TESIS COMPLETA-nuevo orden
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Abreviaturas 1 ABREVIATURAS 8-OH-G 8-oxo-7,8-dihidroxi-2´-deoxiguanosina ADN ácido desoxiribonucleico ADNc ácido desoxiribonucleico complementario APS amonio persulfato ARE elemento de respuesta a antioxidantes ARN ácido ribonucleico ARNm acido ribonucleico mensajero ATP adenosina 5´-trifosfato BSA albúmina sérica bovina C9 clone 9 CDNB 1-cloro-2,4- dinitrobenceno CHX cicloheximida COX ciclooxigenasa dBrU 5-bromo-2´-deoxiuridina DCF diclorofluoresceína DCF-DA diclorofluoresceína diacetato DCIP 2,6-dicloroindofenol DME enzimas metabolizadoras de drogas DMSO dimetil sulfóxido dT deoxitimidina EDTA ácido etilen diamino tetraacético EGTA ácido bis(β-aminoetil eter) N,N,N´,N´-tetraacético FAB región de unión al antígeno GPx glutatión peroxidasa GR glutatión reductasa GSH glutatión reducido GSSG glutatión oxidado GST glutatión-S-transferasa HEPES N-(2-hidroxietil) piperazina-N´-(2 ácido
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Abreviaturas
1
ABREVIATURAS
8-OH-G 8-oxo-7,8-dihidroxi-2´-deoxiguanosina
ADN ácido desoxiribonucleico
ADNc ácido desoxiribonucleico complementario
APS amonio persulfato
ARE elemento de respuesta a antioxidantes
ARN ácido ribonucleico
ARNm acido ribonucleico mensajero
ATP adenosina 5´-trifosfato
BSA albúmina sérica bovina
C9 clone 9
CDNB 1-cloro-2,4- dinitrobenceno
CHX cicloheximida
COX ciclooxigenasa
dBrU 5-bromo-2´-deoxiuridina
DCF diclorofluoresceína
DCF-DA diclorofluoresceína diacetato
DCIP 2,6-dicloroindofenol
DME enzimas metabolizadoras de drogas
DMSO dimetil sulfóxido
dT deoxitimidina
EDTA ácido etilen diamino tetraacético
EGTA ácido bis(β-aminoetil eter) N,N,N´,N´-tetraacético
FAB región de unión al antígeno
GPx glutatión peroxidasa
GR glutatión reductasa
GSH glutatión reducido
GSSG glutatión oxidado
GST glutatión-S-transferasa
HEPES N-(2-hidroxietil) piperazina-N´-(2 ácido
Abreviaturas
2
etanosulfónico)
HGF factor de crecimiento hepático
HP hepatocitos primarios
HRP peroxidasa de rábano picante
hs horas
kDa kilo Dalton
LDH lactato deshidrogenasa
MEM medio mínimo esencial
min minutos
NAD+ nicotinamida adenina dinucleótido oxidado
NADH nicotinamida adenina dinucleótido reducido
NADP+ β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
oxidado
NADPH β-nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
reducido
nm nanometros
NQO1 NADPH quinona oxidoreductasa
Nrf2 factor de transcripción relacionado con NF-E2 2
O2˙⎯ radical superóxido
˙OH radical hidroxilo
PBS tampón fosfato salino
PVDF fluoruro de polivinilideno
R resveratrol, trans-3,5,4´-trihidroxiestilbeno
ROO˙ radical peroxilo
ROOH hidro peróxido
ROS especies reactivas del oxígeno
rpm revoluciones por minuto
SDS dodecil sulfato de sodio
SOD superóxido dismutasa
tBHQ tert-butil hidroquinona
tBHP tert-butil hidroperóxido
Abreviaturas
3
TEMED N,N,N´,N´-tetrametiletilendiamina
U unidades
UAF unidades arbitrarias de fluorescencia
UI unidades internacionales
UV ultra violeta
V voltios
Abreviaturas
4
3
Introducción
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INTRODUCCIÓN 1. Fisiología del hígado
El hígado, el mayor órgano del cuerpo, representa el 2,5 % del peso
corporal total de un adulto. Recibe el 25 % del gasto cardíaco por la vena porta
hepática y la arteria hepática. La vena porta hepática lleva al hígado los
nutrientes y vitaminas absorbidos en el aparato gastrointestinal, y el hígado los
recoge, almacena y distribuye. Este órgano desempeña una función importante
en el mantenimiento de los niveles normales de glucosa en plasma y regula la
cantidad de lípidos en la sangre mediante la secreción de las lipoproteínas de
muy baja densidad. Muchas de las proteínas circulantes son sintetizadas en el
hígado. Además, este órgano está especialmente preparado para metabolizar
fármacos y sustancias tóxicas que recoge de la circulación portal También
funciona como un órgano excretor de pigmentos biliares, colesterol y fármacos.
Finalmente, también realiza importantes funciones endocrinas (Rhodes RA y
Tanner GA, 2001).
Los hepatocitos son células altamente especializadas. En la mayoría de los
libros de texto el termino “célula parenquimática”, usada en relación con el
hígado, se refiere al hepatocito, mientras que las células restantes se clasifican
como no parenquimáticas. Los hepatocitos representan el 60-65% de las
células del hígado, pero debido a que son más grandes que las otras células,
ocupan el 80% del volumen del órgano (Weibel ER et al., 1969; Greengard O
et al., 1972; Blouin A et al., 1977; Drochmanss P et al., 1978). Los hepatocitos
están organizados en una serie de platos ramificados, anastomosados y
perforados, para formar un laberinto entre el cual corren los sinusoides (Leeson
T y Leeson C, 1970). Generalmente los platos tienen una célula de grosor,
aunque una sola célula está rodeada por muchas otras. Los canalículos biliares
normalmente están revestidos por dos hepatocitos y separados del espacio
pericelular por uniones de alta resistencia, que son impermeables y evitan la
mezcla del contenido del canalículo biliar con el del espacio pericelular. La bilis
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formada en los canalículos drena en una serie de túbulos y conductos, que
finalmente se unen al conducto pancreático y entran en el duodeno a través de
esfínter de Oddi.
El espacio pericelular, espacio entre dos hepatocitos, se continúa con el
espacio perisunusoidal. El espacio perisinusoidal, también conocido como
espacio de Disse, está separado del sinusoidal por las células sinusoidales.
Los hepatocitos poseen numerosas proyecciones, a manera de dedo de
guante, que se extienden en el espacio perisinusoidal, incrementando
enormemente la superficie de contacto de los hepatocitos con dicho espacio.
La mayoría de las células sinusoidales son células endoteliales. A diferencia
de las del sistema circulatorio, las células endoteliales hepáticas carecen de
membrana basal. Además, poseen placas parecidas a un tamiz que permiten
el fácil intercambio de material entre el sinusoide y el espacio perisinusoidal.
Observaciones al microscopio electrónico han revelado que partículas tan
grandes como los quilomicrones (100-500 nm de diámetro) pueden atravesar
dichas placas. Aunque la barrera entre los espacios perisinusoidal y sinusoidal
parece bastante permeable, en realidad tiene ciertas propiedades de tamiz. Por
ejemplo, la concentración proteica de la linfa hepática, que se considera
procede del espacio perisinusoidal, es menor que la del plasma.
Las células de Kupffer también revisten los sinusoides hepáticos. Son
macrófagos residentes del sistema macrofágico-monocítico fijo que eliminan de
la circulación, mediante endocitosis, material indeseado (ej.: bacterias,
partículas víricas, complejos de fibrinógeno-fibrina, eritrocitos deteriorados e
inmunocomplejos).
Algunas células sinusoidales contienen gotas de lípidos en el citoplasma.
Son células almacenadotas de grasa o células de Ito. Las gotas de lípidos
contienen vitamina A.
Estas células almacenadoras de grasa están asociadas estrechamente a
fibras de colágeno y semejan a los fibroblastos. Es posible que estén
implicadas en la fibrosis patológica del hígado. Las células sinusiodales
representan alrededor del 40% de número total de células hepáticas, pero
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menos del 10% del volumen del hígado. El resto del volumen del hígado está
compuesto de espacio extracelular, tanto sinusoidal como perisinusoidal
(Rhodes RA y Tanner GA, 2001).
El órgano entero está permeado por un esqueleto de tejido fibroconectivo
compuesto de fibras de colágeno. Dentro de cada lóbulo hepático hay una fina
red de fibras reticulares y colagenosas alrededor de las sinusoides y dentro de
los espacios perisinusoidales. Estas fibras están incluidas en una sustancia
extracelular consistente en una mezcla compleja de proteoglicanos, el más
común contiene sulfato de heparán o sulfato de condroitina (Leeson T y
Leeson C, 1970). La estructura del hígado se representa en la figura 1.
1.1 Irrigación sanguínea del hígado
La vena porta hepática suministra el 70-80 % del flujo sanguíneo hepático;
el resto procede de la arteria hepática. La sangre de la vena porta hepática
está pobremente oxigenada, mientras que la de la arteria hepática está muy
oxigenada. La vena porta se ramifica sucesivamente hasta formar pequeñas
vénulas que desembocan en los sinusoides. La arteria hepática se ramifica
Figura 1: Diagrama de la estructura del hígado
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para formar arteriolas y después capilares que también drenan en los
sinusoides. Por consiguiente, los sinusoides hepáticos pueden considerarse
capilares especializados. Como ya se ha mencionado, los sinusoides hepáticos
son extremadamente porosos y permiten el intercambio rápido de material
entre el espacio perisinusoidal y el sinusoide. Los sinusoides drenan en las
venas centrales, que posteriormente se reúnen formando la vena hepática, que
desemboca en la vena cava inferior (Rhodes RA y Tanner GA, 2001).
2. Cultivo de hepatocitos primarios 2.1 Preparación de hepatocitos aislados a partir de hígado de rata
El punto de inflexión en el desarrollo de métodos para la preparación de
hepatocitos aislados intactos se produjo con la demostración del valor de la
colagenasa como herramienta para la separación de células hepáticas
(Howard RB et al., 1967). Dos años más tarde se introdujo la técnica de
perfusión del hígado con colagenasa como medio para incrementar de gran
manera la obtención de hepatocitos (Berry MN y Friend DS, 1969). Desde
entonces se han descrito varias modificaciones del método de perfusión con
colagenasa, pero en casi todos los casos se han dado poca o ninguna
explicación de los cambios realizados, y por lo tanto no son fácilmente
evaluables. Las modificaciones incluyen alteración en la composición del medio
de perfusión o la duración de la perfusión, remoción del hígado del animal
previo a la perfusión, o cambios en los procedimientos del lavado celular.
Cualquier método de preparación de hepatocitos aislados que utilice
colagenasa tendrá dos requerimientos conflictivos. Las células deben ser
expuestas a una muy baja concentración de Ca2+ para permitir la ruptura de los
desmosomas hepáticos. Por otra parte, la actividad de la colagenasa requiere
la presencia de Ca2+. Este conflicto se ha resuelto de dos maneras,
generalmente nombradas procesos de “una etapa” y de “dos etapas”. El
proceso de una etapa, que esencialmente sigue el método de Berry y Friend
(1969), con modificaciones (Berry MN, 1974), utiliza la ventaja de la
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circunstancia fortuita de que la concentración de Ca2+ necesaria para una
adecuada actividad de la colagenasa es sustancialmente menor que el
requerido para mantener la integridad de los desmosomas. En el proceso de
dos etapas se permite que los desmosomas se rompan irreversiblemente
durante una etapa de pre-perfusión del hígado con medio libre de Ca2+ por lo
menos durante 10 minutos, y luego se agrega colagenasa y Ca2+ en
concentraciones fisiológicas o suprafisiológicas en la solución de perfusión
(Seglen PO, 1972; , 1976). 2.2 Limitaciones de los sistemas de cultivo simple
Los primeros sistemas de cultivo de hepatocitos involucraban la siembra de
células aisladas con suero sobre plástico seguido por un mantenimiento en
medio de cultivo como el E de Williams, várias formulaciones de Waymouth o
Leibovitz L-15. Modificaciones posteriores incluyen el recubrimiento de las
placas con colágeno de tipo I que posibilita un mejor pegado y una mayor
retención de las células en las placas (Bissell DM et al., 1978). La omisión del
agregado de suero al medio ayuda a la preservación de las funciones
específicas del hígado (Reid LM et al., 1986), mientras que la adición de
insulina y dexametasona al medio sin suero mejora el pegado y la preservación
de las células en cultivo, modulan la organización del citoesqueleto y retardan
los cambios en los niveles de varias proteínas hepáticas (Laishes BA y
Williams GM, 1976; Colbert RA et al., 1985; Marceau N et al., 1986). El
mantenimiento de las células en placas recubiertas de colágeno en medio con
insulina y dexametasona provee un sistema simple de cultivo, que aún se
utiliza con variaciones menores, para examinar una variedad de cuestiones
sobre la función de los hepatocitos en períodos experimentales de unos pocos
días.
En dichas condiciones de cultivo las células inicialmente adquieren una
morfología aplanada sobre el sustrato pero se despegan de las placas luego de
una o dos semanas. Está bien establecido que las células sufren grandes
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cambios con el tiempo en el patrón de expresión génica y la función
diferenciada. La actividad de algunas enzimas no específicas del hígado como
la lactato deshidrogenasa (LDH) o la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa cambia
poco, pero muchas funciones específicas del hígado disminuyen rápidamente
en dos o tres días. Los cambios incluyen una reducción en la síntesis de
proteínas séricas como la albúmina; caídas progresivas en los niveles de las
enzimas gluconeogénicas como la glucosa-6-fosfatasa; una disminución en
varios citocromos P-450, citocromo P-450 NADPH reductasa, citocromo b, y
actividades metabolizantes de drogas; una disminución en la expresión de
isozimas características del hígado adulto (ej.: piruvato quinasa L, aldolasa B) y
un incremento en la expresión de isozimas típicas de células no hepáticas o de
hígado fetal (piruvato quinasa M2, aldolasa A) y de otras proteínas que se
encuentran en el hígado fetal como la α-fetoproteína y la γ-glutamil
transpeptidasa. Al mismo tiempo hay un incremento en la expresión de genes
para algunas proteínas del citoesqueleto como la actina y la tubulina y la
proteína extracelular, colágeno tipo I (Sirica AE y Pitot HC, 1980; Guguen-
Guillouzo C y Guillouzo A, 1983; Reid LM et al., 1986; Schuetz EG et al.,
1988). Es una sobre simplificación el considerar estos cambios como una
pérdida de diferenciación o fetalización de los hepatocitos. La expresión de una
gran variedad de enzimas del hígado depende de hormonas in vivo y puede
ser mantenida cerca de los niveles normales bajo condiciones de cultivo
simples si se agrega la hormona adecuada. Sin embargo parecen haber
algunos cambios fundamentales en el patrón de expresión génica en cultivos.
Particularmente, el declive de las funciones específicas del hígado refleja una
disminución pronunciada en la transcripción de los genes relevantes (Clayton
DF y Darnell JE, Jr., 1983).
2.3 Función celular en cultivo con respecto a la densidad
La observación a principios de 1980 de que la densidad celular en cultivo
tiene un papel significativo en la modulación de la función de hepatocitos
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adultos sobre sustratos simples a establecido dos ramas de estudio
mayoritarias. Por un lado, la observación de que las células sembradas en baja
densidad sobre colágeno u otros sustratos proteicos exhiben al menos un
crecimiento limitado en presencia de factores de crecimiento ha sentado la
base para la evolución de condiciones mejoradas para estudios del
crecimiento. Por otro lado, la retención de las células en colágeno y la
preservación de niveles elevados de enzimas específicas del hígado esta
favorecida por el mantenimiento de las células en monocapas confluentes con
alta densidad celular (Nakamura T y Ichihara A, 1985; Jauregui HO et al.,
1986). Los efectos de la alta densidad celular en el retraso de la pérdida de
algunas funciones diferenciadas y en minimizar la acumulación de ARNm para
proteínas del citoesqueleto puede ser acentuado si los hepatocitos se
mantienen en un gel de colágeno semimovil en lugar de un film proteico
(Michalopoulos G y Pitot HC, 1975; Ben-Ze'ev A et al., 1988). Dichos efectos
pueden deberse en parte a la forma celular más cuboide y menos aplanada a
alta densidad, particularmente sobre geles (Ben-Ze'ev A et al., 1988). Sin
embargo, Nakamura e Ichihara (1985) concluyeron que el factor más
importante sobre los efectos recíprocos de la densidad sobre el crecimiento y
la diferenciación es el contacto entre los hepatocitos.
Como se observa al microscopio electrónico, los contactos entre los
hepatocitos incluyen uniones gap y uniones estrechas con uniones intermedias
asociadas y desmosomas (Hughes RC y Stamatoglou SC, 1987). Cuando se
siembran hepatocitos disgregados en cultivo en alta densidad, los hepatocitos
reestablecen tanto las asociaciones cercanas así como las más débiles con 3 a
6 vecinas, con la reformación de los desmosomas y uniones estrechas
(Chapman GS et al., 1973; Wanson JC et al., 1977). En cultivos de ratón una
alta proporción de los hepatocitos rápidamente reestablecen las uniones gap
pero la extención de esta comunicación declina luego de 2 días (Ruch RJ y
Klaunig JE, 1988). Es por lo tanto posible que la reformación de uniones
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12
estrechas y desmosomas pueda estar involucrada en los efectos de la
densidad en cultivos.
2.4 Contribución de medios complejos en el mantenimiento de la función diferenciada
Con intención de preservar el estado diferenciado en hepatocitos, la
utilización de alta densidad celular como mucho demora pero no previene los
cambios en la expresión génica observada con sustratos y medios
relativamente simples. Se han probado una variedad de modificaciones a este
sistema de cultivo básico. Una de estas modificaciones involucra el desarrollo
de medios de cultivo más complejos con una variedad de hormonas, nutrientes
y trazas de elementos. Para hepatocitos de primates, el uso de medio complejo
parece que es suficiente para alcanzar una excelente preservación de
funciones diferenciadas durante largos períodos de tiempo (Jacob JR et al.,
1989). En cambio, para hepatocitos de rata, el medio complejo solo ha resuelto
parte del problema de mantener las funciones normales de los hepatocitos
(Berry M et al., 1991).
Hay una larga y confusa literatura sobre la importancia de la composición
del medio y parece claro que componentes individuales en el medio pueden
ejercer efectos positivos en una función diferenciada sin tener efecto o efectos
negativos sobre otras. Para la preservación de diferentes funciones como la
síntesis de albúmina, el mantenimiento de ligandina o los niveles de proteínas
de las uniones gap, parecen ser importantes diferentes hormonas y nutrientes
(Spray DC et al., 1987). Está claro que las interacciones entre nutrientes u
hormonas pueden producir efectos bastantes diferentes a la suma de sus
acciones individuales (Dich J et al., 1988).
Más allá de sus complejidades se han desarrollado algunos medios
enriquecidos con nutrientes y suplementados con hormonas que tienen
amplios efectos beneficiosos en la sobrevida y función diferenciada durante
tiempos prolongados. Observaciones recientes sugieren que un balance
cuidadoso en las concentraciones de dexametasona, insulina y glucagón
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puede mantener cultivos de hepatocitos de rata durante 2 o 3 semanas con
preservación de algunas actividades enzimáticas casi normales y la
preservación parcial de otras (Dich J et al., 1988) preservando altos niveles de
transcripción de albúmina por hasta 4 días (Lloyd CE et al., 1987).
3. El estrés oxidativo
Las causas de las propiedades tóxicas del oxígeno no estaban claras hasta
la publicación de la teoría de los radicales libres del oxígeno en 1954
(Gerschman R et al., 1954), la cual explica que la toxicidad del oxígeno es
debida a las formas parcialmente reducidas de este. Posteriormente, se
propuso el concepto de que los radicales libres desempeñan un papel
importante en el proceso de envejecimiento (Harman D, 1956).
Los radicales libres del oxígeno, o más generalmente, especies reactivas
del oxígeno (ROS), son productos del metabolismo normal de las células. Se
sabe que tienen una función dual como especies beneficiosas y perjudiciales.
Los efectos beneficiosos de las ROS se producen a concentraciones bajas e
involucran funciones fisiológicas, por ejemplo, en defensa contra agentes
infecciosos y en la función de varios sistemas de señalización celular. Otro
ejemplo de función beneficiosa de las ROS es la inducción de una respuesta
mitogénica (Valko M et al., 2006).
El efecto tóxico de los radicales libres que produce daño biológico se
denomina estrés oxidativo (Kovacic P y Jacintho JD, 2001). Esto ocurre en los
sistemas biológicos cuando hay una sobreproducción de ROS por una parte y
una deficiencia en antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos por otra. Dicho
de otra manera, el estrés oxidativo resulta de las reacciones metabólicas que
utilizan oxígeno e imponen una alteración en el equilibrio entre las reacciones
de oxidación y reducción en los organismos vivos. El exceso de ROS puede
dañar lípidos celulares, proteínas y el ADN inhibiendo o alterando su función
normal. Debido a esto, el estrés oxidativo ha sido implicado en una gran
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variedad de enfermedades humanas así como también en el envejecimiento. El
delicado balance entre los efectos beneficiosos y los nocivos de los radicales
libres es un aspecto muy importante de los organismos vivos y se logra por un
mecanismo denominado “regulación redox”. El proceso de “regulación redox”
protege a los organismos vivos de varios tipos de estrés oxidativo y mantiene
la “homeostasis redox” a través del control del estatus redox in vivo (Droge W,
2002).
