Caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de Fosfolipase A2 do

tipo γ isolado no soro de Crotalus durissus collilineatus Aluna: Sarah Natalie Cirilo Gimenes Orientadora: Profa. Dra. Veridiana de Melo Rodrigues Ávila Coorientadora: Dra. Daiana Silva Lopes

UBERLÂNDIA - MG 2013

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA

ii

Caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de Fosfolipase A2 do

tipo γ isolado do soro de Crotalus durissus collilineatus Aluna: Sarah Natalie Cirilo Gimenes Orientadora: Profa. Dra. Veridiana de Melo Rodrigues Ávila Coorientadora: Dra. Daiana Silva Lopes

Disertação apresentada à Universidade Federal de Uberlândia como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Genética e Bioquímica (Área Bioquímica)

UBERLÂNDIA - MG 2013

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil. G491c 2013

Gimenes, Sarah Natalie Cirilo, 1989- Caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de Fosfolipase A2 do tipo γ isolado do soro de Crotalus durissus collilineatus / Sarah Natalie Cirilo Gimenes. -- 2013. 79 p. il. Orientadora: Veridiana de Melo Rodrigues Ávila. Co-orientadora: Daiana Silva Lopes. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia, Pro- grama de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica. Inclui bibliografia. 1. Bioquímica - Teses. 2. Serpente peçonhenta - Veneno - Teses. 3. Inibidores enzimaticos - Teses. I. Ávila, Veridiana de Melo Rodrigues. II. Lopes, Daiana Silva. III. Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica. III. Título.

CDU: 577.1

Palavras-chave: Inibidores de PLA2, Inibidores tipo γ, Crotalus durissus collilineatus, Fosfolipases A2, Serpentes

iii

Caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de Fosfolipase A2 do tipo γ isolado do soro de Crotalus durissus collilineatus

Aluna: Sarah Natalie Cirilo Gimenes

COMISSÃO EXAMINADORA Presidente: Orientadora Profa. Dra. Veridiana de Melo Rodrigues Ávila Examinadores: Prof. Dr. Andreimar Martins Soares

Prof. Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes Data da Defesa: 29 /07/2013 ___________________________________ Profa. Dra. Veridiana de Melo Rodrigues Ávila

SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOQUÍMICA

iv

DedicatóriaDedicatóriaDedicatóriaDedicatória

Dedico este trabalho aos meus pais, Élcio e Suelene, minha querida irmã Ana

Carolina, por todo apoio emocional e compreensão com meus momentos de

impaciência nesta caminhada. O amor incondicional de vocês me tornou o que

sou hoje.

Dedico ao meu lindo sobrinho, meu pequeno anjo que com seu sorriso carinhoso

me garantiu a força mais pura e verdadeira capaz de superar qualquer obstáculo.

Meu amor por vocês é eterno.

v

AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos

À Profa. Dra. Veridiana de Melo Rodrigues Ávila, que brilhantemente aceitou conduzir este desafio comigo. Agradeço por todo aprendizado que adquiri neste período. O meu eterno obrigado por depositar em mim confiança, isso faz de você um grande exemplo. À Dra. Daiana Silva Lopes, que me coorientou neste trabalho. Agradeço por seus ensinamentos, cada palavra de apoio e incentivo no trabalho, por ter me acompanhados de perto nos experimentos. Isso demonstra a grande pesquisadora que é. Ao Msc. Francis Barbosa Ferreira que ensinou pacientemente os meus primeiros passos dentro do laboratório. Às Profas. Dras. Maria Ines Homsi-Brandeburgo e Amélia Hamaguchi, que desde o começo me deram apoio com ideias e ensinaram o amor à bioquímica. À Profa. Dra. Kelly Aparecida Geraldo Yoneama Tudini pelos valiosos conselhos. À Profa. Dra. Renata Santos Rodrigues, por toda sua ajuda nos resultados, ideias preciosas, palavras de apoio, mesmo antes de se juntar ao nosso grupo sempre disposta a contribuir. Sua valiosa ajuda será muito bem vinda na sequencia deste trabalho. Profa. Dra. Vera Lúcia de Campos Brites por nos ceder e classificar as serpentes. Sempre solícita a contribuir com informações novas e ricas, muito obrigada por ter sempre deixado as portas abertas. Nossos resultados não seriam possíveis sem sua colaboração. Agradecimento também aos técnicos responsáveis pelo setor de répteis, Eduardo e Graciele, por manter os animais em ótimas condições. Ao Prof. Dr. André Luis Quagliato, que desde o início da ideia nos apoiou, sempre solícito para as coletas de sangue. Seu brilhante conhecimento na anatomia dos répteis garantiu nosso sucesso. Agradecimento especial à equipe do Serviço de Bioquímica de Proteínas de Venenos Animais-FUNED, Belo Horizonte, por me receberem tão bem. Em especial Profa. Dra. Marta do Nascimento Cordeiro, por sua valiosa troca de experiência em cromatografias; a Msc. Jomara Gonçalves, por me guiar gentilmente em todos os experimentos no instituto e a Profa. Dra. Márcia Helena Borges, por ter aceitado me receber em seu laboratório e contribuir no

vi

crescimento dos meus conhecimentos científicos. O que aprendi com vocês levarei comigo para sempre. Ao Prof. Dr. Marcos Roberto de Mattos Fontes, do Laboratório de Biologia Molecular Estrutural-UNESP e em especial a Dra. Juliana Izabel dos Santos que aceitaram conduzir parte dos experimentos estruturais, importantes no enriquecimento deste trabalho. Aos técnicos do Laboratório de Química de Proteínas e Produtos Naturais, Tianinha e Marina Lima por toda colaboração com os materiais e manutenção da organização em nosso laboratório. Ao grupo de pesquisa do Laboratório de Química de Proteínas e Produtos Naturais, Vitor, Makswel, Fernanda, Denise, Isabela, Guilherme, Lino, David, Márcia, Dayane, Débora, Letícia, Ana Carolina, Thais, por toda ajuda durante as coletas de sangue e pelos momentos de descontração. Ás agências de fomento, FAPEMIG, por financiar minha bolsa, CAPES, INCT-Nanobiofarm e CNPq pelo financiamento direto e indireto neste trabalho. Agradeço em especial a todos que de forma pessoal me ajudaram durante este período, cada um do seu jeito, com sua forma de carinho fizaram o diferencial nos momentos felizes e momentos difíceis durante estes anos. Todos são a prova de como uma amizade verdadeira começa com uma boa gargalhada. À Veri, por todos os momentos de carinho, com suas palavras confortantes e revigorantes que não me deixaram perder em momento algum a esperança em grandes resultados. Hoje, após anos de convivência posso garantir que meu crescimento e amadurecimento pessoal e profissional tiveram sua participação. Seu espaço no meu coração é eterno, minha mãe científica, você tem minha admiração e orgulho, meu grande exemplo. Dai frooor, minha grande amiga e conselheira, você não imagina o quanto nossa amizade me fez crescer. Desde aquela conversa no lab da veterinária, que desabafei o que me afligia, antes mesmo da nossa amizade fortelecer, talvez não se lembre, mas foi algo muito significativo. Suas palavras me iluminaram, me guiaram em um novo caminho e a partir daquele instante percebi que poderia contar contigo para sempre. Cada vez que falo “Amiga estou em crise”, tenho a certeza de que você tem o conselho ou puxão de orelha certo para me dar. Como aprendi direitinho, vou parar de falar um pouco, rsrs. Você é um ser de luz e agradeço por ter a oportunidade de conviver com essa luz todos os dias.

vii

Carol minha marmotinha. Miiiigs, muito obrigada por sua amizade e me aguentar por tantos anos. Você tem sempre a palavra e a solução certa, passamos por tantos perrengues e zicas que tenho certeza que nossa amizade é eterna. Palavras não são suficientes para demonstrarem todo meu carinho. Thais, amiga obrigada por todos os momentos de alegria, apoio, conversas, discussões filosóficas e conselhos. Nunca esqueça o quanto você é especial para mim. Mesmo brigando de hora em hora e me irritando sua amizade tem valor insubstituível. Isa, minha ic preferida, rsrs. Obrigada por todos os momentos de descontração que só você é capaz de proporcionar (sempre que eu estiver triste vou lembrar do kiwi para voltar a sorrir...hahahaha). Mulher, ter você por perto é a prova de que amizades somam as alegrias e dividem as tristezas. Marininha meu agradecimento a você vai além dos auxílios no laboratório, obrigada amiga por cada abraço e conversa desabafantes. Obrigada ainda mais por descobrir meu dom para a música, kkkkkk. Se nada der certo, tenho certeza que meu espacinho na rock band estará lá. Conte comigo sempre. Finalmente ao Tiii Francis, muito obrigadaa, grande parte deste resultado não seria possível sem sua participação. Talvez você não saiba e eu nunca tenha dito, mas sou eternamente grata a você por tudo que me ajudou, aconselhou, ensinou. Você é um dos exemplos que tenho a seguir.

viii

Sumário

Lista de Tabelas .................................................................................................... xii

Lista de Abreviaturas ............................................................................................ xiii

Resumo .................................................................................................................. 1

Apresentação ......................................................................................................... 3

Capítulo 1 .............................................................................................................. 5

1.0 Fundamentação Teórica .............................................................................. 5

1.1 Serpentes: Distribuição e caracteres morfológicos da espécie Crotalus

durissus .............................................................................................................. 5

1.2 Epidemiologia e sintomatologia do envenenamento ofídico ......................... 7

1.3 Composição da peçonha de serpentes ........................................................ 9

1.4 Fosfolipase A2 (PLA2s): Classificação e catálise ........................................ 11

1.5 PLA2s (Estrutura e função) ......................................................................... 15

1.6 Inibidores Naturais de PLA2s ..................................................................... 17

1.6.2 Mecanismo de ação dos inibidores de PLA2s ......................................... 20

1.6.3 Processo de regulação endógena dos inibidores e filogenia presente no

grupo γ ............................................................................................................. 23

1.6.4 Potencial terapêutico dos PLIs ................................................................ 25

Referências .......................................................................................................... 27

Capítulo 2 ............................................................................................................ 38

Resumo ................................................................................................................ 38

2.0 Material e Animais ........................................................................................ 43

2.1 Reagentes .................................................................................................. 43

2.2 Peçonha e toxinas ...................................................................................... 43

2.3 Obtenção do soro ....................................................................................... 43

2.4 Animais ...................................................................................................... 44

3.0 Métodos ......................................................................................................... 44

3.1 Isolamento do inibidor de fosfolipase A2 (PLA2) presente no soro da

serpente Crotalus durissus colillineatus ........................................................... 44

3.1.1 Cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose fast flow ....................... 44

ix

3.1.2 Cromatografia de afinidade ..................................................................... 45

3.1.3 Cromatografia líquida de alta performance em fase reversa (RP-HPLC) 46

3.2 Dosagem protéica ...................................................................................... 46

3.3 Caracterização Bioquímica ........................................................................ 46

3.3.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida com agentes desnaturantes (SDS-

PAGE) .............................................................................................................. 46

3.3.2 Determinação da massa MALDI-TOF ..................................................... 47

3.4 Caracterização Estrutural ........................................................................... 48

3.4.1 Análise automatizada da sequencia de aminoácidos .............................. 48

3.4.2 Espectrometria de massas (MALDI TOF/TOF) e Análise de Bioinformática

......................................................................................................................... 48

3.4.3 Dicroísmo circular (CD) ........................................................................... 49

3.4.4 Análises de espalhamento de luz dinâmico (DLS) .................................. 50

3.5. Estudos de inibição das atividades biológicas de PLA2s ........................... 50

3.5.1 Atividade Fosfolipásica A2 ....................................................................... 50

3.5.2 Atividade citotóxica ................................................................................. 51

3.5.3 Atividade Miotóxica por dosagem de Creatina Cinase ............................ 51

3.6 Análises estatísticas ................................................................................... 52

4.0 Resultados .................................................................................................... 52

4.1 Isolamento e caracterização bioquímica do inibidor de PLA2 tipo γ ........... 52

4.2 Estudos funcionais ..................................................................................... 59

4.2.1 Atividade fosfolipásica A2 ........................................................................ 59

4.2.2 Neutralização da atividade Miotóxica (Dosagem CK) ............................. 61

4.2.3 Neutralização da citotoxicidade de células tEnd induzidas pela PLA2

BnSP-7 ............................................................................................................. 62

4.3 Estudos estruturais .................................................................................... 63

4.3.1 Determinação da estrutura primária parcial do inibidor ........................... 63

4.3.2 Dicroísmo circular (CD) ........................................................................... 69

4.3.2.1 Análises de CD do inibidor ................................................................... 69

4.3.2.2 Complexo Inibidor – Enzima ................................................................ 69

4.3.3 Análises de espalhamento de luz dinâmico ............................................ 70

6.0 Conclusão ..................................................................................................... 76

Referências ......................................................................................................... 77

x

Lista de Figuras

CAPÍTULO 1

CAPÍTULO 2

Figura 1- Distribuição e tendências evolutivas da cascavel Sulamericana .............. 06

Figura 2- Espécimes da subespécie Crotalus durissus collilineatus utilizados na

pesquisa....................................................................................................................

07

Figura 3- Transcriptoma da glândula de peçonha da serpente C. durissus

collilineatus................................................................................................................

11

Figura 4- Mecanismo catalítico de PLA2s................................................................. 14

Figura 5- Representação do sítio de ligação com cálcio........................................... 15

Figura 6- Modelo de variantes Lys49-PLA2 e interação com a membrana de

células musculares....................................................................................................

16

Figura 7- Modelo teórico trimérica do inibidor αBaltMIP........................................... 19

Figura 1- Fracionamento de 120 mg do soro de Cdc em coluna Q-Sepharose......... 54

Figura 2- Eletroforese em gel de poliacrilamida (12%) em condições

desnaturantes do soro de Cdc e frações obtidas da cromatografia em Q-

sepharose....................................................................................................................

55

Figura 3A- Perfil cromatográfico de 500 µg da fração Q4 em coluna de afinidade

NHS imobilizada com a PLA2 BnSP-7......................................................................

56

Figura 3B- SDS PAGE (12%) em condições redutoras das frações obtidas em

cromatografia de afinidade........................................................................................

56

Figura 4A- Perfil cromatográfico do inibidor γCdcPLI em coluna RP-C4

Vydac...........................................................................................................................

57

xi

Figura 4B- SDS-PAGE (12%) em codições redutoras do γCdcPLI em RP-

C4................................................................................................................................

57

Figura 5- Análises em espectrofotômetro de massas tipo duplo TOF com fonte

MALDI (MALDI-TOF/TOF)...........................................................................................

58

Figura 6- Neutralização da atividade miotóxica por dosagem de Creatina Quinase

(CK) ............................................................................................................................

61

Figura 7- Inibição da citotoxicidade induzida......................................................... 62

Figura 8- Espectro dos fragmentos utilizados no sequencimento por MS/MS.......... 64

Figura 9- Sequência parcial do inibidor γCdcPLI ..................................................... 66

Figura 10- Alinhamento da seqüência do inibidor γCdcPLI e outros inibidores .....

68

Figura 11- Espectro de Dicroísmo Circular do inibidor γCdcPLI ...............................

69

Figura 12- Espectro obtido do Dicroísmo Circular .................................................... 70

xii

Lista de Tabelas

CAPÍTULO 1

CAPÍTULO 2

Tabela 1- Exemplos de inibidores de PLA2s purificados em diferentes

origens.......................................................................................................................

17

Tabela 1- Rendimento proteico do inibidor obtido no fracionamento do soro de

Crotalus durissus collilineatus em Q-Sepharose e Hitrap NHS................................

59

Tabela 2- A atividade PLA2 realizada por titulação potenciométrica ................... 60

Tabela 3- Dados de Espalhamento Dinâmico de Luz para γCdcPLI, cujas

medidas foram feitas com a amostra diluída em tampão PBS 1x (150mM)..............

71

Tabela 4- Dados de Espalhamento Dinâmico de Luz para γCdcPLI, cujas

medidas foram feitas com a amostra diluída em água..............................................

