Leiter“ (Invitrogen) verwendet.
49
Material und Methode
3.3.2 Hämodynamische Untersuchungen an wachen Mäusen
3.3.2.1 Katheterherstellung
Vor der Anfertigung des Katheterpaares mussten die Katheterspitzen gesondert aus einem
Polyurethanschlauch (0,04“ O.D., 0,025“ I.D., Braintree Scientific, INC.) geformt werden.
Ein ca. 6 cm langes Schlauchstück wurde dazu in der Mitte mit Hilfe eines Heißluftgebläses
angeschmolzen. Der geschmolzene Bereich wurde leicht gedehnt und halbrund geformt.
Durch eine Durchtrennung des Schlauches in der Mitte entstanden 2 Spitzen, die auf die
gleiche Länge gekürzt wurden. (Originalende und leicht gebogene verjüngte Spitze: jeweils
ca. 1,5 cm). Bei der Auswahl eines Spitzenpaares musste auf eine möglichst große
Parallelität geachtet werden.
Diese Spitzen wurden mit Hilfe eines ca. 8 mm langen metallenen Verbindungsstifts mit
einem Polyethylen-Schlauch (1,0 mm O.D., 0,5 mm I.D., Portex) verbunden, wobei ein ca.
1 mm langer Überlappungsbereich (Overlap) zwischen der Spitze und dem Polyethylen-
Schlauch entstand. Über den Overlap wurde mittels eines 2 Komponentenklebers (UHU
plus Endfest 300) ein Heat Shrink Tubes geklebt, um die Katheter im Verbindungsbereich
abzudichten. Nach einer 12-stündigen Trocknungsperiode wurde die Durchgängigkeit der
Katheter überprüft.
3.3.2.2 Operative Katheterimplantation
(JUST et al. 2000, modifiziert nach MATTSON 1998)
Den Tieren wurden zur Blutdruck- und Herzfrequenzmessung ein arterieller Katheter in die
A. femoralis implantiert. Zusätzlich wurde in die V. femoralis ebenfalls ein Katheter
implantiert, wodurch eine größere Lagestabilität des arteriellen Katheters gewährleistet
wurde und somit die Gefahr eines Verschlusses durch Abknicken des Katheters reduziert
werden konnte. Die Katheter wurden vor der Operation luftblasenfrei mit einer Heparin-
NaCl-Lösung (5.000 I.E. Heparin/100 ml NaCl-Lösung) gefüllt, um die Gefahr einer
Thrombenbildung in der Spitze des Katheters zu reduzieren.
50
Material und Methode
Die Mäuse wurden mit 10%-igem Ketamin® (120 mg/kg KGW, Atarost GmbH & Co) und
2%-igem Rompun® (16 mg/kg KGW, Bayer) unter Erhaltung der Spontanatmung mittels
i.p. Injektion narkotisiert. Eine Nachdosierung zur Verlängerung der Narkose erfolgte
ausschließlich mit Ketamin®. Bereits vor Beginn der Operation erfolgte eine
Schmerzprophylaxe mittels s.c. Injektion von Carprofen (5 mg/kg KGW). Während der
Operation wurden die Mäuse auf einer 37°C warmen Wärmeplatte gelagert, um eine
Auskühlung zu verhindern.
Nach der Ermittlung des KGW wurden der Nacken und der linke Leistenbereich der Tiere
weiträumig rasiert und mit Betaisodona® desinfiziert.
Nach einer Inzision der Haut im Nacken kaudal des Os occipitale wurde die Haut subkutan
bis zum linken Hinterbein mobilisiert. Daraufhin erfolgte die Lagerung und Fixierung der
Mäuse in Rückenlage und die ca. 5 mm lange Inzision der Haut im Bereich der Leiste
parallel zur Bauchmuskulatur. Durch vorsichtiges Entfernen von Fett- und subkutanem
Bindegewebe mittels Wattestäbchens wurde der N. femoralis sowie die A. und V. femoralis
proximal vom Lig. inguinale bis distal zur V. saphena medialis dargestellt. Mit Hilfe einer
Metallhülse erfolgte eine Verbindung der beiden Inzisionsstellen, um die Katheter von der
Leiste zur Öffnung im Nacken schieben zu können. Dabei war zu beachten, dass der venöse
Katheter ohne Kreuzung parallel zum arteriellen Katheter verlaufend innen zu liegen kam.
Der arterielle Katheter wurde am Ende farbig markiert, um eine spätere Zuordnung zu
ermöglichen.
Die weitere Präparation wurde unter stereomikroskopischer Aufsicht (Fa. Wild M3)
durchgeführt. Nach der präparativen Trennung von Nerv, Vene und Arterie und der
kompletten Mobilisierung beider Gefäße wurden die Gefäße proximal der V. saphena
einzelnen mit einem Faden (Haltezügel) abgebunden. Bei der Arterie wurde vor ihrer
Eröffnung zusätzlich durch eine Unterbindung direkt distal des Leistenbands der Blutfluss
unterbrochen. Dieser Knoten musste wieder zu öffnen sein. Nach dieser Vorbereitung
wurde die Vene bzw. Arterie mit einer Irisschere in der Mitte des dargestellten Bereichs
eröffnet und die Katheterspitze einige Millimeter unter das Leistenband hindurch
vorgeschoben. Die Befestigung der Katheter gewährleisteten der Haltezügel sowie zwei
zusätzlich weiter proximal gelegte Haltefäden.
Nach der Implantation wurden beide Katheter im freien Bereich der Spitzen miteinander
verbunden und der Knoten mit Histoacrylgewebekleber (Fa. Braun) fixiert.
51
Material und Methode
Durch den venösen Katheter wurde dem Tier zur antibiotischen Prophylaxe 0,7 mg
Cefazolin, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, verabreicht.
Abschließend erfolgte noch eine letzte Stabilisierung der Katheter mit Hilfe eines Fadens,
der, ausgehend von der Nackeninzision, soweit wie möglich distal um die Katheter
geknotet wurde.
Die Katheter wurden vor dem anschließenden Wundverschluss mit Hilfe von
Metallstöpseln verschlossen, wobei besonders darauf zu achten war, dass kein Blut sondern
nur Heparin-NaCl-Lösung in den Katheterspitzen verblieb, um das Risiko einer
Thrombenbildung zu minimieren.
Nach Ausschluss von Blutungen und Sicherung der korrekten Katheterposition wurde eine
geringe Menge einer antibiotikahaltigen Wundsalbe (Nebacitin®, Yamanouchi Pharma
GmbH) in die Wunde im Leistenbereich platziert. Die Wunde wurde anschließend mit einer
Einzelknopfnaht (Mersilene 5-0, Ethicon) verschlossen. Die aus dem Nacken
herausgeführten Katheterenden mussten mit einer Metallfeder, die in die Nackenmuskulatur
festgenäht wurde, vor Benagung und anderer mechanischer Belastung geschützt werden.
Der Wundverschluss um die Feder erfolgte ebenfalls mit einer Einzelknopfnaht.
Abschließend wurden die Wunden im Nacken und in der Leiste mit Betaisodona®
desinfiziert.
Die aus der Metallfeder herausragenden Enden der Katheter wurden mit einem
Klebestreifen an der Feder befestigt, um eine Rotation der Katheter in der Feder zu
verhindern.
Die Tiere wurden postoperativ bis zum vollständigen Erwachen weiterhin warmgehalten
und erholten sich sehr schnell.
Die Fixierung der Feder erfolgte mit Hilfe eines Zweikanal - Swivels (TSE-Systems), so
dass sich die Tiere in ihren Einzelkäfigen frei bewegen konnten. Die Futter- und
Wasseraufnahme erfolgte ad libitum, wobei die Wasseraufnahme jeden Tag protokolliert
wurde, um einen Hinweis auf das Allgemeinbefinden der Tiere zu erhalten. Ergänzend
hierzu wurde täglich der Habitus der Tiere beurteilt und Tiere, die mittelgradige bzw.
hochgradige Störungen aufwiesen von den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen und
euthanasiert.
52
Material und Methode
3.3.2.3 Blutdruckmessung
Die Blutdruck- und Herzfrequenzmessungen wurden über den chronischen arteriellen
Katheter nach Anschluss an den Swivel durchgeführt. Die stressfreie Messung erfolgte an
den wachen und freibeweglichen Mäusen, die während der Messung uneingeschränkten
Zugang zu Wasser und Futter hatten. Die Messungen wurden am 2. bzw. 3. postoperativen
Tag kontinuierlich über 1-2 Stunden durchgeführt. Die gemessenen Daten wurden
permanent mittels eines Softwareprogramms (Labtech Notebook®) registriert (siehe Abb.
7). Ihre anschließende Auswertung erfolgte durch das Datenverarbeitungsprogramm Igor®.
Während der Messung herrschte eine ruhige Atmosphäre im Labor, um keine Störung der
Tiere zu verursachen. Die Messungen wurden in einem dreistündigen Zeitfenster zwischen
16.00 und 19.00 Uhr durchgeführt, um den zirkadianen Rhythmus der Tiere zu
berücksichtigen.
Zur Umwandlung der Blutdruckamplitude in ein elektrisches Signal wurde ein
Blutdrucktransducer (Typ DPT-6100, Föhr Medical Instuments) eingesetzt. Der Transducer
wurde vor der Benutzung luftblasenfrei mit entionisiertem Wasser gefüllt und durch einen
Polyethylen-Schlauch mit dem Swivel verbunden. An die zweite Öffnung des Kanals
wurde der arterielle Katheter über ein kurzes Verbindungsstück angeschlossen.
Nach Abschluss der Blutdruckmessung am 1. Messtag musste der Katheter erneut
verschlossen werden. Dabei war wiederum zu beachten, dass kein Blut in der
Katheterspitze verblieb, um eine Thrombosierung zu verhindern.
Aus den gewonnenen Daten wurden der mittlere arterielle Blutdruck und die
durchschnittliche Herzfrequenz ermittelt.
53
Material und Methode
Abbildung 7: Originalregistrierung einer Blutdruck-/Herzfrequenzmessung über 60 Minuten. Die Messung erfolgte bei einer wachen und ungestressten Wildtyp Maus am 3. postoperativen Tag über den arteriellen Katheter (obere Kurve: Blutdruckamplituden; untere Kurve: Herzfrequenz).
54
Material und Methode
3.3.3 Spironolactonapplikation
(DORRANCE et al. 2001)
Es wurden zwei Versuchsgruppen aus männlichen 4-6 Monate alten Mäusen (12 Knock-out
Mäuse bzw. 12 Wildtyp Mäuse) gebildet. Die Tiere wurden nach Bestimmung ihres
Körpergewichts ausgewählt, um eine einheitliche Versuchsgruppe mit 30 g KGW zu
erhalten.
Die Tiere wurden 21 Tage mit dem Aldosteronantagonisten Spironolacton (200 mg/kg
KGW/Tag) behandelt, welches kontinuierlich über diesen Zeitraum mit Hilfe von 2 Time
Release Pellets (Innovative Research of America) pro Tier appliziert wurde.
Die Pellets wurden im Bereich der seitlichen Thoraxwand unter die Haut platziert und setzten
unter Zerfall der Matrix täglich 6 mg Spironolacton frei.
Die Operation erfolgte unter Narkose und nach einer weiträumigen Rasur des
Operationsfeldes mit anschließender Desinfektion (siehe Kap. 3.3.2.2). Nach einer ca. 5 mm
langen Inzision der Haut erfolgte die Präparation einer kleinen subkutanen Tasche nach
kaudal. In diese Tasche wurde ein Pellet gelegt, wobei darauf zu achten war, dass das Pellet
weder mechanisch beansprucht wurde noch mit Desinfektionsmittel in Berührung kam. Das
subkutane Bindegewebe wurde mit einem Einzelheft und die Hautinzision mit zwei
Einzelheften (Mersilene 5-0, Ethicon) verschlossen. Anschließend erfolgte die gleiche
Prozedur mit dem zweiten Pellet auf der anderen Seite.
Die Tiere wurden bis zum vollständigen Erwachen aus der Narkose fortlaufend beobachtet.
Ansonsten war keine postoperative Behandlung nötig, da aufgrund der Lage der Nähte kein
Benagen durch die Tiere möglich war und somit eine schnelle und komplikationsfreie
Wundheilung erfolgte.
55
Material und Methode
3.3.4 Bestimmung von Blutparametern
Den Mäusen wurden nach den Blutdruckmessungen Blutproben entnommen, um
verschiedene Parameter (Elektrolyte, Kreatinin, Renin und Aldosteron) zu bestimmen.
3.3.4.1 Blutabnahme
3.3.4.1.1 Blutabnahme für die Elektrolyt-/ Kreatininbestimmung
Für die Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Natrium, Kalium, Chlorid und
Kreatinin wurden 180 µl Plasma benötigt.
Das benötigte Vollblut wurde nach der vorhergehenden Blutentnahme für die Aldosteron-
und Reninbestimmung (siehe Kap. 3.3.4.1.2) aus dem arteriellen Katheter gewonnen. Dabei
war zu beachten, dass die Abnahme ohne großen Unterdruck erfolgte, um eine mechanisch
bedingte Hämolyse des Bluts zu verhindern. Das gewonnene Blut wurde daraufhin in einen
mit Lithium-Heparin präpariertes Gefäß (15 I.E. Heparin/ml Blut, Firma Sarstedt)
überführt.
Unmittelbar nach der Gewinnung erfolgte die Zentrifugation (6000 x g/10 min) des Bluts
bei Raumtemperatur (20°C). Das gewonnene Plasma wurde alliquotiert (50 µl Kreatinin,
130 µl Elektrolyte), eingefroren und bei –20°C bis zur Analyse gelagert.
3.3.4.1.2 Blutabnahme für die Renin-/ Aldosteronbestimmung
Die Blutabnahme für die Renin-/ Aldosteronbestimmung musste unbemerkt an wachen und
ungestressten Tieren erfolgen, um keine abnahmebedingte Erhöhung der zu untersuchenden
Parameter zu induzieren. Die Blutabnahme für die Bestimmung der Plasmaaldosteron- und
der Reninkonzentration erfolgte in zwei verschiedenen Versuchsgruppen. Dieses Vorgehen
war notwendig, um den Einfluss des Blutverlustes auf die Blutparameter zu minimieren.
Die Blutabnahme erfolgte bei allen Tieren zwischen 17.00 und 19.00 Uhr.
Um die Abnahme für die Tiere unbemerkt durchführen zu können, wurde aus dem
arteriellen Katheter spontan ohne mechanische Manipulation Vollblut gewonnen. Dazu
56
Material und Methode
wurde der Verbindungsschlauch vom Blutdrucktransducer zum Swivel schon vor der
Blutdruckmessung so lang abgemessen, dass er 300 µl Volumen fasste. Vom Swivel
ausgehend wurde der Schlauch nach einem Volumen von 250 µl markiert, da für die
Analyse ca. 120 µl Plasma benötigt wurde. Ausgehend von einem durchschnittlichen
Hämatokrit von ca. 40% (MITRUKA u. RAWNSLEY 1981, RUTSCHITZKA 2000),
wurden 250 µl Vollblut entnommen, um sicher das für die Analyse benötige Plasma
gewinnen zu können.
Nach Beendigung der Blutdruckmessung wurde unbemerkt von dem Tier der
Verbindungsschlauch kurz vor dem Transducer durchschnitten. Infolge des arteriellen
Blutdrucks floss das Blut aus dem arteriellen Katheter in den Verbindungsschlauch. Sobald
die Blutsäule die 250 µl Markierung erreicht hatte, wurde der arterielle Katheter
abgeklemmt und das Blut aus dem Verbindungsschlauch in einen 500 µl Tube (Fa.
Eppendorf) überführt, in dem 5 µl 0,3 M Na4-EDTA vorgelegt war.
Die Blutproben für die Reninbestimmung wurden umgehend im Eisbad abgekühlt. Die
nachfolgende Zentrifugation erfolgte bei 4°C für 10 min bei 6000 x g. Die Blutproben für
die Aldosteronbestimmung wurden bei Raumtemperatur (20°C) ebenfalls bei 6000 x g für
10 min zentrifugiert.
Nach der Zentrifugation wurden die Plasmaproben tiefgefroren und bei –20°C bis zur
Analyse gelagert.
57
Material und Methode
3.3.4.2 Analyse
3.3.4.2.1 Natrium und Kalium
Die Bestimmung der Natrium- und Kaliumkonzentrationen erfolgte mittels
flammenphotometrischer Analyse im FCM 6341 (Eppendorf Gerätebau, Hamburg). 50 µl
der aufgetauten Plasmaprobe wurde mit einer Lithium-Verdünnungslösung (LiCl: 5mmol/l,
Fa. Eppendorf) 1:50 verdünnt. Nach Kalibrierung des Flammenphotometers durch
Abgleich des Nullwertes mittels der Lithium-Verdünnungslösung und Standardabgleich des
Geräts mit Hilfe einer Serum Standard-Stammlösung (Na+: 143,5 mmol/l, K+: 3,84 mmol/l,
Ca2+: 2,50 mmol/l; Eppendorf Gerätebau, 1:50 verdünnt) erfolgte die Messung der
verdünnten Plasmaproben.
Nach jeweils 20 Proben wurde die Kalibrierung des Photometers wiederholt.
3.3.4.2.2 Chlorid
Die Messung von Chloridkonzentrationen im Plasma wurde mit ionensensitiven Elektroden
durchgeführt.
Die Analyse erfolgte mit einem EML100 (Radiometer Copenhagen) in der Abteilung der
Klinischen Chemie des Universitätskrankenhauses Hamburg-Eppendorf.
58
Material und Methode
3.3.4.2.3 Kreatinin
Die Bestimmung des Kreatinins erfolgte mittels Enzymatischem Farbtest (PAP-Methode),
der von der Firma NOBIS (NobiFlow, Kreatinin-PAP) bezogen wurde. Die Bestimmung
der Extinktion erfolgte bei einer Wellenlänge von 555 nm bei einer Temperatur von 25°C.
Die Proben sowie die Reagenzien wurden auf 25°C vorgewärmt und anhand der
Arbeitsanleitung des Herstellers in Halbmikroküvetten (1 cm Schichtdicke) pipettiert.
50 µl Probe / Standard
1000 µl Reagenz 1
Gut mischen und ca. 5 min bei 25°C inkubieren.
200 µl Reagenz 2
Gut mischen, 1 min bei 25°C inkubieren und nachfolgend die
Anfangsextinktion ablesen: EP.
Nach weiteren 5 min Ablesung wiederholen: EST.
3.3.4.2.4 Renin
Die Bestimmung des aktiven Renins (Plasmareninkonzentration: PRC) und des Prorenins,
der inaktiven Vorstufe des Renins, wurde am Institut für Pharmakologie und Toxokologie
der Universität Heidelberg durch Prof. Dr. J. Peters durchgeführt.
Für die Messung beider Parameter wurden die Plasmaproben in 6 mM EDTA, 1,6 mM
Dimercaptopropanolol und 100 mM N-Tris Hydroxymethylaminoethansulfonat bei pH 7,3
und 37°C für 60 min inkubiert. Die Inkubation wurde unter Substratsättigungsbedingungen
in Gegenwart eines Überschusses an Angiotensinogen der Ratte durchgeführt. Zur
Bestimmung des Prorenins wurden die Plasmaproben vor der Inkubation 10 min. mit
Trypsin behandelt, um eine enzymatische Umwandlung des Prorenins in aktive
Reninformen zu bewirken. Die Messung des entstandenen ANG I erfolgte mittels
Radioimmunoassay (HACKENTHAL et al. 1977). Die Plasmareninkonzentration sowie
das Prorenin werden in der Dimension ng ANG I pro Stunde pro ml Plasma angegeben.
59
Material und Methode
3.3.4.2.5 Aldosteron
Die Bestimmung von Aldosteron erfolgte mit Hilfe von Radioimmunoassays (RIAs) nach
dem Coat-a-count-Verfahren, bei dem Kunststoffröhrchen mit einem Aldosteronantikörper
beschichtet sind und radioaktives 125J-markiertes Aldosteron mit dem Aldosteron in der zu
analysierenden Probe um die Bindung an den Antikörper konkurriert. Die zu bestimmenden
Aldosteronkonzentrationen wurden dann nach Messung des freien oder gebundenen 125J-
Aldosteron mit Hilfe von Standardkurven errechnet.
Die Aldosteronkonzentrationen wurden in den Plasmaproben sowie in den Proben aus den
in vitro Inkubationsversuchen (siehe Kap. 3.3.6) bestimmt. Aufgrund des geringen zur
Verfügung stehenden Blut- bzw. Plasmavolumens und der Notwendigkeit von
Doppelbestimmungen wurde die Analyse des Aldosterons in derartigen Fällen mit einem
RIA-Kit der Firma Immunotech (Beckman Coulter, USA) durchgeführt, da für diesen
Assay ein Probenvolumen von jeweils 50 µl ausreichend war.
Freigesetztes Aldosteron in Experimenten von Nebenniereninkubationen wurde mit einem
RIA-Kit der Firma DPC (Diagnostic Products Corporation, USA) bestimmt
(Probenvolumen: 200 µl).
Für jeden Assay wurde eine Standardkurve (siehe Abb. 8) erstellt. Dazu wurden
verschiedene Konzentrationen von Aldosteron eingesetzt (10-2000 pg/ml für Immunotech
und 25-1200 pg/ml für DPC RIA-Kits) und die gebundene Aktivität (B) des markierten
Aldosterons im Verhältnis zur gebundenen Aktivität einer aldosteronfreien Probe (B0)
ermittelt. Die Logit(B/B0)-Werte als Funktion des Logarithmus der
Aldosteronkonzentration wurden einer Kurvenanpassung (TableCurve®, SPSS Inc., USA)
unterworfen und durch eine Geradengleichung (y=a+bx) approximiert. Über die Parameter
„a“ und „b“ der Geradengleichung wurde dann die Konzentration von Aldosteron in der zu
bestimmenden Probe errechnet. Der RIA-Kit des Herstellers DPC lieferte sehr gut
reproduzierbare Ergebnisse mit einem r2 von 0,9913 für 15 verschiedene Kalibrierungen
mit jeweils 6 verschiedenen Konzentrationen an Aldosteron.