3.1 Especies reactivas del oxígeno
Los radicales libres pueden ser definidos como moléculas o fragmentos
moleculares que contienen uno o más electrones desapareados en orbitales
atómicos o moleculares (Halliwell B y Gutteridge J, 1999). Este o estos
electrones desapareado(s) generalmente le otorgan un grado considerable de
reactividad a estos radicales. Los radicales derivados del oxígeno representan
la clase más importante que se genera en los organismos vivos (Miller DM et
al., 1990). El oxígeno molecular (dioxígeno) tiene una configuración electrónica
que lo hace en si mismo un radical. La adición de un electrón al oxígeno
molecular genera el anión radical superóxido (O2˙¯) (Miller ER, 3rd et al.,
2005). El anión superóxido, generado ya sea a través de procesos metabólicos
o luego de la “activación” del oxígeno por irradiación, es considerada la ROS
“primaria”, y puede interactuar con otras moléculas para generar ROS
“secundarias”, por acción directa o más comúnmente a través de procesos
catalizados por enzimas o metales (Valko M et al., 2005).
La producción de superóxido ocurre mayoritariamente dentro de la
mitocondria (Cadenas E y Sies H, 1998). La cadena de transporte de
electrones mitocondrial es la fuente principal de ATP en las células de los
mamíferos y por lo tanto es esencial para la vida. Durante la transducción de
energía, un pequeño número de electrones permean hacia el oxígeno
prematuramente, formando el radical superóxido, el cual ha sido implicado en
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15
la patofisiología de una variedad de enfermedades (Valko M et al., 2004;
Kovacic P et al., 2005).
El radical hidroxilo, ˙OH, es la forma neutral del ión hidróxido. Éste radical
tiene una alta reactividad, haciéndolo muy peligroso con una vida media muy
corta in vivo de aproximadamente 10-9s (Pastor N et al., 2000). Por lo tanto,
cuando se produce in vivo el ˙OH reacciona cerca del sitio en el que se formó.
El estado redox celular está muy relacionado a una pareja redox de hierro (y
cobre) y se mantiene dentro de límites fisiológicos muy estrictos. Se ha
sugerido que la regulación del hierro asegura que no haya hierro intracelular
libre; sin embargo, in vivo, bajo condiciones de estrés, un exceso de
superóxido libera hierro a partir de las moléculas que lo secuestran (Liochev SI
y Fridovich I, 1994). El Fe2+ liberado puede participar en la reacción de Fenton,
generando el radical ˙OH altamente reactivo (Fe2+ + H2O2 → Fe3+ + ˙OH +
OH¯). El ión superóxido participa en la reacción de Haber-Weiss (O2˙¯ + H2O2
→ O2 + ˙OH + OH¯).
En los organismos vivos, se pueden formar radicales adicionales derivados
del oxígeno que son los radicales peroxilo (ROO˙). El radical peroxilo más
simple es el HOO˙, que es la forma protonada del superóxido y se denomina
hidroperóxido (Valko M et al., 2006).
En condiciones fisiológicas, los peroxisomas producen H2O2, pero no O2˙¯.
Estas organelas tienen un alto consumo de oxígeno y participan en varias
funciones metabólicas que utilizan oxígeno. La organela también contiene
catalasa, que descompone el peróxido de hidrógeno y previene la acumulación
de este compuesto tóxico. Por lo tanto, los peroxisomas mantienen un
delicado balance en lo que respecta a las concentraciones relativas o actividad
de esta enzima para asegurar que no haya producción neta de ROS. Cuando
los peroxisomas resultan dañados se libera H2O2 al citosol lo que contribuye a
aumentar el estrés oxidativo (Valko M et al., 2004).
Introducción
16
3.2 Daño oxidativo al ADN, lípidos y proteínas
En altas concentraciones, las ROS pueden producir daños importantes a
las estructuras celulares, principalmente al ADN, lípidos y proteínas (Valko M et
al., 2006). Se sabe que el radical hidroxilo reacciona con todos los
componentes de la molécula de ADN, dañando tanto las bases purínicas como
pirimidínicas así como también el esqueleto de deoxiribosa (Halliwell B y
Gutteridge J, 1999). La lesión del ADN que más ampliamente se ha estudiado
es la formación de 7,8-dihidro-8-oxoguanine (8-OH-G). La modificación
permanente del material genético que resulta de este “daño oxidativo”
representa el primer paso involucrado en la mutagénesis, carcinogénesis y
envejecimiento.
Es sabido que la generación de ROS inducida por metales resulta en el
ataque no solo al ADN, sino también sobre otros componentes celulares que
involucran los residuos ácidos grasos poli-insaturados de los fosfolípidos, que
son extremadamente sensibles a la oxidación (Siems WG et al., 1995). Una
vez se han formado, los radicales peroxilo (ROO˙) pueden ser transformados a
través de reacciones cíclicas a endoperóxidos (precursores de
malondialdehído) siendo el producto final del proceso de peroxidación el
malondialdehído (MDA) (Fedtke N et al., 1990; Wang M et al., 1996; Fink SP et
al., 1997; Mao H et al., 1999; Marnett LJ, 1999). El producto aldehído
mayoritario de la peroxidación de lípidos además del malondialdehído es el 4-
hidroxi-2-nonenal (HNE). El MDA es mutagénico en células bacterianas y de
mamíferos y carcinógena en ratas, mientras que el HNE es levemente
mutagénico.
Cuando se determinaron los mecanismos involucrados en la oxidación de
proteínas por ROS se observó que las cadenas laterales de todos los
aminoácidos en las proteínas, en particular cisteína y metionina, son
susceptibles a la oxidación por acción de ROS (Stadtman ER, 2004). La
oxidación de los residuos de cisteína puede llevar a la formación reversible de
Introducción
17
disulfuros mixtos entre grupos tioles proteicos y grupos tioles de bajo peso
molecular, en particular con S-glutatión. La concentración de grupos carbonilo,
generados por diferentes mecanismos es una buena medida de la oxidación
proteica mediada por ROS.
4. Sistemas enzimáticos antioxidantes y detoxificadores
El efecto de las ROS, es balanceado por al acción antioxidante enzimática y
no enzimática. Dichas defensas antioxidantes son extremadamente
importantes debido a que eliminan directamente a los radicales libres (pro-
oxidantes) o los compuesto tóxicos generados por éstos. Un buen antioxidante
debería: (i) eliminar específicamente radicales libres; (ii) quelar metales redox;
(iii) interaccionar (regenerar) con otros antioxidantes dentro de la “red
antioxidante”; (iv) tener un efecto positivo en la expresión génica; (v) ser
fácilmente absorbible; (vi) alcanzar una concentración fisiológicamente
relevante en tejidos y fluidos biológicos; (vii) actuar tanto en fase acuosa como
en las membranas (Valko M et al., 2006).
4.1 Enzimas antioxidantes 4.1.1 Superóxido dismutasa (SOD)
Esta enzima destruye el radical libre superóxido convirtiéndolo en peróxido
(O2˙¯ + O2˙¯ + 2H+ → H2O2 + O2) que luego puede ser eliminado por la
catalasa o la glutatión peroxidasa (GPx). El superóxido reduce Fe3+ a Fe2+,
liberándolo de los sitios de almacenamiento de manera que puede reaccionar
con peróxido de hidrógeno y producir radicales hidroxilo.
Otra función de la superóxido dismutasa es proteger las dehidratasas
(dihidróxido acido dehidratasa, aconitasa, 6-fosfogluconato dehidratasa y
fumarasas A y B) de su inactivación por la interacción con el radical superóxido
(Benov L y Fridovich I, 1998).
Introducción
18
Se han identificado 4 clases de SOD, estas contienen como cofactores Cu o
Zn dinucleares o Fe, Mn o Ni mononucleares (Whittaker MM y Whittaker JW,
1998). Las Fe-SODs y Mn-SODs tienen residuos metálicos quelantes idénticos
en el sitio activo, comparten una substancial homología de secuencia y en su
estructura tridimensional, mientras que otras SODs no están estructuralmente
relacionadas. En humanos, hay tres formas de SOD: Cu, Zn-SOD citosólica,
Mn-SOD mitocondrial, y SOD extracelular (Majima HJ et al., 1998). Esta
enzima cataliza la dismutación a través de sucesivos ciclos de oxidación y
reducción del metal de transición ubicado en el sitio activo por un mecanismo
de tipo Ping Pong con tasas de reacción muy altas (Hsieh Y et al., 1998).
4.1.2 Catalasa
La catalasa es una enzima tetramérica que contiene hemina y consiste en 4
subunidades idénticas de 60 kDa. Por lo tanto contiene cuatro grupos de
ferriprotoporfirina por molécula. Esta es una de las enzimas más eficientes que
se conocen. Lo es tanto que no puede ser saturada por H2O2 a cualquier
concentración (Lledias F et al., 1998).
Esta enzima reacciona con H2O2 para formar agua y oxígeno molecular
(2H2O2 → 2H2O + O2); y con dadores de H (metanol, etanol, ácido fórmico,
fenol, etc.) utilizando un mol de peróxido con una actividad del tipo peroxidasa
(ROOH + AH2 → H2O + ROH + A).
En animales el H2O2 es detoxificado por catalasa y glutatión peroxidasa. La
catalasa protege a las células del peróxido de hidrógeno que se produce dentro
de estas. Aunque esta enzima no es esencial para algunos tipos celulares en
condiciones normales, desempeña un importante papel en la adquisición de
tolerancia al estrés oxidativo en la respuesta adaptativa de las células (Hunt
CR et al., 1998).
Introducción
19
4.1.3 Glutatión peroxidasa (GPx)
La glutatión peroxidasa es una selenoproteína que cataliza la reducción de
una variedad de hidroperóxidos (ROOH y H2O2) usando grutatión, por lo tanto
protege a las células de mamíferos del daño oxidativo (ROOH + 2GSH → ROH
+ GSSG + H2O).
Existen al menos cinco isoenzimas en mamíferos. Aunque su expresión es
ubicua, los niveles de cada isoforma varían dependiendo el tipo de tejido. Las
formas citosólicas y mitocondriales de esta enzima reducen hidroperóxidos de
ácido grasos y H2O2 oxidando glutatión. En hígado la forma predominante es la
glutatión peroxidasa 1 (GPx1). La GPx1 contiene un residuo de selenocisteína
en cada una de sus cuatro subunidades idénticas, que es esencial para la
actividad de la enzima (Ding L et al., 1998). Esta enzima está complementada
por la glutatión reductasa que se encarga de reducir el glutatión que es oxidado
durante la reacción de la GPx.
4.1.4 NAD(P)H quinona oxidoreductasa 1 y 2 (NQO1-2)
Las enzimas detoxificadoras incluyen a la NQO1 y 2 (enzimas de fase II)
que catalizan la detoxificación metabólica de xenobióticos, drogas y
carcinógenos y, por lo tanto, protege a las células de los ciclos redox y el
subsecuente estrés oxidativo.
La NQO1 es una reductasa que transfiere 2 electrones obligatoriamente y
cataliza la reducción de un amplio rango de sustratos incluyendo quinonas,
quinona-iminas, y compuestos nitrados (Ross D et al., 2000). La NQO1 es una
proteína que contiene FAD y existe como un homodímero que se caracteriza
bioquímicamente por su habilidad única de usar ya sea NADH o NADPH como
cofactores reductores y por su inhibición por el anticoagulante dicumarol
(Ernster L, 1967; Edwards YH et al., 1980). Está considerada como una enzima
de detoxificación debido a su habilidad de reducir quinonas reactivas y
Introducción
20
quinonas iminas a hidroquinonas menos reactivas. La reducción de dos
electrones evita la producción de semiquinonas y por lo tanto previene la
generación de especies reactivas del oxígeno como el superóxido y peróxido
de hidrógeno (Thor H et al., 1982). La habilidad de NQO1 de desactivar
muchas especies reactivas, demuestra su importancia como enzima
quimiopreventiva. El otro efecto protector importante de NQO1 es su función
como enzima preventiva del cáncer, esto ha sido reconocido por más de 30
años (Huggins C y Fukunishi R, 1964).
Las funciones de NQO1 pueden no solo estar restrictas al metabolismo de
quinonas xenobióticas. Además de ser capaz de eliminar por acción directa
superóxido (Siegel D et al., 2004), también juega un papel importante en la
reducción de quinonas endógenas como la vitamina E (Siegel D et al., 1997) y
la coenzima Q10 (Beyer RE et al., 1996). La reducción de estos compuestos
por NQO1 genera hidroquinonas estables con propiedades antioxidantes
excelentes. Otros hallazgos sugieren que NQO1 puede tener un papel
antioxidante aún mayor. Se ha observado que la radiación X y la UV, que se
sabe generan radicales libres, son unos de los inductores de la expresión más
potentes de NQO1 en células humanas (Boothman DA et al., 1993; Agrawal A
et al., 2001).
4.1.5 Glutatión-S-transferasa (GST)
Estas enzimas, también de fase II, catalizan el ataque nucleofílico, por parte
del glutatión reducido (GSH), a compuestos no polares que contienen un
átomo de carbono, nitrógeno o azufre electrofílico. Sus sustratos incluyen
halogenonitrobenzenos, oxidos arenos, quinonas, y carbonilos α, β-insaturados
(Keen JH y Jakoby WB, 1978; Hayes JD y Pulford DJ, 1995; Armstrong RN,
1997; Hayes JD y McLellan LI, 1999).
Las glutatión transferasas son de interés para los farmacólogos y
toxicólogos debido a que son blancos para las terapias antiasmáticas y
Introducción
21
antitumorales (Evans JF et al., 1991; Matsushita N et al., 1998; Jakobsson PJ
et al., 1999; Ruscoe JE et al., 2001). Metabolizan agentes anticancerígenos,
insecticidas, herbicidas, carcinógenos, y productos derivados del estrés
oxidativo. La sobre expresión de GST en células tumorales en mamíferos a
sido relacionada con la resistencia a varios agentes anticancerígenos y
carcinógenos químicos (Hayes JD y Pulford DJ, 1995). Más aún, niveles
elevados de GST han sido asociados con la tolerancia a insecticidas y con la
selectividad a herbicidas (Ranson H et al., 2001).
En microbios, plantas, moscas, peces y mamíferos, la expresión se ve
incrementada ante la exposición a prooxidantes (Desikan R et al., 2001;
Kobayashi M et al., 2002; Veal EA et al., 2002; Allocati N et al., 2003; An JH y
Blackwell TK, 2003; Leiers B et al., 2003; Wang H y LeCluyse EL, 2003). El
incremento en la actividad de las transferasas también se observa en animales
luego de períodos prolongados de hibernación (Grundy JE y Storey KB, 1998).
Colectivamente, estos hallazgos indican que la GST es una respuesta
evolutivamente conservada de las células al estrés oxidativo.
Aunque, como se mencionó anteriormente, los radicales libres pueden
dañar directamente componentes celulares, también lo pueden hacer de
manera indirecta a través de la producción de metabolitos secundarios
generados a partir de oxidación de lípidos de membrana, proteínas y
carbohidratos que dan lugar a productos citotóxicos y mutagénicos (Marnett LJ
et al., 2003). Entre otras proteínas, la GST es una de las enzimas que proteje a
las células de los productos derivados del estrés oxidativo brindando
protección ante variados electrófilos peligrosos que se generan durante el daño
oxidativo a las membranas (Hayes JD y McLellan LI, 1999).
5. Metabolismo y transporte de fase I, II y III
Las enzimas que metabolizan drogas (DMEs) juegan un papel central en el
metabolismo, la eliminación y/o detoxificación de xenobióticos, químicos o
Introducción
22
drogas introducidos en el organismo (Meyer UA, 1996). Generalmente, las
DEMs protegen el organismo ante la exposición potencialmente hostil a
xenobióticos del ambiente así como también a ciertos endobióticos. A fin de
minimizar el daño potencial causado por estos compuestos, la mayoría de los
tejidos y órganos están bien equipados con variadas y diversas DMEs
incluyendo enzimas metabolizantes de fase I y fase II, así como también
transportadores de fase III, que están presentes en abundancia ya sea en el
nivel basal no inducido o a niveles elevados luego de su inducción ante la
exposición a xenobióticos (Meyer UA, 1996; Rushmore TH y Kong AN, 2002;
Wang H y LeCluyse EL, 2003).
Las DMEs de fase I consisten primordialmente en la superfamilia del
citocromo P450 (CYP) de enzimas microsomales que se encuentran
abundantemente en el hígado, tracto gastrointestinal, pulmones y riñones, y
consisten en familias y subfamilias de enzimas que son clasificadas basándose
en la homología de su secuencia de aminoácidos (Gonzalez FJ y Nebert DW,
1990; Nebert DW et al., 1991; Meyer UA, 1996; Nelson DR et al., 1996;
Guengerich FP, 2003). Se han descrito más de 36 familias de genes hasta el
momento. Existen doce familias en todos los mamíferos, las cuales incluyen 22
subfamilias. En humanos, se cree que cinco familias CYP, CYP1, CYP2,
CYP3, y CYP4 y CYP7, juegan un papel crucial en el metabolismo hepático y
extrahepático y en la eliminación de xenobióticos y drogas (Gonzalez FJ y
Nebert DW, 1990; Nebert DW et al., 1991; Nelson DR et al., 1996; Simpson
AE, 1997; Waxman DJ, 1999; Lewis DF, 2003; Pascussi JM et al., 2003).
Las enzimas de metabolización y conjugación de fase II consisten de varias
superfamilias de enzimas incluyendo sulfotransferasas (SULT) (Weinshilboum
RM et al., 1997; Banoglu E, 2000), UDP-glucuronosiltransferasas (UGT)
(Mackenzie PI et al., 1997; King CD et al., 2000; Tukey RH y Strassburg CP,
2000; Innocenti F et al., 2002), DT-diaforasa o NAD(P)H:quinona
oxidoreductasa (NQO) o NAD(P)H:menadiona reductasa (NMO) (Jaiswal AK,
1994; Kong AN et al., 2001), epóxido hidrolasas (EPH) (Guenthner TM et al.,
Introducción
23
1989; Hinson JA y Forkert PG, 1995), glutation-S-transferasa (GST) (Moscow
JA y Dixon KH, 1993; Schilter B et al., 1993; Tew KD y Ronai Z, 1999) y N-
acetiltransferasas (NAT) (Vatsis KP et al., 1995). Cada superfamilia de DMEs
de fase II consiste de familias y subfamilias de genes que codifican las varias
isoformas con diferente especificidad de sustrato, expresión en tejidos y en
desarrollo, así como también inducibilidad por xenobióticos (Schilter B et al.,
1993; Hinson JA y Forkert PG, 1995). En general, la conjugación con DMEs de
fase II aumenta la hidrofilicidad, catalizando la sulfatación y glucuronización,
jugando un papel importante en la conjugación y en última instancia la
excreción y eliminación de muchas drogas y xenobióticos que contienen el
grupo funcional hidroxilo (OH) ya sea presente en la estructura parental y/o
luego de la biotransformación por enzimas de fase I como las CYPs (Schilter B
et al., 1993; Simpson AE, 1997; Banoglu E, 2000; King CD et al., 2000). Por lo
tanto aumentan la excreción en la bilis y/o la orina y consecuentemente el
efecto detoxificador. Bajo ciertas circunstancias, la conjugación con enzimas de
fase II puede resultar en metabolitos activos e incrementar la toxicidad (Schilter
B et al., 1993; Hinson JA y Forkert PG, 1995; Chen C et al., 2000; Kong AN et
al., 2000; Rushmore TH y Kong AN, 2002).
Los transportadores de fase III, incluyendo glicoproteínas-P (P-gp)
(Brinkmann U y Eichelbaum M, 2001), la proteína asociada a la resistencia a
multidrogas (MRP) (Kerb et al., 2001), y el polipéptido transportador de aniones
orgánicos 2 (OATP2) (Tirona RG y Kim RB, 2002) son expresados en muchos
tejidos como el hígado, intestino, riñón y cerebro en donde proveen de una
barrera formidable contra la penetración de drogas, y juegan papeles cruciales
en la absorción, distribución y excreción de estas (Brinkmann U y Eichelbaum
M, 2001; Kim RB, 2003; Mizuno N et al., 2003; Staudinger JL et al., 2003). La
P-gp está asociada a la resistencia a drogas (MDR) en la quimioterapia contra
el cáncer. Las P-gp y MRP utilizan la energía de la hidrólisis de ATP para
transportar sustratos a través de la membrana celular, y son llamadas
transportadores casete de unión de ATP (ABC) (Mizuno N et al., 2003). Los
Introducción
24
transportadores ABC pertenecen a una de las mayores superfamilias de
proteínas, e importan o exportan un amplio rango de sustancias que incluyen
aminoácidos, iones, azúcares, lípidos, xenobióticos y muchas drogas
terapéuticas (Dean M et al., 2001; Kerb R et al., 2001). Solo hay exportadores
en los eucariotas. En humanos, se han identificado 46 transportadores ABC
(Dean M et al., 2001; Mizuno N et al., 2003). Todos los transportadores ABC
están formados por dos dominios de unión a nucleótidos (NBDs) y dos
dominios transmembrana (TMDs).
Por lo tanto, la regulación en la expresión génica de DMEs de fase I y fase II
y transportadores de fase III tiene un efecto potencial en el metabolismo,
eliminación, farmacocinética, farmacodinámica, interacción droga-droga de
muchos agentes terapéuticos, así como también en la protección del cuerpo
humano ante la exposición a xenobióticos medioambientales (Rushmore TH y
Kong AN, 2002; Guengerich FP, 2003; Wang H y LeCluyse EL, 2003).
6. Activación de Nrf2 en respuesta al estrés químico
El estrés químico causado por tóxicos del medio ambiente, y el metabolismo
de xenobióticos puede llevar a muchas enfermedades inflamatorias y
degenerativas, incluyendo el cáncer, la enfermedad de Alzheimer y la artritis.
Para proteger a las células del daño oxidativo por estrés químico, varias
enzimas antioxidantes y metabolizadoras de fase II pueden actuar en concierto
para detoxificar y eliminar estos químicos peligrosos y sus metabolitos. Estas
enzimas son expresadas constitutivamente en un bajo nivel bajo condiciones
fisiológicas. Sin embargo, su expresión se ve incrementada en células
expuestas a un diverso rango de compuestos, incluyendo oxidantes,
antioxidantes fenólicos y agentes electrofílicos que también pueden sufrir ciclos
rédox para producir un exceso de especies reactivas del oxígeno. En un lugar
central en la inducción de estas enzimas está el factor de transcripción
relacionado con NF-E2 2 (Nrf2), que actúa a través de un elemento de
Introducción
25
respuesta a antioxidantes (ARE) para activar la transcripción génica (Nguyen T
et al., 2003b) (figura 2).
