IMUNOTERAPIA DE ÚLCERAS VENOSAS COM ββββ-(1 3) … · Enfermagem. À enfermeira Maria do Ó de...

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

IMUNOTERAPIA DE ÚLCERAS VENOSAS COM ββββ-(1→3)

GLUCANA INSOLÚVEL

SARAH DANTAS VIANA MEDEIROS

Orientadora: Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales

Co-Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha

NATAL - RN

2009

17

SARAH DANTAS VIANA MEDEIROS

IMUNOTERAPIA DE ÚLCERAS VENOSAS COM ββββ-(1→3)

GLUCANA INSOLÚVEL

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Ciências Farmacêuticas da

Universidade Federal do Rio

Grande do Norte, como requisito

parcial para obtenção do título

de Mestre em Ciências

Farmacêuticas – Área de

Concentração Bioanálises e

Medicamento.

NATAL -RN

2009

18

Catalogação da publicação na fonte.

M488i Medeiros, Sarah Dantas Viana.

Imunoterapia deúlcera venosas com β−(1→3) glucana insolúvel / Sarah Dantas Viana Medeiros. - Natal-RN, 2009.

91f.: il. Orientadora: Profª. Drª Valéria Soraya de Farias Sales.

. Coorientador: Profº Drº Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

Dissertação (Mestrado ) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. 1. Imunoterapia - Dissertação. 2. β−(1→3) glucana insolúvel - Dissertação. 3. Úlcera Venosa - Dissertação. 4. Úlcera Varicosa – Dissertação. I. Sales, Valéria Soraya de Farias. II. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. III. Título. UFRN/BSCCS CDU: 615.37(043.3) .

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais,

Rui Medeiros e Silvina Dantas Viana Medeiros, pelo dom da vida, por

todo o amor, por acreditarem nos meus sonhos e me proporcionarem uma plataforma de

vôo.

Aos pacientes,

Que se doaram de forma incondicional na busca da cura das lesões do

corpo e da alma.

21

AGRADECIMENTOS

À Deus, pela orientação superior em todos os momentos da vida.

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela formação concedida ao longo da

Graduação e Pós-Graduação.

Ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, representado pela Profa. Dra.

Adriana Augusto de Rezende, e ao corpo docente pelos ensinamentos transmitidos.

À CAPES, pela concessão de bolsa de estudo durante a realização deste curso.

À Fundação de Apoio a Pesquisa no Rio Grande do Norte (FAPERN) pelo apoio

financeiro.

Ao Prof. Dr. José Ricardo Lagreca de Sales Cabral, Diretor do Hospital Universitário

Onofre Lopes (HUOL/UFRN), que nos permitiu a realização desta pesquisa na referida

instituição.

À Profa. Dra. Valéria Soraya de Farias Sales, pela orientação, dedicação, amizade e por

acreditar nos meus sonhos e no meu trabalho.

Ao Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pela co-orientação e total apoio na

realização do estudo de caracterização da glucana.

Ao Prof. Dr. Irami Araújo Filho, pela colaboração na execução das biópsias, dispondo-se

de maneira incondicional.

À Profa. Msc. Keyla Borges Ferreira Rocha, pela colaboração no estudo histopatológico, e

pela torcida constante.

Aos Professores Elizabeth Maia de Oliveira e Luiz Reginaldo Menezes da Rocha, pela

colaboração na realização do processamento e colorações histológicas.

Ao médico cirurgião vascular Eduardo Baptista Dantas de Faria pela colaboração na

avaliação e acompanhamento dos pacientes.

À enfermeira Julianny Barreto Ferraz, pela colaboração no acompanhamento dos

pacientes, pelo exemplo de profissional e por ter me permitido vivenciar o universo da

Enfermagem.

À enfermeira Maria do Ó de Oliveira Ferreira e aos técnicos de Enfermagem do

Ambulatório de Angiologia e Cirurgia Vascular, pelo apoio e disponibilidade.

À toda a equipe do Centro Cirúrgico do HUOL, pela acolhida e cuidado com os pacientes

quando da realização das biópsias.

Às técnicas de Enfermagem da Comissão de Curativos do HUOL: Tatiane de Souza

Guerra, Monia Vieira Martins e Vanilde Fernandes, pela amizade, incentivo e torcida.

22

À Profa. Msc. Teresa Neuma de Souza Brito, pela amizade e apoio na realização dos

exames laboratoriais.

Ao Prof. Dr. Geraldo Barroso Cavalcanti Júnior, pelo apoio, incentivo e sugestões.

À Profa. Dra. Telma Maria Araújo Moura Lemos, Chefe do Departamento de Análises

Clínicas e Toxicológicas da UFRN, pelo apoio e incentivo na realização deste trabalho.

