RUOLO DEI MICRORGANISMI NELLA PRODUZIONE DI BIOCOMBUSTIBILI

PAOLA QUATRINI

LABORATORIO DI MICROBIOLOGIA MOLECOLARE ED APPLICATA DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPO

DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA CELLULARE E DELLO SVILUPPOUNIVERSITA’ DI PALERMO

a. bacteria b. fungi: yeasts and molds

e. virusesd. protozoac. algae

COSA SONO I MICRORGANISMI

1 μm

Cellula procariotica Cellula eucariotica

L’ALBERO DELLA VITA

MONERA

PROTISTAFUNGIPLANTAEANIMALIA

MONERA

NONSOLOPATOGENI

NONSOLOPATOGENI

PROPRIETÀ CATABOLICHE DEI MICRORGANISMI“bioremediation”

Menu

Idrocarburi (n-alcani)Idrocarburi (aromatici e poliaromatici)Esplosivi (Trinitrotoluene TNT)Bifenili policloruratiorganocloruratiPesticidi (organofosfati)Erbicidi (atrazina)Alcaloidi (nicotina)

DIVERSITA’ METABOLICA DEI MICRORGANISMI

O2

RESPIRAZIONE AEROBIA

CO2, H2O, BIOMASSA, ENERGIA

O2

FERMENTAZIONI

ACIDI ORGANICIETANOLOH2

RESPIRAZIONE ANAEROBIA

NO3SO4CO2

N2H2SCH4

ATP

METABOLISMO ENERGETICO

METABOLISMO ANAEROBIO: FERMETAZIONE ALCOLICA

La fermentazione alcolica

Alcol deidrogenasi

Funghi unicellulari che si riproducono principalmente per via vegetativa (gemmazione o fissione)

Basidiomiceti, Ascomiceti e Deuteromiceti

Metabolismo: Aerobi obbligati o anaerobi facoltativiOsmofili e alofili. Su frutti e vegetali.

Agenti della fermentazione alcolica (vino, birra pane).

Eucarioti modello

AGENTI DELLA FERMENTAZIONE ALCOLICA:I LIEVITI

Saccharomyces cerevisiae

CONVERSIONE DELLE BIOMASSE IN BIOCARBURANTI

• Fattori geopolitici• Ambiente• tecnologie

PRODUZIONE DI ETANOLO DA AMIDO DI MAIS

• Tecnologia matura

• Efficienza (amilasi a basso pH, attive su amido grezzo e crudo)

Saccharomycesα-amylasi

AMIDO saccarificazione GLUCOSIO fermentazione ETANOLO

OCCORRONO ALTRE BIOMASSE

• L’incremento nella produzione di etanolo (che non competa con l’alimentazione umana ed animale) può derivare solo dall’uso di altri substrati

• Tali substrati alternativi sono definiti “biomasse” ed includono residui dell’agricoltura, legno, rifiuti solidi urbani e colture dedicate

• …E DOBBIAMO LIBERARCI DEI RIFIUTI!

BIOETANOLO DA BIOMASSE LIGNOCELLULOSICHE

Più equa distribuzione geografica delle risorse. Risorse domestiche

Il materiale lignocellulosico non compete con le risorse alimentari, costa meno e richiede minori input energetici e fertilizzanti/pesticidi

Basso effetto serra

Impiego in aree rurali

Hahn-Hagerdal et al., Trends Biotech. 2006

Key global biomass resources from agricultural residues, wood, and herbaceousenergy crops.

BIOMASSE

ToxicityTerpenesPhenolics

Monomeric5Extractives

MatrixPhenyl-propane

Amorphous15-25Lignin

MatrixGalactoseMannoseXylose

Semi-crystalline

20-35Hemicellulose& pectin

MicrofibreGlucoseCrystalline40-50Cellulose

FunctionsMade ofState% w/w approxComponent

COMPOSIZIONE DEL LEGNO

LIGNINA etropolimero degli

alcol del fenilpropano(sinapyl, coumaryl,

coniferyl)

CELLULOSAPoPolimero cristallino del

glucosio

EMICELLULOSE E PECTINEPolimeri di galattosio, pentosi (xilosio e mannosio)e altre molecole