Figura 2: Representación de la respuesta al estrés inducido por drogas/químicos/xenobióticos que lleva a la modificación de la interacción Keap1-Nrf2 y a la activación de las rutas de señalización tales como las mediadas por MAPK (ERK, JNK y P38), PKC, PI3K y PERK. La activación de estas rutas de señalización induce la activación de factores de transcripción tales como Nrf2/Maf e incrementa la expresión de los genes regulados por ARE incluyendo las DMEs de fase II (GST, NQO, UGT) así como también otras enzimas de defensa celular como GCL y HO-1, lo cual en última instancia resulta en un incremento en la detoxificación de xenobióticos o ROS y lleva a un potencial aumento de la viabilidad celular (Xu C et al., 2005).
El papel del Nrf2 tanto en la expresión constitutiva como inducible de los
genes dependientes de ARE ha sido bien establecida y documentada en varios
estudios in vivo como in vitro (Venugopal R y Jaiswal AK, 1996; Itoh K et al.,
1997; Venugopal R y Jaiswal AK, 1998; Alam J et al., 1999; Chan K y Kan YW,
1999; Wild AC et al., 1999; Nguyen T et al., 2000; Chan K et al., 2001;
Enomoto A et al., 2001; McMahon M et al., 2001; Ramos-Gomez M et al.,
2001; Chanas SA et al., 2002; Jowsey IR et al., 2003). Los mecanismos
Introducción
26
moleculares y vías de señalización que regulan la activación de Nrf2 han sido
por lo tanto el foco de estudios más recientes.
7. Regulación de la activación de Nrf2 7.1 Regulación de la activación de Nrf2 por Keap1
La identificación de Keap1, y su homólogo en ratas INrf2
(Dhakshinamoorthy S y Jaiswal AK, 2001), como un represor de la actividad de
Nrf2 definió las vías regulatorias que se conocen para la activación de Nrf2
(Itoh K et al., 1999). Inicialmente se aisló Keap1 dentro de una selección en un
experimento de dos híbridos en levadura para identificar las potenciales
proteínas que interactúan con Nrf2. Estudios bioquímicos y de localización
indican que Keap1, que está anclada en el citoplasma, funciona uniendo y
previniendo la acumulación nuclear de Nrf2 y por lo tanto reprimiendo su
actividad transcripcional (figura 3). Esta actividad represora se pierde en
células bajo estrés oxidativo. Por esta razón, el complejo Keap1/Nrf2 se
propuso que constituye un censor rédox de la célula a través del cual se regula
la activación de los genes ARE dependientes, en respuesta al estrés oxidativo
(Itoh K et al., 1999). Esta hipótesis también está sustentada por la observación
de que la proteína Keap1 contiene un gran número de residuos de cisteína,
algunos de los cuales se cree que representan los sitios blanco para el ataque
directo por parte de compuestos electrofílicos para causar la liberación de Nrf2.
Más aún, recientemente se han identificado cuatro residuos de cisteína, 257,
273, 288 y 297, a través de un experimento de marcaje y competición in vitro,
en los cuales se midió y demostró su reactividad hacia varios compuestos
alquilantes (Dinkova-Kostova AT et al., 2002). El papel de estos residuos de
cisteína se exploró más en profundidad en un estudio celular para definir las
funciones biológicas de Keap1 (Zhang DD y Hannink M, 2003). Un hallazgo
significativo en este trabajo demostró que Keap1 no solo inhibe a Nrf2
manteniéndola en el citoplasma si no que también promueve activamente su
ubiquitinización y subsecuente degradación por el proteosoma. Se encontró
Introducción
27
que dos residuos de cisteína de Keap1, C273 y C288, son esenciales para esta
función, ya que la mutación de cualquiera de estos residuos a serina suprime
esta actividad ubiquitinizadora. Adicionalmente, estos mutantes para Keap1, en
efecto incrementan la vida media y actividad transcripcional de Nrf2, lo que
sugiere que la perdida de la habilidad de Keap1 para reprimir es importante
para la estabilización de Nrf2. Se ha identificado un tercer residuo de cisteína,
C151, que es crítico para la liberación inducible de Nrf2 de la represión de
Keap1 y para su estabilización por tert-butilhidroquinona y sulfofrano. La
liberación de esta represión parece estar relacionada con la modificación post-
traduccional Keap1 en C151 (figura 3). La naturaleza molecular de esta
modificación y cómo afecta en la estabilización de Nrf2 no se conocen.
Por lo tanto, aunque la mutación de estos residuos de cisteína afecta
claramente la actividad de Keap1, queda por determinarse si sirven como sitios
de ataque directo de inductores ARE o sus metabolitos reactivos en las células.
Sin embargo, los datos proveen una importante evidencia acerca de que
Keap1 puede funcionar como parte del complejo E3 ubiquitina ligasa o tal vez
como la E3 ligasa misma (Zhang DD y Hannink M, 2003). Esta propuesta está
sustentada por un número de estudios demostrando que Keap1 y el
proteosoma están involucrados en la regulación de Nrf2 (Itoh K et al., 2003;
McMahon M et al., 2003; Nguyen T et al., 2003a; Stewart D et al., 2003).
La habilidad de Keap1 de reprimir Nrf2 también parece depender de que
sea capaz de formar un compuesto homodimérico (Zipper LM y Mulcahy RT,
2002). Se ha identificado un residuo de cisteína muy conservado en la posición
104 en la proteína de Keap1 y se encontró que es importante en el proceso de
dimerización, ya que la mutación de este residuo a alanina previene la
formación de esta forma de Keap1.
Introducción
28
Figura 3: (A) De acuerdo al modelo actual, se propone que la represión de Nrf2 está mediada por un mecanismo por el cual Keap1 retiene al factor de transcripción en el citoplasma y se produce la activación de Nrf2 cuando se interrumpe esta interacción por inductores de los genes dependientes de ARE, lo que permite que Nrf2 migre al núcleo para activar la transcripción. (B) Basado en su homología con la proteína Kelch, se define la estructura de Keap1 que consiste en dos dominios conocidos como BTB y Kelch, separados por la región conectora (Linker) y flanqueados por las regiones NH2-terminal (N) y COOH-TERMINAL (C). Keap1 interactúa con Nrf2 uniéndose a su dominio Neh2. Se indica el motivo ETGE dentro del dominio Neh2 importante para esta interacción. También se indican los residuos de cisteína dentro de Keap1 importantes para su actividad (Nguyen T et al., 2004).
Se ha hecho evidente que la activación de Nrf2 involucra múltiples
mecanismos por los cuales actúan los inductores de ARE para promover su
estabilización y acumulación en el núcleo. Como consecuencia de su
ingerencia en la degradación de Nrf2 (Itoh K et al., 2003; McMahon M et al.,
2003; Zhang DD y Hannink M, 2003), Keap1 tiene un papel prominente en la
regulación de la estabilidad de Nrf2. La importancia de esta proteína se
confirma aún más por datos recientes in vivo que demuestran un aumento en
el nivel de expresión de algunas enzimas de fase II dependiente de Nrf2 en
ratones Keap1 -/- comparados con animales normales (Wakabayashi N et al.,
2003). Sin embargo, es importante hacer notar que Keap1 puede no ser el
Inductores ARE
Introducción
29
único regulador de la estabilidad de Nrf2 y que están involucrados otros
mecanismos mediados por otros factores.
Esto está sustentado por experimentos usando un mutante para Nrf2 que no
tiene el motivo de interacción con Keap1, ETGE, en su dominio Neh2 (ver fig.
3), Nrf2ΔETGE, en el cual se observó que todavía está sujeta a degradación por
el proteosoma a través de un mecanismo independiente de Keap1 (McMahon
M et al., 2003). Se pueden sacar al menos dos conclusiones de estos datos: (i)
la estabilidad de Nrf2 está regulada por al menos dos degrones, uno que se
encuentra en el dominio Neh2 y un segundo en algún otro lugar de la proteína,
y (ii) el degrón en el dominio Neh2 continúa siendo activo más allá de su
afinidad por Keap1. Por lo tanto la estabilización de Nrf2 puede depender de
mecanismos que actúan simultáneamente sobre ambos degrones para
disminuir eficientemente la tasa de degradación
7.2 Estabilización proteica como mecanismo de activación de Nrf2
La actividad de proteínas regulatorias como los factores de trascripción está
frecuentemente regulada a nivel transcripcional o post-traduccionalmente.
Aunque se ha encontrado que la transcripción del gen para Nrf2 aumenta en
queratinocitos de ratón tratados con 3H-1,2-ditiol-3-tiona (Kwak MK et al.,
2002), se observó que los niveles de ARNm para Nrf2 se mantienen estables y
no afectados por otros inductores de los genes dependientes de ARE en otros
sistemas experimentales (Wild AC et al., 1999; Ishii T et al., 2000; Nguyen T et
al., 2003a; Stewart D et al., 2003). Estos datos sugieren que mecanismos post-
tranduccionales son importantes en la regulación de la actividad de Nrf2. Datos
de experimentos de marcaje celular muestran que el tratamiento de células
HepG2 con el antioxidante fenólico tert-butilhidroquinona (tBHQ) lleva a un
incremento en la fosforilación de Nrf2 que está acompañada por acumulación
en el núcleo (Huang HC et al., 2000). Adicionalmente, se encontró que tBHQ
induce un incremento en los niveles de Nrf2 sin afectar la tasa aparente de
transcripción (Nguyen T et al., 2003a). Resulta de particular interés que esta
Introducción
30
respuesta post-traduccional no es única de este antioxidante fenólico porque
se observan efectos similares en células tratadas con otros compuestos,
incluyendo, β-naftoflavona (Nguyen T et al., 2003a), cadmio (Stewart D et al.,
2003), sulfofrano (Sul) (McMahon M et al., 2003) y dietilmaleato (DEM) (Itoh K
et al., 2003), cuatro inductores estructuralmente diversos de los genes
dependientes de ARE. Estas observaciones proveen evidencia acerca de la
existencia de un mecanismo regulatorio que incrementa la estabilidad de Nrf2,
resultando en su acumulación en la célula.
Debido a que la estabilidad de proteínas intracelulares generalmente está
determinada por su tasa de degradación por parte del proteosoma dependiente
de ubiquitina, esta maquinaria proteolitica se convirtió en el principal candidato
de estar involucrado en la vía de regulación que controla la estabilidad de Nrf2
y por lo tanto su actividad transcripcional.
La degradación de proteínas por el proteosoma 26S dependiente de
ubiquitina es un proceso altamente regulado que involucra el reconocimiento
específico y selección de la molécula sustrato para la ubiquitinación por la E3
ubiquitín ligasa antes de la degradación por el proteosoma. Cómo se
seleccionan las proteínas a ser degradadas está basado principalmente en la
presencia de estructuras específicas conocidas como degrones que
generalmente están compuestos de una secuencia específica de amino ácidos
y/o estructura conformacional. Estos degrones sirven como motivos de
reconocimientos para la ligasa E3 y se cree que la interacción entre ellos
representa el paso crítico y limitante temporal que regula la estabilidad de la
proteína blanco (Pickart CM, 2001; Weissman AM, 2001). La estabilización de
Nrf2 por los inductores de ARE se puede producir por una disminución en la
tasa de su degradación, y esto podría ser mediado por los mecanismos que
previenen o disminuyen el reconocimiento e interacción de Nrf2 con la ligasa
E3 o directamente inhibiendo la actividad de la E3 ligasa.
Como la modificación por fosforilación es el mecanismo post-traduccional
más importante en los procesos de señalización, se cree que juega un papel
Introducción
31
central en la regulación de la estabilidad de Nrf2. Datos recientes que muestran
que tBHQ aumenta la fosforilación de Nrf2 en células HepG2 (Huang HC et al.,
2000) aportan evidencia sobre esta posibilidad. Un aporte adicional a este
mecanismo proviene de la observación de que el inhibidor de fosfatasa, ácido
ocadaico, que induce hiperfosforilación celular (Cohen P et al., 1990), tiene
efectos positivos tanto en la acumulación de Nrf2 como en la activación
transcripcional de un gen reportero inducido por ARE (Nguyen T et al., 2003a).
Aunque estos datos no dan evidencias concluyentes, sugieren que la
estabilización de Nrf2 está intimamente ligado a la fosforilación proteica.
7.3 Migración de Nrf2 hacia el núcleo celular
Lo que también se hace aparente es que, sin importar el mecanismo
involucrado, es esencial un aumento en el Nrf2 celular para la inducción de los
genes dependientes de ARE. Cómo este incremento lleva a su acumulación en
el núcleo no se conoce bien, pero se presume que Nrf2 puede migrar
libremente al núcleo y que este proceso no está regulado de manera específica
por los inductores. Esta presunción concuerda con datos experimentales que
muestran un incremento dosis dependiente en la actividad del gen reportero
bajo el control de ARE en células transfectadas con cantidades en aumento de
un vector que expresa Nrf2 sin necesidad de tratamiento con inductores de
ARE. Bajo estas condiciones, Nrf2 aparentemente es capaz de migrar al
núcleo para activar la transcripción de manera no regulada (Venugopal R y
Jaiswal AK, 1996; Wild AC et al., 1999; Nguyen T et al., 2000). El hecho de que
inhibidores del proteosoma no solo estabilizan a Nrf2 sino que también
incrementan la expresión de un gen reportero bajo el control de ARE (Nguyen
T et al., 2003a; Stewart D et al., 2003) o el de un gen endógeno (Sekhar KR et
al., 2000) claramente relaciona la estabilización de Nrf2 con su actividad en el
núcleo. Adicionalmente, el análisis directo de lisados celulares fraccionados
demuestra que el tratamiento de células con estos inhibidores lleva a un
Introducción
32
incremento en el nivel de Nrf2 en el núcleo en lugar de en la fracción
citoplasmática (Itoh K et al., 2003). Por lo tanto, solo la liberación de Nrf2 de
Keap1 y su estabilización parecen ser suficiente para iniciar su acumulación en
el núcleo.
8. Resveratrol 8.1 Síntesis, distribución y contenido de resveratrol en plantas y en el vino
El resveratrol (trans-3, 5, 4´-trihidroxiestilbeno) (figura 4) (R), es una
fitoalexina cuya síntesis en plantas puede ser inducida por infecciones
microbiales, radiación ultravioleta y exposición al ozono (Ignatowicz E y Baer-
Dubowska W, 2001). Es sintetizado en la epidermis de las hojas y en la piel de
las uvas, pero no en la carne (Creasy LL y Cofee M, 1988). En las vides, este
polifenol alcanza concentraciones de 50-400 μg/g en las hojas. La piel fresca
de las uvas contiene alrededor de 50-100 μg de resveratrol por gramo (Jeandet
P et al., 1991). Consecuentemente, la cantidad de este compuesto varía
considerablemente en diferentes tipos de jugos de uvas y vino dependiendo de
la variedad de la uva, los factores medioambientales en los viñedos, la
extracción del jugo y en las técnicas de procesamiento. En las uvas y en el vino
el resveratrol se encuentra libre y como 3β-glucósido de resveratrol (Vrhovsek
U et al., 1995; Romero-Pérez AI et al., 1996). En el vino tinto, las
concentraciones de resveratrol están en el rango de 1,5 a 3 mg/L (Goldberg
DM et al., 1995; Romero-Pérez AI et al., 1996). El mayor contenido de
resveratrol en vinos tintos que en blancos es una consecuencia del prolongado
tiempo de contacto entre la piel de la uva y el caldo. El caldo del vino tinto se
fermenta con la piel de la uva durante varios días, mientras que para el vino
blanco se separa la piel inmediatamente luego del prensado (Daniel O et al.,
1999). En jugos de uva, el contenido de resveratrol también difiere en gran
manera con rango variando desde 3 a 15 μg/L (Soleas GJ et al., 1995) y 690 a
14500 μg/L (Romero-Perez AI et al., 1999). El maní parece ser la otra única
Introducción
33
fuente de consumo humano que contiene resveratrol en cantidades
significativas (Goldberg DM, 1995; Sanders TH et al., 2000).
El resveratrol existe en conformaciones cis y trans (figura 4), y la
isomerización de trans a cis es facilitada por la exposición a luz UV. Su
estructura está relacionada a la del estrógeno sintético dietilestilbestrol. Dos
grupos fenólicos están unidos por un doble enlace estireno para generar 3, 4´,
5-trihidroxiestilbeno (figura 4) (Romero-Pérez AI et al., 1996).
8.2 Efectos del R sobre el ciclo y estatus redox celular
El interés por las propiedades del resveratrol no se inicia con su
descubrimiento en el vino, sino que comienza a principios de los 80s entre
científicos Japoneses. En 1982, notaron que las raíces secas de Polygonum
cuspidatum habían sido usadas en la medicina tradicional Japonesa y China en
un producto llamado “Kojo-kon” (Arichi H et al., 1982). El Kojo-kon, también
llamado Itadori, era utilizado para tratar una amplia variedad de afecciones,
incluyendo infecciones por hongos, inflamaciones de la piel y enfermedades
del corazón, hígado y vasos sanguíneos. Se ha demostrado que el resveratrol
es el ingrediente activo principal de la Polygonum cuspidatum, que es una de
las fuentes más ricas de este compuesto (Arichi H et al., 1982). Muchos
estudios in vitro describen diferentes efectos del resveratrol entre los que se
Figura 4: Estructuras químicas del cis y trans-resveratrol
Introducción
34
encuentran efectos antioxidantes, anti-inflamatorios y estrogénicos así como
también las actividades quimiopreventivas y anticancerígenas (Fremont L,
2000; Bhat KPL et al., 2001).
El resveratrol ha sido sujeto de un gran número de estudios que
investigaron sus efectos beneficiosos en sistemas neurológicos, hepáticos y
cardiovasculares (Fremont L, 2000; Pervaiz S, 2003). Inicialmente se relacionó
el resveratrol con la observación paradójica de que pueden coexistir una baja
mortalidad por enfermedades cardiovasculares con una dieta alta en grasas
saturadas y un consumo moderado de vino tinto (150 – 300 ml al día), un
fenómeno conocido como la paradoja francesa (Renaud S y de Lorgeril M,
1992; Soleas GJ et al., 1997b). Este hecho ha resultado en el uso de
suplementos dietarios de resveratrol con dosis en el rango de 10 – 20 mg
(Kaldas MI et al., 2003). Los posibles mecanismos de la actividad
cardioprotectora incluyen el metabolismo de lípidos y la función de las
plaquetas así como también la respuesta inflamatoria, incluyendo la regulación
negativa de los mediadores pro-inflamatorios, alteración en la síntesis de
eicosanoides, o la inhibición de células inmunes activadas, principalmente
representadas por neutrófilos y monocitos/macrófagos (Ignatowicz E y Baer-
Dubowska W, 2001; Hao HD y He LR, 2004).
Además de las defensas endógenas, el consumo de antioxidantes con la
dieta tiene un importante papel en la protección contra enfermedades
relacionadas con el estrés oxidativo, como las enfermedades cardiovasculares,
el cáncer, la inflamación, y la disfunción cerebral (Lopez-Velez M et al., 2003).
Existe evidencia de que el resveratrol es un inactivador de radicales libres así
como también un antioxidante (Soleas GJ et al., 1997a; Lopez-Velez M et al.,
2003).
Una de las actividades biológicas más importantes del resveratrol que se ha
investigado durante los últimos años a sido su potencial para la
quimioprevención del cáncer. Estas propiedades se apreciaron por primera vez
cuando Jang et al. (Jang M et al., 1997) demostraron la inhibición de la
formación de tumores inducidos por 7,12 dimetilbenzantraceno luego del
Introducción
35
tratamiento con la fitoalexina. Desde entonces, se han publicado una gran
cantidad de trabajos sobre los efectos del resveratrol en pasos críticos que
regulan la proliferación celular y el crecimiento (Roemer K y Mahyar-Roemer
M, 2002; Pervaiz S, 2003). De hecho, recientemente, se ha demostrado que el
resveratrol tiene una actividad quimiopreventiva anti-cancerígena contra las
tres etapas principales de la carcinogénesis, esto es: iniciación, promoción y
progresión (Aziz MH et al., 2003). Esencialmente, los mecanismos posibles de
esta actividad incluyen: inducción de apoptosis, inhibición de etapas claves en
las rutas de señalización, la promoción de diferenciación celular, eliminación de
especies reactivas, o la inhibición de radicales derivados del oxígeno y
actividad anti-inflamatoria a través de la regulación negativa de citoquinas pro-
inflamatorias (Pervaiz S, 2003).
Los efectos que ejerce el resveratrol sobre la progresión del ciclo celular
dependen del sistema experimental, y es altamente variable (Ragione FD et al.,
1998; Schneider Y et al., 2000; Park JW et al., 2001; Joe AK et al., 2002). Este
estilbeno inhibe la proliferación celular de manera dosis dependiente en varias
líneas celulares tumorales humanas, y el efecto parece ser bastante específico
para células malignas (Clement MV et al., 1998). La inhibición de la síntesis de
poliaminas a través de la inhibición de la actividad de la ornitina descarboxilasa
(Schneider Y et al., 2000) o a través de la inhibición de la ribonucleótido
reductasa (Fontecave M et al., 1998) pueden ser los posibles mecanismos de
acción por los cuales el resveratrol ejerce su efecto anti-proliferativo. El
resveratrol también disminuye la proliferación de líneas celulares cancerígenas
de mama (Fontecave M et al., 1998; Mgbonyebi OP et al., 1998; Lu R y Serrero
G, 1999; Damianaki A et al., 2000; Levenson AS et al., 2003). Sin embargo,
también se ha informado el incremento en la proliferación celular inducida por
este polifenol (Gehm BD et al., 1997; Schmitt E et al., 2002). Aunque los
efectos en el crecimiento celular posiblemente estén mediados por la
interacción con el receptor de estrógeno (ER), parece que éste no es el único
mecanismo, ya que se observa inhibición de la proliferación tanto en células
Introducción
36
ER- como en ER+ (Mgbonyebi OP et al., 1998; Damianaki A et al., 2000;
Levenson AS et al., 2003).