Às amigas do Mestrado: Camila Regalado Galvão, Luzia Leiros de Sena Fernandes e

Milena Thaísa Figueirêdo de Araújo, pelo convívio ao longo desses dois anos e constante

troca de experiências.

À minha família, pelo apoio incondicional, em especial aos meus irmãos Rui Medeiros

Júnior e Daniel Dantas Viana Medeiros e minhas avós Suzana Medeiros e Marina Dantas

de Araújo.

À todos que fazem o Laboratório de Biopolímeros do Departamento de Bioquímica da

UFRN, em especial à aluna de iniciação científica Sara Lima Cordeiro.

Ao Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade e ao Prof. Dr. Guilherme Lanzi Sassaki do

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal de Curitiba,

pela colaboração na realização da ressonância magnética nuclear da glucana.

Às secretárias do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas: Maria

Aureliana Nascimento Bezerra e Fábia Cristina Miranda de Araújo Freire, pelo apoio e

amizade.

À amiga e Farmacêutica Amália Cinthia Meneses do Rêgo, pelo apoio e incentivos

constantes.

À bolsista de iniciação científica Jéssica Escorel Chaves Cavalcanti, pela amizade e

colaboração.

Ao meu namorado Fernando Costa Fernandes Gomes, por todo o amor, cuidado e

dedicação.

Ao taxista Bartolomeu Juvêncio, pela disponibilidade e zelo em acompanhar os pacientes

às suas residências após a realização das biópsias.

Ao estatístico Ítalo Medeiros de Azevedo, pela amizade e realização do estudo estatístico.

À todos que fazem o Laboratório de Imunologia Clínica (UFRN), Laboratório Integrado

de Análises Clínicas (LIAC/UFRN), Laboratório de Desenvolvimento de Medicamentos

(UFRN) e Laboratório de Sistemas Dispersos (UFRN) pelo apoio e colaboração na

realização deste trabalho.

23

AO FARMACÊUTICO

Quando alguém de ti precisar,

observa como és indispensável.

Tens o bálsamo que pode aplacar

o sofrer que é tão lamentável.

Reveste-te do saber e do desejo

de curar, vencendo qualquer obstáculo.

Persevera descobrindo no ensejo

a força da Ciência – teu sustentáculo.

Maria Célia Ribeiro Dantas de Aguiar

24

RESUMO

Uma glucana insolúvel foi isolada de fermento biológico (Saccharomyces cerevisiae), o qual foi submetido a um tratamento com base e o resíduo acidificado. Análises químicas e ressonância magnética nuclear (NMR) em uma e duas dimensões (1D e 2D) mostraram que uma β-(1→3) glucana linear foi purificada, a qual não estava contaminada com outros carboidratos, proteínas ou compostos fenólicos. Os efeitos desta glucana na cicatrização de feridas foi avaliado em úlceras venosas humanas por análise histopatológica após 30 dias de tratamento. A β-(1→3) glucana favoreceu a cicatrização das úlceras, promovendo o aumento da hiperplasia epitelial, das células inflamatórias, angiogênese e proliferação fibroblástica. Este foi o primeiro estudo que investigou o efeito da β-(1→3) glucana na cicatrização de úlceras venosas em humanos. Os achados sugerem que a glucana é um potente modificador da resposta biológica na cicatrização de feridas.

Palavras Chaves: Glucana insolúvel, polissacarídeo, fungo, úlcera venosa, imunoterapia, reparo tecidual.

25

ABSTRACT

Water-insoluble glucan was isolated from the baker's yeast Saccharomyces cerevisiae. The yeast cells were treated with alkali and the residue then with acid. Chemical and NMR (1D and 2D) analyses showed that a linear (1→3)-β-glucan was purified that was not contaminated with other carbohydrates, proteins or phenolic compounds. The effects of the glucan on wound healing were assessed in human venous ulcers by histopathological analysis after 30 days of topical treatment. (1→3)-β-glucan enhanced ulcer healing and increased epithelial hyperplasia, as well as increased inflammatory cells, angiogenesis and fibroblast proliferation. This is the first study to investigate the effects of (1→3)-β-glucan on venous ulcer healing in humans; our findings suggest that this glucan is a potential natural biological response modifier in wound healing.

Keywords: Water-insoluble glucan, polysaccharide, yeast, venous ulcer, immunotherapy, tissue repair.