71

xiii

Lista de Abreviaturas

ABNT- Associação Brasileira de Normas técnicas

ACN – Acetonitrila

CA – Subunidade A da crotoxina

CACB – Complexo crotoxina

CB – Subunidade B da crotoxina

CD – Circular Dischroism

CEUA – Comitê de Ética em Utilização Animal

CK – Creatine Kinase

COBEA – Colégio Brasileiro de Experimentação Animal

COX2 – Cicloxigenase 2

cPLA2 – Fosfolipase A2 citosólica

CRD – Domínio de Reconhecimento de Carboidrato

DLS – Dynamic Light Scattering

EDTA – Ethylenediamine tetraacetic acid

HPLC – High-performance liquid chromatography

IBAMA – Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais

Renováveis

im – intramuscular

iPLA2 - Fosfolipase Cálcio independente

LAPAS – Laboratório de Pesquisa em Animais Silvestres

LBME – Laboratório de Biologia Molecular Estrutural

MALDI TOF – Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass

Spectrometry

xiv

MTT – 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide

NHS - N-hydroxysuccinimide

OMS – Organização Mundial da Saúde

PAF-AH – Acetilhidrolases fator de agregação plaquetária

PBS – Phosphate Buffer Saline

PLA2 – Fosfolipase A2

PLIs – Inibidor de Fosfolipase A2

PMF – Peptide Mass Fingerprinting

RP-HPLC – Reverse Phase-High-performance liquid chromatography

SBH- Sociedade Brasileira de Herpetologia

SDS – Sodium Dodecyl Sulfate

SDS-PAGE – Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

sPLA2 – Fosfolipase A2 secretória

TEMED – Tetramethylethylenediamine

tEnd – Thymic endothelium

TFA – Ácido Trifluoroacético

Tris – Tris(hidroximetil)aminometano

UFU – Universidade Federal de Uberlândia

UNESP – Universidade Estadual Paulista

α-CHCA – ácido alfa-ciano-4-hidroxicinâmico

αPLI – Inibidor de PLA2 da classe α

βPLI – Inibidor de PLA2 da classe β

γPLI – Inibidor de Fosfolipase da classe γ

1

Caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de Fosfolipases A2 do

tipo γ isolado do soro de Crotalus durissus collilineatus

Resumo: Alguns animais apresentam uma resistência natural aos efeitos tóxicos induzidos por peçonha de serpentes, isto se deve a presença de inibidores naturais endógenos em seu plasma. Dentre estes, destacam-se os inibidores de fosfolipases A2 (PLA2), os quais são capazes de inibir as atividades enzimáticas e farmacológicas de várias PLA2s de peçonhas ofídicas. No presente trabalho, foi demonstrado o isolamento, a caracterização bioquímica e estrutural de um inibidor de PLA2, o qual foi isolado do soro da serpente Crotalus durissus

collilineatus (Cdc) por dois passos cromatográficos. Inicialmente o soro de Cdc foi aplicado em uma coluna de troca-iônica Q-Sepharos, produzindo seis picos de absorbância a A280nm denominados (Q1 a Q6). Posteriormente, a fração Q4, que demonstrou melhores resultados de inibição foi submetida a uma cromatografia de afinidade NHS–Hitrap imobilizada com uma PLA2-símile (BnSP-7). Deste fracionamento resultaram duas frações denominadas de NHS-1 e NHS-2, sendo que a fração NHS-2 representa o inibidor de PLA2 denominado γCdcPLI. A massa molecular do inibidor determinada por (MALDI-TOF) foi de 22.34 kDa e a sequência primária parcial determinada por Edman e Peptide Mass Fingerprinting (PMF) em MS (MALDI-TOF\TOF) mostrando similaridade com outros inibidores do tipo γ. As análises da estrutura secundária realizada por dicroísmo circular revelaram aproximadamente 22% de alfa hélices e 29% de folhas beta. Estes estudos também indicaram que não houve alteração significativa na conformação tanto do γCdcPLI ou da PLA2-símile BnSP-7. Os resultados obtidos por análises de espalhamento de luz dinâmico demonstraram que o inibidor possui comportamento de oligomerização mediante variação de temperatura e quando dissolvido em H2O ou PBS. O γCdcPLI foi capaz de inibir as atividades enzimática com resultado de 100% na razão 1:5 (m/m) frente as PLA2 utilizadas, miotóxica por dosagem de CK e citotóxica por MTT em células tEnd com característica de ser dose não dependente. Estudos estruturais e funcionais deste inibidor poderão contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos inibidores de PLA2s, bem como na investigação de seu uso como auxiliar no tratamento do envenenamento ofídico ou doenças inflamatórias. Palavras-chave: Inibidores de PLA2, Inibidores tipo γ, Crotalus durissus

collilineatus, Fosfolipases A2, Serpentes

2

Abstract: Some animals have a natural resistance to toxic effects induced by snake venom due to presence of natural endogenous inhibitors in their plasma. Snake venom contains inhibitors of phospholipase A2 (PLA2) that inhibit the enzymatic and pharmacological activities of PLA2. In this work we show the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 inhibitor from Crotalus durissus colillineatus (Cdc) snake serum by two chromatographic steps. Initially, the Cdc serum was applied to a column of ion exchange Q-Sepharose Fast Flow, producing six peaks of absorbance at A280nm (Q1 to Q6). Subsequently, Q4 fraction (best results to inhibition) was applied to affinity chromatography with immobilized HiTrap NHS-BnSP-7. This fractionation resulted in two fractions (NHS-1 and NHS-2) the second fraction contained the inhibitor, named γCdcPLI. The molecular mass of γCdcPLI determined by MALDI-TOF was 22.3kDa and the primary partial structure obtained by Edman and peptide mass fingerprinting (PMF) MS (MALDI-TOF \ TOF), showed similarity when compared with the sequences of other related inhibitors. The secondary structure was evaluated for circular dichroism and showed approximately 22% alpha helix and 29% beta sheets.These studies of interaction have also indicated no significant changes in secondary structure to γCdcPLI and BnSP-7. The results obtained by analysis of dynamic light scattering (DLS) showed that the inhibitor has in oligomerization variation, according to temperature and when dissolved in H2O or PBS. γCdcPLI was able to inhibit the enzymatic, with 100% to inhibition. Cytotoxicity was assayed on Murine endothelial cell line derived from thymus hemangioma- tEnd to MTT and myotoxicity was measuring by creatine kinase (CK) showed inhibition too, but in this case the inhibition was independent dose. Structural and functional studies of this inhibitor may contribute to understanding the mechanisms of action of PLA2 inhibitors. In addition, these studies may serve as starting point for investigating the potential of these inhibitors for the treatment of snake bite or inflammatory diseases. Keywords: PLA2 inhibitor, γ-type inhibitor, Crotalus durissus collilineatus, phospholipase A2, snakes

3

Apresentação

Os acidentes ofídicos em abril de 2009 foram incluídos na lista de Doenças

Tropicais Negligenciadas da Organização Mundial da Saúde (OMS), afetando,

áreas rurais de países da África, Ásia, Oceania e América Latina e os números de

ocorrências e mortes aumentraram nos últimos anos. O quadro clínico de

envenenamento ofídico varia em sua potência e progressão de acordo com a

quantidade de peçonha inoculada, o local, idade e tamanho da serpente, além do

tempo para o atendimento. Os acidentes botrópicos são caracterizados

principalmente por apresentarem sintomatologia local, com edema, hiperalgesia,

hemorragia e necrose. No caso de acidentes crotálicos a sintomatologia mais

expressa é o aparecimento de neuroparalisias, como ptose palpebral, turvação

visual e oftalmoplegia, tornando estes casos mais letais.

As peçonhas de serpentes são consideradas as misturas mais complexas

da natureza. São compostas em sua maior parte por proteínas tóxicas e podem

atuar em suas vítimas de forma isolada ou em sinergia. Muitas destas proteínas

apresentam um grande potencial farmacológico, podendo ser utilizadas como

modelos na produção de fármacos no tratamento de diversas doenças, como em

processos inflamatórios desencadeados por fosfolipases A2, sendo estas

abundantes na peçonha.

São reconhecidos diversos fatores de neutralização de PLA2s, dentre eles

os inibidores endógenos de PLA2s (PLIs), que constituem um importante

mecanismo contra os efeitos tóxicos da peçonha. Estes inibidores podem ser

classificados em três classes α, β e γ de acordo com seus aspectos estruturais.

Neste trabalho foi isolado e caracterizado química, estrutural e

funcionalmente um inibidor do tipo γ presente no soro de Crotalus durissus

collilineatus. Este estudo foi o primeiro a descrever um inibidor nesta subespécie,

além de demonstrar sua grande capacidade inibitória, bem como compreender

algumas propriedades de oligomerização e identificar sua possível utilização

como modelo para fármacos contra processos inflamatórios.

4

A apresentação deste trabalho foi realizada seguindo as normas do curso

de Pós-Graduação em Genética e Bioquímica da Universidade Federal de

Uberlândia – MG e da Associação Brasileira de Normas e Técnicas (ABNT). Este

foi dividido em dois capítulos, sendo que o Capítulo 1 consiste na Fundamentação

Teórica descrevendo aspectos importantes no entendimento, relevância e objetivo

do estudo. O Capítulo 2 apresenta um artigo intitulado: “Caracterização

bioquímica e funcional de um inibidor de Fosfolipases A2 do tipo γ isolado

do soro de Crotalus durissus collilineatus”, nos moldes do Programa de Pós-

Graduação em Genética e Bioquímica e da ABNT.

5

Capítulo 1

1.0 Fundamentação Teórica

1.1 Serpentes: Distribuição e caracteres morfológicos da espécie Crotalus durissus

De acordo com Sociedade Brasileira de Herpetologia (BÉRNILS, 2012), são

reconhecidas aproximadamente 2.900 espécies de serpentes em todo o mundo,

com distribuição em 465 gêneros e 20 famílias. No Brasil há 386 espécies,

divididas em 70 gêneros e 10 famílias, sendo que apenas duas destas famílias

são consideradas peçonhentas, a saber: Elapidae e Viperidae. Estas famílias

compreendem cerca de 70 espécies, as quais estão distribuídas entre os gêneros

Micrurus e Leptomicrurus (Elapidae) e Bothrops, Bothrocophias, Lachesis e

Crotalus (Viperidae).

O gênero Crotalus, representa um clado monofilético, no qual acredita-se ter

sua origem nas florestas Ocidentais de Sierra Madre no planalto centro-norte

mexicano. Esta origem é datada de vários milhões de anos depois que uma única

linhagem Asiática ter cruzado para a América do Norte através do estreito de

Behring, no Oligoceno ou início do Mioceno (GLOYD, 1940; BRATTSTROM,

1964; KNIGHT et al., 1993; KLAUBER, 1997; PLACE, 2004; CASTOE et al.,

2009). A dispersão deste gênero por todo o continente americano consolidou a

diversidade encontrada atualmente, com cerca de 70 espécies e subespécies,

registradas do sul do Canadá ao norte da Argentina (KLAUBER, 1971;

CAMPBELL, 2004; HOSER, 2009).

No Brasil, o gênero Crotalus é representado por uma única espécie,

Crotalus durissus (WÜSTER et al., 2005). Dados biogeográficos sugerem uma

recente dispersão sulamericana de C. durissus através de um corredor central na

Amazônia durante o Pleistoceno médio, seguido por um processo de vicariância e

dispersão no Nordeste do Brasil (WÜSTER et al., 2005; QUIJADA-

MASCAREÑAS, 2007).

De acordo com a Sociedade Brasileira de Herpetologia (SBH), são

reconhecidas no Brasil sete subespécie de C. durissus (C. d. dryinas, C. d.

6

marajoensis, C. d. ruruima, C. d. trigonicus, C. d. terrificus, C. d. cascavella e C. d.

collilineatus). É importante ressaltar a distribuição e a interocorrência das

subespécies Crotalus durissus collilineatus e Crotalus durissus terrificus, apenas

nos estados de São Paulo, Paraná, sul de Minas Gerais e leste de Mato Grosso,

reforçando as diferenças populacionais e isolamento territorial de Crotalus

durissus collilineatus na região do Triângulo Mineiro (FIGURA 1). (BÉRNILS e

COSTA, 2012)

Figura 1: Distribuição e tendências evolutivas entre a cascavel Sulamericana. (A) A distribuição geográfica de C. d. cascavella, C. d. collilineatus e C. d. terrificus no Norte, Centro-Oeste e Sul do Brasil, respectivamente. FONTE: Modificado de Boldrini-França, 2010.

Além destes dados sobre a distribuição territorial, as duas principais

cascavéis da região Sul-Sudeste do Brasil (C. d. collilineatus e C. d. terrificus)

podem ser diferenciadas por caracteres morfológicos. Dessa forma, a subespécie

Crotalus durissus terrificus possui um desenho notório de faixas longitudinais na

região da nuca, seguido de manchas rombóides contrastantes com a cor de

fundo. Nos centros destas manchas raramente são encontradas manchas

7

ligeiramente claras. A subespécie Crotalus durissus collilineatus compartilha as

faixas longitudinais na região da nuca característica do gênero, porém em

contrapartida apresenta o centro das manchas rombóides visivelmente mais

claros, destacando-se em contraste com o resto do corpo (FIGURA 2). Além

disso, outras características morfológicas diferenciam as subespécies de Crotalus

durissus (CAMPBELL e LAMAR, 1989), facilitando sua identificação.

Figura 2: Espécimes da subespécie Crotalus durissus collilineatus utilizados na condução da pesquisa. Destaque para centro das manchas rombóides visivelmente mais claros, característica morfológica principal da subespécie. Universidade Federal de Uberlândia, Setor de Manutenção de Répteis - CRIADOURO CONSERVACIONISTA DA FAUNA SILVESTRE– FINALIDADE CIENTÍFICA.

1.2 Epidemiologia e sintomatologia do envenenamento ofídico

De acordo com o Ministério da Saúde, estima-se que os acidentes ofídicos

afetam mais de 2,5 milhões de pessoas anualmente. No Brasil foram registrados,

em 2010, 29.635 acidentes por serpentes, dentre os quais 85% foram

ocasionados por serpentes peçonhentas, 4% por não-peçonhentas e 11% por

serpentes não identificadas. Em um levantamento dos últimos 12 anos, os casos

notificados de acidentes ofídicos tiveram aumento progressivo durante este

período, sendo que o ano de 2011 teve o maior índice já registrado 30.836 casos.

Neste mesmo período o número de óbitos demonstrou aumento até o ano de

2003 com 123 casos, nos anos subsequentes os números apresentaram

oscilações, sendo que no ano de 2010 147 casos resultaram em óbitos (BRASIL,

2013).

8

A epidemiologia dos acidentes ofídicos revela um perfil de vítimas

preferencialmente do sexo masculino, trabalhadores rurais com idade entre 15 e

49 anos, sendo atingidos, principalmente, em seus membros inferiores. Os

acidentes por serpentes peçonhentas são caracterizados por uma sazonalidade

marcante, com picos de ocorrências no início e no final do ano (BOCHNER;

STRUCHINER, 2003), durante períodos mais chuvosos e quentes no país,

coincidindo com a época de maior atividade humana no campo. Além disso, esta

sazonalidade pode ser explicada pelo hábito dos animais que, nestas épocas do

ano estão em busca de alimentos, parceiros reprodutivos, locais para procriar

e/ou controle da temperatura corporal. Esta busca por controle de temperatura

corporal é explicada por serem animais ectotérmicos, dessa forma, à ocorrência

dos acidentes ofídicos ocorre principalmente em dias quentes e em regiões com

temperaturas altas (BRASIL, 2013).

Os registros de acidentes são principalmente atribuídos aos gêneros Bothrops

e Crotalus, sendo que este último é responsável pelos maiores índices de

letalidade dos acidentes ofídicos registrados no Brasil. Entretanto, os acidentes

com o gênero Bothrops são os casos com maiores danos teciduais locais

(CARDOSO, 2003), constituindo assim uma grave problemática de saúde pública.

A sintomatologia do acidente crotálico é caracterizada por apresentar

manifestações locais sem alterações significativas, dor e edema são usualmente

discretos e restritos ao redor da picada; eritema e parestesia são comuns. As

manifestações sistêmicas consistem no aparecimento de neuroparalisias,

inicialmente por ptose palpebral, turvação visual e oftalmoplegia. Podem ocorrer

também o aparecimento de distúrbios no olfato e paladar, além de ptose

mandibular e sialorreia. Tais manifestações tendem a regredir lentamente, sendo

totalmente reversíveis após tratamento adequado. Alguns casos apresentam

gengivorragia e outros sangramentos discretos, em decorrência da ação das

miotoxinas presente na peçonha. Estas são capazes de destruir as mioglobulinas

musculares, que ao serem filtradas pelos rins e excretadas na urina deixam a

mesma com forte coloração avermelhada (BRASIL, 2013).

9

1.3 Composição da peçonha de serpentes

Estima-se que a peçonha das serpentes seja a mais complexa dentre as

peçonhas do reino animal, devido sua riqueza de componentes e propriedades

tóxicas que a compõe (DALMORA, 1992). Sua composição se baseia em uma

mistura de proteínas com ou sem propriedade enzimática, dentre estas destacam

as fosfolipases A2, proteases, hialuronidases, L-aminoácido oxidases,

acetilcolisnesterases, ativadores de proteína C, lectinas, peptídeos

(potencializadores de bradicinina e desintegirnas). Além dos compostos proteicos

as peçonhas possuem uma constituição por componentes não proteicos como os

compostos orgânicos de baixo peso molecular, dentre eles os carboidratos,

serotonina, histamina, citrato e nucleosídeos. Por fim é descrito na peçonha a

presença de íons inorgânicos como cálcio, cobalto, magnésio, cobre, ferro,

potássio e alguns inibidores enzimáticos (RAMOS, SELISTRE DE ARAÚJO,

2006).

