EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS IFN- E … · PEDRO CARLOS DA ROCHA NETO ......

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

PEDRO CARLOS DA ROCHA NETO

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS IFN- E

TGF-β1 EM CISTOS RADICULARES E CISTOS DENTÍGEROS

Natal/RN

-2012-

Pedro Carlos da Rocha Neto

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS IFN- E

TGF-β1 EM CISTOS RADICULARES E CISTOS DENTÍGEROS

Natal/RN

-2012-

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em

Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do

Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de

Mestre em Patologia Oral.

Orientador: Profº. Drº. Antonio de Lisboa Lopes Costa

Rocha Neto, Pedro Carlos da. Expressão imuno-histoquímica das proteínas IFN-γ e TGF-β1 em

cistos radiculares e cistos dentígeros / Pedro Carlos da Rocha Neto. –

Natal, RN, 2012.

80f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa.

Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal

do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de

Pós-Graduação em Patologia Oral.

1. Cisto Radicular – Dissertação. 2. Cisto Dentígero – Dissertação.

3. Imuno-histoquímica – Dissertação. 4. Interferon Gama –

Dissertação. 5. Fatores de Crescimento Transformadores. –

Dissertação. I. Costa, Antonio de Lisboa Lopes. II. Título.

RN/UF/BSO Black

D793

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.

“Ao meu querido e saudoso irmão Antônio Carlos da Rocha Ramalho, que partiu para

eternidade tão cedo, porém deixando um legado de alegria nos corações de quem o conheceu”.

“Aos meus pais, Antônio Cruz Ramalho e Maria das Graças da Rocha Ramalho, como forma de

retribuição por tudo o que eles investem em mim tão amorosamente”.

“Aos meus irmãos João Carlos da Rocha Ramalho e Dayana Karla da Rocha Ramalho, por tudo

que me proporcionam como família exemplar”.

“Aos meus avós Pedro Carlos da Rocha, Raimunda Isaura da Rocha, Antônio Leite Ramalho e

Severina Cruz Ramalho (in memoriam), por serem as minhas raízes e as folhas mais altas que eu

quero alcançar na escalada da vida”.

“A Deus...Porque dEle, por Ele e para Ele são todas as coisas”.

AGRADECIMENTOS

“Agradeço ao meu amado Senhor e Salvador Jesus Cristo, que me deu a maior prova de amor ao morrer

na cruz humilhado, para que eu pudesse ter o direito de ser chamado filho de Deus, mesmo sendo tão falho

e indigno de ter os pecados perdoados por pura graça...Quão constrangedor é esse amor!”

“Agradeço aos meus pais, que sempre foram para mim um exemplo de amor, fidelidade, honestidade e de

tudo o que há de melhor embaixo do céu”.

“Agradeço aos meus avós, pelo exemplo e história de vida, em que eu tanto tento me espelhar”.

“Agradeço ao meu orientador e amigo Prof. Antonio de Lisboa Lopes Costa, por sua valiosa orientação e

por não me deixar desanimar nos momentos difíceis que enfrentei durante meu curso de mestrado, sempre

me animando e dizendo que tudo daria certo. E de fato deu”.

“Agradeço a todos os meus amigos do mestrado e aos do doutorado, por terem muitas vezes me ajudado

em minhas limitações, e por terem se tornado parte da minha vida. Eu nunca os esquecerei”.

“Agradeço a todos os meus professores do mestrado, que tanto contribuíram na minha formação

intelectual e profissional, e por que não dizer pessoal, desde os meus tempos de graduação. Eu sempre os

terei como referencial de dedicação e sucesso”.

“Agradeço ao prof. Paulo Roberto Medeiros de Azevedo, pela preciosa contribuição na avaliação

estatística”.

“Agradeço a todos os funcionários do departamento de Patologia Oral, pela amizade que formamos ou

fortalecemos durante os dois anos do meu curso de mestrado”.

“Não poderia deixar de agradecer aos funcionários da biblioteca e do laboratório de informática, pelas

valiosas ajudas nos meus trabalhos e pelos momentos agradáveis de descontração que eles me

proporcionam, além da amizade formada é claro. Em especial a Cecília e a Mônica, pela prestatividade em

me ajudar nos trabalhos sempre que precisei”.

Jesus era desprezado, e o mais rejeitado entre os homens, homem de

dores, e experimentado nos trabalhos; e, como um de quem os homens

escondiam o rosto, era desprezado, e não fizemos dele caso algum... Mas

ele foi ferido por causa das nossas transgressões, e moído por causa dos

nossos pecados; o castigo que nos traz a paz estava sobre ele, e pelas

suas pisaduras fomos sarados.

Isaías 53: 3 e 5.

RESUMO

Os cistos odontogênicos são cavidades patológicas revestidas por epitélio odontogênico e

preenchidas por líquido, células descamadas, ou outros materiais. As lesões intra-ósseas, como o

cisto radicular e o cisto dentígero, apresentam um potencial de expansão capaz de promover a

destruição do tecido ósseo circunjacente. Os mecanismos relacionados a esse processo de

expansão são a proliferação do epitélio cístico, o aumento da osmolaridade do fluido cístico e a

síntese de fatores de reabsorção óssea como IFN-γ e TGF-β1. O objetivo deste estudo foi avaliar

e comparar a expressão imuno-histoquímica do IFN-γ e do TGF-β1 entre cistos radiculares e

cistos dentígeros com a finalidade de compreender o papel e o comportamento dessas proteínas

no processo de expansão destes cistos. Selecionamos 20 casos de cisto radicular e 20 casos de

cisto dentígero retirados dos arquivos do Laboratório de Patologia Oral da UFRN. Após análise

dos dados clínicos, os casos foram submetidos a técnica de coloração de rotina (HE) e ao método

imuno-histoquímico para evidenciação da expressão do IFN-γ e do TGF-β1 no epitélio e na

cápsula dos referidos cistos. A análise estatística dos dados utilizando o teste de Mann-Whitney

revelou que não houve diferença estatisticamente significativa da imunoexpressão do IFN- entre

os epitélios (p=0,565) e cápsulas (p=0,414) dos cistos radiculares e cistos dentígeros. Além disso,

não houve diferença estatisticamente significativa da imunoexpressão do TGF-β1 entre os

epitélios (p=0,620) e cápsulas (p=0,056) dos cistos radiculares e cistos dentígeros. O teste de

Wilcoxon revelou que não houve diferença estatisticamente significativa entre as

imunoexpressões do IFN- e do TGF-β1 no epitélio (p=0,225) e na cápsula (p=0,370) dos cistos

radiculares. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN-

e do TGF-β1 no epitélio (p=0,361) dos cistos dentígeros. No entanto, houve diferença

estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN- e do TGF-β1 na cápsula

(p=0,001) dos cistos dentígeros, sendo o TGF-β1 o que apresentou a imunoexpressão mais

significativa. Diante destes resultados, concluímos que não houve diferença de expressão imuno-

histoquímica do IFN-γ e do TGF-β1 entre os cistos radiculares e dentígeros e que o TGF-β1 foi

mais expressivo do que o IFN-γ na cápsula dos cistos dentígeros.

Palavras Chaves: Cisto radicular. Cisto dentígero. Imuno-histoquímica. Interferon gama. Fatores

de crescimento transformadores.

ABSTRACT

Odontogenic cysts are pathologic cavities covered by odontogenic epithelium and filled

by liquid, desquamated cells or other materials. The intraosseous lesions, such as radicular cyst

and dentigerous cyst, present a potential of expansion capable of promoting the destruction of the

surrounding osseous tissue. The mechanisms related to this process of expansion are the

proliferation of cystic epithelium, the increase of the osmolarity of the cystic fluid and the

synthesis of reabsorption factors such as IFN-γ and TGF-β1. The aim of this study was to

evaluate and compare the immunohistochemical expression of IFN-γ and TGF-β1 between

radicular cysts and dentigerous cysts in order to understand the role and behavior of these

proteins in the expansion of these cysts. We selected 20 cases of radicular cyst and 20 cases of

dentigerous cyst chosen from the files of UFRN’s Laboratory of Oral Pathology. After analyzing

the clinical data, the cases underwent the routine staining technique (HE) and

immunohistochemistry for the appearance of IFN-γ and TGF-β1 in the epithelium and capsule of

these cysts. The statistical analysis using the Mann-Whitney test revealed no statistically

significant difference in immunoexpression of IFN-γ between the epithelium (p = 0.565) and

capsules (p = 0.414) of radicular cysts and dentigerous cysts. Moreover, there was no statistically

significant difference of immunoexpression of TGF-β1 between the epithelium (p = 0.620) and

capsules (p = 0.056) of radicular cysts and dentigerous cysts. The Wilcoxon test revealed no

statistically significant difference between IFN-γ and TGF-β1 imunoexpressions in the

epithelium (p = 0.225) and capsules (p = 0.370) of radicular cysts. There was no statistically

significant difference between IFN-γ and TGF-β1 imunoexpressions in the epithelium (p = 0.361)

of dentigerous cysts. However, there was a statistically significant difference between IFN-γ and

TGF-β1 immunoexpressions in the capsule (p = 0.001) of dentigerous cysts, being TGF-β1 the

factor which presented the most significant immunoexpression. Given these results, we conclude

that there was no difference in immunohistochemical expression of IFN-γ and TGF-β1 between

radicular and dentigerous cysts and that TGF-β1 was more significant than the IFN-γ in the

capsule of dentigerous cysts.

Keywords: Radicular cyst. Dentigerous cyst. Immunohistochemistry. Interferon gamma.

Transforming growth factors.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Frequências dos dados relativos a idade nos casos de CR..................................................... 38

Figura 2 - Frequências dos dados relativos a idade nos casos de CD..................................................... 38

Figura 3 - Epitélio de cisto radicular apresentando hiperplasia, espongiose e degeneração hidrópica.

Observe o infiltrado inflamatório na cápsula fibrosa. Hematoxilina-eosina (400X)............................... 53

Figura 4 - Epitélio de cisto dentígero apresentando poucas camadas de células. Observe o escasso

infiltrado inflamatório mononuclear e o extravasamento hemorrágico na cápsula. Hematoxilina-

eosina (400X)........................................................................................................................................... 53

Figura 5 - Imunomarcação do epitélio de cisto radicular pelo IFN-gama. Observe o padrão de

marcação citoplasmático. LSAB (400X)................................................................................................. 54

Figura 6 - Imunomarcação de epitélio de cisto radicular pelo TGF-β1. Observe a marcação nuclear e

citoplasmática. LSAB (400X)................................................................................................................. 54

Figura 7 -Imunomarcação de epitélio de cisto dentígero pelo IFN-gama. Observe marcação nuclear

e citoplasmática. LSAB (400X)............................................................................................................... 55

Figura 8 - Imunomarcação de epitélio de cisto dentígero pelo TGF-β1. Observe marcação nuclear e

citoplasmática. LSAB (400X)................................................................................................................. 55

Figura 9 - Imunomarcação de células inflamatórias mononucleares e células endoteliais pelo IFN-

gama na cápsula de cisto radicular. Observe o padrão de marcação citoplasmático. LSAB (1000X).... 56

Figura 10 - Imunomarcação de células polimorfonucleares, mononucleares e células da linhagem

monocítico-macrofágica pelo TGF-β1 na cápsula de cisto radicular. Observe a marcação nuclear e

citoplasmática, além do padrão de marcação da matriz extra-celular. LSAB (1000X)........................... 56

Figura 11 - Imunomarcação de macrófagos e fibroblastos pelo IFN-gama na cápsula de cisto

dentígero. Observe o padrão de marcação nuclear e citoplasmático. LSAB (1000X)............................ 57

Figura 12 - Imunomarcação de células inflamatórias mononucleares pelo TGF-β1 na cápsula de

cisto dentígero. Observe a intensa marcação citoplasmática. LSAB (1000X)........................................ 57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Distribuição dos escores da marcação imuno-histoquímica para os anticorpos

anti-IFN- e anti-TGF-β1 no epitélio dos cistos radiculares e dos cistos dentígeros. Natal,

RN – 2012............................................................................................................................... 41

Tabela 2 - Distribuição dos percentuais de células imunopositivas para os anticorpos anti-

IFN- e anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos radiculares. Natal, RN – 2012........................... 43


anti-IFN- e anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos radiculares. Natal, RN – 2012.................... 44

Tabela 4 - Distribuição dos percentuais de células imunopositivas para os anticorpos anti-

IFN- e anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos dentígeros. Natal, RN – 2012............................ 46


anti-IFN- e anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos dentígeros. Natal, RN–2012....................... 48

Tabela 6 - Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a imunoexpressão

epitelial dos biomarcadores IFN- e TGF-β1. Natal, RN - 2012........................................... 49

Tabela 7 - Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a

imunoexpressão, em suas cápsulas, dos biomarcadores IFN- e TGF-β1, considerando-se

as avaliações tanto através dos escores de imunomarcação (E) como através dos

percentuais de células imunopositivas (P). Natal, RN -

2012......................................................................................................................................... 50

Tabela 8 - Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1

nos epitélios dos CR e CD. Natal, RN - 2012......................................................................... 52

Tabela 9 - Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1

nas cápsulas dos CR e CD, considerando-se as avaliações tanto através dos escores de

imunomarcação (E) como através dos percentuais de células imunopositivas (P). Natal,

RN - 2012................................................................................................................................ 52

LISTA DE QUADROS

Quadro 1 - Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica, tempo de

incubação e clone dos anticorpos primários utilizados no estudo ................................................. 32

Quadro 2 - Frequências dos dados referentes a gênero, cor da pele, localização da lesão e

sintomatologia dos casos de cisto radicular e cisto dentígero ....................................................... 37

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ALK5 – cinase semelhante ao receptor à activina-5

AP – proteína ativadora

BMP – proteína óssea morfogenética

CD – cisto dentígero

CR – cisto radicular

IFNs – Interferons

IFN- – interferon gama

IL – interleucina

JNK – c-Jun N-terminal kinase

MAPK – proteína quinase ativada por mitógeno

M-CSF - fator macrofágico estimulador de colônia

MHC classe II – complexo principal de histocompatibilidade classe II

NF-κB – fator nuclear κB

OPG – osteoprotegerina

RANK - receptor ativador do fator nuclear κappa β

RANKL - ligante do receptor ativador fator nuclear κappa β

SMAD – do inglês Mothers against decapentaplegic homolog, corresponde a fusão do nome do

gene Mothers against decapentaplegic com o do gene Sma.

