Deficiencias de la Deficiencias de la ββ--oxidacioxidacióónnmitocondrialmitocondrial: e: estrategias bioquímicas strategias bioquímicas

aplicables al cribado neonatalaplicables al cribado neonatal

Antonia RibesServicio de Bioquímica y Genética

Molecular. Sección de ErroresCongénitos del Metabolismo

Hospital Clínic. CIBERER, Barcelona

Piruvato

ACETIL-CoA

Piruvato

Ciclo deKrebs

FosforilaciónOxidativa

H2OO2

ATPADP

CO2

Triglicéridos Glucógeno Proteinas

Acidos grasos Glucosa Aminoácidos

Succinil-CoA

Cuerpos

cetónicos

Ureagénesis

Gluconeogénesis

Piruvato

ACETIL-CoA

Piruvato

Ciclo deKrebs

FosforilaciónOxidativa

H2OO2

ATPADP

CO2

Triglicéridos Glucógeno Proteinas

Acidos grasos Glucosa Aminoácidos

Succinil-CoA

Cuerpos

cetónicos

Ureagénesis

Gluconeogénesis

Insulina GlucagónCatecolaminas

4 16 32horas 24 días

Exógena

GlucógenoNeoglucogénesis, hepática, renal

Tejidosconsumidores

Todos salvo Hígado, Músculo Tejido Adiposo

Glucosa

Todos

Nutriente cerebral

Cerebro células sanguíneasMédula renal

Glucosa GlucosaC Cetónicos

C CetónicosGlucosa

GHGlucagónCatecolaminasCortisol

Origen de laglucosa

H120.MTGS-10-2007

GLUCOSA AGL

CUERPOS CETÓNICOS

HORAS AYUNO

GLUCOSA AGL

CUERPOS CETÓNICOS

HORAS AYUNO

β-OXIDACION MITOCONDRIAL

Es crítica para proporcionar energía durante ejercicio aeróbico prolongado y durante perÍodos de ayuno.

Corazón, músculo esquelético e hígado son particularmente dependientes de esta vía, pero el cerebro no utiliza directamente los ácidos grasos para el metabolismo oxidativo, sino que utiliza los cuerpos cetónicos producidos por la oxidación de los ácidos grasos en el hígado.

CIC

LO β

-OXI

DA

CIÓ

N

Membrana Plasmática

MembranaMitocondrialExterna

MembranaMitocondrialInterna

CIC

LO C

AR

NIT

INA

Ácidos GrasosCadena Media

Carnitina

OCTN2

Carnitina

CPT-II

Acil-CoA

CACT

Acilcarnitina

Acilcarnitina

Ácidos GrasosCadena Larga

AS

Acil-CoA

CPT-I

Acetil-CoA

Cetogénesis Ciclo de Krebs

VLCADMCADSCADETF/ETFDHLCHADMTPSCHAD

Ureagénesis

Gluconeogénesis

β-OXIDACION MITOCONDRIAL

• 1982 (Gregersen y col. Aarhus University))

• Paciente con hipoglucemia hipocetósica

• Ácidos dicarboxílicos en orina, con normalización clínica y bioquímica después de la administración de glucosa

• Grupo de 16 enfermedades genéticas de herencia autosómica recesiva

• Presenta dificultades en el diagnóstico clínico y bioquímico

• Tratamiento fácil y buen pronóstico

• Alta mortalidad si no se trata

ácido dodecanoico dodecanoil-CoA ácido 11-OH-dodecanoico

ácido sebácico decanoil-CoA ácido 9-OH-decanoico

ácido subérico octanoil-CoA ácido 7-OH-octanoico

ácido adípico hexanoil-CoA ácido 5-OH-hexanoico

Acil-CoA de cadena larga

suberilglicinaoctanoilcarnitina

hexanoilglicina

butiril-CoA

acetil-CoA

oxidación ωmicrosomal

oxidación ω-1microsomal

β-oxidaciónperoxisomal

β-oxidaciónperoxisomal

β-oxidaciónmitocondrial

CIC

LO β

-OXI

DA

CIÓ

N

Membrana Plasmática

MembranaMitocondrialExterna

MembranaMitocondrialInterna

CIC

LO C

AR

NIT

INA

Ácidos GrasosCadena Media

Carnitina

OCTN2

Carnitina

CACTCPT-II

Acil-CoA

Acilcarnitina

Acilcarnitina

Ácidos GrasosCadena Larga

AS

Acil-CoA

CPT-I

Acetil-CoA

Cetogénesis Ciclo de Krebs

VLCADMCADSCADETF/ETFDHLCHADMTPSCHAD

Ureagénesis

Gluconeogénesis

SospechaClínica de

Def. ß-oxidaciónmitocondrial

Orina Plasma /sangre impregnada en papel

Acidos orgánicos y acilglicinas Carnitina, acilcarnitinas, perfil de ácidos grasos libres

