SAMARA GRACIANE DA COSTA - 2016. 9. 28.¢  massas. E ao Severino Lucena e ao...

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  • SAMARA GRACIANE DA COSTA

    PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE β-GLICOSIDASES DE Penicillium chrysogenum E SUA APLICAÇÃO NA SUPLEMENTAÇÃO DE

    COQUETÉIS ENZIMÁTICOS PARA A HIDRÓLISE DE BIOMASSAS

    Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae.

    VIÇOSA MINAS GERAIS – BRASIL

    2013

  • SAMARA GRACIANE DA COSTA

    PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE β-GLICOSIDASES DE Penicillium chrysogenum E SUA APLICAÇÃO NA SUPLEMENTAÇÃO DE

    COQUETÉIS ENZIMÁTICOS PARA A HIDRÓLISE DE BIOMASSAS

    Dissertação apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola, para obtenção do título de Magister Scientiae.

    APROVADA: 25 de julho de 2013. ___________________________ ___________________________ Eduardo Basílio de Oliveira Fernando Ariel Genta (Coorientador)

    ___________________________

    Valéria Monteze Guimarães (Orientadora)

  • ii

    Dedico este trabalho

    À Deus

    Aos meus pais

    Ao meu irmão

  • iii

    AGRADECIMENTOS

    À Deus por ter iluminado meus passos e ter me ajudado a superar todos os obstáculos

    que apareceram em meu caminho.

    Ao meu coorientador, Drº Fernando Genta, por ter me acolhido em seu grupo de

    pesquisa, por ter confiado no meu trabalho e acreditado em mim. Agradeço pela troca

    de ideias e pelas discussões científicas que possibilitaram meu engrandecimento e por

    sempre ter me dado ânimo, quando eu me desesperava achando que não ia conseguir.

    Obrigada pelos conselhos e toda a atenção dedicada a este trabalho.

    À minha orientadora, Drª Valéria Monteze Guimarães, pela oportunidade de iniciar na

    carreira científica, por todo apoio e conhecimento passado durante os anos que

    participei de seu grupo de pesquisa.

    Ao professor Drº Eduardo Basílio de Oliveira por se disponibilizar a me auxiliar nas

    correções deste trabalho.

    Agradeço a todos os professores que passaram por minha vida acadêmica, pelos

    ensinamentos.

    Ao professor, Drº Richard Hemmi Valente, pelas análises de espectrometria de

    massas. E ao Severino Lucena e ao Irapoã do LABFISI-FIOCRUZ pelo preparo e

    fornecimento das biomassas coloidais

    A minha mãe e a meu pai, Mauren e Antônio, e a meu irmão Marcelo, pelo amor,

    incentivo e carinho e por terem sempre me apoiado nas minhas decisões. Obrigada,

    sem vocês eu nada seria, vocês foram meus alicerces nesta caminhada.

    Ao Lucas pela paciência, pelo amor, carinho, compreensão e apoio incondicional. Você

    tornou cada um dos meus dias mais felizes.

  • iv

    Aos colegas do LABIFISI que me acolheram carinhosamente quando cheguei ao Rio

    de Janeiro e principalmente as colegas que ficavam até tarde no laboratório. A

    companhia de vocês tornaram as noites de trabalho mais agradáveis.

    Aos colegas do LAFIQ pela força e apoio na hora da correria. Agradeço de maneira

    especial a Carol por me contagiar sempre com sua alegria e me apoiar na hora do

    desespero me mostrando que de alguma maneira eu ia conseguir que as coisas

    dessem certo. À Camila que mostrou-se sempre preocupada e solícita me oferecendo

    ajuda sempre. E ao Léo, amigo sempre presente, me mostrando que a vida não é só

    correria.

    Ao secretário da Pós Graduação em Bioquímica Agrícola, Eduardo Monteiro por ter

    sido sempre solícito e atencioso, respondendo a todas as minhas dúvidas.

    Agradeço a Capes, CNPq, FAPEMIG e FAPERJ pelo suporte financeiro.

    Enfim agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para meu crescimento

    profissional e pessoal.

  • v

    SUMÁRIO

    RESUMO.......................................................................................................................viii

    ABSTRACT......................................................................................................................ix

    LISTA DE FIGURAS........................................................................................................X

    LISTA DE TABELAS......................................................................................................xiv

    LISTA DE ABREVIATURAS...........................................................................................xv

    1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 1

    2 OBJETIVOS.............................................................................................................. 3

    2.1 Objetivos Específicos ......................................................................................... 3

    3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................... 4

    3.1 β-glicosidases (EC 3.2.1.21) .............................................................................. 4

    3.2 Características de β-glicosidases Fúngicas ....................................................... 7

    3.3 Estruturas de β-glicosidases .............................................................................. 8

    3.4 Mecanismo de Ligação ao substrato e Especificidade ....................................... 9

    3.5 Mecanismo de Hidrólise de β-glicosidases ...................................................... 11

    3.6 Aplicações Gerais de β-glicosidases................................................................ 13

    3.6.1 Biodegradação de Resíduos Lignocelulósicos .......................................... 13

    3.6.2 Hidrólise de Isoflavonas............................................................................. 15

    3.6.3 Doença de Gaucher .................................................................................. 16

    3.6.4 Outras Aplicações Biotecnológicas ........................................................... 17

    3.7 Degradação de Biomassa e Produção de Enzimas Celulolíticas por Fungos .. 19

    3.7.1 Penicillium chrysogenum ........................................................................... 20

    4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 21

    4.1 Reagentes ........................................................................................................ 21

    4.2 Origem e Manutenção do Microrganismo ........................................................ 21

    4.3 Indução da Biossíntese de β-glicosidases em Meio Líquido ............................ 22

    4.4 Ensaios Enzimáticos ........................................................................................ 22

    4.4.1 Atividade enzimática sobre p-nitrofenil-β-D-glicopiranosídeo .................... 22

    4.4.2 Atividade sobre metilumbeliferil-β-D-glicopiranosídeo ............................... 23

    4.4.3 Atividade sobre octil-β-D-glicopiranosídeo e oligossacarídeos ................. 23

  • vi

    4.4.4 Atividade sobre Polímeros ......................................................................... 24

    4.5 Quantificação Proteína ..................................................................................... 25

    4.5.1 Método BCA Miniaturizado ........................................................................ 25

    4.5.2 Método Prata Coloidal ............................................................................... 25

    4.6 Purificação β-glicosidases ................................................................................ 26

    4.6.1 Precipitação com Sulfato de Amônio, (NH4)2SO4 ...................................... 26

    4.6.2 Cromatografia de Interação Hidrofóbica .................................................... 26

    4.6.3 Cromatografia de exclusão molecular ....................................................... 27

    4.7 SDS-PAGE e Estimativa de Massa Molecular ................................................. 28

    4.8 Zimografia ........................................................................................................ 29

    4.9 Espectrometria de Massas ............................................................................... 29

    4.10 Estabilização PcβGlu2 ..................................................................................... 31

    4.11 Determinação da Configuração do Carbono Anomérico dos Produtos de Reação ...................................................................................................................... 31

    4.12 Caracterização Bioquímica das β-glicosidases ................................................ 32

    4.12.1 Efeito da Temperatura ............................................................................... 32

    4.12.2 Efeito do pH ...................................................................................