STAT-1 – sinal transdutor e ativador de transcrição 1

T-bet – fator de transcrição T-box

TGF-β– fator de crescimento transformador beta

TNF-α - fator de necrose tumoral alfa

TRAF6 – fator 6 associado ao receptor de TNF

TβR (I ou II) - receptor tipo I ou II de TGF-β

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 16

2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................................... 18

2.1 CISTO RADICULAR ................................................................................................ 18

2.2 CISTO DENTÍGERO ................................................................................................. 20

2.3 TECIDO ÓSSEO ........................................................................................................ 22

2.4 INTERFERON-GAMA (IFN-γ) ................................................................................ 23

2.5 FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMADOR β1 (TGF-β1) ......................... 25

3 PROPOSIÇÃO ......................................................................................................... 29

4 MATERIAL E MÉTODOS .................................................................................... 30

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO ........................................................................ 30

4.2 POPULAÇÃO............................................................................................................. 30

4.3 AMOSTRA ............................................................................................................ ..... 30

4.4 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA .......................................................... 30

4.4.1 Critérios de inclusão ................................................................................................. 30

4.4.2 Critérios de exclusão ................................................................................................ 31

4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO ...................................................................................... 31

4.6 COLETA DOS DADOS CLÍNICOS ......................................................................... 31

4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO ....................................................................... 31

4.7.1 Coloração pelo método imuno-histoquímico .......................................................... 32

4.7.2 Análise da marcação imuno-histoquímica ............................................................. 34

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................................... 35

4.9 IMPLICAÇÕES ÉTICAS .......................................................................................... 35

5 RESULTADOS ......................................................................................................... 36

5.1 ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DA AMOSTRA SELECIONADA PARA O

ESTUDO ............................................................................................................ ........

36

5.2 ANÁLISE DESCRITIVA DE FREQUÊNCIA DOS DADOS .................................. 36

5.2.1 Distribuição dos dados por gênero, cor da pele, localização da lesão e

sintomatologia ...........................................................................................................

36

5.2.2 Distribuição dos dados por idade ............................................................................ 37

5.3 ANÁLISE DESCRITIVA DOS RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS 39

5.3.1 No epitélio .................................................................................................................. 39

5.3.1.1 Cistos radiculares ........................................................................................................ 39

5.3.1.2 Cistos dentígeros ........................................................................................................ 40

5.3.2 Na cápsula ................................................................................................................. 42

5.3.2.1 Cistos radiculares ........................................................................................................ 42

5.3.2.2 Cistos dentígeros ........................................................................................................ 45

5.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS .................................................................................... 49

5.4.1 Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a

imunoexpressão epitelial dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 (teste de Mann-

Whitney)......................................................................................................................

49

5.4.2 Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a

imunoexpressão, em suas cápsulas, dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 (teste

de Mann-Whitney)......................................................................................................

49

5.4.3 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1

no epitélio e na cápsula dos CR (teste de Wilcoxon) ..............................................

50

5.4.3.1 No epitélio .................................................................................................................. 50

5.4.3.2 Na cápsula .................................................................................................................. 50

5.4.4 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1

no epitélio e na cápsula dos CD (teste de Wilcoxon)...............................................

51

5.4.4.1 No epitélio .................................................................................................................. 51

5.4.4.2 Na cápsula .................................................................................................................. 51

6 DISCUSSÃO ............................................................................................................. 58

7 CONCLUSÕES.......................................................................................................... 66

REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 67

APÊNDICES ............................................................................................................. 73

ANEXO....................................................................................................................... 81

16

1 INTRODUÇÃO

Os cistos são cavidades patológicas revestidas por epitélio e preenchidas por líquido,

células descamadas, ou outros materiais. De acordo com sua origem, os cistos podem ser

classificados em cistos de desenvolvimento, de origem desconhecida, e cistos inflamatórios,

oriundos de um processo inflamatório. Os cistos de desenvolvimento podem ser de vários tipos,

como o dentígero, odontogênico ortoceratinizado, gengival (alveolar) do recém-nascido, gengival

do adulto, periodontal lateral, odontogênico calcificante, além de odontogênico glandular. Já os

cistos inflamatórios compreendem os cistos periapicais (radiculares), periapicais residuais e o da

bifurcação vestibular (NEVILLE et al., 2009).

As lesões periapicais crônicas, que são caracterizadas por destruição óssea, ocorrem como

resultado da resposta imuno-inflamatória do hospedeiro a infecções bacterianas no canal

radicular. A infecção que se inicia no canal radicular progride para a região periapical através do

fluxo contínuo de microrganismos e seus produtos pelo forame apical (MENEZES et al., 2006;

VERNAL et al., 2006; KAWASHIMA et al., 2007; MENEZES et al., 2008). A mobilização dos

mecanismos de defesa na tentativa de eliminar o agente agressor pode também destruir o tecido

normal e induzir à reabsorção óssea, resultando no desenvolvimento de lesões inflamatórias no

osso maxilar, como os cistos radiculares (HREN E IHAN, 2009). Já os cistos dentígeros são

cistos de desenvolvimento, que se originam da separação entre o folículo e a coroa de um dente

não erupcionado. Sua patogênese é desconhecida, entretanto, acredita-se que ele se desenvolve

pelo acúmulo de líquido entre o epitélio reduzido do órgão do esmalte e a coroa do dente

(NEVILLE et al., 2009).

A reabsorção óssea ocasionada por essas lesões é iniciada pela proliferação de células

precursoras osteoclásticas imaturas e diferenciação das mesmas em células osteoclásticas

maduras que promovem a degradação dos componentes ósseos orgânicos e inorgânicos. Os

osteoclastos são células derivadas de monócitos/macrófagos e sua diferenciação é regulada

principalmente pelos seguintes fatores: M-CSF, RANK, RANKL e OPG (MENEZES et al.,

2006; MENEZES et al., 2008). A expressão de OPG e RANKL foi primeiramente detectada em

odontoblastos, ameloblastos, células da polpa e do ligamento periodontal (DA SILVA et al.,

2008). RANKL também tem sido identificado em cistos e tumores odontogênicos e em lesões

17

periapicais (TAY et al., 2004, DA SILVA et al., 2008; VERNAL et al. 2004; MENEZES et al.

2006).

A identificação do RANKL e da OPG e a elucidação da regulação do RANK no

desenvolvimento e ativação dos osteoclastos têm criado novas possibilidades para o

desenvolvimento de novas drogas para o tratamento da perda óssea (BAUD’HUIN et al., 2007;

ANDRADE et al., 2008). Sendo assim, sabendo-se do papel central que essas três proteínas

apresentam no processo de reabsorção óssea, pode-se inferir que outras moléculas que atuem

sobre a síntese das mesmas apresentem papéis igualmente importantes nesse processo. Teng et al.

(2005) sugeriram a existência de inter-relações complexas entre citocinas e

RANK/RANKL/OPG, que podem promover a osteoclastogênese. O IFN-γ tem sido implicado

como promotor da osteoclastogênese pela indução da síntese de RANKL (GAO et al., 2007;

TENG et al., 2005; KOTAKE et al., 2005). Por sua vez, o TGF-β1 também tem sido associado a

reabsorção óssea, pois tem se mostrado um fator indispensável na osteoclastogênese induzida por

RANKL (YASUI et al., 2011; FULLER et al., 2000). Apesar disso, de acordo com alguns

estudos, essas duas citocinas têm mostrado atividades contraditórias no metabolismo ósseo, a

saber: o IFN-γ tanto pode inibir como induzir a osteoclastogênese; e o TGF-β1 tanto pode

promover a osteoclastogênese como a osteoblastogênese (YASUI et al., 2011; GAO et al., 2007;

FULLER et al., 2000).

Esta pesquisa tem por objetivo avaliar a expressão imuno-histoquímica do IFN-γ e do

TGF-β1 em cistos radiculares e cistos dentígeros, o que pode sugerir a atuação dessas citocinas

como mediadores da reabsorção óssea, típica dessas lesões, assim como sua provável atuação

como moduladores dessa reabsorção, dado o seu potencial também osteoprotetor.

18

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 CISTO RADICULAR

Os cistos radiculares (CR), também denominados de cistos apicais, periapicais,

periodontais apicais ou perirradiculares, são lesões odontogênicas de natureza inflamatória

formados pela proliferação dos restos epiteliais odontogênicos contidos no granuloma periapical,

seguido de alterações degenerativas que dão origem a cavidade cística (NEVILLE et al., 2009;

NETO, DANESI, UNFER, 2004). A presença de um estímulo inflamatório é suficiente para a

formação do cisto que, histologicamente apresenta-se com uma cavidade delimitada por epitélio

pavimentoso estratificado não ceratinizado, preenchida por líquido e células descamadas. Mais

externamente, se encontra uma cápsula de tecido conjuntivo fibroso (NEVILLE et al., 2009;

REGEZI, SCIUBBA, JORDAN, 2008).

Os cistos radiculares são os cistos mais comuns da região maxilofacial, representando

cerca de 55% dos cistos odontogênicos, e consistindo em 50 a 75% de todos os cistos

encontrados na literatura (NEVILLE et al., 2009; REGEZI, SCIUBBA, JORDAN, 2008; JONES,

CRAIG, FRANKLIN, 2006). Sua incidência entre as lesões periapicais varia de 6 a 55% (LIN,

HUANG, ROSENBERG, 2007). A distribuição por idade varia da terceira à sexta décadas da

vida, sendo relativamente rara a ocorrência na primeira década de vida, mesmo sendo frequentes

as lesões de cárie nesse período. A maioria dos casos ocorre em indivíduos do sexo masculino e,

quanto à localização, 60% ocorrem na maxila, especialmente na região anterior, seguida da

região maxilar posterior, região posterior de mandíbula e por último, região mandibular anterior

((NEVILLE et al., 2009; REGEZI, SCIUBBA, JORDAN, 2008; JONES;CRAIG;FRANKLIN,

2006).

As endotoxinas bacterianas oriundas de canais radiculares infectados são sugeridas como

potentes iniciadores da lesão periapical. As bactérias e seus produtos exercem uma ação direta

através da atividade mitogênica sobre as células epiteliais ou desempenham uma ação indireta

pela indução da produção de citocinas e fatores de crescimento que induzem a proliferação de

restos epiteliais, assim como atuam na expansão da lesão (DANIN et al., 2000; LIN, HUANG,

ROSENBERG, 2007). Os mecanismos responsáveis pela indução da proliferação epitelial e a

biologia do processo de crescimento e expansão do cisto estão associados a eventos

19

imunopatológicos. A reação imunológica de defesa na região periapical é caracterizada pela

participação de várias células inflamatórias como neutrófilos, macrófagos e linfócitos, que

sintetizam numerosos mediadores químicos da inflamação em resposta aos fatores irritativos

bacterianos como lipopolissacarídeos. Dentre esses mediadores estão as interleucinas (IL-1, IL-2,

IL-6, IL-8, IL-12), TNF-α, M-CSF, IFNs, TGF-β, óxido nítrico, prostaglandinas e

metaloproteinases, relacionados com a progressão e expansão da lesão (DANIN et al., 2000;

VERNAL et al., 2006; KAWASHIMA et al., 2007).

Diversas teorias tentam elucidar o processo de formação da cavidade cística. A teoria da

deficiência nutricional aponta que as ilhas epiteliais proliferantes tornam-se grandes, de maneira

que as células mais centrais perdem sua fonte de nutrição, sofrendo degeneração e liquefação

com formação da cavidade. Os restos celulares decompostos promovem um aumento na

concentração de proteínas, o que favorece o transporte de fluido do tecido conjuntivo adjacente

para o interior da cavidade, auxiliando o crescimento cístico (LIN, HUANG, ROSENBERG,

2007; NEVILLE et al., 2009).

Clinicamente, os CR caracterizam-se por serem uma lesão geralmente assintomática, a

menos que sofram reagudização. Geralmente não causam expansão da cortical óssea, porém em

alguns casos podem atingir dimensões consideráveis, causando uma tumefação dura e indolor. A

presença de um dente desvitalizado é determinante para seu diagnóstico, sendo assim os testes de

vitalidade pulpar do dente relacionado se mostram negativos. Cistos radiculares de longa duração

podem provocar reabsorção radicular, deslocamento ou mobilidade dos dentes próximos a ele.

Eles são frequentemente descobertos de maneira casual durante exames radiográficos de rotina e

apresentam-se radiograficamente como uma lesão radiolúcida bem definida, de formato redondo

a oval, associada ao ápice do dente acometido. Observa-se ainda perda de nitidez da lâmina dura

ao nível do ápice e uma margem radiopaca estreita delimitando o cisto, que se continua com a

lâmina dura acima da região apical (NEVILLE et al., 2009; REGEZI, SCIUBBA, JORDAN,

2008; NETO, DANESI, UNFER, 2004).

Histopatologicamente, os CR se apresentam revestidos por um epitélio pavimentoso

estratificado não ceratinizado, podendo apresentar exocitose, espongiose e hiperplasia. Seu lúmen

freqüentemente é preenchido por líquido e células descamadas. Sua cápsula consiste em tecido

conjuntivo fibroso denso, apresentando muitas vezes um infiltrado inflamatório de intensidade

variável, constituído por linfócitos, plasmócitos e neutrófilos. Por vezes podem ser vistos na

20

cápsula calcificações distróficas, extravasamento hemorrágico e imagens negativas de cristais de

colesterol associadas a células gigantes multinucleadas (NEVILLE et al., 2009; REGEZI,

SCIUBBA, JORDAN, 2008).

O tratamento dos CR varia desde procedimentos conservadores como tratamento

endodôntico até cirurgia apical ou exodontia (NEVILLE et al., 2009).

2.2 CISTO DENTÍGERO

O cisto dentígero (CD) é o segundo tipo mais comum dos cistos odontogênicos e o mais

comum entre os cistos odontogênicos de desenvolvimento, correspondendo a cerca de 20% de

todos os cistos dos ossos gnáticos (NEVILLE et al., 2009; REGEZI, SCIUBBA, JORDAN,

2008). Os cistos dentígeros são cistos odontogênicos de desenvolvimento, de origem

desconhecida, caracterizados por uma radiolucidez bem definida, geralmente associada a coroa

de um dente incluso, impedindo a sua erupção (NEVILLE et al., 2004; GONDIM et al., 2008).

Apesar dos cistos dentígeros serem considerados de desenvolvimento, alguns casos

apresentam características de patogênese inflamatória, como por exemplo, aqueles cistos que se

desenvolvem subjacente a dentes decíduos com lesões radiculares ou em terceiros molares

inferiores parcialmente erupcionados que desenvolvem lesões císticas ao longo da face distal ou

vestibular (NEVILLE et al., 2009).

Três teorias tentam explicar a etiologia dos cistos dentígeros. A primeira sugere que a

acumulação de fluido entre o epitélio reduzido do órgão do esmalte e a coroa de um dente

permanente resulta da pressão exercida pela erupção do dente sobre seu folículo dentário, o que

pode causar a saída de exsudato dos capilares em conseqüência da obstrução do retorno venoso.