Pode-se dizer que a presença da peçonha em serpentes refere a uma

adaptação evolutiva convergente (FRY et al., 2006, 2008), considerando que a

glândula de peçonha outrora no caminho evolutivo era equivalente a glândulas

salivares, presente em outras espécies. Dessa forma a peçonha compõe um

poder bioquímico adaptada para atuar nos sistemas vitais de presas destes

animais, agindo de forma a imobilizar, matar e iniciar a sua digestão (MACKESSY

et al., 2003).

A composição da peçonha crotálica difere em relação à botrópica, o que

justifica diferenças notáveis na sintomatologia do envenenamento causado por

estes gêneros. A peçonha crotálica é capaz de bloquear a transmissão

neuromuscular e provocar mialgia, levando o paciente a sintomas de paralisia

progressiva. Do ponto de vista sistêmico, a neurotoxicidade é frequentemente

acompanhada de rabdomiólise com necrose tubular aguda e insuficiência renal,

tal característica do envenenamento representa a principal causa de óbitos

(VITAL-BRAZIL, 1966; AZEVEDO-MARQUES et al., 2009). Estas características

únicas do envenenamento crotálico, são atribuídas à elevada concentração de

crotoxina (WARRELL, 2004), uma PLA2 heterodimérica que exibe ação pré

sináptica (BON, 1989; BON, 1997; SAMPAIO et al., 2010), esta representa

10

normalmente 70-90% da composição proteica da peçonha de C. durissus

(BOLDRINI-FRANÇA et al., 2009; CALVETE et al., 2010).

Além da crotoxina, a peçonha crotálica apresenta quantidades variáveis de

crotamina, que age nos canais de Na+. Além destes exemplos, encontra-se

também na peçonha crotálica componentes diversos, tais como a giroxina, uma

serino protease; a crotalfina, um peptídeo com ação analgésica; a convulxina,

uma lectina tipo-C indutora de agregação plaquetária, dentre outras. (CHANG,

1978; JANDROT-PERRUS et al., 1998; OGUIURA et al., 2005; BOLDRINI-

FRANÇA et al., 2009; RÁDIS-BAPTISTA; KERKIS, 2011). A figura 3 apresenta os

resultados de estudos de trancriptoma da glândula de peçonha de Crotalus

durissus collilineatus. Esta mostra a proporção relativa destes compostos na

peçonha, evidenciando a grande representatividade da crotoxina.

A crotoxina, uma PLA2 conhecida como principal componente tóxico da

peçonha crotálica, (HENDON, 1971; RÜBSAMEN, 1971) possui uma subunidade

tóxica CB (PLA2) e uma subunidade não-tóxica e não-enzimática ácida, CA

(denominada de crotapotina) (FRAENKEL-CONRAT et al., 1980; FAURE, 1988;

FAURE et al., 1991). Este complexo heterodimérico CACB formado é o grande

responsável pela toxicidade da peçonha. Vale destacar que a subunidade CA

aumenta potencialmente a letalidade proporcionada pela PLA2, participando com

a subunidade CB na formação de um complexo ternário, que proporciona a

ligação da crotoxina em membranas pré-sinápticas. Após esta ligação, há a

liberação da subunidade CA. (KRIZAJ, 1997; DUNN, 2001).

11

.

Figura 3: Transcriptoma da glândula de peçonha da serpente C. durissus collilineatus. Mostrando a proporção relativa de compostos tóxicos e não-tóxicos na peçonha, além da proporção dos grupos de toxinas presentes nos transcritos. FONTE: Boldrini-França et al., 2009.

1.4 Fosfolipase A2 (PLA2s): Classificação e catálise

As fosfolipases A2 (PLA2s E.C. 3.1.1.4) são enzimas de interesse médico

científico por estarem relacionadas a uma grande variedade de doenças

inflamatórias humanas e nos envenenamentos ofídicos. Estas desempenham

importantes papéis no catabolismo de lipídeos da dieta e no metabolismo geral de

lipídeos estruturais de membranas celulares. Elas foram ultimamente identificadas

e caracterizadas em tecidos de mamíferos e peçonha de artrópodes e serpentes

(GARCIA-DENEGRI et al., 2010).

As PLA2s hidrolisam especificamente a ligação 2-acil éster de 2-sn-

fosfolipídeos, liberando ácidos graxos livres e lisofosfatídeos (ARNI e WARD,

1996; KINI et al., 2003). Os ácidos graxos liberados, como o ácido araquidônico,

são precursores dos eicosanoides (prostaglandinas, tromboxanas, prostaciclinas

e leucotrienos). Estes são lipídeos bioativos e potenciais mediadores da

inflamação, dor e ativação plaquetária (DENNIS, 1997). Os lisofosfolipídeos estão

relacionados com o processo de sinalização celular e na remodelagem dos

fosfolipídeos de membrana. Além disso, podem atuar também como precursores

de mediadores lipídicos, como ácido lisofosfatídico, relacionados com

12

proliferação, sobrevivência e migração celular (SIX e DENNIS, 2000;

SCHALOSKE e DENNIS, 2006).

Estas enzimas são classificadas como intracelulares e extracelulares. As

PLA2s intracelulares estão frequentemente associadas a membranas e envolvidas

com o metabolismo de fosfolipídeos e outras funções celulares (MUKHEERJEE et

al., 1994). As extracelulares são amplamente distribuídas em secreções

pancreáticas, exudados inflamatórios e em especial nas peçonhas de serpentes

(DENNIS, 1994).

As PLA2s são encontradas em diversos organismos vivos e podem ser

divididas em cinco grupos fundamentais: secretórias (sPLA2), citosólicas (cPLA2),

Ca2+ independentes (iPLA2), PAF acetilhidrolases (fator de ativação agregação

plaquetária) e as lisossômicas (SCHALOSKE e DENNIS, 2006). A divisão das

PLA2s está baseada em sua estrutura primária e a designação é estabelecida

seguindo a numeração romana e por letras arábicas (CUMMINGS, 2007). Este

sistema de classificação agrupa as fosfolipases A2 conforme a sequência de

aminoácidos, origem, mecanismo catalítico e suas peculiaridades estruturais e

funcionais.

As PLA2 citosólicas (cPLA2) são caracterizadas por apresentarem massa

molecular variando de 61 a 114 kDa, o sítio catalítico apresenta resíduos de

Serina e Aspartato; hidrolisam preferencialmente glicerofosfolipídeos contendo

ácido araquidônico na posição sn-2 e esta catálise não dependente de Ca2+. O

grupo das iPLA2 cálcio independentes são classificadas por apresentarem uma

massa molecular entre 28 e146 kDa, o sítio catalítico possui um resíduo de Serina

e a catálise não dependente de Ca2+. As PLA2s acetilhidrolases, conhecidas como

fatores de ativação de plaquetas (PAF-AH) são abundantes no sistema nervoso

central de mamíferos e plaquetas. Neste grupo o grupamento acetila na posição

sn-2 do seu esqueleto de glicerol é essencial para a sua atividade biológica. As

PLA2s lisossomais apresentam uma tríade conservada dos resíduos Ser-His-Asp

e tem quatro resíduos de cisteína necessários para a atividade catalítica. Este

grupo foi encontrado e purificado em cérebro bovino, sendo descritas como

esterificantes de um grupo acila com o grupo hidroxila na posição C-1 de

ceramida utilizando fosfolípidos como doador de grupo acila (BURKE e DENNIS,

2009). Por fim, as PLA2s secretórias, que representam o grupo mais diversificado

13

e bem descrito. Elas têm sua catálise dependente de Ca2+, baixo peso molecular

e possuem envolvimento descrito em processos como: digestão, mediadores

lipídicos, proliferação celular, exocitose, bactericida, doenças inflamatórias, dentre

outras (BURKE e DENNIS, 2009).

As PLA2 secretórias são distribuídas em quinze grupos de acordo com a

origem, massa relativa e quantidade de ligações dissulfeto (SCHALOSKE e

DENNIS, 2006). As fosfolipases A2 secretórias presentes nas peçonhas de

serpentes são reunidas nos grupos I e II, e possuem cerca de 119 a 143 resíduos

de aminoácidos com peso molecular variando entre 13.000 e 18.000. As enzimas

da classe I são comumente encontradas em peçonhas da família Elapidae e

Hydrophidae, enquanto que as pertencentes à classe II são encontradas

principalmente em peçonha de serpentes da família Viperidae (WARD et al.,

2001).

As PLA2s isoladas da peçonha de serpentes são subdivididas em dois

grupos principais, as Asp-49 e Lys-49. Outras variantes de PLA2s também têm

sido descritas, a saber: Ser49, Asn49 ou Arg49 (OWNBY et al., 1999 e

KETELHUT et al., 2003; KRIZAJ et al.,1991; POLGAR et al., 1996; TSAI et

al.2004; WEI et al., 2006).

É descrito que substituição de Asp por Lys na posição 49 acarreta na perda

da atividade catalítica por estas eszimas. Isto acontece pelo fato de que o Ca2+

não consegue se ligar coordenamente à região ligadora de cálcio das PLA2s

(SCOTT et al.,1992; HOLLAND et al., 1990). Porém, algum estudo com

modificações sítio dirigido nas PLA2s-símile Lys49, com substituição de Lys por

Asp na posição 49, não alterou seu estado cataliticamente inativo. Este fato

demonstra que a inatividade apresentada por estas enzimas está relacionada

também com outras modificações estruturais (MAGRO et al., 2003).

O mecanismo catalítico das PLA2 depende da presença de íons cálcio, o

qual se mantém coordenado à carboxila da cadeia lateral do aspartato 49 e aos

oxigênios carbonílicos dos resíduos Gly28 e Gly30, bem como a duas moléculas

de água. Neste caso, o complexo, enzima–substrato, é formado a partir do

deslocamento pelo fosfolipídeo de uma das moléculas de água coordenadas pelo

íon cálcio presente no sítio ativo. Por meio de interações eletrostáticas, o íon

cálcio polariza a carbonila na posição sn-2 do substrato, aumentando o caráter

14

eletrofílico do carbono carbonílico. Após este estágio há um ataque nucleofílico de

uma molécula de água sobre a carbonila sn-2. Por último, ocorre uma protonação

do lisofosfolipídio formado, juntamente com a desprotonação do nitrogênio da

histidina. Dessa forma a catálise acontece (KINI, 2003), como é demonstrado na

figura 4, com esquema geral do sítio catalítico de PLA2.

Figura 4: Mecanismo catalítico de uma PLA2. Em que, verde: Componentes enzimáticos; Vermelho: substrato; Azul: moléculas de água; Lilás: cadeia alifática do grupo ligado à carbonila sn-2 do fosfolipídio. Os símbolos C28, C30 e C32 se referem aos carbonos alfa dos resíduos 28,30 e 32 respectivamente. W6 e W12 representam duas moléculas de água. R1 e R2 são cadeias alifáticas quaisquer. Adaptada de Oliveira (2008).

A atividade catalítica destas enzimas sobre membranas celulares de

tecidos específicos sugerem um importante papel na toxicidade do

envenenamento, sendo considerados grandes alvos de pesquisas com aplicação

farmacológica. (ALVARADO e GUTIERREZ, 1988; LLORET e MORENO 1993;

YUAN et al., 1993; FULY et al., 1997; PÁRAMO et al., 1998; OWNBY, 1998;

SOARES et al., 1998; FERNARD et al., 1999).

Além da atividade enzimática, as PLA2s agem sobre membranas celulares

de tecidos específicos, podendo apresentar independentemente da atividade

catalítica, ações farmacológicas diversas como: neurotoxicidade pré e/ou pós-

15

sináptica, cardiotoxicidade, efeitos na agregação plaquetária, efeitos convulsivos,

atividade hipotensiva, indução de edema, hipotensão, dentre outros efeitos (KINI,

2003).

1.5 PLA2s (Estrutura e função)

Primeiramente, estudos estruturais comparativos entre PLA2 com atividade

catalítica e não catalítica (Asp49 e PLA2-símile Lys49) mostraram como a

mudança de aminoácidos na posição 49 da cadeia polipeptídica altera seu

funcionamento. Arni e Ward (1996) demonstraram como o sítio de ligação com o

cálcio é modificado pela troca de aminoácido nesta posição. O aminoácido

Aspartato na posição 49 é essencial para a ligação de Ca2+ e a substituição

conservadora de Aspartato por Glutamato na cadeia polipeptídica resulta em uma

diminuição de 12 vezes na afinidade com o cálcio. Esta mudança do sítio de

ligação com cálcio é determinante na perda da função enzimática das PLA2-símile

Lys49 (FIGURA 5).

Figura 5: Representação do sítio de ligação com cálcio em modelo em bola e bastão. No qual (a) representa o loop de ligação em PLA2 Asp49 e (b) a região análoga de PLA2-símile Lys49, cataliticamente inativa. FONTE: Arni e Ward, 1996.

Foi demonstrado que a atividade miotóxica das PLA2s Lys49 está

relacionada a uma ativa participação da região C-terminal neste processo (dos

SANTOS et, al,. 2011). Alguns estudos com peptídeos sintéticos com variantes da

Lys49 demonstraram que este seja o provável sítio farmacológico responsável

pelos danos celulares (GUTIÉRREZ et al., 1995; WARD et al., 2002; CHIOATO et

al., 2002; LOMONTE et al., 2003). A figura 6 demonstra, por meio de estudos

16

cristalográficos um modelo hipotético de interação entre a região C-terminal e a

membrana plasmática, sugerindo este mecanismo para a ação de PLA2s.

Figura 6: Modelo de variantes PLA2-símile Lys49 interação com a membrana de células muscular. A região C-terminal da proteína (resíduos 115-129) está colorido em azul e os resíduos Lys20, Lys115and Arg118 em destaque na seta representativa. FONTE: dos Santos et al., 2011, com modificações.

Na literatura são descritos três mecanismos de ação destas PLA2 em

células musculares, correlacionando com sua estrutura. O primeiro mecanismo é

baseado na seletividade dos efeitos induzidos por PLA2 explicada pela existência

de sítios de ligação específicos encontrados em membranas de células alvos. O

segundo mecanismo de ação refere-se à penetração na membrana plasmática,

ocasionando desarranjo na integridade da dupla camada lipídica, mediante um

mecanismo independente da hidrólise de fosfolipídeos. Este efeito é notório em

PLA2s do grupo II PLA2-símile Lys49, no qual a posição deste aminoácido de

carga positiva na posição 49 da cadeia polipeptídica afeta a interação com íons

cálcio, reduzindo sua atividade catalítica, porém não afeta sua atividade

miotóxica. Finalmente, o terceiro modelo de mecanismo de ação das miotoxinas

refere-se à interação e ruptura de membrana plasmática por hidrólise dos

fosfolipídeos que compõem a bicamada lipídica. (GUTIÉRREZ et al., 1984; KINI e

EVANS, 1989; GUTIÉRREZ e OWNBY, 2003).

17

1.6 Inibidores Naturais de PLA2s

1.6.1 Origem, estrutura e classificação

Sabe-se que existem diversos compostos capazes de neutralizar os efeitos

da peçonha e toxinas de serpentes, tais como os anticorpos, agentes químicos,

compostos de origem animal e vegetal. Como mostra a Tabela I que apresenta

alguns inibidores descritos na literatura.

Algumas plantas possuem ação antiofídica, e dessas já foram isolados

componentes bioativos capazes de inibir os principais efeitos tóxicos induzidos

por PLA2s de peçonhas de serpentes, tais como edema e miotoxicidade. Dentre

estes compostos, destacam-se os componentes fenólicos isolados de

Guaçatonga (Casearia sylvestris) (BORGES et al., 2000), de Erva-baleia (Cordia

verbenácea) (TICLI et al., 2005), de Galocatequina (Schizolobium parahyba)

(VALE et al, 2007), dentre outros.

TABELA I: Exemplos de inibidores de PLA2 purificados em diferentes origens.

Origem Espécie Nome do Inibidor

Efeito inibitório miotóxico

Referência

Mamíferos Didelphis

marsupialis DM64

Miotoxinas B.

asper

Rocha et al.

(2002) Didelphis

albiventris

Complexo ABC

Peçonha de Bothrops sp.

Soares et al.

(1997) Serpentes

Bothrops asper BaMIP PLIα Miotoxinas I-IV de B. asper

Lizano et al.

(1997) Bothrops

moojeni BmjMIP PLIα

PLA2 de Bothrops

Soares et al. (2003)

Cerrophidian

godmani

CgMIP-I (PLIγ)

MT-I C.

godmani

Lizano et al.

(2000) CgMIP-II

(PLIα) MT-II C.

godmani

Lizano et al.

(2000) Planta Withania

sonnifera WSG

NNXIa-PLA2 Naja naja

Deepa e Gowda (2002)

Fonte: Lizano; Domont; Perales (2003), com modificações.

Em mamíferos os principais exemplos de inibidores já purificados são

encontrados em animais de hábito ofiófagos, como algumas espécies de

marsupiais: Didelphis marsupialis aurita e Philander opossum, que demonstraram

18

inibição contra os efeitos de necrose muscular (LIZANO; DOMONT; PERALES,

2003).

