DESARROLLO DE NUEVAS ESTRATEGIAS PARA LA

GENERACIÓN DE CÉLULAS PRODUCTORAS DE INSULINA

A PARTIR DE CÉLULAS SOMÁTICAS Y PLURIPOTENTES

INDUCIDAS

Rosa Gasa Arnaldich

Institut d'Investigació Biomèdica August Pi i Sunyer

Sylvia Bedford

CMRB Centre Medicina Regenerativa de Barcelona

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1. Resumen del proyecto

La pérdida de células β pancreáticas causa la diabetes tipo 1 (DT1). La terapia celular

es una alternativa prometedora a las inyecciones diarias de insulina para el tratamiento

de esta enfermedad. En la actualidad la única fuente de células β son los islotes

pancreáticos procedentes de donantes, pero su disponibilidad es limitada. El desarrollo

de terapias basadas en el uso de células madre, embrionarias e inducidas (o iPSC) ha

abierto la esperanza a una cura para la diabetes, pero los protocolos de diferenciación

dirigida no son lo suficientemente eficientes y las células β generadas son inmaduras

desde el punto de vista funcional.

Los mecanismos epigenéticos son claves en la determinación del linaje celular. Entre

estos, la metilación de las histonas altera la estructura de la cromatina y regula los

cambios de perfiles transcripcionales asociados a los programas de diferenciación.

Propusimos que la modulación de estas modificaciones epigenéticas podría ser una

estrategia para promover el destino β en protocolos de diferenciación dirigida a partir

de células madre. Por otra parte, la utilización de células pluripotentes como fuente de

células β para el trasplante conlleva el riesgo de tumorogénesis asociado a estados de

pluripotencia. Por esta razón, en el marco de este proyecto también hemos investigado

la posibilidad de convertir fibroblastos del piel humanos en células productoras de

insulina mediante el proceso de reprogramación o transdiferenciación directa (sin pasar

por un estado intermedio de pluripotencia) combinando factores de transcripción

promotores de linaje β con moduladores de la cromatina.

2. Resultados

El factor epigenético Jarid2 participa en la diferenciación terminal de las

células β durante el desarrollo embrionario.

Hemos observado que los progenitores endocrinos pancreáticos embrionarios están

enriquecidos en el factor epigenético Jarid2 y que la expresión génica de este factor

está modulada positivamente por el factor proendocrino Neurogenina3 in vitro. La

eliminación de Jarid2 en progenitores pancreáticos murinos resulta en una disminución

de la masa celular β al nacer y en intolerancia a la glucosa en la edad adulta. Mediante

el estudio de perfiles transcripcionales globales en el páncreas de embriones control y

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embriones deficientes en Jarid2, hemos concluido que este factor es necesario para la

activación adecuada de genes que codifican proteínas involucradas en la función β pero

no para la de genes involucrados en la activación inicial del programa de diferenciación

endocrino-pancreático. Este papel es independiente de cambios en la marca de

histonas represiva H3K27m3 y se asocia a una disminución de la deposición de la RNA

polimerasa fosforilada en Ser5 en la región promotora de los genes afectados.

Los reguladores de la marca represiva H3K27me3 participan en la actividad

transcripcional del factor proendocrino Neurogenina3.

La actividad proendocrina del factor de transcripción Neurogenina3 se asocia a la

pérdida de la marca represiva H3K27me3 en las regiones promotoras de sus genes

diana. Investigamos la relevancia de este cambio en la cromatina sobre la actividad

transactivadora de este factor. La inhibición de las demetilasas Jmjd3/Utx bloquea la

actividad transcripcional de Neurogenina3 en células en cultivo. Al contrario, la

inhibición de la metiltransferasa EZH2 permite un mayor grado de activación de los

genes diana de Neurogenina3.

Generación de células iPSC de dos pacientes con DT1.

A partir de biopsias dermales de dos pacientes con DT1 se obtuvieron clones de células

iPSC (uno por paciente) mediante tecnología de reprogramación retroviral clásica. Para

mejorar el potencial traslacional de estas células se hicieron nuevas reprogramaciones

con métodos no-integrativos, primero con virus tipo Sendai y luego mediante

electroporación con vectores episomales. Una vez caracterizados, todos estos clones se

han registrado en el Banco Nacional de Células.

Protocolo de diferenciación dirigida a célula β a partir de células

pluripotentes.