G, galactose A, arabinose; FeA, ferulic acid;; Glc, glucuronic acid; X, xylose

STRUTTURA DELLE PRINCIPALI MOLECOLE

overall conversion process of an energy crop to ethanol

SCHEMA DI PROCESSO DI UNA BIORAFFINERIA

GRAY ET AL.2006

Resa in zuccheri ed etanolo di materiale lignocellulosico di abete pre-trattato con vapore . EH, resa in zucchero dopo idrolisi enzimaticaSSF, resa in etanolo dopo saccarificazione e fermentazione simultanea;

INTEGRAZIONE DEI PROCESSI

ATTACCO ENZIMATICODEI POLIMERI LIGNO-CELLULOSICI

. White = glucose, green = xylose, yellow = glucuronic acid, red = arabinose,.

Acetate groups are shown as triangles, phenolic groups as diagonals, and methylgroups as rombs.

CELLULOSA

XILANO

ENDOGLUCANASI: taglio casuale del legame Β-1,4 glicosidico interno alla molecolaEXOGLUCANASI: taglio alle estremità di residui oligosaccaridici corti solubili (es cellobiosio)Β-GLUCOSIDASI: idrolizzano gli oligosaccaridi a glucosio

PRODUTTORI DI ENZIMI DEGRADATORI

• Representative Cellulase-producing Microorganisms•

Fungi Acremonium cellulolyticus Aspergillus acculeatus Aspergillus nigerAspergillus fumigatusIrpex lacteus Penicillium funmiculosumPhanerochaete Fusarium solaniSchizophyllum communeSclerotium rolfsii Sporotrichum cellulophilum Talaromyces emersoniiThielavia terrestris Trichoderma koningii Trichoderma reesei Trichodermaviride

BacteriaClostridium thermocellum Ruminococcus albus

• (Actinomycetes) Streptomyces sp. Thermoactinomyces Thermomonosporacurvata

PRODUTTORI DI ENZIMI DEGRADATORI

• Fungo (ascomicete) filamentoso cellulosolitico

• Secerne enzimi cellulosolitici(cellobioidrolasi e endoglucanasi) ed emicellulosolitici nel mezzo di coltura.

• Prodotti commerciali• Genoma 7 cromosomi, 33Mb• Geneticamente manipolabile • Vari mutanti termostabili ed efficienti

Tricoderma reesei

Impianti attivi

1. Effciente depolimerizzazione di cellulosa ed emicellulose in zuccheri solubili

2. Efficiente fermentazione dell’idrolizzato composto da esosi e pentosi in presenza di inibitori (es composti fenolici)

3. Riduzione dell’input energetico

4. Utilizzazione della lignina

ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO: QUALI OSTACOLI

Produzione di biomasse

Overview of plant traits that can be targeted by accelerated domesticationfor enhanced plant biomass production and processing

ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO: NUOVE STRATEGIE

• NUOVI CEPPI MICROBICI

• INGEGNERIA GENETICADNA ricombinante

• INGEGNERIA METABOLICAApproccio multidisciplinare. Modifica del metabolismo mediante utilizzazione di tecniche ricombinanti include: inserimento di nuovi pathway, Miglioramento efficienza dei pathway esistenti.

ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO: NUOVE STRATEGIE

• NUOVI CEPPI MICROBICI

• INGEGNERIA GENETICADNA ricombinante

• INGEGNERIA METABOLICAApproccio multidisciplinare. Modifica del metabolismo mediante utilizzazione di tecniche ricombinanti include: inserimento di nuovi pathway, Miglioramento efficienza dei pathway esistenti.

CLOSTRIDIUM

• anaerobio• sporigeno• termofilo (60°c)• Ridotta biomassa• Bilancio energetico• elevata crescita su

cellulosa cristallina• Assimila cellodestrine

(non cellobiosio) mediante sistemi trasporto ABC

Clostridium thermocellum

•sistemi celulosolitici complessi (Cellulosomi)

SCHEMA DI PROCESSO SSFPER LA CONVERSIONE DI BIOMASSE AD ETANOLO

Cellulosomes

. Transmission electron micrographs of Clostridium thermocellum cellsshowing cellulosome aggregates on cell surfaces (indicated byarrows; A), and, at higher magnification, individual cellulosomes of Clostridium papyrosolvens (B). Also shown is a model of C. thermocellum cellulosomes and an associated cell-surface anchoringprotein.