Os inibidores de PLA2 não são anticorpos e estão presentes no sangue de

diferentes animais, inclusive em mamíferos, antes mesmo de uma possível

exposição às toxinas (OVADIA; KOCHVA, 1997; DOMONT et al., 1991; THWIN e

GOPALAKRISHNAKONE, 1998). Os inibidores isolados a partir do plasma de

serpentes têm sido bastante citados na literatura. O primeiro inibidor de PLA2 foi

purificado a partir do plasma da serpente Trimeresurus flavoviridis por Kihara

(1976) (KINKAWA et al., 2010, DOMONT, et al., 1991, FAURE, 2000). Acredita-se

que a síntese destes inibidores seja estritamente hepática, uma vez que o fígado

é o principal produtor de proteínas plasmáticas, e são destinados à corrente

sanguínea (LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003).

Os inibidores de PLA2s podem ser classificados em três tipos α, β e γ de

acordo com seus aspectos estruturais (INOUE et al., 1991; THWIN et al., 2002). A

classe de inibidores α (αPLI) é caracterizada por apresentar proteínas globulares

constituídas por mais de duas subunidades isoméricas com 20 a 25 kDa e cerca

de 147 aminoácidos, com um sítio N-glicosilação conservado (LIZANO;

DOMONT; PERALES, 2003). Os αPLI são glicoproteínas ácidas que possuem

similaridade sequencial com o domínio de reconhecimento de carboidrato (CRD)

das lectinas tipo-C (INOUE et al., 1997), o que provavelmente confere a

capacidade de neutralização das fosfolipases A2.

Oliveira e colaboradores (2008) isolaram e caracterizaram estrutura e

funcionalmente um inibidor tipo α a partir do plasma da serpente Bothrops

jararacussu, bem como Santos-Filho e colaboradores (2011) que também

purificaram e caracterizaram um inibidor desta mesma classe, porém do plasma

de Bothrops alternatus. (FIGURA 7). É visto por estes dois autores que mesmo

com o mecanismo ainda não totalmente elucidado, é sabido, por estudos de

dicroísmo circular, que o complexo formado pelo inibidor e as diferentes PLA2,

não altera a conformação de nenhuma das proteínas envolvidas. Além disso,

Santos-Filho e colaboradoes (2011), demonstraram por estudos com inibição de

peptídeos sintéticos contendo a região C-terminal de PLA2s, que a interação entre

o inibidor e proteínas ocorre de várias maneiras e não apenas na região C-

terminal. Soares e colaboradores (2003), sugerem pelo menos, dois mecanismos

19

em que os αPLIs neutralizam PLA2s. O primeiro seria por ligação à PLA2s por

meio do domínio CRD nos inibidores ou em segundo, agindo diretamente ligando

a outros domínios de miotoxinas, evitando o contato direto desta com a

membrana.

Figura 7: Modelo teórico trimérica do inibidor αBaltMIP. Em A o monômero isolado. Em B o arranjo dos três monômeros de αBaltMIP em formação esférica trimérica. FONTE: Santos-Filho e colaboradores (2011), com modificações.

Os inibidores do tipo β (βPLIs) também são constituídos por subunidades

protéicas e apresentam múltiplas repetições de domínios sucessivos ricos em

leucina. Eles mostram-se 33% homólogos com a α2-glicoproteína humana,

também rica em leucina (LRRs) e possuem quatro sítios de N-glicosilação por

subunidade protéica (OKUMURA et al., 1998). Apenas dois βPLIs foram

identificados em duas espécies de serpentes, Gloydius brevicaudus, uma espécie

peçonhenta (OHKURA et al., 1997) e Elaphe quadrivirgata, uma espécie com

hábitos ofiofágicos (OKUMURA et al., 1998; LIZANO; DOMONT; PERALES,

2003). Lima e colaboradoes (2011) demonstraram o primeiro caso de inibidor do

tipo β encontrado no transcriptoma da glândula de veneno de uma espécie de

serpente peçonhenta, porém a funcionalidade da presença deste inibidor na

peçonha, bem como sua possível interferência na atividade, não foi bem definida

até o momento.

Os inibidores de PLA2s do tipo γ (γPLI) são os que apresentam o maior

número de subunidades protéicas, com peso molecular de 90 a 130 kDa,

compostos por 3-6 subunidades não covalentes de massa 20-31 kDa. São

conhecidos por apresentarem dois conjuntos de repetições intramoleculares de

B

20

domínios ricos em cisteína, denominados motivo Three-fingers (OHKURA et al.,

1999; ESTEVÃO-COSTA et al., 2008). Este domínio apresenta grande

semelhança com o receptor da uroquinase ativadora de plasminogênio (u-PAR),

sendo o responsável pelo reconhecimento da região de ligação do Ca2+ de PLA2s,

fato que garante o alto espectro de inibição em todos os grupos de PLA2s (IA, IIA

e IIIA) (DUNM, 2001).

Os inibidores do tipo γ possuem ainda um sítio de glicosilação bem

conservado na posição 157, estes foram descritos no plasma de diferentes

espécies de serpentes, como de Crotalus durissus terrificus (FORTES-DIAS et al.,

1991), Agkistrodon blomhoffıi siniticus, (OKUMURA et al., 1998) e Python

reticulatus (THWIN et al., 2002). Alguns autores propõem uma subdivisão desta

classe em duas novas subclasses γPLI I e II. Esta divisão está baseada em

diferenças nas estruturas quaternárias e nos perfis de inibição destes inibidores

(FORTES-DIAS et al., 1999, LIZANO et al., 2000; 2003). Sendo que, segundo a

nova classificação, a classe γPLI I seria caracterizada por inibidores com inibição

de PLA2s das classes I, II e III, com presença de heterodímeros na estrutura

quartenária (subunidades α e β), comumente encontrados nas serpentes das

famílias Elapidae, Hydrophidae e Colubridae. A classe γPLI II é caracterizada por

inibirem preferencialmente as PLA2s da classe II, estruturalmente são constituídos

por monômeros, sendo facilmente encontrados nas famílias Crotalidae e

Viperidae, dentre outras serpentes do velho mundo (PERALES e DOMONT

2002).

1.6.2 Mecanismo de ação dos inibidores de PLA2s

A elucidação dos mecanismos de ação dos inibidores é descrita de acordo

com as classes a que pertencem (FAURE, 2000). O mecanismo de ação destes

inibidores, frente às fosfolipases A2, ainda é pouco esclarecido. Alguns estudos de

dicroísmo circular demonstraram que não há alteração conformacional dos

inibidores (tipo α e γ) e de fosfolipases A2 no complexo inibidor-proteína

(OLIVEIRA et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2011).

Primeiramente, estudos com os inibidores do tipo α indicam que a região

semelhante ao domínio de reconhecimento de carboidrato (CDR), possui relação

21

direta com o mecanismo de inibição desta classe (OLIVEIRA et al., 2008). É

descrito que os inibidores do tipo α formam um complexo solúvel ligado não

covalentemente, sendo este responsável pela a inibição da atividade de PLA2. O

trabalho de Kihara (1976) foi o primeiro a demonstrar a formação de um complexo

proteico entre uma PLA2 de Trimeresurus flavoviridis e um inibidor do tipo α,

obtido a partir do plasma desta mesma serpente. Neste caso estudos indicaram

que todas as três subunidades CRD-like são necessárias para o reconhecimento

de PLA2 (INOUE et al., 1997).

Similaridades na estrutura primária entre os αPLIs e receptores de sPLA2s

de mamíferos poderiam explicar suas funções fisiológicas como antitoxinas

solúveis no sangue de serpentes. Foi demonstrado ainda, que o receptor humano

destas PLA2s secretória também existe em forma solúvel sem os domínios

transmembrana. Dessa forma, este receptor pode desempenhar um papel

importante na regulação da atividade da PLA2 secretórias, demonstrando

propriedades pró e anti-inflamatórias em mamíferos (LAMBEAU et al., 1999 e

DUNM et al., 2001).

Os inibidores tipo αPLIs são conhecidos por possuir uma maior afinidade

por PLA2 básica do tipo Asp49 (NOEL et al., 1998; FLEMING et al., 1993; KOLBE

et al.,1993; TANAKA et al., 1986), o domínio responsável por esta ligação, inibidor

e enzima, já é conhecido na literatura. Porém um estudo comparando entre dois

tipos de inibidores α e γ, ambos purificados do plasma de Bothrops jararacussu,

indicou que o inibidor α possui maior poder de inibição para PLA2s PLA2-símile

Lys49 quando comparado com o tipo γ (OLIVEIRA et al., 2011).

Outros estudos de ligação com os αPLIs com a Glutationa S-transferase,

indicaram que o fragmento N-terminal com cerca de 37 aminoácidos juntamente

com a região reconhecedora de carboidrato (CRD-like) e o domínio C-terminal

(com 12 aminoácidos hidrofóbicos), estão envolvidos no mecanismo de ligação

com PLA2. O domínio das sPLA2s envolvida na ligação inibidor ainda não foi

claramente determinada. Porém, alguns autores sugerem que a ligação de um

único resíduo aromático sobre a superfície de sPLA2s da molécula, rodeado por

dois resíduos ácidos, podem estar envolvidos no mecanismo de reconhecimento

deste inibidor (INOUE et al., 1997). Além disso, foi demonstrado por técnica de

ressonância de superfície que um mutante, H48Q, de PLA2, desprovido de

22

atividade enzimática, ligou-se ao inibidor com a mesma afinidade que a enzima

nativa, sugerindo que o sítio catalítico das sPLA2 não é diretamente envolvido na

ligação do inibidor do tipo α (LAMBEAU et al., 1995; CHABOT, 1999).

O mecanismo de interação dos inibidores do tipo β ainda não foi totalmente

elucidado, uma vez que este tipo de inibidor é pouco identificado no soro das

serpentes. Porém, estudos apontam que há uma interação direta do βPLI com

uma PLA2 básica de A. blomhoffıi, realizando testes por filtração em gel,

(OKUMURA et al., 1998). Estes testes demonstraram que a razão molar de

PLA2/PLI foi determinada como 3, indicando que cada subunidade deste tipo de

inibidor pode ligar-se uma molécula de PLA2 básica independentemente.

Os βPLIs possuem característica de inibir preferencialmente PLA2s básicas

de sua própria peçonha. Além disso, inibidores desta classe apresentam

reconhecimento por proteínas do Citocromo c como descrito por Shirai e

colaboradores (2010), que justificaria a presença destes inibidores no plasma de

serpentes não peçonhentas.

Para os inibidores do tipo γ, o mecanismo de inibição foi primeiramente

sugerido com estudos conduzidos para o efeito protetor contra a ação neurotóxica

de neurotoxinas da peçonha. Estes inibidores formam um complexo não

covalente toxina-inibidor, como demostraram Ovadia e colaboradores (1997). O

estudo relatou ainda que um fator anti-neurotóxico isolado o soro de Vipera

palestinae forma um complexo, inibidor+enzima com um componente ácido da

peçonha que participa sinergicamente na ação neurotóxica da mesma.

O mecanismo de neutralização do efeito tóxico de neurotoxinas

proporcionado por um inibidor do tipo γ foi descrito por estudos com a crotoxina e

o inibidor de Crotalus durissus terrificus (CNF) (PERALES et al., 1995). Estudos

realizados com um inibidor desta classe, isolado a partir de soro de Crotalus

durissus terrificus denominado como CICS (estruturalmente formado por seis

ligações não covalentes associadas com subunidades de 23 e 25 kDa)

demonstraram a capacidade do mesmo em suprimir a atividade da crotoxina e

sua toxicidade in vivo (FORTES-DIAS et al., 1991; FORTES-DIAS et al., 1994;

PERALES et al., 1995).

A incubação do CICS com a crotoxina levou à formação de um complexo,

comprovado por SDS-PAGE e posteriormente por ressonância plasmônica de

23

superfície (SPR) (FAURE et al., 2000). A composição do complexo CICS-

crotoxina foi analisada por Western blotting em condições não desnaturantes

utilizando anticorpo policlonal específico. Dessa forma, os anticorpos foram

dirigidos às subunidades CA e CB da crotoxina (PERALES et al., 1995). Os

resultados demonstraram que o anticorpo Anti-CB reconheceu CB no complexo,

porém o anti-CA não reagiu com o complexo. Com isso, o autor afirma que o

complexo formado após incubação com a crotoxina apresentou a subunidade CB

ligado obrigatoriamente ao inibidor CICS, porém não ligado à subunidade CA.

(FAURE et al., 2000). Portanto a interação do CICS-CACB aparentemente está

envolvida na dissociação das subunidades da crotoxina, bem como à formação de

um complexo estável e não tóxico conhecido como CICS-CB, no qual a

subunidade tóxica CA do complexo CACB é substituído pelo CICS, confirmando

assim sua capacidade inibitória.

Por fim, a confirmação do mecanismo de inibição da classe γ de inibidores

conta com algumas informações estruturais sobre o domínio da interação com as

sPLA2s. Um estudo de ligação de um γPLI de Trimeresurus flavoviridis indicou

que apenas um de dois motivos three-finger é capaz de se ligar a PLA2s e

neutralizá-la (NOBUHISA, 1998).

1.6.3 Processo de regulação endógena dos inibidores e filogenia presente no grupo γ

Estudos de regulação da expressão de inibidores αPLI, βPLI e γPLI foram

conduzidos administrando diferentes tipos de PLA2s nas próprias serpentes, via

intramuscular. Observou-se, dessa forma, um aumento significativo da expressão

destes inibidores e sua presença no soro destes animais. Tal resultado sugere

que, alguns fatores que induzem a regulação da expressão dos PLIs no fígado

das serpentes estão contidos na constituição protéica de sua peçonha. Visto que,

as PLA2s ácidas, induziram a expressão de αPLI e βPLI em um intervalo de

tempo de 4 a 12 horas, porém a acidificação da peçonha inativou a expressão de

γPLI no fígado. Estes resultados indicam que a expressão dos inibidores no

fígado é regulada de maneira independente no organismo destes animais

(KINKAWA et al., 2010). Dessa forma, a constituição da peçonha está

24

diretamente ligada à produção endógena de inibidores, garantindo assim, a

diversidade encontrada destas proteínas.

Os avanços nos estudos de inter-relação com os inibidores da mesma

classe foram traçados com a classe γ, a partir de clones de cDNA dos inibidores

desta classe. Verificou-se a presença de uma estrutura de oligopeptídeos com ao

menos 19 resíduos de aminoácido conservados na sequência, encontrados em

todos os inibidores correlacionados, indicando uma alta similaridade entre eles.

Esta alta similaridade da estrutura primária entre os inibidores do tipo γ, leva a

considerar também a uma alta similaridade ao padrão da estrutura secundária,

com folhas-β e alfa-hélice. Além disso, foi encontrada uma região de alfa-hélice

na posição carboxi-terminal (157-164 resíduos) comum a todos. Especialmente

nas serpentes do novo mundo foram encontradas regiões comuns para sítios de

fosforilação, bem como determinação de sítios de N-glicosilação (ESTEVÃO-

COSTA et al., 2008).

Dessa forma foi possível traçar a filogenia dos inibidores desta classe,

relacionando-os de acordo com a prospecção e estrutura dos γPLIs analisados.

Como mostra a figura 8, pode-se observar o grau de similaridade entre as

diferentes espécies, em diferentes gêneros de acordo com a estrutura, reforçando

a ideia de similaridade entre espécies próximas no parentesco, bem como com

inibidores a que pertencem.

Além disso, este estudo trouxe a descoberta de um motivo consensual

entre os γPLIs, composto por aproximadamente 15 resíduos de aminoácidos

(104QPFPGLPLSRPNGYY118). Esta sequência é similar ao decapéptido P-PBIII

sintetizado por Thwin e colaboradores (2002), com base em um segmento da

estrutura primária do γPLI de P. reticulatus (PIP). De acordo com estes autores, a

P-PBIII reconhece e inibe a atividade enzimática in vitro da PLA2 dos grupos I-III,

dentre outras PLA2s humana, além de notáveis efeitos antiinflamatórios in vivo.

Em conclusão, o estudo demonstrou que os γPLI encontrados em serpentes

brasileiras, possuem este motivo capaz de proporcionar efeitos de inibição contra

ação direta de PLA2s, bem como de efeitos antiinflamatórios. Além disso, do

ponto de vista terapêutico, possibilitou ainda um desenvolvimento de um forte

modelo para o desenvolvimento de novas drogas contra ação de PLA2 com este

oligopeptídeo (ESTEVÃO-COSTA et al., 2008).

25

1.6.4 Potencial terapêutico dos PLIs

Visando buscar alternativas no tratamento de acidentes ofídicos, bem como

novos modelos de fármacos como forma terapêutica contra doenças

inflamatórias, são necessários investimentos em novas pesquisas, para

descoberta de novos inibidores de PLA2s e compreensão do seu mecanismo de

inibição. Visto que estas glicoproteínas possuem um alto grau de reconhecimento

e inibição da ação de PLA2s (LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003).