A segunda teoria sugere que na sua trajetória de erupção, o dente permanente encontra um cisto

radicular oriundo do seu antecessor decíduo. Já a terceira teoria afirma que o cisto dentígero

poderia ser causado por uma inflamação do tecido periapical de um dente decíduo causada por

uma infecção periapical, que atingiria e estimularia o germe dental do dente permanente

subjacente, proporcionando acúmulo de líquido entre o epitélio reduzido do órgão do esmalte e a

coroa desse germe (GONDIM et al., 2008). Embora várias teorias tentem explicar a origem desse

cisto, sua etiologia permanece incerta (NEVILLE et al., 2009; GONDIM et al., 2008). Assim

como nos outros cistos, a expansão do cisto dentígero está relacionada com a proliferação

21

epitelial, síntese de fatores de reabsorção óssea e aumento da osmolaridade do fluido cístico

(REGEZI, SCIUBBA, JORDAN, 2008).

Eles se desenvolvem com maior freqüência na segunda e terceira décadas de vida,

havendo uma leve predileção pelo gênero masculino. Clinicamente, aparecem como lesões

geralmente assintomáticas, descobertas em radiografias de rotina, envolvendo principalmente

terceiros molares inferiores ou caninos superiores. Ele pode ocasionar uma expansão óssea na

região afetada, deslocamento do dente afetado e assimetria facial. O retardo da erupção de um

dente muitas vezes é um indicador de sua ocorrência (NEVILLE et al., 2009; REGEZI,

SCIUBBA, JORDAN, 2008). Radiograficamente, o cisto dentígero apresenta-se mais comumente

como uma lesão radiolúcida unilocular bem definida, envolvendo a coroa de um dente não

erupcionado. Porém, pode se apresentar como uma radiolucidez envolvendo parte da coroa e se

extendendo lateralmente ao longo da superfície radicular, ou ainda como uma radiolucidez

envolvendo toda a coroa e parte das raízes, de forma que quase todo o dente se localiza dentro do

cisto. Comumente, a área radiolúcida tem uma margem bem definida e muitas vezes esclerótica

(NEVILLE et al., 2009; REGEZI, SCIUBBA, JORDAN, 2008).

O exame histopatológico de um cisto dentígero não inflamado revela um revestimento

epitelial não ceratinizado constituído por 2 a 6 camadas de células delimitando o lúmen cístico, e

uma cápsula fibrosa de tecido conjuntivo frouxo, podendo conter ainda ilhas e cordões de epitélio

odontogênico. A interface epitélio-cápsula é plana. Porém, na presença de processo inflamatório,

o cisto dentígero apresenta uma cápsula mais colagenizada, apresentando um infiltrado

inflamatório crônico de intensidade variável. O limitante epitelial apresenta-se hiperplásico, com

desenvolvimento de projeções epiteliais e aspecto escamoso mais definido (REGEZI, SCIUBBA,

JORDAN, 2008; NEVILLE et al., 2009).

O diagnóstico deve ser feito com base nos critérios clínicos, radiográficos e

histopatológicos da lesão (REGEZI, SCIUBBA, JORDAN, 2008; NEVILLE et al., 2009;

GONDIM et al., 2008).

O tratamento geralmente inclui a enucleação do cisto e remoção do dente incluso.

Entretanto um tratamento mais conservador pode consistir na marsupialização do cisto e espera

da erupção espontânea do dente acometido (NEVILLE et al., 2009; GONDIM et al., 2008).

22

2.3 TECIDO ÓSSEO

O osso é um tecido dinâmico que é permanentemente remodelado num mecanismo

intrínseco que integra estímulos químicos, hormonais e biomecânicos. Ao longo da vida o tecido

ósseo sofre contínua remodelação por meio de um processo coordenado de reabsorção e

formação óssea. A reabsorção ocorre pela ação dos osteoclastos, células derivadas da linhagem

celular macrofágica, enquanto que a formação óssea se deve a ação dos osteoblastos, que são

células de origem mesenquimal. A maioria das doenças ósseas é causada por um distúrbio no

número e atividade das células osteoclásticas, resultando em inapropriada perda óssea que excede

a capacidade compensatória dos osteoblastos (HENERT et al., 2010). O aumento da atividade

osteoclástica é vista em numerosas desordens osteopênicas como a osteoporose pós-menopausa,

Doença de Paget, metástases ósseas e artrite reumatóide (FUKADA et al., 2009).

A atividade macrofágica é associada ao desenvolvimento de lesões no periápice dental e a

destruição óssea, através da secreção de citocinas osteorreabsortivas. Os macrófagos são

considerados a maior fonte de citocinas (IL-1α, IL-1β, TNF-α), metaloproteinases e

prostaglandinas, que contribuem para o processo inflamatório e o resultado destrutivo nas lesões

(VERNAL et al., 2006). Os Metabólitos do ácido araquidônico (via ciclooxigenase –

prostaglandinas e tromboxanos; e via lipooxigenase – leucotrienos) são encontrados em cistos

dentígeros e cistos radiculares. As prostaglandinas e o TNF-α, produzidos por macrófagos

ativados, são reconhecidos por estimularem a reabsorção óssea através do aumento da expressão

do RANKL em osteoblastos e células estromais (TAY et al., 2004).

Os osteoblastos induzem a diferenciação dos osteoclastos através do fator de

diferenciação osteoclástica (ODF), ou RANKL, em resposta a vários fatores estimuladores de sua

secreção. As células progenitoras osteoclásticas reconhecem o RANKL nos osteoblastos e,

através da interação célula-célula diferenciam-se em osteoclastos (KATAGIRI, TAKAHASI,

2002).

Citocinas inflamatórias e lipopolissacarídeos (LPS) estão diretamente envolvidos na

diferenciação e função osteoclástica. A IL-1 estimula diretamente a função osteoclástica e o

TNF-α estimula a diferenciação de progenitores osteoclásticos em osteoclastos na presença de M-

CSF (KATAGIRI, TAKAHASI, 2002; KAWASHIMA et al., 2007). Além dessas, várias outras

citocinas têm sido implicadas na osteoclastogênese e reabsorção óssea nos processos

23

inflamatórios, como por exemplo o IFN-γ e o TGF-β1. O IFN-γ possui a capacidade de induzir a

expressão de MHC classe II, e, portanto, de estimular a apresentação de antígenos aos linfócitos

T, provocando assim sua ativação e consequente liberação de fatores osteoclastogênicos como

RANKL e TNF-α (GAO et al., 2007) . Por sua vez, o TGF-β1 tem se mostrado um fator

indispensável na osteoclastogênese induzida por RANKL (YASUI et al., 2011; FULLER et al.,

2000). Apesar disso, essas duas citocinas têm mostrado atividades contraditórias no metabolismo

ósseo, a saber: o IFN-γ tanto pode inibir como induzir a osteoclastogênese; e o TGF-β1 tanto

pode promover a osteoclastogênese como a osteoblastogênese (YASUI et al., 2011; GAO et al.,

2007; FULLER et al., 2000).

2.4 INTERFERON-GAMA (IFN-γ)

A citocina IFN-γ é uma proteína homodimérica, produzida por células NK e linfócitos

TH1 CD4+

e T CD8+, que possui atividade antiviral e antiparasitária (SHIN et al., 2010; ABBAS,

LICHTMAN E PILLAI, 2008). Ela desempenha um papel importante na imunidade natural,

sendo secretada por células NK estimuladas por ligantes ativadores na superfície de células

hospedeiras infectadas ou lesadas, e indo atuar sobre os macrófagos, ativando-os para eliminação

de microrganismos fagocitados. Já na imunidade adquirida, os linfócitos T secretam o IFN-γ,

após serem estimulados pelo reconhecimento antigênico, com a mesma função de ativar os

macrófagos. Em ambas as respostas imunológicas a secreção de IFN-γ é estimulada pelas

citocinas IL-12 e IL-18, produzidas por macrófagos ativados (MUNK et al., 2011; ABBAS,

LICHTMAN E PILLAI, 2008).

O IFN-γ é considerado a citocina de assinatura dos linfócitos efetores Th1, uma vez que

promove a expressão de T-bet, um fator de transcrição considerado o regulador mestre da

diferenciação de linfócitos T CD4+

naïves em linfócitos efetores Th1, ao mesmo tempo em que

inibe a formação de células Th2. Após a exposição dos linfócitos T CD4+

naïves ao IFN-γ, ocorre

a ativação do fator de transcrição STAT1, que, por sua vez, promove a expressão de T-bet. O T-

bet, então, atua promovendo a transcrição do gene IFN-γ. Desta forma, a estimulação do IFN-γ

promove a expressão de T-bet e o T-bet promove a síntese de IFN-γ de maneira que este ciclo

vicioso compromete as células T CD4+

naïves a desenvolverem o fenótipo Th1 de linfócitos

efetores. Além disso, o T-bet tem a capacidade de se ligar a GATA-3, inibindo assim a sua

24

capacidade de promover a transcrição gênica de citocinas Th2, como IL-4 (SHIN et al., 2010;

ABBAS, LICHTMAN E PILLAI, 2008; PENG, 2006). Os linfócitos Th1 CD4+

regulam as

respostas imunológicas mediadas por células, marcadas pela produção de citocinas pró-

inflamatórias, tais como IFN-γ, TNF-α, IL-2 e IL-12, que têm o potencial de promover destruição

tecidual (SHIN et al., 2010; QUEIROZ-JUNIOR et al., 2010). Os efeitos destas citocinas sobre o

metabolismo ósseo têm sido amplamente estudados, sobretudo a participação do IFN-γ, que tem

mostrado atividades contraditórias sobre a osteoclastogênese, podendo atuar tanto promovendo

como inibindo a reabsorção óssea (GAO et al., 2007; QUEIROZ-JUNIOR et al., 2010). O IFN-γ

suprime a diferenciação osteoclástica induzida por RANKL, a partir das células precursoras de

osteoclastos, assim como a função de osteoclastos maduros, por induzir a rápida degradação de

TRAF6, o que resulta em forte inibição da ativação dos fatores de transcrição NF-κB e JNK,

desta forma, comprometendo a cascata de sinalização para a síntese de genes específicos de

osteoclastos. Sob esse aspecto, o IFN-γ age como uma citocina osteoprotetora (GAO et al., 2007;

QUEIROZ-JUNIOR et al., 2010; Ji et al., 2009). Por outro lado, o IFN-γ é o indutor fisiológico

da expressão de MHC classe II e, portanto, da apresentação de antígenos. Como resultado, ele é

capaz de provocar a ativação de células T, que, por sua vez, realizam a secreção dos fatores

osteoclastogênicos RANKL e TNF-α, desta forma funcionando como uma citocina indutora de

reabsorção óssea. Sendo assim, esses dados sugerem que o IFN-γ apresenta o potencial tanto de

inibir diretamente a diferenciação osteoclástica, por meio de uma atuação direta sobre as células

precursoras de osteoclastos (através da degradação de TRAF6), como de promover a

osteoclastogênese indiretamente, através da estimulação da apresentação de antígenos e

consequente ativação de linfócitos T para produzirem fatores osteoclastogênicos. Portanto, o

efeito final do IFN-γ sobre o tecido ósseo se deve ao desequilíbrio entre suas ações osteoprotetora

e osteorreabsortiva, que, sob circunstâncias inflamatórias e infecciosas, é favorável a reabsorção

óssea (GAO et al., 2007; KOTAKE et al., 2005).

O impacto das respostas imunológicas mediadas por células Th1 e Th2 na reabsorção

óssea associada a lesões periapicais ainda não é totalmente compreendido, e vários trabalhos têm

mostrado resultados controversos a esse respeito. A reabsorção óssea em processos inflamatórios

pode ser estimulada in vivo por citocinas secretadas por células Th1, como IFN-γ, e reprimida por

citocinas secretadas por células Th2, como IL-10 e IL-4 (FUKADA et al., 2009; HREN E IHAN,

2009). Por outro lado, tem sido relatado que tanto a resposta Th1 como a Th2 podem ter efeitos

25

inibitórios sobre a reabsorção óssea (FUKADA et al., 2009; ALAYAN, IVANOVSKI, FARAH,

2007; SATO et al., 2006).

A expressão de IFN-γ em cistos radiculares tem sido observada em estudos que comparam

o perfil das respostas imunológicas Th1 e Th2 entre cistos radiculares e outras lesões

odontogênicas, principalmente granulomas periapicais.

Fukada et al. (2009), observaram que a expressão de IFN-γ foi semelhante entre cistos

radiculares e granulomas periapicais, porém os cisto radiculares, por apresentarem maior

expressão de GATA-3, exibiram predominância de resposta Th2 e, portanto, menor atividade

osteorreabsortiva que os granulomas periapicais, que apresentaram maior resposta Th1, uma vez

que exibiram maior expressão de T-bet. O trabalho de Teixeira-Salum et al. (2010) mostrou

prevalência de IFN-γ em cistos radiculares em relação a granulomas periapicais, e associou sua

ocorrência a reabsorção óssea periapical ocasionada por estes cistos. Hren e Ihan (2009),

comparando a resposta inflamatória de cistos radiculares com a de granulomas periapicais (GP)

ocasionados por Streptococcus (GP-S) ou por bactérias anaeróbias (GP-A), observaram que a

produção de IFN-γ em cistos radiculares é maior que em GP-S, mas é semelhante a de PG-A.

Eles concluíram que infecções provocadas por bactérias anaeróbias provocam uma resposta

inflamatória Th1, e, portanto, com maior poder osteorreabsortivo. Por sua vez, Walker et al.

(2000), observaram, em cistos radiculares e granulomas periapicais, uma pequena quantidade de

células IFN-γ+ comparada à quantidade de células expressando IL-4, IL-6 e IL-10. Portanto, eles

concluíram que a predominância da resposta inflamatória Th2 em cistos radiculares e granulomas

periapicais tem papel fundamental na modulação da resposta inflamatória e resolução destas

lesões.

Trabalhos que relatem a expressão imuno-histoquímica do IFN-γ em cistos dentígeros não

foram encontrados durante a revisão da literatura do presente trabalho.