60
Material und Methode
log(Aldosteronkonz.)
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
log
it(B
/B0)
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
1,5
MeßwerteFit ErgebnisVertr.intervall, 95%
Abbildung 8: Standardkurve. Darstellung einer typischen Kalibrierkurve für einen 125J-RIA von Aldosteron. Der logit (logit(y)=log(y/(1-y)) des Quotienten aus der gebundenen Aktivität des Standards zur gebundenen Aktivität einer aldosteronfreien Probe ist gegen den Logarithmus der Aldosteron-konzentration aufgetragen (als Doppelbestimmung) und kann an eine Geradengleichung (y=a+bx) approximiert werden (r2 = 0,9985); Vertr.intervall: Vertrauensintervall.
61
Material und Methode
3.3.5 Morphometrische Untersuchungen
Nach Beendigung der Blutabnahme wurden die Tiere über den venösen Katheter narkotisiert
(siehe Kap. 3.3.2.2), und anschließend erfolgte die Entnahme der Herzen.
Für die Entnahme des Herzens wurden das Abdomen und der Thorax eröffnet und das Herz
nach Durchtrennung der großen Gefäße entnommen. Anschließend wurde es in Heparin-
NaCl-Lösung (5.000 I.E. Heparin/100 ml NaCl-Lösung) gespült und von Blut und
Blutthromben befreit, auf einem Stück Zellstoff getrocknet und die Reste der großen Gefäße
abpräpariert. Nach Bestimmung des Herzgewichtes (A200S, Fa. Sartorius) erfolgte die
präparative Entfernung der Vorhöfe sowie die Trennung des linken und rechten Ventrikels
mit anschließender Gewichtsbestimmung. Für weitere molekularbiologische Untersuchungen
wurden die Ventrikel in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und einzeln in Alufolie verpackt bei
–80°C gelagert.
62
Material und Methode
3.3.6 Inkubation von Nebennieren in vitro
Im Rahmen dieser Experimente erfolgte die Untersuchung der Regulation der
Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen in vitro unter verschiedenen Stimuli
(K+, ANG II und ACTH). Dazu wurden die Nebennieren entnommen und nach Aufbereitung
in modifizierten Medium 199 inkubiert. Die Aldosteronsekretion wurde unter
Basalbedingungen ohne Stimulus und nach Stimulierung mit K+, ANG II und ACTH
quantitativ mittels Radioimmunoassy (siehe Kap. 3.3.4.2.1) bestimmt.
3.3.6.1 Organentnahme und Präparation
Die Entnahme der Nebennieren erfolgte in dem Zeitraum zwischen 17.00 und 18.30 Uhr.
Die Tiere wurden mittels i.p. Applikation eines Narkosemittels (siehe Kap. 3.3.2.2)
narkotisiert. 20 Minuten nach Einsetzen der Narkose erfolgte die Tötung der Tiere mittels
zervikaler Dislokation. Unmittelbar darauf wurden nach der Eröffnung des Abdomens
beide Nebennieren entnommen und umgehend in modifiziertem Medium 199 auf Eis
gelagert.
Mit Hilfe mikroskopischer Vergrößerung erfolgte die gründliche Entfernung von
Fettgewebe und Blutresten in modifiziertem Medium 199 auf Eis. Jede Nebenniere wurde
darauf in vier Teile geschnitten und die acht Stücke in ein 50 ml Röhrchen (Fa. Beckmann)
überführt. Dieser enthielt 2 ml modifiziertes Medium 199 und wurde im Eisbad gekühlt.
3.3.6.2 Inkubation
Nach Beendigung der Präparation wurden die Nebennieren unter Schütteln im Wasserbad
bei 37°C und Carbogenbegasung (95% O2 // 5% CO2) inkubiert. Zeitgleich wurden die
Nebennieren von 5-6 Tieren unterschiedlichen Genotyps inkubiert.
Zu Beginn der Inkubation erfolgte eine 60-minütige Akklimatisationsphase, in der sich die
Nebennieren an die Versuchsbedingungen gewöhnten und ein stady state der
Aldosteronsekretion erreicht werden sollte. Während der zweiten 30-minütigen
Inkubationsperiode erfolgte keine Stimulation der Zona glomerulosa-Zellen. Die ermittelte
Aldosteronsekretion stellte den Basiswert für die nachfolgende Stimulation dar.
63
Material und Methode
Nach jeder Periode wurde der Puffer vollständig entnommen, eingefroren und die
Nebennieren mit 1 ml des nachfolgenden Puffers gespült. Nach Entnahme dieses
Spülmediums wurde unmittelbar vor Beginn der nächsten Periode 2 ml des frischen auf
37°C angewärmten Puffers hinzugegeben.
Nach Beendigung der Inkubation wurden die Nebennieren in jeweils 1ml PBS überführt
und bei –20°C eingefroren, falls eine weitere Untersuchung der Nebennieren erforderlich
sein sollte.
Die K+-Konzentration des modifizierten Mediums 199 betrug 4,5 mmol/l bei allen
Inkubationen, die im Rahmen der ANG II- und ACTH-Stimulationen durchgeführt wurden.
Auf den folgenden Seiten sind die Inkubationsprotokolle tabellarisch dargestellt.
3.3.6.2.1 Vorversuche
Um den Einfluss des Versuchsaufbaus auf die Aldosteronsekretion sowie das Verhalten der
Nebennieren abhängig von der Zeit beurteilen zu können, wurde während des Vorversuchs
die Aldosteronsekretion über 3,5 Stunden bei gleichen Bedingungen mit einer
Kaliumkonzentration von 3,5 mmol/l untersucht. Um festzustellen, ob die Nebennieren zum
Ende des Versuchs generell noch adäquat auf einen physiologischen Stimulus reagierten
oder eine Erschöpfung der Sekretion eingetreten war, wurde eine einmalige Stimulation mit
11 mmol/l Kalium durchgeführt
Tabelle 2: Inkubationsprotokoll zur Kontrolle des Zeitverlaufs der Aldosteronsekretion (K+ [mmol/l]).
Inkubationsintervalle
60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min
Kontrolle 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 11,0
64
Material und Methode
3.3.6.2.2 Kaliumstimulation
Dosis-Wirkungskurve
Zur Ermittlung der wirksamen K+-Konzentrationen, bei denen eine Stimulation der
Aldosteronsekretion stattfindet, wurde eine Dosis-Wirkungskurve erstellt.
Tabelle 3: Inkubationsprotokoll zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve von K+
[mmol/l].
Inkubationsintervalle
60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min
WT 3,5 3,5 4,0 5,0 7,0 11,0 11,0
Stimulation mit Kalium
Anhand der Vorversuche für K+ wurden die vergleichenden Untersuchungen an
Nebennieren von Knockout und Wildtyp Mäusen durchgeführt.
Tabelle 4: Inkubationsprotokoll der in vitro Untersuchungen zur Stimulation der Aldosteronsekretion durch K+ [mmol/l].
Inkubationsintervalle
60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min
WT 4,0 4,0 4,5 5,5 7,5 11,0
KO 4,0 4,0 4,5 5,5 7,5 11,0
65
Material und Methode
3.3.6.2.3. ANG II-Stimulation
Dosis-Wirkungskurve
Zur Ermittlung der wirksamen ANG II-Konzentrationen, bei denen eine Stimulation der
Aldosteronsekretion stattfindet, wurden Nebennieren von Wildtyp Mäusen mit steigender
Konzentration von ANG II inkubiert und eine Dosis-Wirkungskurve erstellt.
Tabelle 5: Inkubationsprotokoll zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve von ANG II [mol/l].
Inkubationsintervalle
60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min
WT - - 10-12 10-10 10-9 10-8 10-6
Stimulation mit ANG II
Aufgrund der Befunde der Vorversuche zur ANG II-Stimulation wurden die
vergleichenden Untersuchungen an Nebennieren von Knockout und Wildtyp Mäusen
durchgeführt.
Tabelle 6: Inkubationsprotokoll der in vitro Untersuchungen zur Stimulation der
Aldosteronsekretion durch ANG II [mol/l].
Inkubationsintervalle
60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min
WT - - 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
KO - - 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
66
Material und Methode
3.3.6.2.4 ACTH-Stimulation
Dosis-Wirkungskurve
Zur Ermittlung der wirksamen ACTH-Konzentrationen, bei denen eine Stimulation der
Aldosteronsekretion stattfindet, wurde eine Dosis-Wirkungskurve mit Nebennieren von
Wildtyp Mäusen erstellt.
Tabelle 7: Inkubationsprotokoll zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve von ACTH [mol/l].
Inkubationsintervalle
60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min
WT - - 10-15 10-14 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9
Stimulation mit ACTH
Aufgrund der Befunde der erstellten Dosis-Wirkungskurve für ACTH wurden die
vergleichenden Untersuchungen an Nebennieren von Knockout und Wildtyp Mäusen
durchgeführt.
Tabelle 8: Inkubationsprotokoll der in vitro Untersuchungen zur Stimulation der Aldosteronsekretion durch ACTH [mol/l].
Inkubationsintervalle
60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min
WT - - 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7
KO - - 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7
67
Material und Methode
3.3.7 Statistik
Die in dieser Arbeit aufgeführten Werte repräsentieren jeweils den arithmetischen Mittelwert
± Standardfehler (des Mittelwerts). Die Evaluation der Daten erfolgte in Abhängigkeit von
ihrer Gewinnung/Erstellung durch zwei unterschiedliche statistische Verfahren.
Die Unterschiede zwischen den Gruppen der ersten 3 Versuchsserien wurde mittels t-Test für
ungepaarte Daten nach Student (Student`s t-Test) auf ihre Signifikanz getestet.
In den Nebenniereninkubationsexperimenten der Versuchsserie 4 wurden die absoluten
Aldosteronsekretionsraten (in pg/ml/h) in prozentuale, auf das erste Inkubationsintervall nach
der Akklimatisation bezogene, normierte Größen umgewandelt. Die gewonnenen relativen
prozentualen Sekretionsraten von Aldosteron der Wildtyp und Knockout Tiere wurden
mittels zweiseitiger Multivarianzanalyse (two-way ANOVA, GRAPHPAD PRISM®)
miteinander verglichen. Bei signifikanten Ergebnissen und einer fehlenden Interaktion der
untersuchten Parameter wurden Unterschiede in der Aldosteronsekretionsrate zwischen den
Gruppen bei den einzelnen Konzentrationen mittels Student`s t-Test getestet.
Die in Gegenwart der verschiedenen Stimuli aus den normierten Sekretionsraten über
Kurvenanpassungsverfahren mit dem Programm TableCurve approximierten Werte der
Effektiven Dosis 50 (ED50), wurden aufgrund signifikant unterschiedlicher Varianzen mit
dem nach Welch korrigierten t-Test auf statistisch signifikante Unterschiede untersucht.
Außerdem wurde durch Vergleich mit den Ergebnissen unter Verwendung der absoluten
Sekretionsraten sichergestellt, dass durch den Gebrauch normierter Daten keine
systematischen Veränderungen der ED50 Werte provoziert wurden.
Unterschiede wurden als signifikant bewertet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner als
5% war (P<0,05).
68
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1. Genotypisierung
Die Untersuchungen dieser Arbeit wurden an männlichen C57/BL6 Inzuchtmäusen mit
genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals (BKβ1-/-)
durchgeführt. Als Kontrolltiere dienten männliche Wildtyp Tiere mit dem gleichen
genetischen Hintergrund (BKβ1+/+).
Um sowohl die Zuchttiere als auch die Tiere, an denen die beschriebenen Experimente
durchgeführt wurden, sicher einem der Genotypen zuordnen zu können, wurde anhand einer
Ohrbiopsie mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion nachgewiesen, ob der Genlocus, der für
die β1–Untereinheit codiert, bei den Tieren vollständig vorhanden oder durch genetische
Manipulation verkürzt war. Diese Verkürzung des Genfragmentes tritt bei den Knockout
Mäusen infolge einer Deletion des ersten codierenden BKβ1–Exons (exon 2) auf
(BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000). Dieses Exon codiert für die terminale
Aminosequenz inklusive der 1. transmembranen Domaine des β1 Proteins.
Mit Hilfe der in den Methoden beschriebenen Primern konnten die Genfragmente mit
unterschiedlicher Länge nachgewiesen werden.
Durch die Primer 11s und 3a konnte bei den Wildtyp Mäusen ein Genfragment mit 719
Basenpaaren amplifiziert werden, welches dem vollständigen Genabschnitt entspricht. Durch
die Primer 17s und 3a wurde der 372 Basenpaare lange Genabschnitt der Knockout Mäuse
nachgewiesen. Konnten auf dem Agarose-Gel beide Banden nachgewiesen werden, handelte
es sich um Mäuse mit einem heterozygoten Genotyp (siehe Abb. 9).
69
Ergebnisse
Abbildung 9: PCR Analyse von repräsentativen Ohrbiopsien. Dargestellt sind mittels PCR amplifizierte Genfragmente aus Ohrbiopsien von BKβ1+/+ (1-3), BKβ1+/- (4-6) und BKβ1-/- (7-9) Mäusen. M bezeichnet den 1 kb Plus DNA-Marker und K die Kontrolle. Die Genfragmente der BKβ1+/+ liegen bei 719 bp, die BKβ1+/- bei 719 und 372 bp und die BKβ1-/- bei 372 bp.
70
Ergebnisse
4.2 Versuchsserie 1 und 2
Zur Beurteilung des Allgemeinbefindens der katheterisierten Tiere wurde neben der
Beurteilung des Habitus täglich die Wasseraufnahme der Mäuse gemessen. Nach einer
reduzierten Wasseraufnahme am ersten postoperativen Tag (WT: 2,5 ± 0,4 ml u. KO: 2,2 ±
0,4 ml) normalisierte sich die Trinkmenge bei beiden Gruppen am 2. postoperativen Tag
(WT: 4,7 ± 0,4 ml u. KO: 4,6 ± 0,4 ml) und blieb am 3. postoperativen Tag konstant (WT:
4,9 ± 0,2 ml u. KO: 5,0 ± 0,5 ml). Zwischen den Genotypen konnte kein Unterschied in der
Wasseraufnahme festgestellt werden. Die nachfolgend aufgeführten Ergebnisse wurden
ausschließlich von Tieren erhoben, die den Habitus eines gesunden bis geringgradig kranken
Tieres zeigten.
4.2.1 Hämodynamische Daten
In der folgenden Tabelle sind die hämodynamischen Daten der Versuchsserien 1 und 2
dargestellt. Es wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen der Blutdruck und die
Herzfrequenz bestimmt.
Tabelle 9: Mittelwerte und Standardfehler der hämodynamischen Daten der Versuchsserie 1 und 2. (*P<0,05)
1. Messtag 2. Messtag
Versuchsserie n MAD [mmHg]
Herzfrequenz[min-1]
MAD [mmHg]
Herzfrequenz[min-1]
Serie 1
WT
KO
12
14
110,6 ± 1,6
119,7 ± 1,5*
625 ± 13
579 ± 11
106,9 ± 1,7
116,0 ± 1,6*
605 ± 12
604 ± 10
Serie 2
WT
KO
8
9
104,7 ± 1,5
116,4 ± 2,1
550 ± 12
599 ± 19
104,1 ± 1,5
112,7 ± 1,5
591 ± 25
593 ± 7
71
Ergebnisse
Die Daten der Basisuntersuchungen zeigten eine signifikante Erhöhung des mittleren
arteriellen Blutdrucks um ca. 10 mmHg bei den Knockout Mäusen im Vergleich zu den
Wildtyp Tieren (117,8 ± 1,4 mmHg vs. 108,6 ± 1,4 mmHg; P<0,001). Die Herzfrequenzen
wiesen zwischen den beiden Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiede auf (592 ± 9
min-1 vs. 614 ± 8 min-1).
Im Rahmen der Blutdruckbestimmung der 2. Serie konnte der Nachweis des signifikanten
Blutdruckanstieges der Knockout Mäuse reproduziert werden (114,4 ± 1,4 mmHg vs. 104,7 ±
1,2 mmHg; P<0,001). Der MAD sowohl der Wildtyp Tiere als auch der Knockout Mäuse
dieser 2. Versuchsserie liegt gleichmäßig ca. 4 mmHg unter dem Niveau der 1. Serie, wobei
der Unterschied zwischen den Genotypen jedoch quantitativ bestehen blieb.
4.2.2 Morphometrische Daten
In der ersten Versuchsserie wurde als Parameter für eine Herzhypertrophie das Gewicht des
Herzens, des linken sowie rechten Ventrikels bestimmt und zum Körpergewicht ins
Verhältnis gesetzt.
Tabelle 10: Mittelwerte und Standardfehler der Herzgewichte. (*P<0,05) Versuchsserie n HGW
[mg]
LV
[mg]
RV
[mg]
LV/KGW
[mg/g]
Serie 1
WT
KO
9
11
113 ± 2,5
138 ± 5,3*
84 ± 2,0
104 ± 4,4*
21 ± 0,8
27 ± 1,0*
3,16 ± 0,10
3,58 ± 0,10*
Die Daten zeigen einen signifikanten Anstieg des Herzgewichtes und des Gewichtes des
linken sowie rechten Ventrikels der Knockout Mäuse. Da das ermittelte Körpergewicht der
Tiere keinen Unterschied (WT: 28,3 ± 1,2 g vs KO: 30,0 ± 0,8 g) aufwies, zeigte sich auch
im Verhältnis des Gewichtes des linken Ventrikels zum Körpergewicht eine signifikante
72
Ergebnisse
Steigerung bei den Knockout Tieren (WT: 3,16 ± 0,10 mg/g vs. KO: 3,58 ± 0,10 mg/g;
P<0,05), was als Indiz für eine Linksherzhypertrophie zu bewerten ist. Das Verhältnis von
Herzgewicht zu Körpergewicht war ebenfalls signifikant erhöht (WT: 4,23 ± 0,12 mg/g vs.
KO: 4,80 ± 0,16 mg/g; P< 0,05).
73
Ergebnisse
4.2.3 Ergebnisse der Blutuntersuchungen
4.2.3.1 Elektrolyte und Kreatinin
In der folgenden Tabelle sind die Plasmakonzentrationen der untersuchten Elektrolyte und
des Kreatinins der 1. Versuchsserie dargestellt. Im Gegensatz zu den Na+-, K+- und
Kreatininkonzentrationen, ermittelt aus jeweils 10 analysierten Plasmaproben, wurde die
Chloridkonzentration nur in 5 Plasmaproben bestimmt.
Tabelle 11: Mittelwerte und Standardfehler der Elektrolyt-/Kreatinin-konzentrationen im Plasma. (*P<0,05; †: n=5)
Versuchs-
serie
n Na+
[mmol/l]
K+
[mmol/l]
Cl- †
[mmol/l]
Kreatinin
[mg/dl]
Serie 1
WT
KO
10
10
145,1 ± 1,2
149,0 ± 4,8*
4,49 ± 0,10
4,01 ± 0,09*
110,7 ± 1,1
114,5 ± 1,9
0,95 ± 0,11
0,67 ± 0,11
Die Plasmakonzentrationen von Chlorid und Kreatinin zeigten im t-Test keine signifikanten
Abweichungen, wohingegen die Natrium- und Kaliumkonzentrationen signifikante
Unterschiede zwischen den Genotypen aufwiesen. So war die Natriumkonzentration im
Plasma der Knockout Mäuse signifikant um 3,9 mmol/l erhöht (WT: 145,1 ± 1,2 mmol/l vs.
KO: 149,0 ± 4,8 mmol/l; P<0,05). Die Kaliumkonzentration im Plasma der Knockout
Mäuse war hingegen hochsignifikant verringert (WT: 4,49 ± 0,10 mmol/l vs. KO: 4,01 ±
0,09 mmol/l; P<0,001).
74
Ergebnisse
4.2.3.2 Renin
Bei den Tieren der 1. Versuchsserie wurde des Weiteren die Plasmareninkonzentration
(PRC) und die Proreninkonzentration bestimmt, um eine Beurteilung der Aktivität des
Renin-Angiotensin-Systems vornehmen zu können. Beide Parameter wurden indirekt über
die Bestimmung des entstandenen ANG I bestimmt. Zur Angabe der Konzentration des
Prorenins wurde von der gemessenen ANG I-Konzentration die Plasmareninkonzentration
subtrahiert, um die ANG I-Konzentration zu erhalten, die ausschließlich durch die
aktivierten Formen des Prorenins gebildet wurde. Die Ergebnisse zeigten eine leicht
erhöhte Plasmareninkonzentration bei den BKβ1-/- Mäusen, wohingegen die Konzentration
des Prorenins leicht erniedrigt war. Die Unterschiede zwischen den beiden Genotypen
überschritten jedoch bei beiden Bestimmungen das Signifikanzniveau von P<0,05.
Tabelle 12: Mittelwerte und Standardfehler der Plasmarenin- und Proreninkonzentrationen.
Versuchs-
serie
n PRC
[ng ANG I/ml/h]
Prorenin
[ng ANG I/ml/h]
Serie 1
WT
KO
9
9
129,9 ± 22,1
144,5 ± 12,5
960 ± 141
664 ± 95
75
Ergebnisse
4.2.3.3 Aldosteron
Zur Bestimmung des Aldosterongehaltes im Plasma musste aufgrund des geringen
Blutvolumens der Mäuse Blut in einer weiteren Versuchsgruppe abgenommen werden
(Versuchsserie 2).
Die Knockout Mäuse zeigten eine signifikante Erhöhung des zirkulierenden Aldosterons im
Blut gegenüber den Wildtyp Tieren (KO: 134,8 ± 38,0 pg/ml vs. WT: 28,97 ± 5,81 pg/ml;
P<0,05).
Plas
maa
ldos
tero
n [p
g/m
l]
0
40
80
120
160
200
+/+
(n=7)
-/-
(n=8)
P<0.05
Abbildung 10: Aldosteronkonzentrationen im Plasma. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte und Standardfehler der Aldosteronkonzentrationen von Wildtyp (+/+) und Knockout (-/-) Mäusen; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Tiere.