IL CELLULOSOMA DICLOSTRIDIUM

• Cellulosomes are cell protuberanceswhich tightly bind to crystallinecellulose

• They mediate a close neighborhood between cell and substrate and thus minimize diffusion losses of hydrolyticproducts,

• A cellulosome preparation contains a number of different proteins, most of them having enzymatic activity

• This dockerin module bindsspecifically to the cohesin modules, located in a non-catalytic cellulosomecomponent, for which the term"scaffoldin" was coined (cellulosomestructure).

The clostridial coculture process

•The clostridial coculture process in which C. thermocellum serves as the cellulase and hemicellulase producer. The hemicellulose-derived pentosescan be utilized by C. thermosaccharolyticum but not C. thermocellum.

•C. thermosaccharolyticum uses cellobiose faster and is a better ethanolproducer. In addition to cellobiose, cellodextrins are also produced fromcellulose and can be utilized directly.

Demain et al., 2005

ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO: NUOVE STRATEGIE

• NUOVI CEPPI MICROBICI

• INGEGNERIA GENETICADNA ricombinante

• INGEGNERIA METABOLICAApproccio multidisciplinare. Modifica del metabolismo mediante utilizzazione di tecniche ricombinanti include: inserimento di nuovi pathway, Miglioramento efficienza dei pathway esistenti.

Un Gene è una sequenza di DNA che codifica per una proteina, un tRNA o un rRNA

L’INFORMAZIONE GENETICA

DNA ricombinante

Clonaggio di diversiframmenti di DNA

in un vettore

Analisi del gene Espressione eterologa e recupero della proteina

Screening dei cloni ricombinanti

Attività betaglicosidasica

Attività cellobioidrolasica

ETANOLO DA MATERIALE LIGNOCELLULOSICO: NUOVE STRATEGIE

• NUOVI CEPPI MICROBICI

• INGEGNERIA GENETICADNA ricombinante

• INGEGNERIA METABOLICAApproccio multidisciplinare. Modifica del metabolismo mediante utilizzazione di tecniche ricombinanti include: inserimento di nuovi pathway, Miglioramento efficienza dei pathway esistenti.

Either the tail end, as in Escherichia coli and Klebsiella oxytoca, or the front end of metabolism, as for Saccharomyces cerevisiae and Zymomonas mobilis, havebeen engineered. Abbreviation: rec, recombinant.

CEPPI METABOLICAMENTE INGEGNERIZZATI PER L’UTILIZZAZIONE DI PENTOSI

applicazioni

Zymomonas mobilis, a metabolicallyengineered bacteria used for fermenting bothglucose and xylose to ethanol.

Science, February 2007

An 8000-liter fermentation tankused to start the process of turning cellulosic material intoethanol.

FERMENTAZIONE IN CLOSTRIDIUM

• Ethanol, lactate, and acetate fermentationby C. thermocellum.

• 1, enzymes of Embden-Meyerhofpathway;

• 2, lactate dehydrogenase; • 3, pyruvate-ferredoxin oxidoreductase;• 4, acetaldehyde dehydrogenase; • 5, alcohol dehydrogenase; • 6, phosphotransacetylase; • 7, acetate kinase.

STRATEGIE

Lynd et al., Current opinion in Biotechnology 2005CBP: consolidated bioprocessing

Obiettivi della ricerca

• migliorare l’idrolisi enzimatica e ridurre i costi.

• sviluppare microrganismi “robusti” più tolleranti agli inibitori che fermentano tutti gli zuccheri con alte rese in etanolo.

• estendere l’integrazione dei processi riducendo gli steps, ridurre gli input, eliminare l’uso di acqua, riutilizzare gli scarti

Figure 5. Biorefinery – integration of a combined heat and power plant with an ethanol production plant.

metanogenesiLa bioconversione del materiale organico complesso richiede 4 fasi e cinque gruppi fisiologici di microrganismi

a. Idrolisi delle macromolecole a monomeri e fermentazione (m. fermentanti)

b. Ossidazione degli acidi organici a acetato e idrogeno. Acetogenesi (batteri acetogenici)

c. Produzione di acetato da H2 e CO2 (acetogeni e omoacetogeni)

d. Conversione dell’acetato a metano e anidride carbonica (MetanogeniIdrogenotrofi)

e. Metanogenesi (Metanogeni acetoclasti)

La terra: il pianeta dei microrganismi