2.5 FATOR DE CRESCIMENTO TRANSFORMADOR β1 (TGF-β1)

A super família TGF-β consiste em uma família de citocinas diméricas estruturalmente

relacionadas, com representantes em diversos organismos como mamíferos e invertebrados. A

super família inclui a família TGF-β, BMPs, fatores de crescimento e diferenciação, activinas,

inibinas e hormônio anti-Müllerian, que desempenham importantes papéis na regulação da

26

proliferação e diferenciação celular, e possuem funções essenciais durante a embriogênese

(JANSSENS et al., 2005; SHI, MASSAGUE´, 2003). A família TGF-β é representada por três

moléculas intimamente relacionadas, originadas a partir de um ancestral comum, porém

codificadas por genes diferentes. As três isoformas são TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3, que

apresentam grande similaridade no domínio C-terminal, com nove resíduos de cisteína

conservados. Porém, apesar dessa alta homologia de sequência, estudos in vivo das funções

dessas três isoformas, através de genes knockouts, revelaram diferenças impressionantes,

demonstrando ausência de redundância das suas funções. De modo geral, TGF-β1 é a isoforma

mais abundante, sendo produzida principalmente pelo tecido ósseo e células como plaquetas,

eosinófilos, linfócitos T estimulados por antígeno e fagócitos mononucleares ativados por LPS,

além de osteoclastos e osteoblastos, dentre outras (JANSSENS et al., 2005; ABBAS,

LICHTMAN e PILLAI, 2008; DANIN et al., 2000; TYLER et al., 1999).

TGF-β1 regula uma grande quantidade de processos biológicos como proliferação,

sobrevivência, diferenciação, reconhecimento, apoptose e migração celular, e produção de matriz

extra-celular, apresentando assim funções importantes nas respostas imunológicas, angiogênese,

cicatrização de lesões, desenvolvimento do organismo e metabolismo ósseo. Sendo assim, devido

a grande diversidade de processos nos quais TGF-β1 está envolvido, fica clara a grande

importância desta citocina durante a embriogênese e na manutenção da homeostase de tecidos

durante a vida (JANSSENS et al., 2005; SHI, MASSAGUE´, 2003; EHNERT et al., 2010). No

caso de lesões inflamatórias periapicais, o TGF-β1 tem sido relacionado a modulação da resposta

inflamatória e ao processo de reparo das mesmas (GAZIVODA et al., 2009; DANIN et al., 2000;

TYLER et al., 1999).

O TGF-β1 é sintetizado como uma proteína latente, constituída por três partes distintas: o

peptídeo sinal, o peptídeo associado a latência (LAP), e o peptídeo maduro. O LAP confere

latência ao TGF-β1 por impedir os epítopos do peptídeo maduro de interagirem com os

receptores de TGF-β1. O complexo formado pelo LAP associado ao peptídeo maduro é chamado

de complexo latente pequeno (SLC) e pode se tornar associado a uma proteína latente ligadora de

TGF-β (LTBP) para formar o complexo latente grande (LLC). Neste contexto, a LTBP tem um

papel importante na secreção e armazenamento do LLC na matriz extra-celular, através de

interações com a mesma. Apesar da maioria das células secretarem TGF-β1 como parte do LLC,

as células ósseas secretam predominantemente o SLC. Somado a isso, tem sido observado que

27

nenhum outro tecido apresenta a grande quantidade de SLC como o tecido ósseo, o que sugere

uma importante função para esta forma de apresentação do TGF-β1 no osso, provavelmente

funcionando como um pool de TGF-β1 prontamente disponível (EHNERT et al., 2010;

JANSSENS et al., 2005).

A ativação do TGF-β1 é promovida por processos enzimáticos que provocam a liberação

do LLC da matriz extra-celular, bem como a degradação da LAP ou ruptura das ligações não

covalentes entre LAP e o peptídeo maduro, possibilitando desta forma a interação dos epítopos

deste último com os receptores de TGF-β1. No tecido ósseo essa ativação se dá devido a

acidificação local proporcionada pelos osteoclastos, que provoca a quebra das ligações não

covalentes entre LAP e o peptídeo maduro, e provavelmente também pela ação de proteases

liberadas por essas células (EHNERT et al., 2010; JANSSENS et al., 2005).

Para exercer suas diversas funções após sua ativação, o TGF-β1 interage com seus

receptores, que correspondem a duas proteínas transmembrana que apresentam um domínio

serina/treoniona cinase citoplasmático: TβRI (ou ALK5) e TβRII (SHI, MASSAGUE´, 2003). A

ligação do TGF-β1 ao TβRII promove o recrutamento e fosforilação do TβRI, que, por sua vez,

provoca a ativação de cascatas de sinalização tanto pela via Smad como pela via não Smad. Na

via Smad, o Smad 2 e o Smad 3 ativados se ligam ao Smad 4, e o complexo Smad 2/3/4 migra

para o núcleo, onde vai atuar auxiliando a transcrição gênica. Já na via não Smad, estão

envolvidas várias vias Smad independentes, tais como ramos de MAPK (YASUI et al., 2011;

ZHOU, 2011; EHNERT et al., 2010). É através dessas vias que o TGF-β1 promove seus efeitos

sobre o tecido ósseo (JANSSENS et al., 2005).

Ao longo da vida o tecido ósseo sofre contínua remodelação através do equilíbrio entre

processos de reabsorção e formação óssea, realizados por osteoclastos e osteoblastos,

respectivamente. O desequilíbrio desse balanço pode provocar a perda patológica de massa óssea,

vista, por exemplo, na osteoporose (EHNERT et al., 2010). Existem muitas evidências de que o

TGF-β1 está envolvido na fisiologia das células ósseas. Apesar dele ser considerado um

estimulador de formação óssea, através da indução da osteoblastogênese (ZHOU, 2011), muitos

estudos têm mostrado que ele também é um potente estimulador da osteoclastogênese e da

reabsorção óssea (FULLER et al., 2000; MCGOWAN et al., 2003). Sendo assim, por apresentar a

capacidade de promover ou inibir tanto a osteoclastogênese como a osteoblastogênese

28

(EDWARDS et al., 2010), o TGF-β1 pode ser considerado uma citocina com potenciais tanto

osteoprodutivo, como osteorreabsortivo.

Yasui et al. (2011) e Fuller et al. (2000) concluíram em seus estudos que o TGF-β1 é

indispensável na osteoclastogênese induzida por RANKL. Por outro lado, Tachi et al. (2010)

observaram que o TGF-β1 funciona como um grande potencializador da formação de osso

ectópico induzida por BMP-2. Já, Ehnert et al. (2010) investigaram a hipótese de que o aumento

dos níveis séricos de TGF-β1 a longo prazo em doenças crônicas como osteodistrofia hepática ou

renal deve ser um potencial indutor da perda de densidade óssea associada a essas doenças. Em

seu estudo eles investigaram os efeitos do TGF-β1 sobre osteoblastos humanos durante um

período de cultura de 20 dias e observaram que, apesar do TGF-β1 induzir a proliferação dos

osteoblastos nos estágios iniciais do experimento, a contínua estimulação dessas células

desenvolveu eventos desfavoráveis a ação osteoblástica como diminuição da atividade de AP e

dos níveis de BMP-2, assim como aumento da expressão de RANKL, o que ocasionou perda de

função dessas células. Esses efeitos do TGF-β1 poderiam explicar a perda de densidade óssea em

pacientes com doenças inflamatórias crônicas, que apresentam níveis séricos elevados de TGF-β1

por longos períodos de tempo.

Sendo assim, diante dessas informações contrastantes a respeito dos efeitos do TGF-β1

sobre o tecido ósseo, Edwards et al. (2010) relataram que apesar da grande quantidade de

trabalhos que descrevem os efeitos do TGF-β no tecido ósseo, um consenso sobre a verdadeira

função dessa proteína sobre a biologia das células ósseas e sobre a remodelação do tecido ósseo

ainda não foi estabelecido.

29

3 PROPOSIÇÃO

O propósito do presente estudo é avaliar e comparar a expressão imuno-histoquímica do

IFN-γ e do TGF-β1 entre cistos radiculares e cistos dentígeros com o objetivo de compreender o

papel e o comportamento dessas proteínas no processo de expansão destes cistos .

30

4 MATERIAL E MÉTODOS

4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO

Este estudo observacional retrospectivo caracterizou-se por uma análise descritiva dos

dados clínicos de pacientes apresentando CR e CD, assim como uma análise comparativa da

expressão imuno-histoquímica dos biomarcadores IFN-γ e TGF-β1 no epitélio e cápsula desses

cistos radiculares e cistos dentígeros.

4.2 POPULAÇÃO

Todos os casos de cistos radiculares e cistos dentígeros pertencentes ao arquivo do serviço

de Anatomia Patológica do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte (UFRN), Natal-RN, Brasil.

4.3 AMOSTRA

A amostra do estudo foi constituída por 40 espécimes fixados em formol a 10% e

incluídos em parafina, obtidos e selecionados dentre todos os casos registrados no serviço de

Patologia Oral da UFRN, sendo 20 espécimes de cistos radiculares e 20 espécimes de cistos

dentígeros.

4.4 CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DA AMOSTRA

4.4.1 Critérios de inclusão

Foram incluídos na amostra os espécimes de cisto radicular e cisto dentígero que

continham informações sobre dados clínicos dos pacientes, e que exibiam características

histológicas bem definidas pertinentes a cada lesão, sendo a presença do revestimento epitelial e

da cápsula critérios para inclusão na amostra para o estudo imuno-histoquímico.

31

4.4.2 Critérios de exclusão

Foram excluídos do estudo os espécimes com material insuficiente para análise imuno-

histoquímica e os casos que apresentavam poucas informações clínicas dos pacientes. Também

foram excluídos os casos de cisto dentígero inflamatório.

4.5 ESTUDO MORFOLÓGICO

Para o estudo morfológico, examinaram-se sob microscopia de luz (OLIMPUS CH30), as

lâminas que haviam sido submetidas previamente a cortes histológicos de 5μm de espessura e

coradas pela técnica da hematoxilina/eosina. Foi avaliado o tipo de revestimento epitelial, que

enquadrava o espécime como caso de cisto radicular ou cisto dentígero.

4.6 COLETA DOS DADOS CLÍNICOS

Após a seleção dos casos, os dados clínicos dos pacientes foram coletados por meio de

uma ficha clínica (Apêndice A), que averiguava informações sobre gênero, cor da pele, idade,

bem como localização da lesão, sintomatologia e diagnóstico histopatológico. Os dados foram

obtidos das fichas que acompanham o material para exame anátomo-patológico.

4.7 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO

Para o estudo imuno-histoquímico, os espécimes emblocados em parafina foram

submetidos a cortes de 3 m de espessura, que, por sua vez, foram dispostos em lâminas de vidro

previamente preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropiltrietoxisilano, Sigma

Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Posteriormente, os cortes foram submetidos à técnica de

coloração imuno-histoquímica através do método da Estreptoavidina-Biotina (LSAB, do inglês

labeled streptoavidin-biotin), utilizando os anticorpos primários anti-IFN-γ e anti-TGF-β1

(Quadro 1).

32

Quadro 1 Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica, tempo de incubação e clone

dos anticorpos primários utilizados no estudo.

Especificidade Fabricante Diluição Recuperação

antigênica

Tempo de

Incubação Clone

IFN-γ Santa Cruz

Biotechnology 1:200

Pepsina pH 1,8 a 1%,

estufa a 37°C, 60’ Overnight SC-8308

TGF-β1 Santa Cruz

Biotechnology 1:700

Pepsina pH 1,8 a 1%,

estufa a 37°C, 60’ Overnight

SC-146

4.7.1 Coloração pelo método imuno-histoquímico

Como controle positivo para os anticorpos foram utilizados cortes histológicos de lesões

centrais de células gigantes. O controle negativo foi estabelecido pela substituição do anticorpo

primário por albumina de soro bovino (BSA) a 1% em solução tampão.

A técnica utilizada seguiu o protocolo descrito abaixo:

Desparafinização: 2 banhos em xilol, à temperatura ambiente (10 minutos cada);

Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:

Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

Álcool etílico 95°GL (5 minutos);


Remoção de pigmentos formólicos com hidróxido de amônia a 10% em etanol 95°, à

temperatura ambiente (10 minutos);

Lavagem em água corrente (10 minutos)

Duas passagens em água destilada (5 minutos cada);

33

Recuperação antigênica;

Lavagem em água corrente (10 minutos);


Duas incubações dos cortes em solução de peróxido de hidrogênio 3% 10 volumes, em

proporção de 1/1, para o bloqueio da peroxidase endógena tecidual (10 minutos cada);



Duas passagens em solução tampão TRIS-HCl (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)

pH 7,4 (5 minutos cada);

Incubação dos cortes com anticorpos primários, em solução diluente (Antibody diluent with

background reducing components, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA);

Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);

Incubação com anticorpo secundário (Biotinylated link universal, DAKO, A/S, Gloustrup,

Dinamarca +System, diluição 1:200) durante 30 minutos;

Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCl pH 7,4 (5 minutos cada);

Incubação com o sistema LSAB para IFN-γ e TGF-β1;

Duas passagens em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 (5 minutos cada);

Revelação da reação com solução cromógena de 3,3-diaminobenzidina (Liquid DAB+

Substrate, Dako North America Inc., Carpinteria, CA, USA) (10 minutos);


Passagens rápidas em água destilada (2 trocas);

Contracoloração com hematoxilina de Mayer, à temperatura ambiente (10 minutos);

Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:



Álcool etílico absoluto I (5 minutos);

Álcool etílico absoluto II (5 minutos);

Álcool etílico absoluto III (5 minutos);

Duas passagens em xilol (2 minutos cada);

Montagem da lamínula em resina Permount® (Fisher Scientific Inc., Fair Lawn, NJ, USA).

34

4.7.2 Análise da marcação imuno-histoquímica

Para análise imuno-histoquímica dos antígenos em todos os espécimes incluídos na

amostra, o parâmetro consistiu na positividade da marcação, sendo consideradas positivas as

células que exibiram coloração acastanhada no núcleo ou no citoplasma. Após o tratamento

imuno-histoquímico, as células imunorreativas foram analisadas quantitativamente. A expressão

imuno-histoquímica de IFN- e TGF-β1 foi avaliada no revestimento epitelial e na cápsula cística

dos cistos radiculares e cistos dentígeros.

No epitélio, a análise foi semi-quantitativa de acordo com o método proposto por

Leonardi et al. (2003), com algumas modificações relativas aos escores de imunomarcação. Neste

método, a imunomarcação epitelial foi classificada de acordo com os seguintes parâmetros, em

um aumento de 400X: ≤ 10% de células imunomarcadas (escore 0); marcação em 11 a 25% das

células (escore 1); marcação em 26 a 75% das células (escore 2); e, marcação em mais de 75%

das células (escore 3) (Apêndice B). Para obtenção do escore (E) em cada caso, foi analisada toda

a extensão do epitélio cístico disponível na lâmina histológica. Os resultados foram obtidos

avaliando-se a frequência dos escores e a média relativa aos escores dos 20 casos.