76
Ergebnisse
4.3 Versuchsserie 3
4.3.1 Hämodynamische Daten
In dem folgenden Balkendiagramm wird die Veränderung des mittleren arteriellen Blutdrucks
unter Spironolactonbehandlung (3. Serie) dargestellt.
Mitt
lere
r art
erie
ller B
lutd
ruck
[mm
Hg]
90
100
110
120
Spironolacton
+/+(n=11)
-/-(n=12)
P<0.0001
n.s.
Kontrolle
+/+(n=8)
-/-(n=9)
Abbildung 11: Entwicklung des mittleren arteriellen Blutdrucks unter Spirono-lactonbehandlung. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit Standardfehlern von Wildtyp (+/+) und Knockout (-/-) Mäusen ohne und mit Blockade der Mineralocorticoidrezeptoren; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Tiere.
Unter Spironolactonbehandlung sank der mittlere arterielle Blutdruck im Vergleich zu den
Werten der 1. Serie bei den Knockout Mäusen deutlich um 16 mmHg, wohingegen bei den
Wildtyp Tieren nur ein geringer Abfall um 8 mmHg festzustellen war (KO: 102,0 ± 1,7
mmHg vs. WT: 100,8 ± 1,8 mmHg). Zwischen den Versuchsgruppen konnte kein
signifikanter Blutdruckunterschied mehr nachgewiesen werden.
77
Ergebnisse
4.3.2 Morphometrische Daten
Wie aus den Daten der Versuchsserie 1 deutlich wird, entwickelten die Knockout Mäuse eine
linksventrikuläre Hypertrophie, welche durch das Verhältnis von linksventrikulärem
Gewicht / Körpergewicht (WT: 3,16 ± 0,10 mg/g vs. KO: 3,58 ± 0,10 mg/g; P<0,05) deutlich
wird (siehe Abb. 12).
Unter Spironolactonbehandlung reduzierte sich das Gewicht des isolierten linken Ventrikels
(WT: 80 ± 2,0 mg vs. KO: 90 ± 1,9 mg) und somit auch der Quotient aus LV/KGW (WT:
3,00 ± 0,07 mg/g vs. KO: 2,98 ± 0,04 mg/g).
LV/K
GW
[mg/
g]
0
1
2
3
4
+/+
(n=9)
-/-
(n=11)
P<0.05
Abbildung 12: Darstellung der linksventrikulären Hypertrophie der Knockout Mäuse. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit Standardfehlern von Wildtyp (+/+) und Knockout (-/-) Mäusen; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Tiere.
78
Ergebnisse
4.4 Versuchsserie 4
Im Rahmen der in vitro Inkubationsversuche mit Nebennierenstücken von Knockout und
Wildtyp Mäusen wurde untersucht, ob bei Stimulierung der Aldosteronsekretion mittels
verschiedener physiologischer Stimuli (K+, ANG II und ACTH) Unterschiede zwischen den
zwei Versuchsgruppen in der Sekretionsrate und –kinetik nachgewiesen werden können.
4.4.1 Vorversuch
Um die Adaptierung der Nebennierenzellen an die gewählten Inkubationsbedingungen im
modifizierten Medium 199 äquilibriert gegen Carbogen (95% O2 // 5% CO2) sowie den
weiteren zeitlichen Verlauf der Aldosteronsekretion beurteilen zu können, wurden
Nebennieren von 4 Wildtyp Mäusen über 3,5 Stunden unter konstanten
Versuchsbedingungen inkubiert. Anhand der gewonnen Ergebnisse sollte der Zeitverlauf der
weiteren Inkubationsversuche festgelegt werden. Die Einzelwerte sowie die arithmetischen
Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und Standardabweichungen sind
im Anhang in der Tabelle I dokumentiert.
Die Kontrollinkubation erfolgte bei einer K+-Konzentration von 3,5 mmol/l. Während des
letzten Zeitintervalls von 30 Minuten wurden die Nebennieren bei 11 mmol/l K+ inkubiert,
um festzustellen, ob die Zona glomerulosa-Zellen auch zum Ende der Inkubationszeit nach
längerer Versuchsdauer noch stimuliert werden konnten oder ob eine Erschöpfung der
Aldosteronsekretion stattgefunden hatte (siehe Abb. 13).
Innerhalb der ersten Stunde wurde aus den Nebennieren deutlich mehr Aldosteron freigesetzt
als in dem nachfolgenden Zeitintervall (26051 ± 1835 pg/ml/h vs. 18025 ± 441 pg/ml/h). Im
weiteren zeitlichen Verlauf fiel die Aldosteronsekretion kontinuierlich auf 12091 ± 2320
pg/ml/h ab. Durch die abschließende Inkubation bei einer K+-Konzentration von 11,0 mmol/l
erfolgte eine starke Stimulierung der Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen
(41410 ± 3655 pg/ml/h).
Aufgrund des starken Abfalls der Aldosteronproduktion innerhalb der 1. Stunde auf das
nächste Inkubationsintervall, diente die erste Stunde der Inkubation ausschließlich der
79
Ergebnisse
Akklimatisation der Nebennieren an die Versuchsbedingungen und wird in den folgenden
Abbildungen nicht mehr dargestellt.
Zeit [Stunden]
1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
Aldo
ster
onse
kret
ion
[pg/
ml/h
]
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
Abbildung 13: Zeitlicher Verlauf der Aldosteronsekretion bei 3,5 und 11 mmol/l K+. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit zugehörigen Standardfehlern (n=4). Die Aldosteronproduktion wurde generell für eine Stunde berechnet. Die Inkubation erfolgte innerhalb der ersten 3,5 Stunden bei 3,5 mmol/l K+. Die letzte Inkubation wurde in Gegenwart von 11 mmol/l K+ durchgeführt.
80
Ergebnisse
4.4.2 Kaliumstimulation
4.4.2.1 Dosis-Wirkungskurve
Als Vorversuch zur Kaliumstimulation wurde die Aldosteronfreisetzung in Abhängigkeit
steigender K+-Konzentrationen (3,5, 4,0, 5,0, 7,0 und 11 mmol/l) untersucht, um die
potentiell stimulierenden K+-Konzentrationen zu ermitteln (siehe Abb. 14). Es wurden die
Nebennieren von 6 Wildtyp Tieren inkubiert. Die Einzelwerte sowie die arithmetischen
Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und -abweichungen sind im
Anhang in der Tabelle II dokumentiert.
Kaliumkonzentration [mmol/l]
3,5 4 5 6 7 8 9 10
Aldo
ster
onse
kret
ion
[pg/
ml/h
]
15000
25000
35000
45000
55000
20000
30000
40000
50000
11
Abbildung 14: Dosis-Wirkungskurve von Kalium. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit zugehörigen Standardfehlern (n=6).
Die Nebennieren produzierten bei 3,5 mmol/l und 4 mmol/l eine vergleichbare Menge
Aldosteron (22890 ± 1703 pg/ml/h und 22804 ± 1957 pg/ml/h). Ab einer K+-Konzentration
81
Ergebnisse
von 5 mmo/l erfolgte eine deutliche Steigerung der Aldosteronsekretion (28093 ± 2213
pg/ml/h). Die maximale Sekretionsrate wurde in diesem Versuch bei der höchsten K+-
Konzentration (11 mmol/l) erreicht (49489 ± 4643 pg/ml/h).
4.4.2.2 Stimulation mit Kalium
Die vergleichende Untersuchung der Sekretion von Aldosteron unter Kaliumstimulation
wurde an Nebennieren von 10 Knockout Mäusen und 10 Wildtyp Mäusen durchgeführt,
wobei folgende Kaliumkonzentrationen eingesetzt wurden: 4,0, 4,5, 5,5, 7,5 und 11 mmol/l.
Die Einzelwerte sowie die arithmetischen Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit
Standardfehlern und -abweichungen sind im Anhang in der Tabelle III dokumentiert.
Die Abbildung 15 zeigt die arithmetischen Mittelwerte der relativen prozentualen
Sekretionsänderungen, bezogen auf die 1. Inkubation bei 4,0 mmol/l K+. Diese 1.
Inkubation diente somit als Referenzwert der individuellen Aldosteronsekretion (= 100%)
und erlaubte eine Normierung der Stimulation der Aldosteronsekretion.
Ausgehend von 100% bei 4,0 mmol/l K+ fiel die Aldosteronsekretion bei einer
Kaliumkonzentration von 4,5 mmol/l sowohl bei den Wildtyp als auch bei den Knockout
Mäusen geringgradig ab (WT: 94,9 ± 8,8 % vs. KO: 89,7 ± 6,0 %). Bei 5,5 mmol/l K+
zeigte die Kurve beider Gruppen eine deutliche Stimulation der Sekretion wobei die
Knockout Nebennieren tendenziell stärker stimuliert wurden (WT: 158,6 ± 10,3 % vs. KO:
182,4 ± 19,8 %). Durch Inkubation bei 7,5 mmol/l K+ erfolgte eine weitere Steigerung der
relativen Aldosteronsekretion erneut mit einer stärkeren Tendenz bei den Knockout
Nebennieren (WT: 204,8 ± 11,1 % vs. 255,0 ± 23,9 %), die jedoch bei 11 mmol/l K+
stagnierte (WT: 211,4 ± 12,2 % vs. KO: 263,7 ± 23,3 %).
82
Ergebnisse
Kaliumkonzentration [mmol/l]
4 4,5 5,5 7,5
rela
tive
Aldo
ster
onse
kret
ion
[%]
50
100
150
200
250
300
WT, n =10
KO, n =10
11
Abbildung 15: Relative prozentuale Änderung der Aldosteronfreisetzung bei steigenden Kaliumkonzentrationen. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Nebennierenpaare.
Die durchgeführte zweiseitige Multivarianzanalyse zeigte, dass sowohl der Genotyp
(P<0,01) als auch die Kaliumkonzentration (P<0,0001) einen signifikanten Einfluss auf die
Aldosteronsekretion ausüben. Eine signifikante Interaktion zwischen den beiden
Parametern lag jedoch nicht vor, so dass mittels students t-Test geprüft wurde, ob zwischen
den einzelnen Mittelwerten der relativen Sekretion der Knockout Mäuse gegenüber der
relativen Sekretion der Wildtyp Mäuse bei jeweils gleicher Kaliumkonzentration ein
signifikanter Unterschied bestand. Es konnte bei keiner Konzentration ein signifikanter
Unterschied festgestellt werden, wobei sich jedoch bei 7,5 mmo/l K+ (P=0,07) und 11
mmol/l K+ (P=0,06) die P-Werte an der Grenze zur Signifikanz befanden und somit eine
tendenziell stärkere Stimulation der Knockout Nebennieren widerspiegeln. Die Berechnung
der ED50 wurde auf der Basis von 50 Datenpunkten pro Genotyp durchgeführt und ergab
83
Ergebnisse
für die Wildtypen eine Kaliumkonzentration von 5,44 ± 0,23 mmol/l bei einer relativen
Aldosteronsekretion von 152,9 ± 15,1 % und für die Knockouts eine Kaliumkonzentration
von 5,46 ± 0,44 mmol/l bei einer relativen Aldosteronsekretion von 178,2 ± 24,0 %. Der
aufgrund der signifikant unterschiedlichen Varianzen durchgeführte nach Welch korrigierte
t-Test ergab keinen signifikanten Unterschied der ED50 Werte. Die ED50 Werte der
absoluten Aldosteronsekretion stimmten mit denen der relativen Aldosteronsekretion
überein (WT: 5,42 ± 0,31 mmol/l vs. KO: 5,49 ± 0,47 mmol/l).
4.4.3 ANG II-Stimulation
4.4.3.1 Dosis-Wirkungskurve
Im Rahmen dieses Versuchs wurde an Nebennieren von 4 Wildtyp Tieren die
Aldosteronfreisetzung bei steigenden ANG II-Konzentrationen (10-12, 10-10 , 10-9, 10-8 und
10-6 mol/l) untersucht, um das Spektrum der stimulierenden ANG II-Konzentrationen zu
ermitteln (Abb. 16). Die Primärdaten sind im Anhang in der Tabelle IV dargestellt.
Die Akklimatisation und die 1. Inkubation erfolgte ohne ANG II bei 4,5 mmol/l Kalium.
Die Sekretion von Aldosteron fiel von 4,5 mmol/l Kalium (20050 ± 118 pg/ml/h) bis zu
einer ANG II-Konzentration von 10-10 mol/l (16433 ± 1053 pg/ml/h) moderat ab. Nach
einer geringgradigen Steigerung bei 10-9 mol/l ANG II, erfolgte bei 10-8 und 10-6 mol/l
ANG II eine sehr starke Stimulation der Sekretion (25375 ± 1576 pg/ml/h und 37618 ±
2009 pg/ml/h). Eine Sättigung der Aldosteronsekretion konnte bei den gewählten
Konzentrationen nicht dargestellt werden.
84
Ergebnisse
ANG II-Konzentration [mol/l]
0 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6
Aldo
ster
onse
kret
ion
[pg/
ml/h
]
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
Abbildung 16: Dosis-Wirkungskurve von ANG II. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar (n=4). Die basale Inkubation erfolgte bei 4,5 mmol/l K+.
4.4.3.2 Stimulation mit ANG II
Die vergleichende Untersuchung der Sekretion von Aldosteron unter ANG II-Stimulation
(10-10, 10-9, 10-8 , 10-7, 10-6 und 10-5 mol/l ANG II) wurde an Nebennieren von 10 Knockout
Mäusen und 10 Wildtyp Mäusen durchgeführt. Die Akklimatisation und 1. Inkubation
erfolgte ohne ANG II-Stimulus bei 4,5 mmol/l K+. Die Einzelwerte sowie die
arithmetischen Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und
-abweichungen sind im Anhang in der Tabelle V dokumentiert.
Die folgende Abbildung (Abb. 17) zeigt die arithmetischen Mittelwerte der relativen
Sekretionsänderung, bezogen auf die 1. Inkubation bei 4,5 mmol/l K+ in Prozent. Auf der
Abzisse sind die ANG II-Konzentrationen in logarithmischer Einteilung dargestellt.
85
Ergebnisse
Ausgehend von 100% bei 4,5 mmol/l K+ ohne ANG II-Stimulus blieb die
Aldosteronsekretion bei 10-10 mol/l ANG II bei beiden Genotypen weitestgehend konstant
(WT: 95,5 ± 3,6 % vs. KO: 97,0 ± 4,1 %). Ab einer Konzentration von 10-9 mol/l ANG II
zeigte die Kurve der Knockout Nebennieren eine beginnende Stimulation der
Aldosteronsekretion, wohingegen die Sekretion der Wildtyp Nebennieren nur den
Ausgangswert erreichte (WT: 101,0 ± 5,6 % vs. KO: 114,0 ± 2,5 %). Die Kurve der
Knockout Nebennieren zeigte auch im weiteren Verlauf bei gleichen Konzentrationen eine
stärkere Stimulation der Aldosteronsekretion als die Nebennieren der Wildtypen und
erreichte bei 10-6 mol/l ANG II das Sekretionsmaximum (WT: 180,0 ± 6,1 % vs. KO: 206,5
± 11,1 %).
Die durchgeführte zweiseitige Multivarianzanalyse zeigte auch unter ANG II-Stimulation
einen hoch signifikanten Einfluss des Genotyps (P<0,0001) und der ANG II-Konzentration
(P<0,0001) auf die relative Aldosteronsekretion. Eine signifikante Interaktion zwischen den
beiden Parametern lag wiederum nicht vor, so dass ebenfalls mittels t-Test untersucht
wurde, ob zwischen den einzelnen Mittelwerten der relativen Sekretion bei jeweils gleicher
Konzentration ANG II ein signifikanter Unterschied bestand. Es konnte ab einer
Konzentration von 10-9 bei allen weiteren Konzentrationen eine signifikant höhere relative
Aldosteronsekretion (P<0,05) der Knockout Nebennieren festgestellt werden.
Die Berechnung der ED50 wurde auf der Basis von 60 Datenpunkten pro Genotyp
durchgeführt und ergab für die Wildtypen eine ANG II-Konzentration von 1,57 x 10-8 ±
6,20 x 10-9 mol/l bei einer relativen Aldosteronsekretion von 136,2 ± 9,8 % und für die
Knockout Mäuse eine Konzentration von 9,73 x 10-9 ± 4,77 x 10-9 mol/l bei einer relativen
Aldosteronsekretion von 150,2 ± 18,6 %. Der aufgrund der signifikant unterschiedlichen
Varianzen durchgeführte nach Welch korrigierte t-Test ergab keinen signifikanten
Unterschied der ED50 Werte. Die ED50 Werte der absoluten Aldosteronsekretion stimmten
mit denen der relativen Aldosteronsekretion überein (WT: 1,54 x 10-8 ± 7,25 x 10-9 mmol/l
vs. KO: 1,06 x 10-8 ± 7,47 x 10-9 mmol/l).
86
Ergebnisse
ANG II-Konzentration [mol/l]
0 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5
rela
tive
Aldo
ster
onse
kret
ion
[%]
50
100
150
200
250
WT, n =10KO, n =10
∗
∗ ∗∗
∗
Abbildung 17: Relative prozentuale Änderung der Aldosteronfreisetzung bei steigenden ANG II-Konzentrationen. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar. Die basale Inkubation erfolgte bei K+ 4,5 mmol/l. Die Sterne* markieren einen signifikanten Unterschied (P<0,05) der Sekretion von Knockout und Wildtyp Nebennieren; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Nebennierenpaare.
87
Ergebnisse
4.4.4 ACTH-Stimulation
4.4.4.1 Dosis-Wirkungskurve
Im Rahmen dieses Versuchs wurde an Nebennieren von 5 Wildtyp Tieren die
Aldosteronfreisetzung bei steigenden ACTH-Konzentrationen (10-15, 10-14, 10-13 , 10-12, 10-
11, 10-10 und 10-9 mol/l) untersucht, um das Spektrum der stimulierenden ACTH-
Konzentrationen zu ermitteln (Abb. 18). Die Primärdaten sind im Anhang in der Tabelle VI
dargestellt.
ACTH-Konzentration [mol/l]
0 10-15 10-14 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9
Aldo
ster
onse
kret
ion
[pg/
ml/h
]
5000
15000
25000
35000
45000
55000
65000
Abbildung 18: Dosis-Wirkungskurve von ACTH. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar (n=5). Die basale Inkubation erfolgte bei 4,5 mmol/l K+.
Die Akklimatisation und die 1. Inkubation erfolgte ohne ACTH bei 4,5 mmol/l Kalium. Die
Sekretion von Aldosteron fiel, ausgehend von 4,5 mmol/l Kalium (22635 ± 1746 pg/ml/h)
bis zu einer ACTH-Konzentration von 10-12 mol/l (12714 ± 1552 pg/ml/h), kontinuierlich
88
Ergebnisse
ab. Nach einer geringgradigen Steigerung bei 10-11 mol/l ACTH erfolgte bei 10-10 und 10-9
mol/l ACTH eine sehr starke Stimulation der Sekretion (40051 ± 2531 pg/ml/h und 55995
± 3339 pg/ml/h). Eine Sättigung der Aldosteronsekretion konnte bei den gewählten
Konzentrationen ebenfalls nicht dargestellt werden, so dass das Konzentrationsspektrum
innerhalb der vergleichenden Stimulationsversuche zu höheren ACTH-Konzentrationen
verschoben wurde.
4.4.4.2 Stimulation mit ACTH
Die vergleichende Untersuchung der Sekretion von Aldosteron unter ACTH-Stimulation
(10-13, 10-12, 10-11 , 10-10, 10-9 , 10-8 und 10-7 mol/l ACTH) wurde ebenfalls an Nebennieren
von 10 Knockout Mäusen und 10 Wildtyp Mäusen durchgeführt. Die Akklimatisation und
1. Inkubation erfolgte ohne ACTH-Stimulus bei 4,5 mmol/l K+. Die Einzelwerte sowie die
arithmetischen Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und
-abweichungen sind im Anhang in der Tabelle VII dargestellt.
Die Abbildung 19 zeigt die arithmetischen Mittelwerte der relativen Sekretionsänderung,
bezogen auf die 1. Inkubation bei 4,5 mmol/l K+ in Prozent. Auf der Abzisse sind die
ACTH-Konzentrationen in logarithmischer Einteilung dargestellt.
Die Kurven der relativen Aldosteronfreisetzung zeigten unter ACTH-Stimulierung einen
ähnlichen Verlauf wie die relativen Freisetzungskurven unter ANG II-Stimulation (siehe
Abb.17). Ausgehend von 100% bei 4,5 mmol/l K+ ohne ACTH-Stimulus fiel die
Aldosteronsekretion bis 10-12 mol/l ACTH in beiden Gruppen gleichermaßen moderat ab
(WT: 72,5 ± 2,4 % vs. KO: 75,0 ± 3,2 %). Bei einer ACTH-Konzentration von 10-11 mol/l
reagierten die Knockout Nebennieren mit einer geringgradig stärkeren Stimulierung (WT:
74,4 ± 2,4 % vs. KO: 83,9 ± 4,5 %). Diese größere Empfindlichkeit der Knockout
Nebennieren setzte sich bis zur höchsten ACTH-Konzentration fort (WT: 238,8 ± 14,5 %
vs. KO: 252,8 ± 10,6 %). Das Maximum der Aldosteronsekretion erreichten die Knockout
Nebennieren bereits bei 10-8 mol/l (WT: 234,8 ± 13,2 % vs. KO: 263,4 ± 12,8 %),
89
Ergebnisse
wohingegen die Wildtyp Nebennieren auch bei 10-7 eine weitere Steigerung der
Sekretionsrate zeigten (WT: 238,8 ± 14,5 %).
ACTH-Konzentration [mol/l]
0 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7
rela
tive
Aldo
ster
onse
kret
ion
[%]
50
100
150
200
250
300
WT, n =10KO, n =10
Abbildung 19: Relative prozentuale Änderung der Aldosteronfreisetzung bei steigenden ACTH-Konzentrationen. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar. Die basale Inkubation erfolgte bei K+ 4,5 mmol/l; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Nebennierenpaare.