Se han obtenido resultados contradictorios en lo que respecta a los
mecanismos asociados con la inducción de la diferenciación y la apoptosis por
resveratrol en células tumorales (Jang M et al., 1997; Bhat KPL et al., 2001;
Mahyar-Roemer M et al., 2001; Joe AK et al., 2002). La capacidad del
resveratrol de inducir la expresión de CD95L, p53 y p21 puede contribuir a sus
efectos de inhibición de la proliferación (Clement MV et al., 1998; Hsieh TC et
al., 1999). Por lo tanto, esta fitoalexina puede inducir la muerte celular
programada a través de la inducción de p53 (Huang C et al., 1999; Lu J et al.,
2001; She QB et al., 2001; Narayanan BA et al., 2003) pero también se ha
propuesto una vía independiente de p53 (Mahyar-Roemer M et al., 2001). A su
vez, se ha informado que están involucradas las ciclinas (D1, A, B1), p21, el
agonista de la apoptosis bax, y el factor anti-apoptótico bcl-2 (Surh YJ et al.,
1999; Tessitore L et al., 2000; Mahyar-Roemer M et al., 2001; Joe AK et al.,
2002). Por lo tanto el resveratrol puede inhibir las tres etapas de la
carcinogénesis: la iniciación del tumor, su promoción y progresión.
8.3 Efectos del resveratrol sobre el envejecimiento
Está bien establecido que una ingestión reducida de alimentos (restricción
calórica) aumenta el período de vida de un amplio rango de especies (Masoro
EJ, 2000), desde levadura hasta mamíferos (Koubova J y Guarente L, 2003).
En levaduras, el gen sir2 media los efectos que prolongan la vida a partir de la
restricción calórica (Lin SJ et al., 2000), a su vez la sobre expresión de Sir2
puede prolongar la vida de lavaduras crecidas bajo condiciones de nutrición
normales (Kaeberlein M et al., 1999). La enzima Sir2 pertenece a una gran
familia de moléculas evolutivamente conservadas denominadas SIRs, que es
una familia de proteín deacetilasas dependiente de NAD+ (Lin SJ et al., 2002;
Anderson RM et al., 2003). Estas enzimas regulan un amplio rango de
actividades celulares, y juegan un importante papel en el silenciamiento de
genes, la reparación y recombinación del ADN y en el envejecimiento en
Introducción
37
organismos que se usan como modelo (Guarente L, 2000; Gasser SM y
Cockell MM, 2001; Tissenbaum HA y Guarente L, 2001; Rogina B et al., 2002)
afectando el período de vida en organismos inferiores, como las levaduras y
los gusanos (Denu JM, 2003). Por otra parte, aunque no se conoce como las
proteínas Sir afectan al envejecimiento en mamíferos, investigaciones
recientes indican que en células de mamíferos las SIRs parecen actuar como
reguladores de la muerte celular programada y en la maduración celular
(apoptosis y diferenciación, respectivamente) (Denu JM, 2003).
En un estudio realizado recientemente se usaron bibliotecas de varias
moléculas pequeñas y se encontró que el resveratrol puede prolongar la vida
de levaduras (Howitz KT et al., 2003), lo que implica un potencial efecto de
este compuesto como sustancia anti-envejecimiento en el tratamiento de
enfermedades humanas relacionadas con la edad a través de la estimulación
de la actividad de Sir2. El resveratrol fue el activador más potente de Sir2 de
todos los polifenoles de plantas ensayados por estos investigadores.
Demostraron que, en levaduras, el resveratrol tiene el mismo efecto que la
restricción calórica estimulando Sir2, aumentando la estabilidad del ADN, y
aumentando el período de vida en aproximadamente un 70 %. Como
consecuencia parece haber una relación con estudios que sugieren que la
longevidad se puede incrementar a través del consumo regular de vino tinto
(Hall SS, 2003).
8.4 Efectos del resveratrol en sistemas enzimáticos involucrados en la síntesis de mediadores pro-inflamatorios
Dos sistemas enzimáticos involucrados en la síntesis de mediadores pro-
inflamación son las vías de la ciclooxigenasa (COX) y de la lipooxigenasa.
Ambos generan sustancias inflamatorias. Se ha encontrado una gran
correlación entre la inflamación y el cáncer, lo que sugiere que el cáncer es
una enfermedad inflamatoria (Balkwill F y Mantovani A, 2001; Coussens LM y
Werb Z, 2002). La oxidación del araquidonato por COX genera otras especies
oxidativas incrementando el estado oxidativo de la célula. Una consecuencia
Introducción
38
de esto es que COX-2 co-oxidará compuestos como el benzo[a]-pireno (Eling
TE et al., 1990) a compuestos derivados altamente carcinógenos. El daño
oxidativo directo al ADN es un evento mutagénico bien reconocido (Wiseman H
y Halliwell B, 1996) y dicho daño se ve incrementado luego de la inducción de
COX-2 (Nikolic D y van Breemen RB, 2001).
El resveratrol afecta la iniciación de tumores previniendo el daño inicial al
ADN a través de dos vías diferentes (Roemer K y Mahyar-Roemer M, 2002): (i)
actuando como anti-mutágeno a través de la inducción de enzimas de fase II
(Renaud S y de Lorgeril M, 1992; Dubuisson JG et al., 2002), como la quinona
reductasa, capaz de detoxificar carcinógenos y de inhibir las enzimas COX y
citocromo P4501A1 que se sabe son capaces de convertir sustancias en
mutágenos, y (ii) actuando como antioxidante a través de la inhibición del daño
al ADN por radicales libres (Jang M et al., 1997). Por lo tanto, las actividades
antioxidantes de este compuesto podrían ser las responsables de su actividad
preventiva del cáncer. Por ejemplo, el resveratrol reduce el daño oxidativo
inducido por H2O2 en el ADN de timo de cabra (Burkhardt S et al., 2001) y en
varias líneas celulares cancerígenas (Damianaki A et al., 2000; Sgambato A et
al., 2001). Más aún, la administración de resveratrol reduce los niveles de 8-
oxo-7,8-dihidroxi-2´-deoxiguanosina, un marcador de daño oxidativo del ADN in
vivo (Cadenas S y Barja G, 1999). El resveratrol hace todo esto a
concentraciones fisiológicas (Jang M et al., 1997; Bhat KPL et al., 2001; Ciolino
HP y Yeh GC, 2001).
8.5 Metabolismo y biodisponibilidad del trans-resveratrol 8.5.1 Metabolismo del resveratrol en modelos in vitro y ex vivo
La absorción transcelular del Resveratrol a diferentes concentraciones se ha
investigado en células Caco-2, una línea celular humana, y parece ser
concentración dependiente. La limitada linearidad en el transporte con el
tiempo sugiere un extensivo metabolismo del resveratrol por parte de las
células Caco-2 (Kaldas MI et al., 2003). En una aproximación similar, se
midieron las permeabilidades apical a basolateral y basolateral a apical del
Introducción
39
resveratrol en un rango de concentraciones de 5 – 250 μM (Li Y et al., 2003).
No hay diferencia significativa entre ambas permeabilidades, lo que sugiere
que el transporte del resveratrol a través de las monocapas de células Caco-2
es probablemente a través de un mecanismo pasivo concentración
independiente.
Aparte de los estudios en la línea celular Caco-2, la absorción solo se ha
investigado en células hepáticas hasta el momento (Lancon A et al., 2004). Se
utilizaron dos modelos celulares diferentes: una linea celular de
hepatoblastoma (HepG2), que responde al efecto antiproliferativo del
resveratrol, y hepatocitos humanos a fin de comparar el transporte del
resveratrol en células normales y tumorales. Se utilizaron las propiedades
fluorescentes del resveratrol para observar la incorporación celular. Las células
tratadas con resveratrol mostraron un incremento en la intensidad de
fluorescencia, lo que apunta a una incorporación de este estilbeno. La
incorporación con respecto al tiempo fue similar en hepatocitos y en células
HepG2. En experimentos posteriores, se investigó la posibilidad de transporte
mediado por transportadores de [3H]resveratrol. Los resultados indicaron que la
incorporación del resveratrol probablemente resulta de la contribución de dos
procesos, uno pasivo y uno mediado por transportadores. En condiciones
fisiológicas, estos procesos permitirían una incorporación hepática eficiente del
resveratrol presente en la sangre circulante (Lancon A et al., 2004).
8.5.2 Metabolismo y biodisponibilidad del resveratrol en modelos de roedores in vivo
La biodisponibilidad de un nutriente se define por el grado en el que está
disponible a un tejido blanco luego de su administración (Maid-Kohnert U,
2001).
En diferentes especies de roedores el resveratrol es absorbido, distribuido a
varios órganos, y metabolizado a conjugados glucurónidos y sufatos . Los
primeros resultados (Bertelli AA et al., 1996a; Bertelli AA et al., 1996b; Bertelli
A et al., 1998) indicaron la rápida absorción del resveratrol. En plasma, se lo
Introducción
40
detecta 15 min luego de la administración y alcanza concentraciones máximas
a los 30 min (Soleas GJ et al., 2001; Yu C et al., 2002). Junto con el
resveratrol-3-glucurónido y el resveratrol-3-sulfato se detectaron formas
conjugadas de resveratrol en plasma. Estos metabolitos del resveratrol se
detectaron aún luego de 3 hs después de su administración. En este momento,
se encontraron solo trazas de resveratrol libre en muestras de plasma (Yu C et
al., 2002; Sale S et al., 2004). Esta detección prolongada de bajos niveles de
metabolitos de resveratrol en plasma sugiere que este compuesto es
parcialmente metabolizado en el intestino delgado y distribuido a distintos
tejidos también en formas conjugada (Soleas GJ et al., 2001; Yu C et al., 2002;
Vitrac X et al., 2003; Sale S et al., 2004). El hígado es responsable de una alta
acumulación de resveratrol y sus metabolitos. Aún no se sabe si la
acumulación hepática de metabolitos del resveratrol, siendo estos el
resveratrol-3-glucurónido y el resveratrol-3-sulfato, se produce ya sea por
metabolismo del compuesto en el intestino delgado con subsecuente absorción
hepática, o por metabolismo in situ (Yu C et al., 2002; Vitrac X et al., 2003;
Sale S et al., 2004). En estudios cinéticos se detectaron concentraciones
decrecientes de resveratrol en riñones (Bertelli AA et al., 1996b; Bertelli A et
al., 1998). Este resultado fue confirmado con el hallazgo de concentraciones
decrecientes de radiactividad procedente del resveratrol en riñones, lo que
indica que la excreción renal puede ser una de las vías de eliminación más
importantes de la marca de 14C (Vitrac X et al., 2003). Esta hipótesis también
está sustentada por las altas concentraciones de resveratrol y sus metabolitos
que se encontró en la orina (Soleas GJ et al., 2001; Asensi M et al., 2002; Yu C
et al., 2002; Vitrac X et al., 2003).
8.5.3 Metabolismo y biodisponibilidad del resveratrol en humanos
En humanos el resveratrol, ya sea como aglicona o su forma glicosídica
también se absorbe bastante rápidamente luego del consumo oral. Los niveles
de resveratrol se detectan en plasma y en el orina con una concentración
máxima en el plasma que se alcanza alrededor 30-60 min luego de la
Introducción
41
ingestión. Luego de la administración oral la cantidad de resveratrol libre en
plasma y suero es de menos de 2 % del resveratrol total o no se detecta. Sin
embargo, se detectan conjugados glucurónidos y sulfatos (Goldberg DM et al.,
2003; Meng X et al., 2004; Walle T et al., 2004). Adicionalmente, la aparición
de un pico adicional de resveratrol en plasma a las 6 hs sugiere recirculación
entérica de metabolitos conjugados por reabsorción luego de la hidrólisis
intestinal. Aunque el metabolismo presistémico del resveratrol puede ser
importante para la dosis oral, la observación para dosis intravenosas también
demuestran un metabolismo sistémico eficiente (Walle T et al., 2004). La
recuperación total de resveratrol en heces y orina varía entre 54 y 98 %. En
orina, se han identificado dos conjugados glucurónidos isoméricos y un
conjugado sulfato. Finalmente, la absorción no requiere la presencia de
alcohol; el medio acuoso y suspensiones vegetales son, con algunas
excepciones, tan efectivas como el vino (Goldberg DM et al., 2003).
Desafortunadamente en todos estos estudios el número de voluntarios fue
pequeño, de una a seis personas por grupo de estudio. Esto es particularmente
crítico ya que puede existir variabilidad interindividual del metabolismo de
xenobióticos lo que reduciría la significancia de estos resultados.
Introducción
42
Objetivos
43
OBJETIVOS
1- Establecer si el R es tóxico para cultivos de hepatocitos primarios y células
hepáticas de rata transformadas clone 9.
2- Determinar si el R tiene capacidad antioxidante en cultivos de hepatocitos
primarios y de células clone 9.
2-1 De observarse un efecto antioxidante por parte del R en cultivos de
hepatocitos, determinar si este efecto es químico por interacción directa del
compuesto con el agente oxidante o es consecuencia de inducción de sistemas
antioxidantes enzimáticos de las células.
3- Establecer si el R afecta la regulación de las enzimas antioxidante y
detoxificadoras a través de la activación del factor de transcripción Nrf2.
3-1 Determinar si se ve afectada la concentración de Nrf2 y de ser así
establecer, de observarse tal variación, si es consecuencia de una
estabilización proteica o deriva de un aumento en la transcripción del ARNm
que codifica para este factor.
4- Debido a que se ha demostrado que el R inhibe la proliferación de varias
líneas celulares tumorales sin afectar las células normales del mismo tejido,
decidimos determinar el efecto del R sobre la proliferación en cultivos de
hepatocitos primarios y en cultivos de células hepáticas transformadas clone 9
a fin de establecer si en nuestro sistema se observa este efecto diferencial por
parte del R.
5- Determinar si se observa un efecto diferencial en la acción del R en los
cultivos de hepatocitos primarios con respecto a cultivos de células clone 9 con
respecto al estrés oxidativo.
Objetivos
44
Material y métodos
45
MATERIAL Y MÉTODOS 1. Obtención de hepatocitos primarios
Se utilizaron ratas Sprague-Dawley machos, alimentadas Ad libitum, de
200-300 g de peso. Se siguió el método de perfusión con colagenasa de
Seglen con algunas modificaciones (Berry M y Friend D, 1969; Seglen PO,
1976). Las ratas se anestesiaron con una mezcla de ketamina:xilazina (42,5 %
: 20 %; Ketolar® 50 mg, Parke Davis; Rompun® 2 %, Bayer) en solución
fisiológica. Se inyectaron 0,2 ml por cada 100 g de peso, por vía
intraperitoneal. Una vez anestesiada la rata, se colocó y ligó un catéter (18GA,
Becton Dickinson) en la vena porta y se inició la perfusión, siempre a 37°C, con
la solución de perfusión [ClNa 136 mM (Panreac), ClK 27 mM (Panreac),
PO4HNa2.12H2O 0,28 mM (Panreac), Hepes 1 mM (Sigma), EGTA 0,1 mM
(Sigma), pH: 7,4]. Se cortó la vena cava inferior para permitir la salida de la
sangre y los líquidos de perfusión. Se continuó la perfusión pasando una
solución de pH:7,5, de igual composición que la anterior pero sin EGTA, y con
el agregado de colagenasa (tipo IV, Sigma; 0,025 %) y Cl2Ca (5,1 mM,
Panreac). Para finalizar y detener la digestión, se pasó una solución de post-
perfusión (ClNa 136 mM, ClK 27 mM, PO4HNa2.12H2O 0,28 mM, Hepes 1 mM,
pH: 7,65). En las tres etapas de perfusión se utilizó una velocidad de flujo de
20 ml/min. Se extrajo el hígado y se lavó superficialmente con medio L-15 de
Leibovitz (Sigma) con albúmina sérica bovina (BSA, Sigma) al 2 %. En el
mismo medio fresco se rompió la cápsula de Glisson y se dispersaron los
hepatocitos por simple agitación. Luego de filtrar la suspensión a través de una
doble gasa estéril, se dejó decantar por 15 minutos (min), tiempo suficiente
para que se forme un pellet en el que prácticamente la totalidad de las células
son viables. A este pellet se le realizaron dos lavados con Leibovitz/BSA 2 %
luego de lo cual se centrifugaron las células a 200 rpm por 2-3 min a 4°C y se
resuspendieron en medio de “attachment” o “pegado” [199:MEM 1:4 (Sigma),
BSA 1 g/l, insulina 5 mg/l (Sigma), HCO3Na 26,2 mM, estreptomicina 100 μg/ml
(Sigma) penicilina 100 UI/ml (Calbiochem), dexametasona 1,2 mM (Sigma),
Material y métodos
46
suero fetal bovino 10 % (SFB, Gibco)]. En la figura 5 se muestra un esquema
del sistema de perfusión.
Figura 5: Esquema del sistema de perfusión utilizado para la obtención de hepatocitos primarios de rata. Las flechas indican la dirección del flujo de las soluciones y los números el orden en que fueron perfundidas.
1.2 Tinción con Azul de Tripano
Se basa en el principio de que las células vivas o viables excluyen el
colorante, mientras que las muertas o no viables lo internalizan. Con esta
técnica se determinó el número total de células viables/ml y el porcentaje de
viabilidad celular. Para ello, se mezclaron 100 ml de la solución de hepatocitos
y 900 ml de una solución al 0,4 % de azul de tripano (Panreac).
Luego de incubar 5 min se cargó una cámara de Neubauer y se contaron
las células (vivas, muertas, totales) en los cuatro cuadrantes de las esquinas.
El número de células/ml resultó del promedio de células contadas (vivas,
20 ml/min Hígado canulado por vena porta
Soluciones salen por la vena cava inferior
Solu
ción
pre
-pe
rfus
ión
Solu
ción
pe
rfus
ión
Solu
ción
pos
-pe
rfus
ión
(1) (2) (3) Carbógeno
Oxigenación de soluciones a través de manguera permeable a gases
39ºC
Material y métodos
47
muertas, totales) en los cuatro cuadrantes multiplicado por 105 (factor que
incluye la dilución 1/10 y el volumen de la cámara de 0,1 mm3 o 10-4 cm3). La
viabilidad porcentual se calculó dividiendo el número de células viables por el
número de células totales y multiplicando por 100.
1.3 Mantenimiento en cultivo de hepatocitos primarios
Una vez realizado el recuento celular y determinado el porcentaje de células
viables, se sembraron en distintos soportes con el medio de “pegado”, en el
que se incubaron 5-6 horas (hs) a 37°C y 5 % de CO2. El número de
hepatocitos sembrados dependió de las distintas superficies de los soportes de
cultivo. Luego de permitir el pegado de las células, se cambió el medio por el
de “post-attachment” o “post-pegado” [199:MEM 1:4, BSA 1g/l, insulina 5 mg/l,
HCO3Na 26,2 mM, estreptomicina 100 μg/ml, penicilina 100 UI/ml,
hidroxicortisona 0,6 mM (Sigma), SFB 10 %] y se incubaron a 37°C y 5 % CO2
el tiempo necesario para los distintos experimentos.
2. Mantenimiento en cultivo de la línea celular Clone-9
La línea celular clone 9 (C9) deriva de células de hígado normal de ratas
Sprague-Dawley (European Collection of Cell Cultures, ECACC, Ref. N°
88072203). Las células se cultivaron en medio Ham´s F12-K (Sigma)
suplementado con HCO3Na 0,25 %, SFB 10 %, penicilina 100 UI/ml y
estreptomicina 100 μg/ml, a 37°C y 5 % de CO2. Se pasaron 1:6 (mediante
tripsinización), dos veces a la semana.
3. Determinación de necrosis celular Se realizó a través de la determinación de liberación de lactato deshidrogenasa
(LDH) al medio. Las células se trataron con tBHP, tBHP más R o DMSO
Material y métodos
48
(vehículo) y se midió la actividad enzimática espectrofotométricamente en
medio de cultivo y en lisados celulares a través de la velocidad de oxidación de
NADH. La mezcla de reacción contenía tampón fosfato de potasio 50 mM,
NADH 0,25 mM y piruvato 0,75 mM. A 900 μl de mezcla de reacción se agregó
10-100 μl de muestra (medio de cultivo, o lisados celulares) y se midió la
disminución de absorbancia a 340 nm durante 3 min a 30 ºC. La necrosis se
expresó como porcentaje de citotoxicidad que se obtuvo a partir de los valores
de LDH liberada al medio de cultivo con respecto a los obtenidos en los lisados
celulares para cada muestra. 4. Determinación de las especies reactivas del oxígeno con diclorofluorescein diacetato (DCF-DA)
Se utilizó el reactivo fluorescente DCF-DA (SIGMA). Este reactivo es capaz
de atravesar la membrana celular, dentro de las células es deacetilado por las
esterasas celulares y el DCF resultante que es retenido en el interior celular es
sensible a la oxidación dependiente de las especies reactivas del oxígeno que
se encuentren en esta. El DCF oxidado es fluorescente teniendo el máximo de
absorción a 495 nm y el de emisión a 530 nm.
