Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die...

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Aus dem Institut für Tierschutz und Verhalten (Heim-, Labortiere und Pferde) der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca 2+ -aktivierten Kaliumkanals INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Mareike Kristina Budack aus Hamburg Hannover 2004

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  • Aus dem Institut für Tierschutz und Verhalten

    (Heim-, Labortiere und Pferde)

    der Tierärztlichen Hochschule Hannover

    und

    dem Institut für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie

    des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf

    Untersuchungen zur Blutdruckregulation

    bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der

    β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals

    INAUGURAL-DISSERTATION

    zur Erlangung des Grades einer

    DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

    (Dr. med. vet.)

    durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

    vorgelegt von

    Mareike Kristina Budack

    aus Hamburg

    Hannover 2004

  • Wissenschaftliche Betreuung:

    Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth

    Univ. Prof. Dr. H. Ehmke

    1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth

    2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. B. Schröder

    Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2004

  • Meinen Eltern

  • Vorab veröffentlichte Teilergebnisse dieser Arbeit: BUDACK, M., M.E. BLANK, J. FAULHABER u. H. EHMKE (2003): In vitro Untersuchungen zur Aldosteronfreisetzung an isolierten Nebennieren der Maus. Posterpräsentation der kardiovaskulären Forschung am UKE Hamburg, 14.10.2003 Vorab zur Veröffentlichung eingereichte Teilergebnisse dieser Arbeit:

    FAULHABER, J., M. BUDACK, M.E. BLANK u. H. EHMKE (2004): In vitro determination of aldosterone secretion in isolated mice adrenal glands. 83. Jahreskongress der Deutschen Physiologischen Gesellschaft Leipzig, 14.-17.03.2004, in prep.

  • INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung ................................................................................................................ 11

    2 Literaturübersicht ................................................................................................ 13 2.1 Blutdruckregulation ..................................................................................................

    13 2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ................................................................ 15

    2.1.1.1 Aldosteron .............................................................................................................. 17 2.1.1.2 Hyperaldosteronismus ............................................................................................ 22

    2.2 Ionenkanäle ................................................................................................................ 24 2.2.1 Kaliumkanäle ............................................................................................................... 24

    2.2.1.1 Ca2+-aktivierter K+-Kanal ...................................................................................... 27 2.2.1.1.1 SK-Kanal ....................................................................................................... 27 2.2.1.1.2 IK-Kanal ........................................................................................................ 28 2.2.1.1.3 BK-Kanal ...................................................................................................... 29 2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle

    auf die Blutdruckregulation .......................................................................... 37 2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung ............................................................................ 40

    3 Material und Methode ........................................................................................ 41 3.1 Material ....................................................................................................................... 41 3.1.1 Lösungen und Puffer .................................................................................................... 41

    3.1.1.1 Nebenniereninkubation .......................................................................................... 41 3.1.1.2 Gelelektrophorese .................................................................................................. 42

    3.1.2 Chemikalien und Enzyme ............................................................................................ 43 3.2 Versuchstiere .............................................................................................................. 44 3.2.1 Versuchsserien und Stichprobenumfang ...................................................................... 45 3.3 Methoden .................................................................................................................... 47 3.3.1 Genotypisierung der Mäuse ......................................................................................... 47

    3.3.1.1 Lysierung der Ohrprobe ......................................................................................... 47 3.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion .................................................................................... 48 3.3.1.3 Gelelektrophorese .................................................................................................. 49

    3.3.2 Hämodynamische Untersuchungen an wachen Mäusen .............................................. 50 3.3.2.1 Katheterherstellung ................................................................................................ 50 3.3.2.2 Operative Katheterimplantation ............................................................................. 50 3.3.2.3 Blutdruckmessung .................................................................................................. 53

    3.3.3 Spironolactonapplikation ............................................................................................. 55 3.3.4 Bestimmung von Blutparametern ................................................................................ 56

    3.3.4.1 Blutabnahme .......................................................................................................... 56 3.3.4.1.1 Blutabnahme für die Elektrolyt-/ Kreatininbestimmung .............................. 56 3.3.4.1.2 Blutabnahme für die Renin-/ Aldosteronbestimmung .................................. 56

  • 3.3.4.2 Analyse .................................................................................................................. 58 3.3.4.2.1 Natrium und Kalium ........................................................................................ 58 3.3.4.2.2 Chlorid ............................................................................................................. 58 3.3.4.2.3 Kreatinin .......................................................................................................... 59 3.3.4.2.4 Renin ............................................................................................................… 59 3.3.4.2.5 Aldosteron ........................................................................................................ 60

    3.3.5 Morphometrische Untersuchungen .............................................................................. 62 3.3.6 Inkubation von Nebennieren in vitro ........................................................................... 63

    3.3.6.1 Organentnahme und Präparation ............................................................................ 63 3.3.6.2 Inkubation .............................................................................................................. 63

    3.3.6.2.1 Vorversuche ..................................................................................................... 64 3.3.6.2.2 Kaliumstimulation ............................................................................................ 65 3.3.6.2.3 ANG II-Stimulation .....................................................................................… 66 3.3.6.2.4 ACTH-Stimulation .......................................................................................... 67

    3.3.7 Statistik ........................................................................................................................ 68

    4 Ergebnisse ............................................................................................................... 69 4.1 Genotypisierung ......................................................................................................... 69 4.2 Versuchsserie 1 und 2 ................................................................................................ 71 4.2.1 Hämodynamische Daten .............................................................................................. 71 4.2.2 Morphometrische Daten .............................................................................................. 72 4.2.3 Ergebnisse der Blutuntersuchungen ............................................................................ 74

    4.2.3.1 Elektrolyte und Kreatinin ...................................................................................... 74 4.2.3.2 Renin ...................................................................................................................... 75 4.2.3.3 Aldosteron .............................................................................................................. 76

    4.3 Versuchsserie 3 ........................................................................................................... 77 4.3.1 Hämodynamische Daten .............................................................................................. 77 4.3.2 Morphometrische Daten ............................................................................................... 78 4.4 Versuchsserie 4 ........................................................................................................... 79 4.4.1 Vorversuch ................................................................................................................... 80 4.4.2 Kaliumstimulation ........................................................................................................ 81

    4.4.2.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 81 4.4.2.2 Stimulation mit Kalium .......................................................................................... 82

    4.4.3 ANG II-Stimulation ..................................................................................................... 84 4.4.3.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 84 4.4.3.2 Stimulation mit ANG II ......................................................................................... 85

    4.4.4 ACTH-Stimulation ....................................................................................................... 88 4.4.4.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 88 4.4.4.2 Stimulation mit ATCH ......................................................................................…. 89

    5 Diskussion ................................................................................................................ 92

    6 Zusammenfassung .............................................................................................. 108

  • 7 Summary ................................................................................................................ 111

    8 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 114

    9 Anhang ................................................................................................................... 138

  • VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN A. Arterie

    Abb. Abbildung

    ACTH Adrenocorticotropeshormon

    ANG II Angiotensin II

    AT1 Angiotensin-Rezeptor Typ 1

    AT2 Angiotensin-Rezeptor Typ 2

    BK-Kanal big conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal

    bp Basenpaare

    BSA Bovines Serumalbumin

    BW Körpergewicht

    °C Grad Celsius

    cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

    cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

    cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat

    cm Zentimeter

    C-Terminus Carboxyterminus von Proteinen bzw. Peptiden

    dl Deziliter

    DNA Desoxyribonukleinsäure

    dNTP 2´-Desoxyribonukleotid-5´-triphosphat

    ED50 50% der Effektiven Dosis

    EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure

    et al. et alii (und weitere)

    Fa. Firma

    g Gramm

    h Stunde

    HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino)-ethansulfonsäure

    HGW Herzgewicht

    H2O Wasser

    HZV Herzzeitvolumen

    I.D. Innendurchmesser

    I.E. Internationale Einheiten

  • IK-Kanal intermediate conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal

    in prep. in preparationem (in Vorbereitung)

    i.p. intraperitoneal

    Kap. Kapitel

    kb Kilobasenpaare

    kg Kilogramm

    KGW Körpergewicht

    Kir einwärts gleichrichtender Kaliumkanal

    KO Knockout Maus

    Kv spannungsabhängiger Kaliumkanal

    l Liter

    Lig. Ligamentum

    LV linker Ventrikel

    M molar

    MAD mittlerer arterieller Blutdruck

    mg Milligramm

    min Minute

    MJ Megajoule

    ml Milliliter

    mm Millimeter

    mM millimolar

    mosmol Milliosmol

    MW Mittelwert

    µg Mikrogramm

    µl Mikroliter

    n Anzahl

    ng Nanogramm

    nm Nanometer

    nM nanomolar

    N. Nervus

    NO Stickoxid

    N-Terminus Aminoterminus von Proteinen bzw. Peptiden

    O.D. Aussendurchmessser

    PBS phosphatgepufferte Salzlösung

  • PCR Polymerase-Kettenreaktion

    pg Picogramm

    PGI2 Prostaglandin I2 (Prostacyclin)

    PKA Proteinkinase A (cAMP-abhängig)

    PKC Proteinkinase C (Ca2+-abhängig)

    PKG Proteinkinase G (cGMP-abhängig)

    pmol Picomol

    PRC Plasmareninkonzentration

    pS Picosiemens

    ® eingetragenes Warenzeichen

    RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

    RIA Radioimmunoassay

    RT Raumtemperatur

    RV rechter Ventrikel

    s.c. subkutan

    SD Standardabweichung

    SEM Standardfehler des Mittelwerts

    SK-Kanal small conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal

    TAE Tris-Acetat-EDTA

    TBE Tris-Borsäure-EDTA

    TM Transmembransegment

    TPR totaler peripherer Widerstand

    Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

    UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

    UV-Licht ultraviolettes Licht

    V Volt

    V. Vene

    VIP vasoaktives intestinales Peptid

    WT Wildtyp Maus

    x g x-fache Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/sec2)

    ZVD zentral venöser Druck

    Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt.

  • Einleitung

    1 Einleitung

    Die arterielle Hypertonie ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem, von dem 25 % der

    erwachsenen Bevölkerung der Industrieländer betroffen sind (BURT et al. 1995,

    STOWASSER u. GORDON 2003). Trotz der herausragenden Bedeutung des erhöhten

    Blutdrucks als Krankheitsursache ist seine Ätiologie weitgehend unbekannt.

    Durch die Anwendung genetischer Methoden haben sich für die Analyse von Faktoren, die

    an der Entstehung einer Hypertonie beteiligt sind, völlig neue Perspektiven eröffnet. Die

    gezielte Ausschaltung identifizierter Gene ermöglicht es, primäre physiologische

    Mechanismen auch in vivo zu charakterisieren. Tatsächlich hat die Untersuchung seltener

    erblicher Formen von arterieller Hypertonie, bei denen Mutationen einzelner Gene mit

    großen Effekten auf den Blutdruck korreliert sind, wichtige neue Einsichten in fundamentale

    Wege der Blutdruckregulation beim Menschen aufgezeigt (LIFTON et al 2001). Bislang

    konnten mindestens 8 Gene identifiziert werden, bei denen spezifische Fehlfunktionen direkt

    zu einer Hypertonie führen. Bemerkenswert ist hierbei, dass in allen Fällen Genprodukte

    betroffen waren, welche die renale Salzreabsorbtion und Volumenhomöostase beeinflussen.