Die durchgeführte zweiseitige Multivarianzanalyse zeigte unter ACTH-Stimulation, dass
sowohl der Genotyp als auch die Behandlung mit unterschiedlichen ACTH-
Konzentrationen einen signifikanten Einfluss (P<0,0001 und P<0,001) auf die relative
Aldosteronsekretion ausüben. Wiederum fand keine Interaktion zwischen den beiden
getesteten Parametern statt. Im anschließend durchgeführten t-Test wurde jedoch bei keiner
der eingesetzten ACTH-Konzentrationen ein signifikanter Unterschied zwischen beiden
Genotypen festgestellt.
90
Ergebnisse
Die Berechnung der ED50 wurde auf der Basis von 60 Datenpunkten pro Genotyp
durchgeführt und ergab für die Wildtypen eine ACTH-Konzentration von 1,08 x 10-10 ±
3,12 x 10-11 mol/l bei einer relativen Aldosteronsekretion von 151,0 ± 17,9 % und für die
Knockouts eine Konzentration von 7,62 x 10-11 ± 1,82 x 10-11 mol/l bei einer relativen
Aldosteronsekretion von 163,6 ± 17,6 %. Der aufgrund der signifikant unterschiedlichen
Varianzen durchgeführte nach Welch korrigierte t-Test ergab keinen signifikanten
Unterschied der ED50 Werte. Die ED50 Werte der absoluten Aldosteronsekretion stimmten
mit denen der relativen Aldosteronsekretion überein (WT: 1,09 x 10-10 ± 1,98 x 10-11
mmol/l vs. KO: 7,91 x 10-11 ± 1,78 x 10-11 mmol/l).
91
Diskussion
5 Diskussion
Das in dieser Arbeit untersuchte Mausmodell ist das einzige bis heute beschriebene
Tiermodell, in dem durch eine genetische Mutation ein Hypertonus nicht-renaler Genese
ausgelöst werden soll. Nach dem aktuellen Wissensstand wird davon ausgegangen, dass die
BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus übernehmen,
indem sie einen negativen Feedback Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion
vermitteln. Durch die genetische Inaktivierung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle soll durch
eine reduzierte Aktivität der BK-Kanäle eine Erhöhung des Tonus der glatten
Gefäßmuskelzellen in arteriellen Widerstandsgefäßen erfolgen, wodurch eine Steigerung des
arteriellen Bluthochdrucks induziert wird (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000).
Durch Nachweis der BK-Kanäle in der Zona glomerulosa der Nebennieren ist jedoch eine
alternative Erklärung für die Hypertonie vorstellbar. So besteht die Möglichkeit, dass durch
die Inaktivierung der β1-Untereinheit eine veränderte Calciumsensitivität der Zona
glomerulosa-Zellen hervorgerufen wird, aufgrund derer eine Steigerung der
Aldosteronsekretion induziert wird. Aus dieser Hypothese könnte geschlossen werden, dass
erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut ursächlich für die Hypertonie der BKβ1-/- Mäuse
verantwortlich sind.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob bei den BKβ1-/- Mäusen die
Hypothese bestätigt werden kann, dass der beobachtete Bluthochdruck durch einen
Hyperaldosteronismus verursacht wird. Bei Bestätigung dieser Hypothese sollte im
Anschluss daran die mögliche Genese des Hyperaldosteronismus durch in vitro
Inkubationsexperimente untersucht werden.
Untersuchungen zum Aldosteronsystem
Die Untersuchungsergebnisse der 1. und 2. Versuchsserie belegen, dass die BKβ1-/- Mäuse
aufgrund der genetischen Inaktivierung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle einen
Hyperaldosteronismus entwickeln. Es konnte gezeigt werden, dass die Knockout Mäuse
pathophysiologische Veränderungen entwickeln, die bei einem klinischen
92
Diskussion
Hyperaldosteronismus regelmäßig nachzuweisen sind. Hierzu zählen neben einer erhöhten
Plasmaaldosteronkonzentration ein Bluthochdruck und Veränderungen der Elektrolyt-
konzentrationen im Plasma (MELBY 1989).
Die Bestimmung der Plasmaaldosteronkonzentrationen der BKβ1-/- Mäuse und BKβ1+/+
Mäuse lieferte im Laufe der durchgeführten Untersuchungen erste deutliche Hinweise auf
einen Hyperaldosteronismus der Knockout Tiere. Die Blutabnahme für die Analyse erfolgte
unter stressfreien Bedingungen über den arteriellen Katheter, da seit langem bekannt ist, dass
eine Aktivierung des Sympathikus innerhalb kürzester Zeit über direkte und indirekte
Signalwege zu einer Stimulierung der Aldosteronsekretion führt (DUNN 1970, TAUGNER
et al. 1984). Dies wird durch Publikationen bestätigt, in denen je nach Methode der
Blutgewinnung sehr unterschiedliche Werte für die Aldosteronkonzentration im Plasma
mitgeteilt werden (CHOLEWA u. MATTSON 2001, HEIKKILÄ et al. 2002, MASUZAKI et
al. 2003, NEIL et al. 2003). Dementsprechend gibt es noch keinen einheitlichen Referenzwert
für die Plasmaaldosteronkonzentration bei Mäusen. Um das Risiko zu minimieren, durch die
Blutabnahme eine Erhöhung der Aldosteronkonzentration zu verursachen, wurde auf absolute
Ruhe im Labor geachtet und die Abnahmebedingungen so optimiert, dass die Blutentnahme
von den Tieren unbemerkt durchgeführt werden konnte. Die in dieser Arbeit erhobenen
Aldosterondaten liegen infolgedessen in der Regel auch deutlich unter den in der Literatur
publizierten Konzentrationen, was als Indikator für die Qualität der Abnahmebedingungen
angesehen werden kann. Die Blutabnahme erfolgte in einem relativ engen Zeitfenster
zwischen 17.00 und 19.00 Uhr, um den zirkadianen Rhythmus der Aldosteronfreisetzung zu
berücksichtigen. So findet bei dem durchgeführten Lichtregime während dieser Zeit ein
Sekretionsmaximum der Nebennierenrindenhormone statt (DROSTE et al. 2003), wodurch
mögliche Unterschiede bei der Aldosteronsekretion am präzisesten erfasst werden können.
Aufgrund des geringen zur Verfügung stehenden Probenvolumens von weniger als 150 µl
wurde die Aldosteronkonzentration in den einzelnen Proben mit dem Radioimmunoassay der
Firma Immunotech analysiert. Der Aldosteron-RIA von Immunotech wird von vielen
Arbeitsgruppen zur Bestimmung der Aldosteronkonzentration bei verschiedenen Spezies
verwendet (unter anderen HILBERS et al. 1999, ARRIGHI et al. 2001) und zeichnet sich
durch eine hohe Empfindlichkeit (6 pg/ml) aus. Die hochgradig signifikante Erhöhung der
Plasmaaldosteronkonzentration bei BKβ1-/- Mäuse auf 450 % des Wildtypwerts zeigt
93
Diskussion
deutlich, dass die Kontrolle der Aldosteronsekretion bei den Knockout Mäusen pathologisch
verändert ist. Die Diskussion möglicher Ursachen der gesteigerten Aldosteronsekretion der
BKβ1-/- Mäuse erfolgt im zweiten Teil dieses Kapitels.
Wie bereits im Literaturteil ausführlich beschrieben (Seiten 20–23) ist Aldosteron essentiell
an der Homöostase des Wasser- und Elektrolythaushalts beteiligt. Als Folge erhöhter
Aldosteronkonzentrationen kommt es durch eine gesteigerte Aktivität von Ionenkanälen v.a.
in epithelialen Geweben zu einer Störung dieser Homöostase. Auf zellulärer Ebene wird die
pathologische Wirkung von erhöhten Aldosteronkonzentrationen auf die Elektrolyt- und
Volumenhomöostase in erster Linie durch eine Funktionssteigerung des Epithelialen
Natriumkanals sowie der basolateralen Na+/K+-ATPase im distalen Tubulussystem der Niere
verursacht (KELLENBERGER u. SCHILD 2002, ROSSIER et al. 2002). Hierdurch erfolgt
eine verstärkte Reabsorption von Na+ und sekundär, durch Zunahme des transepithelialen
Potentials, eine Steigerung der transepithelialen Diffusion von Cl- (ROTIN et al. 2001,
VERREY et al. 2003). Aufgrund dieser primären Steigerung der Reabsorption von NaCl
werden über sekundäre Prozesse vermehrt Kaliumionen über einen ROMK-Kanal (renal
outer medullary K+ channel), ein Mitglied der einwärts-gleichrichtenden Kaliumkanäle, in
das Tubuluslumen sezerniert und mit dem Urin ausgeschieden (FRINDT et al. 2002).
Zusätzlich wurden Hinweise gefunden, dass die Expression des ROMK in der Niere direkt
durch Aldosteron erhöht wird (PALMER 1998). So erfolgt im Rahmen eines
Hyperaldosteronismus eine Verschiebung der Elektrolytkonzentrationen im Plasma, die sich
in der Regel mit Hilfe labordiagnostischer Untersuchungen durch den Nachweis einer
Hypernatriämie und einer Hypokaliämie bestätigen lässt.
Eine solche Hypernatriämie und Hypokaliämie konnte in dieser Arbeit ebenfalls bei den
BKβ1-/- Mäusen nachgewiesen werden. Die erhobenen Elektrolytkonzentrationen der
Wildtyp Tiere stimmen mit den beschriebenen Werten in der Literatur überein (MITRUKA u.
RAWNSLEY 1981). Der relativer Fehler der Elektrolytmittelwerte von maximal 3% ist ein
weiteres Indiz für die Validität der durchgeführten Untersuchungen. Die in diesen
Experimenten festgestellte Veränderung der Ionenkonzentrationen im Plasma ist ein
typischer Befund, der bei Hyperaldosteronismus erhoben wird (DeGROOT 1989), und festigt
die Hypothese eines funktionell bedeutsamen Hyperaldosteronismus der Knockout Mäuse.
94
Diskussion
Sekundär zur vermehrten NaCl Reabsorption kommt es zu einer gesteigerten
Wasserretention, welche zu einem erhöhten Blutvolumen und damit verbundener Hypertonie
führt. Der Nachweis eines Bluthochdrucks der BKβ1-/- Mäuse erfolgte über Blutdruck- und
Herzfrequenzmessungen an wachen Mäusen über einen chronisch implantierten Katheter in
der Arteria femoralis. Die Blutdruckmessung am wachen Tier über einen chronischen
Katheter ist nach dem heutigen Wissensstand neben der radiotelemetrischen Messung die
präziseste Messmethode zur Bestimmung des Blutdrucks und der Herzfrequenz bei Mäusen.
Im Gegensatz zu der Tail cuff Methode, bei der die Tiere fixiert werden und einer erhöhten
Umgebungstemperatur ausgesetzt sind, erfolgt die Kathetermessung ohne Störung der Tiere,
so dass in der Regel keine stressbedingten Veränderungen der Messparameter infolge eines
erhöhten Sympathikotonus erwartet werden müssen. Die gemessenen Herzfrequenzen von ca.
600 Schlägen pro Minute stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein
(MATTSON 2001). Im Gegensatz zum Umgang mit Ratten ist es sehr schwer, Mäuse an die
erforderlichen Manipulationen bei Verwendung der Tail cuff Methode zu gewöhnen, und als
Folge davon liegen die gemessenen Blutdruckwerte häufig über dem in der Literatur
angegeben mittlerem arteriellen Blutdruck der Mäuse von ca. 105 mmHg (MATTSON 2001).
Vergleiche von Blutdruckwerten in der Literatur, die mittels Tail cuff Methode oder durch
Messungen über chronisch implantierte Katheter an wachen Tieren durchgeführt wurden,
bestätigen die Überlegenheit der gewählten Methode (MATTSON 1998, QUASCHNING et
al. 2001). Die Validität der verwendeten Methode ist unter anderem auch an den kleinen
relativen Fehlern der Blutdruckmittelwerte zwischen den Tieren von maximal 1,8%
erkennbar. Ein weiterer Vorteil der chronisch implantierten Katheter besteht darin, dass
ebenfalls Blutproben am wachen und ungestressten Tier gewonnen werden können.
Die Bestimmung der täglichen Wasseraufnahme bestätigte, dass sich die Mäuse von der
Narkose und der Operation weitestgehend erholt hatten. Am zweiten und dritten
postoperativen Tag nahmen die Tiere im Durchschnitt ca. 4,5 ml Wasser zu sich, was einer
normalen physiologischen Flüssigkeitsaufnahme entspricht (MEYER et al. 1993, S. 203). Da
die Mäuse außerdem im Wesentlichen den Habitus eines gesunden bzw. geringgradig
kranken Tieres zeigten, konnte davon ausgegangen werden, dass die erhobenen
Blutdruckdaten durch die durchgeführte Implantation nur unwesentlich beeinträchtigt
wurden. Voraussetzung für eine schnelle Regeneration der Tiere nach der Operation war
allerdings eine zügige und routinierte Implantation der Katheter.
95
Diskussion
Die BKβ1-/- Mäuse zeigten in den Versuchserien 1 und 2 einen hochsignifikanten
Blutdruckanstieg im Verhältnis zu den BKβ1+/+ Mäusen, wobei die Herzfrequenzen keine
Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen aufwiesen. Die Blutdruckdaten der 2.
Versuchsserie lagen im Mittel 4 mmHg unter denen der 1. Versuchserie. Dies ist vermutlich
durch einen verbesserten Operationsablauf und eine routiniertere Messprozedur zu erklären.
Die erhobenen Blutdruckdaten liegen im Niveau deutlich unter den veröffentlichten Werten
von BRENNER et al. (2000 b), deren Arbeitsgruppe die Blutdruckdaten ebenfalls mittels
chronisch implantierter Katheter erhoben hat. Den unterschiedlichen Messergebnissen
können zwei verschiedene Ursachen zu Grunde liegen. Zum einen wurde die
Blutdruckmessung von BRENNER et al. am 1. postoperativen Tag durchgeführt.
Erfahrungsgemäß haben sich die Tiere zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig von der
Operation erholt. So konnte in eigenen Voruntersuchungen festgestellt werden, dass sich die
Blutdruckmittelwerte bei beiden Genotypen am 1. postoperativen Tag noch nicht normalisiert
hatten. Des Weiteren wurden die Blutdruckmessungen von BRENNER et al. an SV 129
Mäusen durchgeführt. Aus der Literatur ist bekannt, dass Mäuse mit verschiedenem
genetischem Hintergrund Unterschiede des mittleren arteriellen Blutdrucks aufweisen und
SV129 Mäuse generell einen höheren Blutdruck als die C57/BL6 Mäuse besitzen
(MATTSON 2001), was die unterschiedlichen Messergebnisse ebenfalls erklären kann. Der
gemessene Blutdruckunterschied zwischen den Genotypen stimmt jedoch mit früheren
publizierten Daten überein (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000) und bestätigt
somit einen Bluthochdruck bei den BKβ1-/- Mäusen.
Wie im Literaturteil beschrieben (Seiten 38-39), wurde in den letzten Jahren die Hypothese
entwickelt, dass die arterielle Hypertonie bei den BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz
eines erhöhten Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b,
STANDEN 2000, PATTERSON et al. 2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Als erste
beschrieben BRAYDEN u. NELSON (1992), dass die Aktivierung der BK-Kanäle durch den
lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration eine entscheidende Rolle bei der
Regulation des Gefäßmuskeltonus spielt, indem sie einen negativen Feedback Mechanismus
zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermittelt. Die regulatorische β1-Untereinheit erhöht
die Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle maßgeblich und trägt somit fundamental zu einer
Funktionssteigerung der BK-Kanäle und damit auch des negativen Feedback zur Limitierung
96
Diskussion
der Vasokonstriktion bei. Durch Untersuchungen an isolierten Gefäßen von BKβ1-/- Mäusen
konnte gezeigt werden, dass der erhöhte arterielle Tonus mit einer verminderten Ca2+-
Sensitivität der BK-Kanäle und einer gestörten Kopplung von Calcium-Sparks und STOC`s
vergesellschaftet ist. Diese molekularen und zellulären Störungen gehen mit einem erhöhten
systemischen Blutdruck und einer Herzhypertrophie einher. Durch den Nachweis der
erhöhten Plasmaaldosteronkonzentrationen bei den BKβ1-/- Mäusen muss die Vorstellung
eines rein myogen-bedingten Hypertonus jedoch überdacht und die Bedeutung des
Hyperaldosteronismus für die Entstehung des Bluthochdrucks der Knockout Mäuse weiter
untersucht werden.
In Anlehnung an die Untersuchungen von BRENNER et al. (2000 b) wurden an isolierten
Herzen beider Genotypen morphometrische Untersuchungen durchgeführt. Im Rahmen dieser
Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Herzgewichte sowie die Gewichte des
rechten und linken Ventrikels der Knockout Mäuse erhöht waren. Auch das Verhältnis des
Herzgewichts und des Gewichts des linken Ventrikels zum Körpergewicht zeigte eine
signifikante Steigerung bei den BKβ1-/- Mäusen. Dieser Index stellt ein in der Literatur weit
verbreitetes Maß für eine myokardiale Hypertrophie dar. Diese Ergebnisse stimmen mit den
Befunden der morphometrischen und elektronenmikroskopischen Untersuchungen von
BRENNER et al. (2000 b) überein, die ansonsten in den elektronenmikroskopischen
Untersuchungen keine weiteren histologischen Veränderungen wie Nekrosen oder Fibrosen
in der Struktur des Herzgewebes feststellen konnten. Aus diesen Ergebnissen folgerten die
Autoren in Anlehnung an ähnliche Befunde bei Menschen (WILSON 1999), dass die
Herzhypertrophie eine sekundäre Folge des Hypertonus der Knockout Mäuse ist. In
Voruntersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe (AMANN 2001) konnte mit zunehmendem
Alter der Tiere neben einer starken Hypertrophie des linken Ventrikels eine hochgradige
Hypertrophie der Aortenwand festgestellt werden. Da es fraglich ist, ob die relativ geringe
Blutdruckerhöhung von ca. 10 mmHg eine so hochgradig pathologische Hypertrophie
induzieren kann, spielen unter Umständen weitere Faktoren bei der Genese der beschriebenen
Hypertrophien eine Rolle. Durch Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen konnte
nachgewiesen werden, dass sowohl lokal als auch systemisch erhöhte
Aldosteronkonzentrationen eine Hypertrophie der Gefäßwände sowie des Herzens induzieren
können (DELCAYRE et al. 2000, FIEBELER et al. 2001, QUIN et al. 2003, WEBER et al.
97
Diskussion
2003). Somit könnte die festgestellte Herzhypertrophie ebenso eine Folge des
Hyperaldosteronismus der BKβ1-/- Mäuse sein.
Zusammenfassend konnte durch die beschriebenen Befunde der hämodynamischen,
morphometrischen und biochemischen Untersuchungen der 1. und 2. Versuchsserie
nachgewiesen werden, dass die Aldosteronkonzentrationen im Blut der BKβ1-/- Mäuse
signifikant erhöht sind und die Tiere klassische Folgen eines Hyperaldosteronismus wie
Elektrolytveränderungen und Bluthochdruck aufweisen.
Durch die pharmakologische Blockade der Mineralocorticoidrezeptoren in einer 3.
Versuchsgruppe wurde die Bedeutung der erhöhten Aldosteronkonzentrationen für die
Blutdruckerhöhung und die Herzhypertrophie der Knockout Mäuse nachgewiesen und
Evidenzen gegen die beschriebene rein myogen-bedingte Ätiologie (BRENNER et al. 2000 b,
PLÜGER et al. 2000) der Hypertonie erhoben.
Nach heutigem Wissensstand blockiert der Mineralocorticoidrezeptor-Antagonist
Spironolacton wirkungsvoll die physiologische als auch pathologische Wirkung von
Aldosteron und ANG II (STIER et al. 2003). Durch zahlreiche Untersuchungen an
Tiermodellen mit experimentellem Bluthochdruck konnte die protektive Wirkung von
Spironolacton auf die Entwicklung kardiovaskulärer Erkrankungen bei Hypertonien, die auf
einer Störung des RAA-Systems beruhen, demonstriert werden (QUASCHNING et al. 2001,
VIRIDIS et al. 2002, LAL et al. 2003, MILL et al. 2003). Diese Effekte von Spironolacton
konnten ebenfalls in klinischen Studien an menschlichen Patienten gezeigt werden
(CALHOUN et al. 2002, SATO et al. 2002). Die verwendeten Dosen von Spironolacton
variierten sehr stark zwischen den genannten Arbeitsgruppen. Da in der vorliegenden Arbeit
kein dosisabhängiger Effekt von Spironolacton untersucht, sondern die Wirkung von
Aldosteron in Gegenwart eines Überschusses des Antagonisten mit Sicherheit blockiert
werden sollte, wurde mit 200 mg/kg KGW eine relativ hohe Spironolacton-Dosis gewählt.
Die Behandlung erfolgte über Time Release Pellets der Firma Innovative Research of
America, die subkutan implantiert über 21 Tage täglich 6 mg Spironolacton freisetzten
(Angabe des Herstellers). Diese Form der Wirkstoffapplikation ist für die Mäuse
außergewöhnlich schonend, da nach der Implantation keine weiteren Manipulationen an den
Tieren erfolgen müssen. Dies war besonders wichtig, weil das Handling der Tiere nach
98
Diskussion
Implantation der chronischen Katheter äußerst schwierig wird und eine Fixierung für eine
tägliche parenterale Applikation nicht mehr möglich ist. Von einer enteralen Spironolacton-
Applikation wurde abgesehen, um sicherzustellen, dass alle Tiere mit der identischen Dosis
Spironolacton behandelt wurden.