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LISTA DE SIGLAS

AGE: Ácidos Graxos Essenciais

ALT: Alanina Aminotransferase

AVC: Acidente Vascular Cerebral

AP-1: Proteína Ativadora 1

AST: Aspartato Aminotransferase

CEP: Comitê de Ética em Pesquisa

CNS: Conselho Nacional de Saúde

CR3: Receptor de Complemento Tipo 3

EGF: Fator de Crescimento Epidérmico

FGF: Fator de Crescimento Fibroblástico

GGT: Gamaglutamiltransferase

GM-CSF: Fator Estimulador de Colônias de Granulócitos-Monócitos

HCl: Ácido Clorídrico

HE: Hematoxilina-Eosina

HUOL: Hospital Universitário Onofre Lopes

IL-1β: Interleucina 1Beta

IL-6: Interleucina 6




INSS: Instituto Nacional de Seguridade Social

IVC: Insuficiência Venosa Crônica

LIAC: Laboratório Integrado de Análises Clínicas

NaOH: Hidróxido de Sódio

NF-1: Fator Nuclear 1

NK: “Natural Killer”

PAMPs: Padrões Moleculares Associados aos Patógenos

PDGF: Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas

PSF: Programa de Saúde da Família

RMN13C: Ressonância Magnética Nuclear do Carbono 13

SP-1: Proteína Específica 1

SBAVC: Sociedade Brasileira de Angiologia e Cirurgia Vascular

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SUS: Sistema Único de Saúde

TCA: Ácido Tricloroacético

TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TGF-α: Fator Transformador Alfa

TGF-β: Fator Transformador Beta

TNF-α: Fator de Necrose Tumoral Alfa

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte

VEGF: Fator de Crescimento do Endotélio Vascular

VSH: Velocidade de Sedimentação das Hemácias

28

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Classificação CEAP da doença venosa de acordo com o Fórum Venoso Americano.

20

Figura 2: Espectro de RMN 13C da amostra de glucana obtida a partir do Saccharomyces cerevisiae. O número de átomos de carbono foi marcado em cada ponta para se referir à posição. A caixa na parte superior da figura mostra a análise de DEPT da região C-6.

36

Figura 3: Espectro 1H-13C RMN da amostra de glucana insolúvel obtida a partir de Saccharomyces cerevisiae. O 13C RMN é exibido no eixo vertical e o 1H RMN no eixo horizontal.

37

Figura 4: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando hiperplasia epitelial típica e angiogênese na margem da úlcera venosa no pré-tratamento.

39

Figura 5: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando alterações epiteliais reativas e reparativas do epitélio escamoso estratificado da úlcera venosa no pré-tratamento.

40

Figura 6: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando necrose com deposição de fibrina, edema e resposta inflamatória na área ulcerada no pré-tratamento.

40

Figura 7: Hematoxilina-Eosina (100X) exibindo poucos vasos, edema e resposta inflamatória, que se estende desde a derme papilar até a porção média, na área ulcerada no pré-tratamento.

41

Figura 8: Hematoxilina-Eosina (400X) exibindo a presença de resposta inflamatória neutrofílica, angiogênese, edema e fibroblastos jovens da úlcera venosa no pré-tratamento.

41

Figura 9: Hematoxilina-Eosina (400X) exibindo a presença de resposta inflamatória linfoplasmocitária da úlcera venosa no pré-tratamento.

42

Figura 10: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando edema, angiogênese e ocasionais fibroblastos jovens da úlcera venosa no pré-tratamento.

42

Figura 11: Tricrômio de Masson (100X) exibindo deposição de colágeno jovem na área ulcerada e colágeno senescente na profundidade da úlcera no pré-tratamento.

43

Figura 12: Tricrômio de Masson (400X) exibindo detalhe do fibroblasto jovem em meio à deposição de colágeno na área ulcerada no pré-tratamento.

43

Figura 13: Picrosirius red (100X) mostrando pouca deposição de colágeno jovem na superfície da área ulcerada e presença de colágeno senescente depositado na profundidade da úlcera venosa no pré-tratamento.

44

Figura 14: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando fibroblastos jovens associados a edema, extravasamento de hemácias e células inflamatórias mononucleares e polimorfonucleares na profundidade da área ulcerada no pré-tratamento.

44

29

Figura 15: Hematoxilina-Eosina (100X) evidenciando área de reepitelização com alterações epiteliais reparativas e reativas, resposta inflamatória e angiogênese na área ulcerada no trigésimo dia de tratamento.

45

Figura 16: Hematoxilina-Eosina (100X) mostrando necrose superficial, com deposição de fibrina, polimorfonucleares e debris celulares associado a edema na porção papilar da derme na área ulcerada no trigésimo dia de tratamento.

46

Figura 17: Hematoxilina-Eosina (100X) exibindo resposta inflamatória, angiogênese e edema na área ulcerada no trigésimo dia de tratamento.

46

Figura 18: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando infiltrado inflamatório linfoplasmocitário perivascular e intersticial, angiogênese e edema na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.

47

Figura 19: Hematoxilina-Eosina (400X) evidenciando angiogênese, deposição de colágeno entre os vasos e diminuição da resposta inflamatória na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.

47

Figura 20: Tricrômio de Masson (100X) evidenciando colágeno jovem em trama delicada associado a edema na derme papilar e colágeno senescente na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.