    Bei einer Reihe von genetischen Veränderungen betraf die pathophysiologische Störung

    direkt die Regulation des Blutdrucks und der Salzhomöostase durch das Renin-Angiotensin-

    Aldosteron-System, z.B. über eine erhöhte Aldosteronsynthese (PASCOE et al. 1992), eine

    gesteigerte Aldosteronsekretionsrate (LIFTON et al. 1992) oder eine veränderte Aldosteron-

    Mineralocorticoidrezeptor-Interaktion (GELLER et al. 1998 u. 2000).

    Die Konzentrationen von Aldosteron im Plasma unterliegen einer strengen physiologischen

    Regulation. Die Aldosteronsekretion wurde in früheren Studien bereits intensiv an in vitro

    kultivierten Zona glomerulosa-Zellen untersucht (HILBERS et al. 1999, LOTSHAW 1997 a,

    b u. 2001). Die Resultate legten nahe, dass die Kontrolle der Aldosteronsekretion vor allem

    über Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration infolge von Membranpotential-

    änderungen erfolgt, wodurch die sekretorische Aktivität der Zona glomerulosa-Zellen

    entscheidend beeinflusst wird. Da die Höhe des Membranpotentials eng an die Aktivität von

    Kaliumkanälen geknüpft ist (NELSON et al. 1995), wurde bereits seit längerem vermutet,

    dass eine Modulation von Kaliumkanälen maßgeblich an der Regulation der

    Aldosteronsekretion beteiligt ist. Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Prof. H. Ekmke

    11

  • Einleitung

    (2003) konnte an akut dissoziierten Zona glomerulosa-Zellen von Wildtyp Mäusen

    tatsächlich ein sehr ausgeprägter spannungs- und calciumabhängiger Kaliumstrom

    nachgewiesen werden, der sich durch Zugabe von 100 nM Iberiotoxin vollständig blockieren

    ließ. Dieser Befund unterstützt die Vorstellung, dass BK-Kanäle an der Regulation der

    Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen beteiligt sein könnten.

    In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende

    Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielen, indem sie einen negativen

    Feedback-Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermitteln (JAGGAR et al.

    2000). Diese Interpretation schien in hervorragender Weise durch den Phänotyp von Mäusen

    bestätigt zu werden, bei denen die β1−Untereinheit genetisch inaktiviert wurde (BRENNER

    et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000). Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde

    geschlussfolgert, dass die arterielle Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz

    des erhöhten Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b,

    STANDEN 2000, PATTERSON et al. 2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher

    Mechanismus wäre von größtem wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich

    hierbei um den erstmaligen Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie

    handeln würde.

    Allerdings könnte der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen auch eine alternative

    Erklärung finden. In Anbetracht der starken funktionellen Expression von BK-Kanälen in

    Zona glomerulosa-Zellen wäre es sehr gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der

    BKβ1−Untereinheit zu einer gestörten Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen,

    dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für

    die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind. Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei

    BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten starken linksventrikulären Hypertrophie (BRENNER

    et al. 2000 b) beitragen.

    Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob BKβ1-/- Mäuse pathologische

    Veränderungen des Aldosteronsystems aufweisen, die für die Entstehung der Hypertonie

    ursächlich verantwortlich sind. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, soll im Rahmen dieser

    Arbeit des Weiteren untersucht werden, ob diese Störung durch eine veränderte Regulation

    der Aldosteronsekretion in den Nebennieren unter Beteiligung der BK-Kanäle verursacht

    wird.

    12

  • Literaturübersicht

    2 Literaturübersicht

    2.1 Blutdruckregulation

    Als Blutdruck wird der in den Gefäßen des Körper- und Lungenkreislaufs herrschende Druck

    bezeichnet, welcher die treibende hämodynamische Kraft für die Blutzirkulation darstellt. Im

    eigentlichen Sinne stellt der mittlere arterielle Blutdruck (MAD) den im arteriellen System

    auf Herzhöhe gegen den Atmosphärendruck gemessenen Druck dar. Dieser wird als Produkt

    des Herzzeitvolumens (HZV) und des totalen peripheren Widerstandes (TPR) zuzüglich des

    zentral venösen Drucks (ZVD) definiert.

    MAD = (HZV x TPR) + ZVD

    Der totale periphere Widerstand ist abhängig von dem Tonus und der Elastizität der

    Gefäßwände, während das Herzzeitvolumen eine Funktion der Herzfrequenz und des

    Schlagvolumens ist.

    Die Regelung des Blutdrucks erfolgt durch Änderung des peripheren Widerstands durch

    Vasodilatation bzw. Vasokonstriktion der Widerstandsgefäße oder durch Veränderung des

    Herzzeitvolumens (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).

    Eine Vielzahl physiologischer Systeme, die humorale, nervöse und metabolische Faktoren

    einschließen, ist an der Blutdruckregulation beteiligt (GUYTON 1991, COWLEY 1992,

    PERSSON 1996). Diese Systeme interagieren in komplexer Wechselwirkung, wodurch eine

    adäquate Durchblutung der peripheren Gewebe sowie die Aufrechterhaltung des MAD

    gewährleistet werden. Anhand des Zeitraums, in welchem die Regulationssysteme wirksam

    werden, können kurzfristige, mittelfristige und langfristige Systeme unterschieden werden.

    Die kurzfristige Blutdruckregulation basiert vor allem auf der Wirkung des vegetativen

    Nervensystems. Die schnellste der nervalen Reaktionen wird durch arterielle

    Pressorezeptoren vermittelt, die in der Gefäßwand des Carotissinus sowie des Aortenbogens

    lokalisiert sind und den Pressorezeptorenreflex auslösen. Diese Mechanorezeptoren

    detektieren den mittleren Blutdruck sowie Schwankungen des systemischen Blutdrucks, der

    Herzfrequenz und der Anstiegssteilheit des Druckpulses anhand einer veränderten

    13

  • Literaturübersicht

    Wandspannung und senden über Afferenzen der IX. und X. Hirnnerven Signale zum Nucleus

    tractus solitarii und Nucleus ambiguus in der dorsalen Medulla oblongata. Über efferente

    sympathische Nervenbahnen erfolgt eine Regulation der Herzfrequenz, der Kontraktilität des

    Herzens und des TPR, wohingegen parasympathische Efferenzen ausschließlich eine

    Reduktion der Herzfrequenz induzieren. Aufgrund dieser Mechanismen werden

    Schwankungen des MAD innerhalb von Sekunden abgepuffert (TIMMERS et al. 2003). In

    Volumenexpansions-Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch eine Ausschaltung des

    Pressorezeptorenreflexes einerseits die schnelle Blutdruckregulation hochgradig gestört war,

    sich andererseits der Blutdruck jedoch innerhalb einer Stunde nach Expansion des

    Blutvolumens mittels Infusion wieder normalisierte (DOBBS et al. 1971). In weiteren

    Experimenten an verschiedenen Säugetierspezies konnte gezeigt werden, dass durch

    Denervierung der Pressorezeptoren eine Hypertonie induziert wurde, die jedoch innerhalb

    von 7-14 Tagen wieder kompensiert wurde (COWLEY et al. 1973, ITO u. SCHER 1978,

    SHADE et al. 1990). Diese Normalisierung des Blutdrucks wurde durch andere, verzögert

    wirkende Kontrollmechanismen ausgelöst.

    So greift nach einigen Minuten das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) in die

    Blutdruckregulation ein und zählt neben der Volumenverschiebung zwischen den Kapillaren

    und dem extravasalen Raum, dem Kinin-Kallikrein-System (RHALEB et al. 2001,

    TRABOLD et al. 2002) sowie parakrinen Faktoren (RUSKOAHO et al. 1997) zu den

    wichtigsten mittel- bis langfristig wirkenden Regulationsmechanismen (GUYTON 1991).

    Die dominierende Rolle der Niere bei der langfristigen Blutdruckregulation konnte in

    klinischen und experimentellen Studien gezeigt werden (COWLEY u. ROMAN 1996).

    Infolge von Schwankungen des Perfusionsdrucks der Niere erfolgt eine Regulation der

    Wasser- und Natriumausscheidung, woraus eine Veränderung des Blutvolumens resultiert

    (GUYTON 1992). Ebenso bestätigen die Ergebnisse von Nierentransplantationsstudien die

    wichtige Rolle der Niere bei der Langzeitregulation des arteriellen Drucks und der

    Pathogenese genetischer Formen der arteriellen Hypertonie. So konnte gezeigt werden, dass

    es bei der Transplantation der Niere einer genetisch hypertensiven Ratte in eine

    histokompatible normotensive Ratte zur Auslösung einer arteriellen Hypertonie kommt

    (GRAF et al. 1993, RETTIG 1993). Bei Transplantation der Niere einer normotensiven Ratte

    in eine bilateral nephrektomierte spontan hypertensive Ratte (SHR) konnte ein gesenkter

    Blutdruck in der Empfängerratte festgestellt werden (PATSCHAN et al. 1997).

    14

  • Literaturübersicht

    2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

    Das systemische Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ist von zentraler Bedeutung

    für die mittel- bis langfristige Blutdruckregulation und die Homöostase des Wasser- und

    Elektrolythaushalts des Organismus. Die Peptidase Renin wird in den Epitheloidzellen des

    juxtaglomerulären Apparats der Niere synthetisiert (BARAJAS 1979). Die Sekretion von

    Renin aus den Epitheloidzellen wird durch unterschiedliche Stimuli induziert. So wird die

    Reninfreisetzung durch Abnahme des Nierenperfusionsdrucks, durch Verringerung der Na+-

    Konzentration im proximalen Teil des distalen Tubulus (Macula densa) und durch eine

    gesteigerte Sympathikusaktivität stimuliert. Die Reninsekretion unterliegt außerdem der

    Kontrolle durch humorale Faktoren einschließlich Angiotensin II (ANG II), NO, Endothelin

    und Steroidhormonen (TAUGNER et al. 1984, WAGNER et al. 1998). Spezielle Second

    messenger wie cAMP (Steigerung der Reninsekretion), Ca2+ und Proteinkinase C (Hemmung

    der Reninsekretion) sowie cGMP (Steigerung/Hemmung der Reninsekretion) vermitteln

    unter anderem auf zellulärer Ebene die Signalweiterleitung (FRIIS et al. 2002).

    Renin spaltet aus dem von der Leber synthetisierten und ins Plasma freigesetzte

    Angiotensinogen das Dekapeptid Angiotensin I ab. Dieses wird unter Abspaltung zweier

    Aminosäuren durch das ubiquitär vorkommende Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) in

    das stark biologisch aktive Oktapeptid ANG II umgewandelt (siehe Abb. 1).