Na terapêutica para antiveneno existem algumas limitações para o uso de

inibidores de PLA2s, tendo em vista que os efeitos tóxicos do envenenamento são

decorrentes do efeito sinérgico de diferentes tipos de toxinas que compõe a

peçonha. Dessa forma seria necessária a formulação de uma mistura com

diferentes inibidores para conseguir um produto que neutralizasse a toxicidade

global do envenenamento. Isto levaria a outra limitação, a disponibilidade de

inibidores, pois a principal fonte de obtenção é considerada insuficiente e

ecologicamente inviável para fins de comercialização. Para isso as pesquisas

caminham para o desenvolvimento da produção heteróloga destes inibidores

(LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003).

Outra consideração importante a ser ressaltada no desenvolvimento de

inibidores endógenos na terapêutica seria a sua toxicidade e seu potencial

imunogênico. Diversas proteínas de alta massa molecular podem induzir

resposta imune, assim, os PLIs poderiam levar a uma reação anafilática

indesejada (LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003). Dessa forma, os estudos com

desenvolvimento do motivo consensual entre os γPLIs, composto por

aproximadamente 15 resíduos de aminoácidos (104QPFPGLPLSRPNGYY118)

(ESTEVÃO-COSTA et al., 2008), reduziria esta complicação, uma vez que seu

tamanho menor minimizaria estas reações adversas. Outro benefício do

desenvolvimento destes motivos seria a facilidade em serem produzidos em

escala industrial, por não terem a complexidade de uma proteína nativa.

A importância dos inibidores, principalmente na terapêutica de doenças pró

inflamatórias é favorecido por atuar na inibição de PLA2s que produzem como

produto de suas reações fatores pró-inflamatórios, como os eicosanóides,

mediadores da via da Cicloxigenase 2 (COX2). Dessa forma, a utilização de

26

inibidores de PLA2s, como estratégia terapêutica no tratamento de inflamações e

danos teciduais, é de grande importância, uma vez que proporciona o controle da

atividade da PLA2s facilitando o tratamento dos estados patológicos relacionados

a processos inflamatórios (YEDGAR et al., 2000). Para isto é necessário o

desenvolvimento de pesquisas que visam a elucidação dessas estruturas, bem

como suas conformações e mecanismo de ação, incluindo a estrutura

tridimensional e de seus complexos com as diferentes PLA2s. Com isso, os

inibidores de PLA2s são grandes modelos para alvo na formulação de fármacos

com importância em diversos processos inflamatórios.

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38

Capítulo 2

Caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de Fosfolipases A2 do

tipo γ isolado do soro de Crotalus durissus collilineatus

Resumo: Alguns animais apresentam uma resistência natural aos efeitos tóxicos

induzidos por peçonha de serpentes, isto se deve a presença de inibidores

naturais endógenos em seu plasma. Dentre estes, destacam-se os inibidores de

fosfolipases A2 (PLA2), os quais são capazes de inibir as atividades enzimáticas e

farmacológicas de várias PLA2s de peçonhas ofídicas. No presente trabalho, foi

demonstrado o isolamento, a caracterização bioquímica e estrutural de um

inibidor de PLA2, o qual foi isolado do soro da serpente Crotalus durissus

collilineatus (Cdc) por dois passos cromatográficos. Inicialmente o soro de Cdc foi

aplicado em uma coluna de troca-iônica Q-Sepharos, produzindo seis picos de

absorbância a A280nm denominados (Q1 a Q6). Posteriormente, a fração Q4, que

demonstrou melhores resultados de inibição foi submetida a uma cromatografia

de afinidade NHS–Hitrap imobilizada com uma PLA2-símile (BnSP-7). Deste

fracionamento resultaram duas frações denominadas de NHS-1 e NHS-2, sendo

que a fração NHS-2 representa o inibidor de PLA2 denominado γCdcPLI. A

massa molecular do inibidor determinada por (MALDI-TOF) foi de 22.34 kDa e a

sequência primária parcial determinada por Edman e Peptide Mass Fingerprinting

(PMF) em MS (MALDI-TOF\TOF) mostrando similaridade com outros inibidores

do tipo γ. As análises da estrutura secundária realizada por dicroísmo circular

revelaram aproximadamente 22% de alfa hélices e 29% de folhas beta. Estes

estudos também indicaram que não houve alteração significativa na conformação

tanto do γCdcPLI ou da PLA2-símile BnSP-7. Os resultados obtidos por análises

de espalhamento de luz dinâmico demonstraram que o inibidor possui

comportamento de oligomerização mediante variação de temperatura e quando

dissolvido em H2O ou PBS. O γCdcPLI foi capaz de inibir as atividades enzimática

com resultado de 100% na razão 1:5 (m/m) frente as PLA2 utilizadas, miotóxica

por dosagem de CK e citotóxica por MTT em células tEnd com característica de

ser dose não dependente. Estudos estruturais e funcionais deste inibidor poderão

39

contribuir para a compreensão dos mecanismos de ação dos inibidores de PLA2s,

bem como na investigação de seu uso como auxiliar no tratamento do

envenenamento ofídico ou doenças inflamatórias.

Palavras-chave: Inibidores de PLA2, Inibidores tipo γ, Crotalus durissus

collilineatus, Fosfolipases A2, Serpentes

40

Abstract: Some animals have a natural resistance to toxic effects induced by

snake venom due to presence of natural endogenous inhibitors in their plasma.

Snake venom contains inhibitors of phospholipase A2 (PLA2) that inhibit the

enzymatic and pharmacological activities of PLA2. In this work we show the

isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 inhibitor from

Crotalus durissus colillineatus (Cdc) snake serum by two chromatographic steps.

Initially, the Cdc serum was applied to a column of ion exchange Q-Sepharose

Fast Flow, producing six peaks of absorbance at A280nm (Q1 to Q6).

Subsequently, Q4 fraction (best results to inhibition) was applied to affinity

chromatography with immobilized HiTrap NHS-BnSP-7. This fractionation resulted

in two fractions (NHS-1 and NHS-2) the second fraction contained the inhibitor,

named γCdcPLI. The molecular mass of γCdcPLI determined by MALDI-TOF

was 22.3kDa and the primary partial structure obtained by Edman and peptide

mass fingerprinting (PMF) MS (MALDI-TOF \ TOF), showed similarity when

compared with the sequences of other related inhibitors. The secondary structure

was evaluated for circular dichroism and showed approximately 22% alpha helix

and 29% beta sheets.These studies of interaction have also indicated no

significant changes in secondary structure to γCdcPLI and BnSP-7. The results

obtained by analysis of dynamic light scattering (DLS) showed that the inhibitor

has in oligomerization variation, according to temperature and when dissolved in

H2O or PBS. γCdcPLI was able to inhibit the enzymatic, with 100% to inhibition.

Cytotoxicity was assayed on Murine endothelial cell line derived from thymus

hemangioma- tEnd to MTT and myotoxicity was measuring by creatine kinase

(CK) showed inhibition too, but in this case the inhibition was independent dose.

Structural and functional studies of this inhibitor may contribute to understanding

the mechanisms of action of PLA2 inhibitors. In addition, these studies may serve

as starting point for investigating the potential of these inhibitors for the treatment

of snake bite or inflammatory diseases.

Keywords: PLA2 inhibitor, γ-type inhibitor, Crotalus durissus collilineatus,

phospholipase A2, snakes

41

1.0 Introdução

No Brasil, a espécie Crotalus durissus é importante no cenário de acidentes

ofídicos por ser responsável por grande letalidade, segundo os dados do

Ministério da Saúde (BRASIL, 2013). A peçonha crotálica apresenta uma grande

capacidade de dissociar a transmissão neuromuscular e provocar mialgia,

levando o paciente a sintomas de paralisia progressiva. No ponto de vista

sistêmico, a neurotoxicidade é frequentemente acompanhada de rabdomiólise

com necrose tubular aguda e insuficiência renal, tal característica do

envenenamento representa a principal causa de óbitos (VITAL-BRAZIL, 1966;

AZEVEDO-MARQUES e.t. al., 2009). Estas características únicas do

envenenamento crotálico, são atribuídas à elevada concentração de crotoxina

(WARRELL, 2004), uma neurotoxina heterodimérica constituída por um

componente básico (CB, PLA2) e um componente ácido (CA, crotapotina). Estes

exibem ação pré sináptica e pós sináptica, sendo classificada como uma β

neurotoxina (BON et al., 1989; BON, 1997; SAMPAIO et al., 2010).

As PLA2s (E.C. 3.1.1.4) apresentam grande potencial clínico e científico por

estarem relacionadas a uma grande variedade de doenças inflamatórias humanas

e nos envenenamentos ofídicos (ARNI e WARD, 1996; KINI et al., 2003). Estas

enzimas hidrolisam especificamente a ligação 2-acil éster de 2-sn-fosfolipídeos,

liberando ácidos graxos livres e lisofosfatídeos. Os ácidos graxos liberados, como

o ácido araquidônico, podem exercer função de segundo mensageiro e precursor

de eicosanóides, sendo potenciais mediadores da inflamação (DENNIS, 1997).

As PLA2s presentes nas peçonhas de serpentes da família Viperidae

possuem massa molecular variando de 14 a 18 kDa. Apresentam alto grau de

similaridade sequencial e cinco a oito pontes dissulfeto que garantem sua

estabilidade estrutural (FRANCISCHETTI et al., 1998; KINI, 2003; MASUDA et al.,

2005). As PLA2s de peçonhas estão reunidas em dois grupos principais: Asp49 e

PLA2-símile Lys49. As PLA2 Asp49 são assim chamadas porque possuem um

resíduo de aspartato na posição 49, apresentando alta atividade catalítica sobre

substratos artificiais e as PLA2-símile Lys49 possuem um resíduo de lisina na

posição 49, apresentando pouca ou nenhuma atividade catalítica (ARNI; WARD,

1996; OWNBY et al., 1999; SOARES et al., 2004).

42

As PLA2s são responsáveis por uma variedade de efeitos farmacológicos,

tais como neurotoxicidade, mionecrose, cardiotoxicidade, atividade hemolítica,

hemorrágica, hipotensora, inibição da agregação plaquetária e anti-coagulação

(GUTIERREZ; LOMONTE, 1997; OWNBY, 1998; OWNBY et al., 1999). Essas

atividades se relacionam com a atividade enzimática ou podem ser totalmente

independente dela (KINI; EVANS, 1989; KINI, 1997).

É reconhecida a existência de diversos compostos capazes de neutralizar a

peçonha e toxinas de serpentes, como os anticorpos, agentes químicos,

compostos de origem vegetal e animal. Dentre esses, destacam-se os inibidores

de PLA2s (LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003).

Os inibidores de PLA2s são glicoproteínas ácidas obtidas a partir do

sangue e produzidas no fígado de alguns animais, como serpente e mamíferos

ofiófagos. Estes funcionam como um mecanismo de defesa aos efeitos deletérios

de um envenenamento acidental. O primeiro relato de um inibidor de PLA2s

isolado foi encontrado no plasma da serpente Trimeresurus flavoviridis por Kihara

e colaboradores (1976) (KINKAWA et al., 2010, DOMONT et al., 1991, FAURE,

2000). Estas proteínas são classificadas em três tipos α, β e γ de acordo com

seus aspectos estruturais, baseando-se em domínios estruturais comuns,

encontrados em diferentes proteínas com propriedades fisiológicas distintas

(INOUE et al., 1991; THWIN et al., 2002).

O inibidor do tipo γ (γPLI), destaque neste estudo, são os que apresentam

o maior número de subunidades protéicas, com massa molecular variando de 90

a 130 kDa, compostos por 3-6 subunidades não covalentes de massa 20-31 KDa.

São conhecidos por apresentarem dois conjuntos de repetições intramoleculares

de domínios ricos em cisteína, denominados motivo Three-fingers (OHKURA et

al., 1999; ESTEVÃO-COSTA et al., 2008). Este domínio é responsável pelo

reconhecimento da região de ligação do Ca2+ de PLA2s, fato que garante o alto

espectro de inibição em todos os grupos de PLA2s (IA, IIA e IIIA) ácidas ou

básicas (DUNM, 2001).

Considerando o potencial clínico e biotecnológico de inibidores de PLA2s, o

presente trabalho teve como objetivo purificar e caracterizar química, funcional e

estruturalmente um novo inibidor de PLA2 presente no soro da serpente Crotalus

durissus collilineatus.

43

2.0 Material e Animais

2.1 Reagentes

Colunas de cromatografia Q-Sepharose Fast Flow, Afinidade NHS (N-

hydroxysuccinimide) Hi-Trap GE Health Care e coluna RP-C4 Grace Vydac (250

mm x 4,6 mm). Acrilamida, bis-acrilamida, TEMED, SDS, EDTA, azul de

bromofenol, coomassie Brilliant Blue R-250, glicina, soroalbumina bovina,

persulfato de amônio e β-mercaptoetanol Sigma Chem. Co. Padrão de peso

molecular foi obtido da GE Health Care. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyl tetrazolium bromide) Sigma. Os demais reagentes utilizados neste

estudo foram de grau analítico.

2.2 Peçonha e toxinas

As peçonhas de Bothrops pauloensis e Bothrops jararacussu foram obtidas

a partir de espécimes mantidas no Serpentário Proteína Bioativas LTDA,

estabelecido na Fazenda Boa Esperança S/N – Zona Rural – Batatais/SP. Este

serpentário possui comprovante de registro no Instituto Brasileiro do Meio

Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (no de cadastro: 471301). A

peçonha liofilizada foi pesada, dissolvida em salina tamponada (PBS) pH 7,2 e

centrifugada a 3.000 xg por 10 min. O sobrenadante foi coletado e imediatamente

utilizado nos testes de inibição. As PLA2s-símile Lys49 BnSP-7 e Asp49 BpPLA2-

TXI de Bothrops pauloensis e Asp49 BthTX-II de Bothrops jararacussu foram

obtidas de acordo com as metodologias descritas por Soares e colaboradores

(2000), Ferreira (2011) e Homsi-Brandeburgo e colaboradores (1988),

respectivamente.

2.3 Obtenção do soro

Os espécimes de Crotalus durissus collilineatus (Cdc) foram mantidos no

Setor de Manutenção de Répteis, coordenado pela Profa. Dra. Vera Lúcia de

Campos Brites. Este setor possui registro desde 1995 pelo Instituto Brasileiro do

44

Meio Ambiente dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA), enquadrando-se na

categoria Criadouro Conservacionista da Fauna Silvestre – finalidade científica.

O sangue das serpentes foi coletado a cada 30 dias pelo veterinário Prof.

Dr. André Luiz Quagliatto Santos, Coordenador Técnico do Laboratório de

Pesquisa em Animais Silvestres (LAPAS) da Universidade Federal de Uberlândia

(UFU). O soro de Cdc foi obtido após a centrifugação do sangue a 5.000 x g por

10min à 4ºC e foi armazenado à -20ºC para realização dos ensaios de inibição e

purificação. Este projeto recebeu parecer favorável pelo Comitê de Ética e

Utilização de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Uberlândia (UFU) sob

Protocolo de nº 059/10.

2.4 Animais

Camundongos da linhagem Balb-c machos, (20-25 g) foram fornecidos pelo

Centro de Bioterismo da Universidade Federal de Uberlândia. Os animais foram

mantidos sob condições padrões de temperatura 25ᵒC, umidade relativa do ar de

60-65%, ciclo de 12h de luz/noite, dieta e água ad libitum. Os procedimentos a

serem realizados com animais apresentados na presente proposta foram

previamente aprovados pelo do Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA,

número do protocolo 059/10) da Universidade Federal de Uberlândia e está em

acordo com os princípios éticos de experimentação animal adotados pelo Colégio

Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

3.0 Métodos

3.1 Isolamento do inibidor de fosfolipase A2 (PLA2) presente no soro da serpente Crotalus durissus colillineatus

3.1.1 Cromatografia de troca iônica em Q-Sepharose fast flow

O inibidor de PLA2 foi isolado a partir do soro de espécimes da serpente C.

d. colillineatus utilizando-se dois passos cromatográficos. Inicialmente, cerca de

120mg do soro de Cdc foram diluídos em tampão fosfato de sódio 0,05M pH 6,5 e

centrifugados 5000 x g por 10min. O sobrenadante foi posteriormente aplicado em

uma coluna de troca iônica, Q-Sepharose fast flow (GE Healthcare) previamente

45

equilibrada em tampão fosfato de sódio 0,05M pH 6,5. A eluição das proteínas do

soro ocorreu com o tampão fosfato de sódio 0,05M pH 6,5 em diferentes

concentrações de NaCl 0,2M, 0,35M, 0,5M e 0,7M a um fluxo de 12mL/h a

temperatura de 25ºC. As frações obtidas (Q1 a Q6) foram monitoradas a 280nm

em espectrofotômetro Ultrospec 1000 UV/visível (Pharmacia Biotech). As frações

foram reunidas, liofilizadas e armazenadas à -20ºC.

