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Aus dem Institut für Tierschutz und Verhalten (Heim-, Labortiere und Pferde) der Tierärztlichen Hochschule Hannover und dem Institut für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca 2+ -aktivierten Kaliumkanals INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Mareike Kristina Budack aus Hamburg Hannover 2004

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Aus dem Institut für Tierschutz und Verhalten

(Heim-, Labortiere und Pferde)

der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und

dem Institut für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie

des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf

Untersuchungen zur Blutdruckregulation

bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der

β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades einer

DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN

(Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

vorgelegt von

Mareike Kristina Budack

aus Hamburg

Hannover 2004

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Wissenschaftliche Betreuung:

Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth

Univ. Prof. Dr. H. Ehmke

1. Gutachter: Univ. Prof. Dr. H. Hackbarth

2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. B. Schröder

Tag der mündlichen Prüfung: 27.05.2004

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Meinen Eltern

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Vorab veröffentlichte Teilergebnisse dieser Arbeit: BUDACK, M., M.E. BLANK, J. FAULHABER u. H. EHMKE (2003): In vitro Untersuchungen zur Aldosteronfreisetzung an isolierten Nebennieren der Maus. Posterpräsentation der kardiovaskulären Forschung am UKE Hamburg, 14.10.2003 Vorab zur Veröffentlichung eingereichte Teilergebnisse dieser Arbeit:

FAULHABER, J., M. BUDACK, M.E. BLANK u. H. EHMKE (2004): In vitro determination of aldosterone secretion in isolated mice adrenal glands. 83. Jahreskongress der Deutschen Physiologischen Gesellschaft Leipzig, 14.-17.03.2004, in prep.

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INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung ................................................................................................................ 11

2 Literaturübersicht ................................................................................................ 13 2.1 Blutdruckregulation ..................................................................................................

13 2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ................................................................ 15

2.1.1.1 Aldosteron .............................................................................................................. 17 2.1.1.2 Hyperaldosteronismus ............................................................................................ 22

2.2 Ionenkanäle ................................................................................................................ 24 2.2.1 Kaliumkanäle ............................................................................................................... 24

2.2.1.1 Ca2+-aktivierter K+-Kanal ...................................................................................... 27 2.2.1.1.1 SK-Kanal ....................................................................................................... 27 2.2.1.1.2 IK-Kanal ........................................................................................................ 28 2.2.1.1.3 BK-Kanal ...................................................................................................... 29 2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle

auf die Blutdruckregulation .......................................................................... 37 2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung ............................................................................ 40

3 Material und Methode ........................................................................................ 41 3.1 Material ....................................................................................................................... 41 3.1.1 Lösungen und Puffer .................................................................................................... 41

3.1.1.1 Nebenniereninkubation .......................................................................................... 41 3.1.1.2 Gelelektrophorese .................................................................................................. 42

3.1.2 Chemikalien und Enzyme ............................................................................................ 43 3.2 Versuchstiere .............................................................................................................. 44 3.2.1 Versuchsserien und Stichprobenumfang ...................................................................... 45 3.3 Methoden .................................................................................................................... 47 3.3.1 Genotypisierung der Mäuse ......................................................................................... 47

3.3.1.1 Lysierung der Ohrprobe ......................................................................................... 47 3.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion .................................................................................... 48 3.3.1.3 Gelelektrophorese .................................................................................................. 49

3.3.2 Hämodynamische Untersuchungen an wachen Mäusen .............................................. 50 3.3.2.1 Katheterherstellung ................................................................................................ 50 3.3.2.2 Operative Katheterimplantation ............................................................................. 50 3.3.2.3 Blutdruckmessung .................................................................................................. 53

3.3.3 Spironolactonapplikation ............................................................................................. 55 3.3.4 Bestimmung von Blutparametern ................................................................................ 56

3.3.4.1 Blutabnahme .......................................................................................................... 56 3.3.4.1.1 Blutabnahme für die Elektrolyt-/ Kreatininbestimmung .............................. 56 3.3.4.1.2 Blutabnahme für die Renin-/ Aldosteronbestimmung .................................. 56

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3.3.4.2 Analyse .................................................................................................................. 58 3.3.4.2.1 Natrium und Kalium ........................................................................................ 58 3.3.4.2.2 Chlorid ............................................................................................................. 58 3.3.4.2.3 Kreatinin .......................................................................................................... 59 3.3.4.2.4 Renin ............................................................................................................… 59 3.3.4.2.5 Aldosteron ........................................................................................................ 60

3.3.5 Morphometrische Untersuchungen .............................................................................. 62 3.3.6 Inkubation von Nebennieren in vitro ........................................................................... 63

3.3.6.1 Organentnahme und Präparation ............................................................................ 63 3.3.6.2 Inkubation .............................................................................................................. 63

3.3.6.2.1 Vorversuche ..................................................................................................... 64 3.3.6.2.2 Kaliumstimulation ............................................................................................ 65 3.3.6.2.3 ANG II-Stimulation .....................................................................................… 66 3.3.6.2.4 ACTH-Stimulation .......................................................................................... 67

3.3.7 Statistik ........................................................................................................................ 68

4 Ergebnisse ............................................................................................................... 69 4.1 Genotypisierung ......................................................................................................... 69 4.2 Versuchsserie 1 und 2 ................................................................................................ 71 4.2.1 Hämodynamische Daten .............................................................................................. 71 4.2.2 Morphometrische Daten .............................................................................................. 72 4.2.3 Ergebnisse der Blutuntersuchungen ............................................................................ 74

4.2.3.1 Elektrolyte und Kreatinin ...................................................................................... 74 4.2.3.2 Renin ...................................................................................................................... 75 4.2.3.3 Aldosteron .............................................................................................................. 76

4.3 Versuchsserie 3 ........................................................................................................... 77 4.3.1 Hämodynamische Daten .............................................................................................. 77 4.3.2 Morphometrische Daten ............................................................................................... 78 4.4 Versuchsserie 4 ........................................................................................................... 79 4.4.1 Vorversuch ................................................................................................................... 80 4.4.2 Kaliumstimulation ........................................................................................................ 81

4.4.2.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 81 4.4.2.2 Stimulation mit Kalium .......................................................................................... 82

4.4.3 ANG II-Stimulation ..................................................................................................... 84 4.4.3.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 84 4.4.3.2 Stimulation mit ANG II ......................................................................................... 85

4.4.4 ACTH-Stimulation ....................................................................................................... 88 4.4.4.1 Dosis-Wirkungskurve ............................................................................................ 88 4.4.4.2 Stimulation mit ATCH ......................................................................................…. 89

5 Diskussion ................................................................................................................ 92

6 Zusammenfassung .............................................................................................. 108

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7 Summary ................................................................................................................ 111

8 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 114

9 Anhang ................................................................................................................... 138

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VERZEICHNIS DER ABKÜRZUNGEN A. Arterie

Abb. Abbildung

ACTH Adrenocorticotropeshormon

ANG II Angiotensin II

AT1 Angiotensin-Rezeptor Typ 1

AT2 Angiotensin-Rezeptor Typ 2

BK-Kanal big conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal

bp Basenpaare

BSA Bovines Serumalbumin

BW Körpergewicht

°C Grad Celsius

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure

cGMP cyclisches Guanosinmonophosphat

cm Zentimeter

C-Terminus Carboxyterminus von Proteinen bzw. Peptiden

dl Deziliter

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP 2´-Desoxyribonukleotid-5´-triphosphat

ED50 50% der Effektiven Dosis

EDTA Ethylendiaminotetraessigsäure

et al. et alii (und weitere)

Fa. Firma

g Gramm

h Stunde

HEPES 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino)-ethansulfonsäure

HGW Herzgewicht

H2O Wasser

HZV Herzzeitvolumen

I.D. Innendurchmesser

I.E. Internationale Einheiten

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IK-Kanal intermediate conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal

in prep. in preparationem (in Vorbereitung)

i.p. intraperitoneal

Kap. Kapitel

kb Kilobasenpaare

kg Kilogramm

KGW Körpergewicht

Kir einwärts gleichrichtender Kaliumkanal

KO Knockout Maus

Kv spannungsabhängiger Kaliumkanal

l Liter

Lig. Ligamentum

LV linker Ventrikel

M molar

MAD mittlerer arterieller Blutdruck

mg Milligramm

min Minute

MJ Megajoule

ml Milliliter

mm Millimeter

mM millimolar

mosmol Milliosmol

MW Mittelwert

µg Mikrogramm

µl Mikroliter

n Anzahl

ng Nanogramm

nm Nanometer

nM nanomolar

N. Nervus

NO Stickoxid

N-Terminus Aminoterminus von Proteinen bzw. Peptiden

O.D. Aussendurchmessser

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

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PCR Polymerase-Kettenreaktion

pg Picogramm

PGI2 Prostaglandin I2 (Prostacyclin)

PKA Proteinkinase A (cAMP-abhängig)

PKC Proteinkinase C (Ca2+-abhängig)

PKG Proteinkinase G (cGMP-abhängig)

pmol Picomol

PRC Plasmareninkonzentration

pS Picosiemens

® eingetragenes Warenzeichen

RAAS Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

RIA Radioimmunoassay

RT Raumtemperatur

RV rechter Ventrikel

s.c. subkutan

SD Standardabweichung

SEM Standardfehler des Mittelwerts

SK-Kanal small conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal

TAE Tris-Acetat-EDTA

TBE Tris-Borsäure-EDTA

TM Transmembransegment

TPR totaler peripherer Widerstand

Tris Tris-(hydroxymethyl)aminomethan

UKE Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

UV-Licht ultraviolettes Licht

V Volt

V. Vene

VIP vasoaktives intestinales Peptid

WT Wildtyp Maus

x g x-fache Erdbeschleunigung g (g = 9,81 m/sec2)

ZVD zentral venöser Druck

Die chemischen Elemente werden gemäß dem internationalen Periodensystem abgekürzt.

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Einleitung

1 Einleitung

Die arterielle Hypertonie ist ein bedeutendes Gesundheitsproblem, von dem 25 % der

erwachsenen Bevölkerung der Industrieländer betroffen sind (BURT et al. 1995,

STOWASSER u. GORDON 2003). Trotz der herausragenden Bedeutung des erhöhten

Blutdrucks als Krankheitsursache ist seine Ätiologie weitgehend unbekannt.

Durch die Anwendung genetischer Methoden haben sich für die Analyse von Faktoren, die

an der Entstehung einer Hypertonie beteiligt sind, völlig neue Perspektiven eröffnet. Die

gezielte Ausschaltung identifizierter Gene ermöglicht es, primäre physiologische

Mechanismen auch in vivo zu charakterisieren. Tatsächlich hat die Untersuchung seltener

erblicher Formen von arterieller Hypertonie, bei denen Mutationen einzelner Gene mit

großen Effekten auf den Blutdruck korreliert sind, wichtige neue Einsichten in fundamentale

Wege der Blutdruckregulation beim Menschen aufgezeigt (LIFTON et al 2001). Bislang

konnten mindestens 8 Gene identifiziert werden, bei denen spezifische Fehlfunktionen direkt

zu einer Hypertonie führen. Bemerkenswert ist hierbei, dass in allen Fällen Genprodukte

betroffen waren, welche die renale Salzreabsorbtion und Volumenhomöostase beeinflussen.

Bei einer Reihe von genetischen Veränderungen betraf die pathophysiologische Störung

direkt die Regulation des Blutdrucks und der Salzhomöostase durch das Renin-Angiotensin-

Aldosteron-System, z.B. über eine erhöhte Aldosteronsynthese (PASCOE et al. 1992), eine

gesteigerte Aldosteronsekretionsrate (LIFTON et al. 1992) oder eine veränderte Aldosteron-

Mineralocorticoidrezeptor-Interaktion (GELLER et al. 1998 u. 2000).

Die Konzentrationen von Aldosteron im Plasma unterliegen einer strengen physiologischen

Regulation. Die Aldosteronsekretion wurde in früheren Studien bereits intensiv an in vitro

kultivierten Zona glomerulosa-Zellen untersucht (HILBERS et al. 1999, LOTSHAW 1997 a,

b u. 2001). Die Resultate legten nahe, dass die Kontrolle der Aldosteronsekretion vor allem

über Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration infolge von Membranpotential-

änderungen erfolgt, wodurch die sekretorische Aktivität der Zona glomerulosa-Zellen

entscheidend beeinflusst wird. Da die Höhe des Membranpotentials eng an die Aktivität von

Kaliumkanälen geknüpft ist (NELSON et al. 1995), wurde bereits seit längerem vermutet,

dass eine Modulation von Kaliumkanälen maßgeblich an der Regulation der

Aldosteronsekretion beteiligt ist. Laut persönlicher Mitteilung von Herrn Prof. H. Ekmke

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Einleitung

(2003) konnte an akut dissoziierten Zona glomerulosa-Zellen von Wildtyp Mäusen

tatsächlich ein sehr ausgeprägter spannungs- und calciumabhängiger Kaliumstrom

nachgewiesen werden, der sich durch Zugabe von 100 nM Iberiotoxin vollständig blockieren

ließ. Dieser Befund unterstützt die Vorstellung, dass BK-Kanäle an der Regulation der

Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen beteiligt sein könnten.

In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende

Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielen, indem sie einen negativen

Feedback-Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermitteln (JAGGAR et al.

2000). Diese Interpretation schien in hervorragender Weise durch den Phänotyp von Mäusen

bestätigt zu werden, bei denen die β1−Untereinheit genetisch inaktiviert wurde (BRENNER

et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000). Auf der Basis dieser Beobachtungen wurde

geschlussfolgert, dass die arterielle Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz

des erhöhten Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b,

STANDEN 2000, PATTERSON et al. 2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher

Mechanismus wäre von größtem wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich

hierbei um den erstmaligen Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie

handeln würde.

Allerdings könnte der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen auch eine alternative

Erklärung finden. In Anbetracht der starken funktionellen Expression von BK-Kanälen in

Zona glomerulosa-Zellen wäre es sehr gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der

BKβ1−Untereinheit zu einer gestörten Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen,

dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für

die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind. Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei

BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten starken linksventrikulären Hypertrophie (BRENNER

et al. 2000 b) beitragen.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob BKβ1-/- Mäuse pathologische

Veränderungen des Aldosteronsystems aufweisen, die für die Entstehung der Hypertonie

ursächlich verantwortlich sind. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, soll im Rahmen dieser

Arbeit des Weiteren untersucht werden, ob diese Störung durch eine veränderte Regulation

der Aldosteronsekretion in den Nebennieren unter Beteiligung der BK-Kanäle verursacht

wird.

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Literaturübersicht

2 Literaturübersicht

2.1 Blutdruckregulation

Als Blutdruck wird der in den Gefäßen des Körper- und Lungenkreislaufs herrschende Druck

bezeichnet, welcher die treibende hämodynamische Kraft für die Blutzirkulation darstellt. Im

eigentlichen Sinne stellt der mittlere arterielle Blutdruck (MAD) den im arteriellen System

auf Herzhöhe gegen den Atmosphärendruck gemessenen Druck dar. Dieser wird als Produkt

des Herzzeitvolumens (HZV) und des totalen peripheren Widerstandes (TPR) zuzüglich des

zentral venösen Drucks (ZVD) definiert.

MAD = (HZV x TPR) + ZVD

Der totale periphere Widerstand ist abhängig von dem Tonus und der Elastizität der

Gefäßwände, während das Herzzeitvolumen eine Funktion der Herzfrequenz und des

Schlagvolumens ist.

Die Regelung des Blutdrucks erfolgt durch Änderung des peripheren Widerstands durch

Vasodilatation bzw. Vasokonstriktion der Widerstandsgefäße oder durch Veränderung des

Herzzeitvolumens (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).

Eine Vielzahl physiologischer Systeme, die humorale, nervöse und metabolische Faktoren

einschließen, ist an der Blutdruckregulation beteiligt (GUYTON 1991, COWLEY 1992,

PERSSON 1996). Diese Systeme interagieren in komplexer Wechselwirkung, wodurch eine

adäquate Durchblutung der peripheren Gewebe sowie die Aufrechterhaltung des MAD

gewährleistet werden. Anhand des Zeitraums, in welchem die Regulationssysteme wirksam

werden, können kurzfristige, mittelfristige und langfristige Systeme unterschieden werden.

Die kurzfristige Blutdruckregulation basiert vor allem auf der Wirkung des vegetativen

Nervensystems. Die schnellste der nervalen Reaktionen wird durch arterielle

Pressorezeptoren vermittelt, die in der Gefäßwand des Carotissinus sowie des Aortenbogens

lokalisiert sind und den Pressorezeptorenreflex auslösen. Diese Mechanorezeptoren

detektieren den mittleren Blutdruck sowie Schwankungen des systemischen Blutdrucks, der

Herzfrequenz und der Anstiegssteilheit des Druckpulses anhand einer veränderten

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Literaturübersicht

Wandspannung und senden über Afferenzen der IX. und X. Hirnnerven Signale zum Nucleus

tractus solitarii und Nucleus ambiguus in der dorsalen Medulla oblongata. Über efferente

sympathische Nervenbahnen erfolgt eine Regulation der Herzfrequenz, der Kontraktilität des

Herzens und des TPR, wohingegen parasympathische Efferenzen ausschließlich eine

Reduktion der Herzfrequenz induzieren. Aufgrund dieser Mechanismen werden

Schwankungen des MAD innerhalb von Sekunden abgepuffert (TIMMERS et al. 2003). In

Volumenexpansions-Experimenten konnte gezeigt werden, dass durch eine Ausschaltung des

Pressorezeptorenreflexes einerseits die schnelle Blutdruckregulation hochgradig gestört war,

sich andererseits der Blutdruck jedoch innerhalb einer Stunde nach Expansion des

Blutvolumens mittels Infusion wieder normalisierte (DOBBS et al. 1971). In weiteren

Experimenten an verschiedenen Säugetierspezies konnte gezeigt werden, dass durch

Denervierung der Pressorezeptoren eine Hypertonie induziert wurde, die jedoch innerhalb

von 7-14 Tagen wieder kompensiert wurde (COWLEY et al. 1973, ITO u. SCHER 1978,

SHADE et al. 1990). Diese Normalisierung des Blutdrucks wurde durch andere, verzögert

wirkende Kontrollmechanismen ausgelöst.

So greift nach einigen Minuten das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) in die

Blutdruckregulation ein und zählt neben der Volumenverschiebung zwischen den Kapillaren

und dem extravasalen Raum, dem Kinin-Kallikrein-System (RHALEB et al. 2001,

TRABOLD et al. 2002) sowie parakrinen Faktoren (RUSKOAHO et al. 1997) zu den

wichtigsten mittel- bis langfristig wirkenden Regulationsmechanismen (GUYTON 1991).

Die dominierende Rolle der Niere bei der langfristigen Blutdruckregulation konnte in

klinischen und experimentellen Studien gezeigt werden (COWLEY u. ROMAN 1996).

Infolge von Schwankungen des Perfusionsdrucks der Niere erfolgt eine Regulation der

Wasser- und Natriumausscheidung, woraus eine Veränderung des Blutvolumens resultiert

(GUYTON 1992). Ebenso bestätigen die Ergebnisse von Nierentransplantationsstudien die

wichtige Rolle der Niere bei der Langzeitregulation des arteriellen Drucks und der

Pathogenese genetischer Formen der arteriellen Hypertonie. So konnte gezeigt werden, dass

es bei der Transplantation der Niere einer genetisch hypertensiven Ratte in eine

histokompatible normotensive Ratte zur Auslösung einer arteriellen Hypertonie kommt

(GRAF et al. 1993, RETTIG 1993). Bei Transplantation der Niere einer normotensiven Ratte

in eine bilateral nephrektomierte spontan hypertensive Ratte (SHR) konnte ein gesenkter

Blutdruck in der Empfängerratte festgestellt werden (PATSCHAN et al. 1997).

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Literaturübersicht

2.1.1 Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System

Das systemische Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS) ist von zentraler Bedeutung

für die mittel- bis langfristige Blutdruckregulation und die Homöostase des Wasser- und

Elektrolythaushalts des Organismus. Die Peptidase Renin wird in den Epitheloidzellen des

juxtaglomerulären Apparats der Niere synthetisiert (BARAJAS 1979). Die Sekretion von

Renin aus den Epitheloidzellen wird durch unterschiedliche Stimuli induziert. So wird die

Reninfreisetzung durch Abnahme des Nierenperfusionsdrucks, durch Verringerung der Na+-

Konzentration im proximalen Teil des distalen Tubulus (Macula densa) und durch eine

gesteigerte Sympathikusaktivität stimuliert. Die Reninsekretion unterliegt außerdem der

Kontrolle durch humorale Faktoren einschließlich Angiotensin II (ANG II), NO, Endothelin

und Steroidhormonen (TAUGNER et al. 1984, WAGNER et al. 1998). Spezielle Second

messenger wie cAMP (Steigerung der Reninsekretion), Ca2+ und Proteinkinase C (Hemmung

der Reninsekretion) sowie cGMP (Steigerung/Hemmung der Reninsekretion) vermitteln

unter anderem auf zellulärer Ebene die Signalweiterleitung (FRIIS et al. 2002).

Renin spaltet aus dem von der Leber synthetisierten und ins Plasma freigesetzte

Angiotensinogen das Dekapeptid Angiotensin I ab. Dieses wird unter Abspaltung zweier

Aminosäuren durch das ubiquitär vorkommende Angiotensin-Converting-Enzym (ACE) in

das stark biologisch aktive Oktapeptid ANG II umgewandelt (siehe Abb. 1).

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Literaturübersicht

Angiotensinogen (452 AS)

Angiotensin I (10 AS)

Angiotensin II (8 AS)

AT1 AT2

ACE

Renin

• Zelldifferenzierung • Hemmung der

Proliferation • Blutdruckregulation

• Vasokonstriktion • Aldosteronfreisetzung • Kardiale Kontraktilität • Catecholaminfreisetzung • Kardiale u. vaskuläre

Hypertrophie • Aufrechterhaltung der GFR • Steigerung der Na+-Resorption

Abbildung 1: Das Renin-Angiotensin-Aldosteron-System (RAAS). AS: Aminosäure; ACE: Angiotensin-Converting-Enzym; AT1: Angiotensin-Rezeptor Typ 1; AT2: Angiotensin-Rezeptor Typ 2; GFR: glomeruläre Filtrationsrate

Die Wirkungen von ANG II werden über die G-Protein-gekoppelten AT1- und AT2-

Rezeptoren vermittelt. Bei Nagetieren konnten 2 Isoformen des AT1-Rezeptors, AT1a- und

AT1b-Rezeptor, identifiziert werden. Die Rezeptoren sind an der Plasmamembran von Zellen

kardiovaskulärer, endokriner und endothelialer Organe lokalisiert (KASCHINA u. UNGER

2003). Der AT1a-Rezeptor ist unter anderem an der peripheren Vasokonstriktion, der

Hypertrophie glatter Muskulatur, der renalen Salz- und Wasserresorption und an der

zentralen Blutdruckregulation beteiligt. Der AT1b-Rezeptor wird unter anderen in endokrinen

Organen wie der Nebenniere und der Hypophyse sowie in mesangialen und

juxtaglomerulären Zellen exprimiert und ist beispielsweise an der Regulation der

Aldosteronsekretion in den Nebennieren beteiligt (KASCHINA u. UNGER 2003). Der AT2-

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Literaturübersicht

Rezeptor ist für die fetale Entwicklung, die Zelldifferenzierung, die Apoptose und

Regeneration von Gewebe sowie die Blutdruckregulation wichtig (CAREY et al. 1999).

Neben dem klassischen systemischen, endokrinen System, bei dem alle Komponenten des

RAA-Systems in der Blutbahn zirkulieren und so zu den Zielorganen transportiert werden,

sind in den letzten Jahren lokale Systeme in verschiedenen Organen einschließlich Gehirn,

Herz, Gefäße, Fettgewebe, Niere und Nebenniere beschrieben worden (PHILLIPS et al.

1993). Die physiologische Bedeutung und die gewebsspezifische Regulation dieser lokalen

Renin-Angiotensin-Systeme ist derzeit nur unvollständig bekannt. Untersuchungen stützen

jedoch die Hypothese, dass diese lokalen Systeme unter anderem eine pathogenetische Rolle

bei der Entwicklung bestimmter Hypertonieformen und Nephropathien spielen sowie an den

Hypertonie-assoziierten Endorganschäden beteiligt sind (PINTO et al. 1997, LUFT et al.

1999, PARK et al. 2003).

2.1.1.1 Aldosteron

Aldosteron gehört zu den Steroidhormonen mit 21 C-Atomen und wird aufgrund seiner

speziellen Wirkung auf den Elektrolythaushalt als Mineralocorticoid bezeichnet.

Aldosteron wird in den Nebennieren synthetisiert, welche morphologisch in die

Rindenschicht (cortex) und das Mark (medulla) unterteilt werden. In der Rindenschicht

lassen sich histologisch drei Zonen differenzieren: die äußere Zona glomerulosa, in der

Aldosteron produziert wird, die Zona fasciculata als Produktionsregion der Glucocorticoide

sowie die innen gelegene Zona reticularis, in der vor allem Androgene synthetisiert werden.

In der einheitlich strukturierten Medulla werden die Catecholamine Adrenalin und

Noradrenalin produziert (DUNN 1970, BLAND et al. 2003).

Wie alle Steroidhormone wird Aldosteron über Zwischenprodukte aus Cholesterol als

Ausgangssubstrat synthetisiert (siehe Abb. 2). Über die Substrate Pregnenolon und

Progesteron entsteht 11-Desoxycorticosteron, aus welchem sowohl Corticosteron als auch

Aldosteron gebildet werden kann. Entscheidend für die Differenzierung in Corticosteron

bzw. Aldosteron sind zwei Enzyme, welche die letzten Syntheseschritte katalysieren und

eine spezifische Lokalisation in der Nebenniere aufweisen. Die 11β-Hydroxylase

CYP11B1 (auch P450c11 genannt) wird in Zellen der Zona fasciculata exprimiert und

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Literaturübersicht

vermittelt die Bildung der wichtigsten Glucocorticoide Corticosteron und Cortisol. Im

Gegensatz dazu kommt die Aldosteronsynthase CYP11B2 (auch P450aldo genannt)

ausschließlich in Zona glomerulosa-Zellen vor und katalysiert die drei letzten

Aldosteronsyntheseschritte (MULLER 1998).

Cholesterol

11-Desoxycorticosteron (DOC)

17-OH-PregnonolonPregnenolon

Side chaincleavage enzyme

(CYP11A)

17α−Hydroxylase

17-OH-ProgesteronProgesteron

11-Desoxycortisol

3β-Hydroxysteroid dehydrogenase (CYP17)

21-Hydroxylase (CYP21)

Aldosteron Corticosteron Cortisol

Corticosteron

11β-Hydroxylation

18-Hydroxylation

18-Oxidation

Corticosteron

18-Hydroxy-corticosteron

Ald

oste

rons

ynth

ase

(CY

P11B

2)(P

450a

ldo)

11β-Hydroxylase (C

YP11B

1)(P450c11)

11β-Hydroxylation

ACTH (kurzfristig), ANG II, K +

ANG II, K +

ACTH (langfristig)

Abbildung 2: Syntheseschritte und Regulatoren der Aldosteronproduktion.