    15

  • Literaturübersicht

    Angiotensinogen (452 AS)

    Angiotensin I (10 AS)

    Angiotensin II (8 AS)

    AT1 AT2

    ACE

    Renin

    • Zelldifferenzierung • Hemmung der

    Proliferation • Blutdruckregulation

    • Vasokonstriktion • Aldosteronfreisetzung • Kardiale Kontraktilität • Catecholaminfreisetzung • Kardiale u. vaskuläre

    Hypertrophie • Aufrechterhaltung der GFR • Steigerung der Na+-Resorption

    Abbildung 1: Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). AS: Aminosäure; ACE: Angiotensin-Converting-Enzym; AT1: Angiotensin-Rezeptor Typ 1; AT2: Angiotensin-Rezeptor Typ 2; GFR: glomeruläre Filtrationsrate

    Die Wirkungen von ANG II werden über die G-Protein-gekoppelten AT1- und AT2-

    Rezeptoren vermittelt. Bei Nagetieren konnten 2 Isoformen des AT1-Rezeptors, AT1a- und

    AT1b-Rezeptor, identifiziert werden. Die Rezeptoren sind an der Plasmamembran von Zellen

    kardiovaskulärer, endokriner und endothelialer Organe lokalisiert (KASCHINA u. UNGER

    2003). Der AT1a-Rezeptor ist unter anderem an der peripheren Vasokonstriktion, der

    Hypertrophie glatter Muskulatur, der renalen Salz- und Wasserresorption und an der

    zentralen Blutdruckregulation beteiligt. Der AT1b-Rezeptor wird unter anderen in endokrinen

    Organen wie der Nebenniere und der Hypophyse sowie in mesangialen und

    juxtaglomerulären Zellen exprimiert und ist beispielsweise an der Regulation der

    Aldosteronsekretion in den Nebennieren beteiligt (KASCHINA u. UNGER 2003). Der AT2-

    16

  • Literaturübersicht

    Rezeptor ist für die fetale Entwicklung, die Zelldifferenzierung, die Apoptose und

    Regeneration von Gewebe sowie die Blutdruckregulation wichtig (CAREY et al. 1999).

    Neben dem klassischen systemischen, endokrinen System, bei dem alle Komponenten des

    RAA-Systems in der Blutbahn zirkulieren und so zu den Zielorganen transportiert werden,

    sind in den letzten Jahren lokale Systeme in verschiedenen Organen einschließlich Gehirn,

    Herz, Gefäße, Fettgewebe, Niere und Nebenniere beschrieben worden (PHILLIPS et al.

    1993). Die physiologische Bedeutung und die gewebsspezifische Regulation dieser lokalen

    Renin-Angiotensin-Systeme ist derzeit nur unvollständig bekannt. Untersuchungen stützen

    jedoch die Hypothese, dass diese lokalen Systeme unter anderem eine pathogenetische Rolle

    bei der Entwicklung bestimmter Hypertonieformen und Nephropathien spielen sowie an den

    Hypertonie-assoziierten Endorganschäden beteiligt sind (PINTO et al. 1997, LUFT et al.

    1999, PARK et al. 2003).

    2.1.1.1 Aldosteron

    Aldosteron gehört zu den Steroidhormonen mit 21 C-Atomen und wird aufgrund seiner

    speziellen Wirkung auf den Elektrolythaushalt als Mineralocorticoid bezeichnet.

    Aldosteron wird in den Nebennieren synthetisiert, welche morphologisch in die

    Rindenschicht (cortex) und das Mark (medulla) unterteilt werden. In der Rindenschicht

    lassen sich histologisch drei Zonen differenzieren: die äußere Zona glomerulosa, in der

    Aldosteron produziert wird, die Zona fasciculata als Produktionsregion der Glucocorticoide

    sowie die innen gelegene Zona reticularis, in der vor allem Androgene synthetisiert werden.

    In der einheitlich strukturierten Medulla werden die Catecholamine Adrenalin und

    Noradrenalin produziert (DUNN 1970, BLAND et al. 2003).

    Wie alle Steroidhormone wird Aldosteron über Zwischenprodukte aus Cholesterol als

    Ausgangssubstrat synthetisiert (siehe Abb. 2). Über die Substrate Pregnenolon und

    Progesteron entsteht 11-Desoxycorticosteron, aus welchem sowohl Corticosteron als auch

    Aldosteron gebildet werden kann. Entscheidend für die Differenzierung in Corticosteron

    bzw. Aldosteron sind zwei Enzyme, welche die letzten Syntheseschritte katalysieren und

    eine spezifische Lokalisation in der Nebenniere aufweisen. Die 11β-Hydroxylase

    CYP11B1 (auch P450c11 genannt) wird in Zellen der Zona fasciculata exprimiert und

    17

  • Literaturübersicht

    vermittelt die Bildung der wichtigsten Glucocorticoide Corticosteron und Cortisol. Im

    Gegensatz dazu kommt die Aldosteronsynthase CYP11B2 (auch P450aldo genannt)

    ausschließlich in Zona glomerulosa-Zellen vor und katalysiert die drei letzten

    Aldosteronsyntheseschritte (MULLER 1998).

    Cholesterol

    11-Desoxycorticosteron (DOC)

    17-OH-PregnonolonPregnenolon

    Side chaincleavage enzyme

    (CYP11A)

    17α−Hydroxylase

    17-OH-ProgesteronProgesteron

    11-Desoxycortisol

    3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (CYP17)

    21-Hydroxylase (CYP21)

    Aldosteron Corticosteron Cortisol

    Corticosteron

    11β-Hydroxylation

    18-Hydroxylation

    18-Oxidation

    Corticosteron

    18-Hydroxy-corticosteron

    Ald

    oste

    rons

    ynth

    ase

    (CY

    P11B

    2)(P

    450a

    ldo)

    11β-Hydroxylase (C

    YP11B

    1)(P450c11)

    11β-Hydroxylation

    ACTH (kurzfristig), ANG II, K +

    ANG II, K +

    ACTH (langfristig)

    Abbildung 2: Syntheseschritte und Regulatoren der Aldosteronproduktion.

    Die Aldosteronproduktion unterliegt einem multifaktoriellen Kontrollsystem, durch

    welches die Plasmaaldosteronkonzentration an akute und chronische Veränderungen des

    Wasser- und Elektrolythaushalts angepasst wird. Neben den wichtigen Regulatoren ANG II

    18

  • Literaturübersicht

    und der extrazellulären Kaliumkonzentration (VINSON et al. 1985, LOTSHAW 2001,

    PEARCE et al. 2003) kontrollieren zahlreiche weitere Substanzen einschließlich

    Adrenomedullin (NUSSDORFER et al. 1997), Vasopressin (GALLO-PAYET u.

    GUILLON 1998) und Prolactin (GLASOW et al. 1996) die Aldosteronproduktion. In

    diversen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass ergänzend zu dem systemischen

    ANG II das lokale Renin-Angiotensin-System der Nebennierenrinde einen bedeutenden

    Stimulus der Aldosteronproduktion darstellt (HILBERS et al. 1999, MAZZOCCHI et al.

    2000). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnten alle Komponenten des Renin-

    Angiotensin-Systems in den Zellen der Zona glomerulosa nachgewiesen werden

    (MULROW 1999).

    ACTH, der dominierende Regulator der Glucocorticoidproduktion, bewirkt hingegen nur

    eine zeitlich begrenzte Stimulation und wirkt über längeren Zeitraum inhibierend auf die

    Aldosteronproduktion (LUMBERS 1999, SEWER u. WATERMAN 2003). In zahlreichen

    Experimenten an isolierten Nebennierenzellen und Nebennierenstücken konnten weitere

    Faktoren identifiziert werden, die einen modulierenden Einfluss auf die

    Aldosteronsekretion ausüben. Hierzu gehören unter anderem Endothelin (ROSOLOWSKY

    u. CAMPBELL 1990), Stickoxid (HANKE u. CAMPBELL 2000), das atriale natriuretische

    Peptid (ATARASHI et al. 1985) und Veränderungen der extrazellulären Osmolalität

    (MAKARA et al. 2000).

    Die Regulation der Aldosteronsekretion auf zellulärer Ebene erfolgt über verschiedene

    Signalkaskaden. So wird die ACTH-Wirkung über cAMP und die Stimulierung mittels

    ANG II unter anderem durch den Phosphatidylinositolmechanismus vermittelt (SPÄT

    1988, SPÄT et al. 1991). Intensive in vitro Untersuchungen unterstreichen jedoch die große

    Bedeutung der intrazellulären Ca2+-Konzentration (siehe Abb. 3). So wird durch einen

    Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration die Aldosteronsekretion stimuliert (SPÄT et

    al. 1991, ROSSIER et al. 1996 a). Der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration

    erfolgt aufgrund einer Aktivierung von T- und L-Typ Ca2+-Kanälen (ROSSIER et al. 1996

    b) und nichtselektiven Kationenkanälen (LOTSHAW u. LI 1996) sowie durch Freisetzung

    von Ca2+ aus intrazellulären Calciumspeichern (BARRETT et al. 1989). Die

    spannungsabhängigen T- und L-Typ Ca2+-Kanäle werden durch Membrandepolarisation

    unter anderem infolge eines Anstiegs der extrazellulären K+-Konzentration aktiviert und,

    wie Untersuchungen zeigten, durch ANG II in ihrer Funktion moduliert (CHEN et al. 1999

    19

  • Literaturübersicht

    b). Da die Höhe des Membranpotentials eng mit der Aktivität von Kaliumkanälen

    korreliert, wurde bereits seit längerem vermutet, dass eine Modulation von Kaliumkanälen

    durch Änderung der extrazellulären Kaliumkonzentration und/oder ANG II maßgeblich an

    der Regulation der Aldosteronsekretion beteiligt sein könnte. Trotz zahlreicher

    Untersuchungen und des Nachweises einer Reihe von Kaliumkanaluntereinheiten in Zellen

    der Zona glomerulosa konnte jedoch bis heute kein Konsens hinsichtlich ihrer Relevanz für

    die Aldosteronsekretion herbeigeführt werden (BRAUNEIS et al. 1991, VASSILEV et al.

    1992, PAYET et al. 1995, LOTSHAW 1997 a, b).

    ANG II

    ACTHCa 2+

    (AT1b-Rezeptor)

    IP3

    Ca2+Ca2+ Ca2+Ca 2+

    K+Ca 2+

    Ca 2+

    DAG

    PKCCalmodulin

    CaMK

    (ACTH-Rezeptor)

    Ca 2+ATPcAMP

    Aldosteronsynthese

    Ca 2+

    (T-typCa2+-Kanal)

    PKA

    (G-Protein)

    (NSCC)

    Abbildung 3: Schematische Darstellung der zellulären Signalkaskade bei

    Stimulation der Aldosteronsekretion durch K+, ANG II und ACTH. NSCC: nichtselektiver Kationenkanal; PKA: Proteinkinase A; PKC: Proteinkinase C; IP3: Inositoltriphosphat; DAG: Diacylglycerol; ATP: Adenosintriphosphat; cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; CaMK: Ca2+/Calmodulinabhängige Proteinkinase.

    20

  • Literaturübersicht

    Seit langem ist die essentielle Bedeutung von Aldosteron für die Homöostase des Wasser-

    und Elektrolythaushaltes bekannt, welche in neueren Untersuchungen an transgenen

    Mäusen eindrucksvoll bestätigt wurde (BERGER et al. 1998). So besteht die wichtigste

    systemische Funktion des Aldosterons in der Steigerung des transepithelialen

    Ionentransports (insbesondere für Na+, K+ und Cl-) vor allem in der Niere, jedoch auch dem

    Kolon, den Speicheldrüsen und den Schweißdrüsen. Hieraus resultiert eine Veränderung

    der Ionenkonzentration im Plasma sowie des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens und des

    Blutdrucks (PEARCE et al. 2003). In der Niere führt Aldosteron in den distalen

    Tubulusabschnitten zu einer funktionellen Aktivierung des Epithelialen Natriumkanals

    „ENaC“ (CHEN et al. 1999 a, ROSSIER et al. 2002, KAMYNINA u. STAUB 2002), der

    Na+/K+-ATPase (VERREY et al. 2003), des Na+/Cl--Cotransporter (ABDALLAH et al.