Na cápsula, a análise das células imunorreativas foi quantitativa, e realizada de acordo o

método proposto por Menezes et al. (2006). Para cada caso de CR e CD, foi estabelecido o

percentual (P) de células imunopositivas (+) sobre o total de células contadas em 10 campos

consecutivos, utilizando-se um aumento de 1000X. Esse percentual foi obtido por meio da

divisão do número de células imunopositivas pelo número total de células contadas nos 10

campos. Para a contagem das células, os campos selecionados foram fotografados utilizando-se

microscópio de luz OLYMPUS® com máquina fotográfica digital OLYMPUS® acoplada. Estas

imagens foram transferidas para o computador através do sistema OLYMPUS Master v.1.41 EX,

e as células contadas com o auxílio do software IMAGE J® (National Institutes of Health,

Bethesda, Maryland, USA). Tendo-se obtido o percentual de células imunopositivas (P), atribuiu-

se um escore (E) para cada caso, levando-se em conta o padrão do escore utilizado para o

epitélio, sendo: escore 0 (≤ 10% de células imunomarcadas); 1 (marcação em 11 a 25% das

35

células); 2 (marcação em 26 a 75% das células); e 3 (marcação em mais de 75% das células)

(Apêndices C, D, E, F).

Estes procedimentos de contagem foram realizados para os dois imunomarcadores, IFN-

e TGF-β1, em ambas as lesões.

4.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Com o intuito de testar as hipóteses aventadas na presente pesquisa, os resultados obtidos

foram submetidos a testes estatísticos apropriados. Os dados coletados foram digitados em

planilhas eletrônicas do Excel (Microsoft Office 2007 for Windows) e, posteriormente,

transferidos para o programa SPSS (Statistical for Social Science version 17.0 for Windows-SPSS

Inc. Chicago, Illinois, 2007) para análises estatísticas.

Para os dados clínicos, realizou-se uma análise descritiva dos dados. Já, para análise da

associação dos escores de imunomarcação dos biomarcadores (IFN- e TGF-β1) no epitélio com

o tipo de lesão (CR e CD), assim como, para a associação dos escores e percentuais de

imunomarcação dos biomarcadores na cápsula cística com o tipo de lesão, foi realizado o teste

estatístico de Mann-Whitney.

Por sua vez, para análise da correlação entre os escores de imunomarcação dos

biomarcadores (IFN- e TGF-β1) no epitélio dos CR e dos CD, assim como para a correlação

entre os escores e percentuais de imunomarcação dos biomarcadores na cápsula dos CR e dos

CD, foi realizado o teste estatístico de Wilcoxon.

Para todos os testes estatísticos foi estabelecido o nível de significância de 5% (p 0,05).

4.9 IMPLICAÇÕES ÉTICAS

O projeto de pesquisa desenvolvido foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, de acordo com a resolução 196/96 do CNS,

segundo protocolo 185/11-P CEP/UFRN e CAAE n° 0210.0.051.000-11.

36

5 RESULTADOS

5.1 ASPECTOS HISTOPATOLÓGICOS DA AMOSTRA SELECIONADA PARA O ESTUDO

Em nosso estudo os achados histopatológicos dos casos diagnosticados como CR

caracterizam-se pela presença de um revestimento epitelial pavimentoso estratificado não

ceratinizado, variando muito em sua espessura, sendo na maioria dos casos hiperplásico (Figura

3), exibindo áreas de exocitose, espongiose, degeneração hidrópica e apresentando, em alguns

casos, projeções arciformes, além de células mucosas e ciliadas. As cápsulas constituem-se de

tecido conjuntivo fibroso denso, contendo quantidades variáveis de células inflamatórias, no

entanto, apresentando na maioria dos casos um intenso infiltrado inflamatório

predominantemente mononuclear. Além disso, observam-se, em alguns casos, imagens negativas

de cristais de colesterol. Os casos de CD caracterizam-se por um revestimento epitelial

pavimentoso estratificado não ceratinizado, com poucas camadas de células, se mostrando

portanto, na maioria dos casos, atrófico. As cápsulas constituem-se de tecido conjuntivo fibroso

de densidade variável, exibindo áreas de hemorragia, pigmentação por hemossiderina e, na

maioria dos casos, um leve infiltrado inflamatório mononuclear (Figura 4). Em alguns casos,

observam-se ainda ninhos de epitélio odontogênico dispersos na cápsula.

5.2 ANÁLISE DESCRITIVA DE FREQUÊNCIA DOS DADOS

Embora haja certa variação na distribuição dos dados por idade, cor da pele, gênero e

localização das lesões, os dados clínicos e histopatológicos serviram para traçar o universo dos

grupos selecionados para o estudo. Os dados clínicos relativos a cada caso foram coletados e os

resultados dispostos no Quadro 2.

5.2.1 Distribuição dos dados por gênero, cor da pele, localização da lesão e sintomatologia

37

Quadro 2 Frequências dos dados referentes a gênero, cor da pele, localização da lesão e

sintomatologia dos casos de cisto radicular e cisto dentígero.

VARIÁVEIS

LESÕES

CR n (%) CD n (%)

Gênero

Feminino 11 (55%) 9 (45,0%)

Masculino 9 (45,0%) 11 (55,0%)

Total n (%) 20 (100,0%) 20 (100,0%)

Cor da pele

Leucoderma 16 (80,0%) 12 (60,0%)

Feoderma 3 (15,0%) 2 (10,0%)

Melanoderma 1 (5,0%) 4 (20,0%)

Total n (%) 20 (100,0%) 18 (90,0%)

Localização

Maxila anterior 9 (45,0%) 7 (35,0%)

Maxila Posterior 1 (5,0%) 1 (5,0%)

Mandíbula Anterior 3 (15,0%) 0 (0,0%)

Mandíbula Posterior 5 (25,0%) 10 (50%)

Total n (%) 18 (90,0%) 18 (90,0%)

Sintomatologia

Assintomático 12 (60,0%) 13 (65,0%)

Sintomático 4 (20,0%) 5 (25,0%)

Total n (%) 16 (80,0%) 18 (90%)

Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral (UFRN).

Legenda: CR – cisto radicular; CD – cisto dentígero

5.2.2 Distribuição dos dados por idade

Para os CR a idade variou de 13 a 70 anos (Figura 1) (média: 32,5 anos; desvio-padrão:

13,67 anos).

38

Para os CD a idade variou de 9 a 60 anos (Figura 2) (média: 24,79 anos; desvio-padrão:

12,35 anos).

Figura 1 Frequências dos dados relativos a idade nos casos de CR.

Figura 2 Frequências dos dados relativos a idade nos casos de CD (*dado não informado

na ficha clínica).

*

39

5.3 ANÁLISE DESCRITIVA DOS RESULTADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS

Em ambas as lesões, tanto o IFN- como o TGF-β1, marcaram os seguintes tipos de

células: células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos, linfócitos, plasmócitos, neutrófilos e

células da linhagem monocítico-macrofágica. O padrão de marcação dos dois imunomarcadores

nas duas lesões foi predominantemente citoplasmático em todas essas células, embora, por vezes,

as mesmas exibissem marcação nuclear, principalmente as células epiteliais, plasmócitos e

células da linhagem monocítico-macrofágica. Além disso, tanto o IFN- como o TGF-β1,

apresentaram um padrão de marcação da matriz extra-celular em alguns casos nos dois grupos de

lesões. Para uma melhor compreensão dos resultados, eles foram divididos em análises dos

resultados no epitélio e na cápsula dos cistos.

5.3.1 No epitélio

5.3.1.1 Cistos radiculares

A expressão imuno-histoquímica do IFN- e do TGF-β1 localizou-se no citoplasma e por

vezes no núcleo das células do revestimento epitelial dos cistos radiculares (figuras 5 e 6).

A frequência dos escores de imunomarcação para o IFN- foi de 17 casos com escore 3, o

que corresponde a 85% dos casos, seguidos de 3 casos (15%) com escore 2. Para o TGF-β1

houve uma freqüência de 15 casos (75%) com escore 3, seguidos de 4 casos (20%) com escore 2,

e 1 caso (5%) com escore 1. (tabela 1)

Portanto, após analisar as frequências dos escores de imunomarcação, observa-se que

houve um predomínio do escore 3 (isto é, mais de 75% de células imunomarcadas), tanto para o

IFN- como para o TGF-β1 no epitélio dos cistos radiculares.

A média dos escores de imunomarcação ( um desvio padrão) do IFN- no epitélio dos

cistos radiculares foi de 2,85 0,36. Já a do TGF-β1 foi de 2,7 0,57.

40

5.3.1.2 Cistos dentígeros

A expressão imuno-histoquímica do IFN- e do TGF-β1 localizou-se no citoplasma e por

vezes no núcleo das células do revestimento epitelial dos cistos dentígeros (figuras 7 e 8).

A frequência dos escores de imunomarcação para o IFN- foi de 15 casos com escore 3, o

que corresponde a 75% dos casos, seguidos de 4 casos (20%) com escore 2, e 1 caso (5%) com

escore 1. Para o TGF-β1 houve 17 casos (85%) com escore 3, seguidos de 2 casos (10%) com

escore 2, e 1 caso (5%) com escore 1 (tabela 1).

Portanto, após analisar as frequências dos escores de imunomarcação, observa-se que

houve um predomínio do escore 3 (isto é, mais de 75% de células imunomarcadas), tanto para o

IFN- como para o TGF-β1 no epitélio dos cistos dentígeros.

A média dos escores de imunomarcação ( um desvio padrão) do IFN- no epitélio dos

cistos dentígeros foi de 2,7 0,57. Já a do TGF-β1 foi de 2,8 0,52.

41

Tabela 1 Distribuição dos escores da marcação imuno-histoquímica para os anticorpos anti-IFN-

e anti-TGF-β1 no epitélio dos cistos radiculares e dos cistos dentígeros. Natal, RN – 2012.

Casos

CISTO RADICULAR CISTO DENTÍGERO

IFN- TGF-β1 IFN- TGF-β1

E E E E

1 3 3 3 3

2 3 3 3 3

3 3 3 3 3

4 3 3 3 3

5 2 1 3 3

6 3 3 3 3

7 3 3 2 2

8 3 3 3 3

9 3 3 3 3

10 3 3 3 3

11 3 2 3 3

12 3 2 3 2

13 3 3 2 3

14 2 2 2 3

15 3 3 3 3

16 3 2 1 1

17 3 3 3 3

18 2 3 2 3

19 3 3 3 3

20 3 3 3 3

Legenda: E – escore de imunomarcação

42

5.3.2 Na cápsula

Para todos os casos de CR e CD foi estabelecido o percentual de células imunopositivas

sobre o total de células contadas nos 10 campos. Esse percentual foi obtido por meio da divisão

do número de células marcadas (imunopositivas) pelo número total de células contadas nos 10

campos de cada caso. Esses percentuais foram identificados como PIFN-γ e PTGF-β1 para IFN- e

TGF-β1, respectivamente. De posse desses percentuais, foram estabelecidos adicionalmente

escores de imunomarcação (E) para a cápsula de cada caso dos dois grupos de cisto, a

semelhança do que foi feito para o epitélio, considerando-se os mesmos parâmetros de

quantidade (em porcentagem) de células imunomarcadas.

5.3.2.1 Cistos radiculares

A expressão imuno-histoquímica do IFN- e do TGF-β1 na cápsula dos cistos radiculares

se deu principalmente nas células inflamatórias como linfócitos, plasmócitos, neutrófilos e

células de linhagem monocítico-macrofágica, predominantemente com um padrão de marcação

citoplasmática, muito embora essas mesmas células, por vezes, exibissem marcação nuclear

(Figuras 9 e 10). Outras células como fibroblastos e células endoteliais também apresentaram

imunomarcação nuclear e citoplasmática para os dois anticorpos, porém com menor freqüência.

Além disso, observou-se ainda um padrão de imunomarcação da matriz extra-celular para os dois

anticorpos em alguns casos.

Com relação a imunomarcação do IFN- na cápsula dos CR, a quantidade de células

imunopositivas variou de 2 a 126 (Apêndice C), e o percentual de células imunopositivas (PIFN-γ)

de 36% a 93% (Tabela 2). A média dos percentuais de células imunopositivas ( um desvio

padrão) foi de 79 15.

Quanto a imunomarcação do TGF-β1 na cápsula dos CR, a quantidade de células

imunopositivas variou de 5 a 118 (Apêndice D), e o percentual de células imunopositivas (PTGF-

β1) de 33% a 97% (Tabela 2). A média dos percentuais de células imunopositivas ( um desvio

padrão) foi de 82 .

43

Tabela 2 Distribuição dos percentuais de células imunopositivas para os anticorpos anti-IFN- e

anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos radiculares. Natal, RN – 2012.

CASOS

IFN- TGF-β1

PIFN- PTGF-β1

1 78% 88%

2 84% 90%

3 62% 80%

4 73% 91%

5 77% 61%

6 92% 65%

7 50% 93%

8 84% 96%

9 86% 96%

10 79% 83%

11 92% 76%

12 91% 33%

13 92% 94%

14 36% 72%

15 85% 97%

16 93% 94%

17 91% 76%

18 65% 77%

19 85% 80%

20 93% 94%

Legenda: PIFN- - percentual de células imunopositivas para IFN- ; PTGF-β1 - percentual de células imunopositivas

para TGF-β1.

Os resultados referentes aos escores de imunomarcação para a cápsula dos CR encontram-

se dispostos na Tabela 3. A freqüência dos escores de imunomarcação do IFN- na cápsula dos

CR foi de 15 casos (75%) com escore 3, seguidos de 5 casos (25%) com escore 2. Para o TGF-β1

a freqüência foi de 16 casos (80%) com escore 3, e 4 casos (20%) com escore 2. Houve um

44

predomínio do escore 3 (isto é, mais de 75% de células imunopositivas) para os dois

imunomarcadores.

Ademais, a média dos escores de imunomarcação ( um desvio padrão) do IFN- na

cápsula dos CR foi de 2,75 0,44. Por sua vez, a do TGF-β1 foi de 2,8 0,41.


e anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos radiculares. Natal, RN – 2012.

CISTO RADICULAR

CASOS

IFN- TGF-β1

E E

1 3 3

2 3 3

3 2 3

4 2 3

5 3 2

6 3 2

7 2 3

8 3 3

9 3 3

10 3 3

11 3 3

12 3 2

13 3 3

14 2 2

15 3 3

16 3 3

17 3 3

18 2 3

19 3 3

20 3 3


45

5.3.2.2 Cistos dentígeros

Da mesma forma que nos cistos radiculares, a expressão imuno-histoquímica do IFN- e

do TGF-β1 na cápsula dos cistos dentígeros se deu principalmente nas células inflamatórias como

linfócitos, plasmócitos, neutrófilos e células de linhagem monocítico-macrofágica,

predominantemente com um padrão de marcação citoplasmática, muito embora essas mesmas

células, por vezes, exibissem marcação nuclear (Figuras 11 e 12). Outras células como

fibroblastos e células endoteliais, além de ninhos de epitélio odontogênico, também apresentaram

imunomarcação nuclear e citoplasmática para os dois anticorpos, porém com menor freqüência.