Die Aldosteronproduktion unterliegt einem multifaktoriellen Kontrollsystem, durch

welches die Plasmaaldosteronkonzentration an akute und chronische Veränderungen des

Wasser- und Elektrolythaushalts angepasst wird. Neben den wichtigen Regulatoren ANG II

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und der extrazellulären Kaliumkonzentration (VINSON et al. 1985, LOTSHAW 2001,

PEARCE et al. 2003) kontrollieren zahlreiche weitere Substanzen einschließlich

Adrenomedullin (NUSSDORFER et al. 1997), Vasopressin (GALLO-PAYET u.

GUILLON 1998) und Prolactin (GLASOW et al. 1996) die Aldosteronproduktion. In

diversen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass ergänzend zu dem systemischen

ANG II das lokale Renin-Angiotensin-System der Nebennierenrinde einen bedeutenden

Stimulus der Aldosteronproduktion darstellt (HILBERS et al. 1999, MAZZOCCHI et al.

2000). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnten alle Komponenten des Renin-

Angiotensin-Systems in den Zellen der Zona glomerulosa nachgewiesen werden

(MULROW 1999).

ACTH, der dominierende Regulator der Glucocorticoidproduktion, bewirkt hingegen nur

eine zeitlich begrenzte Stimulation und wirkt über längeren Zeitraum inhibierend auf die

Aldosteronproduktion (LUMBERS 1999, SEWER u. WATERMAN 2003). In zahlreichen

Experimenten an isolierten Nebennierenzellen und Nebennierenstücken konnten weitere

Faktoren identifiziert werden, die einen modulierenden Einfluss auf die

Aldosteronsekretion ausüben. Hierzu gehören unter anderem Endothelin (ROSOLOWSKY

u. CAMPBELL 1990), Stickoxid (HANKE u. CAMPBELL 2000), das atriale natriuretische

Peptid (ATARASHI et al. 1985) und Veränderungen der extrazellulären Osmolalität

(MAKARA et al. 2000).

Die Regulation der Aldosteronsekretion auf zellulärer Ebene erfolgt über verschiedene

Signalkaskaden. So wird die ACTH-Wirkung über cAMP und die Stimulierung mittels

ANG II unter anderem durch den Phosphatidylinositolmechanismus vermittelt (SPÄT

1988, SPÄT et al. 1991). Intensive in vitro Untersuchungen unterstreichen jedoch die große

Bedeutung der intrazellulären Ca2+-Konzentration (siehe Abb. 3). So wird durch einen

Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration die Aldosteronsekretion stimuliert (SPÄT et

al. 1991, ROSSIER et al. 1996 a). Der Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration

erfolgt aufgrund einer Aktivierung von T- und L-Typ Ca2+-Kanälen (ROSSIER et al. 1996

b) und nichtselektiven Kationenkanälen (LOTSHAW u. LI 1996) sowie durch Freisetzung

von Ca2+ aus intrazellulären Calciumspeichern (BARRETT et al. 1989). Die

spannungsabhängigen T- und L-Typ Ca2+-Kanäle werden durch Membrandepolarisation

unter anderem infolge eines Anstiegs der extrazellulären K+-Konzentration aktiviert und,

wie Untersuchungen zeigten, durch ANG II in ihrer Funktion moduliert (CHEN et al. 1999

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b). Da die Höhe des Membranpotentials eng mit der Aktivität von Kaliumkanälen

korreliert, wurde bereits seit längerem vermutet, dass eine Modulation von Kaliumkanälen

durch Änderung der extrazellulären Kaliumkonzentration und/oder ANG II maßgeblich an

der Regulation der Aldosteronsekretion beteiligt sein könnte. Trotz zahlreicher

Untersuchungen und des Nachweises einer Reihe von Kaliumkanaluntereinheiten in Zellen

der Zona glomerulosa konnte jedoch bis heute kein Konsens hinsichtlich ihrer Relevanz für

die Aldosteronsekretion herbeigeführt werden (BRAUNEIS et al. 1991, VASSILEV et al.

1992, PAYET et al. 1995, LOTSHAW 1997 a, b).

ANG II

ACTHCa 2+

(AT1b-Rezeptor)

IP3

Ca2+Ca2+ Ca2+Ca 2+

K+Ca 2+

Ca 2+

DAG

PKCCalmodulin

CaMK

(ACTH-Rezeptor)

Ca 2+ATPcAMP

Aldosteronsynthese

Ca 2+

(T-typCa2+-Kanal)

PKA

(G-Protein)

(NSCC)

Abbildung 3: Schematische Darstellung der zellulären Signalkaskade bei

Stimulation der Aldosteronsekretion durch K+, ANG II und ACTH. NSCC: nichtselektiver Kationenkanal; PKA: Proteinkinase A; PKC: Proteinkinase C; IP3: Inositoltriphosphat; DAG: Diacylglycerol; ATP: Adenosintriphosphat; cAMP: cyclisches Adenosinmonophosphat; CaMK: Ca2+/Calmodulinabhängige Proteinkinase.

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Seit langem ist die essentielle Bedeutung von Aldosteron für die Homöostase des Wasser-

und Elektrolythaushaltes bekannt, welche in neueren Untersuchungen an transgenen

Mäusen eindrucksvoll bestätigt wurde (BERGER et al. 1998). So besteht die wichtigste

systemische Funktion des Aldosterons in der Steigerung des transepithelialen

Ionentransports (insbesondere für Na+, K+ und Cl-) vor allem in der Niere, jedoch auch dem

Kolon, den Speicheldrüsen und den Schweißdrüsen. Hieraus resultiert eine Veränderung

der Ionenkonzentration im Plasma sowie des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens und des

Blutdrucks (PEARCE et al. 2003). In der Niere führt Aldosteron in den distalen

Tubulusabschnitten zu einer funktionellen Aktivierung des Epithelialen Natriumkanals

„ENaC“ (CHEN et al. 1999 a, ROSSIER et al. 2002, KAMYNINA u. STAUB 2002), der

Na+/K+-ATPase (VERREY et al. 2003), des Na+/Cl--Cotransporter (ABDALLAH et al.

2001) und des Cl-/Anionen-Austauscher „Pendrin“ (VERLANDER et al. 2003).

Durch zahlreiche Untersuchungen konnten darüber hinaus Mineralocorticoidrezeptoren in

nicht-epithelialen Geweben einschließlich Blutgefäßen und Herz identifiziert werden

(MOGUILEWSKY u. RAYNAUD 1980, COIRINI et al. 1983, GOMEZ-SANCHEZ 1997,

BARBATO et al. 2002). Durch verschiedene Arbeitsgruppen wurde die Hypothese

gefestigt, dass Aldosteron auch in den Blutgefäßen regulierend an dem zellulären

Elektrolyttransport beteiligt ist (ALZAMORA et al. 2003, JIANG et al. 2003). Die

Wirkung von Aldosteron auf kardiale Zellen unter physiologischen Bedingungen ist bis

heute jedoch nicht zweifelsfrei geklärt. Im Gegensatz hierzu konnte deutlich gezeigt

werden, dass Aldosteron in die Pathogenese von kardialen Erkrankungen einschließlich

Herzhypertrophie und –fibrose sowie Arrhythmien involviert ist und auch ein lokales,

kardiales Aldosteronsystem an dem Krankheitsgeschehen beteiligt ist (DELCAYRE et al.

2000, WEBER et al. 2003). Durch pharmakologische Untersuchungen mit

Aldosteronrezeptor-Antagonisten wie Spironolacton und Eplerenon sowie durch

experimentelle Studien an transgenen Mausmodellen konnte diese Hypothese untermauert

werden (ROCHA et al. 2000, DELYANI et al. 2001, OESTREICHER et al. 2003, STIER

et al. 2003).

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2.1.1.2 Hyperaldosteronismus

Hyperaldosteronismus ist eine Erkrankung, die durch eine gesteigerte Sekretion des

Mineralocorticoids Aldosteron verursacht wird und mit spezifischen Symptomen

einhergeht. Anhand der Ätiologie werden ein primärer (adrenaler) und ein sekundärer

(extraadrenaler) Hyperaldosteronismus unterschieden.

Der primäre Hyperaldosteronismus wird neben der erhöhten Aldosteronproduktion in der

Regel durch Hypertonie, Hypokaliämie und in vielen Fällen durch eine Hypernatriämie

charakterisiert (EDER u. GEDIGK 1990). Die Hypokaliämie kann klinische Symptome wie

Muskelschwäche, Muskelkrämpfe, Obstipation und EKG-Veränderungen verursachen.

Weiterhin kann sich infolge der Hypokaliämie eine metabolische Alkalose entwickeln

(NUSSBERGER 2003, MELBY 1989).

Auf zellulärer Ebene werden die Folgen des Hyperaldosteronismus in erster Linie durch

eine Funktionssteigerung des Epithelialen Natriumkanals im distalen Tubulussystem

hervorgerufen (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Durch zahlreiche Arbeitsgruppen

konnte nachgewiesen werden, dass Aldosteron sowohl eine Aktivierung der vorhandenen

Kanäle bewirkt als auch eine Steigerung der Expression des Epithelialen Natriumkanals in

der apikalen Plasmamembran induziert (ROTIN et al. 2001, VERREY et al. 2003).

Hierdurch erfolgt primär eine verstärkte Reabsorption von Na+ und sekundär, durch

Zunahme des transepithelialen Potentials, eine Steigerung der transepithelialen Diffusion

von Cl-. Auf der basolateralen Seite wird durch Aldosteron die Aktivität der Na+/K+-

ATPase gesteigert, so dass die Natriumionen vermehrt aus den Zellen ins Blut transportiert

werden. Durch die Aktivität der Na+/K+-ATPase steigt intrazellulär die

Kaliumkonzentration, wodurch eine erhöhte Sekretion von Kaliumionen durch

Kaliumkanäle der apikalen Plasmamembran, die ebenfalls direkt durch Aldosteron

hochreguliert werden, in das Lumen erfolgt (FRINDT et al. 2002). Durch sekundäre

Steuerungsprozesse erfolgt aufgrund der Elektrolytverschiebung eine Wasserretention,

welche zu einem erhöhten Blutvolumen und damit verbundener Hypertonie führt.

In den letzten Jahren konnte durch verschiedene Arbeitsgruppen demonstriert werden, dass

Hyperaldosteronismus neben den beschriebenen systemischen auch organische

Veränderungen induzieren kann. So wurde die Beteiligung von Aldosteron bei der

Entstehung kardialer Hypertrophie und Fibrose, welche unabhängig vom Blutdruckanstieg

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entstehen, nachgewiesen (NICOLETTI et al. 1995, FIEBELER et al. 2001, MIHAILIDOU

et al. 2002). BROWN et al. (2000) stellten des Weiteren einen ätiologischen

Zusammenhang zwischen der Wirkung von Aldosteron und der Entwicklung von

Nephrosklerosen fest.

Das Krankheitsbild des primären Hyperaldosteronismus wurde erstmals von CONN (1955)

beschrieben und hat als Conn-Syndrom Eingang in die Literatur gefunden. Aktuell gewinnt

der primäre Aldosteronismus im Zusammenhang mit der Erforschung primärer Hypertonien

an Bedeutung. Neueren Untersuchungen zufolge soll seine Prävalenz 2,6 bis 11 Prozent in

Spezialambulanzen betragen und somit eine häufige Ursache arterieller Hypertonien sein

(REINCKE et al. 2003). Der primäre Hyperaldosteronismus entsteht durch eine gesteigerte

Aldosteronfreisetzung, die auf pathologische Veränderungen der Nebennieren

zurückzuführen ist (KELLENBERGER u. SCHILD 2002). Als Folge des erhöhten

Plasmaaldosteronspiegels wird die Produktion von Renin durch negativen Feedback

reduziert. Ursachen der gesteigerten Aldosteronfreisetzung können beispielsweise

aldosteronproduzierende Nebennierenrindentumore, Nebennierenhyperplasien sowie

verschiedene genetische Defekte sein. In den letzten Jahren konnte eine Reihe von

genetischen Mutationen identifiziert werden, die zu einem Hyperaldosteronismus führen

(LIFTON et al. 1992, PASCOE et al. 1992, STOWASSER u. GORDON 2000).

Die Ätiologie des sekundären Hyperaldosteronismus ist sehr umfangreich. Verschiedene

Erkrankungen wie Nierenarterienstenosen, chronische Nierenerkrankungen,

reninproduzierende Tumore, Herzinsuffizienzen und autosomal-rezessiv vererbte renale

Tubulusstörungen mit Kaliumverlust, das sogenannte „Bartter-Syndrom“, können einem

sekundären Hyperaldosteronismus zu Grunde liegen (DeGROOT 1989).

Als Folge der primären Erkrankung kommt es zu einer Stimulation des Renin-Angiotensin-

Aldosteron-Systems, welche durch eine Steigerung der Plasmarenin- und

Aldosteronkonzentrationen charakterisiert ist.

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2.2 Ionenkanäle

Alle Zellen des Organismus werden von ihrer Umgebung sowie anderen Zellen durch

hydrophobe Diffusionsbarrieren, den Membranen, abgegrenzt, durch welche jedoch eine

Kommunikation mit der Umgebung erfolgen kann. So werden aufgrund von

Ionenbewegungen durch die Membran wichtige zelluläre Mechanismen wie beispielsweise

Membranpotentialänderungen und daran gekoppelte physiologische Prozesse vermittelt. Die

Lipiddoppelschicht der Zellmembran ist jedoch für geladene Teilchen quasi nicht permeabel,

und so erfolgt der zelluläre Ionenaustausch über verschiedene integrale

Transmembranproteine. Zu diesen Transportproteinen gehören neben Ionenpumpen, die unter

Energieverbrauch Ionen entgegen ihres Konzentrationsgefälles transportieren, sogenannte

Ionenkanäle, welche Ionen entlang ihres Konzentrationsgefälles den Durchtritt durch die

Plasmamembran per Diffusion ermöglichen. Die meisten dieser Kanäle besitzen aufgrund

von sogenannten Selektivitätsfiltern extrem unterschiedliche Leitfähigkeiten für spezifische

Ionen, so dass sie wegen ihrer Selektivität unter anderem in Ca2+-, K+-, Na+- sowie Cl--

Kanäle eingeteilt werden können. Differenzierte physikalische Eigenschaften ermöglichen

eine weitere Spezifizierung der Kanäle. So lassen sich mit Hilfe biophysikalischer

Untersuchungsmethoden die Aktivierungs- und Inaktivierungskinetiken bestimmen sowie

Regulatoren des Schaltverhaltens und pharmakologische Sensitivitäten identifizieren

(ASHCROFT 1999, HILLE 2001).

2.2.1 Kaliumkanäle

Kaliumselektive Ionenkanäle wurden bis heute in allen Zelltypen nachgewiesen. So werden

Kaliumkanäle sowohl in erregbaren als auch in nicht-erregbaren Zellen exprimiert und sind

an zahlreichen physiologischen Mechanismen beteiligt. Dazu gehören unter anderem die

Kontraktion und Relaxation glatter Muskelzellen, die Weiterleitung von Aktionspotentialen,

die Sekretion von Insulin, die Homöostase des Salz- und Wasserhaushalts in Nierenzellen,

die Zellproliferation und in Neuronen die Steuerung elektrischer Erregbarkeit und

synaptischer Plastizität. Einige Kaliumkanäle sind von Natur aus aktiv, wohingegen jedoch

die Mehrzahl der Kaliumkanäle durch physiologische Signale (z.B.

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Membranpotentialänderung, Second messenger) aktiviert werden (JAN u. JAN 1994).

Darüber hinaus wird die Sensitivität der Kaliumkanäle gegenüber dem physiologischen

Signal in vielen Fällen durch Proteinphosphorylierung bzw. -dephosphorylierung moduliert

(LEVITAN 1999).

Die meisten Kaliumkanäle setzen sich aus mindestens zwei verschiedenen Untereinheiten

zusammen, den porenbildenden α-Untereinheiten und β-Untereinheiten, die regulatorische

Eigenschaften aufweisen. Durch Interaktion von vier α-Untereinheiten entsteht ein tetrameres

integrales Membranprotein, welches den lipophilen Kanal bildet (ASHCROFT 1999).

Die Kaliumkanäle werden aufgrund der unterschiedlichen Anzahl von hydrophoben

Transmembransegmenten (TM) der α-Untereinheiten in zwei umfassende Strukturklassen

eingeteilt. Die erste Klasse umfasst die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus sechs

transmembranen Helices besteht (6TM-Klasse). Zu dieser Klasse gehören unter anderem die

Familie der spannungsabhängigen Kaliumkanäle (Kv), die KCNQ Kanäle, die Familie der

Eag Kanäle und die calciumaktivierten Kaliumkanäle (Ca2+-aktivierte K+-Kanäle). Das S4

Segment der spannungsgesteuerten Kanäle dieser Klasse enthält in regelmäßiger Abfolge

basische Aminosäuren (v.a. Arginin und Lysin) und fungiert als Spannungsmesser (HILLE

2001). Bei allen Mitgliedern der 6TM-Klasse befindet sich die Porenregion zwischen den

Transmembransegmenten S5 und S6 (siehe Abb. 4).

Zur zweiten großen Klasse gehören die Kaliumkanäle, deren α-Untereinheiten aus zwei

transmembranen Helices gebildet werden (2TM-Klasse). Der einwärts gleichrichtende

Kaliumkanal (Kir) ist ein Vertreter dieser Gruppe (ASHCROFT 1999, MILLER 2000).

Alle bisher bekannten α-Untereinheiten von Kaliumkanälen besitzen mit kleinen Variationen

die sogenannte Signatursequenz (S) in der Porenregion. Diese Signatursequenz umfasst einen

Bereich von 21 Aminosäuren und zeigt eine sehr starke Homologie innerhalb der Mitglieder

der Kaliumkanäle. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Bereich innerhalb der Kanalpore

einen Selektivitätsfilter für Kaliumionen darstellt (HARTMANN et al. 1991,

HEGINBOTHAM et al. 1994).

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Abbildung 4: Membrantopologie und wichtigste Bestandteile der α-Untereinheit von Kv und Kir. Nummerierung der transmembranen Helices: Kv S1-S6 u. Kir; M1-M2; P = Pore; S = Signatursequenz; N = Aminoterminus; C = Carboxyterminus; T1 = T1 Domäne; die extrazelluläre Seite befindet sich oberhalb der einzelnen Abbildungen.

In der Regel sind bei den Vertretern beider Klassen sowohl der N-Terminus als auch der C-

Terminus cytoplasmatisch lokalisiert. Eine Ausnahme bildet der spannungsgesteuerte und

calciumaktivierte Kaliumkanal großer Leitfähigkeit (BK-Kanal), der ein zusätzliches

Transmembransegment S0 besitzt, aufgrund dessen der N-Terminus extrazellulär lokalisiert

ist (MEERA et al. 1997).

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2.2.1.1 Ca2+-aktivierter K+-Kanal

GARDOS demonstrierte an Erythrozyten 1958 als Erster, dass durch Änderung der

intrazellulären Ca2+-Konzentration der Kaliumfluss durch die Zellmembran reguliert wird.

Bis heute wurden der Familie der Ca2+-aktivierten K+-Kanälen drei strukturell

unterschiedliche Kaliumkanäle, die SK-, IK- und BK-Kanäle, zugeordnet, die alle durch

einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration aktiviert werden. Anhand ihrer

Einzelkanalleitfähigkeit lassen sich die drei Subfamilien elektrophysiologisch

differenzieren (VERGARA et al. 1998). Darüber hinaus besitzen sie unterschiedliche

Spannungssensitivitäten und reagieren differenziert auf pharmakologisch wirksame

Substanzen.

2.2.1.1.1 SK-Kanal (small conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)

SK-Kanäle besitzen sehr kleine Einzelkanalleitfähigkeiten ≤ 20 pS (in 140 mM

symmetrischer KCl-Lösung). Im Gegensatz zu den BK-Kanälen werden die SK-Kanäle

bereits durch nanomolare Ca2+-Konzentrationen spannungsunabhängig aktiviert (Vergara et

al. 1998, LATORRE et al. 1989). Ca2+ interagiert jedoch nicht direkt mit dem SK-Kanal,

vielmehr wird die Aktivierung durch Calmodulin vermittelt, welches einen heteromeren

Komplex mit der α-Untereinheit des Kanals bildet (XIA et al. 1998).

Mittels Klonierung konnten drei Typen von SK-Kanälen (SK1, SK2 und SK3) identifiziert

werden, die alle eine große strukturelle Ähnlichkeit mit den Kv-Kanälen aufweisen

(KÖHLER et al. 1996). Die Unterscheidung der drei SK-Kanäle ist pharmakologisch

aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber dem Bienengift Apamin möglich

(GRUNNET et al. 2001).

SK-Kanäle konnten in zahlreichen erregbaren und nicht-erregbaren Zellen

(Skelettmuskelzellen, glatte Muskelzellen, Zentrales Nervensystem, chromaffine Zellen der

Nebenniere, T-Lymphozyten etc.) nachgewiesen werden (GRUNNET et al. 2001). In

erregbaren Zellen fällt den SK-Kanälen eine fundamentale Rolle bei der Hyperpolarisation

des Membranpotentials zu. So werden sie durch den Anstieg der intrazellulären Ca2+-

Konzentration während eines Aktionspotentials aktiviert, was zu einer

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Membranhyperpolarisation und damit zu einer Hemmung der Erregbarkeit der Zellen führt

(VERGARA et al. 1998).

2.2.1.1.2 IK-Kanal (intermediate conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)

IK-Kanäle besitzen eine mittlere Einzelkanalleitfähigkeit zwischen 20 und 80 pS. Die IK-

Kanäle werden genau wie die SK-Kanäle bereits durch nanomolare Ca2+-Konzentration

spannungsunabhängig aktiviert (LATORRE et al. 1989, VERGARA et al. 1998). Ebenfalls

vermittelt auch bei den IK-Kanälen Calmodulin die Ca2+-abhängige Aktivierung der Kanäle

(JOINER et al. 2001).

IK-Kanäle werden hauptsächlich in nicht-erregbaren Zellen (wie Blut-, Endothel- und

Epithelzellen) exprimiert, konnten jedoch auch in glatten Muskelzellen nachgewiesen

werden. In nicht-erregbaren Zellen wird die Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern

durch verschiedene Substanzen wie beispielsweise Bradykinin, ATP und Histamin,

induziert (GRYGORCZYK u. SCHWARZ 1983, JENSEN et al. 1998).

Pharmakologisch lassen sich die IK-Kanäle eindeutig von den SK- und BK-Kanälen

unterscheiden. So können die IK-Kanäle durch das Skorpiongift Charybdotoxin und das

Antimykotikum Clotrimazol reversibel blockiert werden. Im Gegensatz zu den BK-

Kanälen sind sie jedoch insensitiv gegenüber dem Skorpiongift Iberiotoxin. Von den SK-

Kanälen können sie durch ihre Insensivität gegenüber Apamin differenziert werden (ISHII

et al. 1997).

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2.2.1.1.3 BK-Kanal (big conductance Ca2+-aktivierter K+-Kanal)

Vorkommen und Funktion

BK-Kanäle (auch als KCNM1, Slo (slowpoke) oder MaxiK+-Kanal bezeichnet) werden

ubiquitär in Zellen und Geweben mit Ausnahme der Myozyten des Herzens exprimiert

(TORO et al. 1998). So konnten bis heute BK-Kanäle aus zahlreichen Geweben

einschließlich Neuronen des zentralen Nervensystems (TSENG-CRANK et al. 1994),

glatten Muskelzellen (SCORNIK et al. 1993, KNAUS et al. 1994) und renalen

Tubuluszellen (KNAUS et al. 1995) isoliert und mittels molekularbiologischer Nachweise

identifiziert werden.

Die ubiquitäre Verteilung legt nahe, dass die BK-Kanäle an zahlreichen physiologischen

Mechanismen beteiligt sind. So konnte gezeigt werden, dass die BK-Kanäle unter anderem

in die Regulation der Sekretion exokriner Drüsen (TRAUTMANN u. MARTY 1984), die

Regulation des Elektrolyt- und Wasserhaushalts in der Niere und im Kolon (GRUNNET et

al. 1999, BRAVO-ZEHNDER et al. 2000, HAY-SCHMIDT et al. 2003, PLUZNICK et al.

2003), die Regulation der Magenmotilität (CARL et al. 1990) und der

Neurotransmitterfreisetzung in Neuronen (TSENG-CRANK et al. 1996) involviert sind. In

glatten Muskelzellen übernehmen die BK-Kanäle eine Schlüsselrolle bei der Regulation

der myogenen Kontraktilität (NELSON et al. 1995).

Ferner konnte nachgewiesen werden, dass die BK-Kanäle in unmittelbarer Nachbarschaft

von L-Typ Calciumkanälen und sarkoplasmatischen Calciumspeichern lokalisiert sind und

als Rückkopplungsmodulatoren dieser Calciumkanäle fungieren. Durch Aktivierung der

BK-Kanäle erfolgt ein Kaliumauswärtsstrom, infolgedessen eine Hyperpolarisation der

Plasmamembran mit Inaktivierung der L-Typ Ca2+-Kanäle erfolgt. Dadurch werden die

zellulären Mechanismen gedämpft, die durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-

Konzentration und/oder Membrandepolarisation eingeleitet wurden (NELSON et al. 1995).

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Molekulare Struktur

BK-Kanäle bestehen aus hetero-oligomeren Komplexen von Poren-bildenden α-

Untereinheiten (neue Nomenklatur: KCNM1) sowie assoziierten β-Untereinheiten (neue

Nomenklatur: KCNMB1-4) mit regulatorischen Eigenschaften (GARCIA-CALVO et al.

1994, BEHRENS et al. 2000). Essentiell für die Bildung eines funktionellen Kanals ist die

Assoziation von 4 α-Untereinheiten zu einem tetrameren Proteinkomplex.

α-Untereinheit

Die α-Untereinheit wurde zuerst aus der Fliege Drosophila melanogaster (ATKINSON et

al. 1991) und später aus verschiedenen anderen Spezies einschließlich Mensch kloniert

(BUTLER et al. 1993, TSENG-CRANK et al. 1994, VOGALIS et al. 1996). Sie wird von

nur einem Gen kodiert, das jedoch mehrere Splicestellen aufweist (TSENG-CRANK et al.