    2001) und des Cl-/Anionen-Austauscher „Pendrin“ (VERLANDER et al. 2003).

    Durch zahlreiche Untersuchungen konnten darüber hinaus Mineralocorticoidrezeptoren in

    nicht-epithelialen Geweben einschließlich Blutgefäßen und Herz identifiziert werden

    (MOGUILEWSKY u. RAYNAUD 1980, COIRINI et al. 1983, GOMEZ-SANCHEZ 1997,

    BARBATO et al. 2002). Durch verschiedene Arbeitsgruppen wurde die Hypothese

    gefestigt, dass Aldosteron auch in den Blutgefäßen regulierend an dem zellulären

    Elektrolyttransport beteiligt ist (ALZAMORA et al. 2003, JIANG et al. 2003). Die

    Wirkung von Aldosteron auf kardiale Zellen unter physiologischen Bedingungen ist bis

    heute jedoch nicht zweifelsfrei geklärt. Im Gegensatz hierzu konnte deutlich gezeigt

    werden, dass Aldosteron in die Pathogenese von kardialen Erkrankungen einschließlich

    Herzhypertrophie und –fibrose sowie Arrhythmien involviert ist und auch ein lokales,

    kardiales Aldosteronsystem an dem Krankheitsgeschehen beteiligt ist (DELCAYRE et al.

    2000, WEBER et al. 2003). Durch pharmakologische Untersuchungen mit

    Aldosteronrezeptor-Antagonisten wie Spironolacton und Eplerenon sowie durch

    experimentelle Studien an transgenen Mausmodellen konnte diese Hypothese untermauert

    werden (ROCHA et al. 2000, DELYANI et al. 2001, OESTREICHER et al. 2003, STIER

    et al. 2003).

    21

  • Literaturübersicht

    2.1.1.2 Hyperaldosteronismus

    Hyperaldosteronismus ist eine Erkrankung, die durch eine gesteigerte Sekretion des

    Mineralocorticoids Aldosteron verursacht wird und mit spezifischen Symptomen

    einhergeht. Anhand der Ätiologie werden ein primärer (adrenaler) und ein sekundärer

    (extraadrenaler) Hyperaldosteronismus unterschieden.

    Der primäre Hyperaldosteronismus wird neben der erhöhten Aldosteronproduktion in der

    Regel durch Hypertonie, Hypokaliämie und in vielen Fällen durch eine Hypernatriämie

    charakterisiert (EDER u. GEDIGK 1990). Die Hypokaliämie kann klinische Symptome wie

    Muskelschwäche, Muskelkrämpfe, Obstipation und EKG-Veränderungen verursachen.

    Weiterhin kann sich infolge der Hypokaliämie eine metabolische Alkalose entwickeln

    (NUSSBERGER 2003, MELBY 1989).

    Auf zellulärer Ebene werden die Folgen des Hyperaldosteronismus in erster Linie durch

    eine Funktionssteigerung des Epithelialen Natriumkanals im distalen Tubulussystem

    hervorgerufen (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Durch zahlreiche Arbeitsgruppen

    konnte nachgewiesen werden, dass Aldosteron sowohl eine Aktivierung der vorhandenen

    Kanäle bewirkt als auch eine Steigerung der Expression des Epithelialen Natriumkanals in

    der apikalen Plasmamembran induziert (ROTIN et al. 2001, VERREY et al. 2003).

    Hierdurch erfolgt primär eine verstärkte Reabsorption von Na+ und sekundär, durch

    Zunahme des transepithelialen Potentials, eine Steigerung der transepithelialen Diffusion

    von Cl-. Auf der basolateralen Seite wird durch Aldosteron die Aktivität der Na+/K+-

    ATPase gesteigert, so dass die Natriumionen vermehrt aus den Zellen ins Blut transportiert

    werden. Durch die Aktivität der Na+/K+-ATPase steigt intrazellulär die

    Kaliumkonzentration, wodurch eine erhöhte Sekretion von Kaliumionen durch

    Kaliumkanäle der apikalen Plasmamembran, die ebenfalls direkt durch Aldosteron

    hochreguliert werden, in das Lumen erfolgt (FRINDT et al. 2002). Durch sekundäre

    Steuerungsprozesse erfolgt aufgrund der Elektrolytverschiebung eine Wasserretention,

    welche zu einem erhöhten Blutvolumen und damit verbundener Hypertonie führt.

    In den letzten Jahren konnte durch verschiedene Arbeitsgruppen demonstriert werden, dass

    Hyperaldosteronismus neben den beschriebenen systemischen auch organische

    Veränderungen induzieren kann. So wurde die Beteiligung von Aldosteron bei der

    Entstehung kardialer Hypertrophie und Fibrose, welche unabhängig vom Blutdruckanstieg

    22

  • Literaturübersicht

    entstehen, nachgewiesen (NICOLETTI et al. 1995, FIEBELER et al. 2001, MIHAILIDOU

    et al. 2002). BROWN et al. (2000) stellten des Weiteren einen ätiologischen

    Zusammenhang zwischen der Wirkung von Aldosteron und der Entwicklung von

    Nephrosklerosen fest.

    Das Krankheitsbild des primären Hyperaldosteronismus wurde erstmals von CONN (1955)

    beschrieben und hat als Conn-Syndrom Eingang in die Literatur gefunden. Aktuell gewinnt

    der primäre Aldosteronismus im Zusammenhang mit der Erforschung primärer Hypertonien

    an Bedeutung. Neueren Untersuchungen zufolge soll seine Prävalenz 2,6 bis 11 Prozent in

    Spezialambulanzen betragen und somit eine häufige Ursache arterieller Hypertonien sein

    (REINCKE et al. 2003). Der primäre Hyperaldosteronismus entsteht durch eine gesteigerte

    Aldosteronfreisetzung, die auf pathologische Veränderungen der Nebennieren

    zurückzuführen ist (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Als Folge des erhöhten

    Plasmaaldosteronspiegels wird die Produktion von Renin durch negativen Feedback

    reduziert. Ursachen der gesteigerten Aldosteronfreisetzung können beispielsweise

    aldosteronproduzierende Nebennierenrindentumore, Nebennierenhyperplasien sowie

    verschiedene genetische Defekte sein. In den letzten Jahren konnte eine Reihe von

    genetischen Mutationen identifiziert werden, die zu einem Hyperaldosteronismus führen

    (LIFTON et al. 1992, PASCOE et al. 1992, STOWASSER u. GORDON 2000).

    Die Ätiologie des sekundären Hyperaldosteronismus ist sehr umfangreich. Verschiedene

    Erkrankungen wie Nierenarterienstenosen, chronische Nierenerkrankungen,

    reninproduzierende Tumore, Herzinsuffizienzen und autosomal-rezessiv vererbte renale

    Tubulusstörungen mit Kaliumverlust, das sogenannte „Bartter-Syndrom“, können einem

    sekundären Hyperaldosteronismus zu Grunde liegen (DeGROOT 1989).

    Als Folge der primären Erkrankung kommt es zu einer Stimulation des Renin-Angiotensin-

    Aldosteron-Systems, welche durch eine Steigerung der Plasmarenin- und

    Aldosteronkonzentrationen charakterisiert ist.

    23

  • Literaturübersicht

    2.2 Ionenkanäle

    Alle Zellen des Organismus werden von ihrer Umgebung sowie anderen Zellen durch

    hydrophobe Diffusionsbarrieren, den Membranen, abgegrenzt, durch welche jedoch eine

    Kommunikation mit der Umgebung erfolgen kann. So werden aufgrund von

    Ionenbewegungen durch die Membran wichtige zelluläre Mechanismen wie beispielsweise

    Membranpotentialänderungen und daran gekoppelte physiologische Prozesse vermittelt. Die

    Lipiddoppelschicht der Zellmembran ist jedoch für geladene Teilchen quasi nicht permeabel,

    und so erfolgt der zelluläre Ionenaustausch über verschiedene integrale

    Transmembranproteine. Zu diesen Transportproteinen gehören neben Ionenpumpen, die unter

    Energieverbrauch Ionen entgegen ihres Konzentrationsgefälles transportieren, sogenannte

    Ionenkanäle, welche Ionen entlang ihres Konzentrationsgefälles den Durchtritt durch die

    Plasmamembran per Diffusion ermöglichen. Die meisten dieser Kanäle besitzen aufgrund

    von sogenannten Selektivitätsfiltern extrem unterschiedliche Leitfähigkeiten für spezifische

    Ionen, so dass sie wegen ihrer Selektivität unter anderem in Ca2+-, K+-, Na+- sowie Cl--

    Kanäle eingeteilt werden können. Differenzierte physikalische Eigenschaften ermöglichen

    eine weitere Spezifizierung der Kanäle. So lassen sich mit Hilfe biophysikalischer

    Untersuchungsmethoden die Aktivierungs- und Inaktivierungskinetiken bestimmen sowie

    Regulatoren des Schaltverhaltens und pharmakologische Sensitivitäten identifizieren

    (ASHCROFT 1999, HILLE 2001).

    2.2.1 Kaliumkanäle

    Kaliumselektive Ionenkanäle wurden bis heute in allen Zelltypen nachgewiesen. So werden

    Kaliumkanäle sowohl in erregbaren als auch in nicht-erregbaren Zellen exprimiert und sind

    an zahlreichen physiologischen Mechanismen beteiligt. Dazu gehören unter anderem die

    Kontraktion und Relaxation glatter Muskelzellen, die Weiterleitung von Aktionspotentialen,

    die Sekretion von Insulin, die Homöostase des Salz- und Wasserhaushalts in Nierenzellen,

    die Zellproliferation und in Neuronen die Steuerung elektrischer Erregbarkeit und

    synaptischer Plastizität. Einige Kaliumkanäle sind von Natur aus aktiv, wohingegen jedoch

    die Mehrzahl der Kaliumkanäle durch physiologische Signale (z.B.

    24

  • Literaturübersicht

    Membranpotentialänderung, Second messenger) aktiviert werden (JAN u. JAN 1994).

    Darüber hinaus wird die Sensitivität der Kaliumkanäle gegenüber dem physiologischen

    Signal in vielen Fällen durch Proteinphosphorylierung bzw. -dephosphorylierung moduliert

    (LEVITAN 1999).

    Die meisten Kaliumkanäle setzen sich aus mindestens zwei verschiedenen Untereinheiten

    zusammen, den porenbildenden α-Untereinheiten und β-Untereinheiten, die regulatorische

    Eigenschaften aufweisen. Durch Interaktion von vier α-Untereinheiten entsteht ein tetrameres

    integrales Membranprotein, welches den lipophilen Kanal bildet (ASHCROFT 1999).