Além disso, observou-se ainda um padrão de imunomarcação da matriz extra-celular para os dois

anticorpos em alguns casos.

Com relação a imunomarcação do IFN- na cápsula dos CD, a quantidade de células

imunopositivas variou de 1 a 92 (Apêndice E), e o percentual de células imunopositivas (PIFN-γ)



Quanto a imunomarcação do TGF-β1 na cápsula dos CD, a quantidade de células

imunopositivas variou de 3 a 80 (Apêndice F), e o percentual de células imunopositivas (PTGF-β1)



46

Tabela 4 Distribuição dos percentuais de células imunopositivas para os anticorpos anti-IFN- e

anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos dentígeros. Natal, RN – 2012.

CASOS

IFN- TGF-β1

PIFN- PTGF-β1

1 82% 96%

2 89% 94%

3 79% 84%

4 88% 90%

5 74% 95%

6 75% 93%

7 41% 65%

8 77% 94%

9 95% 99%

10 87% 93%

11 92% 100%

12 89% 81%

13 75% 98%

14 76% 82%

15 56% 91%

16 65% 91%

17 95% 91%

18 49% 93%

19 74% 88%

20 84% 86%

Legenda: PIFN- - percentual de células imunopositivas para IFN- ; PTGF-β1 - percentual de células

imunopositivas para TGF-β1.

47

Os resultados referentes aos escores de imunomarcação para a cápsula dos CD encontram-

se dispostos na Tabela 5. A freqüência dos escores de imunomarcação do IFN- na cápsula dos

CD foi de 12 casos (60%) com escore 3, seguidos de 8 casos (40%) com escore 2. Para o TGF-β1

a freqüência foi de 19 casos (95%) com escore 3, e apenas 1 caso (5%) com escore 2. Houve um

predomínio do escore 3 (isto é, mais de 75% de células imunopositivas) para os dois

imunomarcadores. Além disso, observa-se que o TGF-β1 apresentou maior freqüência desse

escore.

A média dos escores de imunomarcação ( um desvio padrão) do IFN- na cápsula dos

CD foi de 2,6 0,5. Por sua vez, a do TGF-β1 foi de 2,95 0,22.

48


e anti-TGF-β1 na cápsula dos cistos dentígeros. Natal, RN – 2012.

CISTO DENTÍGERO

CASOS

IFN- TGF-β1

E E

1 3 3

2 3 3

3 3 3

4 3 3

5 2 3

6 2 3

7 2 2

8 3 3

9 3 3

10 3 3

11 3 3

12 3 3

13 2 3

14 3 3

15 2 3

16 2 3

17 3 3

18 2 3

19 2 3

20 3 3


49

5.4 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

5.4.1 Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a imunoexpressão

epitelial dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 (teste de Mann-Whitney)

O teste estatístico de Mann-Whitney revelou não existir diferença estatisticamente

significativa entre as expressões do IFN- nos epitélios dos CR e CD (p=0,565). O mesmo

ocorreu para o TGF-β1 (p=0,620) (Tabela 6).

Tabela 6 Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a imunoexpressão epitelial

dos biomarcadores IFN- e TGF-β1. Natal, RN - 2012.

Biomarcador Lesão Média*

p**

IFN-γ CR 2,85

0,565 CD 2,7

TGF-β1 CR 2,7

0,620 CD 2,8

* Média dos escores de imunomarcação

** Teste de Mann-Whitney

5.4.2 Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a imunoexpressão, em

suas cápsulas, dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 (teste de Mann-Whitney)

a) escores de imunomarcação: ao analisarmos os escores de imunomarcação, observamos

que não houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões do IFN- nas

cápsulas dos CR e CD (p=0,429). O mesmo ocorreu para o TGF-β1 (p=0,429) (Tabela 7);

b) percentuais de células imunopositivas: ao analisarmos os percentuais de células

imunopositivas, observamos que não houve diferença estatisticamente significativa entre

as expressões do IFN- nas cápsulas dos CR e CD (p=0,414) (Tabela 7). O mesmo

ocorreu para o TGF-β1 (p=0,056).

50

Tabela 7 Comparação entre os grupos de cistos CR e CD com relação a imunoexpressão, em suas

cápsulas, dos biomarcadores IFN- e TGF-β1, considerando-se as avaliações tanto através dos

escores de imunomarcação (E) como através dos percentuais de células imunopositivas (P). Natal,

RN - 2012.

Biomarcador Lesão Média*

p**

IFN-γ

CRE 2,75 0,429

CDE 2,6

CRP 79% 0,414

CDP 77%

TGF-β1

CRE 2,8 0,429

CDE 2,95

CRP 82% 0,056

CDP 90%

Legenda: CRE: avaliação dos CR através dos escores de imunomarcação; CDE: avaliação dos CD através dos escores

de imunomarcação;CRP: avaliação dos CR através dos percentuais de células imunopositivas; CDP: avaliação dos CD

através dos percentuais de células imunopositivas. *Média dos escores de imunomarcação (E) ou média dos

percentuais de células imunopositivas (P); **Teste de Mann-Whitney.

5.4.3 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 no epitélio

e na cápsula dos CR (teste de Wilcoxon)

5.4.3.1 No epitélio

O teste estatístico de Wilcoxon revelou que não houve diferença estatisticamente

significativa entre as expressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 no epitélio dos CR

(p=0,225) (Tabela 8).

5.4.3.2 Na cápsula


que não houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões de IFN- e

TGF-β1 na cápsula dos CR (p=0,735) (Tabela 9);

51


imunopositivas, observamos que não houve diferença estatisticamente significativa entre

as expressões de IFN- e TGF-β1 na cápsula dos CR (p=0,370) (Tabela 9).

5.4.4 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 no epitélio

e na cápsula dos CD (teste de Wilcoxon)

5.4.4.1 No epitélio

O teste estatístico de Wilcoxon revelou que não houve diferença estatisticamente

significativa entre as expressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 no epitélio dos CD

(p=0,361) (Tabela 8).

5.4.4.2 Na cápsula


que houve diferença estatisticamente significativa entre as expressões de IFN- e TGF-β1

na cápsula dos CD (p=0,018) (Tabela 9).


imunopositivas, observamos que houve diferença estatisticamente significativa entre as

expressões de IFN- e TGF-β1 na cápsula dos CD (p=0,001) (Tabela 9).

52

Tabela 8 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 nos epitélios

dos CR e CD. Natal, RN - 2012.

Lesão Biomarcador Média*

p**

CR IFN-γ 2,85

0,225 TGF-β1 2,7

CD IFN-γ 2,7

0,361 TGF-β1 2,8

*Média dos escores de imunomarcação

**Teste de Wilcoxon

Tabela 9 Comparação entre as imunoexpressões dos biomarcadores IFN- e TGF-β1 nas cápsulas

dos CR e CD, considerando-se as avaliações tanto através dos escores de imunomarcação (E)

como através dos percentuais de células imunopositivas (P). Natal, RN - 2012.

Lesão Biomarcador Média*

p**

CR

IFN- E 2,75 0,735

TGF-β1E 2,8

IFN- P 79% 0,370

TGF-β1P 82%

CD

IFN- E 2,6 0,018

TGF-β1E 2,95

IFN- P 77% 0,001

TGF-β1P 90%

Legenda: IFN- E: avaliação do IFN- através dos seus escores de imunomarcação; TGF-β1E: avaliação do TGF-β1

através dos seus escores de imunomarcação; IFN- P: avaliação do IFN- através dos seus percentuais de células

imunopositivas; TGF-β1P: avaliação do TGF-β1 através dos seus percentuais de células imunopositivas. *Média dos

escores de imunomarcação (E) ou média dos percentuais de células imunopositivas (P); **Teste de Wilcoxon.

58

6 DISCUSSÃO

Vários estudos buscam avaliar a participação de citocinas no processo de patogênese e

desenvolvimento de cistos odontogênicos procurando relacionar seu crescimento, que é

acompanhado pelo processo de reabsorção óssea, a atuação de citocinas inflamatórias que

apresentam atividades osteorreabsortivas. Além disso, muitos deles procuram avaliar também a

ocorrência de citocinas que desempenham um papel reparador do processo destrutivo ocasionado

pela reação inflamatória na região periapical.

Sob esta perspectiva, muitas pesquisas têm utilizado o CR como objeto de investigação

dessas citocinas, uma vez que é bem conhecido seu potencial destrutivo sobre os ossos gnáticos, e

sua redução em tamanho ou mesmo completa regressão algumas vezes ocorrida após tratamentos

endodônticos, sugerem a participação de citocinas que atuem sobre os processos reparadores dos

tecidos periapicais (MORAES et al., 2011; MARÇAL et al., 2010; TEIXEIRA-SALUM et al.,

2010; HREN E IHAN, 2009; FUKADA et al., 2009; HAYASHI et al., 2008; MENEZES et al.,

2006; KUSAFUKA et al., 2006; WALKER et al., 2000; DANIN et al., 2000; TYLER et al.,

1999). Por outro lado, o CD tem sido utilizado apenas em escassos estudos de investigação dessas

citocinas (PIATELLI et al., 2004; LI, BROWNE, MATTHEWS, 1997).

O contínuo fluxo de bactérias e seus produtos a partir de um canal radicular infectado

provoca uma resposta imuno-inflamatória periapical, com a intenção de combater a disseminação

microbiana. Essa resposta promove a síntese de inúmeras citocinas e fatores de crescimento que

provocam a proliferação dos restos epiteliais de Malassez e a formação dos cistos radiculares. Os

eventos imuno-inflamatórios relacionados à proliferação desses restos epiteliais

concomitantemente induzem a secreção de fatores de reabsorção óssea (MORAES et al., 2011;

HREN E IHAN, 2009; MENEZES et al., 2006; WALKER et al., 2000). A reação imuno-

inflamatória nas lesões periapicais como o CR provoca a ativação da resposta imunológica Th1,

caracterizada pela produção de citocinas pró-inflamatórias como IFN-γ, TNF-α, IL-1, IL-2 e IL-

12, e da resposta Th2, caracterizada pela síntese de citocinas anti-inflamatórias como IL-4, IL-5,

IL-6, IL-10 e IL-13. Além dessas citocinas, observa-se também a presença de fatores de

crescimento como o TGF-β. As respostas Th1 e Th2 apresentam atividades opostas entre si, e, no

contexto das lesões periapicais, acredita-se que a resposta imunológica Th1 está relacionada com

a progressão e o processo de reabsorção óssea da lesão, enquanto que a ação imunossupressora

59

do TGF-β e das citocinas Th2 são de grande importância na modulação da resposta imuno-

inflamatória e no processo de reparação do tecido ósseo lesado (STASHENKO et al., 2007;

COLIC et al., 2006; TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; GAZIVODA et al., 2009; WALKER et al.,

2000).

Kawashima e Stashenko (1999), avaliando lesões periapicais induzidas

experimentalmente em ratos, observaram um aumento na expressão das citocinas Th1 (IL-2, IL-

12 e IFN-γ) durante todo o período estabelecido para a avaliação da progressão das lesões,

enquanto que, apesar de ter havido um aumento da expressão das citocinas Th2 (IL-4 e IL-10),

durante os últimos dias houve uma queda dessa expressão, o que levou os autores a conclusão de

que a resposta imunológica Th1 deve predominar durante o processo de crescimento e reabsorção

óssea nas lesões periapicais. Por sua vez, Teixeira-Salum et al. (2010), avaliando os níveis de

IFN-γ, TNF-α, IL-4 e TGF-β em cistos radiculares e granulomas periapicais, observaram que os

cistos apresentaram maiores níveis de IFN-γ, TNF-α e IL-4, enquanto que os granulomas

expressaram mais TGF-β. Eles concluíram que os cistos radiculares apresentaram reações

imunológicas Th1 e Th2 que se modulam reciprocamente (pois as lesões positivas para IL-4 eram

negativas para IFN-γ e TNF-α), e que os granulomas, devido ao seu alto nível de TGF-β,

consistiam em um ambiente com atividades regulatórias (reparadoras). Além disso, eles

sugeriram um papel osteorreabsortivo para o IFN-γ e TNF-α nessas lesões. Gazivoda et al.

(2009), em um experimento in vitro, adicionaram IL-10 e TGF-β a culturas de células

inflamatórias de lesões periapicais e avaliaram a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Eles

mostraram que tanto o IL-10 como TGF-β foram capazes de inibir a produção de IL-1, TNF-α e

IL-8, porém o TGF-β foi o que apresentou maior poder imunossupressor. Walker et al. (2000),

investigando a expressão de citocinas pró e anti-inflamatória em cistos e granulomas periapicais,

observaram que as células que expressavam IL-4 e IL-6 eram muito mais numerosas do que as

que expressavam IL-2 ou IFN-γ. Eles encontraram, portanto, um maior número de células Th2

nas lesões estudadas e sugeriram que a presença de mecanismos anti-inflamatórios deva ser

crucial para a resolução dessas lesões após a realização de tratamentos apropriados.

Muitos estudos têm relacionado o IFN-γ, que é a principal citocina produzida nas

respostas imunológicas Th1, ao processo de reabsorção óssea nas lesões periapicais inflamatórias,

enquanto que muitos outros têm associado o TGF-β1 a mecanismos imunorregulatórios de

inibição da resposta Th1 e a processos de reparação das lesões periapicais (TEIXEIRA-SALUM

60

et al., 2010; STASHENKO et al., 2007; GAO et al., 2007; DANIN et al., 2000; TYLER et al.,

1999). Portanto, sugere-se que a presença dessas duas citocinas em cistos odontogênicos indicaria

a ocorrência de processos tanto favoráveis como desfavoráveis ao crescimento cístico, a saber, as

ações osteorreabsortivas do IFN-γ, que seriam contrabalanceadas pela atuação osteoprotetora do

TGF-β1, atuando na modulação da intensidade da reação inflamatória e nos processos de

reparação da destruição óssea.