Se utilizaron las técnicas de microscopía confocal y espectrofluorimetría
para determinar la fluorescencia producida por los distintos tratamientos. El
DCF-DA se usó en una concentración final de 20 μM. Para la microscopía
confocal se utilizaron cultivos de hepatocitos primarios en cubreobjetos. Los
tratamientos se realizaron 24 o 48 hs después de sembrados los hepatocitos y
luego de cambiar el medio. Se trataron los cultivos con tBHP y R en las
concentraciones que se detallan en el apartado de resultados. Se incubó
durante 5 hs. Treinta minutos antes de que se cumpla este tiempo se agregó el
DCF-DA. Posteriormente las células fueron lavadas 2 veces con PBS y se
fijaron con parafolmaldehido 4 % durante 15 minutos. Las células fijadas fueron
montadas sobre portaobjetos utilizando como medio de montaje glicerol 90 % y
PBS 10X 10 %. Las células se observaron utlizando un microscopio confocal
Material y métodos
49
(MRC-1024, BIORAD) junto con el software LaserSharp Acquisition (BIORAD).
Se utilizó un objetivo de inmersión 60X (Nikon).
Para determinar ROS por espectrofluorimetría se cultivaron hepatocitos
primarios (30000 células por pocillo) en placas de 24 pocillos. Los distintos
tratamientos se realizaron 24 o 48 hs después de sembrados los hepatocitos y
luego de cambiar el medio. Se incubó en presencia de resveratrol y tBHP
durante 3 hs. Treinta minutos antes de finalizar las 3 hs se agrego DCF-DA y
se siguió incubando 30 min. Posteriormente se lavaron las células 2 veces con
PBS y se lisaron con DMSO. Se midió fluorescencia en un espectrofluorímetro
(Bio-Tek, FL600) utilizando una longitud de onda de excitación de 475 nm y
una de emisión de 530 nm.
5. Determinación de actividades enzimáticas
Se tuvieron que establecer las condiciones a fin de determinar las
actividades enzimáticas de catalasa, SOD, GR, GPx, GST y NQO1. Para esto
se utilizaron métodos ya descriptos a los cuales se les realizaron
modificaciones particulares a fin de adaptarlos a nuestro sistema celular. Para
poner a punto los distintos métodos para la determinación de las actividades
enzimáticas, se utilizaron células C9. Debido a la diferente actividad observada
en HP con respecto a células C9, la cantidad de muestra que se usó para cada
medición de actividad en muchos casos fue diferente en varios órdenes de
magnitud a fin de obtener una variación lineal de actividad durante el tiempo de
medición. Esto se debe a que las células transformadas tienen un citoplasma
más oxidante que las células normales y esto en parte puede ser por una
disminución en la actividad de enzimas antioxidantes.
5.1 Extractos celulares
Los extractos celulares en los que se ensayaron las actividades enzimáticas
se realizaron a partir de cultivos de células clone 9 confluentes sembradas en
Material y métodos
50
placas de 60 mm y a partir de cultivos de hepatocitos primarios (1500000
células por placa de 60 mm). Las células se lavaron 2 veces con PBS luego de
lo cual se levantaron por raspado con scrapper en 2 ml de PBS. Las células en
suspensión fueron lisadas por sonicación durante 20 segundos y los lisados
fueron centrifugados a 13000 rpm (centrífuga SANYO-MSE-Micro Centaur)
luego de lo cual el sobrenadante que contenía las proteínas solubles fue
utilizado para determinar las actividades enzimáticas.
5.2 Catalasa
Se determinó la actividad de catalasa por el método de Aebi (Aebi H, 1984).
En una cubeta de cuarzo se agregaron 950 ml para células clone 9 o 995 ml
para hepatocitos primarios de tampón fosfato de potasio 50 mM y H2O2 30 μM
a 25 ºC. Se agregaron 50 μL de muestra para células clone 9 o 5 μl para
hepatocitos primarios, se mezcló y se colocó en el espectrofotómetro
termostatizado a 25 ºC. Se midió la descomposición del H2O2 a 240 nm.
durante 3 minutos. La actividad de catalasa se expresó como micromoles
consumidos de H2O2 por minuto por miligramo de proteína.
5.3 Superóxido dismutasa (SOD)
La actividad celular total de SOD se determinó por el método de Spitz y
Oberley (Spitz DR y Oberley LW, 1989) con modificaciones. Se preparó la
mezcla de reacción que contenía: tampón fosfato de potasio 50 mM pH 7,5,
ácido dietilentriaminopentaacético 1,33 mM, catalasa 1 U/ml, nitroblue
tetrazolium 70 μM, xantina 0,2 mM, BSA 0,13 mg/ml. Se agregó 0,8 ml de
mezcla de reacción a cada cubeta, luego se agregó 100 μl de muestra y
finalmente se comenzó la reacción con 100 μl de xantina oxidasa (0,05 U/ml).
Se determinó la formación de azul de formazán a 560 nm durante 3 min a 25
ºC. La actividad total de SOD se calculó utilizando una curva patrón de SOD
Material y métodos
51
(Sigma) que se realizó junto con la medición de las muestras y se expresó
como unidades de SOD por mg de proteína.
5.4 Glutatión peroxidasa (GPx)
Se midió la actividad de GPx por el método descrito por Flohe y Gunzler
(Flohe L y Gunzler WA, 1984). A una cubeta que contenía 600 μl tampón
fosfato de potasio 50 mM pH 7,0; EDTA 1 mM y GSH 1 mM se agregaron 100
μl de GSSG reductasa 2,4 U/ml, 100 μl de muestra y 100 μl de NADPH 1,5
mM. La mezcla se incubó durante 3 min a 37 ºC. Luego de la adición de 100 μl
de H2O2 2 mM se midió el consumo de NADPH a 340 nm durante 3 min a 37
ºC. Esto se tomó como el consumo total de NADPH. El consumo no enzimático
de NADPH se midió reemplazando la muestra por 100 μl de PBS. La tasa de
consumo enzimático de NADPH se obtiene restando al consumo total el
consumo no enzimático de NADPH. La actividad de GPx se calculó usando el
coeficiente de extinción molar 6,22 mM-1 cm-1 para NADPH y se expresó como
nmoles de NADPH consumidos por minuto por miligramo de proteína.
5.5 Glutatión reductasa (GR)
Se midió por el método previamente descrito (Wheeler CR et al., 1990). A
una cubeta que contenía 800 μl de tampón fosfato de potasio 50 mM ph 7,0;
EDTA 1 mM y GSSG 2 mM se agregó 100 μl de muestra y se inició la reacción
con 100 μl de NADPH 1,5 mM. Se midió el consumo de NADPH a 340 nm
durante 3 min a 37 ºC. Se calculó la actividad de GRH usando el coeficiente de
extinción molar 6,22 mM-1 cm-1 para NADPH y se expresó como nmoles de
NADPH consumidos por minuto por miligramo de proteína.
5.6 Glutatión-S-transferasa (GST)
Material y métodos
52
Se midió de acuerdo al método descrito anteriormente (Habig WH et al.,
1974) usando CDNB (1-cloro-2, 4-dinitrobenzeno) como sustrato. La mezcla de
reacción contenía GSH 1 mM, CDNB 1mM y BSA 1 mg/ml en tampón fosfato
de potasio 100 mM pH 7,5. A cada cubeta se le agregó 950 μl de la mezcla de
reacción y se inició la reacción agregando 50 μl de muestra. Se midió la
reducción del CDNB a 340 nm durante 3 min a 25 ºC. Se calculó la actividad
de GST usando el coeficiente de extinción molar 9,6 mM-1 cm-1 y se expresó
como nmoles de CDNB consumidos por minuto por mg de proteína.
5.7 NAD(P)H:quinona oxidoreductasa 1 (NQO1)
Se determinó de acuerdo al procedimiento descrito anteriormente (Benson
AM et al., 1980). La mezcla de reacción contenía tampón Tris-HCl 50 mM pH
7,5, Triton X-100 0,08 %, NADPH 0,25 mM, 2,6-dicloroindofenol (DCIP) 80 μM
en presencia o ausencia de dicumarol 60 μM. Se inició la reacción agregando 5
μl de muestra a 695 μl de mezcla de reacción y se determino la reducción del
DCIP a 600 nm durante 3 minutos a 25 ºC. Se determinó la actividad de NQO1
utilizando el coeficiente de extinción molar para el DCIP de 21 mM-1 cm-1 en
base a la variación de absorbancia en presencia y ausencia de dicumarol
(inhibidor de NQO1) para cada muestra. Se expresó la actividad como nmoles
de DCIP reducidos por minuto por miligramo de proteína.
6. Determinación de la concentración de proteínas solubles totales por el método de Bradford
Se utilizó el micro ensayo con el cual se pueden determinar concentraciones
de proteínas menores a 25 μg/ml (Bradford MM, 1976). En cubetas para
espectrofotometría se agregaron 0,8 ml de cada estándar (albúmina sérica
bovina 1, 5, 7, 10, 15 y 20 μg/ml) y las muestras a determinar (10 μl de cada
muestra disuelta en PBS). Posteriormente se agregó 0,2 ml de reactivo de
Bradford (Coomassie brillant blue G-250 0,6 mM, etanol 25 %, ácido orto-
Material y métodos
53
fosfórico 42,5 %). Se incubó durante 15 minutos, luego de lo cual se midió
absorbancia a 595 nm. Utilizando los valores de concentración de proteína de
los estándares, se realizó una curva patrón a partir de la cual se obtuvieron las
concentraciones de proteínas de las muestras.
7. Detección de Nrf2 por Western blot
Preparación de extractos celulares: se sembraron hepatocitos primarios
(1500000 células por placa de 60 mm). Los cultivos fueron tratados con R en
las concentraciones y durante los períodos indicados en el apartado de
resultados. Posteriormente las células fueron lavadas 2 veces con PBS y luego
fueron lisadas por sonicación. Luego de la lisis celular las muestras se
mantuvieron en hielo. Los extractos resultantes se centrifugaron durante 5 min
a 13000 rpm (centrífuga SANYO-MSE-Micro Centaur) a fin de eliminar los
detritos sólidos y se recuperó el sobrenadante que se guardó a -20ºC.
Se determinó la concentración de proteínas totales en los extractos por el
método de Bradford (ver apartado anterior).
Se sembraron los extractos en tampón de siembra (Tris-HCl 0,06 M pH 6,8;
SDS 2 %, glicerol 10%, azul de bromofenol 0,005 %, 2-mercaptoetanol 70 μM)
en geles de poliacrilamida 12 % (acrilimida/bis-acrilamida 12 %, Tris-HCl 1,5 M
pH 8,8; SDS 0,1 %, amonio persulfato 0,1 %, TEMED 0,04 %) con gel de
stacking (archilamida/bis-acrilamida 5,1 %, Tris-HCl 1 M pH 6,8; SDS 0,1 %,
amonio persulfato 0,1 %, TEMED 0,1 %). Se corrió la electroforesis durante 2
hs a 100 V (Mini-Protean® 3 Cell, BioRad) en tampón de corrida (Tris-HCl 25
mM, glicina 192 mM, SDS 0,1%, ph 7,5). Se corrieron geles por duplicado, uno
de los cuales se transfirió mientras que el otro se tiñó con Coomasie Blue. La
tinción se realizó usando una solución de Coomasie Blue R-250 al 0,05%
(Sigma), ácido acético 10% e isopropanol 25% e incubando el gel en esta
solución durante 1 h. Finalmente se decoloró calentando el gel en agua
calentando en un horno microondas.
Material y métodos
54
La transferencia se realizó a membranas de PVDF (InmobilonTM-P,
Millipore). Se transfirió durante 1 h a 100 V (Mini-TransBlot® Electrophoretic
Transfer Cell, BioRad) en tampón de transferencia (Tris-HCl 25 mM, glicina 192
mM, metanol 10%, pH 7,5). Se tiñeron los geles transferidos con Coomasie
Blue a fin de determinar si se había realizado una transferencia correcta.
Luego de las transferencias se bloquearon las membranas con leche en
polvo desnatada al 5% disuelta en PBS durante al menos 2 hs con agitación.
Posteriormente se incubaron las membranas con el anticuerpo anti-Nrf2
(policlonal de conejo, Santa Cruz Biotechnologie) en una dilución de 1:3000
disuelto en PBS con 0,5% de BSA durante 2 hs con agitación. Se lavaron las
membranas 3 veces durante 15 min con PBS luego de lo cual se incubaron con
el segundo anticuerpo marcado con HRP (anti IgG de conejo, policlonal de
burro, Jackson ImmunoResearch), en dilución 1:12000 disuelto en PBS y BSA
0,5%. Se incubó durante 1 h luego de lo cual se lavó con PBS 3 veces durante
5 min. Se revelaron las membranas por quimioluminiscencia utilizando el kit
ECL Plus (Amersham Pharmacia Biotech) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. Luego del último lavado se eliminó el exceso de PBS de las
membranas y se agregó sobre el lado en el que estaban las proteínas el
reactivo de detección. Se incubó durante 5 min a temperatura ambiente luego
de lo cual se eliminó el exceso de reactivo, se envolvieron las membranas en
SaranWrap y se colocaron en un casete en donde se expusieron a placas
fotográficas (AGFA-CURIX RP2). Las placas radiográficas se densitometraron
con el sistema de imágenes VersaDocTM y el programa Quantity One®.
8. Inmunocitoquímica de Nrf2
Se cultivaron hepatocitos primarios en cubreobjetos. Cuarenta y ocho hs
después de sembrados los hepatocitos, se trataron con R 25, 50 y 75 μM
durante 5 y 24 hs. Luego de los tratamientos se lavaron los cubreobjetos 3
veces con PBS y se fijaron usando paraformaldehido 4% (Sigma) disuelto en
PBS durante 15 min a 4ºC. Posteriormente se lavaron los cubreobjetos 3 veces
Material y métodos
55
con PBS durante 5 min, se permeabilizaron las células con Triton-X100 0,2%
disuelto en PBS durante 5 min y se bloqueron los cubreobjetos con BSA 0,5 %
disuelta en PBS. Se incubaron las células en presencia de anti-Nrf2 (policlonal
de conejo, Santa Cruz Biotechnologie) en una dilución 1:1000 durante 3 hs y
se lavaron 3 veces con PBS durante 15 min. Luego se incubaron con el
segundo anticuerpo anti-Ig conejo de burro conjugado con el fluoróforo (Alexa
fluor 532, A11009) en una dilución 1.10000 durante 2 hs, se lavaron 3 veces
con PBS durante 15 minutos, para finalmente montar los cubreobjetos sobre
portaobjetos utilizando glicerol 90 % en PBS como medio de montaje. Los
preparados se analizaron con un microscopio confocal (MRC-1024, BIORAD)
junto con el software LaserSharp Acquisition (BIORAD).
9. PCR cuantitativa
Se trataron cultivos de hepatocitos primarios con R 50 y 75 μM durante 24 hs.
Luego del tratamiento las células fueron lisadas y se extrajo el ARN total
utilizando el kit comercial RNeasy Mini Kit (QIANGEN) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Se determinó la concentración y pureza del ARN
espectrofotométricamente. Posteriormente se comprobó la integridad a través
de una electroforesis en agarosa en presencia de formaldehído. Luego de la
transcripción reversa de las muestras de ARN con oligo dT, las muestras
fueron diluidas 1 / 50 y se analizaron por PCR cuantitativa utilizando un kit
comercial (Roche Applied Science) y el instrumento y software del mismo
fabricante (Roche 1.5 LightCycler®, Roche 3.5.3 LightCycler software). Los
oligonucleótidos utilizados en la amplificación fueron, para el ARNm codificante
para Nrf2: 5´ GCAACTCCAGAAGGAACAGG 3´ y 5´
GGAATGTCTCTGCCAAAAGC 3´ y para el ARNm codificante para ciclofilina:
5´ CTGCACTGCCAAGACTGAATG 3´ y 5´ TTGCCATTCCTGGACCCAAA 3´.
Éste último se utilizó como estándar interno a fin de normalizar la cantidad de
Material y métodos
56
muestra inicial de ADNc en cada reacción de amplificación. Cada condición se
analizó por triplicado y se realizaron tres experimentos.
10. Determinación de proliferación celular
La proliferación celular se midió por dos métodos, por una parte se estudió
la incorporación de deoxi-bromouridina y por otra se determinó contenido de
ADN total en hepatocitos primarios y células C9 sometidas a distintos
tratamientos.
10.1 Incorporación de deoxi-bromouridina (dBrU)
Se utilizó un kit comercial para determinación de proliferación (5-Bromo-2´-
deoxy-uridine Labeling and Detection Kit III, Roche ®).
Se trataron hepatocitos primarios sembrados en placas de 96 pocillos con
factor de crecimiento hepático (HGF). Se incubó en presencia de este factor
durante 48 hs, renovando el medio y el factor a las 24 hs. Luego de este
período se renovó el medio y el factor de crecimiento pero en esta ocasión
también se agregó R 25, 50 y 75 μM o vehículo (DMSO) y dBrU. Se siguió
incubando durante 24 hs. Finalmente se determinó espectrofotometricamente
la incorporación del dBrU siguiendo las instrucciones del kit utilizado. En breve,
luego de las incubaciones, se lavaron las células con medio de cultivo
completo 3 veces, se fijaron con etanol 70 % en HCl 0,5 N. Luego de la fijación
se lavaron las células con medio de cultivo completo y se trataron con
nucleasas a fin de degradar parcialmente el ADN y facilitar la detección de la
dBrU. Se volvió a lavar con medio de cultivo completo y se agregaron los
fragmentos de anticuerpos monoclonales FAB específicos para dBrU unidos a
peroxidasa. Luego de esto se lavaron las células con PBS y BSA 0,1 %.
Finalmente se agregó el sustrato para la peroxidasa y se midió absorbancia a
405 nm y a una longitud de onda de referencia de 500 nm.
Material y métodos
57
En el caso de las células C9, se incubaron cultivos de éstas células al 80 %
de confluencia en presencia de R 25, 50 y 75 μM, o vehículo (DMSO) durante
24 hs. Luego de esta incubación se analizó incorporación de dBrU de la misma
manera que en hepatocitos primarios
10.2 Medición del contenido de ADN total celular
Se trataron hepatocitos primarios con HGF y R y células C9 con R de la
misma manera que en el apartado anterior. Posteriormente se lisaron con
tampon TNE (NaCl 150 mM, Tris HCl 25 mM pH 7,8, EDTA 1 mM, SDS 1 %).
Se generó una curva estándar espectrofluorimétricamente (λex=356;
λem=458) utilizando ADN de esperma de salmón con un rango de 0-800 ng de
ADN utilizando Hoechst 33258 1 / 20000 diluido en PBS y NaCl 2 M pH 7,4. Se
incubaron 10 μl de los lisados celulares con solución de Hoechst 33258 en las
mismas condiciones que los estándares durante 30 min, luego de lo cual se
midió fluorescencia y se extrapoló de la curva estándar las concentraciones de
ADN de las distintas muestras.
Material y métodos
58
Resultados
59
RESULTADOS 1. Determinación de la citotoxicidad del resveratrol en hepatocitos
Inicialmente realizamos experimentos a fin de determinar si el R es
citotóxico para los cultivos celulares que utilizamos para la realización de este
trabajo. Se determinaron necrosis y apoptosis a distintos períodos de tiempo y
usando diferentes concentraciones de R tanto en HPs como en células C9.
1.1 Acción del resveratrol sobre la viabilidad de hepatocitos en cultivo
Se trataron cultivos de hepatocitos (1500000 células por placa de 60 mm) y
cultivos de células C9 al 90 % de confluencia con R 25, 50 y 75 μM. Se agregó
el R 24 hs después de sembrados los hepatocitos primarios y luego de cambiar
el medio. Se determinó necrosis celular midiendo liberación de LDH al medio a
distintos tiempos. Se observó, en ambos casos, que para concentraciones de
hasta 50 μM de R no habian variaciones significativas en la liberación de LdH
al medio con respecto a los cultivos control (Figura 6).
Figura 6: Determinación de actividad de LdH liberada al medio en cultivos de células clone 9 (A) y HP (B) tratados con R. Control: ●, R 25 μM: ▼, R 50 μM: ■, R 75 μM: ♦. Se muestran en las gráficas las medias ± DE (n = 3). * p < 0,05 con respecto al control; ** p < 0,01 con respecto al control
Tiempo (hs)
% c
itoto
xici
dad
0 5 10 15 20 25 301
2
3
4
5
6
** **
Tiempo (hs)0 10 20 30 40 50 60
% c
itoto
xici
dad
1
2
3
4
5
6
7
8
9
** *
A B
Resultados
60
Se pudo observar que el R 75 μM induce necrosis en cultivos de hepatocitos
primarios así como en células clone 9. La necrosis en cualquiera de los casos
no fue pronunciada, siendo la variación de aproximadamente 2 % a las 48 de
incubación en presencia de R en células C9 y en hepatocitos primarios.
1.2 Apoptosis
Se trataron cultivos de HP y células C9 en las mismas condiciones que para
el caso del estudio de necrosis. Veinticuatro horas después de agregado el R
se levantaron las células junto con el medio y se determinó apoptosis por
medición de actividad de caspasa 3 y por citometría de flujo.
No se observaron variaciones en la apoptosis en las células tratadas con R
con respecto a los cultivos control, tanto para los HPs como para las células C9
(no se muestran los resultados).
2. Inhibición del estrés oxidativo por resveratrol
A fin de determinar si el R ejerce un efecto antioxidante químico directo a
través de la eliminación de especies reactivas del oxígeno se realizaron
experimentos en los que se trataron cultivos de HP con R y el agente oxidante
tBHP que fueron agregados al mismo tiempo y se determinó la presencia de
ROS luego de distintos períodos de tiempo. Las determinaciones de especies
reactivas se realizaron espectrofluorimétricamente y por microscopía de
confocal.
2.1 Determinación espectrofluorimétrica de ROS
Se trataron hepatocitos primarios con tBHP 0,5 y 1 mM y R 50 μM durante 3
hs. Ambos reactivos se agregaron al mismo tiempo. Treinta minutos antes de
finalizar este período se agregó DCF-DA en una concentración final de 20 μM y
se siguió incubando hasta alcanzar las 3 hs, luego de lo cual las células fueron
Resultados
61
lisadas y se determinó la intensidad de fluorescencia. Los cultivos tratados con
tBHP 0,5 y 1 mM presentaron mayores intensidades de fluorescencia que las
observadas en los cultivos tratados con tBHP 0,5 y 1 mM más R 50 μM
respectivamente. Estos tratamientos resultaron en mayores intensidades de
fluorescencia que la observada en los controles (Figura 7).