    Die Kaliumkanäle werden aufgrund der unterschiedlichen Anzahl von hydrophoben

    Transmembransegmenten (TM) der α-Untereinheiten in zwei umfassende Strukturklassen

    eingeteilt. Die erste Klasse umfasst die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus sechs

    transmembranen Helices besteht (6TM-Klasse). Zu dieser Klasse gehören unter anderem die

    Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanäle (Kv), die KCNQ Kanäle, die Familie der

    Eag Kanäle und die calciumaktivierten Kaliumkanäle (Ca2+-aktivierte K+-Kanäle). Das S4

    Segment der spannungsgesteuerten Kanäle dieser Klasse enthält in regelmäßiger Abfolge

    basische Aminosäuren (v.a. Arginin und Lysin) und fungiert als Spannungsmesser (HILLE

    2001). Bei allen Mitgliedern der 6TM-Klasse befindet sich die Porenregion zwischen den

    Transmembransegmenten S5 und S6 (siehe Abb. 4).

    Zur zweiten großen Klasse gehören die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus zwei

    transmembranen Helices gebildet werden (2TM-Klasse). Der einwärts gleichrichtende

    Kaliumkanal (Kir) ist ein Vertreter dieser Gruppe (ASHCROFT 1999, MILLER 2000).

    Alle bisher bekannten α-Untereinheiten von Kaliumkanälen besitzen mit kleinen Variationen

    die sogenannte Signatursequenz (S) in der Porenregion. Diese Signatursequenz umfasst einen

    Bereich von 21 Aminosäuren und zeigt eine sehr starke Homologie innerhalb der Mitglieder

    der Kaliumkanäle. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Bereich innerhalb der Kanalpore

    einen Selektivitätsfilter für Kaliumionen darstellt (HARTMANN et al. 1991,

    HEGINBOTHAM et al. 1994).

    25

  • Literaturübersicht

    Abbildung 4: Membrantopologie und wichtigste Bestandteile der α-Untereinheit von Kv und Kir. Nummerierung der transmembranen Helices: Kv S1-S6 u. Kir; M1-M2; P = Pore; S = Signatursequenz; N = Aminoterminus; C = Carboxyterminus; T1 = T1 Domäne; die extrazelluläre Seite befindet sich oberhalb der einzelnen Abbildungen.

    In der Regel sind bei den Vertretern beider Klassen sowohl der N-Terminus als auch der C-

    Terminus cytoplasmatisch lokalisiert. Eine Ausnahme bildet der spannungsgesteuerte und

    calciumaktivierte Kaliumkanal großer Leitfähigkeit (BK-Kanal), der ein zusätzliches

    Transmembransegment S0 besitzt, aufgrund dessen der N-Terminus extrazellulär lokalisiert

    ist (MEERA et al. 1997).

    26

  • Literaturübersicht

    2.2.1.1 Ca2+-aktivierter K+-Kanal

    GARDOS demonstrierte an Erythrozyten 1958 als Erster, dass durch Änderung der

    intrazellulären Ca2+-Konzentration der Kaliumfluss durch die Zellmembran reguliert wird.

    Bis heute wurden der Familie der Ca2+-aktivierten K+-Kanälen drei strukturell

    unterschiedliche Kaliumkanäle, die SK-, IK- und BK-Kanäle, zugeordnet, die alle durch

    einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert werden. Anhand ihrer

    Einzelkanalleitfähigkeit lassen sich die drei Subfamilien elektrophysiologisch

    differenzieren (VERGARA et al. 1998). Darüber hinaus besitzen sie unterschiedliche

    Spannungssensitivitäten und reagieren differenziert auf pharmakologisch wirksame

    Substanzen.

    2.2.1.1.1 SK-Kanal (small conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)

    SK-Kanäle besitzen sehr kleine Einzelkanalleitfähigkeiten ≤ 20 pS (in 140 mM

    symmetrischer KCl-Lösung). Im Gegensatz zu den BK-Kanälen werden die SK-Kanäle

    bereits durch nanomolare Ca2+-Konzentrationen spannungsunabhängig aktiviert (Vergara et

    al. 1998, LATORRE et al. 1989). Ca2+ interagiert jedoch nicht direkt mit dem SK-Kanal,

    vielmehr wird die Aktivierung durch Calmodulin vermittelt, welches einen heteromeren

    Komplex mit der α-Untereinheit des Kanals bildet (XIA et al. 1998).

    Mittels Klonierung konnten drei Typen von SK-Kanälen (SK1, SK2 und SK3) identifiziert

    werden, die alle eine große strukturelle Ähnlichkeit mit den Kv-Kanälen aufweisen

    (KÖHLER et al. 1996). Die Unterscheidung der drei SK-Kanäle ist pharmakologisch

    aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber dem Bienengift Apamin möglich

    (GRUNNET et al. 2001).

    SK-Kanäle konnten in zahlreichen erregbaren und nicht-erregbaren Zellen

    (Skelettmuskelzellen, glatte Muskelzellen, Zentrales Nervensystem, chromaffine Zellen der

    Nebenniere, T-Lymphozyten etc.) nachgewiesen werden (GRUNNET et al. 2001). In

    erregbaren Zellen fällt den SK-Kanälen eine fundamentale Rolle bei der Hyperpolarisation

    des Membranpotentials zu. So werden sie durch den Anstieg der intrazellulären Ca2+-

    Konzentration während eines Aktionspotentials aktiviert, was zu einer

    27

  • Literaturübersicht

    Membranhyperpolarisation und damit zu einer Hemmung der Erregbarkeit der Zellen führt

    (VERGARA et al. 1998).

    2.2.1.1.2 IK-Kanal (intermediate conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)

    IK-Kanäle besitzen eine mittlere Einzelkanalleitfähigkeit zwischen 20 und 80 pS. Die IK-

    Kanäle werden genau wie die SK-Kanäle bereits durch nanomolare Ca2+-Konzentration

    spannungsunabhängig aktiviert (LATORRE et al. 1989, VERGARA et al. 1998). Ebenfalls

    vermittelt auch bei den IK-Kanälen Calmodulin die Ca2+-abhängige Aktivierung der Kanäle

    (JOINER et al. 2001).

    IK-Kanäle werden hauptsächlich in nicht-erregbaren Zellen (wie Blut-, Endothel- und

    Epithelzellen) exprimiert, konnten jedoch auch in glatten Muskelzellen nachgewiesen

    werden. In nicht-erregbaren Zellen wird die Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern

    durch verschiedene Substanzen wie beispielsweise Bradykinin, ATP und Histamin,

    induziert (GRYGORCZYK u. SCHWARZ 1983, JENSEN et al. 1998).

    Pharmakologisch lassen sich die IK-Kanäle eindeutig von den SK- und BK-Kanälen

    unterscheiden. So können die IK-Kanäle durch das Skorpiongift Charybdotoxin und das

    Antimykotikum Clotrimazol reversibel blockiert werden. Im Gegensatz zu den BK-

    Kanälen sind sie jedoch insensitiv gegenüber dem Skorpiongift Iberiotoxin. Von den SK-

    Kanälen können sie durch ihre Insensivität gegenüber Apamin differenziert werden (ISHII

    et al. 1997).

    28

  • Literaturübersicht

    2.2.1.1.3 BK-Kanal (big conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)

    Vorkommen und Funktion

    BK-Kanäle (auch als KCNM1, Slo (slowpoke) oder MaxiK+-Kanal bezeichnet) werden

    ubiquitär in Zellen und Geweben mit Ausnahme der Myozyten des Herzens exprimiert

    (TORO et al. 1998). So konnten bis heute BK-Kanäle aus zahlreichen Geweben

    einschließlich Neuronen des zentralen Nervensystems (TSENG-CRANK et al. 1994),

    glatten Muskelzellen (SCORNIK et al. 1993, KNAUS et al. 1994) und renalen

    Tubuluszellen (KNAUS et al. 1995) isoliert und mittels molekularbiologischer Nachweise

    identifiziert werden.

    Die ubiquitäre Verteilung legt nahe, dass die BK-Kanäle an zahlreichen physiologischen

    Mechanismen beteiligt sind. So konnte gezeigt werden, dass die BK-Kanäle unter anderem

    in die Regulation der Sekretion exokriner Drüsen (TRAUTMANN u. MARTY 1984), die

    Regulation des Elektrolyt- und Wasserhaushalts in der Niere und im Kolon (GRUNNET et

    al. 1999, BRAVO-ZEHNDER et al. 2000, HAY-SCHMIDT et al. 2003, PLUZNICK et al.

    2003), die Regulation der Magenmotilität (CARL et al. 1990) und der

    Neurotransmitterfreisetzung in Neuronen (TSENG-CRANK et al. 1996) involviert sind. In

    glatten Muskelzellen übernehmen die BK-Kanäle eine Schlüsselrolle bei der Regulation

    der myogenen Kontraktilität (NELSON et al. 1995).

    Ferner konnte nachgewiesen werden, dass die BK-Kanäle in unmittelbarer Nachbarschaft

    von L-Typ Calciumkanälen und sarkoplasmatischen Calciumspeichern lokalisiert sind und

    als Rückkopplungsmodulatoren dieser Calciumkanäle fungieren. Durch Aktivierung der

    BK-Kanäle erfolgt ein Kaliumauswärtsstrom, infolgedessen eine Hyperpolarisation der

    Plasmamembran mit Inaktivierung der L-Typ Ca2+-Kanäle erfolgt. Dadurch werden die

    zellulären Mechanismen gedämpft, die durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-

    Konzentration und/oder Membrandepolarisation eingeleitet wurden (NELSON et al. 1995).

    29

  • Literaturübersicht

    Molekulare Struktur

    BK-Kanäle bestehen aus hetero-oligomeren Komplexen von Poren-bildenden α-

    Untereinheiten (neue Nomenklatur: KCNM1) sowie assoziierten β-Untereinheiten (neue

    Nomenklatur: KCNMB1-4) mit regulatorischen Eigenschaften (GARCIA-CALVO et al.

    1994, BEHRENS et al. 2000). Essentiell für die Bildung eines funktionellen Kanals ist die

    Assoziation von 4 α-Untereinheiten zu einem tetrameren Proteinkomplex.

    α-Untereinheit

    Die α-Untereinheit wurde zuerst aus der Fliege Drosophila melanogaster (ATKINSON et

    al. 1991) und später aus verschiedenen anderen Spezies einschließlich Mensch kloniert

    (BUTLER et al. 1993, TSENG-CRANK et al. 1994, VOGALIS et al. 1996). Sie wird von

    nur einem Gen kodiert, das jedoch mehrere Splicestellen aufweist (TSENG-CRANK et al.

    1994, KNAUS et al. 1995). Die Splicestellen sind auf dem C-Terminus lokalisiert, welcher

    2/3 der gesamten Länge der Untereinheit einnimmt (ORIO et al. 2002). Die verschiedenen

    Splicevarianten unterscheiden sich hinsichtlich ihrer biophysikalischen und biochemischen

    Eigenschaften, wodurch gewebespezifische Unterschiede in der Regulation und in der

    physiologischen Funktion der BK-Kanäle erklärt werden können (KNAUS et al. 1995).

    Die α-Untereinheit weist eine große Homologie zu der α-Untereinheit der Kv-Kanäle auf.