Apesar da vasta quantidade de estudos feitos a respeito do papel do IFN-γ no metabolismo

ósseo, os resultados ainda são controversos, uma vez que em muitos trabalhos essa citocina tem

revelado um papel inibidor da reabsorção óssea, enquanto que em outros ela tem mostrado um

comportamento osteorreabsortivo. A ação inibitória do IFN-γ tem sido relacionada por muitos

autores ao fato dele induzir a rápida degradação da TRAF6 nas células precursoras de

osteoclastos, resultando em forte inibição das vias de sinalização NF-κB e JNK, essenciais para a

síntese de genes da diferenciação osteoclástica (TAKAYANAGI, KIM, TANIGUCHI, 2002). De

fato muitos trabalhos têm associado o IFN-γ a uma ação anti-osteoclastogênica (Ji et al., 2009;

MERMUT et al., 2007; HUANG, O’KEEFE, SCHWARZ, 2003), porém muitas investigações

têm atribuído a ele um potencial osteorreabsortivo em várias doenças inflamatórias. Kotake et al.

(2005), aventando a hipótese de que células T produtoras de IFN-γ inibiriam a osteoclastogênese,

cultivaram células T IFN-γ+

juntamente com monócitos precursores de osteoclastos oriundos de

uma lesão inflamatória (artritre reumatóide). Eles observaram a diferenciação osteoclástica dos

monócitos, assim como uma expressão aumentada de RANKL pelas células T IFN-γ+

, e

concluíram que, ao contrário do que esperavam, as células T produtoras de IFN-γ induziram a

osteoclastogênese através da expressão de RANKL. Teng et al. (2005) em seus experimentos,

propuseram que o IFN-γ modularia positivamente a osteoclastogênese mediada por RANKL

durante a progressão da doença periodontal induzida por A. actinomycetemcomitans em ratos e

humanos. Eles observaram em todos os seus experimentos que houve uma expressão simultânea

de IFN-γ e RANKL nas células T reativas ao microorganismo e sugeriram que a

osteoclastogênese mediada pelo RANKL é modulada positivamente pelo IFN-γ. Por sua vez, Gao

et al. (2007), investigando, em experimentos in vivo utilizando roedores, as ações contraditórias

do IFN-γ sobre o tecido ósseo, constataram que ele apresenta o potencial tanto de inibir

diretamente a diferenciação osteoclástica, por meio de uma atuação direta sobre as células

precursoras de osteoclastos (através da degradação da TRAF6), como de promover a

61

osteoclastogênese indiretamente, através da estimulação da apresentação de antígenos pelos

macrófagos e consequente ativação de linfócitos T para produzirem os fatores osteoclastogênicos

RANKL e TNF-α, uma vez que o IFN- γ é o indutor fisiológico do MHC classe II nas células

apresentadoras de antígeno. Eles concluíram que o efeito final do IFN-γ sobre o tecido ósseo se

deve ao desequilíbrio entre suas ações osteoprotetora e osteorreabsortiva, que, sob condições

inflamatórias e infecciosas, é favorável a reabsorção óssea. Portanto, pode-se inferir que o

RANKL produzido nesses estudos seria o responsável pela diferenciação osteoclástica observada,

e não o IFN-γ por si só, uma vez que, segundo Huang, O’Keefe e Schwarz (2003), quando o

RANKL atua sobre as células precursoras de osteoclastos, as torna resistentes ao efeito inibitório

do IFN-γ, por induzir diferenciação terminal dessas células em osteoclastos. Além disso, sabe-se

que o IFN-γ é um potente estimulador de macrófagos na secreção de IL-1 e TNF-α, duas

citocinas relacionadas com a destruição óssea periapical (GAZIVODA et al., 2009).

Diante do exposto, pode-se inferir que a presença do IFN-γ nos cistos odontogênicos

sugere uma ação osteorreabsortiva dessa citocina, fundamental para o processo de crescimento

desses cistos. Vários estudos têm observado sua ocorrência em CR, porém nenhum estudo que

relatasse sua expressão em CD foi encontrado durante a revisão de literatura deste trabalho. Essa

diferença na produção científica sobre o IFN-γ nesses dois cistos talvez se deva a diferença entre

as naturezas dos mesmos, que tornaria a investigação dessa citocina pró-inflamatória mais

atraente no cisto de natureza inflamatória, ou seja, o CR. Contudo, o fato de que os CD possuem

um potencial de crescimento, e que muitos estão relacionados a processos inflamatórios, sugere a

participação dessa citocina em seu processo de expansão, o que fundamenta a investigação do

IFN-γ nos CD.

Com relação a imunomarcação do IFN-γ neste trabalho, as células marcadas foram

principalmente células epiteliais e células inflamatórias como linfócitos, plasmócitos, neutrófilos

e células de linhagem monocítico-macrofágica, além de fibroblastos e células endoteliais (Figuras

5, 7, 9 e 11). Os trabalhos na literatura relatam principalmente linfócitos, macrófagos e

fibroblastos (KOGA, DUAN, FURUE, 2002; WALKER et al., 2000; HREN E IHAN, 2009). Foi

observado ainda um padrão de imunomarcação da matriz extra-celular, o que corrobora com o

trabalho de Koga, Duan, Furue (2002).

Os resultados deste trabalho mostraram não haver diferença estatisticamente significativa

da imunoexpressão do IFN-γ entre os CR e CD, tanto entre seus epitélios como entre suas

62

cápsulas, o que sugere que ambos os grupos de lesões neste trabalho possuem o mesmo potencial

osteolítico associado a essa citocina (Tabelas 6 e 7). O fato de não ter sido encontrado nenhum

trabalho que relatasse a expressão do IFN-γ em cistos dentígeros impossibilitou a comparação

desse achado, entre essas duas lesões, com algum outro trabalho parecido. No entanto, alguns

trabalhos na literatura comparam a expressão do IFN-γ entre cistos e granulomas periapicais.

Dentre estes, tem-se Fukada et al. (2009) que observaram que a expressão de IFN-γ foi

semelhante entre cistos radiculares e granulomas periapicais; Teixeira-Salum et al. (2010) que

mostraram prevalência de IFN-γ em cistos radiculares em relação a granulomas periapicais; e

Ihan Hren e Ihan (2009), que, comparando a resposta inflamatória de cistos radiculares com a de

granulomas periapicais (GP) ocasionados por Streptococcus (GP-S) ou por bactérias anaeróbias

(GP-A), observaram que a produção de IFN-γ em cistos radiculares é maior que em GP-S, mas é

semelhante a de GP-A. Todos esses trabalhos associaram o IFN- γ ao seu poder osteolítico nas

lesões.

Da mesma forma que para o IFN-γ, os estudos feitos sobre as ações do TGF-β1 sobre o

metabolismo ósseo têm mostrado resultados controversos. Muitos autores têm atribuído a esse

fator de crescimento um efeito favorável a osteoblastogênese, e, portanto, indutor da formação

óssea (TACHI et al., 2011; ZHOU, 2011; SMITH et al., 2011; RIPAMONT, RODEN, 2010),

porém outros têm associado a ele um papel na osteoclastogênese e, portanto, um potencial

osteolítico (YASUI et al., 2011; KAWAKATSU et al., 2010; MCGOWAN et al., 2003; FULLER

et al., 2000). Porém, apesar desses achados conflitantes, tem sido constatada uma alta expressão

de TGF-β1 durante a cicatrização de fraturas ósseas, o que sugere a sua participação no processo

de reparo ósseo (SARAHRUDI et al., 2011; JANSSENS et al., 2005; CHO, GERSTENFELD,

EINHORN, 2002). Janssens et al. (2005), em uma vasta revisão de literatura sobre o TGF-β1,

analisaram 39 pesquisas que investigaram a ação dessa citocina sobre o tecido ósseo, e

constataram que a maioria desses trabalhos concluíram que o TGF-β1 promove a cicatrização de

fraturas ósseas e formação de osso in vivo. Eles relataram que o TGF-β1 é um fator de

crescimento que pode ser considerado para uso como um agente osteogênico no reparo de

fraturas ósseas ou na reversão da excessiva reabsorção óssea vista na osteoporose.

Apesar de não se ter encontrado nenhum trabalho que investigasse a ação osteogênica do

TGF-β1 em cistos odontogênicos, sugere-se que, de alguma forma, essa ação do TGF-β1 poderia

também estar operante durante o processo de expansão desses cistos. No entanto, ele tem sido

63

implicado no processo de reparo da perda óssea em cistos e granulomas periapicais, e sua

importância nesse processo talvez se deva principalmente a sua atividade anti-inflamatória e

imunorreguladora, que suprime a resposta imunológica Th1, além de outras ações como indução

da angiogênese e síntese de componentes da matriz extra-celular como colágeno I e fibronectina.

Somado a isso, alguns estudos têm sugerido que a reabsorção óssea é inibida na presença do

TGF-β1 (TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; PIATTELLI et al., 2004; DANIN et al., 2000;

TYLER et al., 1999). Portanto, a presença do TGF-β1 nos cistos odontogênicos supõe um

mecanismo compensatório através do qual a resposta inflamatória atua na reparação e

remodelação do osso lesado (TEIXEIRA-SALUM et al., 2010; TYLER et al., 1999).

Quanto as células imunomarcadas pelo TGF-β1, este trabalho mostrou positividade de

marcação principalmente para células epiteliais e células inflamatórias como linfócitos,

plasmócitos, neutrófilos e células da linhagem monocítico-macrofágica, além de fibroblastos e

células endoteliais (Figuras 6, 8, 10 e 12), o que corrobora com os achados de outros autores

(DANIN et al., 2000; TYLER et al., 1999; LI, BROWNE, MATTHEWS, 1997). Além disso, foi

observado um padrão de imunomarcação da matriz extra-celular (Figura 10), o que também foi

observados em outros trabalhos (TYLER et al., 1999; LI, BROWNE, MATTHEWS, 1997).

De acordo com os resultados obtidos, não houve diferença estatisticamente significativa

da imunoexpressão do TGF-β1 entre os CR e CD, tanto entre seus epitélios como entre suas

cápsulas (Tabelas 6 e 7). No entanto, o teste estatístico revelou um p=0,056 quando da

comparação dos percentuais de células imunopositivas para TGF-β1 entre as cápsulas dos CR e

CD, que, por ser um valor muito próximo ao do nível de significância adotado por este trabalho

(5%), pôde ser considerado como suficiente para sugerirmos que há uma tendência de haver

maior expressão de TGF-β1 nas cápsulas dos CD, uma vez que a média dos percentuais de

células imunopositivas do TGF-β1 nas cápsulas desse grupo de cistos (90%) foi maior que a do

grupo dos CR (82%) (Tabela 7). Mesmo não tendo também havido diferença estatisticamente

significativa (p=0,429) quando foram analisados os escores de imunomarcação do TGF-β1 nas

cápsulas dos CR e CD, essa conclusão foi admitida por considerar-se que a análise de dados feita

por meio dos percentuais de células imunopositivas é soberana quando comparada a análise feita

por meio dos escores, uma vez que esta última possui menor riqueza de informação (Tabela 7).

Tyler et al. (1999) encontraram TGF-β1 em cistos e granulomas periapicais e atribuíram a

ele um papel no processo de reparo da destruição periapical nas duas lesões. Por sua vez, Piattelli

64

et al. (2004) observaram maior expressão de TGF-β1 em ceratocistos odontogênicos do que em

CR e CD, e associaram esse fato ao maior potencial de crescimento dos ceratocistos através da

intensa proliferação celular, que seria regulada pelo TGF-β1.

Ainda de acordo com os resultados, não houve diferença estatisticamente significativa

entre as imunoexpressões do IFN-γ e do TGF-β1 nem no epitélio nem na cápsula dos CR, o que

sugere que a ação inflamatória e osteolítica do IFN-γ é contrabalanceada em igual proporção pela

ação anti-inflamatória e reparadora do TGF-β1 neste grupo de lesões (Tabelas 8 e 9). Isto

implicaria dizer que ocorre um estado de equilíbrio entre as “forças” osteorreabsortiva e

osteoprotetora exercidas pelo CR (referentes a essas duas citocinas) no osso que o circunda, de

maneira que a influência dessas citocinas sobre o crescimento ou a diminuição da lesão se

encontraria a mercê da sobreposição de uma das forças sobre a outra.

Por sua vez, apesar de não ter havido diferença estatisticamente significativa entre as

imunoexpressões do IFN-γ e do TGF-β1 no epitélio dos CD, essa diferença ocorreu na cápsula

dessas lesões, o que foi verificado tanto por meio da análise dos escores de imunomarcação

(p=0,018), como pela análise dos percentuais de células imunopositivas (p=0,001) (Tabelas 8 e

9). Ao verificarmos as médias dos escores de imunomarcação e as dos percentuais de células

imunopositivas dos dois biomarcadores nas cápsulas dos CD, vemos que ambas as médias do

TGF-β1 são maiores que as do IFN-γ (Tabela 9). Esses resultados sugerem que os mecanismos

anti-inflamatórios, imunorreguladores e reparadores do TGF-β1 estão predominando sobre as

ações inflamatórias e osteolíticas do IFN-γ no grupo dos CD. Supõe-se com isto, que o grupo dos

CD apresenta um maior potencial reparador, relacionado ao TGF-β1, do que o grupo dos CR.

Teixeira-Salum et al. (2010), avaliando os níveis de IFN-γ, TNF-α, IL-4 e TGF-β em

cistos radiculares e granulomas periapicais, observaram que os cistos apresentaram maiores

níveis de IFN-γ, TNF-α e IL-4, enquanto que os granulomas expressaram maiores níveis de TGF-

β e menores de citocinas pró-inflamatórias. Eles concluíram que os cistos radiculares

apresentaram reações imunológicas Th1 e Th2 que se modulam reciprocamente (pois as lesões

positivas para IL-4 eram negativas para IFN-γ e TNF-α), e que os granulomas, devido ao seu alto

nível de TGF-β, consistiam em um ambiente com atividades regulatórias. Com isso, eles

atribuíram um maior potencial reparador aos granulomas.

Diante dos resultados encontrados neste trabalho, pode-se concluir que tanto os CR como

os CD apresentam expressão das citocinas IFN-γ e TGF-β1, o que sugere a participação dessas

65

proteínas no processo de expansão destes dois tipos de cisto odontogênico. Além disso, pode-se

inferir ainda que o fato do grupo dos CD terem apresentado a tendência de exibir maior expressão

de TGF-β1 nas suas cápsulas, quando comparado ao grupo dos CR, somado ao fato de que a

expressão dessa citocina foi maior do que a do IFN-γ na cápsula dos CD, não havendo diferença

entre as expressões do IFN-γ e TGF-β1 no grupo dos CR, sugerem a predominância de

mecanismos imunorreguladores e reparadores no grupo dos CD quando comparado ao grupo dos

CR.