Figura 7: Emisión de fluorescencia en HP tratados con tBHP y R. Los valores están expresados como medias ± la DE (n = 4). * p < 0,01 cultivos tratados con tBHP con respecto a los demás tratamientos; ** p < 0,01 con respecto al control sin DCF-DA y *** p < 0,01 con respecto al control con DCF-DA.
2.2 Determinación de ROS por microscopía confocal en hepatocitos primarios
Se trataron cultivos de hepatocitos primarios con tBHP 500 μM y R 50 y 75
μM durante 5 hs. Se agregó DCF-DA 30 minutos antes de finalizar este
período, como se describe en el apartado de materiales y métodos. Las células
fueron lavadas y fijadas y se analizaron por microscopía confocal (figura 8).
UA
F
0
500
1000
1500
2000
tBHP 0,5 mM tBHP 0,5 mM, R 50 μM
tBHP 1 mM, R 50 μM tBHP 1 mM
Control con DCF-DA Control sin DCF-DA
********
**** *****
**
***
**
*
Resultados
62
Figura 8: Microscopía confocal de HP tratados con tBHP y R. Las células tratadas con tBHP presentan una mayor intensidad de fluorescencia que las tratadas con tBHP más R. Las células control muestran la menor intensidad de fluorescencia de todos los tratamientos analizados. Las células redondeadas que se observan en todos los casos son células muertas.
Se pudo observar una mayor intensidad de fluorescencia en las células
tratadas con tBHP 300 μM con respecto a las células control, en donde la
intensidad de fluorescencia fue casi nula, y las tratadas con tBHP 300 μM y R
50 y 75 μM.
Se enfocaron las células con luz blanca previo a la exposición al láser de
manera de evitar en lo posible la oxidación del DCF por la acción de este. Se
Control
tBHP 300 μM
tBHP 300 μM, R 75 μM tBHP 300 μM, R 50 μM
tBHP 300 μM
Control
Resultados
63
tomaron las imágenes de cada campo luego de una única exposición al láser a
fin de obtener las imágenes de fluorescencia.
3. Citoprotección ante el estrés oxidativo
Se trataron cultivos de HPs (1500000 células por placa de 60 mm) y células
C9 al 90 % de confluencia con resveratrol 25, 50 y 75 μM; y tBHP 300 μM para
HPs y 500 μM para células C9. Ambos reactivos se agregaron al mismo
tiempo. Se midió la liberación de LDH al medio de cultivo a distintos tiempos
(Figura 9).
Figura 9: Determinación de actividad de LdH en células clone 9 (A) y hepatocitos primarios (B) tratados con R y tBHP. Control: ●, tBHP: ▼, tBHP-R25 μM: ■, tBHP-R50 μM: ♦, tBHP-R75 μM: ▲. Se muestran en las gráficas las medias ± DE (n = 3). * p < 0,01 con respecto al control ** p < 0,01 con respecto a los cultivos tratados con R + tBHP.
Cuando las células C9 fueron tratadas con R 25, 50 y 75 μM más tBHP 500
μM, no se observó un aumento en la liberación de LDH al medio con respecto
a los cultivos control luego de 3 hs de tratamiento, mientras que solo luego de
24 hs, las células tratadas con R25 μM más tBHP 500 μM mostraron un
pequeño aumento significativo en la liberación de LDH con respecto a los
cultivos control. Las células tratadas solo con tBHP 500 μM mostraron un
marcado aumento en la liberación de LDH a las 3 hs que aumentó aún más
Tiempo (hs)0 10 20 30 40 50 60
% c
itoto
xici
dad
0
20
40
60
Tiempo (hs)0 5 10 15 20 25 30
% c
itoto
xici
dad
0
10
20
30
40
50
60
A B
*
*
*
* * * *
* **
** ** **
Resultados
64
luego de 24 hs con respecto a los cultivos control y a los tratados con R y tBHP
(figura 9A).
En cultivos de HP, las células tratadas con R 25, 50 y 75 μM más tBHP 300
μM tuvieron una mayor liberación de LDH al medio que los cultivos control pero
una menor liberación de esta enzima con respecto a los cultivos tratados solo
con tBHP 500 μM hasta las 24 hs. No se observaron diferencias entre los
cultivos tratados con R más tBHP y los tratados con tBHP luego de 48 hs. En
los cultivos tratados con tBHP se observa que se alcanza el máximo de
liberación de LDH a las 3 hs de incubación en presencia de este compuesto,
mientras que se necesitan 48 hs para alcanzar estos valores cuando las
células fueron tratadas con R más tBHP (figura 9B).
Los datos obtenidos en células C9 como en HP indican que el R ejerce un
efecto antioxidante químico efectivo en ambos tipos de cultivos celulares. Este
efecto citoprotector es más pronunciado en células C9 que en HP (figura 9).
4. Efecto del pre-tratamiento con R sobre la capacidad antioxidante en hepatocitos primarios
A fin de determinar si el R altera la capacidad antioxidante endógena de los
hepatocitos primarios en cultivo, se incubaron los mismos con R 25, 50 y 75
μM durante 24 hs. Luego de esta incubación, se cambió el medio y se agregó
tBHP 300 μM y se continuó la incubación por otras 24 hs más. Se tomaron
muestras del medio de cultivo a las 3 y 24 hs, se levantaron las células y se
lisaron. Tanto en las muestras de medio como en los lisados celulares, se
determinó actividad de LDH a fin de obtener el % de muerte celular por
necrosis luego de los distintos tratamientos (figura 10). La observación de
citoprotección a través de un aumento de la actividad de las enzimas
detoxificadoras de especies reactivas, sería un indicativo de que el R podría
aumentar la capacidad antioxidante en el hígado por este mecanismo.
Resultados
65
Se observó que los cultivos pre-incubados con R 25, 50 y 75 μM antes de
ser expuestos al oxidante, tenían un porcentaje menor de muerte celular que
los cultivos tratados solo con el agente oxidante lo que indicó que el R estaría
aumentando las actividades de las enzimas antioxidantes celulares, e
induciendo de esta manera una mayor capacidad celular para resistir el estrés
oxidativo. En todos los casos anteriores, los porcentajes de muerte celular
fueron mayores que los observados en los cultivos control.
La mayor citoprotección se obtuvo cuando se usó R 50 μM, caso en el cual
se observó que hubo un aumento muy pequeño en el porcentaje de muerte
celular, de aproximadamente un 10 % con respecto a los cultivos control.
Contrariamente a lo que cabría esperarse, el R 75 μM mostró una menor
capacidad citoprotectora que el R 50 μM. Hay que notar en este caso que el R
75 μM es levemente citotóxico para los hepatocitos primarios, lo que podría ser
la causa de los resultados observados en este experimento. Aún así, se obtuvo
citoprotección preincubando con R a esta concentración cuando
posteriormente se expusieron los cultivos a estrés oxidativo.
Previo a levantar las células luego de las 24 hs de exposición a tBHP 300
μM, se analizaron los cultivos por microscopía de campo claro y se tomaron
Figura 10: Determinación de liberación de LDH al medio en cultivos de hepatocitos primarios pre-incubados con R 25, 50 y 75 μM y posteriormente expuestos a tBHP 300 μM. Control: ●, tBHP 300 μM: ▼, R 25 μM + tBHP 300 μM: ■, R 50 μM + tBHP 300 μM: ♦, R 75 μM + tBHP 300 μM: ▲. * diferencias significativas con respecto al control p < 0,01 (n=3). ** diferencias significativas con respecto a los cultivos tratados con R p < 0,01 (n=3). *** diferencias significativas entre los cultivos tratados con R 25 y 75 μM + tBHP 300 μM y los tratados con R 50 μM + tBHP 300 μM. p < 0,01 (n=3).
Tiempo (hs)0 5 10 15 20 25 30
% c
itoto
xici
dad
0
20
40
60
80
*** *****
**
****
* *
Resultados
66
fotos a fin de poder observar el estado de las células luego de los distintos
tratamientos (figura 11).
Figura 11: Imágenes de los cultivos de hepatocitos primarios luego de la pre-incubación con R 25, 50 y 75 μM durante 24 hs más la posterior exposición a tBHP 300 μM durante otras 24 hs. Las fotos fueron tomadas con un aumento de 200 X. En los cultivos tratados solo con tBHP se pueden observar “blebings” (flecha sólida), desaparición de las estructuras del tipo de canalículo biliar (flecha discontinua, señalados en los cultivos control en donde se aprecian de manera más clara) y agrupaciones de células muertas (flecha de puntos).
tBHP 300 μM-R50 μM
tBHP 300 μM-R75 μM
tBHP 300 μM-R25 μM
Control
tBHP 300 μM
Resultados
67
Se observó que las células que solo fueron expuestas al estrés oxidativo,
por agregado de tBHP, presentaron alteraciones morfológicas importantes con
respecto a los demás tratamientos. En muchos casos los núcleos celulares
fueron difícilmente identificables, también se observó daño en las membranas
celulares (“blebing”) y desaparición de las estructuras del tipo de canalículo
biliar que eran fácilmente identificables en los demás casos. Todas estas
alteraciones no se observaron en los cultivos pre-incubados con R que luego
fueron expuestos al tBHP.
5. Efecto del R sobre la actividad enzimática antioxidante en HP
Debido a que observamos que el R afecta la capacidad antioxidante
endógena de los hepatocitos primarios haciéndolos más resistentes al estrés
oxidativo, decidimos determinar la actividad de las enzimas detoxificadoras y
antioxidantes encargadas de eliminar las especies reactivas del oxígeno y los
productos de la acción de éstos en las células. Medimos actividad de catalasa,
superóxido dismutasa, glutatión reductasa, glutatión peroxidasa, NADPH
quinona oxidoreductas y glutatión-S-transferasa.
Para la determinación de todas las actividades enzimáticas, se trataron
cultivos de hepatocitos primarios (1500000 células por placa) con R 25, 50 y 75
μM. Luego de 24 o 48 hs de tratamiento, se midieron las actividades de
catalasa, SOD, GR, GPx, NQO1 y GST.
5.1 Actividad de catalasa y SOD
Se observó un aumento significativo en la actividad de catalasa para las 3
concentraciones de R ensayadas durante 24 y 48 hs (figura 12A, tabla 1 pag.
72). Cuando las células se incubaron en presencia de R 25, 50 y 75 μM
durante 24 hs se observó un aumento de 1,1; 1,2 y 1,7 veces con respecto al
control respectivamente, mietras que luego de 48 hs, el aumento fue de 1,2;
1,5 y 1,9 veces con respecto al control.
Resultados
68
Para el caso de SOD, se observó un aumento en su actividad en las células
tratadas con R 50 y 75 μM durante 24 hs de 1,1 y 1,3 veces con respecto al
control respectivamente, mientras que en las células tratadas con R durante 48
hs, solo hubo un aumento significativo, de 1,3 veces con respecto al control, en
la actividad enzimática para el tratamiento con R 50 μM (figura 12B, tabla 1
pag. 72)
Figura 12: Actividad de catalasa (A) y SOD (B) en cultivos de hepatocitos primarios tratados con R 25, 50 y 75 μM. Se muestran las medias ± DE (n = 3). * p < 0,01 y ** p < 0,05. Los experimentos fueron realizados 3 veces cada uno con resultados similares.
B
U/m
l
0
2
4
6
8
10
48 hs 24 hs
** * *
Control R 25 μM R 50 μM R 75 μM
24 hs 48 hs
A
μmol
es H
2O2/
min
/mg
prot
eína
0
50
100
150
200
250
300
350 Control R 25 μM R 50 μM R 75 μM * *
*
* *
*
Resultados
69
5.2 Actividad de GR y GPx
Solo se observaron aumentos significativos en la actividad de GR cuando
las células fueron tratadas R 25 y 50 μM durante 48 hs (figura 13A, tabla 1 pag.
72). El aumento observado fue de muy baja magnitud.
La actividad de GPx solo se vio aumentada en hepatocitos primarios
tratados con R 50 y 75 mM durante 48 hs. No se observaron cambios en la
actividad enzimática en HP tratados con R durante 24 hs (figura 13B, tabla 1
pag. 72).
Figura 13: Actividad de GR (A) y GPx (B) en cultivos de hepatocitos tratados con R 25, 50 y 75 μM. Se muestran las medias ± DE (n = 3). * p < 0,01. Los experimentos fueron realizados 3 veces cada uno con resultados similares.
24 hs 48 hs
nmol
es N
ADP
H/m
in/m
g pr
oteí
na
0
20
40
60
80
100
120
A
* * Control R 25 μM R 50 μM R 75 μM
nmol
es N
AD
PH/m
in/m
g pr
oteí
na
0
200
400
600
800
48 hs 24 hs
* * Control R 25 μM R 50 μM R 75 μM
B
Resultados
70
5.3 Actividad de NADPH quinona oxidoreductasa y glutatión-S-transferasa
La actividad de NQO1 se vio incrementada en HP tratados con R 25, 50 y
75 μM a las 24 y 48 hs. A las 24 hs el aumento en la actividad enzimática fue
de 1,7; 1,8 y 1,7 veces en los cultivos tratados con R 25, 50 y 75 μM
respectivamente con respecto a los cultivos control, mientras que a las 48 hs el
aumento en actividad fue de 1,3; 1,5 y 1,5 veces en los cultivos tratados con R
25, 50 y 75 μM con respecto a los cultivos control. El incremento fue más
pronunciado cuando las células fueron tratadas con R durante 24 hs con
respecto a las células tratadas durante 48 hs (figura 14A, tabla 1 pag. 72).
También hubo un incremento en la actividad de GST de 1,6; 1,8 y 1,7 veces
con respecto a los cultivos control en las células tratadas con R 25, 50 y 75 μM
respectivamente durante 24 hs, mientras que dicho aumento fue de 1,2; 1,6 y
1,6 veces con respecto al control en las células tratadas con R 25, 50 y 75 mM
respectivamente durante 48 hs. Se observó, al igual que con la actividad de
NQO1, que el aumento en la actividad de GST fue de mayor magnitud cuando
las células fueron tratadas con R durante 24 hs (figura 14B, tabla 1 pag. 72).
Igualmente el incremento en actividad observado luego de 48 hs de tratamiento
es importante.
nmol
es d
e D
CIP
/min
/mg
prot
eína
0
1000
2000
3000
4000
5000
24 hs 48 hs
A
* * *
* * *
Control R 25 μM R 50 μM R 75 μM
Resultados
71
Figura 14: Actividad de NQO1 (A) y GST (B) en cultivos de HP tratados con R 25, 50 y 75 μM. Se muestran las medias ± DE (n = 3). * p < 0,01 y ** p < 0,05. Los experimentos fueron realizados 3 veces cada uno con resultados similares.
En la tabla 1 se resumen las actividades enzimáticas medidas para
catalasa, SOD, GR, GPx, GST y NQO1, en los cultivos de hepatocitos
primarios tratados con R 25, 50 y 75 μM.
nmol
CD
NB
-GSH
/min
/mg
prot
eína
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
48 hs 24 hs
B
* * *
**
* *
Control R 25 μM R 50 μM R 75 μM
Resultados
72
Hep
atoc
itos
prim
ario
s CA
TALA
SA
(1)
SOD
(2)
GR
(3)
GPx
(3)
NQO
1 (4
) GS
T (5
)
C (D
MS
O)
177.
1 ±
1.4
5.4
± 0.
2 83
.7 ±
3.6
36
5.1
± 32
.0
2034
.5 ±
240
.4
605.
8 ±
52.9
R
25
μM
194.
6 ±
1.3a
5.3
± 0.
3 94
.0 ±
1.8
37
2.7
± 19
.0
3475
.7 ±
203
.7b
987.
7 ±
184.
1a R
50
μM
209.
1 ±
3.4a
6.1
± 0.
2b 88
.9 ±
1.5
42
6.0
± 15
.1
3651
,0 ±
572
.1a
1113
.6 ±
75,
0a 24
hs
R 7
5 μM
29
6.8
± 2.
2a 6.
8 ±
0.2a
76.9
± 4
.1
406.
3 ±
32.9
35
14.2
± 7
90.3
a 11
04.4
± 1
96.5
a C
(DM
SO
) 11
5.3
± 6,
0 5.
8 ±
0.4
85.1
± 0
.7
352.
3 ±
9.6
2589
.4 ±
212
.4
619.
8 ±
48.7
R
25
μM
137.
6 ±
6,0a
6.4
± 0.
1 95
.1 ±
2.7
a 39
7.9
± 34
.1
3342
.4 ±
34.
0a 72
3.5
± 37
.3b
R 5
0 μM
16
9.7
± 6.
4a 7.
3 ±
0.1a
97.7
± 2
.4a
568.
2 ±6
7.2a
3869
.4 ±
40.
6a 98
0.0
± 10
0.9a
48 h
s
R 7
5 μM
21
6.7
± 2.
5a 6.
3 ±
0.3
76.1
± 5
.1
625.
0 ±6
6.6a
3872
.5 ±
264
.1a
961.
3 ±
14.6
a
Tabl
a 1:
A
ctiv
idad
es e
nzim
átic
as o
bser
vada
s en
hep
atoc
itos
prim
ario
s tr
atad
os c
on re
sver
atro
l vs
hepa
toci
tos
cont
rol
Se
real
izar
on tr
es e
xper
imen
tos
para
cad
a ac
tivid
ad e
nzim
átic
a ob
teni
éndo
se re
sulta
dos
sim
ilare
s.
(1) μ
mol
H2O
2/min
/mg
prot
eína
(2
) U/m
l (3
) nm
ol N
AD
PH
/min
/mg
prot
eína
(4
) nm
ol D
CIP
/min
/mg
prot
eína
(5
) nm
ol G
S-D
NB
/min
/mg
prot
eína
a
Dife
renc
ias
sign
ifica
tivas
con
resp
ecto
a la
s cé
lula
s co
ntro
l. p
< 0,
01 (n
= 3
). b
Dife
renc
ias
sign
ifica
tivas
con
resp
ecto
a la
s cé
lula
s co
ntro
l. p
< 0,
05 (n
= 3
).
Resultados
73
6. Localización subcelular y variación de la concentración de Nrf2 por tratamiento con resveratrol en HP 6.1 Determinación de la localización subcelular de Nrf2 por microscopía confocal
Debido a que es detectaron aumentos importantes en las actividades de
catalasa, NQO1, GST, y en menor medida de SOD, decidimos investigar si el
R activaba al factor de transcripción Nrf2 que es el encargado de regular la
expresión de estas enzimas. También determinamos si este compuesto induce
un aumento en la concentración de Nrf2 (siguiente sección).
Hepatocitos primarios crecidos en cubreobjetos fueron tratados con R 50 y
75 μM durante 5 y 24 hs. Las células fueron fijadas e incubadas con los
anticuerpos anti-Nrf2 y secundario para finalmente ser montados en
portaobjetos como se indica en materiales y métodos. Se observó la
distribución subcelular de Nrf2 por microscopía confocal (figura 15).
Se puede observar que las células tratadas con R 50 y 75 μM, tanto para las
analizadas a las 5 hs como para las analizadas a las 24 hs, muestran una
acumulación de Nrf2 en el núcleo así como una mayor cantidad total de esta
proteína con respecto a los cultivos controles. El Nrf2 no desaparece del
citoplasma en las células tratadas con R. El aumento de Nrf2 en las células
tratadas con R es coincidente con los resultados obtenidos por western blot
(ver sección siguiente). Aunque la respuesta al resveratrol se produzca en las
primeras horas de incubación, esta dura hasta al menos 24 hs, ya que se
puede observar Nrf2 presente en el núcleo celular luego de 24 hs de
incubación con R.
Resultados
74
A
R 5
0 μM
, 5 h
s
Con
trol
R 5
0 μM
, 24h
s
Resultados
75
B
Con
trol
R 7
5 μM
, 5 h
s
R 7
5 μM
, 24
hs
Resultados
76
Figura 15: Imágenes obtenidas por microscopía confocal de HP tratados con R 50 μM (A) y 75 μM (B) durante los tiempos indicados. Se muestran las secciones a lo largo del eje z del mismo plano para cada tratamiento. Las células redondeadas con similar fluorescencia en todos los tratamientos son células muertas.
6.2 Determinación de la variación en la concentración de Nrf2 por western blot
Se trataron cultivos de hepatocitos primarios con resveratrol 50 y 75 μM
durante 6, 24 y 48 hs. Las células fueron lavadas y levantadas. Luego de lisar
las células, se sembraron 25 μg de proteína soluble por calle, en geles de
poliacrilamida 12 % y se separaron electroforéticamente. Luego se transfirieron
a membranas de nylon y se realizó la detección de Nrf2 como se indica en
materiales y métodos (figura 16 A).
A
Resultados
77
Figura 15: (A) Western blots para Nrf2 en extractos celulares de hepatocitos primarios tratados con resveratrol durante los períodos de tiempo indicados, los experimentos se repitieron 3 veces con resultados similares. (B) análisis por densitometría de las bandas observadas en los western blots (n = 2, *: p < 0,05; Δ: P < 0,01).
Al analizar los western blots densitometricamente, se observa que el
resveratrol induce un aumento de la concentración intracelular de Nrf2 tanto a
50 como a 75 μM (figura 16 B). Para el caso en el que se utilizó R 50 μM se
detecta la máxima concentración de Nrf2 a las 24 hs, manteniéndose este
incremento hasta las 48 hs, mientras que para R 75 μM la máxima
concentración de Nrf2 se observa a las 24 hs. No se observa un aumento
significativo en la concentración de Nrf2 en las células tratadas con R 75 μM
durante 48 hs. Como se mencionó anteriormente, este compuesto es
levemente citotóxico para estos cultivos durante períodos largos de incubación,
lo que puede ser la causa de lo observado en este caso.