    Zusätzlich zu den 6 Transmembransegmenten besitzt sie jedoch ein 7.

    Transmembransegment (S0), das dem S1-Segment vorgeschaltet ist. Durch dieses

    zusätzliche Segment verlagert sich der N-Terminus der α-Untereinheiten auf die

    extrazelluläre Seite. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl diese extrazelluläre

    Lokalisation als auch das S0-Segment entscheidend für die Interaktion mit der

    regulatorischen β-Untereinheit ist (WALLNER et al. 1996, MEERA et al. 1997).

    Die α-Untereinheit wird in zwei große Abschnitte unterteilt (siehe Abb. 5): einerseits den

    Kern (core), welcher sich vom N-Terminus bis zur Verbindung zwischen dem S8 und dem

    S9 Segment erstreckt, und anderseits den sich anschließenden Schwanz (tail). Der Kern

    umfasst unter anderem den N-Terminus, den Spannungssensor im S4-Segment und die

    Pore. Im Schwanz sind ein wichtiger Ca2+-Sensor und das Ende des C-Terminus lokalisiert.

    30

  • Literaturübersicht

    Abbildung 5 (ORIO et al. 2002): Molekulare Struktur des BK-Kanals. Topologie der α- und β-Untereinheit.

    Die β-Untereinheit

    Die β-Untereinheiten der BK-Kanäle sind im Gegensatz zu den cytosolisch lokalisierten β-

    Untereinheiten der Kv-Kanäle membranständige Proteine (KNAUS et al. 1994, WALLNER

    et al. 1999, XIA et al. 1999). Sie wurden zuerst von KNAUS et al. (1994) aus Gewebe von

    Rindertracheen isoliert. Bis heute konnten 4 Varianten der β-Untereinheit (β1–β4)

    identifiziert werden, die in chronologischer Reihenfolge nach ihrer Entdeckung nummeriert

    wurden. Die β-Untereinheiten weisen untereinander eine große Homologie auf. Sie besitzen

    zwei homologe membranspannende Segmente, intrazellulär lokalisierte N- und C- Termini

    (siehe Abb. 5) und eine große extrazelluläre Schleife mit zwei Glycosylierungsstellen und

    vier Cysteinloci, welche Disulfidbrücken ausbilden (BRENNER et al. 2000 a, JIANG et al.

    1998). Am N-Terminus befindet sich eine Phosphorylierungsregion für die cAMP-

    abhängige Proteinkinase PKA (CHANG et al. 1997).

    Die vier β-Untereinheiten werden gewebespezifisch unterschiedlich stark exprimiert:

    o Die β1-Untereinheit kommt hauptsächlich in glatten Muskelzellen vor (KNAUS et al. 1994, VOGALIS et al. 1996), konnte jedoch auch im Gehirn (TSENG-CRANK et al.

    31

  • Literaturübersicht

    1996, CHANG et al. 1997) und in Haarzellen von Vögeln (RAMANATHAN et al.

    1999 u. 2000) detektiert werden.

    o Die β2-Untereinheit konnte unter anderem in humanen chromaffinen Zellen und in humanem Hirngewebe nachgewiesen werden (WALLNER et al. 1999, BRENNER et

    al. 2000 b).

    o Die β3-Untereinheit wird in zahlreichen Geweben relativ schwach exprimiert und konnte von BRENNER et al. (2000 a) bei Menschen nur im Hodengewebe in größeren

    Mengen nachgewiesen werden.

    o Die β4-Untereinheit ist die β-Untereinheit mit der geringsten Homologie und wird vor allem im Gehirn in verschiedenen Regionen exprimiert (MEERA et al. 2000).

    Die β-Untereinheiten variieren außerdem in ihrem stoichometrischen Verhalten gegenüber

    der α-Untereinheit. In der Regel wird die β1-Untereinheit in den glatten Muskelzellen im

    Verhältnis 1:1 zu der α-Untereinheit exprimiert (KNAUS et al. 1994), wohingegen im

    Gehirn die α-Untereinheit deutlich häufiger als die β4-Untereinheit vorkommt (CHANG et

    al. 1996, WANNER et al. 1999).

    Durch die β-Untereinheiten wird in außerordentlichem Masse die Ca2+-Sensitivität und die

    Öffnungskinetik der BK-Kanäle moduliert. So konnte mittels elektrophysiologischer

    Untersuchungen gezeigt werden, dass durch die Koexpression der β-Untereinheiten die

    Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der BK-Kanäle verlangsamt und deren Ca2+-

    Sensitivität erhöht wurde (VOGALIS et al. 1996, ORIO et al. 2002, QIAN u. MAGLEBY

    2003). Nur die β2-Untereinheit, welche die Aktivierungszeit des Kanals verkürzt, stellt eine

    Ausnahme dar. Diese Inaktivierung wird durch einen Inaktivierungsball am N-Terminus

    der β2-Untereinheit vermittelt, welcher mit der α-Untereinheit interagiert (WALLNER et

    al. 1999).

    Durch die Koexpression der α- und β-Untereinheit werden außerdem die

    pharmakologischen und biochemischen Eigenschaften sowie die Toxinbindung der BK-

    Kanäle moduliert (HANNER et al. 1997 u. 1998, ORIO et al. 2002, PATTERSON et al.

    2002).

    32

  • Literaturübersicht

    Aktivierung

    BK-Kanäle lassen sich elektrophysiologisch anhand ihrer hohen Einzelkanalleitfähigkeit

    von den vorher beschriebenen SK- und IK-Kanälen unterscheiden. So werden in der

    Literatur Einzelkanalleitfähigkeiten zwischen 100 und 250 pS in symmetrischer KCl-

    Lösung beschrieben (LATORRE et al. 1989). Im Gegensatz zu den IK- und SK-Kanälen

    werden die BK-Kanäle spannungsabhängig durch Membranpotentialänderungen aktiviert.

    Der Spannungssensor ist bei den BK-Kanälen wie bei den KV-Kanälen im S4-Segment

    lokalisiert (DIAZ et al. 1998, SMITH-MAXWELL et al. 1998).

    Durch lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration über 1µM wird die

    Spannungssensitivität moduliert (STEFANI et al. 1997, TORO et al. 1998). So zeigten

    HORRIGAN u. ALDRICH (2002) in sehr umfangreichen Experimenten, dass durch

    Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen die Offenwahrscheinlichkeit der BK-

    Kanäle in Abhängigkeit von dem Membranpotential deutlich vergrößert wird. Bei extrem

    hohen intrazellulären Ca2+-Konzentrationen werden die BK-Kanäle schon bei normalen

    Ruhemembranpotentialen aktiviert (BUTLER et al. 1993). Zwei auf dem C-Terminus

    gelegene Regionen konnten als Bindungsstellen für Ca2+ identifiziert werden: Zum einen

    der sogenannte „Calcium-bowl“, welcher kurz vor dem S10-Segment liegt, und zum

    anderen die Regulatorenregion „RCK“ (regulator of conductance for K+), die zwischen S6

    und S7 lokalisiert wurde. Diese Region dient neben Ca2+ noch weiteren Liganden (z.B.

    Kationen, Nucleotiden) als Bindungsstelle (XIA et al. 2002). Durch PISKOROWSKI u.

    ALDRICH (2002) werden diese Lokalisationen jedoch sehr kontrovers diskutiert, da sie in

    ihren Experimenten zeigen konnten, dass auch nach Entfernung dieser beiden Regionen, die

    Ca2+-Sensitivität des Kanals nicht verändert war, sondern nur das Schaltverhalten

    modifiziert wurde.

    33

  • Literaturübersicht

    Blockade

    Die BK-Kanäle lassen sich von den anderen Mitgliedern der Familie der Ca2+-aktivierten

    K+-Kanäle aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften differenzieren. So sind sie im

    Gegensatz zu den IK-Kanälen durch Iberiotoxin hemmbar. Die Unterscheidung der β-

    Untereinheiten ist pharmakologisch aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber

    Iberiotoxin möglich (MEERA et al. 2000). Zusätzlich blockieren Charybdotoxin,

    Tetraethylammonium und Tertrapentylammonium (CARL et al. 1993, GARCIA et al.

    1997) und, wie neueste Untersuchungen zeigten, auch das Skorpiongift Slotoxin

    (GARCIA-VALDES et al. 2001) die BK-Kanäle. Im Gegensatz zu den SK-Kanälen

    verhalten sich die BK-Kanäle jedoch insensitiv gegenüber Apamin.

    Modulation

    Wie bereits unter dem Abschnitt „Vorkommen und Funktion“ (Seite 29) aufgeführt, sind

    die BK-Kanäle in den verschiedensten Geweben an zahlreichen Funktionen beteiligt. Diese

    gewebespezifische Funktionalität des Kanals wird durch diverse Modulatoren

    gewährleistet, welche die Eigenschaften der BK-Kanäle verändern. Neben den zahlreichen

    Splicevarianten tragen, wie vorher beschrieben, die β-Untereinheiten in überragender

    Weise zu dieser gewebespezifischen Diversität der BK-Kanäle bei. Zusätzlich werden

    jedoch die Aktivität und Aktivierbarkeit der Kanäle durch zahlreiche körpereigene

    Substanzen und Second messenger Systeme maßgeblich beeinflusst und somit die

    Zellfunktion an akute Stoffwechselbedürfnisse und spezifische Leistungen angepasst

    (TORO et al. 1998).

    So konnte in den letzten Jahren durch zahlreiche Arbeitsgruppen nachgewiesen werden,

    dass die Aktivität der BK-Kanäle durch die Phosphorylierung der α- und β-Untereinheiten

    mittels Proteinkinasen verändert wird (SCHUBERT u. NELSON 2001). In Abhängigkeit

    von der Lokalisation und der Proteinkinase erfolgt eine Aktivierung bzw. Inhibierung der

    Kanäle. An der Aktivierung der Proteinkinasen sind wiederum zahlreiche Substanzen als

    Second messenger beteiligt.

    34

  • Literaturübersicht

    PKA

    Die cAMP-abhängige Proteinkinase A aktiviert die BK-Kanäle in glatten Muskelzellen und

    Neuronen, inhibiert sie jedoch in endokrinen Zellen und in der Hypophyse (TIAN et al.

    1998 u. 2001). Die PKA induziert v.a. eine N-terminale Phosphorylierung der β-

    Untereinheit. Die aktivierende Wirkung unterschiedlichster Substanzen wird über PKA

    durch Second messenger vermittelt. So zeigten SCORNIK et al. bereits 1993, dass durch β-

    adrenerge Substanzen wie Isoproterenol eine Aktivierung der BK-Kanäle über PKA

    vermittelt werden kann. Ebenso ist die Relaxation von Gefäßen infolge einer Behandlung

    mit dem PGI2-Analogon Beraprost unter anderem cAMP vermittelt (YAMAKI et al. 2001).

    Auch die vasodilatorische Wirkung von VIP wird neben anderen Mechanismen durch eine

    Aktivierung von cAMP und nachfolgender Aktivierung der PKA erzielt (TANAKA et al.

    1999).