Hemos establecido un protocolo de diferenciación dirigida hacia células β a partir de

células pluripotentes que sigue cinco estadios secuenciales con una duración total de

21 días. El protocolo incluye modificaciones puntuales a protocolos publicados que

mejoran la eficiencia de formación de células β. Este protocolo funciona con células

madre embrionarias, células iPSC controles y células iPSC de DT1 (generadas en el

marco de este proyecto). La adición de inhibidores de la metiltransferasa EZH2 en el

estadio previo al estadio de formación de progenitores pancreáticos (estadio 3)

aumenta el número de células β al final del protocolo.

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Establecimiento de un protocolo de transdiferenciación de fibroblastos

humanos hacia células productoras de insulina.

Hemos establecido un protocolo de

transdiferenciación de fibroblastos hacia

células productoras de insulina basado en la

introducción de cinco factores de transcripción

que son importantes para la diferenciación y

funcionalidad de las células β. En un plazo de

10 días tras la introducción de los primeros

factores, se alcanzan niveles de expresión del

gen de la insulina del orden de 106 veces

sobre el control y unas 100 veces menor que

la expresión en islotes humanos aislados. No

solo se activa el gen de la insulina sino que

también se induce la expresión de genes de diferenciación y de genes marcadores de

células β diferenciadas. Estas activaciones génicas van acompañadas de la represión de

genes característicos de fibroblastos, confirmando así el cambio de linaje celular. Junto

a estas líneas se muestran imágenes de inmunofluorescencia con anticuerpos

específicos para insulina y péptido C (derivado del procesamiento de la proinsulina).

Puede observarse la tinción citoplasmática (en rojo) para estos dos marcadores en

fibroblastos reprogramados y no en fibroblastos controles. En azul se muestran los

núcleos celulares.

Los resultados derivados de este proyecto se han presentado en los siguientes

congresos:

EASD Islet Study Group: Beta-cell Regeneration and Genome Regulation. Sitges, 2013

Cervantes S, Fontcuberta Pi-Sunyer M, Tutusaus A, Sánchez L, Lee Y and Gasa R.

Exploring the potential role of Jarid2 in pancreatic endocrine cell formation

Congreso Anual de la Sociedad Española de Diabetes. Valencia, 2015

Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, García A, Sánchez L, Gomis R and Gasa R.

Uso the inhibidores epigenéticos para la mejora de la diferenciación endocrina in vitro

Annual Meeting of the European Association for the Study of Diabetes, Stockholm 2015

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Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, García A, Sánchez L, Gomis R and Gasa R.

Use of epigenetic inhibitors to modulate endocrine differentiation

Congreso Anual de la Sociedad Española de Diabetes. Barcelona, 2017

Fontcuberta Pi-Sunyer M, Cervantes S, Sánchez L, Soler A, Montserrat N, Novials A,

Gomis R and Gasa R.

Generación de celulas productoras de insulina a partir de cèlulas de la piel.

3. Relevancia y posibles implicaciones

Conseguir un control glucémico adecuado es un hito terapéutico básico en el

tratamiento de la diabetes. En este sentido, la terapia celular sustitutiva dirigida a

restituir la masa β perdida con nuevas células β sustitutas es una de las estrategias

más prometedoras que puede conducir a la curación definitiva de esta enfermedad.

Idealmente, las células sustitutas deberían poderse derivar a partir de fuentes celulares

de fácil obtención y renovables como podrían ser las células madre embrionarias o

células pluripotentes inducidas (iPSC) generadas a partir de fibroblastos. Aunque en los

últimos años se han producido grandes avances en el diseño de protocolos de

diferenciación dirigida a partir de células pluripotentes, los actuales protocolos son aún

ineficientes y las células β obtenidas son funcionalmente inmaduras. Nuestros

resultados sobre el uso de inhibidores de la metiltransferasa EZH2 y la función del

regulador epigenético Jarid2 abren la posibilidad de mejorar los protocolos aplicando

estos nuevos conocimientos.

Por otra parte, el uso de células iPSC generadas a partir de fibroblastos de piel del

propio paciente como fuente de células β para el trasplante abre la puerta a la

posibilidad de realizar autotrasplantes (el paciente recibe sus propias células),

evitándose así el riesgo de rechazo del injerto. A pesar de ello, emplear células que han

pasado por un estadio de pluripotencia lleva asociado el riesgo de tumorogénesis. En

este sentido, nuestro protocolo de reprogramación directa de fibroblastos de piel con

factores de transcripción endocrinos supondría una mejora, pues se evitaría tanto el

rechazo (trasplante autólogo) como el riesgo de tumores. Creemos que este

descubrimiento abre la puerta a investigar y optimizar protocolos de reprogramación

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directa como estrategia alternativa para generar células β sustitutas para la curación

de la diabetes.