ACC: N AG:NC:↓↓↓AGL: N AO: N

Deficiencia transporte de

carnitina

CIC

LO β

-OXI

DA

CIÓ

N

Membrana Plasmática

MembranaMitocondrialExterna

MembranaMitocondrialInterna

CIC

LO C

AR

NIT

INA

Ácidos GrasosCadena Media

Carnitina

OCTN2

Carnitina

CACTCPT-II

Acil-CoA

Acilcarnitina

Acilcarnitina

Ácidos GrasosCadena Larga

AS

Acil-CoA

CPT-I

Acetil-CoA

Cetogénesis Ciclo de Krebs

VLCADMCADSCADETF/ETFDHLCHADMTPSCHAD

Ureagénesis

Gluconeogénesis

SospechaClínica de

Def. ß-oxidaciónmitocondrial

Orina Plasma /sangre impregnada en papel

Acidos orgánicos y acilglicinas Carnitina, acilcarnitinas, perfil de ácidos grasos libres

CPT I

ACC: NAG: N C: ↑AGL: N AO: N

ACC: N AG:NC:↓↓↓AGL: N AO: N

Deficiencia transporte de

carnitina

CIC

LO β

-OXI

DA

CIÓ

N

Membrana Plasmática

MembranaMitocondrialExterna

MembranaMitocondrialInterna

CIC

LO C

AR

NIT

INA

Ácidos GrasosCadena Media

Carnitina

OCTN2

Carnitina

CACTCPT-II

Acil-CoA

Acilcarnitina

Acilcarnitina

Ácidos GrasosCadena Larga

AS

Acil-CoA

CPT-I

Acetil-CoA

Cetogénesis Ciclo de Krebs

VLCADMCADSCADETF/ETFDHLCHADMTPSCHAD

Ureagénesis

Gluconeogénesis

SospechaClínica de

Def. ß-oxidaciónmitocondrial

Orina Plasma /sangre impregnada en papel

Acidos orgánicos y acilglicinas Carnitina, acilcarnitinas, perfil de ácidos grasos libres

CPT II/CACT

ACC: C16, C16:1, C18, C18:1AG: NC:↓AGL: NAO: ±dicarboxilicos

CPT I

ACC: NAG: N C: ↑AGL: N AO: N

ACC: N AG:NC:↓↓↓AGL: N AO: N

Deficiencia transporte de

carnitina

CIC

LO β

-OXI

DA

CIÓ

N

Membrana Plasmática

MembranaMitocondrialExterna

MembranaMitocondrialInterna

CIC

LO C

AR

NIT

INA

Ácidos GrasosCadena Media

Carnitina

OCTN2

Carnitina

CACTCPT-II

Acil-CoA

Acilcarnitina

Acilcarnitina

Ácidos GrasosCadena Larga

AS

Acil-CoA

CPT-I

Acetil-CoA

Cetogénesis Ciclo de Krebs

VLCADMCADSCADETF/ETFDHLCHADMTPSCHAD

Ureagénesis

Gluconeogénesis

SospechaClínica de

Def. ß-oxidaciónmitocondrial

Orina Plasma /sangre impregnada en papel

Acidos orgánicos y acilglicinas Carnitina, acilcarnitinas, perfil de ácidos grasos libres

LCHAD/MTP

ACC:3-OHacilcarnitinasAG: NC:↓AGL: C14:1n-9, 3-OH-ácidosAO: ± 3-OH-dicarboxilicos