    PKG

    ROBERTSON et al. (1993) zeigten in Patch clamp Untersuchungen an glatten

    Muskelzellen von Cerebralarterien der Ratte eine Aktivierung der BK-Kanäle durch die

    cGMP-abhängige Proteinkinase G. Sie konnten weiterhin nachweisen, dass durch NO und

    Nitroprussid eine Aktivierung der PKG erfolgt, wodurch eine Vasodilatation der Gefäße

    vermittelt wird.

    ALIOUA et al. (1998) konnten in heterologen Expressionsexperimenten in Xenopus

    Oozyten nachweisen, dass die PKG aktivierend auf humane BK-Kanäle wirkt. Die Befunde

    ergaben, dass durch die Phosphorylierung der α-Untereinheit die Offenwahrscheinlichkeit

    der BK-Kanäle signifikant erhöht wird. Infolgedessen erfolgt eine längere und stärkere

    Hyperpolarisation der Zellen und der myogene Tonus der Gefäße wird reduziert. So ist eine

    Aktivierung der BK-Kanäle mittels PKG ebenfalls entscheidend an der Vasorelaxation

    durch das atriale natriuretische Peptid beteiligt (TANAKA et al. 1998).

    PKC

    Die Ca2+-abhängige Proteinkinase C führt in glatten Muskelzellen zu einer verminderten

    Aktivität der BK-Kanäle unter der Voraussetzung einer Koexpression der α- und β1-

    Untereinheit. So zeigten HAGEN et al. (2003) in elektrophysiologischen Untersuchungen

    35

  • Literaturübersicht

    an Myozyten des Kolons von Mäusen, dass die Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle

    sowie die Amplitude und die Frequenz des Kaliumauswärtsstroms durch eine Aktivierung

    der PKC reduziert werden konnten. Die Aktivierung der PKC erfolgt sowohl über den

    Einstrom von Ca2+ durch nichtselektive Ca2+-Kanäle, als auch über die Bindung von

    Acetylcholin an muskarinerge Rezeptoren und ATP mit nachgeschalteter Aktivierung des

    Phosphatidylinositolmechanismus und direkter Wirkung des freigesetzten Diacylglycerols

    auf die Aktivität der Proteinkinase C (BAYGUINOV et al. 2001). Als Ergänzung zu diesen

    Befunden zeigten BAYGUINOV et al. (2003) eine Aktivierung der BK-Kanäle durch

    Substanz P, welche ebenfalls indirekt über eine Aktivierung der PKC vermittelt wird. In

    diesem Fall ist die aktivierende Wirkung der PKC auf L-Typ Calciumkanäle jedoch von

    entscheidender Bedeutung, und erst sekundär erfolgt eine Aktivierung der BK-Kanäle

    durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration.

    Andere körpereigene Botenstoffe modulieren die Aktivität der BK-Kanäle direkt durch

    Interaktion mit der α- und/oder β-Untereinheit ohne die Zwischenschaltung eines Second

    messengers. So erhöhen Östrogene und Tamoxifen (ein Östrogenantagonist) die

    Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle und bewirken eine Steigerung der

    Spannungssensitivität der Kanäle, infolgedessen die Einzelkanäle bei geringeren

    Membranpotentialen aktiviert werden. Diese Wirkung wird jedoch nur in Anwesenheit der

    β-Untereinheit beobachtet, wobei die Östrogene und Tamoxifen von der extrazellulären

    Seite mit den BK-Kanälen interagieren (VALVERDE et al. 1999, DICK u. SANDERS

    2001, DICK et al. 2002). Zusätzlich wird durch Östrogene die Einzelkanalleitfähigkeit

    reduziert, was jedoch unabhängig von der β-Untereinheit geschieht und somit auf eine

    direkte Interaktion mit der α-Untereinheit hinweist (DICK u. SANDERS 2001).

    Die Aktivität der BK-Kanäle wird weiterhin durch H2O2 (SOTO et al. 2002), Angiotensin II

    (TORO et al. 1990, ABOULAFIA et al. 2002) und durch einen Anstieg des intrazellulären

    Magnesiumgehalts in Anwesenheit der β-Untereinheit moduliert. In Abwesenheit der β-

    Untereinheit wirkt Magnesium aktivierend auf die BK-Kanäle (SHI et al. 2002, QIAN u.

    MAGLEBY 2003).

    36

  • Literaturübersicht

    2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle auf die Blutdruckregulation

    Wie bereits beschrieben, werden BK-Kanäle mit der regulatorischen β1-Untereinheit

    (BKβ1) in hohem Maße in glatten Muskelzellen verschiedener Organe einschließlich

    Blutgefäßen exprimiert (PEREZ et al. 1993, GARCIA-CALVO et al. 1994,

    GIANGIACOMO et al. 1995, PETKOV et al. 2001). Glatte Muskulatur ist an der Funktion

    vieler Organe einschließlich Magen, Darm, Uterus und Blase beteiligt. In Blutgefäßen

    tragen glatte Muskelzellen wesentlich zur Regulation des peripheren Widerstands bei,

    indem sie den Durchmesser der Gefäße mittels Kontraktion oder Relaxation verändern.

    Gesteuert wird das Kontraktionsverhalten glatter Muskelzellen über

    Membranpotentialänderungen, die durch die Transmitter Acetylcholin und Noradrenalin

    sowie durch diverse Hormone induziert werden (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).

    Das Membranpotential glatter Muskelzellen wird hauptsächlich durch den

    Kaliumgradienten bestimmt. So werden in glatten Muskelzellen neben BK-Kanälen noch

    weitere Kaliumkanäle (Kv-Kanäle, Kir, KATP-Kanäle) exprimiert (NELSON u. QUAYLE

    1995). Die durch Transmitter oder mechanischen Druck induzierte Depolarisation des

    Membranpotentials führt zu einer Öffnung spannungsabhängiger L-Typ Calciumkanäle.

    Durch das einströmende Calcium wird eine Muskelkontraktion ausgelöst (KLINKE u.

    SILBERNAGEL 1996). In der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) werden

    durch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration Ryanodin-sensitive

    Calciumkanäle aktiviert, durch die aus diesem intrazellulären Calciumspeicher lokal

    begrenzt Calcium freigesetzt wird. Diese spontanen und lokal begrenzten Calciumausstösse

    aus dem SR werden Calcium-Sparks genannt (NELSON et al. 1995). Durch diese Sparks

    werden die in der benachbarten Plasmamembran lokalisierten calciumabhängigen BK-

    Kanäle aktiviert. Der dadurch entstehende spontane transiente Kaliumauswärtsstrom wird

    auch als STOC (spontaneus transient outward current) bezeichnet (NELSON et al. 1995).

    Die Membrandepolarisation hat ebenfalls eine Öffnung von spannungsabhängigen und

    auswärts gleichrichtenden Kaliumkanälen zur Folge. Der durch diese Kanäle vermittelte

    Kaliumausstrom aus den Zellen führt zu einer Membranhyperpolarisation und nachfolgend

    zum Schließen der spannungsabhängigen Calciumkanäle. Die intrazelluläre Ca2+-

    Konzentration nimmt wieder ab und die Zellen relaxieren.

    37

  • Literaturübersicht

    In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass die Aktivierung der BK-Kanäle

    durch einen lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration eine entscheidende

    Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielt, indem sie einen negativen Feedback

    Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermittelt (BRAYDEN u. NELSON

    1992). Die regulatorische β1-Untereinheit erhöht, wie bereits beschrieben, die Ca2+-

    Sensitivität der BK-Kanäle maßgeblich und trägt somit fundamental zu einer

    Funktionssteigerung der BK-Kanäle und damit auch des negativen Feedback zur

    Limitierung der Vasokonstriktion bei. Diese Hypothese wurde durch verschiedene

    Arbeitsgruppen vor allem in pharmakologischen Experimenten an isolierten Gefäßen

    bestätigt. In diesen Untersuchungen wurde durch die Gabe von Iberiotoxin eine ausgeprägte

    Membrandepolarisation ausgelöst, die zu einer Vasokonstriktion führte (JAGGAR et al.

    2000, LÖHN et al. 2001).

    Druck und Vasokonstriktoren

    Membrandepolarisation

    Öffnung spannungsabhängigerL-Typ Calciumkanäle

    Anstieg des intrazellulären Calciums

    +

    Zunahme des arteriellen Tonus

    SR Ryanodin Rezeptor

    Öffnung von BK-Kanälen

    - IberiotoxinCharybdotoxinTEA

    +

    +

    ++

    +

    +

    Calciumkanal-blocker

    Abbildung 6: Modell für die Rolle der BK-Kanäle als Teil des negativen

    Feedback Mechanismus bei der Regulation des arteriellen Tonus. Modifiziert nach NELSON u. QUAYLE (1995).

    Diese Ergebnisse wurden durch den Phänotyp von Mäusen, bei denen die β1-Untereinheit

    genetisch inaktiviert wurde, grundlegend bestätigt (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et

    38

  • Literaturübersicht

    al. 2000). Die BKβ1-/- Mäuse zeigten einen erhöhten arteriellen Tonus in isolierten

    Gefäßen, welcher mit einer verminderten Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle und einer

    gestörten Kopplung von Calcium-Sparks und STOC`s vergesellschaftet war. Diese

    molekularen und zellulären Störungen gingen mit einem erhöhten systemischen Blutdruck

    und einer Herzhypertrophie einher. Eine verminderte Expression der β1-Untereinheit,

    verbunden mit einer geringeren Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle, wurde auch in glatten

    Gefäßmuskelzellen von Ratten mit einer genetisch bedingten Hypertonie beobachtet

    (WELLMANN et al. 2001, AMBERG et al. 2003, AMBBERG u. SANTANA 2003). Im

    Widerspruch zu diesen Ergebnissen stehen allerdings die Befunde von LIU et al. (1997,

    1998), die in Cerebralarterien von spontan hypertensiven Ratten einen Anstieg der BK-

    Kanal Expression nachweisen konnten, welche einen verstärkten Kaliumauswärtsstrom

    durch die BK-Kanäle verursachte. Die Autoren interpretieren dies als Versuch des Körpers,

    die Ausprägung einer Hypertonie einzuschränken.

    Auf der Basis der beschriebenen Beobachtungen wurde geschlussfolgert, dass die arterielle

    Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz des erhöhten Tonus in arteriellen

    Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b, STANDEN 2000, PATTERSON et al.

    2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher Mechanismus ist von größtem

    wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich hierbei um den erstmaligen

    Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie handeln würde.

    39

  • Literaturübersicht

    2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung

    Der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen könnte im Gegensatz zu der im

    vorherigen Abschnitt beschriebenen Hypothese eine alternative Erklärung finden. In

    Anbetracht der starken Expression von BK-Kanälen in Zona glomerulosa-Zellen ist es sehr

    gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der β1-Untereinheit zu einer gestörten

    Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen, dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen

    im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind.

    Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten

    ausgeprägten linksventrikulären Hypertrophie beitragen.

    Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob die BKβ1-/- Mäuse tatsächlich

    pathologisch erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut aufweisen, die für die Entstehung

    der Hypertonie ursächlich verantwortlich sind. Weiterhin soll untersucht werden, ob es durch

    pharmakologische Blockierung des zirkulierenden Plasmaaldosterons mit Hilfe des

    Aldosteronantagonisten Spironolacton möglich ist, bei BKβ1-/- Mäusen eine Normalisierung

    des arteriellen Blutdrucks und eine Beeinflussung der linksventrikulären Hypertrophie zu

    bewirken.