1994, KNAUS et al. 1995). Die Splicestellen sind auf dem C-Terminus lokalisiert, welcher

2/3 der gesamten Länge der Untereinheit einnimmt (ORIO et al. 2002). Die verschiedenen

Splicevarianten unterscheiden sich hinsichtlich ihrer biophysikalischen und biochemischen

Eigenschaften, wodurch gewebespezifische Unterschiede in der Regulation und in der

physiologischen Funktion der BK-Kanäle erklärt werden können (KNAUS et al. 1995).

Die α-Untereinheit weist eine große Homologie zu der α-Untereinheit der Kv-Kanäle auf.

Zusätzlich zu den 6 Transmembransegmenten besitzt sie jedoch ein 7.

Transmembransegment (S0), das dem S1-Segment vorgeschaltet ist. Durch dieses

zusätzliche Segment verlagert sich der N-Terminus der α-Untereinheiten auf die

extrazelluläre Seite. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl diese extrazelluläre

Lokalisation als auch das S0-Segment entscheidend für die Interaktion mit der

regulatorischen β-Untereinheit ist (WALLNER et al. 1996, MEERA et al. 1997).

Die α-Untereinheit wird in zwei große Abschnitte unterteilt (siehe Abb. 5): einerseits den

Kern (core), welcher sich vom N-Terminus bis zur Verbindung zwischen dem S8 und dem

S9 Segment erstreckt, und anderseits den sich anschließenden Schwanz (tail). Der Kern

umfasst unter anderem den N-Terminus, den Spannungssensor im S4-Segment und die

Pore. Im Schwanz sind ein wichtiger Ca2+-Sensor und das Ende des C-Terminus lokalisiert.

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Abbildung 5 (ORIO et al. 2002): Molekulare Struktur des BK-Kanals. Topologie der α- und β-Untereinheit.

Die β-Untereinheit

Die β-Untereinheiten der BK-Kanäle sind im Gegensatz zu den cytosolisch lokalisierten β-

Untereinheiten der Kv-Kanäle membranständige Proteine (KNAUS et al. 1994, WALLNER

et al. 1999, XIA et al. 1999). Sie wurden zuerst von KNAUS et al. (1994) aus Gewebe von

Rindertracheen isoliert. Bis heute konnten 4 Varianten der β-Untereinheit (β1–β4)

identifiziert werden, die in chronologischer Reihenfolge nach ihrer Entdeckung nummeriert

wurden. Die β-Untereinheiten weisen untereinander eine große Homologie auf. Sie besitzen

zwei homologe membranspannende Segmente, intrazellulär lokalisierte N- und C- Termini

(siehe Abb. 5) und eine große extrazelluläre Schleife mit zwei Glycosylierungsstellen und

vier Cysteinloci, welche Disulfidbrücken ausbilden (BRENNER et al. 2000 a, JIANG et al.

1998). Am N-Terminus befindet sich eine Phosphorylierungsregion für die cAMP-

abhängige Proteinkinase PKA (CHANG et al. 1997).

Die vier β-Untereinheiten werden gewebespezifisch unterschiedlich stark exprimiert:

o Die β1-Untereinheit kommt hauptsächlich in glatten Muskelzellen vor (KNAUS et al.

1994, VOGALIS et al. 1996), konnte jedoch auch im Gehirn (TSENG-CRANK et al.

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Literaturübersicht

1996, CHANG et al. 1997) und in Haarzellen von Vögeln (RAMANATHAN et al.

1999 u. 2000) detektiert werden.

o Die β2-Untereinheit konnte unter anderem in humanen chromaffinen Zellen und in

humanem Hirngewebe nachgewiesen werden (WALLNER et al. 1999, BRENNER et

al. 2000 b).

o Die β3-Untereinheit wird in zahlreichen Geweben relativ schwach exprimiert und

konnte von BRENNER et al. (2000 a) bei Menschen nur im Hodengewebe in größeren

Mengen nachgewiesen werden.

o Die β4-Untereinheit ist die β-Untereinheit mit der geringsten Homologie und wird vor

allem im Gehirn in verschiedenen Regionen exprimiert (MEERA et al. 2000).

Die β-Untereinheiten variieren außerdem in ihrem stoichometrischen Verhalten gegenüber

der α-Untereinheit. In der Regel wird die β1-Untereinheit in den glatten Muskelzellen im

Verhältnis 1:1 zu der α-Untereinheit exprimiert (KNAUS et al. 1994), wohingegen im

Gehirn die α-Untereinheit deutlich häufiger als die β4-Untereinheit vorkommt (CHANG et

al. 1996, WANNER et al. 1999).

Durch die β-Untereinheiten wird in außerordentlichem Masse die Ca2+-Sensitivität und die

Öffnungskinetik der BK-Kanäle moduliert. So konnte mittels elektrophysiologischer

Untersuchungen gezeigt werden, dass durch die Koexpression der β-Untereinheiten die

Aktivierungs- und Deaktivierungskinetik der BK-Kanäle verlangsamt und deren Ca2+-

Sensitivität erhöht wurde (VOGALIS et al. 1996, ORIO et al. 2002, QIAN u. MAGLEBY

2003). Nur die β2-Untereinheit, welche die Aktivierungszeit des Kanals verkürzt, stellt eine

Ausnahme dar. Diese Inaktivierung wird durch einen Inaktivierungsball am N-Terminus

der β2-Untereinheit vermittelt, welcher mit der α-Untereinheit interagiert (WALLNER et

al. 1999).

Durch die Koexpression der α- und β-Untereinheit werden außerdem die

pharmakologischen und biochemischen Eigenschaften sowie die Toxinbindung der BK-

Kanäle moduliert (HANNER et al. 1997 u. 1998, ORIO et al. 2002, PATTERSON et al.

2002).

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Literaturübersicht

Aktivierung

BK-Kanäle lassen sich elektrophysiologisch anhand ihrer hohen Einzelkanalleitfähigkeit

von den vorher beschriebenen SK- und IK-Kanälen unterscheiden. So werden in der

Literatur Einzelkanalleitfähigkeiten zwischen 100 und 250 pS in symmetrischer KCl-

Lösung beschrieben (LATORRE et al. 1989). Im Gegensatz zu den IK- und SK-Kanälen

werden die BK-Kanäle spannungsabhängig durch Membranpotentialänderungen aktiviert.

Der Spannungssensor ist bei den BK-Kanälen wie bei den KV-Kanälen im S4-Segment

lokalisiert (DIAZ et al. 1998, SMITH-MAXWELL et al. 1998).

Durch lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration über 1µM wird die

Spannungssensitivität moduliert (STEFANI et al. 1997, TORO et al. 1998). So zeigten

HORRIGAN u. ALDRICH (2002) in sehr umfangreichen Experimenten, dass durch

Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentrationen die Offenwahrscheinlichkeit der BK-

Kanäle in Abhängigkeit von dem Membranpotential deutlich vergrößert wird. Bei extrem

hohen intrazellulären Ca2+-Konzentrationen werden die BK-Kanäle schon bei normalen

Ruhemembranpotentialen aktiviert (BUTLER et al. 1993). Zwei auf dem C-Terminus

gelegene Regionen konnten als Bindungsstellen für Ca2+ identifiziert werden: Zum einen

der sogenannte „Calcium-bowl“, welcher kurz vor dem S10-Segment liegt, und zum

anderen die Regulatorenregion „RCK“ (regulator of conductance for K+), die zwischen S6

und S7 lokalisiert wurde. Diese Region dient neben Ca2+ noch weiteren Liganden (z.B.

Kationen, Nucleotiden) als Bindungsstelle (XIA et al. 2002). Durch PISKOROWSKI u.

ALDRICH (2002) werden diese Lokalisationen jedoch sehr kontrovers diskutiert, da sie in

ihren Experimenten zeigen konnten, dass auch nach Entfernung dieser beiden Regionen, die

Ca2+-Sensitivität des Kanals nicht verändert war, sondern nur das Schaltverhalten

modifiziert wurde.

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Literaturübersicht

Blockade

Die BK-Kanäle lassen sich von den anderen Mitgliedern der Familie der Ca2+-aktivierten

K+-Kanäle aufgrund ihrer pharmakologischen Eigenschaften differenzieren. So sind sie im

Gegensatz zu den IK-Kanälen durch Iberiotoxin hemmbar. Die Unterscheidung der β-

Untereinheiten ist pharmakologisch aufgrund ihrer dosisabhängigen Sensitivität gegenüber

Iberiotoxin möglich (MEERA et al. 2000). Zusätzlich blockieren Charybdotoxin,

Tetraethylammonium und Tertrapentylammonium (CARL et al. 1993, GARCIA et al.

1997) und, wie neueste Untersuchungen zeigten, auch das Skorpiongift Slotoxin

(GARCIA-VALDES et al. 2001) die BK-Kanäle. Im Gegensatz zu den SK-Kanälen

verhalten sich die BK-Kanäle jedoch insensitiv gegenüber Apamin.

Modulation

Wie bereits unter dem Abschnitt „Vorkommen und Funktion“ (Seite 29) aufgeführt, sind

die BK-Kanäle in den verschiedensten Geweben an zahlreichen Funktionen beteiligt. Diese

gewebespezifische Funktionalität des Kanals wird durch diverse Modulatoren

gewährleistet, welche die Eigenschaften der BK-Kanäle verändern. Neben den zahlreichen

Splicevarianten tragen, wie vorher beschrieben, die β-Untereinheiten in überragender

Weise zu dieser gewebespezifischen Diversität der BK-Kanäle bei. Zusätzlich werden

jedoch die Aktivität und Aktivierbarkeit der Kanäle durch zahlreiche körpereigene

Substanzen und Second messenger Systeme maßgeblich beeinflusst und somit die

Zellfunktion an akute Stoffwechselbedürfnisse und spezifische Leistungen angepasst

(TORO et al. 1998).

So konnte in den letzten Jahren durch zahlreiche Arbeitsgruppen nachgewiesen werden,

dass die Aktivität der BK-Kanäle durch die Phosphorylierung der α- und β-Untereinheiten

mittels Proteinkinasen verändert wird (SCHUBERT u. NELSON 2001). In Abhängigkeit

von der Lokalisation und der Proteinkinase erfolgt eine Aktivierung bzw. Inhibierung der

Kanäle. An der Aktivierung der Proteinkinasen sind wiederum zahlreiche Substanzen als

Second messenger beteiligt.

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Literaturübersicht

PKA

Die cAMP-abhängige Proteinkinase A aktiviert die BK-Kanäle in glatten Muskelzellen und

Neuronen, inhibiert sie jedoch in endokrinen Zellen und in der Hypophyse (TIAN et al.

1998 u. 2001). Die PKA induziert v.a. eine N-terminale Phosphorylierung der β-

Untereinheit. Die aktivierende Wirkung unterschiedlichster Substanzen wird über PKA

durch Second messenger vermittelt. So zeigten SCORNIK et al. bereits 1993, dass durch β-

adrenerge Substanzen wie Isoproterenol eine Aktivierung der BK-Kanäle über PKA

vermittelt werden kann. Ebenso ist die Relaxation von Gefäßen infolge einer Behandlung

mit dem PGI2-Analogon Beraprost unter anderem cAMP vermittelt (YAMAKI et al. 2001).

Auch die vasodilatorische Wirkung von VIP wird neben anderen Mechanismen durch eine

Aktivierung von cAMP und nachfolgender Aktivierung der PKA erzielt (TANAKA et al.

1999).

PKG

ROBERTSON et al. (1993) zeigten in Patch clamp Untersuchungen an glatten

Muskelzellen von Cerebralarterien der Ratte eine Aktivierung der BK-Kanäle durch die

cGMP-abhängige Proteinkinase G. Sie konnten weiterhin nachweisen, dass durch NO und

Nitroprussid eine Aktivierung der PKG erfolgt, wodurch eine Vasodilatation der Gefäße

vermittelt wird.

ALIOUA et al. (1998) konnten in heterologen Expressionsexperimenten in Xenopus

Oozyten nachweisen, dass die PKG aktivierend auf humane BK-Kanäle wirkt. Die Befunde

ergaben, dass durch die Phosphorylierung der α-Untereinheit die Offenwahrscheinlichkeit

der BK-Kanäle signifikant erhöht wird. Infolgedessen erfolgt eine längere und stärkere

Hyperpolarisation der Zellen und der myogene Tonus der Gefäße wird reduziert. So ist eine

Aktivierung der BK-Kanäle mittels PKG ebenfalls entscheidend an der Vasorelaxation

durch das atriale natriuretische Peptid beteiligt (TANAKA et al. 1998).

PKC

Die Ca2+-abhängige Proteinkinase C führt in glatten Muskelzellen zu einer verminderten

Aktivität der BK-Kanäle unter der Voraussetzung einer Koexpression der α- und β1-

Untereinheit. So zeigten HAGEN et al. (2003) in elektrophysiologischen Untersuchungen

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Literaturübersicht

an Myozyten des Kolons von Mäusen, dass die Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle

sowie die Amplitude und die Frequenz des Kaliumauswärtsstroms durch eine Aktivierung

der PKC reduziert werden konnten. Die Aktivierung der PKC erfolgt sowohl über den

Einstrom von Ca2+ durch nichtselektive Ca2+-Kanäle, als auch über die Bindung von

Acetylcholin an muskarinerge Rezeptoren und ATP mit nachgeschalteter Aktivierung des

Phosphatidylinositolmechanismus und direkter Wirkung des freigesetzten Diacylglycerols

auf die Aktivität der Proteinkinase C (BAYGUINOV et al. 2001). Als Ergänzung zu diesen

Befunden zeigten BAYGUINOV et al. (2003) eine Aktivierung der BK-Kanäle durch

Substanz P, welche ebenfalls indirekt über eine Aktivierung der PKC vermittelt wird. In

diesem Fall ist die aktivierende Wirkung der PKC auf L-Typ Calciumkanäle jedoch von

entscheidender Bedeutung, und erst sekundär erfolgt eine Aktivierung der BK-Kanäle

durch einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration.

Andere körpereigene Botenstoffe modulieren die Aktivität der BK-Kanäle direkt durch

Interaktion mit der α- und/oder β-Untereinheit ohne die Zwischenschaltung eines Second

messengers. So erhöhen Östrogene und Tamoxifen (ein Östrogenantagonist) die

Offenwahrscheinlichkeit der BK-Kanäle und bewirken eine Steigerung der

Spannungssensitivität der Kanäle, infolgedessen die Einzelkanäle bei geringeren

Membranpotentialen aktiviert werden. Diese Wirkung wird jedoch nur in Anwesenheit der

β-Untereinheit beobachtet, wobei die Östrogene und Tamoxifen von der extrazellulären

Seite mit den BK-Kanälen interagieren (VALVERDE et al. 1999, DICK u. SANDERS

2001, DICK et al. 2002). Zusätzlich wird durch Östrogene die Einzelkanalleitfähigkeit

reduziert, was jedoch unabhängig von der β-Untereinheit geschieht und somit auf eine

direkte Interaktion mit der α-Untereinheit hinweist (DICK u. SANDERS 2001).

Die Aktivität der BK-Kanäle wird weiterhin durch H2O2 (SOTO et al. 2002), Angiotensin II

(TORO et al. 1990, ABOULAFIA et al. 2002) und durch einen Anstieg des intrazellulären

Magnesiumgehalts in Anwesenheit der β-Untereinheit moduliert. In Abwesenheit der β-

Untereinheit wirkt Magnesium aktivierend auf die BK-Kanäle (SHI et al. 2002, QIAN u.

MAGLEBY 2003).

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Literaturübersicht

2.2.1.1.4 Einfluss der β1-Untereinheit der BK-Kanäle auf die Blutdruckregulation

Wie bereits beschrieben, werden BK-Kanäle mit der regulatorischen β1-Untereinheit

(BKβ1) in hohem Maße in glatten Muskelzellen verschiedener Organe einschließlich

Blutgefäßen exprimiert (PEREZ et al. 1993, GARCIA-CALVO et al. 1994,

GIANGIACOMO et al. 1995, PETKOV et al. 2001). Glatte Muskulatur ist an der Funktion

vieler Organe einschließlich Magen, Darm, Uterus und Blase beteiligt. In Blutgefäßen

tragen glatte Muskelzellen wesentlich zur Regulation des peripheren Widerstands bei,

indem sie den Durchmesser der Gefäße mittels Kontraktion oder Relaxation verändern.

Gesteuert wird das Kontraktionsverhalten glatter Muskelzellen über

Membranpotentialänderungen, die durch die Transmitter Acetylcholin und Noradrenalin

sowie durch diverse Hormone induziert werden (KLINKE u. SILBERNAGEL 1996).

Das Membranpotential glatter Muskelzellen wird hauptsächlich durch den

Kaliumgradienten bestimmt. So werden in glatten Muskelzellen neben BK-Kanälen noch

weitere Kaliumkanäle (Kv-Kanäle, Kir, KATP-Kanäle) exprimiert (NELSON u. QUAYLE

1995). Die durch Transmitter oder mechanischen Druck induzierte Depolarisation des

Membranpotentials führt zu einer Öffnung spannungsabhängiger L-Typ Calciumkanäle.

Durch das einströmende Calcium wird eine Muskelkontraktion ausgelöst (KLINKE u.

SILBERNAGEL 1996). In der Membran des sarkoplasmatischen Retikulums (SR) werden

durch die Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration Ryanodin-sensitive

Calciumkanäle aktiviert, durch die aus diesem intrazellulären Calciumspeicher lokal

begrenzt Calcium freigesetzt wird. Diese spontanen und lokal begrenzten Calciumausstösse

aus dem SR werden Calcium-Sparks genannt (NELSON et al. 1995). Durch diese Sparks

werden die in der benachbarten Plasmamembran lokalisierten calciumabhängigen BK-

Kanäle aktiviert. Der dadurch entstehende spontane transiente Kaliumauswärtsstrom wird

auch als STOC (spontaneus transient outward current) bezeichnet (NELSON et al. 1995).

Die Membrandepolarisation hat ebenfalls eine Öffnung von spannungsabhängigen und

auswärts gleichrichtenden Kaliumkanälen zur Folge. Der durch diese Kanäle vermittelte

Kaliumausstrom aus den Zellen führt zu einer Membranhyperpolarisation und nachfolgend

zum Schließen der spannungsabhängigen Calciumkanäle. Die intrazelluläre Ca2+-

Konzentration nimmt wieder ab und die Zellen relaxieren.

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Literaturübersicht

In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass die Aktivierung der BK-Kanäle

durch einen lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration eine entscheidende

Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus spielt, indem sie einen negativen Feedback

Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermittelt (BRAYDEN u. NELSON

1992). Die regulatorische β1-Untereinheit erhöht, wie bereits beschrieben, die Ca2+-

Sensitivität der BK-Kanäle maßgeblich und trägt somit fundamental zu einer

Funktionssteigerung der BK-Kanäle und damit auch des negativen Feedback zur

Limitierung der Vasokonstriktion bei. Diese Hypothese wurde durch verschiedene

Arbeitsgruppen vor allem in pharmakologischen Experimenten an isolierten Gefäßen

bestätigt. In diesen Untersuchungen wurde durch die Gabe von Iberiotoxin eine ausgeprägte

Membrandepolarisation ausgelöst, die zu einer Vasokonstriktion führte (JAGGAR et al.

2000, LÖHN et al. 2001).

Druck und Vasokonstriktoren

Membrandepolarisation

Öffnung spannungsabhängigerL-Typ Calciumkanäle

Anstieg des intrazellulären Calciums

+

Zunahme des arteriellen Tonus

SR Ryanodin Rezeptor

Öffnung von BK-Kanälen

- IberiotoxinCharybdotoxinTEA

+

+

++

+

+

Calciumkanal-blocker

Abbildung 6: Modell für die Rolle der BK-Kanäle als Teil des negativen

Feedback Mechanismus bei der Regulation des arteriellen Tonus. Modifiziert nach NELSON u. QUAYLE (1995).

Diese Ergebnisse wurden durch den Phänotyp von Mäusen, bei denen die β1-Untereinheit

genetisch inaktiviert wurde, grundlegend bestätigt (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et

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Literaturübersicht

al. 2000). Die BKβ1-/- Mäuse zeigten einen erhöhten arteriellen Tonus in isolierten

Gefäßen, welcher mit einer verminderten Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle und einer

gestörten Kopplung von Calcium-Sparks und STOC`s vergesellschaftet war. Diese

molekularen und zellulären Störungen gingen mit einem erhöhten systemischen Blutdruck

und einer Herzhypertrophie einher. Eine verminderte Expression der β1-Untereinheit,

verbunden mit einer geringeren Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle, wurde auch in glatten

Gefäßmuskelzellen von Ratten mit einer genetisch bedingten Hypertonie beobachtet

(WELLMANN et al. 2001, AMBERG et al. 2003, AMBBERG u. SANTANA 2003). Im

Widerspruch zu diesen Ergebnissen stehen allerdings die Befunde von LIU et al. (1997,

1998), die in Cerebralarterien von spontan hypertensiven Ratten einen Anstieg der BK-

Kanal Expression nachweisen konnten, welche einen verstärkten Kaliumauswärtsstrom

durch die BK-Kanäle verursachte. Die Autoren interpretieren dies als Versuch des Körpers,

die Ausprägung einer Hypertonie einzuschränken.

Auf der Basis der beschriebenen Beobachtungen wurde geschlussfolgert, dass die arterielle

Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz des erhöhten Tonus in arteriellen

Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b, STANDEN 2000, PATTERSON et al.

2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Ein solcher Mechanismus ist von größtem

wissenschaftlichen und medizinischen Interesse, da es sich hierbei um den erstmaligen

Nachweis einer monogenetischen nicht-renalen Hypertonie handeln würde.

39

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Literaturübersicht

2.3 Arbeitshypothese und Zielsetzung

Der chronisch erhöhte Blutdruck bei BKβ1-/- Mäusen könnte im Gegensatz zu der im

vorherigen Abschnitt beschriebenen Hypothese eine alternative Erklärung finden. In

Anbetracht der starken Expression von BK-Kanälen in Zona glomerulosa-Zellen ist es sehr

gut vorstellbar, dass es beim Fehlen der β1-Untereinheit zu einer gestörten

Aldosteronsekretion kommt. Hieraus würde folgen, dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen

im zirkulierenden Blut die tatsächliche Ursache für die Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen sind.

Ebenfalls könnte ein Hyperaldosteronismus bei BKβ1-/- Mäusen zu der beobachteten

ausgeprägten linksventrikulären Hypertrophie beitragen.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist es festzustellen, ob die BKβ1-/- Mäuse tatsächlich

pathologisch erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut aufweisen, die für die Entstehung

der Hypertonie ursächlich verantwortlich sind. Weiterhin soll untersucht werden, ob es durch

pharmakologische Blockierung des zirkulierenden Plasmaaldosterons mit Hilfe des

Aldosteronantagonisten Spironolacton möglich ist, bei BKβ1-/- Mäusen eine Normalisierung

des arteriellen Blutdrucks und eine Beeinflussung der linksventrikulären Hypertrophie zu

bewirken.

Sollte sich die Hypothese eines Hyperaldosteronismus bestätigen, soll im Rahmen dieser

Arbeit des Weiteren an Nebennieren von BKβ1-/- Mäusen untersucht werden, ob der

Hyperaldosteronismus durch eine veränderte Regulation der Aldosteronsekretion in den

Nebennieren unter Beteiligung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle verursacht wird.

40

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Material und Methode

3 Material und Methode

3.1 Material

3.1.1 Lösungen und Puffer

3.1.1.1 Nebenniereninkubation

Die Inkubationen erfolgten in einem durch Krebs-HEPES Puffer modifizierten Medium

199 der Firma Sigma (M 2154).

Modifiziertes Medium M199 (K+: 3,5 mmol/l)

Endkonzentration

Medium 199 (5,36 mmol/l K+) 653 ml

Krebs-HEPES Puffer, modifiziert 347 ml

L-Glutamin (200 mmol/l Stock, 1:294) 0,68 mmol/l

BSA, Fraktion V (w/v) 0,1%

D-Glucose 11,1 mmol/l

NaCl (kompensiert variable [K+]) ≤ 25 mmol/l

pH: 7,4 // 290 mosmol/kg

Krebs-HEPES Puffer, modifiziert

Endkonzentration

NaCl 75 mmol/l

CaCl2 1,8 mmol/l

MgSO4 0,8 mmol/l

NaHCO3 25 mmol/l

Na2HPO4 1,0 mmol/l

HEPES (20 ml 1,0 mol/l Stock, pH: 7,4) 20 mmol/l

41

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Material und Methode

dazu benötigte Lösungen:

HEPES Puffer, Stocklösung (pH: 7,4) 1,0 mol/l

NaCl Lösung 1,0 mol/l

KCl Lösung 1,0 mol/l

Für Versuche in Gegenwart erhöhter Kaliumkonzentrationen wurden die Osmolalitäten der

Inkubationslösungen durch entsprechende Verringerung der variablen NaCl Konzentration

konstant gehalten.

Einstellung verschiedener Kaliumkonzentrationen

Bezogen auf 1 Liter Inkubationslösung resultierte die Zugabe von 500 µl KCl Lösung (1,0

mol/l) in einer Erhöhung der Kaliumkonzentration um 0,5 mmol/l. Das Volumen der 1,0

mol/l NaCl Lösung wurde entsprechend um 500 µl reduziert: von 8,675 ml auf 8,175 ml.

PBS (10x)

NaCl 1,54 mol/l

Na2HPO4 0,70 mol/l

KH2PO4 0,30 mol/l

pH: 6,8 ± 0,1

3.1.1.2 Gelelektrophorese

Loading-Buffer

Glycerol 50%

Bromphenolblau, gesättigt 1%

Xylenecyanol (10%ig) 1%

50 x TAE 2%

H2O, steril ad 100 ml

42

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Material und Methode

TAE (50x)

Tris 242 g

Eisessig 57,1 g

EDTA (0,5 M), pH 8,0 100 ml

H2O, destilliert ad 1000 ml

TBE (0,5x)

Tris 242 g

Borsäure 27,5 g

EDTA (0,5 M), pH 8,0 20 ml

H2O, destilliert ad 1000 ml

1:10 verdünnt

3.1.2 Chemikalien und Enzyme

Falls nicht anders angegeben, wurden sämtliche Chemikalien von den Firmen Sigma,

Invitrogen, Serva, Calbiochem, Braun und Merck in p.a. oder reinst-Qualität bezogen.

Nukleinsäuren und Nukleotidtriphosphate wurden bei der Firma Invitrogen, Pharmacia

Biotech und MWG Biotech erworben.

43

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Material und Methode

3.2 Versuchstiere

Die Versuche wurden an männlichen, 3 bis 7 Monate alten C57/BL6 Inzuchtmäusen mit

genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals (Knockout

Mäuse: BKβ1-/-) durchgeführt. Als Kontrolltiere dienten männliche ingezüchtete C57/BL6

Mäuse (Wildtyp Mäuse: BKβ1+/+).