Unter der Spironolactonbehandlung konnte der Blutdruck der BKβ1-/- Mäuse bis auf das
Blutdruckniveau der BKβ1+/+ Mäuse reduziert und die Hypertonie der Knockout Mäuse
vollständig behandelt werden. Darüber hinaus konnte bei den Knockout Mäusen eine
Reduktion der Herzhypertrophie festgestellt werden. Diese Normalisierung der Herzgewichte
kann einerseits auf der direkten Blockade des Aldosteron und ANG II an den Herzzellen
beruhen, andererseits könnte dies jedoch auch die Folge des reduzierten arteriellen Drucks
sein. Es ist jedoch nicht zu erwarten, dass bei einem rein myogen-bedingten Hypertonus
durch eine Behandlung mit dem Mineralocorticoidrezeptor-Antagonisten Spironolacton eine
vollständige Normalisierung des Blutdrucks erfolgen kann. Die Untersuchungsergebnisse
stellen somit die Hypothese in Frage, dass ausschließlich eine verminderte Aktivität der BK-
Kanäle in den glatten Muskelzellen der arteriellen Widerstandsgefäße für die
Blutdruckerhöhung der BKβ1-/- Mäuse verantwortlich ist.
Die Ergebnisse der bis hierher diskutierten Befunde dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass
eine Störung des RAA-Systems, einhergehend mit einem klinisch manifestierten
Hyperaldosteronismus, die Ursache für die Hypertonie der BKβ1-/- Mäuse darstellt.
Untersuchungen zur Ätiologie des Hyperaldosteronismus
Die Untersuchungen des zweiten Teils dieser Arbeit wurden mit dem Ziel durchgeführt,
mögliche Ursachen des Hyperaldosteronismus der BKβ1-/- Mäuse aufzudecken. Die
Resultate früherer Studien legen nahe, dass die Steuerung der Aldosteronsekretion vor allem
über Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgt (siehe Literaturübersicht
ab Seite 19). So wird durch die Zunahme der intrazellulären Calciumkonzentration eine
Steigerung der Aldosteronsynthese induziert (ROSSIER et al. 1996). Der Anstieg der
intrazellulären Calciumkonzentration erfolgt zum einen durch eine spannungsabhängige
99
Diskussion
Aktivierung von T-Typ und L-Typ Calciumkanälen, durch die Calcium bei
Membrandepolarisation von extrazellulär in die Zelle gelangt (SPÄT et al. 1991).
LOTSHAW (2000) konnte in umfangreichen elektrophysiologischen Untersuchungen
nachweisen, dass sowohl eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration als auch
von ANG II eine Depolarisation der Membran hervorrufen und somit eine Stimulation der
Aldosteronfreisetzung auslösen können. Über ANG II wird zusätzlich die Freisetzung von
Calcium aus intrazellulären Calciumspeichern gefördert, was einen weiteren Signalweg für
den Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration darstellt (BARRETT et al. 1989). Sollte
es zu einer funktionellen Veränderung von zellulären Mechanismen kommen, die maßgeblich
an der Regulation des Membranpotentials beteiligt sind und in deren Folge es zu einer
ausgeprägteren Membrandepolarisation kommt, könnte dies eine erhöhte
Aldosteronfreisetzung induzieren und infolgedessen einen primären, Renin unabhängigen
Hyperaldosteronismus verursachen. Erst kürzlich konnte an kultivierten Zona glomerulosa-
Zellen gezeigt werden, dass TASK-3 Kanäle für den Großteil der Hintergrundleitfähigkeit
verantwortlich sind. Darüber hinaus gelang der Nachweis von KCNQ1/KCNE1 Kanälen in
Zellen der Zona glomerulosa (ARRIGHI et al. 2001). Die gezielte Ausschaltung der KCNE1
β-Untereinheit führte zu einem primären Hyperaldosteronismus, was eine Beteiligung von
KCNQ1/KCNE1 Kanälen an der Regulation der Aldosteronsynthese und/oder –freisetzung
nahe legt (ARRIGHI et al. 2001). Der Nachweis von BK-Kanälen in Zellen der Zona
glomerulosa (EHMKE 2003) lassen die Überlegung zu, dass diese ebenfalls an der
Regulation der Aldosteronsekretion beteiligt sein können. So übernehmen die BK-Kanäle,
wie in der Literaturübersicht auf den Seiten 29-39 dargelegt, eine wichtige Funktion bei der
Beendigung der zellulären Mechanismen, die durch einen Anstieg der intrazellulären
Calciumkonzentration ausgelöst werden, indem sie der initialen Membrandepolarisation
entgegen wirken und schließlich eine Membranhyperpolarisation durch einen
Kaliumausstrom aus den Zellen induzieren. Wie bereits beschrieben, wird durch die β1-
Untereinheit die Calciumsensitivität der BK-Kanäle entscheidend gesteigert und somit auch
die Wirkung des negative Feedback der BK-Kanäle verstärkt (VOGALIS et al. 1996, ORIO
et al. 2002, QIAN u. MAGLEBY 2003). Durch die genetische Inaktivierung der β1-
Untereinheit könnte eine verringerte Calciumsensitivität der BK-Kanäle bei den BKβ1-/-
Tieren auch in den Zellen der Zona glomerulosa zu einer verstärkten Depolarisation der
100
Diskussion
Zellen führen, woraus eine erhöhte Aldosteronsekretion der BKβ1-/- Mäuse resultieren
könnte. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, ließe dies auf einen primären
Hyperaldosteronismus der BKβ1-/- Mäuse schließen.
Durch in vitro Untersuchungen der Aldosteronfreisetzung aus isolierten Nebennierenstücken
unter Kalium- und ANG II-Stimulierung sollte die Gültigkeit dieser Hypothese untersucht
werden. Ergänzend wurde zusätzlich die Aldosteronfreisetzung unter ACTH-Wirkung
untersucht, da ACTH kurzfristig ebenfalls eine hochgradig verstärkte Aldosteronfreisetzung
induziert (LUMBERS 1999, SEWER u. WATERMAN 2003). ACTH verursacht in
endokrinen Zellen über eine PKA vermittelte Phosphorylierung der β1-Untereinheit
außerdem eine Inhibierung der BK-Kanäle (TIAN et al. 1998 u. 2001). Bei genetischer
Inaktivierung der β1-Untereinheit sollte diese Inhibierung nicht zu beobachten sein, und
somit könnte die Aldosteronsekretion unter ACTH-Stimulierung bei den Knockout Tieren im
Verhältnis zu den Wildtyp Tieren verringert sein. Da Calcium als Second messenger bei der
Aktivierung der Aldosteronfreisetzung durch ACTH allerdings nicht beteiligt ist, ist es
fraglich, ob die Interaktion von ACTH mit den BK-Kanälen über die Proteinkinase A
überhaupt einen Einfluss auf die Höhe der Aldosteronsekretion ausübt.
Der Versuchsaufbau und -ablauf wurde auf der Grundlage der Ergebnisse von NERI et al.
(2002) gewählt, die Untersuchungen an Nebennierenschnitten von Ratten durchgeführt
haben. Von einer Isolierung der Zona glomerulosa-Zellen, wie unter anderem von HILBERS
et al. (1999) beschrieben, wurde aus mehreren Gründen abgesehen. Im Rahmen der
Isolierung der Nebennierenzellen kommt es durch Adhäsion der Zellen an Instrumenten und
Gefäßen in der Regel zu einem wesentlichen Verlust von Zellen, der durch die zusätzliche
mechanische Schädigung weiterer Zellen zu einer deutlich verringerten Zellausbeute führen
kann. Aufgrund der Größe der Nebennieren der Mäuse sollte dieses Risiko ausgeschlossen
werden, um die Zahl der benötigten Versuchstiere auf ein Minimum zu beschränken. Die
Zerteilung der Nebennieren in vier Stücke stellte einen Kompromiss zwischen der Schonung
der Zellen bzw. des Zellverbands und ausreichend kleinen Diffusionstrecken dar.
Aufgrund des zur Verfügung stehenden Probenvolumens von ca. 1,5 ml erfolgte die
Bestimmung der Aldosteronkonzentration in den einzelnen Proben mittels
Radioimmunoassays der Firma DPC (Diagnostic Products Corporation). Der Aldosteron-RIA
101
Diskussion
von DPC wird routinemäßig von vielen Arbeitsgruppen zur Aldosteronbestimmung
eingesetzt (unter anderen BROWN et al. 2000, NERI et al. 2002, OESTREICHER et al. 2003) und
zeichnet sich durch eine hohe Spezifität und geringe Kreuzreaktionen mit Corticosteron aus.
Durch die Erstellung von Eichkurven mit modifiziertem Medium 199 wurde außerdem
festgestellt, dass die Antigen-Antikörperwechselwirkungen durch das Inkubationsmedium
nicht nachweisbar gestört wurden.
Die ermittelten Aldosteronkonzentrationen in den Proben der Inkubationsansätze wurden in
den Abbildungen als relative Aldosteronsekretionsraten dargestellt. Als Bezugsgröße und
damit Referenzwert (= 100%) diente die auf eine Stunde berechnete Aldosteronproduktion im
ersten halbstündigen Inkubationsintervall im Anschluss an die einstündige
Akklimatisationsphase. Dieser basale Wert der individuellen Aldosteronsekretion wurde zur
Normierung der Stimulation der Aldosteronsekretion in den nachfolgenden
Inkubationsintervallen herangezogen. Diese Form der Normierung führte nicht zu
systematischen Fehlern, weil die absoluten Aldosteronkonzentrationen (in pg/ml/h) des
Bezugsintervalls zwischen den beiden Genotypen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen
(siehe Tabellen III, V und VII im Anhang). NERI et al. (2000) normierten die
Aldosteronsekretion in ihren Versuchen, nach der Bestimmung der Proteinmenge der
inkubierten Nebennieren, auf mg Protein. Da die Ausprägung der einzelnen
Nebennierenzonen je nach Stoffwechsellage jedoch stark variieren kann und somit auch ein
Unterschied in der Nebennierenmorphologie zwischen den Knockout und den Wildtyp Tieren
denkbar wäre, könnte eine proteinbezogene Normierung der Aldosteronsekretion zu einer
Fehleinschätzung der Versuchsergebnisse führen.
Der Verlauf der relativen Aldosteronsekretion unter den eingesetzten Stimuli zeigte für alle
drei Versuchsgruppen eine tendenziell höhere Aldosteronsekretion bei den BKβ1-/- Mäusen.
Die Beurteilung der Signifikanz mittels einer zweiseitigen Multivarianzanalyse ergab, dass
bei allen drei Versuchsreihen sowohl der Genotyp der Tiere als auch die Behandlung mit den
jeweiligen Substanzen (Kalium, ANG II oder ACTH) einen signifikanten Einfluss auf die
relative Aldosteronsekretion hatten. Im anschließend durchgeführten t-Test nach Student, bei
dem die relativen Sekretionsunterschiede zwischen den Genotypen bei jeder eingesetzten
Konzentration miteinander verglichen wurden, bestätigte sich die Signifikanz nur bei der
Stimulierung durch ANG II. Bei Kalium konnten mathematisch keine signifikanten
Unterschiede errechnet werden. Mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 7 % und 6 % bei
102
Diskussion
Kaliumkonzentrationen von 7,5 und 11 mmol/l liegen die relativen Sekretionsraten der
Knockout Nebennieren jedoch tendenziell deutlich über denen der Wildtyp Nebennieren. Die
Ermittelung der Dosis, bei der eine halbmaximale Stimulation der Aldosteronsekretion
(ED50) auftrat, ermöglichte eine Beurteilung der Sensitivität der Nebennieren auf die
einzelnen Stimuli. Die ED50 Werte für die Versuchsreihen ANG II und ACTH waren
zwischen den Genotypen zwar numerisch deutlich unterschiedlich, wiesen aber statistisch
keine signifikanten Unterschiede innerhalb einer 5%igen Irrtumswahrscheinlichkeit auf.
Obwohl tendenziell eine generell höhere Sensitivität bei den Knockout Tieren vorhanden ist,
lässt sie sich bei einem Signifikanzniveau von 5% statistisch nicht belegen. Zur Kontrolle der
durchgeführten Normierung der Aldosteronsekretion wurden zusätzlich die ED50 Werte der
absoluten Aldosteronsekretion bestimmt, die mit denen der relativen Aldosteronsekretion
übereinstimmten. Dieses Ergebnis bestätigt, dass durch die Normierung keine systematischen
Fehler bei der Datenanalyse verursacht wurden.
Die Befunde stimmen mit der aufgestellten Hypothese insoweit überein, als ANG II und
Kalium anscheinend konzentrationsabhängig die Freisetzung von Aldosteron im Verhältnis
zu der individuellen basalen Aldosteronsekretion bei den BKβ1-/- Mäusen stärker
stimulieren. Diese Befunde ließen sich durch die oben ausgeführten Überlegungen sehr gut
erklären und würden zeigen, dass die genetische Inaktivierung der β1-Untereinheit der BK-
Kanäle über adrenale Effekte einen primären Hyperaldosteronismus induzieren kann. Die
tendenziell erhöhte Aldosteronsekretion unter ACTH-Stimulierung lässt sich jedoch nicht mit
der Inaktivierung der β1-Untereinheit bei den Knockout Mäusen erklären.
Vielmehr könnten der erhöhten relativen Aldosteronfreisetzung der BKβ1-/- Mäuse
alternative Mechanismen zu Grunde liegen. So ist seit längerem bekannt, dass zahlreiche
parakrine Substanzen, die in der Nebenniere produziert werden, eine Modulation der
Steroidhormonsekretion bewirken (EHRHART-BORNSTEIN et al. 1998). So wird die
Aldosteronproduktion, wie PETERS und GANTEN (1998) sowie HILBERS et al. (1999)
zeigten, unter anderem durch das lokale Renin-Angiotensin-System der Nebenniere
stimuliert. Eine vermehrte lokale Reninfreisetzung der Knockout Mäuse könnte somit
Ursache für die erhobenen Befunde sein und einen sekundären Hyperaldosteronismus
induzieren. Des Weiteren wäre es möglich, dass durch die gesteigerte Aldosteronproduktion
in vivo, die beteiligten zellulären Systeme hochreguliert sind. Dies könnte zur Folge haben,
103
Diskussion
dass die Knockout Mäuse eine größere Kapazität besitzen, auf physiologische Stimuli mit
einer stärkeren Aldosteronsekretion zu reagieren.
Unter Berücksichtigung dieser sehr komplexen adrenalen Zusammenhänge bei der
Aldosteronfreisetzung aus den Nebennieren konnte durch die erhobenen Befunde der in vitro
Untersuchungen kein zellulärer Mechanismus identifiziert werden, der die erhöhte relative
Aldosteronsekretion bei den BKβ1-/- Mäusen erklären würde. Für die Aufklärung der
zellulären Mechanismen ist es erforderlich, weiterführende elektrophysiologische,
molekularbiologische und histologische Untersuchungen durchzuführen.
Neben den Inkubationsversuchen diente die Bestimmung des zirkulierenden Renins im Blut
dazu, eine Differenzierung zwischen einer primären und einer sekundären Ätiologie des
Hyperaldosteronismus vornehmen zu können (DeGROOT 1989). So wird in klinischen
Untersuchungen an Patienten die Bestimmung des Reningehalts als Screening-Test für eine
Unterscheidung der beiden Hyperaldosteronismus-Formen durchgeführt (REINCKE et al.
2003). Bei einem primären Hyperaldosteronismus induziert das zirkulierende Aldosteron
über einen negativen Feedback Mechanismus eine verminderte Reninsekretion, aufgrund
derer der Reningehalt im Blut erniedrigt ist. Bei einem sekundären Hyperaldosteronismus
hingegen ist eine gesteigerte Reninfreisetzung die Ursache für eine verstärkte
Aldosteronsekretion, so dass in diesem Fall der Reningehalt im Plasma erhöht ist
(DeGROOT 1989, MELBY 1989). Neben der Hypothese eines primären
Hyperaldosteronismus aufgrund der verminderten Aktivität der BK-Kanäle in den Zellen der
Zona glomerulosa wäre es vorstellbar, dass durch die genetische Inaktivierung der β1-
Untereinheit die Reninsekretion bei den Knockout Mäusen erhöht ist. So ist es denkbar, dass
infolge des erhöhten myogenen Tonus aller arteriellen Widerstandsgefäße ebenfalls die Vas
afferens der kortikalen Glomeruli der Niere bei den BKβ1-/- Mäusen stärker kontrahiert sind.
Dadurch könnte ein so starker Blutdruckabfall in den folgenden Gefäßabschnitten induziert
werden, dass dieser zu einer druckabhängigen Sekretion von Renin führt. Diese gesteigerte
Reninsekretion könnte somit sekundär die Aldosteronfreisetzung stimulieren und einen
sekundären Hyperaldosteronismus hervorrufen.
In den letzten Jahren wurde unter anderem durch Prof. Dr. Peters die Methode der
Reninbestimmung bei Ratten und Mäusen etabliert (PETERS et al. 1996, BREDE et al.
104
Diskussion
2001). Zur Beurteilung des Aktivitätszustands des Renin-Angiotensin-Systems wurden
sowohl die Plasmareninkonzentration als auch die Konzentration von Prorenin bestimmt.
Beide Parameter werden über eine Messung von gebildeten Angiotensin I in Abhängigkeit
von der Zeit bestimmt, indem dem Inkubationsmedium im Überschuss Angiotensinogen der
Ratte als Substrat für Renin zugesetzt wird. Durch diese Messbedingungen wird die Bildung
von ANG I nicht durch einen Substratmangel limitiert, und das Messergebnis spiegelt die
tatsächliche Reninkonzentration in vivo wieder. Prorenin als inaktive Vorstufe des Renins
sollte Hinweise auf die Kapazität des Reninsystems liefern. Die Plasmareninkonzentration ist
bei einer Gewichtung beider Parameter von größerer Bedeutung, da in vivo die
Plasmakonzentration von ANG I und, daraus resultierend, von ANG II durch die Menge des
aktiven Renins gesteuert wird und somit entscheidend für die Aldosteronfreisetzung ist.
Wie schon bei der Beurteilung der Plasmaaldosteronkonzentration auf den Seiten 91 und 92
diskutiert, musste die Blutabnahme für die Reninbestimmung aus den gleichen Gründen
unter absolut stressfreien Bedingungen für die Tiere erfolgen. Durch eine stressbedingte
Aktivierung des Sympathikus erfolgt über sympathische Afferenzen und β1-adrenerge
Rezeptoren umgehend eine Stimulierung der Reninsekretion (TAUGNER et al. 1984), so
dass der Reningehalt im Plasma zu höheren Werten verschoben wird. Aufgrund des
außerordentlichen Einflusses der Bedingungen der Blutabnahme auf die Messergebnisse
werden in der Literatur keine übereinstimmenden Daten als Referenzwert für die
Plasmareninkonzentration publiziert (beispielsweise BOHLENDER et al. 1998, ARRIGHI et
al. 2001, CHENG et al. 2002, LUM et al. 2003). Da im Rahmen der eigenen Untersuchungen
jedoch die Bedingungen der Blutentnahme und der Analyse des zirkulierenden Renins bei
beiden Versuchsgruppen identisch waren, können die Daten zwischen den Genotypen, ohne
Beurteilung der absoluten Werte, miteinander verglichen werden. Der Vergleich zeigt eine
tendenziell leicht erhöhte Plasmareninkonzentration der BKβ1-/- Mäuse im Verhältnis zu den
BKβ1+/+ Mäusen, wobei dieser Unterschied zwischen den Versuchsgruppen das
Signifikanzniveau von P<0,05 jedoch nicht erreicht. In Übereinstimmung mit diesem Befund
lässt sich die erniedrigte Proreninkonzentration der Knockout Mäuse interpretieren. So ist
denkbar, dass durch eine gesteigerte Bereitstellung von aktivem Renin die Menge des
Vorläuferproteins reduziert wird.
105
Diskussion
In Hinblick auf das Untersuchungsziel, Evidenzen für die Ätiologie des
Hyperaldosteronismus zu erhalten, lassen diese Befunde aufgrund der fehlenden Signifikanz
keinen eindeutigen Schluss zu. Bei einer primären Ätiologie des Hyperaldosteronismus wäre,
wie vorher bereits ausgeführt, eine deutliche Suppression der Reninkonzentration zu
erwarten gewesen. Die tendenziell höhere Reninkonzentration der Knockout Mäuse spricht
insofern gegen einen primären Hyperaldosteronismus. Bei einem sekundären, Renin
abhängigen Hyperaldosteronismus ist das zirkulierende Renin im Blut deutlich erhöht.
Aufgrund der fehlenden Signifikanz zwischen den Reninkonzentrationen konnte diese
Ätiologie durch die Ergebnisse ebenfalls nicht eindeutig nachgewiesen werden. Es besteht
jedoch die Möglichkeit, dass das zirkulierende Renin bei den Knockout Tieren primär
signifikant erhöht gewesen ist und durch sekundäre Feedback Mechanismen wieder
supprimiert wurde. So ist bekannt, dass Bluthochdruck über verschiedene Mechanismen zu
einer Reduktion der Reninsekretion führt (TAUGNER et al. 1984). Insofern kann spekuliert
werden, dass durch eine erhöhte Reninsekretion ein Hyperaldosteronismus induziert wird,
der zu einem deutlich höheren Blutdruck bei den BKβ1-/- Mäusen führt. Dieser Hypertonus
reduziert jedoch sekundär wieder die Reninfreisetzung, bis ein Gleichgewichtszustand
zwischen erhöhter Reninsekretion und Bluthochdruck entstand, der sich in den Ergebnissen
dieser Arbeit widerspiegelt.
Bei zusammenfassender Betrachtung der Ergebnisse der Inkubationsversuche und der
Bestimmung des zirkulierenden Renins konnte im Rahmen dieser Arbeit die Ätiologie des
nachgewiesenen Hyperaldosteronismus nicht eindeutig geklärt werden. Vielmehr ergaben
sich Hinweise auf beide Formen des Hyperaldosteronismus. Für die vollständige Aufklärung
der Pathogenese ist es notwendig, weiterführende molekularbiologische, pharmakologische
und elektrophysiologische Untersuchungen durchzuführen.
106
Diskussion
Schlussfolgerung
In der vorliegenden Studie konnte durch die Bestimmung der Plasmaaldosteronkonzentration
nachgewiesen werden, dass hypertensive BKβ1-/- Mäuse einen Hyperaldosteronismus
aufweisen. Durch weiterführende biochemische und morphometrische Untersuchungen
erfolgte der Nachweis weiterer Veränderungen bei den BKβ1-/- Mäusen, die durch erhöhte
Aldosteronkonzentrationen ausgelöst werden können. So wurden bei den Knockout Mäusen
eine Hypokaliämie, Hypernatriämie und eine kardiale Hypertrophie nachgewiesen.