    Sollte sich die Hypothese eines Hyperaldosteronismus bestätigen, soll im Rahmen dieser

    Arbeit des Weiteren an Nebennieren von BKβ1-/- Mäusen untersucht werden, ob der

    Hyperaldosteronismus durch eine veränderte Regulation der Aldosteronsekretion in den

    Nebennieren unter Beteiligung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle verursacht wird.

    40

  • Material und Methode

    3 Material und Methode

    3.1 Material

    3.1.1 Lösungen und Puffer

    3.1.1.1 Nebenniereninkubation

    Die Inkubationen erfolgten in einem durch Krebs-HEPES Puffer modifizierten Medium

    199 der Firma Sigma (M 2154).

    Modifiziertes Medium M199 (K+: 3,5 mmol/l)

    Endkonzentration

    Medium 199 (5,36 mmol/l K+) 653 ml

    Krebs-HEPES Puffer, modifiziert 347 ml

    L-Glutamin (200 mmol/l Stock, 1:294) 0,68 mmol/l

    BSA, Fraktion V (w/v) 0,1%

    D-Glucose 11,1 mmol/l

    NaCl (kompensiert variable [K+]) ≤ 25 mmol/l

    pH: 7,4 // 290 mosmol/kg

    Krebs-HEPES Puffer, modifiziert

    Endkonzentration

    NaCl 75 mmol/l

    CaCl2 1,8 mmol/l

    MgSO4 0,8 mmol/l

    NaHCO3 25 mmol/l

    Na2HPO4 1,0 mmol/l

    HEPES (20 ml 1,0 mol/l Stock, pH: 7,4) 20 mmol/l

    41

  • Material und Methode

    dazu benötigte Lösungen:

    HEPES Puffer, Stocklösung (pH: 7,4) 1,0 mol/l

    NaCl Lösung 1,0 mol/l

    KCl Lösung 1,0 mol/l

    Für Versuche in Gegenwart erhöhter Kaliumkonzentrationen wurden die Osmolalitäten der

    Inkubationslösungen durch entsprechende Verringerung der variablen NaCl Konzentration

    konstant gehalten.

    Einstellung verschiedener Kaliumkonzentrationen

    Bezogen auf 1 Liter Inkubationslösung resultierte die Zugabe von 500 µl KCl Lösung (1,0

    mol/l) in einer Erhöhung der Kaliumkonzentration um 0,5 mmol/l. Das Volumen der 1,0

    mol/l NaCl Lösung wurde entsprechend um 500 µl reduziert: von 8,675 ml auf 8,175 ml.

    PBS (10x)

    NaCl 1,54 mol/l

    Na2HPO4 0,70 mol/l

    KH2PO4 0,30 mol/l

    pH: 6,8 ± 0,1

    3.1.1.2 Gelelektrophorese

    Loading-Buffer

    Glycerol 50%

    Bromphenolblau, gesättigt 1%

    Xylenecyanol (10%ig) 1%

    50 x TAE 2%

    H2O, steril ad 100 ml

    42

  • Material und Methode

    TAE (50x)

    Tris 242 g

    Eisessig 57,1 g

    EDTA (0,5 M), pH 8,0 100 ml

    H2O, destilliert ad 1000 ml

    TBE (0,5x)

    Tris 242 g

    Borsäure 27,5 g

    EDTA (0,5 M), pH 8,0 20 ml

    H2O, destilliert ad 1000 ml

    1:10 verdünnt

    3.1.2 Chemikalien und Enzyme

    Falls nicht anders angegeben, wurden sämtliche Chemikalien von den Firmen Sigma,

    Invitrogen, Serva, Calbiochem, Braun und Merck in p.a. oder reinst-Qualität bezogen.

    Nukleinsäuren und Nukleotidtriphosphate wurden bei der Firma Invitrogen, Pharmacia

    Biotech und MWG Biotech erworben.

    43

  • Material und Methode

    3.2 Versuchstiere

    Die Versuche wurden an männlichen, 3 bis 7 Monate alten C57/BL6 Inzuchtmäusen mit

    genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals (Knockout

    Mäuse: BKβ1-/-) durchgeführt. Als Kontrolltiere dienten männliche ingezüchtete C57/BL6

    Mäuse (Wildtyp Mäuse: BKβ1+/+).

    Der BKβ1-Knockout wurde 1999/2000 von der Arbeitsgruppe um Prof. O. Pongs (Zentrum

    für molekulare Neurobiologie Hamburg) generiert (PLÜGER et al. 2000). Der Arbeitsgruppe

    um Prof. H. Ehmke wurden Zuchttiere zur Verfügung gestellt, deren weitere Vermehrung

    und Aufzucht von der Versuchstierhaltung des Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

    übernommen wurde.

    Die Tiere wurden bei Raumtemperatur 22 ± 2°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 ±

    5% und einem 12-stündigen Tag-Nacht-Rhythmus (Licht: 7.00-19.00 Uhr) in durchsichtigen

    Polycarbonatkäfigen (Fa. Techniplast) des Types II long (365 x 207 x 140 mm) auf

    staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Zur Beschäftigung der Tiere wurden die Käfige

    zusätzlich mit einigen Blättern Zellstoff und Häusern aus Kunststoff (Fa. Techniplast)

    ausgestattet.

    Die Ernährung der Tiere erfolgte mit standardisiertem, pelletierten Trockenfutter (Ssniff

    R/M-H, extrudiert) und Leitungswasser ad libitum. Das Futter war wie folgt

    zusammengesetzt: Rohprotein 22,7%, Rohfett 4,0%, Rohfaser 5,6%, Rohasche 7,6%,

    umsetzbare Energie 12,5 MJ/kg (Angaben in % des Trockengewichts). Die Tiere wurden auf

    das Freisein von Erregern entsprechend der Liste GV-SOLAS 1998 kontrolliert.

    Eine Woche vor Beginn der Versuche wurden die Mäuse aus der zentralen Tierhaltung in

    ihren Käfigen in das Physiologische Institut transportiert, um durch eine vollständige

    Erholung von dem Transport und Eingewöhnung an die Laborumgebung eine stressbedingte

    Beeinflussung der Messergebnisse auszuschließen. Die Haltung und Fütterung der Tiere im

    Mäuselabor erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie vorher beschrieben. Hervorgerufen

    durch Tätigkeiten im Labor, mussten sich die Tiere jedoch an eine geänderte Geräuschkulisse

    adaptieren.

    Die Tierversuchsgenehmigungen wurden von der Behörde für Umwelt und Gesundheit,

    Hamburg, mit den Aktenzeichen A6/218 und 35/02 erteilt.

    44

  • Material und Methode

    3.2.1 Versuchsserien und Stichprobenumfang

    Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit basieren auf den in der nachfolgenden Tabelle

    dargestellten Versuchsserien.

    Tabelle 1: Übersicht über die Versuchsserien mit durchgeführten Bestimmungen

    Untersuchungen

    Versuchsserie 1 Basisuntersuchungen

    • hämodynamische / morphometrische Untersuchungen

    • Bestimmung von Blutparametern

    Versuchsserie 2 Aldosteronbestimmung

    • hämodynamische / morphometrische Untersuchungen

    • Bestimmung der Plasmaaldosteronkonzentration

    Versuchsserie 3 Spironolactonbehandlung

    • hämodynamische / morphometrische Untersuchungen

    Versuchsserie 4 Nebennieren – Inkubationsversuche

    • basale und stimulierte Aldosteronsekretion

    Die Untersuchungen der Versuchsserien 1-3 sollen pro Serie und Genotyp an 13 Tieren

    durchgeführt werden. Ergebnisse in der Literatur haben eine mittlere interindividuelle

    Variabilität des Blutdrucks mit einen Variationskoeffizient von ~5-8% bei wachen Mäusen

    gezeigt (Plüger et al. 2000). Hinzu kommt, dass aus nicht vermeidbaren methodischen

    Gründen (Operationskomplikationen, Katheterverschluss) etwa 10-20% der operierten Tiere

    nicht in den Versuch aufgenommen werden können. Die eingeplante Zahl von Tieren reicht

    45

  • Material und Methode

    aus, um bei dieser Varianz einen Blutdruckunterschied von 10 mmHg statistisch auf dem 5%

    Signifikanzniveau zu identifizieren.

    Die Untersuchungen der Versuchsserie 4 sollen pro Versuchsgruppe (Stimulus und Genotyp)

    an Nebennieren von jeweils 10 Tieren durchgeführt werden, um mögliche Unterschiede

    statistisch beurteilen zu können.

    46

  • Material und Methode

    3.3 Methoden

    3.3.1 Genotypisierung der Mäuse

    Zur Bestimmung des Genotyps wurde den Zuchttieren durch die Tierpfleger der

    Versuchstierhaltung im Alter von ca. 6 Wochen und den Mäusen, an denen Versuche

    durchgeführt wurden, zum Abschluss der Experimente eine Ohrbiopsie entnommen. Die

    Entnahme der Ohrprobe erfolgte mit einer speziellen Lochzange.

    Nach Lysierung der Ohrprobe wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain

    reaction = PCR) überprüft, ob der Genlocus, der die β1-Untereinheit des Ca+-aktivierten

    Kaliumkanals codiert, bei den Tieren vorhanden war bzw. fehlte.

    3.3.1.1 Lysierung der Ohrprobe

    Folgender Ansatz wurde für den Verdau einer Ohrprobe verwendet:

    NP- 40 (0,5%) 0,5 µl

    Tween® 20 (0,5%) 0,5 µl

    10x PCR RXN Puffer (-Mg2+) 10 µl

    Proteinase K 0,03 mg

    H2O, steril ad 100 µl

    Der Verdau erfolgte mit Hilfe eines Thermomixers (Eppendorf Gerätebau) auf Stufe 11

    (11x100/min) bei 65°C für 2 h 50 min und wurde abgeschlossen bei 95°C für 10 min. Falls

    die Polymerase-Kettenreaktion nicht direkt angeschlossen wurde, fand eine Lagerung des

    Lysats bei –20°C statt.

    47

  • Material und Methode

    3.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion

    (SAIKI et al. 1988, PLÜGER et al. 2000)

    Folgender Standardansatz (50 µl Gesamtvolumen) wurde für die Amplifikation von DNA

    durch die PCR verwendet:

    Ohrprobenlysat 3 µl

    10x PCR RXN-Puffer (-Mg2+) 5 µl

    50 mM MgCl2 1,5 µl

    20 mM dNTP`s 0,5 µl

    Primer 1 (100 pmol/µl) 1 µl

    Primer 2 (100 pmol/µl) 0,5 µl

    Primer 3 (100 pmol/µl) 0,125 µl

    Taq-Polymerase (5 Units/µl) 0,5 µl

    H2O, steril ad 50 µl

    Die Primer wurden von der Firma MWG-Biotech GmbH bezogen und hatten folgende

    Sequenzen:

    Primer 1 (BKMB 11s) 5`-GCT GAA ACT CTG AAG CTA CTC-3`

    Primer 2 (BKMB 17s) 5`-GCT ATG AGG CAA CTA AAC AGG-3`

    Primer 3 (BKMB 3a) 5`-CAC AGC TGA TAC ATT GAC CC-3`

    Die Poly