Der BKβ1-Knockout wurde 1999/2000 von der Arbeitsgruppe um Prof. O. Pongs (Zentrum

für molekulare Neurobiologie Hamburg) generiert (PLÜGER et al. 2000). Der Arbeitsgruppe

um Prof. H. Ehmke wurden Zuchttiere zur Verfügung gestellt, deren weitere Vermehrung

und Aufzucht von der Versuchstierhaltung des Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf

übernommen wurde.

Die Tiere wurden bei Raumtemperatur 22 ± 2°C, einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60 ±

5% und einem 12-stündigen Tag-Nacht-Rhythmus (Licht: 7.00-19.00 Uhr) in durchsichtigen

Polycarbonatkäfigen (Fa. Techniplast) des Types II long (365 x 207 x 140 mm) auf

staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Zur Beschäftigung der Tiere wurden die Käfige

zusätzlich mit einigen Blättern Zellstoff und Häusern aus Kunststoff (Fa. Techniplast)

ausgestattet.

Die Ernährung der Tiere erfolgte mit standardisiertem, pelletierten Trockenfutter (Ssniff

R/M-H, extrudiert) und Leitungswasser ad libitum. Das Futter war wie folgt

zusammengesetzt: Rohprotein 22,7%, Rohfett 4,0%, Rohfaser 5,6%, Rohasche 7,6%,

umsetzbare Energie 12,5 MJ/kg (Angaben in % des Trockengewichts). Die Tiere wurden auf

das Freisein von Erregern entsprechend der Liste GV-SOLAS 1998 kontrolliert.

Eine Woche vor Beginn der Versuche wurden die Mäuse aus der zentralen Tierhaltung in

ihren Käfigen in das Physiologische Institut transportiert, um durch eine vollständige

Erholung von dem Transport und Eingewöhnung an die Laborumgebung eine stressbedingte

Beeinflussung der Messergebnisse auszuschließen. Die Haltung und Fütterung der Tiere im

Mäuselabor erfolgte unter den gleichen Bedingungen wie vorher beschrieben. Hervorgerufen

durch Tätigkeiten im Labor, mussten sich die Tiere jedoch an eine geänderte Geräuschkulisse

adaptieren.

Die Tierversuchsgenehmigungen wurden von der Behörde für Umwelt und Gesundheit,

Hamburg, mit den Aktenzeichen A6/218 und 35/02 erteilt.

44

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Material und Methode

3.2.1 Versuchsserien und Stichprobenumfang

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit basieren auf den in der nachfolgenden Tabelle

dargestellten Versuchsserien.

Tabelle 1: Übersicht über die Versuchsserien mit durchgeführten Bestimmungen

Untersuchungen

Versuchsserie 1 Basisuntersuchungen

• hämodynamische / morphometrische Untersuchungen

• Bestimmung von Blutparametern

Versuchsserie 2 Aldosteronbestimmung

• hämodynamische / morphometrische Untersuchungen

• Bestimmung der Plasmaaldosteronkonzentration

Versuchsserie 3 Spironolactonbehandlung

• hämodynamische / morphometrische Untersuchungen

Versuchsserie 4 Nebennieren – Inkubationsversuche

• basale und stimulierte Aldosteronsekretion

Die Untersuchungen der Versuchsserien 1-3 sollen pro Serie und Genotyp an 13 Tieren

durchgeführt werden. Ergebnisse in der Literatur haben eine mittlere interindividuelle

Variabilität des Blutdrucks mit einen Variationskoeffizient von ~5-8% bei wachen Mäusen

gezeigt (Plüger et al. 2000). Hinzu kommt, dass aus nicht vermeidbaren methodischen

Gründen (Operationskomplikationen, Katheterverschluss) etwa 10-20% der operierten Tiere

nicht in den Versuch aufgenommen werden können. Die eingeplante Zahl von Tieren reicht

45

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Material und Methode

aus, um bei dieser Varianz einen Blutdruckunterschied von 10 mmHg statistisch auf dem 5%

Signifikanzniveau zu identifizieren.

Die Untersuchungen der Versuchsserie 4 sollen pro Versuchsgruppe (Stimulus und Genotyp)

an Nebennieren von jeweils 10 Tieren durchgeführt werden, um mögliche Unterschiede

statistisch beurteilen zu können.

46

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Material und Methode

3.3 Methoden

3.3.1 Genotypisierung der Mäuse

Zur Bestimmung des Genotyps wurde den Zuchttieren durch die Tierpfleger der

Versuchstierhaltung im Alter von ca. 6 Wochen und den Mäusen, an denen Versuche

durchgeführt wurden, zum Abschluss der Experimente eine Ohrbiopsie entnommen. Die

Entnahme der Ohrprobe erfolgte mit einer speziellen Lochzange.

Nach Lysierung der Ohrprobe wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain

reaction = PCR) überprüft, ob der Genlocus, der die β1-Untereinheit des Ca+-aktivierten

Kaliumkanals codiert, bei den Tieren vorhanden war bzw. fehlte.

3.3.1.1 Lysierung der Ohrprobe

Folgender Ansatz wurde für den Verdau einer Ohrprobe verwendet:

NP- 40 (0,5%) 0,5 µl

Tween® 20 (0,5%) 0,5 µl

10x PCR RXN Puffer (-Mg2+) 10 µl

Proteinase K 0,03 mg

H2O, steril ad 100 µl

Der Verdau erfolgte mit Hilfe eines Thermomixers (Eppendorf Gerätebau) auf Stufe 11

(11x100/min) bei 65°C für 2 h 50 min und wurde abgeschlossen bei 95°C für 10 min. Falls

die Polymerase-Kettenreaktion nicht direkt angeschlossen wurde, fand eine Lagerung des

Lysats bei –20°C statt.

47

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Material und Methode

3.3.1.2 Polymerase-Kettenreaktion

(SAIKI et al. 1988, PLÜGER et al. 2000)

Folgender Standardansatz (50 µl Gesamtvolumen) wurde für die Amplifikation von DNA

durch die PCR verwendet:

Ohrprobenlysat 3 µl

10x PCR RXN-Puffer (-Mg2+) 5 µl

50 mM MgCl2 1,5 µl

20 mM dNTP`s 0,5 µl

Primer 1 (100 pmol/µl) 1 µl

Primer 2 (100 pmol/µl) 0,5 µl

Primer 3 (100 pmol/µl) 0,125 µl

Taq-Polymerase (5 Units/µl) 0,5 µl

H2O, steril ad 50 µl

Die Primer wurden von der Firma MWG-Biotech GmbH bezogen und hatten folgende

Sequenzen:

Primer 1 (BKMB 11s) 5`-GCT GAA ACT CTG AAG CTA CTC-3`

Primer 2 (BKMB 17s) 5`-GCT ATG AGG CAA CTA AAC AGG-3`

Primer 3 (BKMB 3a) 5`-CAC AGC TGA TAC ATT GAC CC-3`

Die Polymerase-Kettenreaktion wurde in einem GeneAmp PCR System 9700 (Applied

Biosystems) durchgeführt. Nach einer anfänglichen Denaturierung bei 93°C für 2 Minuten

erfolgte die PCR in 35 Amplifikationszyklen mit folgenden Temperaturschritten:

30`` 93°C (Denaturierung)

30`` 58°C (Primerhybridisierung)

45`` 72°C (Extension)

48

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Material und Methode

Im Anschluss an die 35 Zyklen wurde der Amplifikationsprozess mit einer 10-minütigen

Extensionsphase bei 72°C beendet und die Proben nachfolgend auf 4°C abgekühlt. Die

Lagerung bis zur Analyse des Produktes durch Gelelektrophorese erfolgte bei –20°C. Um

Kontaminationen auszuschließen, wurde für jeden PCR-Ansatz eine Negativkontrolle

mitamplifiziert, die bis auf die cDNA sämtliche für die PCR notwendigen Reagenzien

enthielt.

3.3.1.3 Gelelektrophorese

Die präparative Trennung und Analyse der DNA-Fragmente wurde in 1,2%igen

horizontalen Agaroseflachbett-Gelen in EPS 600 –Kammern (Pharmacia Biotech) in 0,5x

TBE mit 6 µl/100 ml Ethidiumbromid durchgeführt.

10 µl des zu analysierenden Ansatzes wurden mit 1,5 µl DNA-Loading-Buffer versetzt und

davon 11 µl in die Probentaschen des Agarose-Gels pipettiert.

Die Trennung erfolgte innerhalb von 45 min bei einer konstanten Spannung von 110 V. Zur

Anfärbung der DNA wurde Ethidiumbromid (Sigma) in einer Konzentration von 0,5 µg/ml

in das Agarose-Gel einpolymerisiert. Die mit Ethidiumbromid angefärbten DNA-

Amplifikate wurden mit Hilfe von UV-Licht der Wellenlänge 254 nm (UV-

Transilluminator KAISER RS 1, Biometra) sichtbar gemacht und zur Dokumentation mit

einer CCD-Kamera (Computar) fotografiert. Die Identifizierung der Fragmente erfolgte

anhand ihrer Länge nach Anzahl von Basenpaaren. Als Größenstandard wurde eine „1 kb

Plus DNA-Leiter“ (Invitrogen) verwendet.

49

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Material und Methode

3.3.2 Hämodynamische Untersuchungen an wachen Mäusen

3.3.2.1 Katheterherstellung

Vor der Anfertigung des Katheterpaares mussten die Katheterspitzen gesondert aus einem

Polyurethanschlauch (0,04“ O.D., 0,025“ I.D., Braintree Scientific, INC.) geformt werden.

Ein ca. 6 cm langes Schlauchstück wurde dazu in der Mitte mit Hilfe eines Heißluftgebläses

angeschmolzen. Der geschmolzene Bereich wurde leicht gedehnt und halbrund geformt.

Durch eine Durchtrennung des Schlauches in der Mitte entstanden 2 Spitzen, die auf die

gleiche Länge gekürzt wurden. (Originalende und leicht gebogene verjüngte Spitze: jeweils

ca. 1,5 cm). Bei der Auswahl eines Spitzenpaares musste auf eine möglichst große

Parallelität geachtet werden.

Diese Spitzen wurden mit Hilfe eines ca. 8 mm langen metallenen Verbindungsstifts mit

einem Polyethylen-Schlauch (1,0 mm O.D., 0,5 mm I.D., Portex) verbunden, wobei ein ca.

1 mm langer Überlappungsbereich (Overlap) zwischen der Spitze und dem Polyethylen-

Schlauch entstand. Über den Overlap wurde mittels eines 2 Komponentenklebers (UHU

plus Endfest 300) ein Heat Shrink Tubes geklebt, um die Katheter im Verbindungsbereich

abzudichten. Nach einer 12-stündigen Trocknungsperiode wurde die Durchgängigkeit der

Katheter überprüft.

3.3.2.2 Operative Katheterimplantation

(JUST et al. 2000, modifiziert nach MATTSON 1998)

Den Tieren wurden zur Blutdruck- und Herzfrequenzmessung ein arterieller Katheter in die

A. femoralis implantiert. Zusätzlich wurde in die V. femoralis ebenfalls ein Katheter

implantiert, wodurch eine größere Lagestabilität des arteriellen Katheters gewährleistet

wurde und somit die Gefahr eines Verschlusses durch Abknicken des Katheters reduziert

werden konnte. Die Katheter wurden vor der Operation luftblasenfrei mit einer Heparin-

NaCl-Lösung (5.000 I.E. Heparin/100 ml NaCl-Lösung) gefüllt, um die Gefahr einer

Thrombenbildung in der Spitze des Katheters zu reduzieren.

50

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Material und Methode

Die Mäuse wurden mit 10%-igem Ketamin® (120 mg/kg KGW, Atarost GmbH & Co) und

2%-igem Rompun® (16 mg/kg KGW, Bayer) unter Erhaltung der Spontanatmung mittels

i.p. Injektion narkotisiert. Eine Nachdosierung zur Verlängerung der Narkose erfolgte

ausschließlich mit Ketamin®. Bereits vor Beginn der Operation erfolgte eine

Schmerzprophylaxe mittels s.c. Injektion von Carprofen (5 mg/kg KGW). Während der

Operation wurden die Mäuse auf einer 37°C warmen Wärmeplatte gelagert, um eine

Auskühlung zu verhindern.

Nach der Ermittlung des KGW wurden der Nacken und der linke Leistenbereich der Tiere

weiträumig rasiert und mit Betaisodona® desinfiziert.

Nach einer Inzision der Haut im Nacken kaudal des Os occipitale wurde die Haut subkutan

bis zum linken Hinterbein mobilisiert. Daraufhin erfolgte die Lagerung und Fixierung der

Mäuse in Rückenlage und die ca. 5 mm lange Inzision der Haut im Bereich der Leiste

parallel zur Bauchmuskulatur. Durch vorsichtiges Entfernen von Fett- und subkutanem

Bindegewebe mittels Wattestäbchens wurde der N. femoralis sowie die A. und V. femoralis

proximal vom Lig. inguinale bis distal zur V. saphena medialis dargestellt. Mit Hilfe einer

Metallhülse erfolgte eine Verbindung der beiden Inzisionsstellen, um die Katheter von der

Leiste zur Öffnung im Nacken schieben zu können. Dabei war zu beachten, dass der venöse

Katheter ohne Kreuzung parallel zum arteriellen Katheter verlaufend innen zu liegen kam.

Der arterielle Katheter wurde am Ende farbig markiert, um eine spätere Zuordnung zu

ermöglichen.

Die weitere Präparation wurde unter stereomikroskopischer Aufsicht (Fa. Wild M3)

durchgeführt. Nach der präparativen Trennung von Nerv, Vene und Arterie und der

kompletten Mobilisierung beider Gefäße wurden die Gefäße proximal der V. saphena

einzelnen mit einem Faden (Haltezügel) abgebunden. Bei der Arterie wurde vor ihrer

Eröffnung zusätzlich durch eine Unterbindung direkt distal des Leistenbands der Blutfluss

unterbrochen. Dieser Knoten musste wieder zu öffnen sein. Nach dieser Vorbereitung

wurde die Vene bzw. Arterie mit einer Irisschere in der Mitte des dargestellten Bereichs

eröffnet und die Katheterspitze einige Millimeter unter das Leistenband hindurch

vorgeschoben. Die Befestigung der Katheter gewährleisteten der Haltezügel sowie zwei

zusätzlich weiter proximal gelegte Haltefäden.

Nach der Implantation wurden beide Katheter im freien Bereich der Spitzen miteinander

verbunden und der Knoten mit Histoacrylgewebekleber (Fa. Braun) fixiert.

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Material und Methode

Durch den venösen Katheter wurde dem Tier zur antibiotischen Prophylaxe 0,7 mg

Cefazolin, gelöst in physiologischer Kochsalzlösung, verabreicht.

Abschließend erfolgte noch eine letzte Stabilisierung der Katheter mit Hilfe eines Fadens,

der, ausgehend von der Nackeninzision, soweit wie möglich distal um die Katheter

geknotet wurde.

Die Katheter wurden vor dem anschließenden Wundverschluss mit Hilfe von

Metallstöpseln verschlossen, wobei besonders darauf zu achten war, dass kein Blut sondern

nur Heparin-NaCl-Lösung in den Katheterspitzen verblieb, um das Risiko einer

Thrombenbildung zu minimieren.

Nach Ausschluss von Blutungen und Sicherung der korrekten Katheterposition wurde eine

geringe Menge einer antibiotikahaltigen Wundsalbe (Nebacitin®, Yamanouchi Pharma

GmbH) in die Wunde im Leistenbereich platziert. Die Wunde wurde anschließend mit einer

Einzelknopfnaht (Mersilene 5-0, Ethicon) verschlossen. Die aus dem Nacken

herausgeführten Katheterenden mussten mit einer Metallfeder, die in die Nackenmuskulatur

festgenäht wurde, vor Benagung und anderer mechanischer Belastung geschützt werden.

Der Wundverschluss um die Feder erfolgte ebenfalls mit einer Einzelknopfnaht.

Abschließend wurden die Wunden im Nacken und in der Leiste mit Betaisodona®

desinfiziert.

Die aus der Metallfeder herausragenden Enden der Katheter wurden mit einem

Klebestreifen an der Feder befestigt, um eine Rotation der Katheter in der Feder zu

verhindern.

Die Tiere wurden postoperativ bis zum vollständigen Erwachen weiterhin warmgehalten

und erholten sich sehr schnell.

Die Fixierung der Feder erfolgte mit Hilfe eines Zweikanal - Swivels (TSE-Systems), so

dass sich die Tiere in ihren Einzelkäfigen frei bewegen konnten. Die Futter- und

Wasseraufnahme erfolgte ad libitum, wobei die Wasseraufnahme jeden Tag protokolliert

wurde, um einen Hinweis auf das Allgemeinbefinden der Tiere zu erhalten. Ergänzend

hierzu wurde täglich der Habitus der Tiere beurteilt und Tiere, die mittelgradige bzw.

hochgradige Störungen aufwiesen von den weiteren Untersuchungen ausgeschlossen und

euthanasiert.

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Material und Methode

3.3.2.3 Blutdruckmessung

Die Blutdruck- und Herzfrequenzmessungen wurden über den chronischen arteriellen

Katheter nach Anschluss an den Swivel durchgeführt. Die stressfreie Messung erfolgte an

den wachen und freibeweglichen Mäusen, die während der Messung uneingeschränkten

Zugang zu Wasser und Futter hatten. Die Messungen wurden am 2. bzw. 3. postoperativen

Tag kontinuierlich über 1-2 Stunden durchgeführt. Die gemessenen Daten wurden

permanent mittels eines Softwareprogramms (Labtech Notebook®) registriert (siehe Abb.

7). Ihre anschließende Auswertung erfolgte durch das Datenverarbeitungsprogramm Igor®.

Während der Messung herrschte eine ruhige Atmosphäre im Labor, um keine Störung der

Tiere zu verursachen. Die Messungen wurden in einem dreistündigen Zeitfenster zwischen

16.00 und 19.00 Uhr durchgeführt, um den zirkadianen Rhythmus der Tiere zu

berücksichtigen.

Zur Umwandlung der Blutdruckamplitude in ein elektrisches Signal wurde ein

Blutdrucktransducer (Typ DPT-6100, Föhr Medical Instuments) eingesetzt. Der Transducer

wurde vor der Benutzung luftblasenfrei mit entionisiertem Wasser gefüllt und durch einen

Polyethylen-Schlauch mit dem Swivel verbunden. An die zweite Öffnung des Kanals

wurde der arterielle Katheter über ein kurzes Verbindungsstück angeschlossen.

Nach Abschluss der Blutdruckmessung am 1. Messtag musste der Katheter erneut

verschlossen werden. Dabei war wiederum zu beachten, dass kein Blut in der

Katheterspitze verblieb, um eine Thrombosierung zu verhindern.

Aus den gewonnenen Daten wurden der mittlere arterielle Blutdruck und die

durchschnittliche Herzfrequenz ermittelt.

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Material und Methode

Abbildung 7: Originalregistrierung einer Blutdruck-/Herzfrequenzmessung über 60 Minuten. Die Messung erfolgte bei einer wachen und ungestressten Wildtyp Maus am 3. postoperativen Tag über den arteriellen Katheter (obere Kurve: Blutdruckamplituden; untere Kurve: Herzfrequenz).

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Material und Methode

3.3.3 Spironolactonapplikation

(DORRANCE et al. 2001)

Es wurden zwei Versuchsgruppen aus männlichen 4-6 Monate alten Mäusen (12 Knock-out

Mäuse bzw. 12 Wildtyp Mäuse) gebildet. Die Tiere wurden nach Bestimmung ihres

Körpergewichts ausgewählt, um eine einheitliche Versuchsgruppe mit 30 g KGW zu

erhalten.

Die Tiere wurden 21 Tage mit dem Aldosteronantagonisten Spironolacton (200 mg/kg

KGW/Tag) behandelt, welches kontinuierlich über diesen Zeitraum mit Hilfe von 2 Time

Release Pellets (Innovative Research of America) pro Tier appliziert wurde.

Die Pellets wurden im Bereich der seitlichen Thoraxwand unter die Haut platziert und setzten

unter Zerfall der Matrix täglich 6 mg Spironolacton frei.

Die Operation erfolgte unter Narkose und nach einer weiträumigen Rasur des

Operationsfeldes mit anschließender Desinfektion (siehe Kap. 3.3.2.2). Nach einer ca. 5 mm

langen Inzision der Haut erfolgte die Präparation einer kleinen subkutanen Tasche nach

kaudal. In diese Tasche wurde ein Pellet gelegt, wobei darauf zu achten war, dass das Pellet

weder mechanisch beansprucht wurde noch mit Desinfektionsmittel in Berührung kam. Das

subkutane Bindegewebe wurde mit einem Einzelheft und die Hautinzision mit zwei

Einzelheften (Mersilene 5-0, Ethicon) verschlossen. Anschließend erfolgte die gleiche

Prozedur mit dem zweiten Pellet auf der anderen Seite.

Die Tiere wurden bis zum vollständigen Erwachen aus der Narkose fortlaufend beobachtet.

Ansonsten war keine postoperative Behandlung nötig, da aufgrund der Lage der Nähte kein

Benagen durch die Tiere möglich war und somit eine schnelle und komplikationsfreie

Wundheilung erfolgte.

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Material und Methode

3.3.4 Bestimmung von Blutparametern

Den Mäusen wurden nach den Blutdruckmessungen Blutproben entnommen, um

verschiedene Parameter (Elektrolyte, Kreatinin, Renin und Aldosteron) zu bestimmen.

3.3.4.1 Blutabnahme

3.3.4.1.1 Blutabnahme für die Elektrolyt-/ Kreatininbestimmung

Für die Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Natrium, Kalium, Chlorid und

Kreatinin wurden 180 µl Plasma benötigt.

Das benötigte Vollblut wurde nach der vorhergehenden Blutentnahme für die Aldosteron-

und Reninbestimmung (siehe Kap. 3.3.4.1.2) aus dem arteriellen Katheter gewonnen. Dabei

war zu beachten, dass die Abnahme ohne großen Unterdruck erfolgte, um eine mechanisch

bedingte Hämolyse des Bluts zu verhindern. Das gewonnene Blut wurde daraufhin in einen

mit Lithium-Heparin präpariertes Gefäß (15 I.E. Heparin/ml Blut, Firma Sarstedt)

überführt.

Unmittelbar nach der Gewinnung erfolgte die Zentrifugation (6000 x g/10 min) des Bluts

bei Raumtemperatur (20°C). Das gewonnene Plasma wurde alliquotiert (50 µl Kreatinin,

130 µl Elektrolyte), eingefroren und bei –20°C bis zur Analyse gelagert.

3.3.4.1.2 Blutabnahme für die Renin-/ Aldosteronbestimmung

Die Blutabnahme für die Renin-/ Aldosteronbestimmung musste unbemerkt an wachen und

ungestressten Tieren erfolgen, um keine abnahmebedingte Erhöhung der zu untersuchenden

Parameter zu induzieren. Die Blutabnahme für die Bestimmung der Plasmaaldosteron- und

der Reninkonzentration erfolgte in zwei verschiedenen Versuchsgruppen. Dieses Vorgehen

war notwendig, um den Einfluss des Blutverlustes auf die Blutparameter zu minimieren.

Die Blutabnahme erfolgte bei allen Tieren zwischen 17.00 und 19.00 Uhr.

Um die Abnahme für die Tiere unbemerkt durchführen zu können, wurde aus dem

arteriellen Katheter spontan ohne mechanische Manipulation Vollblut gewonnen. Dazu

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Material und Methode

wurde der Verbindungsschlauch vom Blutdrucktransducer zum Swivel schon vor der

Blutdruckmessung so lang abgemessen, dass er 300 µl Volumen fasste. Vom Swivel

ausgehend wurde der Schlauch nach einem Volumen von 250 µl markiert, da für die

Analyse ca. 120 µl Plasma benötigt wurde. Ausgehend von einem durchschnittlichen

Hämatokrit von ca. 40% (MITRUKA u. RAWNSLEY 1981, RUTSCHITZKA 2000),

wurden 250 µl Vollblut entnommen, um sicher das für die Analyse benötige Plasma

gewinnen zu können.

Nach Beendigung der Blutdruckmessung wurde unbemerkt von dem Tier der

Verbindungsschlauch kurz vor dem Transducer durchschnitten. Infolge des arteriellen

Blutdrucks floss das Blut aus dem arteriellen Katheter in den Verbindungsschlauch. Sobald

die Blutsäule die 250 µl Markierung erreicht hatte, wurde der arterielle Katheter

abgeklemmt und das Blut aus dem Verbindungsschlauch in einen 500 µl Tube (Fa.

Eppendorf) überführt, in dem 5 µl 0,3 M Na4-EDTA vorgelegt war.

Die Blutproben für die Reninbestimmung wurden umgehend im Eisbad abgekühlt. Die

nachfolgende Zentrifugation erfolgte bei 4°C für 10 min bei 6000 x g. Die Blutproben für

die Aldosteronbestimmung wurden bei Raumtemperatur (20°C) ebenfalls bei 6000 x g für

10 min zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation wurden die Plasmaproben tiefgefroren und bei –20°C bis zur

Analyse gelagert.

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3.3.4.2 Analyse

3.3.4.2.1 Natrium und Kalium

Die Bestimmung der Natrium- und Kaliumkonzentrationen erfolgte mittels

flammenphotometrischer Analyse im FCM 6341 (Eppendorf Gerätebau, Hamburg). 50 µl

der aufgetauten Plasmaprobe wurde mit einer Lithium-Verdünnungslösung (LiCl: 5mmol/l,

Fa. Eppendorf) 1:50 verdünnt. Nach Kalibrierung des Flammenphotometers durch

Abgleich des Nullwertes mittels der Lithium-Verdünnungslösung und Standardabgleich des

Geräts mit Hilfe einer Serum Standard-Stammlösung (Na+: 143,5 mmol/l, K+: 3,84 mmol/l,

Ca2+: 2,50 mmol/l; Eppendorf Gerätebau, 1:50 verdünnt) erfolgte die Messung der

verdünnten Plasmaproben.

Nach jeweils 20 Proben wurde die Kalibrierung des Photometers wiederholt.

3.3.4.2.2 Chlorid

Die Messung von Chloridkonzentrationen im Plasma wurde mit ionensensitiven Elektroden

durchgeführt.

Die Analyse erfolgte mit einem EML100 (Radiometer Copenhagen) in der Abteilung der

Klinischen Chemie des Universitätskrankenhauses Hamburg-Eppendorf.

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3.3.4.2.3 Kreatinin

Die Bestimmung des Kreatinins erfolgte mittels Enzymatischem Farbtest (PAP-Methode),

der von der Firma NOBIS (NobiFlow, Kreatinin-PAP) bezogen wurde. Die Bestimmung

der Extinktion erfolgte bei einer Wellenlänge von 555 nm bei einer Temperatur von 25°C.