3.1.2 Cromatografia de afinidade

Cerca de 500µg da fração Q4, obtida do fracionamento do soro de Cdc em

Q-sepharose, foi aplicado a uma coluna de afinidade NHS Hitrap (N-

hydroxysuccinimide) previamente imobilizada com a PLA2 BnSP-7. A montagem

da coluna foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante. Para

efetuar a ligação da PLA2 (BnSP-7) foi utilizado um tampão de acoplamento (0,2

M NaHCO3 + 0,5 M NaCl pH 8,3), sendo que a enzima foi ressuspendida neste

tampão na concentração de 0,5-10 mg/mL de proteína. A coluna foi lavada com

HCl 1mM gelado para retirada do isopropanol presente. Após tal procedimento foi

injetado 1ml da solução ligante (Tampão de acoplamento+Enzima), a coluna foi

vedada e deixada em repouso por cerca de 24h a 4°C.

Para lavagem e desativação da coluna foram utilizados dois tampões, o

tampão A (0,5 M etanolamina, 0,5 M NaCl pH 8,3) e o tampão B (0,1 M Acetato,

0,5 M NaCl pH 4). Estes tampões foram injetados alternadamente, completando

6ml de cada tampão completando em um ciclo de seis aplicações. Após este ciclo

foram injetados 2ml de um tampão com pH neutro para efetuar o ajuste de pH da

coluna. A coluna acoplada ao sistema de cromatografia AKTA PRIME GE-Health

Care foi inicialmente equilibrada com tampão Tris- HCl 10 mM/L pH 7,5. A

cromatografia iniciou-se com o mesmo tampão para que proteínas que não

apresentassem afinidade à PLA2s fossem retiradas da coluna. Em seguida, as

proteínas que interagiram com a resina foram eluídas com o tampão Glicina 100

mM/L pH 2. Esta fração de interesse, contendo o inibidor, foi neutralizada com um

tampão de neutralização (Tris-HCl 1 M , pH 8).

46

3.1.3 Cromatografia líquida de alta performance em fase reversa (RP-HPLC)

Amostras do inibidor de PLA2 (1 mg) foram preparadas em 500 µL de

solvente A (0,1% ácido trifluoracético, v/v e acetonitrila 5%, v/v) e aplicadas ao

sistema de cromatografia liquida de fase reversa de alta performance (RP-HPLC)

em coluna RP-C4 Vydac (250 mm x 4,6 mm) (GE Healthcare Bio-Sciences). A

coluna foi previamente equilibrada com solvente A e eluída com o solvente B

(acetonitrila 80%, v/v e ácido trifluoracético 0,1%, v/v). Esta cromatografia foi

realizada com o gradiente de concentração linear de 0 - 100% do solvente B a um

fluxo de 0,5 mL/min.

3.2 Dosagem protéica

As dosagens de proteínas em soluções foram realizadas utilizando o

método estabelecido por Bradford (1976). As determinações das concentrações

de proteínas foram realizadas em triplicatas e a absorbância medida a 595 nm.

Paralelamente à dosagem de proteínas foi construída uma curva padrão de

soroalbumina bovina (1 mg/mL), considerando o coeficiente de extinção molar em

280 nm (0,665). A concentração de proteínas em µg/µL foi determinada a partir de

cálculos de regressão linear baseados nos valores obtidos na curva padrão.

3.3 Caracterização Bioquímica

3.3.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida com agentes desnaturantes (SDS-PAGE)

As amostras foram analisadas em gel de poliacrilamida a 12 % (m/v) em

condições redutoras, na presença de SDS e β-mercaptoeanol, segundo

metodologia descrita por Laemmli (1970), com algumas modificações. O sistema

de SDS-PAGE descontínuo consistiu de: gel de empilhamento a 3%, contendo

Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) e SDS a 0,1% (m/v) e gel de separação a 12% contendo

Tris-HCl 2,0 M pH 8,8 e SDS 0,1% (m/v), mantendo a relação de bis:acrilamida

0,8:30. Todos os géis foram preparados num sistema de eletroforese Hoefer SE

260 Mighty Small II Mini-Vertical. As amostras foram dissolvidas em um tampão

47

de Tris-HCl 0,06 M pH 6,8; SDS 2% (m/v); β-mercaptoetanol 5% (v/v); azul de

bromofenol 0,005 % (m/v) e glicerol 10% (v/v). Em seguida as amostras foram

aquecidas por 5 minutos a 100ºC. O tampão do eletrodo continha Tris 0,025 M,

Glicina 0,192 M e SDS 0,1% (m/v), pH 8,3. O gel foi corado em solução de

coomassie blue- R250 0,1% (m/v) em água, ácido acético 10% (v/v) e metanol

50% (v/v) e descorado em solução de ácido acético a 7% (v/v) e etanol 30% (v/v)

para posterior análise.

A massa molecular do inibidor isolada foi estimada pela interpolação de

uma curva logarítmica linear da massa molecular relativa das proteínas do padrão

de massa molecular versus a distância de migração no gel. O padrão de massa

molecular consistia nas proteínas: Albumina Bovina 66 kDa; Ovoalbumina 45 kDa;

Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase 36 kDa; Anidrase carbônica 29 kDa;

Tripsinogênio 24 kDa; Inibidor de tripsina 20,1 kDa; α-lactoalbumina; 14,2 kDa.

3.3.2 Determinação da massa MALDI-TOF

A massa molecular do inibidor de PLA2s foi determinada por espectrometria

de massas com ionização e dessorção de matriz assistida por laser (MALDI-TOF-

MS) (Matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry).

As análises foram feitas em espectrofotômetro de massas tipo duplo TOF com

fonte MALDI (MALDI-TOF/TOF, modelo AutoFlex III Bruker Daltonics, Bremen,

Alemanha). Cerca de 100 µg do inibidor liofilizado foi ressuspendido em 10 µL de

0,1% ácido trifluoracético/H2O e posteriormente 0,5 µL dessa solução foram

misturados com 0,5 µL de solução matriz de ácido sinapínico a 10 mg/ml em

Acetonitrila (ACN): Ácido trifluoroacético 0,1 %. Estas misturas foram aplicadas

diretamente na placa MALDI TARGET (Bruker Daltonis), onde foram

homogeneizadas e secas à temperatura ambiente. Para calibragem do

equipamento foi utilizado misturas de proteína padrão (Tripsinogênio, Proteína A,

Albumina-bovina) também aplicadas na mesma placa. Os espectros de massa

foram adquiridos no modo linear positivo, após calibragem do aparelho com

padrões de proteínas (Bruker Daltonics, Bremen, Germany). A faixa de massas

moleculares avaliada foi de 3.000-80.000 m/z.

48

Os experimentos descritos nos itens 3.3.2, 3.4.1, 3.4.2 foram realizados no

Laboratório de Serviço de Bioquímica de Proteínas de Venenos Animais-FUNED,

Belo Horizonte, em colaboração com a Profa. Dra. Márcia Helena Borges.

3.4 Caracterização Estrutural

3.4.1 Análise automatizada da sequencia de aminoácidos

O inibidor foi sequenciado segundo a técnica por degradação de Edman de

acordo com o seguinte protocolo. Primeiramente, 1 mg da amostra foi reduzida e

alquilada com 4-vinil piridina. A amostra foi diluída em 1 mL de Tris-HCl (0,1 M e

pH 8) e Guanidina-HCl 6 M. Depois da adição de 30 µL de β-mercaptoetanol, a

amostra foi primeiramente incubada a 50oC por 4h, e com 40 µL de 4-vinil piridina

a 37oC por 2 horas no escuro. Posteriormente, a amostra foi dessalinizada em

uma coluna P10 (GE, healthcare). A proteína foi clivada por tripsina (2% m/m,

enzima: substrato em 1 mL de 0,1 M de bicarbonato de amônio, pH 7,9) por 4,5h

a 37oC. Os produtos de clivagem foram separadas por uma coluna Vydac C18

(4,6 x 250 mm) usando um gradiente linear de 0 a 50% de acetonitrila em solução

de 0,1% TFA e a sequência determinada utilizando o sequenciador de proteínas

Shimadzu PPSQ-21A. A estrutura primária dos peptídeos foi comparada com

outras sequências do banco de dados relatadas no SWISS-PROT/TREMBL

usando os programas FASTA3 e o BLAST.

3.4.2 Espectrometria de massas (MALDI TOF/TOF) e Análise de Bioinformática

Cerca de 100 µg do inibidor foi solubilizado em NH4HCO3 100 mM e Ureia 8

M, durante 20 min. Esta mistura foi submetida a redução com DTT 10 mM em

NH4HCO3 50 mM, a 37 °C durante 60 min. Para alquilação, foram adicionados 50

mM de iodoacetamida em NH4HCO3 50 mM a 37 ºC durante 30 min. Uma alíquota

de tripsina Gold 0.5 µg/2.5 µL (Promega, Madison, WI, EUA) foi adicionada para

prosseguir a digestão a 37 °C durante à noite. A reação foi interrompida pela

adição de TFA a 1% e a mistura de fragmentos obtidos da digestão com a tripsina

foram concentrados em Speed-Vac (Savant SPD121P). A mistura de peptídeos

49

foi dessalinizada utilizando um cartucho C18 acoplado ao sistema HPLC. Para

cada análise, 1 µL da amostra foi adicionado a 3 µL da matriz ácido alfa-ciano-4-

hidroxicinâmico (α-CHCA), e posteriormente 1 µL desta mistura foi aplicado sobre

uma placa (Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha) e seca à temperatura ambiente.

Análise por espectrometria de massa foi realizada por MALDI TOF (matrix-

assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry) utilizando

um dispositivo Autoflex III MALDI-TOF-TOF (Bruker Daltonics, Billerica, EUA),

controlada pelo software FlexControl 3.1 (Bruker Daltonics , Billerica, EUA). O

software Flex 3,3 (Bruker Daltonics, Billerica, EUA) foi utilizado para a análise de

dados de espectrometria de massa. As massas peptídicas monoisotópicas foram

obtidas em modo refletor com calibração externa, utilizando-se um padrão de

calibração de peptídeos (Bruker Daltonics, Billerica, EUA). Espectros de

peptídeos (MS/MS) foram realizados pela fragmentação LIFT. Os espectros de

massa foram analisados com o software Biotools (Bruker Daltonics) e a

identificação da proteína realizada com o software Mascot. As pesquisas foram

obtidas no banco de dados NCBI, as sequências homólogas foram obtidas a partir

do banco de dados NCBI usando o algoritmo BLASTP. Para alinhamento das

sequências depositadas com os fragmentos obtidos foi utilizado o programa

ClustalW.

3.4.3 Dicroísmo circular (CD)

Os experimentos descritos nos itens 3.4.3 e 3.4.4 foram realizados no

Laboratório de Biologia Molecular Estrutural (LBME) do Departamento de Física e

Biofísica - Instituto de Biociências-UNESP, em colaboração com o Prof. Dr.

Marcos Roberto de Matos Fontes.

Para a análise da estrutura secundária e interação do complexo

inibidor/enzima foi utilizado o equipamento Jasco J-815 com os programas

Spectra Manager™ II e CDPro. As medidas de CD foram realizadas utilizando-se

uma cubeta de quartzo de 0,5 mm com os seguintes parâmetros: scanning speed

100 nm/min; band width 1nm; step resolution 0.5 nm, temperatura 20°C para as

medidas do inibidor γCdcPLI (340 µg/ml) e 37°C para as medidas da interação

inibidor-BpPLA2-TXI (700 µg/ml), a solução diluente utilizada foi água deionizada.

50

Cada espectro corresponde à média de 10 acumulações com o branco já

devidamente subtraído. Os espectros das fosfolipases A2 foram coletados no

intervalo de 185-260 nm e do inibidor no intervalo de 195-260 nm. Todas as

amostras foram analisadas na presença de fluxo de N2 para que O2 presente no

ar não interferisse na leitura dos dados dentro do equipamento.

3.4.4 Análises de espalhamento de luz dinâmico (DLS)

O inibidor foi analisado por DLS visando obter características de agregação

(calculado a partir do grau de polidispersividade da amostra) e estimativa do

estado oligomérico (calculado a partir do raio hidrodinâmico). Para foi utilizado o

equipamento de DLS da Wyatt Inc.Technology, modelo DynaPro TITAN e o

programa Dynamics V.6.10 (fornecido pela Wyatt Tech).

3.5. Estudos de inibição das atividades biológicas de PLA2s

Todos os estudos de inibição foram conduzidos após a pré-incubação do

inibidor com as PLA2s (BnSP-7, BpPLA2-TXI e Bth-TxII) em diferentes razões de

toxina:inibidor (m/m) por 30 min a 37°C antes dos testes.

3.5.1 Atividade Fosfolipásica A2

A atividade PLA2 foi realizada por titulação potenciométrica como descrito

por De Haas e Postema (1968). O substrato utilizado consistia em uma emulsão

de gema de ovo na presença de desoxicolato de sódio 0,03 M e CaCl2 0,6 M. Os

ácidos graxos liberados enzimaticamente foram titulados com uma solução

padrão de NaOH 0,1208 M em pH 8,0 e temperatura ambiente. A atividade

fosfolipásica A2 foi expressa em microequivalentes de base consumida por minuto

por µg de proteína (µEq de NaOH/min./mg). Em cada ensaio foram utilizados 5 µg

da PLA2 de Bothrops pauloensis (BpPLA2-TXI) e 10 µg da PLA2 de B. jararacussu

(BthTX-II).

51

3.5.2 Atividade citotóxica

Para este experimento foram utilizadas células endoteliais murinas da

linhagem tEnd (Thymic endothelium), estabelecida por Bussolino et al. (1991). As

células foram cultivadas em meio RPMI 1640 acrescido com 10% de soro fetal

bovino e suplementado com 2 mM de L-glutamina, 2 mM de piruvato de sódio, 1

mM de aminoácidos não essenciais, 100 U/mL de penicilina e 100 µg/mL de

estreptomicina, mantidas em estufa 37°C e 5% CO2.

A viabilidade celular de culturas de células tEnd tratadas com a PLA2

BnSP-7 foi quantificada pela atividade da succinil desidrogenase, uma enzima

mitocondrial presente somente em células vivas, cujo o substrato é o MTT (3-

(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide). Para determinar a

viabilidade, 1,5x104 células/poço foram semeadas em microplacas de cultura de

96 poços. Após a adesão, o meio foi trocado e as células foram tratadas com a

BnSP-7 (25 µg/mL) e BthTX-II (50 µg/mL) ou BnSP-7/BthTX-II inibidas com

diferentes concentrações do inibidor, razões de 1:0,5 a 1:5 (m/m) por um período

de 24 horas. Culturas tratadas apenas com meio de cultura foram utilizadas como

controle negativo. Após 24 horas de incubação, foram adicionados diretamente

sobre o meio de cultura 20 µL de uma solução contendo 5 mg/mL de MTT e a

cultura mantida a 37°C por 3h. Após este período, foram adicionados 100 uL de

uma solução de SDS 10%/HCl 0,01 M durante um período de 18h. A intensidade

da reação foi determinada pela leitura da densidade óptica a 570 nm em um leitor

de ELISA (BioTeK – Elx50).

3.5.3 Atividade Miotóxica por dosagem de Creatina Cinase

Camundongos Balb-c machos (20 - 25g, n=4) receberam por via

intramuscular (im) no músculo gasctrocnêmio direito doses de 10 µg contendo a

PLA2 BnSP-7. Três horas depois os camundongos foram previamente

anestesiados com (ketamina® 10% (0,05 ml/kg) + xilasina® 2% (0,025 ml/kg) e

sacrificados por deslocamento cervical. O sangue coletado por punção cardíaca

foi centrifugado a 2.500 x g por 10 minutos a 4ºC. A quantificação dos níveis de

creatina cinase (CK-EC. 2.7.3.2) no plasma obtido foi determinada utilizando a

52

metodologia descrita no Kit CK-UV kinetic (Biotécnia). A atividade foi expressa em

unidades por litro (U/L), cada unidade corresponde à produção de 1 µmol de

NADH por minuto a 30ºC. Para este ensaio foram formados os seguintes grupos:

Controles (animais receberam somente PBS ou diferentes doses de inibidor: 10 e

30 µg); Testes (animais receberam amostras contendo BnSP-7:inibidor na razão

1:1 e 1:3, m/m).

3.6 Análises estatísticas

A montagem dos gráficos, cálculos das médias e desvios padrões das

médias foram realizados com auxílio do software Prisma 5.0. Significâncias

estatísticas dos resultados foram determinadas utilizando o teste ANOVA e

KrusKal-Wallis. Os valores de p < 0,05 foram considerados significativos.