VLCAD

ACC: C14:1, C14, C16, C12AG: NC:↓AGL : C14:1n-9AO: ±dicarboxílicos

CPT II/CACT

ACC: C16, C16:1, C18, C18:1AG: NC:↓AGL: NAO: ±dicarboxilicos

CPT I

ACC: NAG: N C: ↑AGL: N AO: N

ACC: N AG:NC:↓↓↓AGL: N AO: N

Deficiencia transporte de

carnitina

SospechaClínica de

Def. ß-oxidaciónmitocondrial

Orina Plasma /sangre impregnada en papel

Acidos orgánicos y acilglicinas Carnitina, acilcarnitinas, perfil de ácidos grasos libres

MADD

ACC: C4 -C16AG: HG, SG, IVG,2-MBG,BGC: ↓AGL: C14:1n-9, C10:1n-6AO: ± dicarboxílicos

MCAD

ACC: C8,C10,C6AG: HG, SGC:↓AG: C10:1n-6AO: ±dicarboxílicos

SCAD

ACC: C4AG: ±C: ±AGL: N AO:etilmalónico

SCHAD

ACC: C4-OHAG: N C: ±AGL: N AO: 3-hidroxiglutáricoHPERINSULINISMO

C16*

C0

C0*

C2 C2*

C3

C3*C4*

C5*

C5C4 C6

C6*

C8

C8*

C10

C10*

C12

C12*

C14

C16

C14*Control

C16*

C0 C0*C2 C3

C3* C4*C5*

C5C4 C6

C6*C8

C8*C10

C10*

C12

C12*

C14 C16

C14*

C2*

CUD

C16*

C0

C0*

C2 C2*

C3

C3*C4*

C5*

C5C4 C6

C6*

C8

C8*

C10

C10*

C12

C12*

C14

C16

C14*Control

CPT IC0

C0*C2*

C3

C3* C4*C5*

C5C4 C6

C6*

C8

C8*

C10

C10*C12

C12*

C14 C16

C14*

C2

C16*

C10* C16

C2*

C3* C4* C6*C5*

C8*C2

C12*

C14*

ControlC16*

C18*

C4* C5* C6*C8*

C10*

C12*

C14

C16

C14*CPT II

C18:1

C18:2

C16*

C10* C16

C2*

C3* C4* C6*C5*

C8*C2

C12*

C14*

ControlC16*

LCHADC16*

C4*C5* C6*

C8*C10*

C12*C14*

C18*

C18: 1-OHC18:1

C16:1C14:1

C16-OHC16

C16*

C0

C0*

C2 C2*

C3

C3*C4*

C5*

C5C4 C6

C6*

C8

C8*

C10

C10*

C12

C12*

C14

C16

C14*

Control

MCAD

C0 C0*

C2*

C3

C3* C4*C5*

C5

C4C6

C6*

C8

C8*

C10

C10*

C12

C12*

C14

C16

C14*

C2

C16*

MCAD

C8/C10 > 2

C16*

C0

C0*

C2 C2*

C3

C3*C4*

C5*

C5C4 C6

C6*

C8

C8*

C10

C10*

C12

C12*

C14

C16

C14*Control

C16*

C0C0*

C2

C3C3*

C4 C4*C5* C6*

C8

C8*

C10

C10*

C12

C12*

C14

C16

C14*

C2*

SCAD

SospechaClínica de

Def. ß-oxidaciónmitocondrial

Orina Plasma /sangre impregnada en papel

acidos orgánicos y acilglicinas carnitina, acilcarnitinas, perfil de ácidos grasos libres

Metabolitos característicos

Estudios de confirmación moleculares o enzimáticos

↓formación H3Oacilcarnitinas anómalas

Def. β-oxidación; def. cadena respiratoria

↓formación H3Oacilcarnitinas normales

def. β-oxidación no descritos def. cadena respiratoria Otras enfermedades

formación H3O normalacilcarnitinas normal

def. β-oxidación improbable

estudios en fibroblastos: oxidación de sustratos marcados con tritio y valoración de agua tritiada; oxidación de sustrados marcados con isótopos estables y análisis de las acilcarnitinas formadas

metabolitos alterados, aunque inespecíficos

metabolitos normales, pero sospecha clínica importante

+ + +

+ +

+

+ + +

+ + e - Deuterio

e -

e -

Hidrógeno

Tritio

ISÓTOPOS DE HIDRÓGENO

Estable

Estable

Radioactivo

Defecto exacto

Via defectuosa

D3C-(CH2)13-CH2-COOH

Ac. palmítico deuterado, (C16)

D3C-(CH2)11-CH2-COOH (C14)