Durch die Behandlung der BKβ1-/- Mäuse mit dem Mineralocorticoidrezeptor-Antagonisten
Spironolacton konnte eine Normalisierung des Blutdrucks und der myokardialen
Hypertrophie herbeigeführt werden.
Diese Befunde sind von außerordentlicher Bedeutung, da sie die aktuelle Hypothese einer
rein myogen-bedingten Pathogenese des Hypertonus in Frage stellen und zeigen, dass ein
klinisch manifestierter Hyperaldosteronismus möglicherweise den Bluthochdruck der BKβ1
-/- Mäuse induziert.
Im Rahmen dieser Studie wurden des Weitern durch in vitro Untersuchungen der
Aldosteronfreisetzung aus isolierten Nebennieren Evidenzen für eine primäre Pathogenese
des Hyperaldosteronismus dargelegt. Da jedoch keine Supprimierung des zirkulierenden
Renins bei den BKβ1-/- Mäusen nachgewiesen wurde, konnte die Ursache des
Hyperaldosteronismus letztendlich nicht geklärt werden.
Um den zellulären Mechanismus identifizieren zu können, der bei den BKβ1-/- Mäusen eine
Störung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems verursacht, ist es erforderlich, weitere
Untersuchungen durchzuführen.
107
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Mareike Kristina Budack
Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der
β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals
Eine chronische Erhöhung des Blutdrucks gehört zu den häufigsten Erkrankungen der
westlichen Welt. Nahezu 50 % der über Fünfzigjährigen weisen eine Hypertonie auf. Durch
die Anwendung genetischer Methoden haben sich für die Analyse von Faktoren, die an der
Entstehung einer Hypertonie beteiligt sind, zahlreiche neue Perspektiven eröffnet. So ist das
in dieser Arbeit untersuchte Mausmodell das einzige bis heute beschriebene Tiermodell, in
dem durch eine genetische Mutation ein Hypertonus nicht-renaler Genese ausgelöst werden
soll. Nach dem aktuellen Wissensstand wird davon ausgegangen, dass durch die genetische
Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals eine Erhöhung des
Tonus der glatten Gefäßmuskelzellen in arteriellen Widerstandsgefäßen erfolgt, wodurch eine
Steigerung des arteriellen Bluthochdrucks induziert wird. Die starke Expression von BK-
Kanälen in der Zona glomerulosa der Nebennieren macht jedoch eine alternative Erklärung
für die Hypertonie vorstellbar. So besteht die Möglichkeit, dass aus einer veränderten
Calciumsensitivität der Zona glomerulosa-Zellen infolge der Inaktivierung der β1-
Untereinheit eine veränderte Aldosteronsekretion resultiert. Aus dieser Hypothese könnte
geschlossen werden, dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut ursächlich für die
Hypertonie der BKβ1-/- Mäuse verantwortlich sind.
Vor diesem Hintergrund war das Ziel dieser Arbeit zu klären, ob durch eine veränderte BK-
Kanalaktivität die Aldosteronsekretion beeinflusst wird und bei den BKβ1-/- Mäusen ein
Hyperaldosteronismus festzustellen ist. Bei Bestätigung dieser Hypothese sollte des Weiteren
die Pathogenese des Hyperaldosteronismus und seine Rolle bei der Entwicklung der
Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen untersucht werden.
Hierzu wurden in 3 Versuchsserien an adulten männlichen BKβ1-/- Mäusen und BKβ1+/+
Mäusen (jeweils n=13) sowie in einer 4. Versuchsserie an isolierten Nebennieren von adulten
108
Zusammenfassung
männlichen BKβ1-/- Mäusen und BKβ1+/+ Mäusen (jeweils n=10) folgende Untersuchungen
durchgeführt:
1. Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks und der Herzfrequenz an wachen und
ungestressten Mäusen über einen chronischen arteriellen Katheter am 2. und 3.
postoperativen Tag.
2. Entnahme von Blutproben über den arteriellen Katheter mit anschließender
Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Natrium, Kalium, Chlorid, Kreatinin,
Aldosteron und zirkulierendem Renin.
3. Entnahme der Herzen mit Bestimmung des Herzgewichts sowie des Gewichts des
linken und rechten Ventrikels. Anschließende Berechnung des Verhältnisses von
Herzgewicht bzw. Gewicht des linken Ventrikels zum Körpergewicht als Index einer
myokardialen Hypertrophie.
4. Behandlung der Tiere über drei Wochen mit dem Mineralocorticoidrezeptor-
Antagonisten Spironolacton mittels subkutan implantierter Time Release Pellets (200
mg/kg KGW/Tag).
5. Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks und der Herzfrequenz nach 18 Tagen
Spironolactonbehandlung an wachen und ungestressten Mäusen über den chronischen
arteriellen Katheter und Entnahme der Herzen mit Bestimmung des Verhältnisses von
Herzgewicht bzw. Gewicht des linken Ventrikels zum Körpergewicht zur Beurteilung
der Entwicklung der myokardialen Hypertrophie.
6. In vitro Untersuchung der Aldosteronsekretion an isolierten Nebennieren unter
Stimulation mit Kalium, ANG II und ACTH. Bestimmung der
Aldosteronkonzentration in den Inkubationsproben mittels Radioimmunoassays.
Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen:
1. Bei den hypertensiven BKβ1-/- Mäusen konnte ein klinisch manifestierter
Hyperaldosteronismus nachgewiesen werden. So war bei den BKβ1-/- Mäusen die
Plasmaaldosteronkonzentration signifikant erhöht und es konnte eine Hypokaliämie
sowie eine Hypernatriämie nachgewiesen werden. Die Befunde der
109
Zusammenfassung
morphometrischen Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine myokardiale
Hypertrophie der BKβ1-/- Mäuse.
2. Durch die Spironolactonbehandlung normalisierte sich der Blutdruck der BKβ1-/-
Mäuse und die myokardiale Hypertrophie bildete sich innerhalb von 2 Wochen
nahezu vollständig zurück.
3. Die isolierten Nebennieren der BKβ1-/- Mäuse setzten unter ANG II-Stimulation
signifikant mehr Aldosteron frei. Ebenso war die relative Aldosteronsekretion unter
Kalium- und ACTH-Stimulation tendenziell bei den BKβ1-/- Mäusen gesteigert.
Diese Befunde lassen Spekulationen über eine adrenale Pathogenese des
Hyperaldosteronismus zu.
4. Die Plasmareninaktivität der BKβ1-/- Mäuse war tendenziell erhöht, was als Evidenz
für einen sekundären Hyperaldosteronismus bewertet werden kann.
Zusammenfassend konnte durch die Untersuchungen gezeigt werden, dass der
Hypertonus der BKβ1-/- Mäuse durch einen Hyperaldosteronismus verursacht wird.
Durch Aufklärung der zellulären Mechanismen, die den Hyperaldosteronismus
verursachen, können wichtige Erkenntnisse über die Bedeutung des Renin-Angiotensin-
Aldosteron-Systems bei der Pathogenese des essentiellen Bluthochdrucks beim Menschen
gewonnen werden.
110
Summary
7 Summary
Mareike Kristina Budack
Regulation of blood pressure in mice with genetic inactivation of the β1 subunit of the
Ca2+ activated potassium channel
The mouse model used in this work has up to now been the only animal model in which
hypertension of non renal genesis is assumed to be induced by genetic mutation. Coming
from the current opinion it is believed that genetic inactivation of the β1 subunit of the Ca2+
activated potassium channel causes an increase in smooth muscle vascular cell tone of arterial
vessels, inducing a rise in arterial blood pressure. Since the presence of BK channels in the
Zona glomerulosa of adrenal glands has been established there might be an alternative
explanation for the development of hypertension. That is, as a result of the inactivation of the
β1 subunit the calcium sensitivity of the Zona glomerulosa cells is modified and causes a
change in the secretion of aldosterone. This mechanism would allow the conclusion that
elevated plasma aldosterone could be the reason for hypertension in BKβ1-/- mice.
Against that background the aim of this study was to clarify if hypertension in BKβ1-/- mice
is originating from hyperaldosteronism. In case the hypothesis would be confirmed the
pathogenesis of hyperaldosteronism should be investigated.
For this, 3 experimental series were done on adult male BKβ1-/- mice (with n=13 for each
series) and a 4th experimental series on isolated adrenal glands from adult male BKβ1-/- and
BKβ1+/+ mice (with n=10 for each genotype) with the following investigations:
1. Measurement of the mean arterial blood pressure and heart rate of conscious and
unstrained mice by a chronic arterial catheter on day 2 and 3 after surgery.
2. Extraction of blood samples through the arterial catheter to measure the
concentrations of sodium, potassium, chloride, creatinine, aldosterone, and circulating
renin.
111
Summary
3. Removal of the heart to determine heart weight and mass of the left and right ventricle
for calculation of heart to body weight ratio and weight of the left ventricle to body
weight ratio as indices for myocardial hypertrophy.
4. Treatment of animals for three weeks with subcutaneously implanted Time Release
Pellets (200 mg/kg BW/day) of spironolactone, an antagonist to mineralocorticoid
receptors.
5. Measurement of the mean arterial blood pressure and heart rate of conscious and
unstrained mice after 18 days of treatment with spironolactone through a chronic
arterial catheter, and removal of the heart to determine the ratios of heart weight and
mass of left ventricle to body weight to assess the development of myocardial
hypertrophy.
6. In vitro investigation of aldosterone secretion in isolated adrenal glands under
stimulation by potassium, ANG II, and ACTH, respectively. Measurement of
aldosterone concentration by radioimmunoassay.
The results of this work can be summarized as follows:
1. In hypertensive BKβ1-/- mice a clinically manifest hyperaldosteronism has been
established, i.e. concentration of plasmaaldosterone was significantly elevated and
hypokalemia as well as hypernatremia could be demonstrated. Besides that, the results
of the morphometric examinations pointed towards myocardial hypertrophy in
BKβ1-/- mice.
2. The blood pressure of BKβ1-/- mice developed towards and became normal under
treatment with spironolactone and myocardial hypertrophy completely regressed,
which contradicts a sole myogenetic etiology of hypertension.
3. Isolated adrenal glands of BKβ1-/- mice stimulated by ANG II released more
aldosterone than wild types. Furthermore, the relative secretion of aldosterone showed
a tendency to higher levels in BKβ1-/- mice stimulated by potassium and ACTH as
well. These results allow speculation about an adrenal pathogenesis of
hyperaldosteronism.
112
Summary
4. Plasma renin activity in BKβ1-/- mice was tendentiously elevated which can be
interpreted as evidence for a secondary hyperaldosteronism.
To summarize, the investigations have shown that hypertension of BKβ1-/- mice is linked to
hyperaldosteronism. By solution of cellular mechanisms that lead to hyperaldosteronism
important insights could be gained regarding the relevance of the renin-angiotensin-
aldosterone system in the pathogenesis of essential hypertension in man.
113
Literaturverzeichnis
8 Literaturverzeichnis
ABDALLAH, J.G., R.W. SCHRIER, C. EDELSTEIN, S.D. JENNINGS, B. WYSE u. D.H. ELLISON (2001): Loop diuretic infusion increases thiazide-sensitive Na+/Cl--Cotransporter abundance: role of aldosterone. J. Am. Soc. Nephrol. 12, 1335-1341
ABOULAFIA, J., B.A. SILVA u. V.L.A. NOUAILHETAS (2002): Protein kinase C modulators enhance angiotensin II desensitization of guinea pig ileum via maxi-K+ channels. Eur. J. Pharmacol. 442, 29-36 ALIOUA, A., Y. TANAKA, M. WALLNER, F. HOFMANN, P. RUTH, P. MEERA u. L. TORO (1998): The large conductance, voltage-dependent, and calcium-sensitive K+ channel, Hslo, is a target of cGMP-dependent protein kinase phosphorylation in vivo. J. Biol. Chem. 273, 32950-32956 ALZAMORA, R., E.T. MARUSIC, M. GONZALEZ u. L. MICHEA (2003): Nongenomic effect of aldosterone on Na+, K+-Adenosine Triphosphatase in arterial vessels. Endocrinology 144, 1266-1272 AMANN, K. (2001): Persönliche Mitteilung. AMBERG, G.C., A.D. BONEV, C.F. ROSSOW, M.T. NELSON u. L.F. SANTANA (2003): Modulation of the molecular composition of large conductance, Ca2+ activated K+ channels in vascular smooth muscle during hypertension. J. Clin. Invest. 112, 717-724 AMBERG, G.C., u. L.F. SANTANA (2003): Downregulation of the BK channel beta1 subunit in genetic hypertension. Circ. Res. 93, 893-895 ARRIGHI, I., M. BLOCH-FAURE, F. GRAHAMMER, M. BLEICH, R. WARTH, R. MENGUAL, M.D. DRICI, J. BARHANIN u. P. MENETON (2001): Altered potassium balance and aldosterone secretion in a mouse model of human congenital long QT syndrome. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 8792-8797 ASHCROFT, F.M. (1999): Ion channels and disease. Academic Press, San Diego, San Francisco
114
Literaturverzeichnis
ATARASHI, K., P.J. MULROW u. R. FRANCO-SAENZ (1985): Effect of atrial peptides on aldosterone production. J. Clin. Invest. 76, 1807-11 ATKINSON, N., G.A. ROBERTSON u. B. GANETZKY (1991): A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus. Science 253, 551-555 BARAJAS, L. (1979): Anatomy of the juxtaglomerular apparatus. Am. J. Physiol. 268, F333-F343 BARBATO, J.C., P.J. MULROW, J.I. SHAPIRO u. R. FRANCO-SAENZ (2002): Rapid effects of aldosterone and spironolactone in the isolated working rat heart. Hypertension 40, 130-135 BARRETT, P.Q., W.B. BOLLAG, C.M. ISALES, R.T. MCCARTHY u. H. RASMUSSEN (1989): Role of calcium in Angiotensin II-mediated aldosterone secretion. Endocr. Rev. 10, 496-518 BAYGUINOV, O., B. HAGEN u. K.M. SANDERS (2003): Substance P modulates calcium transients and membrane current responses in murine colonic myocytes. Br. J. Pharmacol. 38, 1233-1243 BAYGUINOV, O., B. HAGEN, J.L. KENYON u. K.M. SANDERS (2001): Coupling strength between localized Ca2+ transients and K+ channels is regulated by protein kinase C. Am. J. Physiol. 281, C1512-C1523 BEHRENS, R., A. NOLTING, F. REIMANN, M. SCHWARZ, R. WALDSCHÜTZ u. O. PONGS (2000): HKCNMB3 and hKCNMB4 cloning and characterization of two members of the large-conductance calcium-activated potassium channel β subunit family. FEBS Letters 474, 99-106 BERGER, S., M. BLEICH, W. SCHMID, T.J. COLE, J. PETERS, H. WATANABE, W. KRIZ, R. WARTH, R. GREGER u. G. SCHÜTZ (1998): Mineralocorticoid receptor knockout mice: physiology of Na+ metabolism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 9424-9429 BLAND, M.L., M. DESCLOZEAUX u. H.A. INGRAHAM (2003): Tissue growth and remodeling of the embryonic and adult adrenal gland. Ann. N.Y. Acad. Sci. 995, 59-72
115
Literaturverzeichnis
BOHLENDER, J., J. MENARD, O. EDLING, D. GANTEN u. F.C. LUFT (1998): Mouse and rat plasma renin concentration and gene expressiuon in (mRen2)27 transgenic rats. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 274, H1450-1456 BRAUNEIS, U., P.M. VASSILEV, S.J. QUINN, G.H. WILLIAMS u. D.L. TILLOTSON (1991): ANG II blocks potassium currents in zona glomerulosa cells in rat, bovine, and human adrenals. Am J. Physiol. 260, E772-779 BRAVO-ZEHNDER, M., P. ORIO, A. NORAMBUENA, M. WALLNER, P. MEERA, L. TORO, R. LATORRE u. A. GONZALES (2000): Apical sorting of a voltage- and Ca2+-activated K+ channel α-subunit in Madin-Darby canine kidney cells is independent of N-glycosylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 13114-13119 BRAYDEN, J.E., u. M.T. NELSON (1992): Regulation of arterial tone by activation of calcium-dependent potassium channels. Science 256, 532-535 BREDE, M., K. HADAMEK, L. MEINEL, F. WIESMANN, J. PETERS, S. ENGELHARDT, A. SIMM, A. HAASE, M.J. LOHSE u. L. HEIN (2001): Vascular hypertrophy and increased P70S6 kinase in mice lacking the angiotensin II AT2 receptor. Circulation 104, 2602-2607 BRENNER, R., T.J. JEGLA, A. WICKENDEN, Y. LIU u. W. ALDRICH (2000 a): Cloning and functional characterization of novel large conductance calcium-activated potassium channel β subunits hKCNMB3 and hKCNMB4. J. Biol. Chem. 275, 6453-6461 BRENNER, R., G.J. PEREZ, A.D. BONEV, D.M. ECKMANN, J.C. KOSEK, S.W. WILLER, A.J. PATTERSON, M.T. NELSON u. R.W. ALDRICH (2000 b): Vasoregulation by the β1 subunit of the calcium-activated potassium channel. Nature 407, 845,847-8 BROWN, N.J., S. NAKAMURA, L. MA, I. NKAMURA, E. DONNERT, M. FREEMAN, D.E. VAUGHAN u. A.B. FOGO (2000): Aldosterone modulates plasminogen activator inhibitor-1 and glomerulosclerosis in vivo. Kidney Int. 58, 1219-1227 BURT, V.L., P. WHELTON, E.J. ROCCELLA, C. BROWN, J.A. CUTLER, M. HIGGINS, M.J. HORAN u. D. LABARTHE (1995): Prevalence of hypertension in the US adult population. Results from the Third National Health and Nutrition Examination Survey, 1988-1991 (1995). Hypertension 25, 305-13
116
Literaturverzeichnis
BUTLER, A., S. TSUNODA, D.P. MCCOBB, A. WEI u. L. SALKOFF (1993): MSlo, a complex mouse gene encoding “maxi” calcium-activated potassium channels. Science 261, 221-224 CALHOUN, D.A., M.K. NISHIZAKA, M.A. ZAMAN, R.B. THAKKAR u. P. WEISSMANN (2002): Hyperaldosteronism among black and white subjects with resistant hypertension. Hypertension 40, 892-896 CAREY, R.M., Z.Q. WANG u. H.M. SIRAGY (1999): Role of the angiotensin type 2 receptor in the regulation of blood pressure and renal function. Hypertension 35, 155-163 CARL, A., B.W. FREY, S.M. WARD, K.M. SANDERS u. J.L. KENYON (1993): Inhibition of slow-wave repolarization and Ca2+-activated K+ channels by quaternary ammonium ions. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 264, C625-C631 CARL, A., N.G. McHALE, N.G. PUBLICOVER u. K.M. SANDERS (1990): Participation of Ca2+-activated K+ channels in electrical activity of canine gastric smooth muscle. J. Physiol. 429, 205-221 CHANG, C.P., S.I. DWORETZKY, J. WANG u. M.E. GOLDSTEIN (1997): Differential expression of the α and β subunits of the large-conductance calcium-activated potassium channel: Implication for channel diversity. Mol. Brain Res. 45, 33-40 CHEN, S.Y., A. BHARGAVA, L. MASTROBERARDINO, O.C. MEIJER, J. WANG, P. BUSE, G.L. FIRESTONE, F. VERREY u. D. PEARCE (1999 a): Epithelial sodium channel regulated by aldosterone-induced protein sgk. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 2514-2519 CHEN, X.L., D.A. BAYLISS, R.J. FERN u. P.Q. BARRETT (1999 b): A role for T-type Ca2+ channels in the synergistic control of aldosterone production by ANG II and K+. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 276, F674-F683 CHENG, H.F., S.W. WANG, M.Z. ZHANG, J.A. McKANNA, R. BREYER u. R.C. HARRIS (2002): Prostaglandin that increase renin production in response to ACE inhibition are not derived from cyclooxygenase-1. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 283, R638-R646 CHOLEWA, B.C., u. D.L. MATTSON (2001): Role of the renin-angiotensin system during alterations of sodium intake in conscious mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, R987-R993
117
Literaturverzeichnis