Die Proben sowie die Reagenzien wurden auf 25°C vorgewärmt und anhand der

Arbeitsanleitung des Herstellers in Halbmikroküvetten (1 cm Schichtdicke) pipettiert.

50 µl Probe / Standard

1000 µl Reagenz 1

Gut mischen und ca. 5 min bei 25°C inkubieren.

200 µl Reagenz 2

Gut mischen, 1 min bei 25°C inkubieren und nachfolgend die

Anfangsextinktion ablesen: EP.

Nach weiteren 5 min Ablesung wiederholen: EST.

3.3.4.2.4 Renin

Die Bestimmung des aktiven Renins (Plasmareninkonzentration: PRC) und des Prorenins,

der inaktiven Vorstufe des Renins, wurde am Institut für Pharmakologie und Toxokologie

der Universität Heidelberg durch Prof. Dr. J. Peters durchgeführt.

Für die Messung beider Parameter wurden die Plasmaproben in 6 mM EDTA, 1,6 mM

Dimercaptopropanolol und 100 mM N-Tris Hydroxymethylaminoethansulfonat bei pH 7,3

und 37°C für 60 min inkubiert. Die Inkubation wurde unter Substratsättigungsbedingungen

in Gegenwart eines Überschusses an Angiotensinogen der Ratte durchgeführt. Zur

Bestimmung des Prorenins wurden die Plasmaproben vor der Inkubation 10 min. mit

Trypsin behandelt, um eine enzymatische Umwandlung des Prorenins in aktive

Reninformen zu bewirken. Die Messung des entstandenen ANG I erfolgte mittels

Radioimmunoassay (HACKENTHAL et al. 1977). Die Plasmareninkonzentration sowie

das Prorenin werden in der Dimension ng ANG I pro Stunde pro ml Plasma angegeben.

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Material und Methode

3.3.4.2.5 Aldosteron

Die Bestimmung von Aldosteron erfolgte mit Hilfe von Radioimmunoassays (RIAs) nach

dem Coat-a-count-Verfahren, bei dem Kunststoffröhrchen mit einem Aldosteronantikörper

beschichtet sind und radioaktives 125J-markiertes Aldosteron mit dem Aldosteron in der zu

analysierenden Probe um die Bindung an den Antikörper konkurriert. Die zu bestimmenden

Aldosteronkonzentrationen wurden dann nach Messung des freien oder gebundenen 125J-

Aldosteron mit Hilfe von Standardkurven errechnet.

Die Aldosteronkonzentrationen wurden in den Plasmaproben sowie in den Proben aus den

in vitro Inkubationsversuchen (siehe Kap. 3.3.6) bestimmt. Aufgrund des geringen zur

Verfügung stehenden Blut- bzw. Plasmavolumens und der Notwendigkeit von

Doppelbestimmungen wurde die Analyse des Aldosterons in derartigen Fällen mit einem

RIA-Kit der Firma Immunotech (Beckman Coulter, USA) durchgeführt, da für diesen

Assay ein Probenvolumen von jeweils 50 µl ausreichend war.

Freigesetztes Aldosteron in Experimenten von Nebenniereninkubationen wurde mit einem

RIA-Kit der Firma DPC (Diagnostic Products Corporation, USA) bestimmt

(Probenvolumen: 200 µl).

Für jeden Assay wurde eine Standardkurve (siehe Abb. 8) erstellt. Dazu wurden

verschiedene Konzentrationen von Aldosteron eingesetzt (10-2000 pg/ml für Immunotech

und 25-1200 pg/ml für DPC RIA-Kits) und die gebundene Aktivität (B) des markierten

Aldosterons im Verhältnis zur gebundenen Aktivität einer aldosteronfreien Probe (B0)

ermittelt. Die Logit(B/B0)-Werte als Funktion des Logarithmus der

Aldosteronkonzentration wurden einer Kurvenanpassung (TableCurve®, SPSS Inc., USA)

unterworfen und durch eine Geradengleichung (y=a+bx) approximiert. Über die Parameter

„a“ und „b“ der Geradengleichung wurde dann die Konzentration von Aldosteron in der zu

bestimmenden Probe errechnet. Der RIA-Kit des Herstellers DPC lieferte sehr gut

reproduzierbare Ergebnisse mit einem r2 von 0,9913 für 15 verschiedene Kalibrierungen

mit jeweils 6 verschiedenen Konzentrationen an Aldosteron.

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Material und Methode

log(Aldosteronkonz.)

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

log

it(B

/B0)

-1,0

-0,5

0,0

0,5

1,0

1,5

MeßwerteFit ErgebnisVertr.intervall, 95%

Abbildung 8: Standardkurve. Darstellung einer typischen Kalibrierkurve für einen 125J-RIA von Aldosteron. Der logit (logit(y)=log(y/(1-y)) des Quotienten aus der gebundenen Aktivität des Standards zur gebundenen Aktivität einer aldosteronfreien Probe ist gegen den Logarithmus der Aldosteron-konzentration aufgetragen (als Doppelbestimmung) und kann an eine Geradengleichung (y=a+bx) approximiert werden (r2 = 0,9985); Vertr.intervall: Vertrauensintervall.

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Material und Methode

3.3.5 Morphometrische Untersuchungen

Nach Beendigung der Blutabnahme wurden die Tiere über den venösen Katheter narkotisiert

(siehe Kap. 3.3.2.2), und anschließend erfolgte die Entnahme der Herzen.

Für die Entnahme des Herzens wurden das Abdomen und der Thorax eröffnet und das Herz

nach Durchtrennung der großen Gefäße entnommen. Anschließend wurde es in Heparin-

NaCl-Lösung (5.000 I.E. Heparin/100 ml NaCl-Lösung) gespült und von Blut und

Blutthromben befreit, auf einem Stück Zellstoff getrocknet und die Reste der großen Gefäße

abpräpariert. Nach Bestimmung des Herzgewichtes (A200S, Fa. Sartorius) erfolgte die

präparative Entfernung der Vorhöfe sowie die Trennung des linken und rechten Ventrikels

mit anschließender Gewichtsbestimmung. Für weitere molekularbiologische Untersuchungen

wurden die Ventrikel in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und einzeln in Alufolie verpackt bei

–80°C gelagert.

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Material und Methode

3.3.6 Inkubation von Nebennieren in vitro

Im Rahmen dieser Experimente erfolgte die Untersuchung der Regulation der

Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen in vitro unter verschiedenen Stimuli

(K+, ANG II und ACTH). Dazu wurden die Nebennieren entnommen und nach Aufbereitung

in modifizierten Medium 199 inkubiert. Die Aldosteronsekretion wurde unter

Basalbedingungen ohne Stimulus und nach Stimulierung mit K+, ANG II und ACTH

quantitativ mittels Radioimmunoassy (siehe Kap. 3.3.4.2.1) bestimmt.

3.3.6.1 Organentnahme und Präparation

Die Entnahme der Nebennieren erfolgte in dem Zeitraum zwischen 17.00 und 18.30 Uhr.

Die Tiere wurden mittels i.p. Applikation eines Narkosemittels (siehe Kap. 3.3.2.2)

narkotisiert. 20 Minuten nach Einsetzen der Narkose erfolgte die Tötung der Tiere mittels

zervikaler Dislokation. Unmittelbar darauf wurden nach der Eröffnung des Abdomens

beide Nebennieren entnommen und umgehend in modifiziertem Medium 199 auf Eis

gelagert.

Mit Hilfe mikroskopischer Vergrößerung erfolgte die gründliche Entfernung von

Fettgewebe und Blutresten in modifiziertem Medium 199 auf Eis. Jede Nebenniere wurde

darauf in vier Teile geschnitten und die acht Stücke in ein 50 ml Röhrchen (Fa. Beckmann)

überführt. Dieser enthielt 2 ml modifiziertes Medium 199 und wurde im Eisbad gekühlt.

3.3.6.2 Inkubation

Nach Beendigung der Präparation wurden die Nebennieren unter Schütteln im Wasserbad

bei 37°C und Carbogenbegasung (95% O2 // 5% CO2) inkubiert. Zeitgleich wurden die

Nebennieren von 5-6 Tieren unterschiedlichen Genotyps inkubiert.

Zu Beginn der Inkubation erfolgte eine 60-minütige Akklimatisationsphase, in der sich die

Nebennieren an die Versuchsbedingungen gewöhnten und ein stady state der

Aldosteronsekretion erreicht werden sollte. Während der zweiten 30-minütigen

Inkubationsperiode erfolgte keine Stimulation der Zona glomerulosa-Zellen. Die ermittelte

Aldosteronsekretion stellte den Basiswert für die nachfolgende Stimulation dar.

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Material und Methode

Nach jeder Periode wurde der Puffer vollständig entnommen, eingefroren und die

Nebennieren mit 1 ml des nachfolgenden Puffers gespült. Nach Entnahme dieses

Spülmediums wurde unmittelbar vor Beginn der nächsten Periode 2 ml des frischen auf

37°C angewärmten Puffers hinzugegeben.

Nach Beendigung der Inkubation wurden die Nebennieren in jeweils 1ml PBS überführt

und bei –20°C eingefroren, falls eine weitere Untersuchung der Nebennieren erforderlich

sein sollte.

Die K+-Konzentration des modifizierten Mediums 199 betrug 4,5 mmol/l bei allen

Inkubationen, die im Rahmen der ANG II- und ACTH-Stimulationen durchgeführt wurden.

Auf den folgenden Seiten sind die Inkubationsprotokolle tabellarisch dargestellt.

3.3.6.2.1 Vorversuche

Um den Einfluss des Versuchsaufbaus auf die Aldosteronsekretion sowie das Verhalten der

Nebennieren abhängig von der Zeit beurteilen zu können, wurde während des Vorversuchs

die Aldosteronsekretion über 3,5 Stunden bei gleichen Bedingungen mit einer

Kaliumkonzentration von 3,5 mmol/l untersucht. Um festzustellen, ob die Nebennieren zum

Ende des Versuchs generell noch adäquat auf einen physiologischen Stimulus reagierten

oder eine Erschöpfung der Sekretion eingetreten war, wurde eine einmalige Stimulation mit

11 mmol/l Kalium durchgeführt

Tabelle 2: Inkubationsprotokoll zur Kontrolle des Zeitverlaufs der Aldosteronsekretion (K+ [mmol/l]).

Inkubationsintervalle

60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min

Kontrolle 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5 11,0

64

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Material und Methode

3.3.6.2.2 Kaliumstimulation

Dosis-Wirkungskurve

Zur Ermittlung der wirksamen K+-Konzentrationen, bei denen eine Stimulation der

Aldosteronsekretion stattfindet, wurde eine Dosis-Wirkungskurve erstellt.

Tabelle 3: Inkubationsprotokoll zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve von K+

[mmol/l].

Inkubationsintervalle

60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min

WT 3,5 3,5 4,0 5,0 7,0 11,0 11,0

Stimulation mit Kalium

Anhand der Vorversuche für K+ wurden die vergleichenden Untersuchungen an

Nebennieren von Knockout und Wildtyp Mäusen durchgeführt.

Tabelle 4: Inkubationsprotokoll der in vitro Untersuchungen zur Stimulation der Aldosteronsekretion durch K+ [mmol/l].

Inkubationsintervalle

60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min

WT 4,0 4,0 4,5 5,5 7,5 11,0

KO 4,0 4,0 4,5 5,5 7,5 11,0

65

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Material und Methode

3.3.6.2.3. ANG II-Stimulation

Dosis-Wirkungskurve

Zur Ermittlung der wirksamen ANG II-Konzentrationen, bei denen eine Stimulation der

Aldosteronsekretion stattfindet, wurden Nebennieren von Wildtyp Mäusen mit steigender

Konzentration von ANG II inkubiert und eine Dosis-Wirkungskurve erstellt.

Tabelle 5: Inkubationsprotokoll zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve von ANG II [mol/l].

Inkubationsintervalle

60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min

WT - - 10-12 10-10 10-9 10-8 10-6

Stimulation mit ANG II

Aufgrund der Befunde der Vorversuche zur ANG II-Stimulation wurden die

vergleichenden Untersuchungen an Nebennieren von Knockout und Wildtyp Mäusen

durchgeführt.

Tabelle 6: Inkubationsprotokoll der in vitro Untersuchungen zur Stimulation der

Aldosteronsekretion durch ANG II [mol/l].

Inkubationsintervalle

60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min

WT - - 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5

KO - - 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5

66

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Material und Methode

3.3.6.2.4 ACTH-Stimulation

Dosis-Wirkungskurve

Zur Ermittlung der wirksamen ACTH-Konzentrationen, bei denen eine Stimulation der

Aldosteronsekretion stattfindet, wurde eine Dosis-Wirkungskurve mit Nebennieren von

Wildtyp Mäusen erstellt.

Tabelle 7: Inkubationsprotokoll zur Erstellung der Dosis-Wirkungskurve von ACTH [mol/l].

Inkubationsintervalle

60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min

WT - - 10-15 10-14 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9

Stimulation mit ACTH

Aufgrund der Befunde der erstellten Dosis-Wirkungskurve für ACTH wurden die

vergleichenden Untersuchungen an Nebennieren von Knockout und Wildtyp Mäusen

durchgeführt.

Tabelle 8: Inkubationsprotokoll der in vitro Untersuchungen zur Stimulation der Aldosteronsekretion durch ACTH [mol/l].

Inkubationsintervalle

60 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min 30 min

WT - - 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7

KO - - 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7

67

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Material und Methode

3.3.7 Statistik

Die in dieser Arbeit aufgeführten Werte repräsentieren jeweils den arithmetischen Mittelwert

± Standardfehler (des Mittelwerts). Die Evaluation der Daten erfolgte in Abhängigkeit von

ihrer Gewinnung/Erstellung durch zwei unterschiedliche statistische Verfahren.

Die Unterschiede zwischen den Gruppen der ersten 3 Versuchsserien wurde mittels t-Test für

ungepaarte Daten nach Student (Student`s t-Test) auf ihre Signifikanz getestet.

In den Nebenniereninkubationsexperimenten der Versuchsserie 4 wurden die absoluten

Aldosteronsekretionsraten (in pg/ml/h) in prozentuale, auf das erste Inkubationsintervall nach

der Akklimatisation bezogene, normierte Größen umgewandelt. Die gewonnenen relativen

prozentualen Sekretionsraten von Aldosteron der Wildtyp und Knockout Tiere wurden

mittels zweiseitiger Multivarianzanalyse (two-way ANOVA, GRAPHPAD PRISM®)

miteinander verglichen. Bei signifikanten Ergebnissen und einer fehlenden Interaktion der

untersuchten Parameter wurden Unterschiede in der Aldosteronsekretionsrate zwischen den

Gruppen bei den einzelnen Konzentrationen mittels Student`s t-Test getestet.

Die in Gegenwart der verschiedenen Stimuli aus den normierten Sekretionsraten über

Kurvenanpassungsverfahren mit dem Programm TableCurve approximierten Werte der

Effektiven Dosis 50 (ED50), wurden aufgrund signifikant unterschiedlicher Varianzen mit

dem nach Welch korrigierten t-Test auf statistisch signifikante Unterschiede untersucht.

Außerdem wurde durch Vergleich mit den Ergebnissen unter Verwendung der absoluten

Sekretionsraten sichergestellt, dass durch den Gebrauch normierter Daten keine

systematischen Veränderungen der ED50 Werte provoziert wurden.

Unterschiede wurden als signifikant bewertet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner als

5% war (P<0,05).

68

Page 69: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

4 Ergebnisse

4.1. Genotypisierung

Die Untersuchungen dieser Arbeit wurden an männlichen C57/BL6 Inzuchtmäusen mit

genetischer Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals (BKβ1-/-)

durchgeführt. Als Kontrolltiere dienten männliche Wildtyp Tiere mit dem gleichen

genetischen Hintergrund (BKβ1+/+).

Um sowohl die Zuchttiere als auch die Tiere, an denen die beschriebenen Experimente

durchgeführt wurden, sicher einem der Genotypen zuordnen zu können, wurde anhand einer

Ohrbiopsie mit Hilfe der Polymerase Kettenreaktion nachgewiesen, ob der Genlocus, der für

die β1–Untereinheit codiert, bei den Tieren vollständig vorhanden oder durch genetische

Manipulation verkürzt war. Diese Verkürzung des Genfragmentes tritt bei den Knockout

Mäusen infolge einer Deletion des ersten codierenden BKβ1–Exons (exon 2) auf

(BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000). Dieses Exon codiert für die terminale

Aminosequenz inklusive der 1. transmembranen Domaine des β1 Proteins.

Mit Hilfe der in den Methoden beschriebenen Primern konnten die Genfragmente mit

unterschiedlicher Länge nachgewiesen werden.

Durch die Primer 11s und 3a konnte bei den Wildtyp Mäusen ein Genfragment mit 719

Basenpaaren amplifiziert werden, welches dem vollständigen Genabschnitt entspricht. Durch

die Primer 17s und 3a wurde der 372 Basenpaare lange Genabschnitt der Knockout Mäuse

nachgewiesen. Konnten auf dem Agarose-Gel beide Banden nachgewiesen werden, handelte

es sich um Mäuse mit einem heterozygoten Genotyp (siehe Abb. 9).

69

Page 70: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

Abbildung 9: PCR Analyse von repräsentativen Ohrbiopsien. Dargestellt sind mittels PCR amplifizierte Genfragmente aus Ohrbiopsien von BKβ1+/+ (1-3), BKβ1+/- (4-6) und BKβ1-/- (7-9) Mäusen. M bezeichnet den 1 kb Plus DNA-Marker und K die Kontrolle. Die Genfragmente der BKβ1+/+ liegen bei 719 bp, die BKβ1+/- bei 719 und 372 bp und die BKβ1-/- bei 372 bp.

70

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Ergebnisse

4.2 Versuchsserie 1 und 2

Zur Beurteilung des Allgemeinbefindens der katheterisierten Tiere wurde neben der

Beurteilung des Habitus täglich die Wasseraufnahme der Mäuse gemessen. Nach einer

reduzierten Wasseraufnahme am ersten postoperativen Tag (WT: 2,5 ± 0,4 ml u. KO: 2,2 ±

0,4 ml) normalisierte sich die Trinkmenge bei beiden Gruppen am 2. postoperativen Tag

(WT: 4,7 ± 0,4 ml u. KO: 4,6 ± 0,4 ml) und blieb am 3. postoperativen Tag konstant (WT:

4,9 ± 0,2 ml u. KO: 5,0 ± 0,5 ml). Zwischen den Genotypen konnte kein Unterschied in der

Wasseraufnahme festgestellt werden. Die nachfolgend aufgeführten Ergebnisse wurden

ausschließlich von Tieren erhoben, die den Habitus eines gesunden bis geringgradig kranken

Tieres zeigten.

4.2.1 Hämodynamische Daten

In der folgenden Tabelle sind die hämodynamischen Daten der Versuchsserien 1 und 2

dargestellt. Es wurden an zwei aufeinanderfolgenden Tagen der Blutdruck und die

Herzfrequenz bestimmt.

Tabelle 9: Mittelwerte und Standardfehler der hämodynamischen Daten der Versuchsserie 1 und 2. (*P<0,05)

1. Messtag 2. Messtag

Versuchsserie n MAD [mmHg]

Herzfrequenz[min-1]

MAD [mmHg]

Herzfrequenz[min-1]

Serie 1

WT

KO

12

14

110,6 ± 1,6

119,7 ± 1,5*

625 ± 13

579 ± 11

106,9 ± 1,7

116,0 ± 1,6*

605 ± 12

604 ± 10

Serie 2

WT

KO

8

9

104,7 ± 1,5

116,4 ± 2,1

550 ± 12

599 ± 19

104,1 ± 1,5

112,7 ± 1,5

591 ± 25

593 ± 7

71

Page 72: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

Die Daten der Basisuntersuchungen zeigten eine signifikante Erhöhung des mittleren

arteriellen Blutdrucks um ca. 10 mmHg bei den Knockout Mäusen im Vergleich zu den

Wildtyp Tieren (117,8 ± 1,4 mmHg vs. 108,6 ± 1,4 mmHg; P<0,001). Die Herzfrequenzen

wiesen zwischen den beiden Versuchsgruppen keine signifikanten Unterschiede auf (592 ± 9

min-1 vs. 614 ± 8 min-1).

Im Rahmen der Blutdruckbestimmung der 2. Serie konnte der Nachweis des signifikanten

Blutdruckanstieges der Knockout Mäuse reproduziert werden (114,4 ± 1,4 mmHg vs. 104,7 ±

1,2 mmHg; P<0,001). Der MAD sowohl der Wildtyp Tiere als auch der Knockout Mäuse

dieser 2. Versuchsserie liegt gleichmäßig ca. 4 mmHg unter dem Niveau der 1. Serie, wobei

der Unterschied zwischen den Genotypen jedoch quantitativ bestehen blieb.

4.2.2 Morphometrische Daten

In der ersten Versuchsserie wurde als Parameter für eine Herzhypertrophie das Gewicht des

Herzens, des linken sowie rechten Ventrikels bestimmt und zum Körpergewicht ins

Verhältnis gesetzt.

Tabelle 10: Mittelwerte und Standardfehler der Herzgewichte. (*P<0,05) Versuchsserie n HGW

[mg]

LV

[mg]

RV

[mg]

LV/KGW

[mg/g]

Serie 1

WT

KO

9

11

113 ± 2,5

138 ± 5,3*

84 ± 2,0

104 ± 4,4*

21 ± 0,8

27 ± 1,0*

3,16 ± 0,10

3,58 ± 0,10*

Die Daten zeigen einen signifikanten Anstieg des Herzgewichtes und des Gewichtes des

linken sowie rechten Ventrikels der Knockout Mäuse. Da das ermittelte Körpergewicht der

Tiere keinen Unterschied (WT: 28,3 ± 1,2 g vs KO: 30,0 ± 0,8 g) aufwies, zeigte sich auch

im Verhältnis des Gewichtes des linken Ventrikels zum Körpergewicht eine signifikante

72

Page 73: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

Steigerung bei den Knockout Tieren (WT: 3,16 ± 0,10 mg/g vs. KO: 3,58 ± 0,10 mg/g;

P<0,05), was als Indiz für eine Linksherzhypertrophie zu bewerten ist. Das Verhältnis von

Herzgewicht zu Körpergewicht war ebenfalls signifikant erhöht (WT: 4,23 ± 0,12 mg/g vs.

KO: 4,80 ± 0,16 mg/g; P< 0,05).

73

Page 74: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

4.2.3 Ergebnisse der Blutuntersuchungen

4.2.3.1 Elektrolyte und Kreatinin

In der folgenden Tabelle sind die Plasmakonzentrationen der untersuchten Elektrolyte und

des Kreatinins der 1. Versuchsserie dargestellt. Im Gegensatz zu den Na+-, K+- und

Kreatininkonzentrationen, ermittelt aus jeweils 10 analysierten Plasmaproben, wurde die

Chloridkonzentration nur in 5 Plasmaproben bestimmt.

Tabelle 11: Mittelwerte und Standardfehler der Elektrolyt-/Kreatinin-konzentrationen im Plasma. (*P<0,05; †: n=5)

Versuchs-

serie

n Na+

[mmol/l]

K+

[mmol/l]

Cl- †

[mmol/l]

Kreatinin

[mg/dl]

Serie 1

WT

KO

10

10

145,1 ± 1,2

149,0 ± 4,8*

4,49 ± 0,10

4,01 ± 0,09*

110,7 ± 1,1

114,5 ± 1,9

0,95 ± 0,11

0,67 ± 0,11

Die Plasmakonzentrationen von Chlorid und Kreatinin zeigten im t-Test keine signifikanten

Abweichungen, wohingegen die Natrium- und Kaliumkonzentrationen signifikante

Unterschiede zwischen den Genotypen aufwiesen. So war die Natriumkonzentration im

Plasma der Knockout Mäuse signifikant um 3,9 mmol/l erhöht (WT: 145,1 ± 1,2 mmol/l vs.

KO: 149,0 ± 4,8 mmol/l; P<0,05). Die Kaliumkonzentration im Plasma der Knockout

Mäuse war hingegen hochsignifikant verringert (WT: 4,49 ± 0,10 mmol/l vs. KO: 4,01 ±

0,09 mmol/l; P<0,001).

74

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Ergebnisse

4.2.3.2 Renin

Bei den Tieren der 1. Versuchsserie wurde des Weiteren die Plasmareninkonzentration

(PRC) und die Proreninkonzentration bestimmt, um eine Beurteilung der Aktivität des

Renin-Angiotensin-Systems vornehmen zu können. Beide Parameter wurden indirekt über

die Bestimmung des entstandenen ANG I bestimmt. Zur Angabe der Konzentration des

Prorenins wurde von der gemessenen ANG I-Konzentration die Plasmareninkonzentration

subtrahiert, um die ANG I-Konzentration zu erhalten, die ausschließlich durch die

aktivierten Formen des Prorenins gebildet wurde. Die Ergebnisse zeigten eine leicht

erhöhte Plasmareninkonzentration bei den BKβ1-/- Mäusen, wohingegen die Konzentration

des Prorenins leicht erniedrigt war. Die Unterschiede zwischen den beiden Genotypen

überschritten jedoch bei beiden Bestimmungen das Signifikanzniveau von P<0,05.

Tabelle 12: Mittelwerte und Standardfehler der Plasmarenin- und Proreninkonzentrationen.

Versuchs-

serie

n PRC

[ng ANG I/ml/h]

Prorenin

[ng ANG I/ml/h]

Serie 1

WT

KO

9

9

129,9 ± 22,1

144,5 ± 12,5

960 ± 141

664 ± 95

75

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Ergebnisse

4.2.3.3 Aldosteron

Zur Bestimmung des Aldosterongehaltes im Plasma musste aufgrund des geringen

Blutvolumens der Mäuse Blut in einer weiteren Versuchsgruppe abgenommen werden

(Versuchsserie 2).

Die Knockout Mäuse zeigten eine signifikante Erhöhung des zirkulierenden Aldosterons im

Blut gegenüber den Wildtyp Tieren (KO: 134,8 ± 38,0 pg/ml vs. WT: 28,97 ± 5,81 pg/ml;

P<0,05).

Plas

maa

ldos

tero

n [p

g/m

l]

0

40

80

120

160

200

+/+

(n=7)

-/-

(n=8)

P<0.05

Abbildung 10: Aldosteronkonzentrationen im Plasma. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte und Standardfehler der Aldosteronkonzentrationen von Wildtyp (+/+) und Knockout (-/-) Mäusen; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Tiere.

76

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Ergebnisse

4.3 Versuchsserie 3

4.3.1 Hämodynamische Daten

In dem folgenden Balkendiagramm wird die Veränderung des mittleren arteriellen Blutdrucks

unter Spironolactonbehandlung (3. Serie) dargestellt.

Mitt

lere

r art

erie

ller B

lutd

ruck

[mm

Hg]

90

100

110

120

Spironolacton

+/+(n=11)

-/-(n=12)

P<0.0001

n.s.