4.0 Resultados

4.1 Isolamento e caracterização bioquímica do inibidor de PLA2 tipo γ

O fracionamento de 120 mg do soro obtido após centrifugação do sangue

da serpente Cdc, foi realizado em coluna cromatográfica de troca-iônica em Q-

Sepharose resultando em seis frações principais denominadas (Q1, Q2, Q3, Q4,

Q5 e Q6) (Figura 1). Nesta primeira etapa testes preliminares demonstraram que

o gradiente descontínuo apresentou melhores resultados quando comparado ao

gradiente linear (dados não mostrados). Estas foram reunidas em pools,

liofilizadas e armazenadas a -20º C. Em análises por SDS-PAGE 12% (Figura 2)

a fração Q4 apresentou duas bandas majoritárias de massa molecular de

aproximadamente 66 kDa e 24 kDa, além de outros contaminantes em menores

proporções. As demais frações (Q1, Q2, Q3) apresentaram diversas bandas

proteicas, e as frações Q5 e Q6 não foram visualizadas no gel (Figura 2). A

fração Q4, que demonstrou maior inibição (Tabela 2), foi aplicada a coluna de

afinidade previamente imobilizada com a PLA2 BnSP-7 resultou em dois picos de

absorbância a 280 nm (NHS-1 e NHS-2) (Figura 3A). A fração NHS-2, contendo

a proteína de interesse foi posteriormente liofilizada e visualizada em SDS-PAGE

a 12% em condições redutoras, revelando uma massa aparente de 24 kDa

53

(Figura 3B). Esta proteína, denominada de γCdcPLI, representou 2,6% do total

proteico do soro de Cdc (Tabela I) e foi posteriormente aplicada em uma coluna

de fase reversa (C4/RP-HPCL) (Figura 4A). Amostras obtidas após RP-HPLC

foram utilizadas para a determinação da massa por MALDI-TOF, sequenciamento

por degradação de Edman e MS/MS, análises de dicroísmo circular e

espalhamento de luz dinâmico.

As análises por SDS-PAGE (12%) em condições redutoras para estimativa

da massa molecular do inibidor de PLA2s, revelou um único componente com

massa molecular estimada de 24 kDa (Figura 4B). A massa real atribuída para a

proteína, de acordo com a técnica de MALDI-TOF foi de 22.34 kDa, como mostra

a Figura 5. É possível verificar nesta figura também o valor da massa da proteína

duplamente carregada.

54

Figura 1- Fracionamento de 120 mg do soro de Cdc em coluna Q-Sepharose Fast

Flow equilibrada com tampão fosfato de sódio 0,5M, pH 6,5 e 0,02M de NaCl.

Frações de 1mL/tubo foram coletadas utilizando um fluxo de 12mL/h, a

temperatura ambiente. A eluição foi realizada com o mesmo tampão, em

concentrações crescentes de NaCl (0,35, 0,5 e 0,7 M).

55

Figura 2: Eletroforese em gel de poliacrilamida (12%) em condições

desnaturantes do soro total de Cdc e frações obtidas da cromatografia em Q-

sepharose: PM- Padrão de peso molecular; S- Soro total; 1- Q1; 2- Q2; 3-Q3; 4-

Q4; 5-Q5; 6-Q6. Tempo de corrida 57 min a 20 mA. O gel foi corado com

coomassie Brilliant Blue R-250 a 2,5% por 10 min. e em seguida descorado em

ácido acético 10%, etanol 30% e água deionizada. Padrão de massa molecular

(PM): Albumina Bovina 66 kDa; Ovoalbumina 45 kDa; Gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase 36 kDa; Anidrase carbônica 29 kDa; Tripsinogênio 24 kDa; Inibidor

de tripsina 20,1 kDa; α-lactoalbumina; 14,2 kDa.

PM S 1 2 3 4 5 6

66

45

36 29 24

20,1

14,2

56

Figura 3: (A) Perfil cromatográfico de 500 µg da fração Q4 em coluna de afinidade NHS imobilizada com a PLA2 BnSP-7, equilibrada com Tampão Tris-HCl 10 mM pH 7,5 e eluida com tampão glicina 100 mM pH 2,5. Fluxo de 0,5 ml/tubo. Com o eixo X representando os tubos numerados e o eixo Y representando a absorbância em mAu a 280 nm. (B) SDS PAGE (12%) em condições redutoras. Tempo de corrida 75 min. a 20 mA. O gel foi corado com coomassie Brilliant Blue R-250 a 2,5% por 10 min. e em seguida descorado em ácido acético 10%, etanol 30% e água deionizada. 1- Padrão de massa molecular; 2- NHS-2. Padrão de massa molecular (PM): Fosforilase B 97 kDa; Albumina Bovina 66 kDa; Ovoalbumina 45 kDa; Anidrase carbônica 30 kDa; Inibidor de tripsina 20,1 kDa; DC-lactoalbumina; 14,4 kDa.

PM

57

Figura 4: (A) Perfil cromatográfico do inibidor γCdcPLI em coluna RP-C4 Vydac (1 cm x 25 cm). 1mg do inibidor foi dissolvido em 550µL de ácido trifluoracético 0,1% (v/v). O pico foi eluido com fluxo de 1mL/min e absorbância monitorado a 280nm. Com o eixo X representando os tubos numerados e o eixo Y representando a absorbância em mAu. (B) SDS-PAGE (12%) 1- Padrão de massa molecular PM (97 kDa Fosforilase B; 66 kDa Albumina; 45 kDa Ovoalbumina; 30 kDa Anidrase carbônica; 20,1 kDa Inibidor de tripsina; 14,1 kDa DC-lactoalbumina). 2- Inibidor γCdcPLI em condições redutoras (20% de β-mercaptoetanol).

58

Figura 5: Análises em espectrofotômetro de massas tipo duplo TOF com fonte MALDI (MALDI-TOF/TOF), modelo AutoFlex III Bruker Daltonics, Bremen, Alemanha). Cerca de 100 µg do inibidor liofilizado ressuspendido em 10 µL de 0,1% ácido trifluoracético/H2O e 0,5 µL de solução matriz de ácido sinapínico a 10 mg/ml em Acetonitrila (ACN): Ácido trifluoroacético 0,1 %.

59

Tabela I: Rendimento proteico do inibidor obtido no fracionamento do soro de Crotalus durissus collilineatus em Q-Sepharose e Hitrap NHS

Etapas de purificação mg (totais)* Recuperação (%)

Soro 120 mg 100 %

Fração Q4 12 mg 10 %

γCdcPLI 3,13 mg 2,60 %

* Dosagem realizada pelo método de Bradford (1976).

4.2 Estudos funcionais

4.2.1 Atividade fosfolipásica A2

Inicialmente foi analisado o perfil inibitório do soro de Cdc sobre a atividade

PLA2 da peçonha bruta de B. pauloensis e da BpPLA2-TXI, nas razões de 1:5,1:10

e 1:20 (peçonha ou BpPLA2-TXI:soro Cdc, m/m), com resultados significativos

apenas na razão 1:20, para peçonha bruta e em todas razões para BpPLA2-TXI

(Tabela 2).

As frações (Q1 a Q4) na razão de 1:20 (peçonha B. pauloensis: frações,

m/m) foram testadas quanto à sua capacidade em inibir a atividade PLA2 da

peçonha de B. pauloensis. Com estes resultados pôde-se perceber que as

frações Q3 e Q4 tiveram maior inibição (resultados não mostrados), porém Q4

indicou melhor ação inibitória. A fração Q4 também foi testada nas proporções

1:5, 1:10 e 1:20 (peçonha B. pauloensis : Q4, m/m) (Tabela 2). Esta conseguiu

reduzir a atividade PLA2 da peçonha de B. pauloensis em todas as proporções,

diferentemente do soro total que inibiu esta peçonha apenas na razão 1:20.

O γCdcPLI, isolado no presente estudo, foi capaz de inibir a atividade PLA2

de BpPLA2-TXI de B. pauloensis em diferentes proporções, 1:1, 1:2 e 1:5 (m/m),

bem como da PLA2 básica purificada da peçonha de B. jararacussu (BthTX-II),

nas razões 1:1, 1:3 e 1:5 (m/m). O γCdcPLI demonstrou inibição dose

dependente, com 100% de inibição na razão 1:5 para ambas PLA2s (Tabela 2).

60

Tabela 2- A atividade PLA2 realizada por titulação potenciométrica.

Amostra Razões de

Inibição

Amostra : Soro

Atividade PLA2

(U/mg)

% de Inibição

B. pauloesis 1:5 67,83 ± 2,74 7,60%

1:10 64,33 ± 7,55 6%

1:20 61,39 ± 7,02 * 12,65% *

BpPLA2-TXI 1:5 179,26 ± 4,59 * 11,80% *

1:10 162,28 ± 8,76 * 18,05% *

1:20 158,87 ± 6,89 * 21,23% *

Amostra Razões de

Inibição

Amostra : Q4

Atividade PLA2

(U/mg)

% de Inibição

B. pauloensis 1:5 62,63 ± 8,57 * 21% *

1:10 59,69 ± 0,85 * 24% *

1:20 42,58 ± 5,58 * 46% *

Amostra Razões de

Inibição

Amostra :

γCdcPLI

Atividade PLA2

(U/mg)

% de Inibição

BpPLA2-TXI 1:1 130,0 ± 7,52 * 25% *

1:2 98,0 ± 7,74 * 43% *

1:5 0 * 100% *

BthTX-II 1:1 33,4 ± 1,41* 40% *

1:3 26,4 ± 5,02 * 53,67% *

1:5 0 * 100% *

* Valores significativos de acordo com a análise estatística. Foi utilizado o teste ANOVA e KrusKal-Wallis, com significância de α <0,005, com o software Prisma 5.0

61

4.2.2 Neutralização da atividade Miotóxica (Dosagem CK) A neutralização da atividade miotóxica induzida pelo inibidor γCdcPLI após

a inoculação im de 10µg da PLA2 BnSP-7 pré incubada com o inibidor nas razões

1:1 e 1:3 (m/m) no músculo gastrocnêmio de camundongos foi verificada pela

quantificação dos níveis plasmáticos de creatina cinase (CK). Os resultados

mostraram uma capacidade de neutralização significativa da atividade miotóxica,

porém esta inibição não demonstrou ser dose dependente. O γCdcPLI nas

razões 1:1 e 1:3 (proteína:inibidor, m/m) foi capaz de inibir cerca de 27% e 21 %

respectivamente a atividade miotóxixa induzida pela BnSp-7. (Figura 6). Os

grupos controles, contendo apenas inibidor nas concentrações de 10 e 30 µg, não

apresentaram aumentos significativos nos níveis plasmáticos de CK em

comparação com o controle negativo PBS (Figura 6).

PBS 10 ug 30 ug BnSP7 1:1 1:30

200

400

600

Inhibitor control BnSP7 : yCdcPLI

* *

**

CK

(U

/L)

Figura 6: Neutralização da atividade miotóxica por dosagem de Creatina Quinase (CK) promovida PLA2 (BnSP-7) e BnSP-7 pré incubada com o inibidor γCdcPLI. Como controle foram utilizados, inibidor (10 µg e 30 µg) e PBS. Os resultados foram mostrados em U/L. (*) Dados estatisticamente significativos em relação ao grupo controle com BnSP-7.

62

4.2.3 Neutralização da citotoxicidade de células tEnd induzidas pela PLA2 BnSP-7

A neutralização da citotoxicidade induzida pela BnSP-7 em células

endoteliais murinas (tEnd) foi avaliada utilizando diferentes razões toxina: inibidor

(m/m) por ensaio de MTT. Os resultados mostraram uma capacidade de

neutralização significativa, porém esta inibição não demonstrou ser dose

dependente. Razões até 1:10 (toxina: inibidor, m/m) (resultados não mostrados)

não demonstraram diferença significativa. Dessa forma, como pode ser

observado na Figura 7, as razões 1:0,5 e 1:1 (toxina:inibidor, m/m) foram capazes

de inibir aproximadamente 31% e 38%, respectivamente a citotoxicidade induzida

pela BnSP-7, assim como verificado para as demais razões (toxina; inibidor, m/m)

utilizadas no experimento (Figura 7). Os grupos controles contendo apenas

inibidor não induziram toxicidade significativa (resultado não mostrado).

Meio Triton BnSP-7 1:0,5 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

BnSP-7:yCdcPLI

******

% C

ito

toxi

cid

ade

Figura 7: Inibição da citotoxicidade induzida pela BnSP-7 em culturas de tEnd. Células foram tratadas com BnSP-7 (25 µg/ml) ou BnSP-7 pré incubada com o inibidor nas razões 1:0,5; 1:1; 1:2; 1:3; 1:4 e 1:5.. Controle positivo triton 0,1%; controle negativo meio de cultura. Sendo que o símbolo (*) indica diferença significativa quando comparado com valores da PLA2 BnSP-7.

63

4.3 Estudos estruturais 4.3.1 Determinação da estrutura primária parcial do inibidor

O sequenciamento parcial do γCdcPLI foi obtido inicialmente por

espectrometria de massa. Cerca de 100µg da proteína foi digerida com tripsina e

o espectro dos fragmentos foi analisado com o software Biotools (Bruker

Daltonics) e a identificação da proteína realizada com o software Matrix Science

(Mascot Search Results) (resultados não apresentados). Para a identificação da

proteína os peptídeos gerados foram submetidos às análises de Peptide Mass

Fingerprinting (PMF) em espectrômetro de massa tipo duplo TOF com o método

LIFT. A figura 6 demonstra os fragmentos utilizados para realização das análises

da sequência por MS/MS, bem como o espectro do inibidor tripsinizado. A partir

deste perfil foi possível utilizar três parentais (Figura 8 B, C e D) para

fragmentação e sequenciamento. A sequência destes garantiu 14% da cobertura

proteica (Figura 9 em itálico).

O sequenciamento por degradação de Edman garantiu uma maior

cobertura da sequência polipeptídica do inibidor. A Figura 9 apresenta as

sequências com destaque para os fragmentos obtidos por degradação de Edman

(em negrito e sublinhado). Com isso, esta técnica juntamente com o

sequenciamento por MS/MS garantiu o sequenciamento de 63% da estrutura

primária da proteína.

A Figura 10 apresenta o alinhamento da sequência do inibidor com a de

outros inibidores depositados no banco de dados NCBI. Este alinhamento revelou

grande similaridade com outros inibidores do tipo γ, sendo possível classificá-lo

como pertencente a este grupo. O alinhamento também demonstrou a diferença

em alguns resíduos de aminoácidos nas posições (como Ser22 e Glu107)

presentes na estrutura primária do γCdcPLI quando comparada à estrutura

primária do inibidor CNF de Crotalus durissus terrificus (Figura 10). Além disso,

vale destacar as regiões de glicosilação do inibidor (destacado com retângulo

rósea).

64

K.CINIVGHR.Y K.VECKDAIR.L

K.VLLEISSASLSVR.T

Parentais

A

B C

D

65

Figura 8: Espectro dos fragmentos utilizados no sequencimento por MS/MS. A: espectro do inibidor tripsinizado; B, C e D: fragmentos utilizados para a análise de sequencia do inibidor γCdcPLI.

66

Figura 9: Sequência parcial do inibidor γCdcPLI. Em destaque (negrito e sublinhado) a sequência obtida com a degradação por Edman e em itálico, a sequência para os fragmentos obtidos no seqüenciamento por MS/MS.

67

γCdcPLI ---------------------SDFCHNIGKDCDGYEEECSSPEDVCGKVLLEISSASLSV 39

CNF MKYLHTICLLFIFVARGNSRSCDFCHNIGKDCDGYEEECSSPEDVCGKVLLEISSASLSV 60

LNF1 MKYLHTICLLFIFVARGNSRSCDFCHNIGKDCDGYEEECSSPEDVCGKVLLEISSASLSV 60

LNF2 MKSLHTICLLFIFVARGNSRSCDFCHNIGKDCDGYEQECSSPEDVCGKVFLEISSASLSV 60

B.alternatus MKSLHTICLLFIFVARGNSRSCDFCHNVGKDCDGYEQECSSPEDVCGKVFLEISSASLSV 60

B.moojeni MKSLHTICLLFIFVARGNSRSCDFCHNIGKDCDGYQQECSSPEDVCGKVFLEISSASLSV 60

.*****:*******::************:**********

γCdcPLI R----NCFSSSIC-----------------------KELCEDQPEPGEPLSK-------- 64

CNF RTVHKNCFSSSICKLGQFDVNIGHHSYIRGRINCCEKELCEDQPFPGLPLSKPNGYYCPG 120

LNF1 RTVHKNCFSSSICKLGQFDVNIGHHSYIRGRINCCEKEPCEDQLFPGLPLSKPNGYYCPG 120

LNF2 RTVHKNCFSSSICKLGQIDVNIGHHSYIRGRVNCCEKEPCEDQPFPGLPLSRPNGYYCPG 120

B.alternatus RTVHKNCFSSSICKLGQIDVNIGHHSYIRGRINCCEKEPCEDQPFPGLPLSRPNGYYCPG 120

B.moojeni RTVHKNCFSSSICKLGQIDVNIGHHSYIRGGINCCEKEPCEDQPFPGLPLSRPNGYYCPG 120

* ******** ** **** ** ***:

γCdcPLI -------DSTEYEAICK-----CINIVGHRYEQFPGDISYNLKGCVSSCPLLSLSNATFE 112

CNF AIGLFTKDSTEYEAICKGTETKCINIVGHRYEQFPGDISYNLKGCVSSCPLLSLSNATFE 180

LNF1 AIGLFTKDSTEYEAICKGTQTKCINIVGHRYEPFPGDISYNLKGCVSSCPLLSLSNATFE 180

LNF2 ALGLFTEDSTEYEAICHGTETKCINIVGHRYENFPGDITYNLKGCVSSCPLLSLSNATRE 180

B.alternatus ALGLFTEDSTEYEAICHGTETKCIDIVGHRYENFPGDITYNLKGCVSSCPLLSLSNATRE 180

B.moojeni ALGLFTEDSTEYEAICHGTETKCIDIVGHRHEHFPGDIAYNLKGCVSSCPLLSLSNATHE 180

*********: **:*****:* *****:******************* *

Identidade

γCdcPLI QNR-----VECKDAIR---- 123 100%

CNF QNRNYLEKVECKDAIRLASL 200 69%

LNF1 QNRNYLEKVECKDAIRLASL 200 67%

LNF2 ENRNYLQKVECKDAIRLASL 200 64%

B.alternatus QNRNYLEKVECKDAIRLASL 200 64%

B.moojeni QNRNYLEKVECKDAIRLASL 200 63%

:** ********

Figura 10: Alinhamento da seqüência do inibidor γCdcPLI e outros inibidores de PLA2s obtidas do banco de dados de proteínas do BLAST (PubMed-Medline) e do Uniprot: Códigos de acesso: 86519 = γCdcPLI / Q90358.1 = CNF / P60591.1 = LNF1 / P60592.1 = LNF2 / ABV91326.1 = γ inhibitor phospholipase A2 (Bothrops alternatus) / ABV91334.1 = γ inhibitor phospholipase A2 (Bothrops moojeni). O símbolo (*) indica os resíduos de aminoácidos iguais com outras sequências; (.) indica

68

mudança de resíduos de aminoácidos com natureza diferente; (:) indica mudança de resíduos de aminoácidos de mesma natureza; retângulo rósea destaca o sítio de glicosilação dos inibidores (Asn178-Ala179-Thr180); retângulo azul destaca o heptapepitídeo comum em inibidores de PLA2 supostamente relacionado com mecanismo de ação; resíduos em vermelho destacam os aminoácidos diferentes ao inibidor de uma subespécie de Crotalus durissus terrificus (CNF).