Detección

Acilcarnitinas deuteradas

D3C-(CH2)9-CH2-COOH, (C12)

D3C - COOH, (C2)

CPT IIAcilcarnitinas Paciente con CPT II Controles

D3-C10:1 0,14 0,29 - 0,41

D3-C10 0,14 1,24 - 1,34

D3-C4DC 0,00 0,06 - 0,13

D3-C5DC 0,00 0,17 - 0,30

D3-C12:1 1,86 0,28 - 0,52

D3-C12 10,76 1,28 - 2,44

D3-C6DC 0,34 0,08 - 0,15

D3-C14:2 0,76 0,13 - 0,40

D3-C14:1 0,90 0,29 - 0,57

D3-C14 0,83 0,23 - 0,77

D3-C8DC 0,00 0,04 - 0,08

D3-C14:1-OH 0,00 0,02 - 0,20

D3-C14-OH 0,00 0,10 - 0,30

D3-C16:1 7,45 0,40 - 0,60

D3-C16 46,34 2,68 - 4,96

D3-C10DC 2,07 0,10 - 0,30

D3-C16:1-OH 0,07 0,06 - 0,10

D3-C16-OH 0,14 0,08 - 0,44

D3-C16-DC 0,07 0,02 - 0,14

Acilcarnitinas Paciente con VLCAD Controles

D3-C10:1 0,00 0,29 - 0,41

D3-C10 0,27 1,24 - 1,34

D3-C4DC 0,00 0,06 - 0,13

D3-C5DC 0,00 0,17 - 0,30

D3-C12:1 1,11 0,28 - 0,52

D3-C12 44,3 1,28 - 2,44

D3-C6DC 1,3 0,08 - 0,15

D3-C14:2 0,00 0,13 - 0,40

D3-C14:1 0,23 0,29 - 0,57

D3-C14 3,21 0,23 - 0,77

D3-C8DC 0,16 0,04 - 0,08

D3-C14:1-OH 0,01 0,02 - 0,20

D3-C14-OH 0,01 0,10 - 0,30

D3-C16:1 0,00 0,40 - 0,60

D3-C16 81,9 2,68 - 4,96

D3-C10DC 3,63 0,10 - 0,30

D3-C16:1-OH 0,01 0,06 - 0,10

D3-C16-OH 0,11 0,08 - 0,44

D3-C16-DC 0,00 0,02 - 0,14

VLCAD

LCHAD-MTPAcilcarnitinas Paciente con LCHAD Paciente con MTP controles

D3-C10:1 0,54 0,50 0,29 - 0,41

D3-C10 0,60 1,68 1,24 - 1,34

D3-C4DC 0,07 0,05 0,06 - 0,13

D3-C5DC 0,20 0,46 0,17 - 0,30

D3-C12:1 1,37 0,92 0,28 - 0,52

D3-C12 4,16 3,35 1,28 - 2,44

D3-C6DC 0,13 0,09 0,08 - 0,15

D3-C14:2 0,54 0,17 0,13 - 0,40

D3-C14:1 1,37 1,16 0,29 - 0,57

D3-C14 1,25 0,76 0,23 - 0,77

D3-C8DC 0,09 0 0,04 - 0,08

D3-C14:1-OH 0,41 0 0,02 - 0,20

D3-C14-OH 0,67 0,32 0,10 - 0,30

D3-C16:1 2,42 0,88 0,40 - 0,60

D3-C16 9,27 5,42 2,68 - 4,96

D3-C10DC 0,38 0,20 0,10 - 0,30

D3-C16:1-OH 0,58 0,07 0,06 - 0,10

D3-C16-OH 2,93 0,81 0,08 - 0,44

D3-C16-DC 0,02 0,02 0,02 - 0,14

Acilcarnitinas Paciente con SCAD Controles

D3-C3 0,00 0,04 - 0,15D3-C4 0,87 0,19 - 0,30D3-C5:1 0,12 0,00 - 0,17D3-C5 0,06 0,04 - 0,06D3-C4-OH 0,00 0,06 - 0,15D3-C6 0,25 0,53 - 0,79D3-C5-OH 0,06 0,04 - 0,09D3-C8 0,37 0,61 - 0,68D3-C10:1 0,25 0,29 - 0,41D3-C10 0,62 1,24 - 1,34D3-C12:1 0,31 0,28 - 0,52D3-C12 1,37 1,28 - 2,44D3-C14:2 0,12 0,13 - 0,40D3-C14:1 0,31 0,29 - 0,57D3-C14 0,19 0,23 - 0,77D3-C16:1 0,25 0,40 - 0,60D3-C16 2,05 2,68 - 4,96