Kontrolle

+/+(n=8)

-/-(n=9)

Abbildung 11: Entwicklung des mittleren arteriellen Blutdrucks unter Spirono-lactonbehandlung. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit Standardfehlern von Wildtyp (+/+) und Knockout (-/-) Mäusen ohne und mit Blockade der Mineralocorticoidrezeptoren; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Tiere.

Unter Spironolactonbehandlung sank der mittlere arterielle Blutdruck im Vergleich zu den

Werten der 1. Serie bei den Knockout Mäusen deutlich um 16 mmHg, wohingegen bei den

Wildtyp Tieren nur ein geringer Abfall um 8 mmHg festzustellen war (KO: 102,0 ± 1,7

mmHg vs. WT: 100,8 ± 1,8 mmHg). Zwischen den Versuchsgruppen konnte kein

signifikanter Blutdruckunterschied mehr nachgewiesen werden.

77

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Ergebnisse

4.3.2 Morphometrische Daten

Wie aus den Daten der Versuchsserie 1 deutlich wird, entwickelten die Knockout Mäuse eine

linksventrikuläre Hypertrophie, welche durch das Verhältnis von linksventrikulärem

Gewicht / Körpergewicht (WT: 3,16 ± 0,10 mg/g vs. KO: 3,58 ± 0,10 mg/g; P<0,05) deutlich

wird (siehe Abb. 12).

Unter Spironolactonbehandlung reduzierte sich das Gewicht des isolierten linken Ventrikels

(WT: 80 ± 2,0 mg vs. KO: 90 ± 1,9 mg) und somit auch der Quotient aus LV/KGW (WT:

3,00 ± 0,07 mg/g vs. KO: 2,98 ± 0,04 mg/g).

LV/K

GW

[mg/

g]

0

1

2

3

4

+/+

(n=9)

-/-

(n=11)

P<0.05

Abbildung 12: Darstellung der linksventrikulären Hypertrophie der Knockout Mäuse. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit Standardfehlern von Wildtyp (+/+) und Knockout (-/-) Mäusen; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Tiere.

78

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Ergebnisse

4.4 Versuchsserie 4

Im Rahmen der in vitro Inkubationsversuche mit Nebennierenstücken von Knockout und

Wildtyp Mäusen wurde untersucht, ob bei Stimulierung der Aldosteronsekretion mittels

verschiedener physiologischer Stimuli (K+, ANG II und ACTH) Unterschiede zwischen den

zwei Versuchsgruppen in der Sekretionsrate und –kinetik nachgewiesen werden können.

4.4.1 Vorversuch

Um die Adaptierung der Nebennierenzellen an die gewählten Inkubationsbedingungen im

modifizierten Medium 199 äquilibriert gegen Carbogen (95% O2 // 5% CO2) sowie den

weiteren zeitlichen Verlauf der Aldosteronsekretion beurteilen zu können, wurden

Nebennieren von 4 Wildtyp Mäusen über 3,5 Stunden unter konstanten

Versuchsbedingungen inkubiert. Anhand der gewonnen Ergebnisse sollte der Zeitverlauf der

weiteren Inkubationsversuche festgelegt werden. Die Einzelwerte sowie die arithmetischen

Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und Standardabweichungen sind

im Anhang in der Tabelle I dokumentiert.

Die Kontrollinkubation erfolgte bei einer K+-Konzentration von 3,5 mmol/l. Während des

letzten Zeitintervalls von 30 Minuten wurden die Nebennieren bei 11 mmol/l K+ inkubiert,

um festzustellen, ob die Zona glomerulosa-Zellen auch zum Ende der Inkubationszeit nach

längerer Versuchsdauer noch stimuliert werden konnten oder ob eine Erschöpfung der

Aldosteronsekretion stattgefunden hatte (siehe Abb. 13).

Innerhalb der ersten Stunde wurde aus den Nebennieren deutlich mehr Aldosteron freigesetzt

als in dem nachfolgenden Zeitintervall (26051 ± 1835 pg/ml/h vs. 18025 ± 441 pg/ml/h). Im

weiteren zeitlichen Verlauf fiel die Aldosteronsekretion kontinuierlich auf 12091 ± 2320

pg/ml/h ab. Durch die abschließende Inkubation bei einer K+-Konzentration von 11,0 mmol/l

erfolgte eine starke Stimulierung der Aldosteronsekretion aus den Zona glomerulosa-Zellen

(41410 ± 3655 pg/ml/h).

Aufgrund des starken Abfalls der Aldosteronproduktion innerhalb der 1. Stunde auf das

nächste Inkubationsintervall, diente die erste Stunde der Inkubation ausschließlich der

79

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Ergebnisse

Akklimatisation der Nebennieren an die Versuchsbedingungen und wird in den folgenden

Abbildungen nicht mehr dargestellt.

Zeit [Stunden]

1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0

Aldo

ster

onse

kret

ion

[pg/

ml/h

]

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

Abbildung 13: Zeitlicher Verlauf der Aldosteronsekretion bei 3,5 und 11 mmol/l K+. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit zugehörigen Standardfehlern (n=4). Die Aldosteronproduktion wurde generell für eine Stunde berechnet. Die Inkubation erfolgte innerhalb der ersten 3,5 Stunden bei 3,5 mmol/l K+. Die letzte Inkubation wurde in Gegenwart von 11 mmol/l K+ durchgeführt.

80

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Ergebnisse

4.4.2 Kaliumstimulation

4.4.2.1 Dosis-Wirkungskurve

Als Vorversuch zur Kaliumstimulation wurde die Aldosteronfreisetzung in Abhängigkeit

steigender K+-Konzentrationen (3,5, 4,0, 5,0, 7,0 und 11 mmol/l) untersucht, um die

potentiell stimulierenden K+-Konzentrationen zu ermitteln (siehe Abb. 14). Es wurden die

Nebennieren von 6 Wildtyp Tieren inkubiert. Die Einzelwerte sowie die arithmetischen

Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und -abweichungen sind im

Anhang in der Tabelle II dokumentiert.

Kaliumkonzentration [mmol/l]

3,5 4 5 6 7 8 9 10

Aldo

ster

onse

kret

ion

[pg/

ml/h

]

15000

25000

35000

45000

55000

20000

30000

40000

50000

11

Abbildung 14: Dosis-Wirkungskurve von Kalium. Dargestellt sind die arithmetischen Mittelwerte mit zugehörigen Standardfehlern (n=6).

Die Nebennieren produzierten bei 3,5 mmol/l und 4 mmol/l eine vergleichbare Menge

Aldosteron (22890 ± 1703 pg/ml/h und 22804 ± 1957 pg/ml/h). Ab einer K+-Konzentration

81

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Ergebnisse

von 5 mmo/l erfolgte eine deutliche Steigerung der Aldosteronsekretion (28093 ± 2213

pg/ml/h). Die maximale Sekretionsrate wurde in diesem Versuch bei der höchsten K+-

Konzentration (11 mmol/l) erreicht (49489 ± 4643 pg/ml/h).

4.4.2.2 Stimulation mit Kalium

Die vergleichende Untersuchung der Sekretion von Aldosteron unter Kaliumstimulation

wurde an Nebennieren von 10 Knockout Mäusen und 10 Wildtyp Mäusen durchgeführt,

wobei folgende Kaliumkonzentrationen eingesetzt wurden: 4,0, 4,5, 5,5, 7,5 und 11 mmol/l.

Die Einzelwerte sowie die arithmetischen Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit

Standardfehlern und -abweichungen sind im Anhang in der Tabelle III dokumentiert.

Die Abbildung 15 zeigt die arithmetischen Mittelwerte der relativen prozentualen

Sekretionsänderungen, bezogen auf die 1. Inkubation bei 4,0 mmol/l K+. Diese 1.

Inkubation diente somit als Referenzwert der individuellen Aldosteronsekretion (= 100%)

und erlaubte eine Normierung der Stimulation der Aldosteronsekretion.

Ausgehend von 100% bei 4,0 mmol/l K+ fiel die Aldosteronsekretion bei einer

Kaliumkonzentration von 4,5 mmol/l sowohl bei den Wildtyp als auch bei den Knockout

Mäusen geringgradig ab (WT: 94,9 ± 8,8 % vs. KO: 89,7 ± 6,0 %). Bei 5,5 mmol/l K+

zeigte die Kurve beider Gruppen eine deutliche Stimulation der Sekretion wobei die

Knockout Nebennieren tendenziell stärker stimuliert wurden (WT: 158,6 ± 10,3 % vs. KO:

182,4 ± 19,8 %). Durch Inkubation bei 7,5 mmol/l K+ erfolgte eine weitere Steigerung der

relativen Aldosteronsekretion erneut mit einer stärkeren Tendenz bei den Knockout

Nebennieren (WT: 204,8 ± 11,1 % vs. 255,0 ± 23,9 %), die jedoch bei 11 mmol/l K+

stagnierte (WT: 211,4 ± 12,2 % vs. KO: 263,7 ± 23,3 %).

82

Page 83: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

Kaliumkonzentration [mmol/l]

4 4,5 5,5 7,5

rela

tive

Aldo

ster

onse

kret

ion

[%]

50

100

150

200

250

300

WT, n =10

KO, n =10

11

Abbildung 15: Relative prozentuale Änderung der Aldosteronfreisetzung bei steigenden Kaliumkonzentrationen. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Nebennierenpaare.

Die durchgeführte zweiseitige Multivarianzanalyse zeigte, dass sowohl der Genotyp

(P<0,01) als auch die Kaliumkonzentration (P<0,0001) einen signifikanten Einfluss auf die

Aldosteronsekretion ausüben. Eine signifikante Interaktion zwischen den beiden

Parametern lag jedoch nicht vor, so dass mittels students t-Test geprüft wurde, ob zwischen

den einzelnen Mittelwerten der relativen Sekretion der Knockout Mäuse gegenüber der

relativen Sekretion der Wildtyp Mäuse bei jeweils gleicher Kaliumkonzentration ein

signifikanter Unterschied bestand. Es konnte bei keiner Konzentration ein signifikanter

Unterschied festgestellt werden, wobei sich jedoch bei 7,5 mmo/l K+ (P=0,07) und 11

mmol/l K+ (P=0,06) die P-Werte an der Grenze zur Signifikanz befanden und somit eine

tendenziell stärkere Stimulation der Knockout Nebennieren widerspiegeln. Die Berechnung

der ED50 wurde auf der Basis von 50 Datenpunkten pro Genotyp durchgeführt und ergab

83

Page 84: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

für die Wildtypen eine Kaliumkonzentration von 5,44 ± 0,23 mmol/l bei einer relativen

Aldosteronsekretion von 152,9 ± 15,1 % und für die Knockouts eine Kaliumkonzentration

von 5,46 ± 0,44 mmol/l bei einer relativen Aldosteronsekretion von 178,2 ± 24,0 %. Der

aufgrund der signifikant unterschiedlichen Varianzen durchgeführte nach Welch korrigierte

t-Test ergab keinen signifikanten Unterschied der ED50 Werte. Die ED50 Werte der

absoluten Aldosteronsekretion stimmten mit denen der relativen Aldosteronsekretion

überein (WT: 5,42 ± 0,31 mmol/l vs. KO: 5,49 ± 0,47 mmol/l).

4.4.3 ANG II-Stimulation

4.4.3.1 Dosis-Wirkungskurve

Im Rahmen dieses Versuchs wurde an Nebennieren von 4 Wildtyp Tieren die

Aldosteronfreisetzung bei steigenden ANG II-Konzentrationen (10-12, 10-10 , 10-9, 10-8 und

10-6 mol/l) untersucht, um das Spektrum der stimulierenden ANG II-Konzentrationen zu

ermitteln (Abb. 16). Die Primärdaten sind im Anhang in der Tabelle IV dargestellt.

Die Akklimatisation und die 1. Inkubation erfolgte ohne ANG II bei 4,5 mmol/l Kalium.

Die Sekretion von Aldosteron fiel von 4,5 mmol/l Kalium (20050 ± 118 pg/ml/h) bis zu

einer ANG II-Konzentration von 10-10 mol/l (16433 ± 1053 pg/ml/h) moderat ab. Nach

einer geringgradigen Steigerung bei 10-9 mol/l ANG II, erfolgte bei 10-8 und 10-6 mol/l

ANG II eine sehr starke Stimulation der Sekretion (25375 ± 1576 pg/ml/h und 37618 ±

2009 pg/ml/h). Eine Sättigung der Aldosteronsekretion konnte bei den gewählten

Konzentrationen nicht dargestellt werden.

84

Page 85: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

ANG II-Konzentration [mol/l]

0 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6

Aldo

ster

onse

kret

ion

[pg/

ml/h

]

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

Abbildung 16: Dosis-Wirkungskurve von ANG II. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar (n=4). Die basale Inkubation erfolgte bei 4,5 mmol/l K+.

4.4.3.2 Stimulation mit ANG II

Die vergleichende Untersuchung der Sekretion von Aldosteron unter ANG II-Stimulation

(10-10, 10-9, 10-8 , 10-7, 10-6 und 10-5 mol/l ANG II) wurde an Nebennieren von 10 Knockout

Mäusen und 10 Wildtyp Mäusen durchgeführt. Die Akklimatisation und 1. Inkubation

erfolgte ohne ANG II-Stimulus bei 4,5 mmol/l K+. Die Einzelwerte sowie die

arithmetischen Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und

-abweichungen sind im Anhang in der Tabelle V dokumentiert.

Die folgende Abbildung (Abb. 17) zeigt die arithmetischen Mittelwerte der relativen

Sekretionsänderung, bezogen auf die 1. Inkubation bei 4,5 mmol/l K+ in Prozent. Auf der

Abzisse sind die ANG II-Konzentrationen in logarithmischer Einteilung dargestellt.

85

Page 86: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

Ausgehend von 100% bei 4,5 mmol/l K+ ohne ANG II-Stimulus blieb die

Aldosteronsekretion bei 10-10 mol/l ANG II bei beiden Genotypen weitestgehend konstant

(WT: 95,5 ± 3,6 % vs. KO: 97,0 ± 4,1 %). Ab einer Konzentration von 10-9 mol/l ANG II

zeigte die Kurve der Knockout Nebennieren eine beginnende Stimulation der

Aldosteronsekretion, wohingegen die Sekretion der Wildtyp Nebennieren nur den

Ausgangswert erreichte (WT: 101,0 ± 5,6 % vs. KO: 114,0 ± 2,5 %). Die Kurve der

Knockout Nebennieren zeigte auch im weiteren Verlauf bei gleichen Konzentrationen eine

stärkere Stimulation der Aldosteronsekretion als die Nebennieren der Wildtypen und

erreichte bei 10-6 mol/l ANG II das Sekretionsmaximum (WT: 180,0 ± 6,1 % vs. KO: 206,5

± 11,1 %).

Die durchgeführte zweiseitige Multivarianzanalyse zeigte auch unter ANG II-Stimulation

einen hoch signifikanten Einfluss des Genotyps (P<0,0001) und der ANG II-Konzentration

(P<0,0001) auf die relative Aldosteronsekretion. Eine signifikante Interaktion zwischen den

beiden Parametern lag wiederum nicht vor, so dass ebenfalls mittels t-Test untersucht

wurde, ob zwischen den einzelnen Mittelwerten der relativen Sekretion bei jeweils gleicher

Konzentration ANG II ein signifikanter Unterschied bestand. Es konnte ab einer

Konzentration von 10-9 bei allen weiteren Konzentrationen eine signifikant höhere relative

Aldosteronsekretion (P<0,05) der Knockout Nebennieren festgestellt werden.

Die Berechnung der ED50 wurde auf der Basis von 60 Datenpunkten pro Genotyp

durchgeführt und ergab für die Wildtypen eine ANG II-Konzentration von 1,57 x 10-8 ±

6,20 x 10-9 mol/l bei einer relativen Aldosteronsekretion von 136,2 ± 9,8 % und für die

Knockout Mäuse eine Konzentration von 9,73 x 10-9 ± 4,77 x 10-9 mol/l bei einer relativen

Aldosteronsekretion von 150,2 ± 18,6 %. Der aufgrund der signifikant unterschiedlichen

Varianzen durchgeführte nach Welch korrigierte t-Test ergab keinen signifikanten

Unterschied der ED50 Werte. Die ED50 Werte der absoluten Aldosteronsekretion stimmten

mit denen der relativen Aldosteronsekretion überein (WT: 1,54 x 10-8 ± 7,25 x 10-9 mmol/l

vs. KO: 1,06 x 10-8 ± 7,47 x 10-9 mmol/l).

86

Page 87: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

ANG II-Konzentration [mol/l]

0 10-10 10-9 10-8 10-7 10-6 10-5

rela

tive

Aldo

ster

onse

kret

ion

[%]

50

100

150

200

250

WT, n =10KO, n =10

∗ ∗∗

Abbildung 17: Relative prozentuale Änderung der Aldosteronfreisetzung bei steigenden ANG II-Konzentrationen. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar. Die basale Inkubation erfolgte bei K+ 4,5 mmol/l. Die Sterne* markieren einen signifikanten Unterschied (P<0,05) der Sekretion von Knockout und Wildtyp Nebennieren; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Nebennierenpaare.

87

Page 88: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

4.4.4 ACTH-Stimulation

4.4.4.1 Dosis-Wirkungskurve

Im Rahmen dieses Versuchs wurde an Nebennieren von 5 Wildtyp Tieren die

Aldosteronfreisetzung bei steigenden ACTH-Konzentrationen (10-15, 10-14, 10-13 , 10-12, 10-

11, 10-10 und 10-9 mol/l) untersucht, um das Spektrum der stimulierenden ACTH-

Konzentrationen zu ermitteln (Abb. 18). Die Primärdaten sind im Anhang in der Tabelle VI

dargestellt.

ACTH-Konzentration [mol/l]

0 10-15 10-14 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9

Aldo

ster

onse

kret

ion

[pg/

ml/h

]

5000

15000

25000

35000

45000

55000

65000

Abbildung 18: Dosis-Wirkungskurve von ACTH. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar (n=5). Die basale Inkubation erfolgte bei 4,5 mmol/l K+.

Die Akklimatisation und die 1. Inkubation erfolgte ohne ACTH bei 4,5 mmol/l Kalium. Die

Sekretion von Aldosteron fiel, ausgehend von 4,5 mmol/l Kalium (22635 ± 1746 pg/ml/h)

bis zu einer ACTH-Konzentration von 10-12 mol/l (12714 ± 1552 pg/ml/h), kontinuierlich

88

Page 89: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

ab. Nach einer geringgradigen Steigerung bei 10-11 mol/l ACTH erfolgte bei 10-10 und 10-9

mol/l ACTH eine sehr starke Stimulation der Sekretion (40051 ± 2531 pg/ml/h und 55995

± 3339 pg/ml/h). Eine Sättigung der Aldosteronsekretion konnte bei den gewählten

Konzentrationen ebenfalls nicht dargestellt werden, so dass das Konzentrationsspektrum

innerhalb der vergleichenden Stimulationsversuche zu höheren ACTH-Konzentrationen

verschoben wurde.

4.4.4.2 Stimulation mit ACTH

Die vergleichende Untersuchung der Sekretion von Aldosteron unter ACTH-Stimulation

(10-13, 10-12, 10-11 , 10-10, 10-9 , 10-8 und 10-7 mol/l ACTH) wurde ebenfalls an Nebennieren

von 10 Knockout Mäusen und 10 Wildtyp Mäusen durchgeführt. Die Akklimatisation und

1. Inkubation erfolgte ohne ACTH-Stimulus bei 4,5 mmol/l K+. Die Einzelwerte sowie die

arithmetischen Mittelwerte der Inkubationsintervalle mit Standardfehlern und

-abweichungen sind im Anhang in der Tabelle VII dargestellt.

Die Abbildung 19 zeigt die arithmetischen Mittelwerte der relativen Sekretionsänderung,

bezogen auf die 1. Inkubation bei 4,5 mmol/l K+ in Prozent. Auf der Abzisse sind die

ACTH-Konzentrationen in logarithmischer Einteilung dargestellt.

Die Kurven der relativen Aldosteronfreisetzung zeigten unter ACTH-Stimulierung einen

ähnlichen Verlauf wie die relativen Freisetzungskurven unter ANG II-Stimulation (siehe

Abb.17). Ausgehend von 100% bei 4,5 mmol/l K+ ohne ACTH-Stimulus fiel die

Aldosteronsekretion bis 10-12 mol/l ACTH in beiden Gruppen gleichermaßen moderat ab

(WT: 72,5 ± 2,4 % vs. KO: 75,0 ± 3,2 %). Bei einer ACTH-Konzentration von 10-11 mol/l

reagierten die Knockout Nebennieren mit einer geringgradig stärkeren Stimulierung (WT:

74,4 ± 2,4 % vs. KO: 83,9 ± 4,5 %). Diese größere Empfindlichkeit der Knockout

Nebennieren setzte sich bis zur höchsten ACTH-Konzentration fort (WT: 238,8 ± 14,5 %

vs. KO: 252,8 ± 10,6 %). Das Maximum der Aldosteronsekretion erreichten die Knockout

Nebennieren bereits bei 10-8 mol/l (WT: 234,8 ± 13,2 % vs. KO: 263,4 ± 12,8 %),

89

Page 90: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

wohingegen die Wildtyp Nebennieren auch bei 10-7 eine weitere Steigerung der

Sekretionsrate zeigten (WT: 238,8 ± 14,5 %).

ACTH-Konzentration [mol/l]

0 10-13 10-12 10-11 10-10 10-9 10-8 10-7

rela

tive

Aldo

ster

onse

kret

ion

[%]

50

100

150

200

250

300

WT, n =10KO, n =10

Abbildung 19: Relative prozentuale Änderung der Aldosteronfreisetzung bei steigenden ACTH-Konzentrationen. Die Symbole stellen die arithmetischen Mittelwerte und die zugehörigen Standardfehler dar. Die basale Inkubation erfolgte bei K+ 4,5 mmol/l; n bezeichnet die Anzahl der jeweils untersuchten Nebennierenpaare.

Die durchgeführte zweiseitige Multivarianzanalyse zeigte unter ACTH-Stimulation, dass

sowohl der Genotyp als auch die Behandlung mit unterschiedlichen ACTH-

Konzentrationen einen signifikanten Einfluss (P<0,0001 und P<0,001) auf die relative

Aldosteronsekretion ausüben. Wiederum fand keine Interaktion zwischen den beiden

getesteten Parametern statt. Im anschließend durchgeführten t-Test wurde jedoch bei keiner

der eingesetzten ACTH-Konzentrationen ein signifikanter Unterschied zwischen beiden

Genotypen festgestellt.

90

Page 91: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Ergebnisse

Die Berechnung der ED50 wurde auf der Basis von 60 Datenpunkten pro Genotyp

durchgeführt und ergab für die Wildtypen eine ACTH-Konzentration von 1,08 x 10-10 ±

3,12 x 10-11 mol/l bei einer relativen Aldosteronsekretion von 151,0 ± 17,9 % und für die

Knockouts eine Konzentration von 7,62 x 10-11 ± 1,82 x 10-11 mol/l bei einer relativen

Aldosteronsekretion von 163,6 ± 17,6 %. Der aufgrund der signifikant unterschiedlichen

Varianzen durchgeführte nach Welch korrigierte t-Test ergab keinen signifikanten

Unterschied der ED50 Werte. Die ED50 Werte der absoluten Aldosteronsekretion stimmten

mit denen der relativen Aldosteronsekretion überein (WT: 1,09 x 10-10 ± 1,98 x 10-11

mmol/l vs. KO: 7,91 x 10-11 ± 1,78 x 10-11 mmol/l).

91

Page 92: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

5 Diskussion

Das in dieser Arbeit untersuchte Mausmodell ist das einzige bis heute beschriebene

Tiermodell, in dem durch eine genetische Mutation ein Hypertonus nicht-renaler Genese

ausgelöst werden soll. Nach dem aktuellen Wissensstand wird davon ausgegangen, dass die

BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des Gefäßmuskeltonus übernehmen,

indem sie einen negativen Feedback Mechanismus zur Limitierung einer Vasokonstriktion

vermitteln. Durch die genetische Inaktivierung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle soll durch

eine reduzierte Aktivität der BK-Kanäle eine Erhöhung des Tonus der glatten

Gefäßmuskelzellen in arteriellen Widerstandsgefäßen erfolgen, wodurch eine Steigerung des

arteriellen Bluthochdrucks induziert wird (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000).

Durch Nachweis der BK-Kanäle in der Zona glomerulosa der Nebennieren ist jedoch eine

alternative Erklärung für die Hypertonie vorstellbar. So besteht die Möglichkeit, dass durch

die Inaktivierung der β1-Untereinheit eine veränderte Calciumsensitivität der Zona

glomerulosa-Zellen hervorgerufen wird, aufgrund derer eine Steigerung der

Aldosteronsekretion induziert wird. Aus dieser Hypothese könnte geschlossen werden, dass

erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut ursächlich für die Hypertonie der BKβ1-/- Mäuse

verantwortlich sind.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, ob bei den BKβ1-/- Mäusen die

Hypothese bestätigt werden kann, dass der beobachtete Bluthochdruck durch einen

Hyperaldosteronismus verursacht wird. Bei Bestätigung dieser Hypothese sollte im

Anschluss daran die mögliche Genese des Hyperaldosteronismus durch in vitro

Inkubationsexperimente untersucht werden.

Untersuchungen zum Aldosteronsystem

Die Untersuchungsergebnisse der 1. und 2. Versuchsserie belegen, dass die BKβ1-/- Mäuse

aufgrund der genetischen Inaktivierung der β1-Untereinheit der BK-Kanäle einen

Hyperaldosteronismus entwickeln. Es konnte gezeigt werden, dass die Knockout Mäuse

pathophysiologische Veränderungen entwickeln, die bei einem klinischen

92

Page 93: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Hyperaldosteronismus regelmäßig nachzuweisen sind. Hierzu zählen neben einer erhöhten

Plasmaaldosteronkonzentration ein Bluthochdruck und Veränderungen der Elektrolyt-

konzentrationen im Plasma (MELBY 1989).