7. Niveles de ARNm codificantes para Nrf2 por PCR cuantitativa
Como se mencionó en la introducción de este trabajo, en algunos sistemas
celulares se produce un aumento en la concentración de Nrf2 a consecuencia
DO
0
5
10
15
20
25
*
* *
* * *
*
(1) (2) (3)
B
C 6hs 24hs 48hs C 6hs 24hs 48hs C 24hs 24hs
Resultados
78
de una estabilización proteica de este factor de transcripción o por una
disminución en la expresión de su represor Keap1. En otros casos, se observa
un aumento de la transcripción del gen que codifica para Nrf2. A fin de
establecer cual era el caso en HP, realizamos experimentos de PCR
cuantitativa con el objetivo de establecer si había un aumento en la
concentración del ARNm para Nrf2 en cultivos de HP tratados con R con
respecto a cultivos control.
Se trataron cultivos de HP en placas de 60 mm (1500000 células por placa)
con R 50 y 75 μM durante 24 hs. Luego del período de incubación las células
fueron levantadas de la placa y lisadas para luego extraer el ARN total (ver
materiales y métodos). Se realizó transcripción reversa utilizando oligo dT para
el ARN total, luego de lo cual se analizó la variación del ARNm codificante para
Nrf2 por PCR cuantitativa utilizando oligonucleótidos específicos para este
ARN y oligonucleótidos específicos para ciclofilina que fue empleado como
estándar interno a fin de determinar variaciones en la concentración inicial de
ADNc que se agregó por reacción de PCR (ver materiales y métodos). Se
observó un aumento en el ARNm codificante para Nrf2 en las células tratadas
con R con respecto a las células control (figura 17). Cada condición fue
analizada por triplicado y se realizaron tres experimentos con cultivos aislados
de tres animales con resultados similares.
Figura 17: Variación de la concentración de ARNm codificante para Nrf2 en HP tratados durante 24 hs con R 50 y 75 μM con respecto a cultivos control. Se muestran las medias ± DE. * p < 0,05; ** p < 0,001.
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
R 50 μM Control
R 75 μM
*
**
Resultados
79
8. Efecto del R sobre la proliferación en hepatocitos
Hepatocitos primarios o células C9 cultivados en placas de 96 pocillos
fueron tratados con R 25, 50 o 75 μM y HGF en el caso de los hepatocitos
primarios. Se determinó la proliferación en los distintos tipos celulares
determinando incorporación de dBrU y midiendo el contenido total de ADN
utilizando Hoechst 33258. Se puede observar que los hepatocitos primarios
tratados con R luego de ser inducidos a proliferar con HGF presentan una
menor tasa de incorporación de BrdU que los hepatocitos expuestos a HGF y
vehículo (figura 18A). En esta figura también se puede observar que el R no
afecta positiva ni negativamente la tasa de proliferación en hepatocitos
quiescentes. Un resultado similar se observa cuando se mide contenido total
de ADN, los hepatocitos proliferantes tratados con HGF + R 50 y 75 μM tienen
un menor contenido de ADN que los hepatocitos proliferantes tratados con
HGF y vehículo (figura 18B).
A40
5/A
490
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
*
*
Δ
ng A
DN
0
50
100
150
200
250
300
350
Control
HGF-R 25 μM
HGF-R 50 μM
HGF-R 75 μM HGF-DMSO
R 25 μM
R 50 μM
R 75 μM
Control-HGF
HGF-R 25 μM
HGF-R 50 μM
HGF-R 75 μM
Control-HGF-DMSO
**** **
A B
Resultados
80
Figura 18: Determinación de proliferación en hepatocitos primarios por detección de incorporación de dBrU (A) y por medición del ADN total (B). Se puede observar que el R inhibe la proliferación en hepatocitos primarios. Las células tratadas con R + HGF tienen una menor incorporación de dBrU y un menor contenido de ADN total que las células tratadas con HGF y vehículo. ∆ diferencias significativas con respecto a las células tratadas con R + HGF p < 0,01 (n = 8). * diferencias significativas con respecto al control sin HGF p < 0,01 (n = 8). ** diferencias significativas con respecto a las células tratadas con HGF o HGF + DMSO (vehículo) p < 0,01 (n=3).
En las células C9 se puede observar un efecto similar del R sobre la
proliferación al que se obtuvo en hepatocitos primarios. Las células tratadas
con resveratrol presentan una menor incorporación de dBrU (figura 19A) y un
menor contenido de ADN total que las células tratadas con vehículo (figura
19B). En el caso de las células C9 la dosis dependencia es significativa
mientas que en el caso de los hepatocitos primarios la dosis dependencia no lo
es pero igualmente se observa que las células tratadas con R 25 μM tienen
una mayor incorporación de BrdU que las tratadas con R 50 y 75 μM.
Figura19: Determinación de proliferación en células C9 por detección de incorporación de dBrU (A) y por medición del ADN total (B). El R inhibe la proliferación de manera docis dependiente en los cultivos de estas células. * diferencias significativas con respecto a las células control p < 0,01 (n = 8). ** diferencias significativas con respecto a las células control p < 0,01 (n = 3).
A40
5/A
490
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
* *
*
ng A
DN
0
50
100
150
200
250
300
350
**
** **
Control
R 25 μM
R 50 μM
R 75 μM
R 25 μM
R 50 μM
R 75 μM
Control R 100 μM
A B
Resultados
81
9. Efecto del estrés oxidativo en células C9 pre-incubadas con R
A fin de determinar si las células hepáticas transformadas C9 responden de
igual manera que los hepatocitos primarios al estrés oxidativo luego de ser pre-
incubadas con R, se trataron cultivos confluentes de células C9 con R 25, 50 y
75 μM o vehículo (DMSO) durante 24 hs. Posteriormente, se cambió el medio
por otro conteniendo tBHP 400 μM o vehículo para las células control y se
siguió incubando. Se tomaron muestras de medio a las 5 y 24 hs, e
inmediatamente se levantaron las células, se lisaron y se recuperó el
sobrenadante luego de centrifugar. Se determinó actividad de LDH en las
muestras de medio de cultivos y en el lisado celular. Se expresó la necrosis
celular observada para los distintos tratamientos determinando el % de
liberación de LDH al medio (figura 20).
En la figura se puede observar que las células pre-incubadas con R y luego
expuestas a estrés oxidativo muestran un mayor % de liberación de LDH al
medio que las células que solo fueron expuestas a estrés oxidativo. Excepto
las muestras correspondientes a las células tratadas con R25 μM y luego
expuestas a tBHP 400 mM tomadas a las 3 hs de exposición al agente
oxidante, todas las demás muestras correspondientes a células pre-incubadas
Tiempo (hs)0 5 10 15 20 25 30
% c
itoto
xici
dad
0
10
20
30
40
50 Figura 20: Determinación de liberación de LDH al medio en cultivos de células C9 pre-incubadas con R 25, 50 y 75 μM y posteriormente expuestos a tBHP 400 μM. Control: ●, tBHP 400 μM: ▼, R 25 μM + tBHP 400 μM: ■, R 50 μM + tBHP 400 μM: ♦, R 75 μM + tBHP 400 μM: ▲. * diferencias significativas con respecto al control p < 0,01 (n=3). ** diferencias significativas con respecto a los cultivos tratados con tBHP 400 μM p < 0,01 (n=3).
*
*
* ****
****
****
**
Resultados
82
con R y luego expuestas a tBHP 400 mM presentan un mayor porcentaje de
muerte celular con respecto a las células expuestas solo al agente oxidante a
los dos períodos de tiempo ensayados. Esto indica que el R sensibiliza a las
células C9 a la muerte por estrés oxidativo. En este caso se observa lo
contrario que lo observado en hepatocitos primarios en donde la pre-
incubación con R protege a las células de la muerte por este tipo de estrés
(figura 10).
Antes de levantar las células para lisarlas y realizar la determinación de
LDH que se muestra en la figura 20, los cultivos fueron fotografiados utilizando
un microscopio a fin de observar el aspecto morfológico que presentaban las
células luego de los distintos tratamientos (figura 21).
En las fotos de la figura 21 se puede observar que en las células pre-
incubadas con R que posteriormente fueron expuestas a R existen alteraciones
morfológicas importantes para las tres concentraciones de R utilizadas. En los
cultivos tratados con R 25 μM todavía quedan células con morfología normal,
mientras que estas no se pueden observar en los cultivos tratados con R 50 y
75 μM. En los cultivos tratados solo con tBHP 400 μM se aprecian células
muertas o dañadas pero la mayoría de las células presentan una morfología
normal en comparación con las células control.
Además de determinar necrosis celular se determinó apoptosis por
determinación de actividad de caspasa 3, sin observarse variaciones
significativas entre los distintos tratamientos (no se muestran los resultados).
Resultados
83
Figura 21: Imágenes de los cultivos de células C9 luego de la pre-incubación con R 25, 50 y 75 μM durante 24 hs más la posterior exposición a tBHP 400 μM durante otras 24 hs. Las fotos fueron tomadas con un aumento de 200 X.
tBHP 400 μM-R25 μM
tBHP 400 μM-R50 μM
tBHP 400 μM-R75 μM
tBHP 400 μM
Control
Resultados
84
Discusión
85
DISCUSIÓN 1. Sistema celular de estudio
El sistema de hepatocitos maduros en cultivo que mantienen varias de las
funciones específicas del hígado es un modelo de gran utilidad para el estudio
de la acción de compuestos que pueden afectar la función hepática.
Para la realización de este trabajo se utilizaron cultivos de HP y de células
C9. Las técnicas de obtención y mantenimiento en cultivo de HP fueron
previamente descritas (Berry MN y Friend DS, 1969; Seglen PO, 1972; Berry
MN, 1974; Seglen PO, 1976). Posteriormente en este laboratorio se
introdujeron modificaciones que fueron utilizadas en la obtención y cultivo de
células para este trabajo (Pazo J et al., 2002). La utilización de esta técnica
nos permitió obtener hepatocitos aislados con una alta viabilidad luego de la
perfusión (80 – 90 %). Las células obtenidas son en su mayoría hepatocitos,
debido a que estos representan alrededor del 80 % del hígado. Las células no
parenquimáticas representan un 6,6 % siendo estas células endoteliales (2,8
%), células de Kupffer (2,1 %) y células de Ito (1,4 %). A fin de inhibir la
proliferación de fibroblastos contaminantes se utilizó hemisuccinato de
cortisona en el medio de cultivo.
Inicialmente en este trabajo se determinó el efecto del R sobre la viabilidad
de cultivos de HP y células C9. Luego de establecer que este compuesto no
era citotóxico hasta concentraciones de 50 μM mientras que era levemente
citotóxico a una concentración de 75 μM, se estudió la capacidad antioxidante
del R en cultivos de HP. Se observó que el R ejerce un efecto antioxidante
directo ante la exposición a ROS y que a su vez induce un aumento en la
actividad de enzimas antioxidantes y detoxificadoras. Posteriormente se
determinó que el R activa el factor de transcripción Nrf2 que controla la
expresión de las enzimas antioxidantes y de fase II, aumentando su
concentración y la del ARNm que lo codifica. También se estableció que el R
inhibe la proliferación de HP y células C9. Finalmente, se determinó si el R
ejerce un efecto diferencial en HP con respecto a las células hepáticas
Discusión
86
transformadas C9 expuestas a estrés oxidativo, observándose que en estas
últimas el R sensibiliza los cultivos hacia este tipo de estrés mientras que en
HP proteje ante esta agresión.
2. Estudios de viabilidad en células hepáticas tratadas con R
Inicialmente se determinó el efecto del R en cultivos de HP y en cultivos de
células C9. Esto se realizó a fin de evaluar si concentraciones que se pueden
considerar fisiológicas para el ser humano eran tolerables para los cultivos
antes mencionados durante distintos períodos de tiempo. Estos experimentos
mostraron que el R no induce apoptosis, medida por determinación de
actividad de caspasa 3, tanto en HP así como en células C9 en ninguna de las
concentraciones y tiempos de incubación ensayados. En el caso del estudio de
necrosis, que se realizó determinando la liberación de LdH al medio de cultivo
luego de la adición del R, e incubando durante distintos período, se observó
que el R 75 μM, que es la mayor concentración utilizada, induce necrosis en
HP y células C9. A esta concentración se halló daño celular cuando se
observaron los cultivos bajo el microscopio luego de 48 hs de incubación con
R. Cabe destacar que la citotoxicidad detectada luego de 48 hs de incubación
de los dos tipos celulares con R 75 μM es significativa, pero de muy pequeña
magnitud, siendo la diferencia en el % de citotoxicidad entre los cultivos de HP
y células C9 tratadas con R 75 μM de aproximadamente 2 % con respecto a
los cultivos control (figura 6).
En relación a la inducción de apoptosis y necrosis por parte del R, la
mayoría de las investigaciones se han realizado en líneas celulares tumorales
debido al interés que ha despertado este compuesto debido a su potencial uso
como anticancerígeno. Previamente otros grupos de investigación han
determinado que el R induce apoptosis en varias líneas celulares cancerígenas
(Joe AK et al., 2002; Kuo PL et al., 2002; Aggarwal BB et al., 2004). Esto no es
lo que observamos en la línea celular hepática transformada C9. Se obtuvo el
mismo efecto tanto en HP como en células C9. El compuesto no presentó
efecto citotóxico hasta concentraciones de 50 μM mientras que fue levemente
Discusión
87
citotóxico a una concentración de 75 μM. La citotoxicidad se manifestó como
necrosis y no como apoptosis como en los casos arriba mencionados.
3. Efecto antioxidante del R 3.1 Determinación de la capacidad antioxidante del R en cultivos de HP
Posteriormente se determinó la capacidad antioxidante del R en cultivos de
HP sometidos a estrés oxidativo con tBHP. Se observó que el R disminuye la
concentración de especies reactivas del oxígeno generadas por la adición de
tBHP. Esto se realizó a través de la determinación de fluorescencia generada
por la diclorofluoresceína oxidada, que se genera en las células luego de su
incorporación al ser tratadas con un agente oxidante como el tBHP. La
fluorescencia se detectó espectrofluorimétricamente (figura 7) y por
microscopia confocal (figura 8). En el primer caso se observó una menor
fluorescencia en cultivos tratados con R más tBHP con respecto a los cultivos
tratados solo con tBHP. En ambos casos se observó una mayor fluorescencia
con respecto a los cultivos control. En tanto que cuando se observó la emisión
de fluorescencia por microscopia confocal nuevamente los cultivos de HP
tratados con R más tBHP fueron menos fluorescentes que los cultivos tratados
con tBHP y ambos más fluorescentes que los cultivos control.
3.2 Inhibición de necrosis inducida por estrés oxidativo
Luego de determinar la capacidad antioxidante del R en cultivos de HP se
estudió la capacidad citoprotectora del R tanto en cultivos de HP así como de
células C9 tratados con tBHP. En ambos casos se agregaron ambos reactivos
al mismo tiempo a fin de determinar la acción antioxidante derecta del R.
Se observó que el R inhibe total o parcialmente la necrosis inducida por
estrés oxidativo. En cultivos de células C9 el R inhibe la necrosis inducida por
tBHP de manera total hasta las 24 hs cuando el R se utilizó en concentraciones
50 y 75 μM, mientras que la inhibición fue casi total con R 25 μM (figura 9A).
Discusión
88
En HP el R inhibe de manera parcial la necrosis inducida por estrés
oxidativo hasta las 24 hs para las tres concentraciones de R ensayadas (figura
9B). En los cultivos de HP tratados solo con tBHP se alcanza el máximo nivel
de liberación de LDH luego de 5 hs y no se observaron cambios cuando se
determinó LDH liberada al medio luego de 24 hs. En los cultivos tratados con R
más tBHP la inhibición de la necrosis luego de 5 hs de incubación es casi total
mientras que es solo parcial luego de 24 hs.
En estos estudios en que el agente oxidante y el agente protector en ensayo
se agregan conjuntamente a los cultivos celulares y están presentes durante
toda la incubación, no es posible discriminar entre una acción química directa o
la inducción y/o activación de sistemas enzimáticos protectores.
Se ha demostrado la capacidad citoprotectora del R a través de la inhibición
de la necrosis inducida por estrés oxidativo en otros sistemas en donde se ha
observado que en células cardíacas actúa como un potente citoprotector. En
cardiomiocitos se observó que su capacidad como antioxidante depende de la
inducción de enzimas detoxificadoras de especies reactivas del oxígeno así
como de enzimas de fase II (Cao Z y Li Y, 2002; , 2004; Li Y et al., 2006). En
este caso se observó que la pre-incubación con R concede una marcada
citoprotección a las células que luego son tratadas con un agente oxidante lo
que reduce la necrosis resultante. Esta citoproteccíon no resulta de la
capacidad antioxidante inherente del R sino de la inducción de enzimas
antioxidantes y de fase II como la catalasa, SOD, GR, GPx, GST, NQO1.
4. Estudio del efecto de la pre-incubación de HP con R previo a la exposición a estrés oxidativo
Luego de determinar que el R era efectivo como antioxidante en cultivos de
HP por su acción directa de eliminación de especies reactivas del oxígeno,
decidimos estudiar si este compuesto era capaz de mejorar y mantener
durante cierto tiempo la capacidad celular de detoxificación de especies
reactivas del oxígeno. Para esto se incubaron cultivos de HP en presencia de
R, luego retirarlo, fueron expuestos a estrés oxidativo. Observamos que los
Discusión
89
cultivos pre-incubados con R previo a la exposición al estrés oxidativo
presentaron un menor porcentaje de necrosis que los cultivos expuestos a
estrés oxidativo solamente. La mayor citoprotcción se observó con R 50 μM,
mientras que los valores de citoprotección obtenidos con R 25 y 75 μM fueron
similares (figura 10). Como se ha mencionado anteriormente el R 75 μM es
levemente citotóxico para los hepatocitos. Aún así las células pre-incubadas
con R 75 μM, antes de ser sometidas a estrés oxidativo, presentaron un menor
% de muerte celular que las expuestas a estrés oxidativo solamente. Esto
indicaba que el efecto sobre la capacidad antioxidante celular que produce este
compuesto prevalece con respecto a la necrosis inducida por las especies
reactivas del oxígeno, en vez de observarse un efecto acumulativo.
La observación al microscopio, también se hizo evidente la citoprotección
ejercida por la preincubación con R previo a la exposición a estrés oxidativo
(figura 11). Los cultivos pre-incubados con R y luego tratados con tBHP no
presentaron alteraciones morfológicas importantes al compararlos con los
cultivos control, mientras que los cultivos que solo fueron expuestos al agente
oxidante, presentaron claros signos de daño celular.
Los resultados obtenidos en este experimento indicaban que el R era capaz
de incrementar la capacidad antioxidante endógena de los hepatocitos, y para
comprobarlo se determinaron las actividades enzimáticas antioxidantes y de
fase II. Estas últimas son importantes para la eliminación de compuestos
tóxicos además de ser capaces de eliminar ROS o productos generados por la
acción de éstas.
5. Estudio de la actividad de enzimas antioxidantes y de fase II 5.1 Determinación de la actividad de enzimas antioxidantes y de fase II en HP
Una vez determinado el efecto antioxidante y citoprotector del R en HP y
células C9 se estudió la capacidad de este compuesto de incrementar la
actividad de las enzimas antioxidantes catalasa, SOD, GR, GPx y de las
Discusión
90
enzimas de fase II NQO1 y GST en HP. Para esto se incubaron cultivos de HP
en presencia de R 25, 50 y 75 μM.
Se observó un aumento significativo dosis dependiente en la actividad de
catalasa en cultivos tratados con R 25, 50, 75 μM tanto a las 24 como a las 48
hs (figura 12A). La actividad de SOD se vio incrementada en menor medida
que la de catalasa en los cultivos tratados con R 50 y 75 μM durante 24 hs y en
los tratados con R 50 μM durante 48 hs. Luego de 48 hs de incubación con R
aunque se observa un incremento significativo en la actividad en los cultivos
tratados con R 50 μM, esto no se observa en los cultivos tratados con R 75 μM,
lo que podría deberse a que el R en esta concentración es levemente citotóxico
para los HP en cultivo luego de 48 hs de incubación (figura 12B).
En los HP incubados en presencia de R durante 24 hs, no se observan
variaciones significativas en la actividad de GR con respecto a los cultivos
control, mientras que se observa un incremento significativo de la actividad de
GR en las células incubadas en presencia de R 25 y 50 μM luego de 48 hs. No
se observan cambios en la actividad en las células tratadas con R 75 μM para
los dos períodos ensayados (figura 13A). La actividad de GPx no sufrió
cambios significativos con respecto a los cultivos control luego de incubar las
células en presencia de R durante 24 hs. Sin embargo luego de 48 hs de
incubación en presencia de R se observó un aumento significativo en la
actividad de GPx en los cultivos tratados con R 50 y 75 μM (figura 13B).
En el caso de las enzimas de fase II, se pudo observar un aumento
importante en la actividad de NQO1 luego de incubar las células en presencia
de R 25, 50 y 75 mM luego de 24 hs. En estos aumentos de similar magnitud
no se aprecia dosis dependencia por lo que se puede concluir que la mínima
concentración de R utilizada es suficiente para inducir un aumento máximo en
la actividad de NQO1. El incremento en la actividad de NQO1 observada luego
de 48 hs de incubación en presencia de R, aunque significativa, es de menor
magnitud que la observada luego de 24 hs de incubación con R (figura 14A).
Discusión
91
En el caso de GST también se observa un importante aumento de actividad
en los cultivos tratados con R durante 24 y 48 hs. Al igual que en el caso de
NQO1, el incremento en la actividad enzimática fue mayor luego de 24 hs de
incubación con R que luego de 48 hs (figura 14B).