COIRINI, H., E.T. MARUSIC, A.F. DE NICOLA, T.C. RAINBOW u. B.S. McEWEN (1983): Identification of mineralocorticoid binding sites in rat brain by competition studies and density gradient centrifugation. Neuroendocrinology 37, 354-360 CONN, J.W. (1955): Primary aldosteronism, a new clinical syndrome. J. Lab. Clin. Med. 45, 6-17 COWLEY, A.W. JR. (1992): Long-term control of arterial blood pressure. Physiol. Rev. 72, 231-300 COWLEY, A.W., J.F. LIARD u. A.C. GUYTON (1973): Role of baroreceptor reflex in daily control of arterial blood pressure and other variables in dogs. Circ. Res. 32, 564-576 COWLEY, A.W. JR., u. R.J. ROMAN (1996): The role of the kidney in hypertension. JAMA. 275, 1581-9 DeGROOT, L.J. (1989): Endocrinology 2. Aufl. Saunders Company, Philadelphia, London, Bd. 2, S. 1601-1609 DELCAYRE, C., J.S. SILVESTRE, A. GARNIER, A. OUBENAISSA, S. CAILMAIL, E. TATARA, B. SWYNGHEDAUW u. V. ROBERT (2000): Cardiac aldosterone production and ventricular remodelling. Kidney Int. 57, 1346-1351 DELYANI, J.A., E.L. ROBINSON u. A.E. RUDOLPH (2001): Effect of a selective aldosterone receptor antagonist in myocardial infarction. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 50, H647-H654 DÍAZ, L., P. MEERA, J. AMIGO, E. STEFANI, O. ALVAREZ, L. TORO u. R. LATORRE (1998): Role of the S4 segment in a voltage-dependent calcium-sensitive potassium (hSlo) channel. J. Biol. Chem. 273, 32430-32436 DICK, G.M., C. HUNTER u. K.M. SANDERS (2002): Ethylbromide tamoxifen, a membrane-impermeant antiestrogen, activates smooth muscle calcium-activated large-conductance potassium channels from the extracellular side. Mol. Pharmacol. 61, 1105-1113
118
Literaturverzeichnis
DICK, G.M., u. K.M. SANDERS (2001): (Xeno)estrogen sensitivity of smooth muscle BK channels conferred by the regulatory β1 subunit. J. Biol. Chem. 276, 44835-44840 DOBBS, W.A., J.W. PRATHER u. A.C. GUYTON (1971): Relative importance of nervous control of cardiac output and arterial pressure. Am. J. Cardiol. 27, 507-512 DORRANCE, A.M., L.O. HEATHER, R. GREKIN u. R.C. WEBB (2001): Spironolactone reduces cerebral infarct size and EGF-receptor mRNA in stroke-prone rats. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 281, R944-R950 DROSTE, S.K., A. GESING, S. ULBRICHT, M.B. MÜLLER, A.C.E. LINTHORST u. J.M.H. REUL (2003): Effects of long-term voluntary exercise on the mouse hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis. Endocrinology 144, 3012-3023 DUNN, T.B. (1970): Normal and pathologic anatomy of the adrenal gland of the mouse, including neoplasm. J. Natl. Cancer Inst. 44, 1323-1389 EDER, M., u. P. GEDIGK (1990): Allgemeine Pathologie und pathologische Anatomie. 33. Aufl. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, S. 471-475 EHMKE, H. (2003): Persönliche Mitteilung. EHRHART-BORNSTEIN, M., J.P. HINSON, S.R. BORNSTEIN, W.A. SCHERBAUM u. G.P. VINSON (1998): Intraadrenal interactions in the regulation of adrenocortical steroidgenesis. Endocr. Rev. 19, 101-143 FIEBELER, A., F. SCHMIDT, D.N. MÜLLER, J.K. PARK, R. DECHEND, M. BIERINGER, E. SHAGDARSUREN, V. BREU, H. HALLER u. F.C. LUFT (2001): Mineralocorticoid receptor affects AP-1 and nuclear factor-kB activation in angiotensin II-induced cardiac injury. Hypertension 37, 787-793 FRIIS, U.G., B.L. JENSEN, S. SETHI, D. ANDREASEN, P.B. HANSEN u. O. SKØTT (2002): Control of renin secretion from rat juxtaglomerular cells by cAMP-specific phosphodiesterases. Circ. Res. 90, 996-1003
119
Literaturverzeichnis
FRINDT, G., T. McNAIR, A. DAHLMANN, E. JACOBS-PALMER u. L.G. PALMER (2002): Epithelial Na channels and short-term renal response to salt deprivation. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 283, F717-F726 GALLO-PAYET, N., u. G. GUILLON (1998): Regulation of adrenocortical function by vasopressin. Horm. Metab. Res. 30, 360-367 GARCIA, L., M. HANNER, H.G. KNAUS, R. KOCH, W. SCHMALHOFER, R.S. SLAUGHTER u. G.J. KACZOROWSKI (1997): Pharmacology of potassium channels. Adv. Pharmacol. 39, 425-471 GARCIA-CALVO, M., H.G. KNAUS, O.B. MCMANUS, K.M. GIANGIACOMO, G.J. KACZOROWSKI u. L. GARCIA (1994): Purification and reconstitution of the high-conductance, calcium-activated potassium channel from tracheal smooth muscle. J. Biol. Chem. 269, 676-682 GARCIA-VALDES, J., F.Z. ZAMUDIO, L. TORO u. L.D. POSSAN (2001): Slotoxin, αKTx1.11, a new scorpion peptide blocker of MaxiK channels differentiates between α and α+β (β1 or β4) complexes. FEBS Letters 505, 369-373 GARDOS, G. (1958): The function of calcium in the potassium permeability of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta. 30, 653-654 GELLER, D.S., A. FARHI, N. PINKERTON, M. FREDLEY, M. MORITZ, A. SPITZER, G. MEINKE, F.T. TSAI, P.B. SIGLER u. R.P. LIFTON (2000): Activating mineralocorticoid receptor mutation in hypertension exacerbated by pregnancy. Science 289, 119-23
GELLER, D.S., J. RODRIGUEZ-SORIANO, A.V. BOADO, S. SCHIFTER, M. BAYER, S.S. CHANG u. R.P. LIFTON (1998): Mutations in the mineralocorticoid receptor gene cause autosomal dominant pseudohypoaldosteronism type I. Nature genetics 19, 279-281
GIANGIACOMO, K.M., M. GARCIA-CALVO, H.G. KNAUS, T.J. MULLMANN, M.L. GARCIA u. O. McMANUS (1995): Functional reconstitution of the large-conductance, calcium-activated potassium purified from bovine aortic smooth muscle. Biochemistry 34, 15849-15862
120
Literaturverzeichnis
GLASOW, A., M. BREIDERT, A. HAIDAN, U. ANDEREGG, P.A. KELLY u. S.R. BORNSTEIN (1996): Functional aspects of the effect of prolactin (PRL) on adrenal steroidogenesis and distribution of the PRL receptors in the human adrenal gland. J. Clin. Endocrinol. Metab. 81, 3103-3111 GOMEZ-SANCHEZ, E.P. (1997): Central hypertensive effects of aldosterone. Front Neuroendocrinol. 18, 440-462 GRAF, C., C. MASER-GLUTH, W. DE MUINCK KEIZER u. R. RETTIG (1993): Sodium retention and hypertension after kidney transplantation in rats. Hypertension 21, 724-730 GRUNNET, M., B.S. JENSEN, S.P. OLESEN u. D.A. KLAERKE (2001): Apamin interacts with all subtypes of cloned small-conductance Ca2+-activated K+ channels. Pflügers Arch. 441, 544-550
GRUNNET, M., H.G. KNAUS, C. SOLANDER u. D.A. KLAERKE (1999): Quantification and distribution of Ca2+-activated maxi K+ channels in rabbit distal colon. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 277, G22-G30 GRYGORCZYK, R., u. W. SCHWARZ (1983): Properties of the Ca2+-activated K+ conductance of human red cells as revealed by the patch-clamp technique. Cell Calcium 4, 499-510
GUYTON, A.C. (1991): Blood pressure control-special role of the kidneys and body fluids. Science 252, 1813-1816 GUYTON, A.C. (1992): Kidneys and fluids in pressure regulation. Hypertension 19(Suppl.I), 2-8 HACKENTHAL, E., R. HACKENTHAL u. K.G. HOFBAUER (1977): No evidence for product inhibition of the renin-angiotensinogen reaction in the rat. Circ. Res. 41(Suppl.II), 49-54 HACKENTHAL, E., M. PAUL, D. GANTEN u. R. TAUGNER (1990): Morphology, physiology, and molecular biology of renin secretion. Physiol. Rev. 70, 1067-1116 HAGEN, B.M., O. BAYGUINOV u. K.M. SANDERS (2003): β1-subunits are required for regulation of coupling between Ca2+ transients and characterization K+ (BK) channels by protein kinase C. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 285, C1270-C1280
121
Literaturverzeichnis
HANKE, C.J., u. W.B. CAMPBELL (2000): Endothelial cell nitric oxide inhibits aldosterone synthesis in zona glomerulosa cells: modulation by oxygen. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 279, E846-E854 HANNER, M., W.A. SCHMALHOFER, P. MUNUJOS, H.G. KNAUS, G.J. KACZOROWSKI u. L. GARCIA (1997): The β subunit of the high-conductance calcium-activated potassium channel contributes to the high-affinity receptor for charybdotoxin. J. Biol. Chem. 273, 16289-16296 HANNER, M., R. VIANNA-JORGE, A. KAMASSAH, W.A. SCHMALHOFER, H.G. KNAUS, G.J. KACZOROWSKI u. M.L. GARCIA (1998): The β subunit of the high-conductance calcium-activated potassium channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 2853-2858 HARTMANN, H.A., G.E. KIRSCH, J.A. DREWE, M. TAGLIALATELA, R.H. JOHO u. A.M. BROWN (1991): Exchange of conduction pathways between two related K+ channels. Science 251, 942-944 HAY-SCHMIDT, A., M. GRUNNET, S.L. ABRAHAMSE, H.G. KNAUS u. D.A. KLAERKE (2003): Localization of Ca2+-activated big-conductance K+ channels in rabbit distal colon. Pflügers Arch. 446, 61-68 HEGINBOTHAM, L., Z. LU, T. ABRAMSON u. R. McKINNON (1994): Mutations in the K+ channel signature sequence. Biophy. J. 66, 1061-1067 HEIKKILÄ, M., H. PELTOKETO, J. LEPPÄLUOTO, M. ILVES, O. VUOLTEENAHO u. S. VAINIO (2002): Wnt-4 deficiency alters mouse adrenal cortex function, reducing aldosterone production. Endocrinology 143, 4358-4365 HILBERS, U., J. PETERS, S.R. BORNSTEIN, F.M.A. CORREA, O. JÖHREN, J.M. SAAVEDRA u. M. EHRHART-BORNSTEIN (1999): Local renin-angiotensin system is involved in K+-induced aldosterone secretion from human adrenocortical NVI-H295 cells. Hypertension 33,1025-1030 HILLE, B. (2001): Ion channels of excitable membranes. 3. Aufl. Sinauer Associates, Sunderland
122
Literaturverzeichnis
HORRIGAN, F.T., u. R.W. ALDRICH (2002): Coupling between voltage sensor activation, Ca2+ binding and channel opening in large conductance (BK) potassium channels. J. Gen. Physiol. 120, 267-305 ISHII, T.M., C. SILVIA, B. HIRSCHBERG, C.T. BOND, J.P. ADELMANN u. J. MAYLIE (1997): A human intermediate conductance calcium-activated potassium channel. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 11651-11656 ITO, C.S., u. A.M. SCHER (1978): Regulation of arterial blood pressure by aortic baroreceptors in the unanesthetized dog. Circ. Res. 42, 230-236 JAGGAR, J.H., V.A. PORTER, W.J. LEDERER u. M.T. NELSON (2000): Calcium sparks in smooth muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 278, C235-C256 JAN, L.Y., u. Y.N. JAN (1994): Potassium channels and their evolving gates. Nature 371, 119-122 JENSEN, B.S., D. STRØBÆK, P. CHRISTOPHERSEN, T.D. JØRGENSEN, C. HANSEN, A. SILAHTAROGLU, S.P. OLESEN u. P.K. AHRING (1998): Characterization of the cloned human intermediate-conductance Ca2+-activated K+ channel. Cell Physiol. 44, C848-C856 JIANG, G., S. COBBS, J.D. KLEIN u. W.C. O`NEILL (2003): Aldosterone regulates the Na-K-2Cl cotransporter in vascular smooth muscle. Hypertension 41, 1131-1135 JIANG, Z., M. WALLNER, P. MEERA u. L. TORO (1999): Human and rodent MaxiK channel β-subunit genes: cloning and characterization. Genomics 55, 57-67 JOINER, W.J., R. KHANNA, L.C. SCHLICHTER u. L.K. KACZMAREK (2001): Calmodulin regulates assembly and trafficking of SK4/IK1 Ca2+-activated K+ channels. J. Biol. Chem. 276, 37980-37985 JUST, A., J. FAULHABER u. H. EHMKE (2000): Autonomic cardiovascular control in conscious mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 279, R2214-R2221 KAMYNINA, E., u. O. STAUB (2002): Concerted action of ENaC, Nedd4-2, and Sgk1 in transepithelial Na+ transport. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 283, F377-F387
123
Literaturverzeichnis
KASCHINA, E., u. T. UNGER (2003): Angiotensin AT1/AT2 receptors: regulation, signaling and function. Blood Press. 12, 70-88 KELLENBERG, S., u. L. SCHILD (2002): Epithelial sodium channel/degenerin family of ion channels: a variety of functions for a shared structure. Physiol. Rev. 82, 735-767 KLINKE, R. u. S. SILBERNAGEL (1996): Lehrbuch der Physiologie 2. Aufl. Thieme Verlag, Stuttgart, New York, S. 162-171 KNAUS, H.G., A. EBERHART, H. GLOSSMANN, P. MUNUJOS, G.J. KACZOROWSKI u. L. GARCIA (1994 a): Pharmacology and structure of high conductance calcium-activated potassium channels. Cell Signal. 6, 861-870 KNAUS, H.G., A. EBERHART, R.O.A. KOCH, P. MUNUJOS, W.A. SCHMALHOFER, J.W. WARMKE, G.J. KACZOROWSKI u. M.L. GARCIA (1995): Characterization of tissue-expressed α subunits of the high conductance Ca2+-activated K+
channel. J. Biol. Chem. 270, 22434-22439 KNAUS, H.G., K. FOLANDER, M. GARCIA-CALVO, M.L. GARCIA, G.J. KACZOROWSKI, M. SMITH u. R. SWANSON (1994 b): Primary sequence and immunological characterization of beta-subunit of high conductance Ca(2+)-activated K+ channel from smooth muscle. J. Bio. Chem. 269, 17274-17278 KNAUS, H.G., M. GARCIA-CALVOS, G.J. KACZOROWSKI u. M.L.GARCIA (1994 c): Subunit composition of the high conductance calcium-activated potassium channel from smooth muscle, a representative of the mSlo and slowpoke family of potassium channel. J. Biol. Chem. 269, 3921-3924 KÖHLER, M., B. HIRSCHBERG, C.T. BOND, J.M. KINZIE, N.V. MARRION, J. MAYLIE u. J.P. ADELMANN (1996): Small-conductance, calcium-activated potassium channels from mammalian brain. Science 273, 1709-1714 KOTLIKOFF, M., u. J. HALL (2003): Hypertension: β testing. J. Clin. Invest. 112, 654-656 LAL, A., J.P. VEINOT u. F.H. LEENEN (2003): Prevention of high salt diet-induced cardiac hypertrophy and fibrosis by spironolacton. Am. J. Hypertens. 16, 319-323
124
Literaturverzeichnis
LATORRE, R., A. OBERHAUSER, P. LABARCA u. O. ALVAREZ (1989): Varieties of calcium-activated potassium channels. Annu. Rev. Physiol. 51, 385-399 LEVITAN, I.B. (1999): Modulation of ion channels by protein phosphorylation. How brain works. Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 3-22 LIFTON, R.P., R.G. DLUHY, M. POWERS, G.M. RICH, S. COOK, S. ULICK u. J.M. LALOUEL (1992): A chimaeric llβ-hydroxylase/aldosterone synthase gene causes glucocorticoid-remediable aldosteronism and human hypertension. Nature 355, 262-265 LIFTON, R.P., A.G. GHARAVI u. D.S. GELLER (2001): Molecular mechanism of human hypertension. Cell 104, 545-546 LIU, Y., A.G. HUDETZ, H.G. KNAUS u. N.J. RUSCH (1998): Increased expression of Ca2+-sensitive K+ channels in the cerebral microcirculation of genetically hypertensive rats. Circ Res. , 729-737 82
LIU, Y., K. PLEYTE, H.G. KNAUS u. N.J. RUSCH (1997): Increased expression of Ca2+-sensitive K+ channels in aorta of hypertensive rats. Hypertension 30, 1403-1409 LÖHN, M., B. LAUTERBACH, H. HALLER, O. PONGS, F.C. LUFT u. M. GOLLASCH (2001): β1 subunit of BK channels regulates arterial wall [Ca2+] and diameter in mouse cerebral arteries. J. Appl. Physiol. 91, 1350-1354 LOTSHAW, D.P. (1997 a): Characterization of angiotensin II-regulated K+ conductance in rat adrenal glomerulosa cells. J. Membrane Biol. 156, 261-277 LOTSHAW, D.P. (1997 b): Effects of K+ channel blockers on K+ channels, membrane potential, and aldosterone secretion in rat adrenal zona glomerulosa cells. Endocrinology 138, 4167-4175 LOTSHAW, D.P. (2001): Role of membrane depolarisation and T-type Ca2+ channels in angiotensin II and K+ stimulated aldosterone secretion. Mol. Cell. Endocrinol. 175, 157-171
125
Literaturverzeichnis
LOTSHAW, D.P., u. F. LI (1996): Angiotensin II activation of Ca2+-permeant nonselective cation channels in rat adrenal glomerulosa cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 271, C1705-C1715 LUFT, F.C., E. MERVAALA, D.N. MÜLLER, V. GROSS, F. SCHMIDT, J.K. PARK, C. SCHMITZ, A. LIPPOLDT, V. BREU, R. DECHEND, D. DRAGUN, W. SCHNEIDER, D. GANTEN u. H. HALLER (1999): Hypertension-induced end-organ damage. A new transgenic approach to an old problem. Hypertension 33, 212-218 LUM, C., E.G. SHESELY, D`A.L. POTTER u. W.H. BEIERWALTES (2004): Cardiovascular and renal phenotype in mice with one or two renin genes. Hypertension 43, 79-86 LUMBERS, E.R. (1999): Angiotensin and aldosterone. Regul. Pept. 80, 91-100 MAKARA, J.K., G.L. PETHEÖ, A. TOTH u. A. SPÄT (2000): Effect of osmolarity on aldosterone production by rat adrenal glomerulosa cells. Endocrinology 141, 1705-1710 MASUZAKI, H., H. YAMAMOTO, C.J. KENYON, J.K. ELMQUIST, N.M. MORTON, J.M. PATERSON, H. SHINYAMA, M.G.F. SHARP, S. FLEMING, J.J. MULLINS, J.R. SECKL u. J.S. FLIER (2003): Transgenic amplification of glucocorticoid action in adipose tissue causes high blood pressure in mice. J. Clin. Invest. 112, 83-90 MATTSON, D.L. (1998): Long-term measurement of arterial blood pressure in conscious mice. Am. J. Physiol. 274, R564-70 MATTSON, D.L. (2001): Comparison of arterial blood pressure in different strains of mice. Am. J. Hypertens. 14, 405-408 MAZZOCCHI, G., L.K. MALENDOWICZ, A. MARKOWSKA, G. ALBERTIN u. G.G. NUSSDORFER (2000): Role of adrenal renin-angiotensin systems in the control of aldosterone secretion in sodium-restricted rats. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 278, E1027-E1030
126
Literaturverzeichnis
MEERA, P., M. WALLNER, M. SONG u. L. TORO (1997): Large conductance voltage- and calcium-dependent K+ channel, a distinct member of voltage-dependent ion channels with seven N-terminal transmembrane segments (S0-S6), an extracellular N terminus, and an intracellular (S9-S10) C terminus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 14066-14071 MEERA, P., M. WALLNER u. L. TORO (2000): A neuronal β subunit (KCNMB4) makes the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ channel resistant to charybdotoxin and iberiotoxin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 5562-5567 MELBY, J.C. (1989): Diagnosis and treatment of primary aldosteronism and isolated hypoaldosteronism. in: L.J. DeGROOT (Hrsg.): Endocrinology 2. Aufl. Saunders Company, Philadelphia, London, Bd. 2, S. 1705-1713 MEYER, H., K. BRONSCH u. J. LEIBETSEDER (1993): Supplemente zu Vorlesungen und Übungen in der Tierernährung. 8. Aufl. Verlag Schaper, Alfeld-Hannover MIHAILIDOU, A.S., M. MARDINI, J.W. FUNDER u. M. RAISON (2002): Mineralocorticoid and angiotensin receptor antagonism during hyperaldosteronemia. Hypertension 40, 124-129 MIL, J.G., C. MILANEZ, M.M. de RESENDE, G. GOMES u. C.M. LEITE (2003): Spironolactone prevents cardiac proliferation after myocardial infarction rats. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 30, 739-744 MILLER, C. (2000): An overview of the potassium channel family. Genome Biol. 1, reviews 0004.1-0004.5 MITURKA, B.M., u. H.M. RAWNSLEY (1981): Clinical biochemical and hematological reference values in normal experimental animals and normal humans. 2. Aufl. Masson Publishing USA, New York, Paris MOGUILEWSKY, M., u. J.P. RAYNAUD (1980): Evidence for a specific mineralocorticoid receptor in rat pituitary and brain. J. Steroid. Biochem. 12, 309-314 MULLER, J. (1998): Regulation of aldosterone biosynthesis: the end of the road? Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. Suppl. 25, S79-85
127
Literaturverzeichnis
MULROW, P.J. (1999): Angiotensin II and aldosterone regulation. Regul. Pept. 80, 27-32 NELSON, M.T., H. CHENG, M. RUBART, L.F. SANTANA, A.D. BONEV, H.J. KNOT u. W.J. LEDERER (1995 a): Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks. Science 270, 633-637 NELSON, M.T., u. J.M. QUAYLE (1995 b): Physiological roles and properties of potassium channels in arterial smooth muscle. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 268, C799-C822 NICOLETTI, A., D. HEUDES, N. HINGLAIS, M.D. APPAY, M. PHILIPPE, C. SASSY-PRIGENT, J. BARIETY, J.B. MICHEL (1995): Left ventricular fibrosis in renovascular hypertensive rats. Hypertension 26, 101-111 NUSSBERGER, J. (2003): Investigating mineralocorticoid hypertension. J. Hypertens. Suppl. 21, S25-30 NUSSDORFER, G.G., G.P. ROSSI u. G. MAZZOCCHI (1997): Role of adrenomedullin and related peptides in the regulation of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis. Peptides 18, 1079-1089 OESTREICHER, E.M., D. MARTINEZ-VASQUEZ, J.R. STONE, L. JONASSON, W. ROUBSANTHISUK, K. MUKASA u. G.K. ADLER (2003): Aldosterone and not plasminogen activator inhibitor-1 is a critical mediator of early angiotensin II/NG-nitro-L-arginin methyl ester-induced myocardial injury. Circulation 108, 2517-2523