Die Bestimmung der Plasmaaldosteronkonzentrationen der BKβ1-/- Mäuse und BKβ1+/+

Mäuse lieferte im Laufe der durchgeführten Untersuchungen erste deutliche Hinweise auf

einen Hyperaldosteronismus der Knockout Tiere. Die Blutabnahme für die Analyse erfolgte

unter stressfreien Bedingungen über den arteriellen Katheter, da seit langem bekannt ist, dass

eine Aktivierung des Sympathikus innerhalb kürzester Zeit über direkte und indirekte

Signalwege zu einer Stimulierung der Aldosteronsekretion führt (DUNN 1970, TAUGNER

et al. 1984). Dies wird durch Publikationen bestätigt, in denen je nach Methode der

Blutgewinnung sehr unterschiedliche Werte für die Aldosteronkonzentration im Plasma

mitgeteilt werden (CHOLEWA u. MATTSON 2001, HEIKKILÄ et al. 2002, MASUZAKI et

al. 2003, NEIL et al. 2003). Dementsprechend gibt es noch keinen einheitlichen Referenzwert

für die Plasmaaldosteronkonzentration bei Mäusen. Um das Risiko zu minimieren, durch die

Blutabnahme eine Erhöhung der Aldosteronkonzentration zu verursachen, wurde auf absolute

Ruhe im Labor geachtet und die Abnahmebedingungen so optimiert, dass die Blutentnahme

von den Tieren unbemerkt durchgeführt werden konnte. Die in dieser Arbeit erhobenen

Aldosterondaten liegen infolgedessen in der Regel auch deutlich unter den in der Literatur

publizierten Konzentrationen, was als Indikator für die Qualität der Abnahmebedingungen

angesehen werden kann. Die Blutabnahme erfolgte in einem relativ engen Zeitfenster

zwischen 17.00 und 19.00 Uhr, um den zirkadianen Rhythmus der Aldosteronfreisetzung zu

berücksichtigen. So findet bei dem durchgeführten Lichtregime während dieser Zeit ein

Sekretionsmaximum der Nebennierenrindenhormone statt (DROSTE et al. 2003), wodurch

mögliche Unterschiede bei der Aldosteronsekretion am präzisesten erfasst werden können.

Aufgrund des geringen zur Verfügung stehenden Probenvolumens von weniger als 150 µl

wurde die Aldosteronkonzentration in den einzelnen Proben mit dem Radioimmunoassay der

Firma Immunotech analysiert. Der Aldosteron-RIA von Immunotech wird von vielen

Arbeitsgruppen zur Bestimmung der Aldosteronkonzentration bei verschiedenen Spezies

verwendet (unter anderen HILBERS et al. 1999, ARRIGHI et al. 2001) und zeichnet sich

durch eine hohe Empfindlichkeit (6 pg/ml) aus. Die hochgradig signifikante Erhöhung der

Plasmaaldosteronkonzentration bei BKβ1-/- Mäuse auf 450 % des Wildtypwerts zeigt

93

Page 94: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

deutlich, dass die Kontrolle der Aldosteronsekretion bei den Knockout Mäusen pathologisch

verändert ist. Die Diskussion möglicher Ursachen der gesteigerten Aldosteronsekretion der

BKβ1-/- Mäuse erfolgt im zweiten Teil dieses Kapitels.

Wie bereits im Literaturteil ausführlich beschrieben (Seiten 20–23) ist Aldosteron essentiell

an der Homöostase des Wasser- und Elektrolythaushalts beteiligt. Als Folge erhöhter

Aldosteronkonzentrationen kommt es durch eine gesteigerte Aktivität von Ionenkanälen v.a.

in epithelialen Geweben zu einer Störung dieser Homöostase. Auf zellulärer Ebene wird die

pathologische Wirkung von erhöhten Aldosteronkonzentrationen auf die Elektrolyt- und

Volumenhomöostase in erster Linie durch eine Funktionssteigerung des Epithelialen

Natriumkanals sowie der basolateralen Na+/K+-ATPase im distalen Tubulussystem der Niere

verursacht (KELLENBERGER u. SCHILD 2002, ROSSIER et al. 2002). Hierdurch erfolgt

eine verstärkte Reabsorption von Na+ und sekundär, durch Zunahme des transepithelialen

Potentials, eine Steigerung der transepithelialen Diffusion von Cl- (ROTIN et al. 2001,

VERREY et al. 2003). Aufgrund dieser primären Steigerung der Reabsorption von NaCl

werden über sekundäre Prozesse vermehrt Kaliumionen über einen ROMK-Kanal (renal

outer medullary K+ channel), ein Mitglied der einwärts-gleichrichtenden Kaliumkanäle, in

das Tubuluslumen sezerniert und mit dem Urin ausgeschieden (FRINDT et al. 2002).

Zusätzlich wurden Hinweise gefunden, dass die Expression des ROMK in der Niere direkt

durch Aldosteron erhöht wird (PALMER 1998). So erfolgt im Rahmen eines

Hyperaldosteronismus eine Verschiebung der Elektrolytkonzentrationen im Plasma, die sich

in der Regel mit Hilfe labordiagnostischer Untersuchungen durch den Nachweis einer

Hypernatriämie und einer Hypokaliämie bestätigen lässt.

Eine solche Hypernatriämie und Hypokaliämie konnte in dieser Arbeit ebenfalls bei den

BKβ1-/- Mäusen nachgewiesen werden. Die erhobenen Elektrolytkonzentrationen der

Wildtyp Tiere stimmen mit den beschriebenen Werten in der Literatur überein (MITRUKA u.

RAWNSLEY 1981). Der relativer Fehler der Elektrolytmittelwerte von maximal 3% ist ein

weiteres Indiz für die Validität der durchgeführten Untersuchungen. Die in diesen

Experimenten festgestellte Veränderung der Ionenkonzentrationen im Plasma ist ein

typischer Befund, der bei Hyperaldosteronismus erhoben wird (DeGROOT 1989), und festigt

die Hypothese eines funktionell bedeutsamen Hyperaldosteronismus der Knockout Mäuse.

94

Page 95: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Sekundär zur vermehrten NaCl Reabsorption kommt es zu einer gesteigerten

Wasserretention, welche zu einem erhöhten Blutvolumen und damit verbundener Hypertonie

führt. Der Nachweis eines Bluthochdrucks der BKβ1-/- Mäuse erfolgte über Blutdruck- und

Herzfrequenzmessungen an wachen Mäusen über einen chronisch implantierten Katheter in

der Arteria femoralis. Die Blutdruckmessung am wachen Tier über einen chronischen

Katheter ist nach dem heutigen Wissensstand neben der radiotelemetrischen Messung die

präziseste Messmethode zur Bestimmung des Blutdrucks und der Herzfrequenz bei Mäusen.

Im Gegensatz zu der Tail cuff Methode, bei der die Tiere fixiert werden und einer erhöhten

Umgebungstemperatur ausgesetzt sind, erfolgt die Kathetermessung ohne Störung der Tiere,

so dass in der Regel keine stressbedingten Veränderungen der Messparameter infolge eines

erhöhten Sympathikotonus erwartet werden müssen. Die gemessenen Herzfrequenzen von ca.

600 Schlägen pro Minute stimmen mit den in der Literatur angegebenen Daten überein

(MATTSON 2001). Im Gegensatz zum Umgang mit Ratten ist es sehr schwer, Mäuse an die

erforderlichen Manipulationen bei Verwendung der Tail cuff Methode zu gewöhnen, und als

Folge davon liegen die gemessenen Blutdruckwerte häufig über dem in der Literatur

angegeben mittlerem arteriellen Blutdruck der Mäuse von ca. 105 mmHg (MATTSON 2001).

Vergleiche von Blutdruckwerten in der Literatur, die mittels Tail cuff Methode oder durch

Messungen über chronisch implantierte Katheter an wachen Tieren durchgeführt wurden,

bestätigen die Überlegenheit der gewählten Methode (MATTSON 1998, QUASCHNING et

al. 2001). Die Validität der verwendeten Methode ist unter anderem auch an den kleinen

relativen Fehlern der Blutdruckmittelwerte zwischen den Tieren von maximal 1,8%

erkennbar. Ein weiterer Vorteil der chronisch implantierten Katheter besteht darin, dass

ebenfalls Blutproben am wachen und ungestressten Tier gewonnen werden können.

Die Bestimmung der täglichen Wasseraufnahme bestätigte, dass sich die Mäuse von der

Narkose und der Operation weitestgehend erholt hatten. Am zweiten und dritten

postoperativen Tag nahmen die Tiere im Durchschnitt ca. 4,5 ml Wasser zu sich, was einer

normalen physiologischen Flüssigkeitsaufnahme entspricht (MEYER et al. 1993, S. 203). Da

die Mäuse außerdem im Wesentlichen den Habitus eines gesunden bzw. geringgradig

kranken Tieres zeigten, konnte davon ausgegangen werden, dass die erhobenen

Blutdruckdaten durch die durchgeführte Implantation nur unwesentlich beeinträchtigt

wurden. Voraussetzung für eine schnelle Regeneration der Tiere nach der Operation war

allerdings eine zügige und routinierte Implantation der Katheter.

95

Page 96: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Die BKβ1-/- Mäuse zeigten in den Versuchserien 1 und 2 einen hochsignifikanten

Blutdruckanstieg im Verhältnis zu den BKβ1+/+ Mäusen, wobei die Herzfrequenzen keine

Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen aufwiesen. Die Blutdruckdaten der 2.

Versuchsserie lagen im Mittel 4 mmHg unter denen der 1. Versuchserie. Dies ist vermutlich

durch einen verbesserten Operationsablauf und eine routiniertere Messprozedur zu erklären.

Die erhobenen Blutdruckdaten liegen im Niveau deutlich unter den veröffentlichten Werten

von BRENNER et al. (2000 b), deren Arbeitsgruppe die Blutdruckdaten ebenfalls mittels

chronisch implantierter Katheter erhoben hat. Den unterschiedlichen Messergebnissen

können zwei verschiedene Ursachen zu Grunde liegen. Zum einen wurde die

Blutdruckmessung von BRENNER et al. am 1. postoperativen Tag durchgeführt.

Erfahrungsgemäß haben sich die Tiere zu diesem Zeitpunkt noch nicht vollständig von der

Operation erholt. So konnte in eigenen Voruntersuchungen festgestellt werden, dass sich die

Blutdruckmittelwerte bei beiden Genotypen am 1. postoperativen Tag noch nicht normalisiert

hatten. Des Weiteren wurden die Blutdruckmessungen von BRENNER et al. an SV 129

Mäusen durchgeführt. Aus der Literatur ist bekannt, dass Mäuse mit verschiedenem

genetischem Hintergrund Unterschiede des mittleren arteriellen Blutdrucks aufweisen und

SV129 Mäuse generell einen höheren Blutdruck als die C57/BL6 Mäuse besitzen

(MATTSON 2001), was die unterschiedlichen Messergebnisse ebenfalls erklären kann. Der

gemessene Blutdruckunterschied zwischen den Genotypen stimmt jedoch mit früheren

publizierten Daten überein (BRENNER et al. 2000 b, PLÜGER et al. 2000) und bestätigt

somit einen Bluthochdruck bei den BKβ1-/- Mäusen.

Wie im Literaturteil beschrieben (Seiten 38-39), wurde in den letzten Jahren die Hypothese

entwickelt, dass die arterielle Hypertonie bei den BKβ1-/- Mäusen eine direkte Konsequenz

eines erhöhten Tonus in arteriellen Widerstandsgefäßen ist (BRENNER et al. 2000 b,

STANDEN 2000, PATTERSON et al. 2002, KOTLIKOFF u. HALL 2003). Als erste

beschrieben BRAYDEN u. NELSON (1992), dass die Aktivierung der BK-Kanäle durch den

lokalen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration eine entscheidende Rolle bei der

Regulation des Gefäßmuskeltonus spielt, indem sie einen negativen Feedback Mechanismus

zur Limitierung einer Vasokonstriktion vermittelt. Die regulatorische β1-Untereinheit erhöht

die Ca2+-Sensitivität der BK-Kanäle maßgeblich und trägt somit fundamental zu einer

Funktionssteigerung der BK-Kanäle und damit auch des negativen Feedback zur Limitierung

96

Page 97: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

der Vasokonstriktion bei. Durch Untersuchungen an isolierten Gefäßen von BKβ1-/- Mäusen

konnte gezeigt werden, dass der erhöhte arterielle Tonus mit einer verminderten Ca2+-

Sensitivität der BK-Kanäle und einer gestörten Kopplung von Calcium-Sparks und STOC`s

vergesellschaftet ist. Diese molekularen und zellulären Störungen gehen mit einem erhöhten

systemischen Blutdruck und einer Herzhypertrophie einher. Durch den Nachweis der

erhöhten Plasmaaldosteronkonzentrationen bei den BKβ1-/- Mäusen muss die Vorstellung

eines rein myogen-bedingten Hypertonus jedoch überdacht und die Bedeutung des

Hyperaldosteronismus für die Entstehung des Bluthochdrucks der Knockout Mäuse weiter

untersucht werden.

In Anlehnung an die Untersuchungen von BRENNER et al. (2000 b) wurden an isolierten

Herzen beider Genotypen morphometrische Untersuchungen durchgeführt. Im Rahmen dieser

Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Herzgewichte sowie die Gewichte des

rechten und linken Ventrikels der Knockout Mäuse erhöht waren. Auch das Verhältnis des

Herzgewichts und des Gewichts des linken Ventrikels zum Körpergewicht zeigte eine

signifikante Steigerung bei den BKβ1-/- Mäusen. Dieser Index stellt ein in der Literatur weit

verbreitetes Maß für eine myokardiale Hypertrophie dar. Diese Ergebnisse stimmen mit den

Befunden der morphometrischen und elektronenmikroskopischen Untersuchungen von

BRENNER et al. (2000 b) überein, die ansonsten in den elektronenmikroskopischen

Untersuchungen keine weiteren histologischen Veränderungen wie Nekrosen oder Fibrosen

in der Struktur des Herzgewebes feststellen konnten. Aus diesen Ergebnissen folgerten die

Autoren in Anlehnung an ähnliche Befunde bei Menschen (WILSON 1999), dass die

Herzhypertrophie eine sekundäre Folge des Hypertonus der Knockout Mäuse ist. In

Voruntersuchungen der eigenen Arbeitsgruppe (AMANN 2001) konnte mit zunehmendem

Alter der Tiere neben einer starken Hypertrophie des linken Ventrikels eine hochgradige

Hypertrophie der Aortenwand festgestellt werden. Da es fraglich ist, ob die relativ geringe

Blutdruckerhöhung von ca. 10 mmHg eine so hochgradig pathologische Hypertrophie

induzieren kann, spielen unter Umständen weitere Faktoren bei der Genese der beschriebenen

Hypertrophien eine Rolle. Durch Untersuchungen verschiedener Arbeitsgruppen konnte

nachgewiesen werden, dass sowohl lokal als auch systemisch erhöhte

Aldosteronkonzentrationen eine Hypertrophie der Gefäßwände sowie des Herzens induzieren

können (DELCAYRE et al. 2000, FIEBELER et al. 2001, QUIN et al. 2003, WEBER et al.

97

Page 98: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

2003). Somit könnte die festgestellte Herzhypertrophie ebenso eine Folge des

Hyperaldosteronismus der BKβ1-/- Mäuse sein.

Zusammenfassend konnte durch die beschriebenen Befunde der hämodynamischen,

morphometrischen und biochemischen Untersuchungen der 1. und 2. Versuchsserie

nachgewiesen werden, dass die Aldosteronkonzentrationen im Blut der BKβ1-/- Mäuse

signifikant erhöht sind und die Tiere klassische Folgen eines Hyperaldosteronismus wie

Elektrolytveränderungen und Bluthochdruck aufweisen.

Durch die pharmakologische Blockade der Mineralocorticoidrezeptoren in einer 3.

Versuchsgruppe wurde die Bedeutung der erhöhten Aldosteronkonzentrationen für die

Blutdruckerhöhung und die Herzhypertrophie der Knockout Mäuse nachgewiesen und

Evidenzen gegen die beschriebene rein myogen-bedingte Ätiologie (BRENNER et al. 2000 b,

PLÜGER et al. 2000) der Hypertonie erhoben.

Nach heutigem Wissensstand blockiert der Mineralocorticoidrezeptor-Antagonist

Spironolacton wirkungsvoll die physiologische als auch pathologische Wirkung von

Aldosteron und ANG II (STIER et al. 2003). Durch zahlreiche Untersuchungen an

Tiermodellen mit experimentellem Bluthochdruck konnte die protektive Wirkung von

Spironolacton auf die Entwicklung kardiovaskulärer Erkrankungen bei Hypertonien, die auf

einer Störung des RAA-Systems beruhen, demonstriert werden (QUASCHNING et al. 2001,

VIRIDIS et al. 2002, LAL et al. 2003, MILL et al. 2003). Diese Effekte von Spironolacton

konnten ebenfalls in klinischen Studien an menschlichen Patienten gezeigt werden

(CALHOUN et al. 2002, SATO et al. 2002). Die verwendeten Dosen von Spironolacton

variierten sehr stark zwischen den genannten Arbeitsgruppen. Da in der vorliegenden Arbeit

kein dosisabhängiger Effekt von Spironolacton untersucht, sondern die Wirkung von

Aldosteron in Gegenwart eines Überschusses des Antagonisten mit Sicherheit blockiert

werden sollte, wurde mit 200 mg/kg KGW eine relativ hohe Spironolacton-Dosis gewählt.

Die Behandlung erfolgte über Time Release Pellets der Firma Innovative Research of

America, die subkutan implantiert über 21 Tage täglich 6 mg Spironolacton freisetzten

(Angabe des Herstellers). Diese Form der Wirkstoffapplikation ist für die Mäuse

außergewöhnlich schonend, da nach der Implantation keine weiteren Manipulationen an den

Tieren erfolgen müssen. Dies war besonders wichtig, weil das Handling der Tiere nach

98

Page 99: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Implantation der chronischen Katheter äußerst schwierig wird und eine Fixierung für eine

tägliche parenterale Applikation nicht mehr möglich ist. Von einer enteralen Spironolacton-

Applikation wurde abgesehen, um sicherzustellen, dass alle Tiere mit der identischen Dosis

Spironolacton behandelt wurden.

Unter der Spironolactonbehandlung konnte der Blutdruck der BKβ1-/- Mäuse bis auf das

Blutdruckniveau der BKβ1+/+ Mäuse reduziert und die Hypertonie der Knockout Mäuse

vollständig behandelt werden. Darüber hinaus konnte bei den Knockout Mäusen eine

Reduktion der Herzhypertrophie festgestellt werden. Diese Normalisierung der Herzgewichte

kann einerseits auf der direkten Blockade des Aldosteron und ANG II an den Herzzellen

beruhen, andererseits könnte dies jedoch auch die Folge des reduzierten arteriellen Drucks

sein. Es ist jedoch nicht zu erwarten, dass bei einem rein myogen-bedingten Hypertonus

durch eine Behandlung mit dem Mineralocorticoidrezeptor-Antagonisten Spironolacton eine

vollständige Normalisierung des Blutdrucks erfolgen kann. Die Untersuchungsergebnisse

stellen somit die Hypothese in Frage, dass ausschließlich eine verminderte Aktivität der BK-

Kanäle in den glatten Muskelzellen der arteriellen Widerstandsgefäße für die

Blutdruckerhöhung der BKβ1-/- Mäuse verantwortlich ist.

Die Ergebnisse der bis hierher diskutierten Befunde dieser Arbeit lassen den Schluss zu, dass

eine Störung des RAA-Systems, einhergehend mit einem klinisch manifestierten

Hyperaldosteronismus, die Ursache für die Hypertonie der BKβ1-/- Mäuse darstellt.

Untersuchungen zur Ätiologie des Hyperaldosteronismus

Die Untersuchungen des zweiten Teils dieser Arbeit wurden mit dem Ziel durchgeführt,

mögliche Ursachen des Hyperaldosteronismus der BKβ1-/- Mäuse aufzudecken. Die

Resultate früherer Studien legen nahe, dass die Steuerung der Aldosteronsekretion vor allem

über Änderungen der intrazellulären Calciumkonzentration erfolgt (siehe Literaturübersicht

ab Seite 19). So wird durch die Zunahme der intrazellulären Calciumkonzentration eine

Steigerung der Aldosteronsynthese induziert (ROSSIER et al. 1996). Der Anstieg der

intrazellulären Calciumkonzentration erfolgt zum einen durch eine spannungsabhängige

99

Page 100: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Aktivierung von T-Typ und L-Typ Calciumkanälen, durch die Calcium bei

Membrandepolarisation von extrazellulär in die Zelle gelangt (SPÄT et al. 1991).

LOTSHAW (2000) konnte in umfangreichen elektrophysiologischen Untersuchungen

nachweisen, dass sowohl eine Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration als auch

von ANG II eine Depolarisation der Membran hervorrufen und somit eine Stimulation der

Aldosteronfreisetzung auslösen können. Über ANG II wird zusätzlich die Freisetzung von

Calcium aus intrazellulären Calciumspeichern gefördert, was einen weiteren Signalweg für

den Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration darstellt (BARRETT et al. 1989). Sollte

es zu einer funktionellen Veränderung von zellulären Mechanismen kommen, die maßgeblich

an der Regulation des Membranpotentials beteiligt sind und in deren Folge es zu einer

ausgeprägteren Membrandepolarisation kommt, könnte dies eine erhöhte

Aldosteronfreisetzung induzieren und infolgedessen einen primären, Renin unabhängigen

Hyperaldosteronismus verursachen. Erst kürzlich konnte an kultivierten Zona glomerulosa-

Zellen gezeigt werden, dass TASK-3 Kanäle für den Großteil der Hintergrundleitfähigkeit

verantwortlich sind. Darüber hinaus gelang der Nachweis von KCNQ1/KCNE1 Kanälen in

Zellen der Zona glomerulosa (ARRIGHI et al. 2001). Die gezielte Ausschaltung der KCNE1

β-Untereinheit führte zu einem primären Hyperaldosteronismus, was eine Beteiligung von

KCNQ1/KCNE1 Kanälen an der Regulation der Aldosteronsynthese und/oder –freisetzung

nahe legt (ARRIGHI et al. 2001). Der Nachweis von BK-Kanälen in Zellen der Zona

glomerulosa (EHMKE 2003) lassen die Überlegung zu, dass diese ebenfalls an der

Regulation der Aldosteronsekretion beteiligt sein können. So übernehmen die BK-Kanäle,

wie in der Literaturübersicht auf den Seiten 29-39 dargelegt, eine wichtige Funktion bei der

Beendigung der zellulären Mechanismen, die durch einen Anstieg der intrazellulären

Calciumkonzentration ausgelöst werden, indem sie der initialen Membrandepolarisation

entgegen wirken und schließlich eine Membranhyperpolarisation durch einen

Kaliumausstrom aus den Zellen induzieren. Wie bereits beschrieben, wird durch die β1-

Untereinheit die Calciumsensitivität der BK-Kanäle entscheidend gesteigert und somit auch

die Wirkung des negative Feedback der BK-Kanäle verstärkt (VOGALIS et al. 1996, ORIO

et al. 2002, QIAN u. MAGLEBY 2003). Durch die genetische Inaktivierung der β1-

Untereinheit könnte eine verringerte Calciumsensitivität der BK-Kanäle bei den BKβ1-/-

Tieren auch in den Zellen der Zona glomerulosa zu einer verstärkten Depolarisation der

100

Page 101: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Zellen führen, woraus eine erhöhte Aldosteronsekretion der BKβ1-/- Mäuse resultieren

könnte. Sollte sich diese Hypothese bestätigen, ließe dies auf einen primären

Hyperaldosteronismus der BKβ1-/- Mäuse schließen.

Durch in vitro Untersuchungen der Aldosteronfreisetzung aus isolierten Nebennierenstücken

unter Kalium- und ANG II-Stimulierung sollte die Gültigkeit dieser Hypothese untersucht

werden. Ergänzend wurde zusätzlich die Aldosteronfreisetzung unter ACTH-Wirkung

untersucht, da ACTH kurzfristig ebenfalls eine hochgradig verstärkte Aldosteronfreisetzung

induziert (LUMBERS 1999, SEWER u. WATERMAN 2003). ACTH verursacht in

endokrinen Zellen über eine PKA vermittelte Phosphorylierung der β1-Untereinheit

außerdem eine Inhibierung der BK-Kanäle (TIAN et al. 1998 u. 2001). Bei genetischer

Inaktivierung der β1-Untereinheit sollte diese Inhibierung nicht zu beobachten sein, und

somit könnte die Aldosteronsekretion unter ACTH-Stimulierung bei den Knockout Tieren im

Verhältnis zu den Wildtyp Tieren verringert sein. Da Calcium als Second messenger bei der

Aktivierung der Aldosteronfreisetzung durch ACTH allerdings nicht beteiligt ist, ist es

fraglich, ob die Interaktion von ACTH mit den BK-Kanälen über die Proteinkinase A

überhaupt einen Einfluss auf die Höhe der Aldosteronsekretion ausübt.

Der Versuchsaufbau und -ablauf wurde auf der Grundlage der Ergebnisse von NERI et al.

(2002) gewählt, die Untersuchungen an Nebennierenschnitten von Ratten durchgeführt

haben. Von einer Isolierung der Zona glomerulosa-Zellen, wie unter anderem von HILBERS

et al. (1999) beschrieben, wurde aus mehreren Gründen abgesehen. Im Rahmen der

Isolierung der Nebennierenzellen kommt es durch Adhäsion der Zellen an Instrumenten und

Gefäßen in der Regel zu einem wesentlichen Verlust von Zellen, der durch die zusätzliche

mechanische Schädigung weiterer Zellen zu einer deutlich verringerten Zellausbeute führen

kann. Aufgrund der Größe der Nebennieren der Mäuse sollte dieses Risiko ausgeschlossen

werden, um die Zahl der benötigten Versuchstiere auf ein Minimum zu beschränken. Die

Zerteilung der Nebennieren in vier Stücke stellte einen Kompromiss zwischen der Schonung

der Zellen bzw. des Zellverbands und ausreichend kleinen Diffusionstrecken dar.

Aufgrund des zur Verfügung stehenden Probenvolumens von ca. 1,5 ml erfolgte die

Bestimmung der Aldosteronkonzentration in den einzelnen Proben mittels

Radioimmunoassays der Firma DPC (Diagnostic Products Corporation). Der Aldosteron-RIA

101

Page 102: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

von DPC wird routinemäßig von vielen Arbeitsgruppen zur Aldosteronbestimmung

eingesetzt (unter anderen BROWN et al. 2000, NERI et al. 2002, OESTREICHER et al. 2003) und

zeichnet sich durch eine hohe Spezifität und geringe Kreuzreaktionen mit Corticosteron aus.

Durch die Erstellung von Eichkurven mit modifiziertem Medium 199 wurde außerdem

festgestellt, dass die Antigen-Antikörperwechselwirkungen durch das Inkubationsmedium

nicht nachweisbar gestört wurden.