El menor incremento en la actividad observado luego de 48 hs de
tratamiento con R en principio no se debería a que los hepatocitos en cultivo
pierden su estado de diferenciación con la consecuente caída en la actividad
de enzimas detoxificadoras de bebido a que esto se debería ver también en los
cultivos control y no es el caso (figura 14). La razón podría ser que las células
pierden sensibilidad hacia el R luego de la subsecuente exposición a este
compuesto durante 48 hs.
Debido a que el hígado es uno de los órganos que más acumulan R luego
de su ingestión (Soleas GJ et al., 2001; Aggarwal BB et al., 2004), se puede
alcanzar una concentración de este compuesto que además de ejercer un
efecto antioxidante por si mismo, también podría ser capaz de aumentar la
actividad de enzimas antioxidantes y de fase II. El efecto antioxidante a través
del aumento en la actividad de enzimas antioxidantes tiene una mayor duración
y magnitud que el efecto antioxidante directo del R. Esto haría que la
exposición de las células al R generaría en estas una capacidad antioxidante a
más largo plazo y más efectiva aunque el R no estuviese presente. En cuanto
a su potencial acción in vivo, no sería necesaria la presencia del resveratrol en
el hígado a fin de que este tuviese una mayor capacidad antioxidante, sino que
la exposición del órgano al compuesto generaría en este un aumento en su
capacidad de detoxificar especies reactivas del oxígeno a través de un
aumento en la actividad de enzimas antioxidantes y detoxificadoras. Estas
enzimas no solo detoxifican radicales del oxígeno, sino que también están
involucradas en la eliminación y detoxificación de otros compuesto tóxicos y
cancerígenos por lo que la citoprotección que se obtendría abarcaría otros
compuestos peligrosos además de oxidantes. Recientemente se ha informado
que el R es capaz de evitar la disminución en las actividades de catalasa,
SOD, GR, GPx en hígado en ratas expuestas a etanol (Kasdallah-Grissa A et
Discusión
92
al., 2007). Este trabajo aporta evidencias que indican que el R puede ser un
antioxidante efectivo para el hígado.
6. Efectos del incremento de la capacidad antioxidante celular
El incremento en la actividad catalasa, SOD, GR y GPx representa un
beneficio para las células debido a que al incrementar su capacidad para
eliminar especies reactivas del oxígeno, estas pueden tolerar agresiones de
este tipo de una magnitud que resultaría en muerte celular en el caso de
células con valores basales de actividad de estas enzimas. Esto ha sido
demostrado en otros sistemas celulares como células vasculares de músculo
liso (Cao Z y Li Y, 2002), así como también en cardiomiocitos (Cao Z y Li Y,
2004). En estos casos también las células preincubadas con R tienen una
mayor viabilidad cuando se las expone a estrés oxidativo.
Las especies reactivas del oxígeno son responsables de importantes daños
al ADN que pueden no solo producir la muerte celular sino también inducir la
acumulación de mutaciones que están relacionadas con la aparición de células
transformadas y potencialmente tumorales (Goetz ME y Luch A, 2008). El
aumento de la capacidad antioxidante de la célula haría más rápida la
eliminación de las especies reactivas del oxígeno y que la aparición de
mutaciones potencialmente peligrosas sea menor.
7. Efectos del incremento en la actividad de enzimas de fase II
Las enzimas de fase II son responsables de la detoxificación de drogas y
xenobióticos, siendo este proceso una de las funciones principales del hígado.
Por esto, un aumento en la actividad de estas enzimas hace que esta
capacidad detoxificadora se vea incrementada. De hecho, la inducción de las
enzimas de fase II es suficiente para aumentar la protección ante una gran
variedad de agentes cancerígenos (Talalay P, 2000).
Como ejemplo de la importancia de estas enzimas en relación a la
citoprotección con respecto al cáncer se pueden citar los trabajos en donde
usando mutagénesis dirigida se han generado ratones knock out para dos
Discusión
93
enzimas de fase II (Henderson CJ et al., 1998; Radjendirane V et al., 1998). En
un caso se generaron ratones mutantes para la glutation-S-transferasa Pi, los
que mostraron una alta susceptibilidad a los tumores cutáneos. Esto demostró
que la eliminación de una única enzima encargada del metabolismo de
xenobióticos puede tener un importante efecto en lo que respecta a la
exposición a agentes cancerígenos. En otro caso se mutó el gen para NQO1 y
los ratones que carecían de esta enzima aunque fenotípicamente
indistinguibles de los ratones salvajes, presentaban una mayor susceptibilidad
a la toxicidad por menadiona.
También es importante mencionar que, niveles elevados de GST, son
consistentes con la disminución en la susceptibilidad de las células hepáticas a
la carcinogénesis (Smith GJ et al., 1977).
En el caso de humanos se puede citar el caso del benceno, que es bien
conocido como agente neoplásico para el sistema hematopoyético. Los seres
humanos se exponen al benceno a través del hábito de fumar, en el lugar de
trabajo y a través de los gases emitidos por los vehículos. Una fracción de la
población humana es polimórfica para la expresión de NQO1 y los individuos
que tienen el fenotipo NQO1 -/- son considerablemente más susceptibles a los
efectos tóxicos y neoplásicos del benceno (Smith MT, 1999). El benceno es un
procarcinógeno y es convertido en el hígado en una variedad de metabolitos
que incluyen óxido de benceno (que espontáneamente forma fenol), catecol, 1,
4-hidroquinona y 1, 2, 4-benzenotriol, por la actividad catalítica de CYP2E1.
Una vez que estos compuestos se transportan a la médula espinal, estas
hidroquinonas sirven como sustrato para la mieloperoxidasa resultando
benzoquinonas que son extremadamente genotóxicas. Es la capacidad
catalítica de NQO1 la que puede detoxificar estas benzoquinonas en el hígado
a través de reducciones de dos electrones a hidroquinonas menos tóxicas que
pueden ser excretadas.
Aunque los estudios epidemiológicos no siempre han llegado a las mismas
conclusiones en lo que respecta a la significación de esta mutación con
respecto a la susceptibilidad hacia el cáncer (Wiencke JK et al., 1997), es
Discusión
94
importante señalar que la frecuencia de polimorfismos en NQO1 está
incrementada en pacientes con cáncer de pulmón (Rosvold EA et al., 1995),
malignidades urológicas (Schulz WA et al., 1997) y leucemia mieloide (Larson
RA et al., 1999).
Todos estos datos demuestran la importancia de las enzimas GST y NQO1
en la detoxificación de compuestos potencialmente cancerígenos. Siendo el
hígado el órgano principal en este proceso, el aumento de estas enzimas le
brindaría una mayor capacidad de inactivación y posterior eliminación de estas
sustancias.
Es importante hacer notar que la enzima NQO1 es también una enzima
antioxidante, la reducción de quinonas que evita la producción de
semiquinonas y por lo tanto evita la generación de especies reactivas del
oxígeno como O2˙¯, es una de sus funciones antioxidantes. Por otra parte
también reduce quinonas con actividad antioxidante, como la vitamina E
(Siegel D et al., 1997) y la coenzima Q10 (Beyer RE et al., 1996). Se ha
demostrado también que la NQO1 es capaz de eliminar diréctamente el O2˙¯
(Siegel D et al., 2004). Esta última actividad es importante porque implica que
si se genera O2˙¯ por autooxidación de hidroquinonas, este podría ser
eliminado en el mismo lugar en el que se generó. También, debido a que el
O2˙¯ es el mayor responsable de la oxidación de hidroquinonas (Ollinger K et
al., 1990), la remoción del O2˙¯ prevendría la autooxidación de hidroquinonas
preservando la molécula en esta forma y facilitando su excreción. Aunque la
NQO1 tiene menor eficiencia que SOD en lo que respecta a la eliminación de
O2˙¯, la primera es altamente inducible luego de la exposición celular al estrés
oxidativo, y su inducción rápida y extensiva es consistente con un papel de
NQO1 como parte de una respuesta adaptativa al estrés producido por
especies reactivas del oxígeno como el superóxido.
En cuanto a la GST y el estrés oxidativo, es importante mencionar, que esta
enzima es responsable de la detoxificación de productos secundarios
generados por la oxidación de lípidos de membrana y proteínas (Hayes JD et
al., 2005).
Discusión
95
8. Activación de Nrf2 por Resverastrol 8.1 Efectos del R sobre la concentración y distribución subcelular de Nrf2
Aunque la carcinogénesis química es un fenómeno multifactorial, el estrés
oxidativo es un componente clave para la transformación celular (Klaunig JE y
Kamendulis LM, 2004). Los polimorfismos en algunas de las enzimas
antioxidantes y detoxificadoras son factores de riesgo para el desarrollo de
cáncer (Wormhoudt LW et al., 1999; Nebert DW et al., 2002; Ross D, 2004;
Hayes JD et al., 2005; McIlwain CC et al., 2006; Nagar S y Remmel RP, 2006).
Estos factores de riesgo apuntan hacia un papel de las defensas antioxidantes
controladas por Nrf2 en la prevención de la carcinogénesis inducida por
químicos que es el principal responsable de la inducción de las enzimas de
fase II (NQO1 y GST entre otras), catalasa y SOD. Esto lo realiza a través del
elemento de respuesta a antioxidantes ARE (Nguyen T et al., 2003b).
Se ha demostrado que Nrf2 inhibe la apoptosis en células HeLa (Kotlo KU et
al., 2003). A su vez Nrf2 puede ser degradado por caspasas tanto in vitro como
in vivo (Ohtsubo T et al., 1999). La degradación de Nrf2 por parte de las
caspasas puede ser un mecanismo para regular negativamente las rutas de
sobrevivencia celular que se oponen a la muerte celular.
En este trabajo se demuestra que el R activa este factor de transcripción
haciendo posible su detección en el núcleo celular luego del tratamiento de
cultivos de hepatocitos primarios con R 50 y 75 μM (figura 15 A y B). También
se observa un aumento de la concentración de este factor en las células
tratadas con resveratrol con respecto a las células control. Este aumento se
observa inicialmente luego de 6 hs de tratamiento con R 50 y 75 μM. Para el
caso de células tratadas con R 50 μM, el máximo aumento se observa luego
de 24 hs de tratamiento, y este nivel alcanzado se mantiene hasta las 48 hs sin
observarse un aumento significativo con respecto a las 24 hs de incubación. En
las células tratadas con R 75 μM, también el máximo nivel de Nrf2 se observa
luego de 24 hs de tratamiento, sin embargo no se observa un aumento
significativo de Nrf2 con respecto al control luego de 48 hs de tratamiento
Discusión
96
(figura 16). Esto puede deberse al efecto parcialmente necrótico que tiene el
resveratrol en estas células cuando se usa a esta concentración y se incuba
durante 48 hs.
8.2 Inducción de la transcripción del gen para Nrf2 por R
Se ha demostrado previamente que en macrófagos (Ishii T et al., 2000), en
cultivo de células tumorales hepáticas humanas HepG2 (Nguyen T et al.,
2003a), así como en cultivos de células tumorales de ratones Hepa (Stewart D
et al., 2003), se puede producir la activación de Nrf2 y un aumento en su
concentración intracelular sin un aumento en la transcripción del gen nrf2. Esto
se logra a través de la estabilización del factor de transcripción evitando su
degradación por parte del proteosoma. Sin embargo en queratinocitos de ratón
se ha observado un aumento de los niveles de ARNm codificante para Nrf2
luego de su activación con al agente anticancerígeno 3H-1,2-dithiole-3-thione
(D3T) (Kwak MK et al., 2002). Debido a que dependiendo del sistema celular y
forma de activación de Nrf2, se produce o no un aumento en la transcripción
del gen que codifica para este factor, decidimos evaluar si el R induce un
aumento en la transcripción de este gen. Para esto se analizaron muestras de
ARN purificadas de cultivos de hepatocitos primarios tratados con R 50 y 75
μM y cultivos control por PCR cuantitativa. Se observó un aumento en la
concentración del ARNm para Nrf2 en las células tratadas con Nrf2 y el
aumento observado fue dosis dependiente (figura 17).
Por esto el aumento en la concentración de Nrf2 observada en cultivos de
hepatocitos primarios observado luego del tratamiento con R puede ser
consecuencia de un aumento en la transcripción del gen que codifica para este
factor o al mismo tiempo pueden darse dos procesos que resulten en el
aumento de Nrf2, siendo estos el aumento de la transcripción génica y la
estabilización del factor que haga que la velocidad de degradación sea menor
prolongando la vida media de Nrf2.
Discusión
97
En células de hepatoblastoma humano (HepG2), tratadas con el polifenol
quercetina, se ha observado una disminución en la concentración intracelular
de Keap1 que como se menciona en la introducción es el inhibidor de Nrf2 lo
que produce un aumento intracelular de este último factor (Tanigawa S et al.,
2007). Debido a que el R también es un polifenol, este podría ser el caso para
hepatocitos primarios por lo que debería plantearse su estudio.
9. El R como antioxidante en HP y en el hígado
De acuerdo con las propiedades que debería tener un buen antioxidante
que se enumeran en la introducción (pag. 17), se puede decir de acuerdo a los
resultados obtenidos en este trabajo, que el R lo es en HP, debido a que tiene
capacidad de eliminar radicales libres de manera directa, debería ser capaz de
regenerar otros antioxidantes dentro de las células a través del incremento en
GR encargado de reducir el glutatión oxidado y de NQO1 capaz de reducir la
vitamina E y la coenzima Q10 que son dos potentes antioxidantes celulares.
Tiene un efecto positivo en la expresión génica ya que activa el factor de
transcripción Nrf2 encargado de modular positivamente la expresión de
enzimas antioxidantes y de fase II. Esto está relacionado con un aumento en la
actividad de estas enzimas, lo que se muestra en este trabajo. También
incrementa la concentración celular de este factor de transcripción y la del
ARNm que lo codifica. En lo que respecta a la absorción y la necesidad de
alcanzar una concentración fisiológica relevante se pueden citar los trabajos en
los que se ha demostrado que el R es absorvido, siendo el hígado responsable
de la mayor tasa de absorción, tanto en roedores como en humanos y puede
alcanzar concentraciones fisiológicas en el rango que se ha utilizado en este
trabajo (Bertelli AA et al., 1996a; Bertelli AA et al., 1996b; Bertelli A et al., 1998;
Soleas GJ et al., 2001; Yu C et al., 2002; Goldberg DM et al., 2003; Meng X et
al., 2004; Walle T et al., 2004). Por todo lo mencionado anteriormente se puede
decir que el R es un buen candidato para ser utilizado como antioxidante
efectivo en la prevención del daño hepático.
Discusión
98
10. Efecto del R sobre la proliferación en HP y células C9
Luego de estudiar el efecto del R en HP y células C9 observamos que este
compuesto inhibe la proliferación en ambos tipos celulares. En el caso de HP la
inhibición se observa para todas las concentraciones de R utilizadas mientras
que para células C9 se observa inhibición de la proliferación para el R 50 y 75
μM. A su vez el R no afecta ni negativa ni positivamente la proliferación en HP
quiescentes que no habían sido expuestos al HGF (figuras 18 y 19).
En algunos sistemas celulares el R se ha demostrado que inhibe la
proliferación e induce apoptosis en líneas celulares tumorales sin afectar las
células normales del mismo tipo, por ejemplo en la línea celular de leucemia
humana HL60, el R induce apoptosis sin afectar a linfocitos sanguíneos
periféricos (Clement MV et al., 1998). En nuestro sistema, a diferencia del
citado anteriormente, el R inhibe la proliferación de ambos tipos celulares, las
células transformadas y las normales, sin inducir apoptosis en ambos casos.
Se ha demostrado también que el R inhibe la proliferación en algunos tipos
celulares a través de la inducción de p53 (Huang C et al., 1999; Lu J et al.,
2001; She QB et al., 2001; Narayanan BA et al., 2003), mientras que en otros
casos la inhibición es independiente de esta proteína (Mahyar-Roemer M et al.,
2001) por lo que queda por establecer cual es el caso para hepatocitos.
Es importante destacar que sería importante realizar experimentos in vivo a
fin de determinar si el R inhibe la proliferación de células hepáticas en esta
situación. Si esto se comprobase, habría que alertar de este efecto debido a
que este compuesto se usa como suplemento antioxidante. En hígados
normales hay una muy baja tasa de proliferación de las células
parenquimáticas por lo que la inhibición de la proliferación por parte del R no
sería relevante, pero ante un daño severo del hígado los hepatocitos proliferan
hasta recuperar la masa hepática perdida (Fausto N y Campbell JS, 2003). Por
ejemplo, luego de una hepatectomía parcial, el 95 % de los hepatocitos se
replican entre 12-48 hs en ratas y 30-60 hs en ratones luego de la cirugía
(Grisham JW, 1962). En el hígado de roedores adultos, solo el 20-25 % de los
Discusión
99
hepatocitos son diploides. La mayoría de los hepatocitos son tetraploides (ya
sea mononucleados o binucleados con dos núcleos diploides) y células de
mayor ploidía pueden constituir el 5-10 % de la población de hepatocitos.
Luego de una hepatectomía parcial, el ADN se replica en los hepatocitos de
todas las ploidías mencionadas (Weglarz TC et al., 2000). En este último caso
en el que se necesita una proliferación masiva de los hepatocitos, no sería
conveniente que el R estuviese presente debido a su efecto inhibidor de la
proliferación.
11. Efecto de la pre-incubación con R y el estrés oxidativo en células C9
A diferencia de lo observado en HP, la preincubación de células hepáticas
transformadas C9 con R previo a ser expuestas a estrés oxidativo produjo un
aumento en la necrosis celular con respecto a las células expuestas solo al
agente oxidante (figura 20). El aumento en el % de muerte celular por necrosis
fue dosis dependiente obteniéndose el mayor porcentaje de muerte celular
cuando se pre-incubaron los cultivos con R 75 μM. También cabe resaltar que
se observa una amplia muerte celular luego de 3 hs de exposición a estrés
oxidativo en las células pre-incubadas con R, sin observarse variación
importante en este porcentaje en las células expuestas solo a estrés oxidativo
con respecto al control. Esto indica que el R sensibiliza a las células
transformadas, induciendo una mayor tasa de muerte celular por estrés
oxidativo.
El daño celular generado por la pre-incubación de los cultivos de células C9
con R y luego expuestas a tBHP se pudo apreciar al microscopio. Se
observaron importantes alteraciones morfológicas en estos cultivos con
respecto a los cultivos control. Aunque en los cultivos tratados solo con el
agente oxidante se pudieron observar células muertas o dañadas, su cantidad
fue mucho menor que en los cultivos pre-incubados con R (figura 21).
La resistencia a la apoptosis es una causa importante de la falta de
respuesta del cancer hacia la quimioterapia, lo que lleva a una inefectivadad
Discusión
100
del tratamiento. Se ha demostrado que el resveratrol sensibiliza a células
tumorales resistentes a tratamientos anticanceríganos para la apoptosis
inducida por el ligando inductor de apoptosis relacionado con el factor necrótico
tumoral (TRAIL), sin afectar la respuesta hacia este ligando de las células
normales del mismo tejido (Fulda S y Debatin KM, 2004). También se ha
demostrado que el estrés oxidativo es un mediador de la apoptosis inducida
por TRAIL, existe una acumulación de especies reactivas del oxígeno en las
céluas HeLa inducida por TRAIL previo a la inducción de caspasas que es
seguido de apoptosis (Lee MW et al., 2002). Por esto, la sensibilización
observada en este trabajo hacia la muerte celular por estrés oxidativo apoya la
noción de que el R sesibiliza a las células a este tipo de agresión. También
cabe mencionar que, si la sensibilización inducida por R es hacia el estrés
oxidativo, se debería observar una sensibilización similar a la observada hacia
TRAIL en células cancerígenas resistentes a tratamiento expuestas a R y
sometidas a tratamientos que induzcan estrés oxidativo, siendo estos químicos
o físicos.
Nuestros resultados están de acuerdo también al respecto de la
sesibilización hacia la muerte celular por R en células transformadas mientras
que esto no se produce en células normales. Mientras que la pre-incubación de
HP con R produjo un aumento de enzimas antioxidantes y detoxificadoras y
una mayor resistencia de estas células hacia el estrés oxidativo (figura 10), la
pre-incubación de células C9 con R las hace más sensibles hacia la muerte por
este tipo de estrés. A diferencia del caso antes mencionado, en los que el R
sensibiliza las células hacia la muerte celular por apoptosis inducida por TRAIL,
en nuestro caso, el R sensibiliza a las células transformadas hacia la muerte
celular por necrosis y no por apoptosis al ser expuestas a estrés oxidativo.
Conclusiones
101
CONCLUSIONES 1. El resveratrol es levemente tóxico, en cultivos de hepatocitos primarios y
células clone 9, a la máxima concentración utilizada en este estudio mientras
que no es tóxico en las demás concentraciones ensayadas.
1.1 La toxicidad observada se manifiesta como necrosis sin observarse
apoptosis.
2. El resveratrol es un antioxidante efectivo en hepatocitos primarios en cultivo.
Inhibiendo la muerte celular por necrosis inducida por estrés oxidativo en
cultivos de hepatocitos primarios y de células clone 9.
2.2 Ejerce un efecto antioxidante directo interaccionando con las especies
reactivas del oxígeno.
2.3 Ejerce un efecto antioxidante de mayor magnitud a través de la inducción
de un aumento en la actividad de enzimas antioxidantes y detoxificadoras en
cultivos de hepatocitos primarios.
2.4 Activa el factor de transcripción Nrf2 responsable de la regulación génica
de enzimas antioxidantes y detoxificacoras de fase II; como la Catalasa, SOD,
NADPH quinona oxidoreductasa y glutatión-S-transferasa; incrementando su
concentración intracelular y la del ARNm que lo codifica.
3. Inhibe la proliferación en cultivos de HP y de células C9. En HP por si mismo
el R no afecta ni positiva ni negativamente la proliferación.
4. Sensibiliza a células Clone 9 en cultivo a muerte celular por necrosis
inducida por estrés oxidativo, teniendo un efecto contrario en ésta línea celular
con respecto a lo observado en HP
Conclusiones
102
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