ORIO, P., P. ROJAS, G. FERREIRA u. R. LATORRE (2002): New disguises for an old channel: MaxiK channel β-subunits. News Physiol. Sci. 17, 156-161 PALMER, L.G. (1998): Potassium secretion and the regulation of distal nephron K channels. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 274, F817-F833 PARK, S.Y., C.Y. SONG, B.C. KIM, H.K. HONG u. H.S. LEE (2003): Angiotensin II mediates LDL-induced superoxide generation in mesangial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 285, F909-F915
128
Literaturverzeichnis
PASCOE, L., K.M. CURNOW, L. SLUTSKER, J.M.C. CONNELL, P.W. SPEISER, M.I. NEW u. P.C. WHITE (1992): Glucocorticoid-suppressible hyperaldosteronism results from hybrid genes created by unequal crossovers between CYP11B1 and CYP11B2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 8327-8331 PATSCHAN, O., B. KUTTLER, U. HEEMANN, A. UBER u. R. RETTIG (1997): Kidneys from normotensive donors lower blood pressure in young transplanted spontaneously hypertensive rats. Am. J. Physiol. 273, R175-180 PATTERSON, A.J., J. HENRIE-OLSON u. R. BRENNER (2002): Vasoregulation at the molecular level: a role for the β1 subunit of the calcium-activated potassium (BK) channel. Trends Cardiovasc. Med. 12, 78-82 PAYET, M.D., L. BILODEAU, P. DROLET, J. IBARRONDO, G. GUILLON u. N. GALLO-PAYET (1995): Modulation of a Ca(2+)-activated K+ channel by angiotensin in rat adrenal glomerulosa cells: involvement of a G protein. Mol. Endocrinol. 9, 935-947 PEARCE, D., A. BHARGAVA u. T.J. COLE (2003): Aldosterone: its receptor, target genes, and actions. Vitam. Horm. 66, 29-76 PÉREZ, G.J., L. TORO, S.D. ERULKAR u. E. STEFANI (1993): Characterization of large-conductance, calcium-activated potassium channels from human myometrium. Am. Obstet. Gynecol. 168, 652-660 PERSSON, P.B. (1996): Modulation of cardiovascular control mechanisms and their interaction. Physiol. Rev. 76, 193-244 PETERS, J., u. D. GANTEN (1998): Adrenal renin expression and ist role in ren-2 transgenic rats TGR(mREN2)27. Horm. Metab. Res. 30, 350-354 PETERS, J., K.F. HILGERS, C. MASER-GLUTH u. R. KREUTZ (1996): Role of the circulating renin-angiotensin system in the pathogenesis of hypertension in transgenic rats, TGR (mREN2)27. Clin. Exp. Hypertens. 18, 933-948
129
Literaturverzeichnis
PETKOV, G.V., A.D. BONEV, T.J. HEPPNER, R. BRENNER, R.W. ALDRICH u. M.T. NELSON (2001): β1-Subunit of the Ca2+-activated K+ channel regulates contractile activity of mouse urinary bladder smooth muscle. J. Physiol. 537.2, 443-452 PHILLIPS, M.I., E.A. SPEAKMAN u. B. KIMURA (1993): Levels of angiotensin and molecular biology of the tissue renin angiotensin systems. Regul. Pept. 43, 1-20 PINTO, Y.M., H. BUIKEMA, W.H. VAN GILST, E. SCHOLTENS, P.P. VAN GEEL, P.A. DE GRAEFF, J. WAGNER u. M. PAUL (1997): Cardiovascular end-organ damage in REN-2 transgenic rats compared to spontaneously hypertensive rats. J. Mol. Med. 75, 371-377 PISKOROWSKI, R., u. W. ALDRICH (2002): Calcium activation of BKCa potassium channels lacking the calcium bowl and RCK domains. Nature 420, 499-502 PLÜGER, S., J. FAULHABER, M. FÜRSTENAU, M. LÖHN, R. WALDSCHÜTZ, M. GOLLASCH, H. HALLER, F.C. LUFT, H. EHMKE u. O. PONGS (2000): Mice with disrupted BK channel β1 subunit gene feature abnormal Ca2+ Sparks/STOC coupling and elevated blood pressure. Circ. Res. 87, e53-e60
PLUZNICK, J.L., P. WIE, P.K. CARMINES u. S.C. SANSOM (2003): Renal fluid and electrolyte handling in BKCa-β1-/-
mice. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 284, F1274-1279 QIAN, X., u. K.L. MAGLEBY (2003): β1 subunits facilitate gating of BK channels by acting through the Ca2+, but not the Mg2+, activating mechanisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 10061-10066 QUASCHNING, T., F. RUSCHITZKA, S. SHAW u. T.F. LÜSCHER (2001): Aldosterone receptor antagonism normalizes vascular function in liquorice-induced hypertension. Hypertension 37, 801-805 RAMANATHAN, K., T.H. MICHAEL u. P.A. FUCHS (2000): β subunits modulate alternatively spliced, large conductance, calcium-activated potassium channels of avian hair cells. J. Neurosci. 20, 1675-1684
130
Literaturverzeichnis
RAMANATHAN, K., T.H. MICHAEL, G.J. JIANG, H. HIEL u. P.A. FUCHS (1999): A molecular mechanism for electrical tuning of cochlear hair cells. Science 283, 215-217 REINCKE, M., L. SEILER u. L.C. RUMP (2003): Normokaliämischer primärer Hyperaldosteronismus. Dt. Arztbl. 4, 184-190 RETTIG, R. (1993) : Does the kidney play a role in the aetiology of primary hypertension? Evidence from renal transplantation studies in rats and humans. J. Hum. Hypertens. 7, 177-178 RHALEB, N.E., X.P. YANG, M. NANBA, E.G. SHESELY u. O.A. CARRETERO (2001): Effect of chronic blockade of the Kallikrein-Kinin system on the development of hypertension in rats. Hypertension 37, 121-128 ROBERTSON, B.E., R. SCHUBERT, J. HESCHELER u. M.T. NELSON (1993): cGMP-dependent protein kinase activates Ca-activated K channels in cerebral artery smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 265, C299-C303 ROCHA, R., C.T. STIER JR., I. KIFOR, M.R. OCHA-MAYA, H.G. RENNKE, G.H. WILLIAMS u. G.K. ADLER (2000): Aldosterone: a mediator of myocardial necrosis and renal arteriopathy. Endocrinology 141, 3871-3878 ROSOLOWSKY, L.J., u. W.B. CAMPBELL (1990): Endothelin enhances adrenocorticotropin-stimulated aldosterone release from cultured bovine adrenal cells. Endocrinology 126, 1860-1866 ROSSIER, M.F., M.M. BURNAY, Y. BRANDENBURGER, N. CHERRADI, M.B. VALLOTTON u. A.M. CAPPONI (1996 a): Sources and sites of action of calcium in the regulation of aldosterone biosynthesis. Endocr. Res. 22, 579-588 ROSSIER, M.F., M.M. BURNAY, M.B. VALLOTTON u. A.M. CAPPONI (1996 b): Distinct functions of T- and L-type calcium channels during activation of bovine adrenal glomerulosa cells. Endocrinology 137, 4817-4826 ROSSIER, B.C., S. PRADERVAND, L. SCHILD u. E. HUMMLER (2002): Epithelial sodium channel and the control of sodium balance: interaction between genetic and environmental factors. Annu. Rev. Physiol. 64, 877-897
131
Literaturverzeichnis
ROTIN, D., V. KANELIS u. L. SCHILD (2001): Trafficking and cell surface stability of ENaC. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 281, F391-F399 ROWLAND, N.E., B.E. GOLDSTEIN u. K.L. ROBERTSON (2003): Role of angiotensin in body fluid homeostasis of mice: fluid intake, plasma hormones, and brain Fos. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 284, R1586-R1594 RUSCHITZKA, F.T., R.H. WENGER, T. STALLMACH, T. QUASCHNING, C. DE WIT, K. WAGNER, R. LABUGGER, M. KELM, G. NOLL, T. RÜLICKE, S. SHAW, R.L.P. LINDBERG, B. RODENWALDT, H. LUTZ, C. BAUER, T.F. LÜSCHER u. M. GASSMANN (2000): Nitric oxide prevents cardiovascular disease and determines survival in polyglobulic mice overexpressing erythropoetin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11609-11613 RUSKOAHO, H., H. LESKINEN, J. MAGGA, P. TASKINEN, P. MÄNTYMAA, O. VUOLTEENAHO u. J. LEPPÄLUOTO (1997): Mechanisms of mechanical load-induced atrial natriuretic peptide secretion: role of endothelin, nitric oxide, and angiotensin II. J. Mol. Med. 75, 876-885 SAIKI, R.K., D.H. GELFAND, S. STOFFEL, S.J. SCHARF, R. HIGUCHI, G.T. HORN, K.B. MULLIS u. H.A. EHRLICH (1988): Primer-directed enzymatic amplification on DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-91 SATO, A., M. HAYASHI u. T. SARUTA (2002): Relative long-term effects of spironolactone in conjunction with an angiotensin-converting enzyme inhibitor on left ventricular mass and diastolic function in patients with essential hypertension. Hypertens. Res. 25, 837-842 SCHUBERT, R., u. M.T. NELSON (2001): Protein kinases: tuners of the BKCa channel in smooth muscle. Trends Pharmacol. Sci. 22, 505-512 SCORNIK, F.S., J. CODINA, L. BIRNBAUMER u. L. TORO (1993): Modulation of coronary smooth muscle KCa channels by Gsα independent of phosphorylation by protein kinase A. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 265, H1460-H1465 SEWER, M.B., u. M.R. WATERMAN (2003): ACTH modulation of transcription factors responsible for steroid hydroxylase gene expression in the adrenal cortex. Microsc. Res. Tech. 61, 300-307
132
Literaturverzeichnis
SHADE, R.E., V.S. BISHOP, J.R. HAYWOOD u. C.K. HAMM (1990): Cardiovascular and neuroendocrine responses to baroreceptor denervation in baboons. Am. J. Physiol. 258, R930-938 SHI, J., G. KRISHNAMOORTHY, Y. YANG, L. HU, N. CHATURVEDI, D. HARILAL, J. QIN u. J. CUI (2002): Mechanism of magnesium activation of calcium-activated potassium channels. Nature 418, 876-880 SMITH-MAXWELL, C.J., J. LEDWELL u. W. ALDRICH (1998): Role of the S4 in cooperativity of voltage-dependent potassium channel activation. J. Gen. Physiol. 111, 399-420 SOTO, M.A., C. GONZÁLEZ, E. LISSI, C. VERGARA u. R. LATORRE (2002): Ca2+-activated K+ channel inhibition by reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282, C461-C471 SPÄT, A. (1988): Stimulus-secretion coupling in angiotensin-stimulated adrenal glomerulosa cells. J. steroid. Biochem. 29, 443-453 SPÄT, A., P. ENYEDI, G. HAJNOCZKY u. L. HUNYADY (1991): Generation and role of calcium signal in adrenal glomerulosa cells. Exp. Physiol. 76, 859-885 STANDEN, N. (2000): Tuning channels for blood pressure. Nature 407, 845-848 STEFANI, E., M. OTTOLIA, F. NOCETI, R. OLCESE, M. WALLNER, R. LATORRE u. L. TORO (1997): Voltage-controlled gating in a large conductance Ca2+-sensitive K+ channel (hslo). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 5427-5431 STIER, C.T.JR., S. KOENIG, D.Y. LEE, M. CHAWALA u. W.H. FRISHMAN (2003): Aldosterone and aldosterone antagonism in cardiovascular disease: focus on eplerenone (Inspra). Heart Dis. 5, 102-118 STOWASSER, M., u. R.D. GORDON (2000): Primary aldosteronism: learning from the study of familial varieties. J. Hypertension 18, 1165-1176 STOWASSER, M., u. R.D. GORDON (2003): Primary aldosteronism: from genesis to genetics. Trends Endocrinol Metab. 14, 310-7
133
Literaturverzeichnis
TANAKA, Y., M. AIDA, H. TANAKA, K. SHIGENOBU u. L. TORO (1998): Involvement of maxi-KCa channel activation in atrial natriuretic peptide-induced vasorelaxation. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 357, 705-708 TANAKA, Y., Y. MOCHIZUKI, H. HIRANO, M. AIDA, H. TANAKA, L. TORO u. K. SHIGENOBU (1999): Role of MaxiK channels in vasoactive intestinal peptide-induced relaxation of rat mesenteric artery. Eur. J. Pharmacol. 383, 291-296 TAUGNER, R., C.P. BUHRLE, E. HACKENTHAL, E. MANNEK u. R. NOIBILING (1984): Morphology of the juxtaglomerular apparatus and secretory mechanisms. Contrib. Nephrol. 43, 76-101 TIAN, L., R.R. DUNCAN, M.S.L. HAMMOND, L.S. COGHILL, H. WEN, R. RUSINOVA, A.G. CLARK, I.B. LEVITAN u. M.J. SHIPSTON (2001): Alternative splicing switches potassium channel sensitivity to protein phosphorylation. J. Biol. Chem. 276, 7717-7720 TIAN, L., H.G. KNAUS u. M.J. SHIPSTON (1998): Glucocorticoid regulation of calcium-activated potassium channels mediated by Serine/Threonine protein phosphatase. J. Biol. Chem. 273, 13531-13536 TIMMERS, H.J.L.M., W. WIELING, J.M. KAREMAKER u. J.W.M. LENDERS (2003): Denervation of carotid baro- and chemoreceptors in humans. J. Physiol. 553.1, 3-11 TORO, L., M. AMADOR u. E. STEFANI (1990): ANG II inhibits calcium-activated potassium channels from coronary smooth muscle in lipid bilayers. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 258, H912-H915 TORO, L., M. WALLNER, O. MEERA u. Y. TANAKA (1998): Maxi-KCa, a unique member of the voltage-gated K channel superfamily. News Physiol. Sci. 13, 112-117 TOTH, I.E., E.S. VIZI, J.P. HINSON u. G.P. VINSON (1997): Innervation of the adrenal cortex, its physiological relevance, with primary focus on the noradrenergic transmission. Microsc. Res. Tech. 36, 534-545
134
Literaturverzeichnis
TRABOLD, F., S. PONS, A.A. HAGEGE, M. BLOCH-FAURE, F. ALHENC-GELAS, J.F. GIUDICELLI, C. RICHER-GUIDICELLI u. P. MENETON (2002): Cardiovascular phenotypes of Kinin B2 receptor- and tissue Kallikrein-deficient mice. Hypertension 40, 90-95 TRAUTMANN, A., u. A. MARTY (1984): Activation of Ca-dependent K channels by carbamoylcholine in rat lacrimal glands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 611-615 TSENG-CRANK, J., C.D. FOSTER, J.D. KRAUSE, R. MERTZ, N. GODINOT, T.J. DICHIARA u. P. REINHART (1994): Cloning, expression, and distribution of functionally distinct Ca2+-activated K+ channel isoforms from human brain. Neuron 13, 1315-1330 TSENG-CRANK, J., N. GODINOT, T.E. JOHANSEN, P.K. AHRING, D. STRÖBAEK, R. MERTZ, C.D. FOSTER, S.P. OLESEN U. P.H. REINHART (1996): Cloning, expression, and distribution of a Ca2+-activated K+ channel β-subunit from human brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9200-9205 VALVERDE, M.A., P. ROJAS, J. AMIGO, D. COSMELLI, P. ORIO, M.I. BHAMONDE, G. MANN, C. VERGARA u. R. LATORRE (1999): Acute activation of Maxi-K channels (hSlo) by estradiol binding to the β subunit. Science 285, 1929-1931 VASSILEV, P.M., M.V. KANAZIRSKA, S.J. QUINN, D.L. TILLOTSON u. G.H. WILLIAMS (1992): K+ channels in adrenal zona glomerulosa cells. I. characterization of distinct channel types. Am. J. Physiol. 263, E752-759 VERGARA, C., R. LATORRE, N.V. MARRION u. J.P. ADELMANN (1998): Calcium-activates potassium channels. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 321-329 VERLANDER, J.W., K.A. HASSELL, I.E. ROYAUX, D.M. GLAPION, M.E. WANG, L.A. EVERETT, E.D. GREEN u. S.M. WALL (2003): Deoxycorticosterone upregulates PDS (Slc26a4) in mouse kidney. Role of Pendrin in mineralocorticoid-induced hypertension. Hypertension 42, 356-362 VERREY, F., J. LOFFING, M. ZECEVIC, D. HEITZMANN u. O. STAUB (2003): SGK1: aldosteron-induced relay of Na+ transport regulation in distal kidney nephron cells. Cell. Physiol. Biochem. 13, 21-28
135
Literaturverzeichnis
VERREY, F., V. SUMMA, D. HEITZMANN, D. MORDASINI, A. VANDEWALLE, E. FERAILLE u. M. ZECEVIC (2003): Short-term aldosterone action on Na,K-ATPase surface expression. Role of aldosterone-induced SGK1? Ann. N.Y. Acad. Sci. 986, 554-561 VINSON, G.P., J.P. HINSON u. P.W. RAVEN (1985): The relationship between tissue preparation and function; methods for the study of control of aldosterone secretion: a review. Cell Biochem. Funct. 3, 235-253 VINSON, G.P., u. M.M. HO (1998): The adrenal renin/angiotensin system in the rat. Horm. Metab. Res. 30, 355-359 VIRDIS, A., M. FRITSCH NEVES, F. AMIRI, E. VIEL, R.M. TOUYZ u. E.L. SCHIFFRIN (2002): Spironolactone improves angiotensin-induced vascular changes and oxidative stress. Hypertension 40, 504-510 VOGALIS, F., T. VINCENT, I. QURESHI, F. SCHMALZ, M.W. WARD, K.M. SANDERS u. B. HOROWITZ (1996): Cloning and expression of the large-conductance Ca2+-activated K+ channel from colonic smooth muscle. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 271, G629-G639 WAGNER, C., B.L. JENSEN, B.K. KRAMER u. A. KURTZ (1998): Control of the renal renin system by local factors. Kidney Int. Suppl. 67, S78-83 WALLNER, M., P. MEERA u. L. TORO (1996): Determinant for β-subunit regulation in high-conductance voltage-activated and Ca2+-sensitive K+ channels: An additional transmembrane region at the N terminus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14922-14927 WALLNER, M., P. MEERA u. L. TORO (1999). Molecular basis of fast inactivation in voltage and Ca2+-activated K+ channels: A transmembrane β-subunit homolog. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4137-4142 WANNER, S.G., R.O. KOCH, A. KOSCHAK, M. TRIEB, M.L. GARCIA, G.J. KACZOROWSKI u. H.G. KNAUS (1999): High-conductance calcium-activated potassium channels: pharmacology, distribution, and subunit composition. Biochemistry 38, 5392-5400
136
Literaturverzeichnis
WEBER, K.T., Y. SUN, L.A. WODI, A. MUNIR, E. JAHANGIR, R.A. AHOKAS, I.C. GERLING, A.E. POSTLETHWAITE u. K.J. WARRINGTON (2003): Toward a broader understanding of aldosterone in congestive heart failure. J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst. 4, 155-163 WELLMAN, G.C., L. CARTIN, D.M. ECKMAN, A.S. STEVENSON, C.M. SAUNDRY, W.J. LEDERER u. M.T. NELSON (2001): Membrane depolarization, elevated Ca2+ entry, and gene expression in cerebral arteries of hypertensive rats. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H2559-H2567 WILSON, P.W. (1999): From hypertension to heart failure: what have we learned? Clin. Cardiol. 22(Suppl.V), 1-10 XIA, X.M., B. FAKLER, A. RIVARD, G. WAYMAN, T. JOHNSON-PAIS, J.E. KEEN, T. ISHII, B. HIRSCHBERG, C.T. BOND, S. LUTSENKO, J. MAYLIE u. J.P. ADELMANN (1998): Mechanism of calcium gating in small-conductance calcium-activated potassium channels. Nature 395, 503-507 XIA, X.M., X. ZENG u. C.J. LINGLE (2002): Multiple regulatory sites in large-conductance calcium-activated potassium channels. Nature 418, 880-884 YAMAKI, F., M. KAGA, T. HORINOUCHI, H. TANAKA, K. KOIKE, K. SHIGENOBU, L. TORO u. Y. TANAKA (2001): MaxiK channel-mediated relaxation of guinea-pig aorta following stimulation of IP receptor with beraprost via cyclic AMP-dependent and -independent mechanism. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. 364, 538-550
137
Anhang
9 Anhang
Ergebnisse der in vitro Inkubationsversuche
138
Anhang
139
Anhang
140
Anhang
141
Anhang
142
Anhang
143
Anhang
144
Danksagung Herrn Prof. Dr. H. Ehmke danke ich herzlich für die Überlassung des interessanten Themas und für seine freundliche und motivierende Unterstützung bei allen Problemen, die zu überwinden waren. Mein Dank gilt ebenso Herrn Prof. Dr. H. Hackbarth für die Übernahme dieser Arbeit zur Vorlage beim Fachbereich der Tierärztlichen Hochschule Hannover und für seine engagierte Beratung bei der Anfertigung der Dissertationsschrift. Herrn Dr. Jörg Faulhaber danke ich ganz besonders für die umfassende und immer hilfsbereite Betreuung bei der Durchführung der Experimente und der Anfertigung dieser Arbeit. Vielen Dank, Jörg, für die verständnisvolle Unterstützung auf allen Ebenen. Sehr herzlich möchte ich mich bei Herrn Dr. Michael Blank für seine kompetente und uneigennützige Hilfe bei zahlreichen technischen und privaten Problemen bedanken. Ohne seine Interventionen hätte ich den Kampf gegen den Computer hoffnungslos verloren. Obwohl ihm die Zeit permanent zwischen den Fingern zerrinnt, hat er sich für mich immer Zeit genommen und mir den Freiraum für die Fertigstellung dieser Arbeit geschaffen. Frau Kornelia Anders danke ich für die freundliche Aufnahme in den Arbeitskreis und die Unterstützung bei anfallenden Analysen im Labor. Bei allen Mitarbeitern des Instituts für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf sowie meinen Freundinnen möchte ich mich für die Hilfsbereitschaft und die netten Stunden abseits des Laboralltags bedanken. Mein ganz besonderer Dank gilt allerdings meinen Eltern für die liebevolle Anteilnahme und Unterstützung, die es mir ermöglichten, mein Studium und die Promotion zu absolvieren. Vielen Dank für diesen Rückhalt, aus dem ich häufig die Kraft und den Mut geschöpft habe, kleine sowie große Krisen zu überwinden.