Die ermittelten Aldosteronkonzentrationen in den Proben der Inkubationsansätze wurden in

den Abbildungen als relative Aldosteronsekretionsraten dargestellt. Als Bezugsgröße und

damit Referenzwert (= 100%) diente die auf eine Stunde berechnete Aldosteronproduktion im

ersten halbstündigen Inkubationsintervall im Anschluss an die einstündige

Akklimatisationsphase. Dieser basale Wert der individuellen Aldosteronsekretion wurde zur

Normierung der Stimulation der Aldosteronsekretion in den nachfolgenden

Inkubationsintervallen herangezogen. Diese Form der Normierung führte nicht zu

systematischen Fehlern, weil die absoluten Aldosteronkonzentrationen (in pg/ml/h) des

Bezugsintervalls zwischen den beiden Genotypen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen

(siehe Tabellen III, V und VII im Anhang). NERI et al. (2000) normierten die

Aldosteronsekretion in ihren Versuchen, nach der Bestimmung der Proteinmenge der

inkubierten Nebennieren, auf mg Protein. Da die Ausprägung der einzelnen

Nebennierenzonen je nach Stoffwechsellage jedoch stark variieren kann und somit auch ein

Unterschied in der Nebennierenmorphologie zwischen den Knockout und den Wildtyp Tieren

denkbar wäre, könnte eine proteinbezogene Normierung der Aldosteronsekretion zu einer

Fehleinschätzung der Versuchsergebnisse führen.

Der Verlauf der relativen Aldosteronsekretion unter den eingesetzten Stimuli zeigte für alle

drei Versuchsgruppen eine tendenziell höhere Aldosteronsekretion bei den BKβ1-/- Mäusen.

Die Beurteilung der Signifikanz mittels einer zweiseitigen Multivarianzanalyse ergab, dass

bei allen drei Versuchsreihen sowohl der Genotyp der Tiere als auch die Behandlung mit den

jeweiligen Substanzen (Kalium, ANG II oder ACTH) einen signifikanten Einfluss auf die

relative Aldosteronsekretion hatten. Im anschließend durchgeführten t-Test nach Student, bei

dem die relativen Sekretionsunterschiede zwischen den Genotypen bei jeder eingesetzten

Konzentration miteinander verglichen wurden, bestätigte sich die Signifikanz nur bei der

Stimulierung durch ANG II. Bei Kalium konnten mathematisch keine signifikanten

Unterschiede errechnet werden. Mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von 7 % und 6 % bei

102

Page 103: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Kaliumkonzentrationen von 7,5 und 11 mmol/l liegen die relativen Sekretionsraten der

Knockout Nebennieren jedoch tendenziell deutlich über denen der Wildtyp Nebennieren. Die

Ermittelung der Dosis, bei der eine halbmaximale Stimulation der Aldosteronsekretion

(ED50) auftrat, ermöglichte eine Beurteilung der Sensitivität der Nebennieren auf die

einzelnen Stimuli. Die ED50 Werte für die Versuchsreihen ANG II und ACTH waren

zwischen den Genotypen zwar numerisch deutlich unterschiedlich, wiesen aber statistisch

keine signifikanten Unterschiede innerhalb einer 5%igen Irrtumswahrscheinlichkeit auf.

Obwohl tendenziell eine generell höhere Sensitivität bei den Knockout Tieren vorhanden ist,

lässt sie sich bei einem Signifikanzniveau von 5% statistisch nicht belegen. Zur Kontrolle der

durchgeführten Normierung der Aldosteronsekretion wurden zusätzlich die ED50 Werte der

absoluten Aldosteronsekretion bestimmt, die mit denen der relativen Aldosteronsekretion

übereinstimmten. Dieses Ergebnis bestätigt, dass durch die Normierung keine systematischen

Fehler bei der Datenanalyse verursacht wurden.

Die Befunde stimmen mit der aufgestellten Hypothese insoweit überein, als ANG II und

Kalium anscheinend konzentrationsabhängig die Freisetzung von Aldosteron im Verhältnis

zu der individuellen basalen Aldosteronsekretion bei den BKβ1-/- Mäusen stärker

stimulieren. Diese Befunde ließen sich durch die oben ausgeführten Überlegungen sehr gut

erklären und würden zeigen, dass die genetische Inaktivierung der β1-Untereinheit der BK-

Kanäle über adrenale Effekte einen primären Hyperaldosteronismus induzieren kann. Die

tendenziell erhöhte Aldosteronsekretion unter ACTH-Stimulierung lässt sich jedoch nicht mit

der Inaktivierung der β1-Untereinheit bei den Knockout Mäusen erklären.

Vielmehr könnten der erhöhten relativen Aldosteronfreisetzung der BKβ1-/- Mäuse

alternative Mechanismen zu Grunde liegen. So ist seit längerem bekannt, dass zahlreiche

parakrine Substanzen, die in der Nebenniere produziert werden, eine Modulation der

Steroidhormonsekretion bewirken (EHRHART-BORNSTEIN et al. 1998). So wird die

Aldosteronproduktion, wie PETERS und GANTEN (1998) sowie HILBERS et al. (1999)

zeigten, unter anderem durch das lokale Renin-Angiotensin-System der Nebenniere

stimuliert. Eine vermehrte lokale Reninfreisetzung der Knockout Mäuse könnte somit

Ursache für die erhobenen Befunde sein und einen sekundären Hyperaldosteronismus

induzieren. Des Weiteren wäre es möglich, dass durch die gesteigerte Aldosteronproduktion

in vivo, die beteiligten zellulären Systeme hochreguliert sind. Dies könnte zur Folge haben,

103

Page 104: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

dass die Knockout Mäuse eine größere Kapazität besitzen, auf physiologische Stimuli mit

einer stärkeren Aldosteronsekretion zu reagieren.

Unter Berücksichtigung dieser sehr komplexen adrenalen Zusammenhänge bei der

Aldosteronfreisetzung aus den Nebennieren konnte durch die erhobenen Befunde der in vitro

Untersuchungen kein zellulärer Mechanismus identifiziert werden, der die erhöhte relative

Aldosteronsekretion bei den BKβ1-/- Mäusen erklären würde. Für die Aufklärung der

zellulären Mechanismen ist es erforderlich, weiterführende elektrophysiologische,

molekularbiologische und histologische Untersuchungen durchzuführen.

Neben den Inkubationsversuchen diente die Bestimmung des zirkulierenden Renins im Blut

dazu, eine Differenzierung zwischen einer primären und einer sekundären Ätiologie des

Hyperaldosteronismus vornehmen zu können (DeGROOT 1989). So wird in klinischen

Untersuchungen an Patienten die Bestimmung des Reningehalts als Screening-Test für eine

Unterscheidung der beiden Hyperaldosteronismus-Formen durchgeführt (REINCKE et al.

2003). Bei einem primären Hyperaldosteronismus induziert das zirkulierende Aldosteron

über einen negativen Feedback Mechanismus eine verminderte Reninsekretion, aufgrund

derer der Reningehalt im Blut erniedrigt ist. Bei einem sekundären Hyperaldosteronismus

hingegen ist eine gesteigerte Reninfreisetzung die Ursache für eine verstärkte

Aldosteronsekretion, so dass in diesem Fall der Reningehalt im Plasma erhöht ist

(DeGROOT 1989, MELBY 1989). Neben der Hypothese eines primären

Hyperaldosteronismus aufgrund der verminderten Aktivität der BK-Kanäle in den Zellen der

Zona glomerulosa wäre es vorstellbar, dass durch die genetische Inaktivierung der β1-

Untereinheit die Reninsekretion bei den Knockout Mäusen erhöht ist. So ist es denkbar, dass

infolge des erhöhten myogenen Tonus aller arteriellen Widerstandsgefäße ebenfalls die Vas

afferens der kortikalen Glomeruli der Niere bei den BKβ1-/- Mäusen stärker kontrahiert sind.

Dadurch könnte ein so starker Blutdruckabfall in den folgenden Gefäßabschnitten induziert

werden, dass dieser zu einer druckabhängigen Sekretion von Renin führt. Diese gesteigerte

Reninsekretion könnte somit sekundär die Aldosteronfreisetzung stimulieren und einen

sekundären Hyperaldosteronismus hervorrufen.

In den letzten Jahren wurde unter anderem durch Prof. Dr. Peters die Methode der

Reninbestimmung bei Ratten und Mäusen etabliert (PETERS et al. 1996, BREDE et al.

104

Page 105: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

2001). Zur Beurteilung des Aktivitätszustands des Renin-Angiotensin-Systems wurden

sowohl die Plasmareninkonzentration als auch die Konzentration von Prorenin bestimmt.

Beide Parameter werden über eine Messung von gebildeten Angiotensin I in Abhängigkeit

von der Zeit bestimmt, indem dem Inkubationsmedium im Überschuss Angiotensinogen der

Ratte als Substrat für Renin zugesetzt wird. Durch diese Messbedingungen wird die Bildung

von ANG I nicht durch einen Substratmangel limitiert, und das Messergebnis spiegelt die

tatsächliche Reninkonzentration in vivo wieder. Prorenin als inaktive Vorstufe des Renins

sollte Hinweise auf die Kapazität des Reninsystems liefern. Die Plasmareninkonzentration ist

bei einer Gewichtung beider Parameter von größerer Bedeutung, da in vivo die

Plasmakonzentration von ANG I und, daraus resultierend, von ANG II durch die Menge des

aktiven Renins gesteuert wird und somit entscheidend für die Aldosteronfreisetzung ist.

Wie schon bei der Beurteilung der Plasmaaldosteronkonzentration auf den Seiten 91 und 92

diskutiert, musste die Blutabnahme für die Reninbestimmung aus den gleichen Gründen

unter absolut stressfreien Bedingungen für die Tiere erfolgen. Durch eine stressbedingte

Aktivierung des Sympathikus erfolgt über sympathische Afferenzen und β1-adrenerge

Rezeptoren umgehend eine Stimulierung der Reninsekretion (TAUGNER et al. 1984), so

dass der Reningehalt im Plasma zu höheren Werten verschoben wird. Aufgrund des

außerordentlichen Einflusses der Bedingungen der Blutabnahme auf die Messergebnisse

werden in der Literatur keine übereinstimmenden Daten als Referenzwert für die

Plasmareninkonzentration publiziert (beispielsweise BOHLENDER et al. 1998, ARRIGHI et

al. 2001, CHENG et al. 2002, LUM et al. 2003). Da im Rahmen der eigenen Untersuchungen

jedoch die Bedingungen der Blutentnahme und der Analyse des zirkulierenden Renins bei

beiden Versuchsgruppen identisch waren, können die Daten zwischen den Genotypen, ohne

Beurteilung der absoluten Werte, miteinander verglichen werden. Der Vergleich zeigt eine

tendenziell leicht erhöhte Plasmareninkonzentration der BKβ1-/- Mäuse im Verhältnis zu den

BKβ1+/+ Mäusen, wobei dieser Unterschied zwischen den Versuchsgruppen das

Signifikanzniveau von P<0,05 jedoch nicht erreicht. In Übereinstimmung mit diesem Befund

lässt sich die erniedrigte Proreninkonzentration der Knockout Mäuse interpretieren. So ist

denkbar, dass durch eine gesteigerte Bereitstellung von aktivem Renin die Menge des

Vorläuferproteins reduziert wird.

105

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Diskussion

In Hinblick auf das Untersuchungsziel, Evidenzen für die Ätiologie des

Hyperaldosteronismus zu erhalten, lassen diese Befunde aufgrund der fehlenden Signifikanz

keinen eindeutigen Schluss zu. Bei einer primären Ätiologie des Hyperaldosteronismus wäre,

wie vorher bereits ausgeführt, eine deutliche Suppression der Reninkonzentration zu

erwarten gewesen. Die tendenziell höhere Reninkonzentration der Knockout Mäuse spricht

insofern gegen einen primären Hyperaldosteronismus. Bei einem sekundären, Renin

abhängigen Hyperaldosteronismus ist das zirkulierende Renin im Blut deutlich erhöht.

Aufgrund der fehlenden Signifikanz zwischen den Reninkonzentrationen konnte diese

Ätiologie durch die Ergebnisse ebenfalls nicht eindeutig nachgewiesen werden. Es besteht

jedoch die Möglichkeit, dass das zirkulierende Renin bei den Knockout Tieren primär

signifikant erhöht gewesen ist und durch sekundäre Feedback Mechanismen wieder

supprimiert wurde. So ist bekannt, dass Bluthochdruck über verschiedene Mechanismen zu

einer Reduktion der Reninsekretion führt (TAUGNER et al. 1984). Insofern kann spekuliert

werden, dass durch eine erhöhte Reninsekretion ein Hyperaldosteronismus induziert wird,

der zu einem deutlich höheren Blutdruck bei den BKβ1-/- Mäusen führt. Dieser Hypertonus

reduziert jedoch sekundär wieder die Reninfreisetzung, bis ein Gleichgewichtszustand

zwischen erhöhter Reninsekretion und Bluthochdruck entstand, der sich in den Ergebnissen

dieser Arbeit widerspiegelt.

Bei zusammenfassender Betrachtung der Ergebnisse der Inkubationsversuche und der

Bestimmung des zirkulierenden Renins konnte im Rahmen dieser Arbeit die Ätiologie des

nachgewiesenen Hyperaldosteronismus nicht eindeutig geklärt werden. Vielmehr ergaben

sich Hinweise auf beide Formen des Hyperaldosteronismus. Für die vollständige Aufklärung

der Pathogenese ist es notwendig, weiterführende molekularbiologische, pharmakologische

und elektrophysiologische Untersuchungen durchzuführen.

106

Page 107: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Diskussion

Schlussfolgerung

In der vorliegenden Studie konnte durch die Bestimmung der Plasmaaldosteronkonzentration

nachgewiesen werden, dass hypertensive BKβ1-/- Mäuse einen Hyperaldosteronismus

aufweisen. Durch weiterführende biochemische und morphometrische Untersuchungen

erfolgte der Nachweis weiterer Veränderungen bei den BKβ1-/- Mäusen, die durch erhöhte

Aldosteronkonzentrationen ausgelöst werden können. So wurden bei den Knockout Mäusen

eine Hypokaliämie, Hypernatriämie und eine kardiale Hypertrophie nachgewiesen.

Durch die Behandlung der BKβ1-/- Mäuse mit dem Mineralocorticoidrezeptor-Antagonisten

Spironolacton konnte eine Normalisierung des Blutdrucks und der myokardialen

Hypertrophie herbeigeführt werden.

Diese Befunde sind von außerordentlicher Bedeutung, da sie die aktuelle Hypothese einer

rein myogen-bedingten Pathogenese des Hypertonus in Frage stellen und zeigen, dass ein

klinisch manifestierter Hyperaldosteronismus möglicherweise den Bluthochdruck der BKβ1

-/- Mäuse induziert.

Im Rahmen dieser Studie wurden des Weitern durch in vitro Untersuchungen der

Aldosteronfreisetzung aus isolierten Nebennieren Evidenzen für eine primäre Pathogenese

des Hyperaldosteronismus dargelegt. Da jedoch keine Supprimierung des zirkulierenden

Renins bei den BKβ1-/- Mäusen nachgewiesen wurde, konnte die Ursache des

Hyperaldosteronismus letztendlich nicht geklärt werden.

Um den zellulären Mechanismus identifizieren zu können, der bei den BKβ1-/- Mäusen eine

Störung des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems verursacht, ist es erforderlich, weitere

Untersuchungen durchzuführen.

107

Page 108: Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit ... · In den letzten Jahren wurde die Hypothese entwickelt, dass BK-Kanäle eine entscheidende Rolle bei der Regulation des

Zusammenfassung

6 Zusammenfassung

Mareike Kristina Budack

Untersuchungen zur Blutdruckregulation bei Mäusen mit genetischer Inaktivierung der

β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals

Eine chronische Erhöhung des Blutdrucks gehört zu den häufigsten Erkrankungen der

westlichen Welt. Nahezu 50 % der über Fünfzigjährigen weisen eine Hypertonie auf. Durch

die Anwendung genetischer Methoden haben sich für die Analyse von Faktoren, die an der

Entstehung einer Hypertonie beteiligt sind, zahlreiche neue Perspektiven eröffnet. So ist das

in dieser Arbeit untersuchte Mausmodell das einzige bis heute beschriebene Tiermodell, in

dem durch eine genetische Mutation ein Hypertonus nicht-renaler Genese ausgelöst werden

soll. Nach dem aktuellen Wissensstand wird davon ausgegangen, dass durch die genetische

Inaktivierung der β1-Untereinheit des Ca2+-aktivierten Kaliumkanals eine Erhöhung des

Tonus der glatten Gefäßmuskelzellen in arteriellen Widerstandsgefäßen erfolgt, wodurch eine

Steigerung des arteriellen Bluthochdrucks induziert wird. Die starke Expression von BK-

Kanälen in der Zona glomerulosa der Nebennieren macht jedoch eine alternative Erklärung

für die Hypertonie vorstellbar. So besteht die Möglichkeit, dass aus einer veränderten

Calciumsensitivität der Zona glomerulosa-Zellen infolge der Inaktivierung der β1-

Untereinheit eine veränderte Aldosteronsekretion resultiert. Aus dieser Hypothese könnte

geschlossen werden, dass erhöhte Aldosteronkonzentrationen im Blut ursächlich für die

Hypertonie der BKβ1-/- Mäuse verantwortlich sind.

Vor diesem Hintergrund war das Ziel dieser Arbeit zu klären, ob durch eine veränderte BK-

Kanalaktivität die Aldosteronsekretion beeinflusst wird und bei den BKβ1-/- Mäusen ein

Hyperaldosteronismus festzustellen ist. Bei Bestätigung dieser Hypothese sollte des Weiteren

die Pathogenese des Hyperaldosteronismus und seine Rolle bei der Entwicklung der

Hypertonie bei BKβ1-/- Mäusen untersucht werden.

Hierzu wurden in 3 Versuchsserien an adulten männlichen BKβ1-/- Mäusen und BKβ1+/+

Mäusen (jeweils n=13) sowie in einer 4. Versuchsserie an isolierten Nebennieren von adulten

108

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Zusammenfassung

männlichen BKβ1-/- Mäusen und BKβ1+/+ Mäusen (jeweils n=10) folgende Untersuchungen

durchgeführt:

1. Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks und der Herzfrequenz an wachen und

ungestressten Mäusen über einen chronischen arteriellen Katheter am 2. und 3.

postoperativen Tag.

2. Entnahme von Blutproben über den arteriellen Katheter mit anschließender

Bestimmung der Plasmakonzentrationen von Natrium, Kalium, Chlorid, Kreatinin,

Aldosteron und zirkulierendem Renin.

3. Entnahme der Herzen mit Bestimmung des Herzgewichts sowie des Gewichts des

linken und rechten Ventrikels. Anschließende Berechnung des Verhältnisses von

Herzgewicht bzw. Gewicht des linken Ventrikels zum Körpergewicht als Index einer

myokardialen Hypertrophie.

4. Behandlung der Tiere über drei Wochen mit dem Mineralocorticoidrezeptor-

Antagonisten Spironolacton mittels subkutan implantierter Time Release Pellets (200

mg/kg KGW/Tag).

5. Messung des mittleren arteriellen Blutdrucks und der Herzfrequenz nach 18 Tagen

Spironolactonbehandlung an wachen und ungestressten Mäusen über den chronischen

arteriellen Katheter und Entnahme der Herzen mit Bestimmung des Verhältnisses von

Herzgewicht bzw. Gewicht des linken Ventrikels zum Körpergewicht zur Beurteilung

der Entwicklung der myokardialen Hypertrophie.

6. In vitro Untersuchung der Aldosteronsekretion an isolierten Nebennieren unter

Stimulation mit Kalium, ANG II und ACTH. Bestimmung der

Aldosteronkonzentration in den Inkubationsproben mittels Radioimmunoassays.

Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. Bei den hypertensiven BKβ1-/- Mäusen konnte ein klinisch manifestierter

Hyperaldosteronismus nachgewiesen werden. So war bei den BKβ1-/- Mäusen die

Plasmaaldosteronkonzentration signifikant erhöht und es konnte eine Hypokaliämie

sowie eine Hypernatriämie nachgewiesen werden. Die Befunde der

109

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Zusammenfassung

morphometrischen Untersuchungen ergaben Hinweise auf eine myokardiale

Hypertrophie der BKβ1-/- Mäuse.

2. Durch die Spironolactonbehandlung normalisierte sich der Blutdruck der BKβ1-/-

Mäuse und die myokardiale Hypertrophie bildete sich innerhalb von 2 Wochen

nahezu vollständig zurück.

3. Die isolierten Nebennieren der BKβ1-/- Mäuse setzten unter ANG II-Stimulation

signifikant mehr Aldosteron frei. Ebenso war die relative Aldosteronsekretion unter

Kalium- und ACTH-Stimulation tendenziell bei den BKβ1-/- Mäusen gesteigert.

Diese Befunde lassen Spekulationen über eine adrenale Pathogenese des

Hyperaldosteronismus zu.

4. Die Plasmareninaktivität der BKβ1-/- Mäuse war tendenziell erhöht, was als Evidenz

für einen sekundären Hyperaldosteronismus bewertet werden kann.

Zusammenfassend konnte durch die Untersuchungen gezeigt werden, dass der

Hypertonus der BKβ1-/- Mäuse durch einen Hyperaldosteronismus verursacht wird.

Durch Aufklärung der zellulären Mechanismen, die den Hyperaldosteronismus

verursachen, können wichtige Erkenntnisse über die Bedeutung des Renin-Angiotensin-

Aldosteron-Systems bei der Pathogenese des essentiellen Bluthochdrucks beim Menschen

gewonnen werden.

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Summary

7 Summary

Mareike Kristina Budack

Regulation of blood pressure in mice with genetic inactivation of the β1 subunit of the

Ca2+ activated potassium channel

The mouse model used in this work has up to now been the only animal model in which

hypertension of non renal genesis is assumed to be induced by genetic mutation. Coming

from the current opinion it is believed that genetic inactivation of the β1 subunit of the Ca2+

activated potassium channel causes an increase in smooth muscle vascular cell tone of arterial

vessels, inducing a rise in arterial blood pressure. Since the presence of BK channels in the

Zona glomerulosa of adrenal glands has been established there might be an alternative

explanation for the development of hypertension. That is, as a result of the inactivation of the

β1 subunit the calcium sensitivity of the Zona glomerulosa cells is modified and causes a

change in the secretion of aldosterone. This mechanism would allow the conclusion that

elevated plasma aldosterone could be the reason for hypertension in BKβ1-/- mice.

Against that background the aim of this study was to clarify if hypertension in BKβ1-/- mice

is originating from hyperaldosteronism. In case the hypothesis would be confirmed the

pathogenesis of hyperaldosteronism should be investigated.

For this, 3 experimental series were done on adult male BKβ1-/- mice (with n=13 for each

series) and a 4th experimental series on isolated adrenal glands from adult male BKβ1-/- and

BKβ1+/+ mice (with n=10 for each genotype) with the following investigations:

1. Measurement of the mean arterial blood pressure and heart rate of conscious and

unstrained mice by a chronic arterial catheter on day 2 and 3 after surgery.

2. Extraction of blood samples through the arterial catheter to measure the

concentrations of sodium, potassium, chloride, creatinine, aldosterone, and circulating

renin.

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Summary

3. Removal of the heart to determine heart weight and mass of the left and right ventricle

for calculation of heart to body weight ratio and weight of the left ventricle to body

weight ratio as indices for myocardial hypertrophy.

4. Treatment of animals for three weeks with subcutaneously implanted Time Release

Pellets (200 mg/kg BW/day) of spironolactone, an antagonist to mineralocorticoid

receptors.

5. Measurement of the mean arterial blood pressure and heart rate of conscious and

unstrained mice after 18 days of treatment with spironolactone through a chronic

arterial catheter, and removal of the heart to determine the ratios of heart weight and

mass of left ventricle to body weight to assess the development of myocardial

hypertrophy.

6. In vitro investigation of aldosterone secretion in isolated adrenal glands under

stimulation by potassium, ANG II, and ACTH, respectively. Measurement of

aldosterone concentration by radioimmunoassay.

The results of this work can be summarized as follows:

1. In hypertensive BKβ1-/- mice a clinically manifest hyperaldosteronism has been

established, i.e. concentration of plasmaaldosterone was significantly elevated and

hypokalemia as well as hypernatremia could be demonstrated. Besides that, the results

of the morphometric examinations pointed towards myocardial hypertrophy in

BKβ1-/- mice.

2. The blood pressure of BKβ1-/- mice developed towards and became normal under

treatment with spironolactone and myocardial hypertrophy completely regressed,

which contradicts a sole myogenetic etiology of hypertension.

3. Isolated adrenal glands of BKβ1-/- mice stimulated by ANG II released more

aldosterone than wild types. Furthermore, the relative secretion of aldosterone showed

a tendency to higher levels in BKβ1-/- mice stimulated by potassium and ACTH as

well. These results allow speculation about an adrenal pathogenesis of

hyperaldosteronism.

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Summary

4. Plasma renin activity in BKβ1-/- mice was tendentiously elevated which can be

interpreted as evidence for a secondary hyperaldosteronism.

To summarize, the investigations have shown that hypertension of BKβ1-/- mice is linked to

hyperaldosteronism. By solution of cellular mechanisms that lead to hyperaldosteronism

important insights could be gained regarding the relevance of the renin-angiotensin-

aldosterone system in the pathogenesis of essential hypertension in man.

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Ergebnisse der in vitro Inkubationsversuche

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Danksagung Herrn Prof. Dr. H. Ehmke danke ich herzlich für die Überlassung des interessanten Themas und für seine freundliche und motivierende Unterstützung bei allen Problemen, die zu überwinden waren. Mein Dank gilt ebenso Herrn Prof. Dr. H. Hackbarth für die Übernahme dieser Arbeit zur Vorlage beim Fachbereich der Tierärztlichen Hochschule Hannover und für seine engagierte Beratung bei der Anfertigung der Dissertationsschrift. Herrn Dr. Jörg Faulhaber danke ich ganz besonders für die umfassende und immer hilfsbereite Betreuung bei der Durchführung der Experimente und der Anfertigung dieser Arbeit. Vielen Dank, Jörg, für die verständnisvolle Unterstützung auf allen Ebenen. Sehr herzlich möchte ich mich bei Herrn Dr. Michael Blank für seine kompetente und uneigennützige Hilfe bei zahlreichen technischen und privaten Problemen bedanken. Ohne seine Interventionen hätte ich den Kampf gegen den Computer hoffnungslos verloren. Obwohl ihm die Zeit permanent zwischen den Fingern zerrinnt, hat er sich für mich immer Zeit genommen und mir den Freiraum für die Fertigstellung dieser Arbeit geschaffen. Frau Kornelia Anders danke ich für die freundliche Aufnahme in den Arbeitskreis und die Unterstützung bei anfallenden Analysen im Labor. Bei allen Mitarbeitern des Instituts für Vegetative Physiologie und Pathophysiologie des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf sowie meinen Freundinnen möchte ich mich für die Hilfsbereitschaft und die netten Stunden abseits des Laboralltags bedanken. Mein ganz besonderer Dank gilt allerdings meinen Eltern für die liebevolle Anteilnahme und Unterstützung, die es mir ermöglichten, mein Studium und die Promotion zu absolvieren. Vielen Dank für diesen Rückhalt, aus dem ich häufig die Kraft und den Mut geschöpft habe, kleine sowie große Krisen zu überwinden.