66

7 CONCLUSÕES

Diante dos resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que:

1. Não houve diferença estatisticamente significativa da imunoexpressão do IFN- e do

TGF-β1 entre os cistos dentígeros e radiculares, considerando-se os epitélios e as cápsulas

das referidas lesões;

2. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN- e

do TGF-β1 nos epitélios e nas cápsulas dos cistos radiculares;

3. Não houve diferença estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN- e

do TGF-β1 nos epitélios dos cistos dentígeros, no entanto, houve diferença

estatisticamente significativa entre as imunoexpressões do IFN- e do TGF-β1 nas

cápsulas dos cistos dentígeros, sendo o TGF-β1 o que apresentou a maior

imunoexpressão.

67

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73

APÊNDICES

APÊNDICE A

FICHA CLÍNICA

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Ciências da Saúde

Departamento de Odontologia

Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral

Projeto de Pesquisa:

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS IFN- E TGF-

β1 EM CISTOS RADICULARES E CISTOS DENTÍGEROS

Nome do paciente: _______________________________________ Tel.:____________

Biópsia:_________

Idade:__________ Sexo: ( ) 1- masc. Cor da pele: ( ) 1 - leucoderma

2 – fem. 2 - feoderma

9 – não informado 3 - melanoderma

9 – não informado

Localização da lesão: ( )

1- Maxila anterior; 2 – maxila posterior; 3 – mandíbula anterior; 4- mandíbula posterior; 9-

não informado

Sintomatologia: ( ) 1 – sintomático 2 – assintomático 9 – não informado

Diagnóstico histopatológico: ( ) 1- cisto radicular 2 - cisto dentígero.

Observações:___________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

74

APÊNDICE B

Ficha de avaliação dos escores de imunomarcação da expressão imuno-histoquímica de IFN- e TGF-β1

no epitélio dos CR e CD.

LESÃO CR CD

CASO IFN- TGF-β1 IFN- TGF-β1

1 3 3 3 3

2 3 3 3 3

3 3 3 3 3

4 3 3 3 3

5 2 1 3 3

6 3 3 3 3

7 3 3 2 2

8 3 3 3 3

9 3 3 3 3

10 3 3 3 3

11 3 2 3 3

12 3 2 3 2

13 3 3 2 3

14 2 2 2 3

15 3 3 3 3

16 3 2 1 1

17 3 3 3 3

18 2 3 2 3

19 3 3 3 3

20 3 3 3 3

Escore de imunomarcação

0 - ≤ 10% de células imunomarcadas

1 – 11 a 25%

2 – 26 a 75%

3 - >75%

75

APÊNDICE C

Ficha de avaliação da expressão imuno-histoquímica de IFN-γ na cápsula dos cistos radiculares

CASOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P E

+ - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

4347 19 0 4 5 7 4 10 4 6 1 2 1 11 3 21 5 6 2 5 1 78% 3

4404 32 10 44 9 28 6 54 5 34 6 45 6 53 7 31 8 12 2 21 9 84% 3

4431 11 11 8 10 2 1 3 1 11 6 4 3 9 4 10 4 23 10 14 9 62% 2

4559 26 12 21 5 28 10 47 17 26 14 38 10 27 8 28 8 33 13 31 15 73% 2

4571 86 21 76 19 29 18 37 28 120 30 62 20 82 18 78 17 77 20 72 28 77% 3

4713 22 0 50 2 34 5 19 3 23 6 25 0 43 4 65 6 51 3 38 4 92% 3

4717 24 26 35 5 43 38 14 13 51 16 36 28 29 162 37 30 35 14 38 10 50% 2

4763 29 6 16 1 28 2 14 3 19 3 12 1 13 3 23 5 10 1 17 10 84% 3

4770 57 9 29 1 64 11 65 15 53 7 39 9 38 13 66 10 48 7 53 3 86% 3

4888 41 2 46 5 24 3 20 5 14 6 22 8 19 10 39 16 30 10 28 8 79% 3

4915 57 1 39 1 61 2 58 12 50 6 40 6 34 5 37 6 59 2 66 4 92% 3

4926 39 9 35 2 28 3 25 0 22 4 28 2 32 2 30 2 20 2 20 1 91% 3

4982 12 2 14 0 25 2 11 0 16 0 6 2 8 0 10 2 14 2 19 2 92% 3

5019 24 72 20 93 33 100 32 27 32 100 24 18 20 22 32 21 31 14 18 4 36% 2

5170 76 2 105 16 62 16 41 3 46 9 26 11 67 13 73 9 64 2 126 40 85% 3

5225 52 3 31 5 57 5 45 2 43 3 53 4 25 2 21 2 27 3 31 2 93% 3

5305 29 2 21 4 38 7 36 4 16 2 29 3 74 2 36 1 2 1 31 4 91% 3

9898 23 17 11 11 20 11 23 20 15 12 13 4 8 0 7 4 11 3 45 11 65% 2

9961 33 1 16 5 13 3 9 1 9 2 7 2 7 3 9 2 14 0 9 3 85% 3

10882 35 4 46 4 34 1 37 2 27 3 35 2 26 1 53 2 25 3 28 6 93% 3

(+) número de células imunomarcadas; (-) número de células não imunomarcadas; (P) percentual de células imunomarcadas; (E) escore de imunomarcação.

76

APÊNDICE D

Ficha de avaliação da expressão imuno-histoquímica de TGF-β1 na cápsula dos cistos radiculares

CASOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P E

+ - + - + - + - + - + - + - + - + - + -

4347 14 8 16 5 14 1 5 0 26 0 16 1 8 3 25 1 12 1 11 1 88% 3

4404 29 3 57 2 26 7 31 1 23 0 53 3 48 6 27 2 45 11 48 7 90% 3

4431 16 6 37 6 18 1 20 4 26 9 23 8 25 8 27 9 21 4 52 13 80% 3

4559 36 3 62 5 32 3 23 3 41 4 35 4 50 5 45 4 35 6 41 4 91% 3

4571 54 10 55 8 60 18 33 21 45 40 28 35 22 17 69 22 44 72 32 37 61% 2

4713 17 7 16 11 20 12 18 9 20 14 34 16 42 30 20 8 35 17 25 10 65% 2

4717 61 1 70 3 57 3 56 0 74 6 48 2 75 7 76 15 60 10 66 4 93% 3

4763 26 0 32 3 45 1 31 1 10 0 27 4 22 1 26 0 20 0 42 1 96% 3

4770 48 0 64 0 72 0 60 3 25 3 24 5 40 2 33 3 27 1 32 0 96% 3

4888 44 12 38 12 35 9 24 12 25 10 38 0 39 3 13 1 40 6 43 2 83% 3

4915 21 5 18 7 18 6 68 37 37 4 45 8 88 33 58 12 22 10 29 6 76% 3

4926 36 42 15 35 10 40 14 12 26 65 6 23 10 33 5 14 20 18 10 25 33% 2

4982 16 0 18 1 5 0 8 2 6 0 11 1 8 0 12 0 7 0 19 3 94% 3

5019 42 6 75 32 36 18 32 27 45 28 45 12 48 11 65 15 40 15 27 14 72% 2

5170 87 2 80 2 70 3 66 1 72 1 95 1 111 5 100 5 118 7 115 3 97% 3

5225 18 2 35 2 22 3 45 2 54 5 49 7 47 4 60 3 67 1 60 2 94% 3

5305 21 4 37 7 27 14 28 6 21 8 28 9 31 13 44 16 30 4 22 8 76% 3

9898 35 10 39 12 31 10 37 10 26 6 32 10 27 8 44 13 18 8 39 9 77% 3

9961 20 6 17 5 17 5 26 8 40 7 35 8 23 5 12 3 38 9 10 5 80% 3

10882 50 3 86 2 48 2 56 1 35 5 38 5 48 3 15 0 62 4 60 9 94% 3


77

APÊNDICE E

Ficha de avaliação da expressão imuno-histoquímica de IFN-γ na cápsula dos cistos dentígeros

CASOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P E

+ − + − + − + − + − + − + − + − + − + −

2112 29 1 25 3 30 30 27 2 31 8 37 3 42 8 34 4 37 9 26 4 82% 3

2219 8 1 6 0 12 3 10 1 12 1 12 0 19 2 13 4 10 2 12 0 89% 3

2653 8 2 32 16 13 3 9 1 7 1 6 0 10 2 9 1 12 0 17 7 79% 3

3017 5 0 5 1 13 1 8 2 4 1 7 1 9 1 14 1 11 2 5 1 88% 3

3286 5 0 3 2 5 1 12 2 4 1 5 0 5 1 4 6 9 5 6 2 74% 2

3683 7 4 10 1 6 0 10 4 5 2 6 2 5 0 10 6 11 4 13 4 75% 2

6364 7 4 6 6 1 10 1 6 4 7 2 2 2 4 4 6 6 2 7 10 41% 2

6612 30 16 18 6 19 8 42 8 12 1 24 8 5 3 31 8 27 8 40 10 77% 3

6644 66 3 43 2 58 1 46 1 49 5 62 2 67 2 51 5 50 6 38 2 95% 3

6645 50 2 30 3 24 8 30 4 35 6 40 7 33 5 25 4 26 6 27 2 87% 3

6701 35 3 34 2 45 3 45 3 28 5 41 9 35 1 35 1 32 1 26 5 92% 3

7354 8 0 3 1 3 0 3 0 8 2 6 2 8 1 12 2 13 0 12 1 89% 3

7819 35 27 45 30 41 10 41 5 49 18 52 12 40 16 34 14 48 8 55 10 75% 2

8260 14 13 20 17 22 3 15 2 15 0 10 2 11 1 13 1 17 4 11 3 76% 3

8435 20 18 20 14 4 8 10 13 11 9 8 6 19 13 18 10 6 3 12 6 56% 2

2855 12 6 11 6 14 11 22 11 11 11 16 10 8 8 12 5 17 3 10 1 65% 2

9141 73 5 92 2 80 4 52 4 50 8 62 3 70 2 50 3 48 3 42 1 95% 3

9437 13 6 11 11 17 12 11 9 6 19 6 17 10 16 9 9 10 8 16 7 49% 2

9918 25 5 11 3 30 6 12 4 8 4 22 5 30 10 40 11 35 15 32 25 74% 2

10075 12 5 11 5 4 4 12 5 6 2 12 1 20 1 33 1 22 1 18 3 84% 3


78

APÊNDICE F

Ficha de avaliação da expressão imuno-histoquímica de TGF-β1 na cápsula dos cistos dentígeros

CASOS

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 P E

+ − + − + − + − + − + − + − + − + − + −

2112 40 1 22 0 25 1 19 1 15 1 17 1 17 1 31 1 21 1 21 1 96% 3

2219 12 0 10 0 11 1 14 0 11 1 10 0 15 3 15 1 9 0 10 1 94% 3

2653 4 0 5 1 7 0 16 3 15 1 18 4 16 4 20 6 13 1 10 3 84% 3

3017 6 1 11 1 16 2 10 0 10 1 13 2 13 1 18 2 11 0 18 4 90% 3

3286 9 1 8 0 13 1 7 0 11 1 8 1 9 0 17 1 7 0 8 0 95% 3

3683 10 1 8 0 15 2 4 0 13 1 5 0 10 1 10 1 18 1 9 1 93% 3

6364 7 7 16 3 3 4 5 2 7 6 4 2 4 4 5 0 5 3 10 5 65% 2

6612 69 4 34 3 58 2 58 4 60 3 56 5 40 1 59 2 61 8 21 2 94% 3

6644 37 0 25 1 38 0 21 0 22 0 31 2 26 0 33 0 35 0 50 0 99% 3

6645 14 2 67 6 60 6 57 1 40 4 36 3 33 2 30 2 40 2 45 2 93% 3

6701 29 0 20 0 61 0 54 1 64 0 52 0 53 0 55 0 43 1 50 0 100% 3

7354 6 1 8 2 3 3 10 3 7 1 6 0 12 1 4 3 11 2 12 3 81% 3

7819 53 0 48 1 71 0 52 2 79 1 66 2 63 0 58 1 58 2 80 1 98% 3

8260 13 2 23 7 14 7 15 7 28 3 39 7 40 10 20 8 35 3 26 3 82% 3

8435 10 0 12 0 5 0 5 1 4 0 8 0 23 5 13 0 15 3 32 4 91% 3

2855 9 1 15 1 12 0 9 0 4 0 9 1 6 2 8 2 6 0 5 1 91% 3

9141 23 1 15 3 20 1 30 3 32 3 39 1 16 6 23 2 20 2 36 3 91% 3

9437 18 2 14 1 20 3 15 2 22 2 25 2 31 2 26 2 30 2 44 0 93% 3

9918 7 0 3 0 10 3 44 7 11 1 13 2 9 2 18 3 22 2 16 1 88% 3

10075 13 1 12 1 31 4 29 4 22 3 28 3 34 4 30 6 26 9 4 1 86% 3


79

APÊNDICE G


CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE



TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Este é um convite para você participar da pesquisa “Expressão imuno-histoquímica das

proteínas IFN- e TGF-β1 em Cistos Radiculares e Cistos Dentígeros” que é coordenada pelo

Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa. Sua participação é voluntária, o que significa que você

poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga nenhum

prejuízo ou penalidade.

Esta pesquisa procura estudar o processo de reabsorção do osso que ocorre devido a lesão

apresentada por você e diagnosticada como tal. Caso decida aceitar o convite, a lesão removida

por indicação cirúrgica será utilizada para a confecção de lâminas para o estudo, não havendo

qualquer prejuízo para você e objetivando, no futuro, uma melhora nos tratamentos empregados

até o momento para este tipo de lesão.

Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em nenhum

momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos resultados será feita de

forma a não identificar os voluntários.

Se você tiver qualquer gasto financeiro devido a sua participação nesta pesquisa, você será

ressarcido, caso solicite. Em qualquer momento, se você sofrer algum dano comprovadamente

decorrente desta pesquisa, você terá direito à indenização.

Você ficará com uma cópia deste Termo e, qualquer dúvida que você tiver a respeito desta

pesquisa, poderá perguntar diretamente ao Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa, na Faculdade de

Odontologia (em frente ao Nordestão da Av. Salgado Filho) na disciplina de Patologia Oral, ou

pelo telefone (84)3215-4108.

80


CENTRO DE CIENCIAS DA SAÚDE



TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Consentimento Livre e Esclarecido

Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e

benefícios envolvidos, e concordo em participar voluntariamente da pesquisa.

_________________________________ ______________________________

Nome do Voluntário Assinatura do voluntário

___________________________________________

Prof. Dr. Antonio de Lisboa Lopes Costa

81

ANEXO

Documento de aprovação do projeto de pesquisa pelo Comitê de Ética em pesquisa da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS PROTEÍNAS IFN- E … · PEDRO CARLOS DA ROCHA NETO ......

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