69

4.3.2 Dicroísmo circular (CD)

4.3.2.1 Análises de CD do inibidor

A Figura 11 representa o espectro de CD do inibidor γCdcPLI isolado do

soro de C. d. collilineatus, em uma concentração da amostra de 340 µg.ml-1.

Figura 11: Espectro de Dicroísmo Circular do inibidor γCdcPLI.

De acordo com os resultados e análises realizadas, o espectro obtido

apresenta uma mistura de alfas-hélices e folhas beta pregueadas em sua

estrutura secundária, com maior quantidade de folhas beta, por conta do valor

mínimo de [θ] obtido a 217 nm, mas com relativa incidência de alfas hélices por

haver uma grande área da curva abaixo dos -8.500 [θ] até por volta dos 208 nm,

indicando uma mistura desses dois elementos de estrutura secundária. Isso pode

ser verificado através da desconvolução da curva obtida, que mostrou a presença

de aproximadamente 22% de alfas hélices e 29% de folhas beta.

4.3.2.2 Complexo Inibidor – Enzima

O espectro de CD do γCdcPLI, isolado do soro de C. d. colillineatus

incubado a 37ºC por 30 minutos com a BpPLA2-TXI ácida de B. pauloensis na

70

proporção 1:1 é demonstrado na Figura 12. A concentração total da amostra

medida foi de 700 µg.ml-1.

Figura 12: Espectro obtido do Dicroísmo Circular mostrando o perfil do inibidor sozinho em preto (γCdcPLI) e o perfil do complexo inibidor/PLA2 ácida em vermelho (γCdcPLI +BpPLA2-TXI).

Pode-se observar que a incubação do γCdcPLI com a BpPLA2-TXI ácida

de B. pauloensis não provocou nenhuma mudança significativa na estrutura

secundária do inibidor. A inibição da BpPLA2-TXI ácida ocasionada pelo inibidor

γCdcPLI não resultou em sua modificação estrutural.

4.3.3 Análises de espalhamento de luz dinâmico

Os resultados obtidos por esta técnica demonstraram que o inibidor possui

uma tendência a oligomerização diante das condições experimentais avaliadas,

tais como variação de temperatura ou quando o mesmo foi dissolvido em H2O ou

em PBS. O inibidor γCdcPLI quando em H2O apresentou aumento do número de

monômeros na estrutura quaternária de acordo com o aumento da temperatura.

Em 4oC ele se comportou como dímero e a temperatura de 37oC apresentou 32

γCdcPLI γCdcPLI + BpPLA2-TXI

71

monômeros. Nesta condição a massa molecular aproximada foi de 780 kDa

(Tabela 3).

Os resultados dos ensaios de DLS em H2O, também demonstraram que o

inibidor tem uma tendência a oligomerização em estequiometria par, com dímero,

tetrâmero, octâmetro e assim por diante (Tabela 3). Em solução salina

tamponada (PBS), o inibidor também apresentou tendência a oligomerização,

porém de uma forma diferente quando em água, chegando a formar 14

monômeros a 37ºC (Tabela 4). Estes resultados obtidos podem ser explicados

por influência das condições delineadas para os experimentos.

Tabela 3. Dados de Espalhamento Dinâmico de Luz para γCdcPLI, cujas medidas foram feitas com a amostra diluída em água.

T °C R

(nm)

MM

(kDa)

Pd

(%)

m

(%)

Corformação oligomérica

estimada

4 oC 3,1 46 0 99,8 Dímero

10 oC 4,1 93 18,3 98,7 Tetrâmero

18 oC 5,1 197 13,8 99,4 Octâmero

25 oC 7,3 350 0 98,5 16 (monômeros)

32 oC 8,7 536 19,8 93 24 (monômeros)

37,5°C 10,2 780 18,2 95,7 32 (monômeros)

R = raio hidrodinâmico (nm); MM = massa molecular (kDa); Pd = polidispersividade (%); m = massa (%) Tabela 4. Dados de Espalhamento Dinâmico de Luz para γCdcPLI, cujas medidas foram feitas com a amostra diluída em tampão PBS 1x (150mM).

T °C R (nm) MM

(kDa)

Pd

(%)

M

(%)

Corformação oligomérica

estimada

4 oC 3 44 0 97,7 Dímero

10 oC 3,7 72 13,2 97 Trímero

18 oC 4,6 111 13,3 98 Pentâmero

25 oC 5,3 163 11,2 97,6 7x (monômeros)

32 oC 7 324 0 93,2 14x (monômeros)

37,5oC 7 321 18,3 96,3 14x (monômeros)

72

R = raio hidrodinâmico (nm); MM = massa molecular (kDa); Pd = polidispersividade (%); m = massa (%) 5.0 Discussão

Sabe-se da existência de inibidores de PLA2 no sangue de diversas

espécies de serpentes (LIZANO; DOMONT; PERALES, 2003; MARCUSSI et al.,

2007). A presença de inibidores nestes animais tem sido associado à resistência

inata aos efeitos deletérios da peçonha (FAURE et al., 2000), agindo como auto

proteção contra as PLA2 que poderiam alcançar o sistema circulatório (LIZANO;

DOMONT; PERALES, 2003). Estes inibidores são classificados como α, β e γ de

acordo com suas diferenças estruturais (FORTES-DIAS, 2002; MARCUSSI et al.,

2007).

Dessa forma, este trabalho teve como objetivo o isolamento e a

caracterização química, estrutural e funcional de um novo inibidor do tipo γ

presente no soro de Crotalus durissus collilineatus (Cdc). Inicialmente foi avaliado

o potencial inibitório do soro de Cdc sobre a atividade PLA2 de diferentes

peçonhas de serpentes (resultados não apresentados). De acordo com estes

resultados obtidos foi confirmada a presença de inibidores de PLA2 no soro de

Cdc.

Para a purificação do inibidor utilizou-se uma cromatografia de troca-iônica

em gel de Q-Sepharose Fast Flow, onde foram obtidas seis frações (Q1 a Q6)

(Figura 1). Em seguida, a fração de interesse (Q4), foi submetida a uma nova

cromatografia em coluna de afinidade como o já descrito por outros autores

(LIZANO et al., 2000; SOARES et al., 2003, OLIVEIRA et al., 2008). Esta coluna

foi previamente preparada pelo acoplamento a resina de uma PLA2 PLA2-símile

Lys49 BnSP-7 isolada da peçonha de B. pauloensis (RODRIGUES et al., 1998 e

SOARES et al., 2000). Neste segundo passo cromatográfico obtivemos o inibidor

de PLA2, denominado de γCdcPLI (Figura 3), o qual representou 2,6% das

proteínas totais presentes no soro de Cdc (Tabela 1). A combinação da técnica

utilizada na obtenção do soro de Cdc e os passos cromatográficos escolhidos

garantiram o bom rendimento apresentado. Em contrapartida, o rendimento na

purificação de outros inibidores apresenta baixo rendimento como citado

73

brevemente por Santos-Filho (2012) na purificação de um inibidor do plasma de

Bothrops alternatus.

Com o intuito de verificar a pureza e de se obter, essa proteína para

proseguir com os estudos de caracterização bioquímica, estrutural e funcional, as

amostras do γCdcPLI foram submetidas a cromatografias em HPLC-RP em

coluna C4 (Figura 4A). Este procedimento preservou as características funcionais

da proteína, visto que a inibição permaneceu inalterada. Diferentemente do

inibidor CNF (FORTES-DIAS et al., 1991) que perde a atividade após ser

submetido à cromatografia em fase reversa.

A massa molecular do γCdcPLI determinada por MALDI-TOF foi 22,34 kDa

(Figuras 5). A diferença entre as massas moleculares determinadas por SDS-

PAGE e espectrometria de massas pode ser explicada pela maior precisão dessa

última técnica, refletindo melhor a massa molecular real da proteína. A massa

molecular do γCdcPLI determinada por MALDI-TOF está próxima à de alguns

inibidores tipo γ já isolados, a saber: inibidor de PLA2 CNF de Crotalus durissus

terrificus (20,05 kDa), LNF1 (20,07 kDa) e LNF2 (20,05 kDa) de Lachesis muta

muta (ESTEVÃO-COSTA et al., 2008).

A estrutura primária do γCdcPLI foi parcialmente determinada pelo

sequenciamento de fragmentos obtidos pela digestão com a tripsina, utilizando o

sequenciamento por degradação de Edman e por MS/MS (Figura 8 e 9). A

sequência parcial demonstrou alta similaridade com outros inibidores do tipo γ.

Sendo assim, foi possível determiná-lo como o primeiro inibidor de PLA2 do tipo γ

presente no soro de Crotalus durissus collilineatus.

Os inibidores do tipo γ encontrados na literatura demonstram sítios de N-

glicosilação em sua estrutura primária. Geralmente este sítio de glicosilação é

encontrado em asparaginas na sequência Asn-Xaa-Ser/Thr, sendo que Xaa é

representado por qualquer aminoácido com exceção da Prolina (ESTEVÃO-

COSTA et al., 2008; SHIRAI et al., 2009). Essa sequência foi encontrada no

sequenciamento do γCdcPLI, com a sequência Asn-Ala-Thr na posição 178,

como destacado na Figura 10 por um retângulo azul. Testes adicionais deverão

ser realizados com o intuito de confirmar a presença deste sítio de glicosilação no

inibidor.

74

Adicionalmente, em relação à estrutura primária, os inibidores tipo y

apresentam uma região comum responsável pelo reconhecimento de PLA2, o

decapeptídeo (107PGLPLSLQNG116), o qual foi primeiramente observado na

estrutura do P-PBIII isolado do plasma da serpente Python reticulates (THWIN et

al., 2002). Parte desta sequência 105PGEPLSK112 também está presente na

estrutura primária do γCdcPLI, confirmando a identidade deste novo inibidor

(Figura 10). A estrutura primária do γCdcPLI também demonstrou alguns

resíduos de aminoácidos diferentes quando comparados com a sequência do

inibidor CNF isolado do plasma de Crotalus durissus terríficos. Os resíduos Ser22

e Glu107 em γCdcPLI diferem do CNF por conter nesta posição resíduos de Cys

e Phe nestas posições, possivelmente outras diferenças surgirão no

sequenciamento completo deste inibidor.

Os estudos de dicroísmo circular revelaram que o inibidor γCdcPLI,

apresenta uma mistura de alfas-hélices (22%) e folhas beta (29%), verificado

através da desconvolução da curva obtida (Figura 11). Este resultado corrobora a

alta similaridade da estrutura primária entre os inibidores do tipo γ, considerando

o padrão da estrutura secundária, com folhas-β e alfa-hélice (ESTEVÃO-COSTA

et al., 2008). As análises de CD do complexo γCdcPLI + BpPLA2-TXI revelaram

nenhuma alteração na conformação da estrutura secundária das proteínas

envolvidas (Figura 12), este resultado também foi verificado para diferentes

classes de inibidores já isolados e estruturalmente caracterizados (OLIVEIRA et

al., 2008; SANTOS-FILHO et al., 2011).

Os inibidores são conhecidos por formarem oligômeros com diferentes

números de cadeias monoméricas, tendo relatos de inibidores do tipo γ com dois

a seis monômeros em sua estrutura (OHKURA et al., 1999; ESTEVÃO-COSTA et

al., 2008). O γCdcPLI em estudos de espalhamento de luz dinâmico demonstrou

um padrão de oligomerização deferente do que o até então é descrito na

literatura, o que pode ser reflexo das condições experimentais (Tabelas 3 e 4).

No entanto, novos experimentos utilizando outras técnicas biofísicas, tal como

espalhamento de raios X a baixo ângulo deverão ser conduzidos para se obter a

conformação oligomérica da proteína.

A massa molecular aparente determinada por estudo de DLS indicaram

que na temperatura de 37°C a proteína apresentou uma massa molecular

75

aparente de 780 kDa em água e 321 kDa em PBS. Porém, atualmente os dados

descritos na literatura indicam uma massa molecular variando de 90 a 130 kDa,

compostos por 3-6 subunidades não covalentes (OHKURA et al., 1999;

ESTEVÃO-COSTA et al., 2008). Novos testes deverão ser realizados para

confirmação da massa da proteína nativa.

A capacidade inibitória do γCdcPLI frente à diferentes PLA2 reforçou uma

característica marcante dos inibidores dessa classe. Estes apresentam um

domínio responsável pelo reconhecimento da região de ligação do Ca2+ de PLA2,

independente da carga que a PLA2 possua. Tal característica compartilhada pela

classe garante o alto espectro de inibição em todos os grupos de PLA2 (IA, IIA e

IIIA) (DUNM, 2001).

Os estudos de inibição da atividade catalítica de PLA2 foram conduzidos

utilizando-se duas fosfolipases A2, sendo uma ácida (BpPLA2-TXI) e outra básica

(BthTX-II), ambas Asp49. Pôde-se observar uma dose-dependência dos valores

de inibição, com valores máximos de inibição na proporção 1:5 (PLA2:γCdcPLI,

m/m) (Tabela 2). Estes resultados também sugerem que o inibidor γCdcPLI é

capaz de interagir com PLA2s Asp-49 ácidas ou básicas.

O γCdcPLI também foi capaz de inibir a citoxicidade sobre células tEnd e a

miotoxicidade em músculo gastrocnêmio de camundongos induzidas pela PLA2

Lys-49 BnSP-7, no entanto para as duas atividades a inibição não foi dose

dependente (Figuras 6 e 7). Além disso, o inibidor demonstrou ser eficiente

mesmo em pequenas razões, como 1:0,5 (BnSP-7: γCdcPLI; m/m), com inibição

significativa de aproximadamente 38%. Este dado sugere que deve haver uma

razão molar ótima de interação entre a BnSP-7 e o inibidor γCdcPLI que seja

responsável pela inibição das atividades citotóxica e miotóxica, contudo ensaios

adicionais devem ser conduzidos para confirmar essa hipótese.

Analisados em conjunto, aparentemente o inibidor γCdcPLI apresenta

melhor inibição sobre as atividades induzidas por PLA2 Asp49 do que as

induzidas por PLA2 PLA2-símile Lys49, característica comum da classe dos

inibidores γ como descrito por Oliveira e colaboradores (2011). Assim, o

mecanismo de inibição pode estar relacionado a diferentes sítios na estrutura do

inibidor que interajam de forma diferenciada para o sítio catalítico e os sítios

citotóxicos e ou miotóxicos de PLA2s.

76

6.0 Conclusão

Neste trabalho foi isolado um novo inibidor de PLA2 do tipo γ presente no

soro de Crotalus durissus collilineatus, denominado γCdcPLI. Esta proteína

possui grande similaridade com outros inibidores já descritos e depositados em

bancos de dados, em especial o CNF e o LNF1 e 2, com diferenças em alguns

aminoácidos da cadeia polipeptídica. O γCdcPLI demonstrou potencial inibitório

frente diferentes atividades induzidas por PLA2, como enzimática, citotóxica e

miotóxica. Dessa forma, estudos que demonstram os aspectos estruturais e

funcionais de novos inibidores de PLA2s poderão fornecer subsídios para

métodos alternativos na terapêutica do envenenamento ofídico ou no tratamento

de desordens relacionadas à atividades de PLA2s.

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