SCAD

Acilcarnitinas Paciente con MAD Controles

D3-C4 0,32 0 - 0,08D3-C5 0,01 0 - 0D3-C6 0,61 0,09 - 0,23D3-C8 0,98 0,17 - 0,25D3-C10:1 0,10 0 - 0D3-C10 1,75 0,33 - 0,60D3-C5DC 0,10 0,07 - 0,11D3-C12:1 0,33 0 - 0,16D3-C12 3,57 0,45 - 0,65D3-C14:2 0,03 0 - 0D3-C14:1 0,30 0,02 - 0,08D3-C14 0,67 0,01 - 0,11D3-C14:1-OH 0 0 - 0D3-C16:1 0,42 0,04 - 0,19D3-C16 4,66 1,13 - 1,69D3-C16:1-OH 0 0 - 0D3-C16-DC 0,04 0 – 0

MAD

¿ Diagnóstico precoz para la deficiencia de MCAD?Revisión retrospectiva de 120 casos con deficiencia de MCADIafolla et al. J Pediatr 1994; 124:409 – 415

• 20% fallecieron durante el primer episodio• Sólo un 15% de los pacientes fueron diagnosticados en el 1er episodio• Una vez establecido el diagnóstico y en consecuencia el tratamiento no hubo otras recurrencias•Tratamiento sencillo y eficaz

BS Andresen et al. Am J Hum Genet 68:1408-1418, 2001Estudio molecular en 62 pacientes con deficiencia de MCAD

930.078 rn acilcarnitinas indicativo de MCAD en 62 Frecuencia 1/15.000Previamente Ziadeh et. Al 1995, 1/ 8.930 en una

muestra de 90.000 Por sospecha clínica 1/26.000

Discrepancia: algunos pacientes habrían fallecido, otros asintomáticos

CRIBADO NEONATAL: Pone en evidencia formas leves o formas silentes clínicamente

♣Deficiencia de MCAD:Andresen et al.2001; Am J Hum Genet 68:1408-1418

♣Deficiencia de biotinidasaMöslinger et al. 2003; Eur J Pediatr 162: S46-S49

♣ Deficiencia de 3-metilcrotonil-CoA carboxilasa:Koeberl DD et al. 2003; J Inherit Metab Dis 26:25-35

♣ Acidemia isovalérica:Ensenauer R. et al. 2004; Am.J. Hum.Genet 75:1136-1142

Exones

Dominios

Mutaciones

Pèptido señal

DominioN-terminal(6 α-hélice)

Dominio intermedio(hojas β)

DominioC-terminal(6 α-hélice)

100 pb

343-348 delC91Y

G112RM124IR28C

C219RG242R

M301T955-956 del

K304E999-1000 ins 13S311RR324XY327C1100-1103 delA347TI350TE359X1189-1190 ins T

474 delY133XT168AG170R

121 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

GEN MCAD

Genotipo Fenotipo39 K304E/K304E MS/MS severo7 K304E/Y42H MS/MS leve

11 K304E/ otras MS/MSleve/severo 2 ???? MS/MS leve/severo

BS Andresen et al. Am J Hum Genet 68:1408-1418, 2001MCAD mutations identified by MS/MS-basedprospective screening of newborns differ fromthose observed in patients with clinicalsymptoms: identification andcharacterization of a new, prevalent mutationthat results in mild MCAD deficiency.

MUTACIONES MCAD CRIBADO NEONATAL, SANTIAGO DE COMPOSTELA

GENOTIPO PACIENTESK304E/ K304E 6K304E/ Y42H 1K304E/W57S 1K304E/ ? 2

mutación

alteraciónproteína

enfermedad

MUTACION Y ENFERMEDAD GENETICA

Effect of cellular factors:Quality control/temperature

Effect of missense mutations

Effect of other factors

Residual protein function

Probability of clinical disease

J. Inherit. Metab. Dis (2001) 24:189-212

Mildmutation

Severemutation

High Low

Neutral Severe

Asymptomatic Clinical disease

Threshold for clinical disease