48

Figura 21: Picrosirius red (100X) evidenciando a deposição de colágeno jovem e intensa angiogênese na porção papilar e colágeno senescente na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.

48

Figura 22: Hematoxilina-Eosina (400x) evidenciando fibroblastos jovens e senescentes em área de deposição de colágeno na profundidade da úlcera no trigésimo dia de tratamento.

49

30

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Deslocamentos químicos dos átomos de carbono e hidrogênio verificados nos espectros de 13C RMN e 1H RMN da amostra de glucana obtida a partir do Saccharomyces cerevisiae.

38

Tabela 2. Distribuição dos parâmetros histopatológicos evidenciados em úlceras venosas na fase de pré-tratamento (dia 0) e no trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β-(1→3) glucana por via tópica.

50

Tabela 3. Eritrograma, contagem de plaquetas e VSH dos pacientes portadores de úlceras venosas nas fases de pré-tratamento (dia 0) e de trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β-(1→3) glucana por via tópica.

52

Tabela 4. Leucograma dos pacientes portadores de úlceras venosas nas fases de pré-tratamento (dia 0) e de trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β-(1→3) glucana por via tópica.

53

Tabela 5. Dosagens bioquímicas dos pacientes portadores de úlceras venosas nas fases de pré-tratamento (dia 0) e de trigésimo dia de tratamento (dia 30) com β-(1→3) glucana por via tópica.

54

Tabela 6. Área e o percentual de redução das úlceras venosas por período de segmento terapêutico.

73

31

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .............................................................................................................................. 16

2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................................................. 18

2.1 ÚLCERA VENOSA............................................................................................................................... 18

2.2 FISIOLOGIA DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO.................................................................................. 21

2.3 TRATAMENTO DA ÚLCERA VENOSA.................................................................................................. 23

2.4 IMUNOTERAPIA COM β-GLUCANAS.................................................................................................. 24

3 OBJETIVOS.................................................................................................................................... 27

3.1 OBJETIVO GERAL................................................................................................................................ 27

3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................................................................... 27

4 CASUÍSTICA E METODOLOGIA....................................................................................................... 28

4.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA.......................................................................................................... 28

4.2 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA GLUCANA............................................................ 28

4.3 FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA.......................................................................................................... 29

4.4 APLICAÇÃO DA GLUCANA................................................................................................................... 29

4.5 REGISTRO FOTOGRÁFICO E MENSURAÇÃO DA ÁREA DA ÚLCERA...................................................... 30

4.6 BIÓPSIA CUTÂNEA............................................................................................................................... 30

4.7 PROCESSAMENTO E COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS............................................................................. 30

4.8 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA......................................................................................................... 31

4.8.1 Análise qualitativa........................................................................................................................... 31

4.8.2 Análise semiquantitativa................................................................................................................. 31

4.8.3 Análise quantitativa........................................................................................................................ 33

4.9 AVALIAÇÕES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS................................................................................. 33

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA........................................................................................................................ 34

5 RESULTADOS.................................................................................................................................. 35

5.1 CASUÍSTICA......................................................................................................................................... 35

5.2 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA GLUCANA............................................................. 35

5.3 REGISTRO FOTOGRÁFICO E MENSURAÇÃO DA ÁREA DA ÚLCERA ..................................................... 38

5.4 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA......................................................................................................... 39

32

5.4.1 Análise qualitativa............................................................................................................................ 39

5.4.2 Análise semiquantitativa................................................................................................................. 50

5.4.3 Análise quantitativa......................................................................................................................... 51

5.5 AVALIAÇÕES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS................................................................................ 51

6 DISCUSSÃO................................................................................................................................... 55

7 CONCLUSÃO.................................................................................................................................. 58

REFERÊNCIAS.................................................................................................................................... 59

APÊNDICES....................................................................................................................................... 65

ANEXO............................................................................................................................................... 90

16

1 INTRODUÇÃO_______________________________________________________

As úlceras venosas são lesões cutâneas de difícil cicatrização que surgem nos

membros inferiores como conseqüência da insuficiência venosa crônica (IVC).

Configuram um sério problema de saúde pública em função de sua alta prevalência e do

impacto socioeconômico (SIMON; DIX; MCCOLLUM 2004). Embora a mortalidade

associada a este tipo de ferida seja praticamente nula, a morbidade é bastante

significativa, levando a um comprometimento da qualidade de vida do paciente e da sua

produtividade no trabalho, além de restrições das suas atividades da vida cotidiana

(NUNES, 2006).

O processo de cicatrização de feridas é sistêmico, complexo e resulta de uma

série de fenômenos desencadeados em resposta à injúria tecidual (GURTNER, et al.,

2008). Mesmo com o arsenal terapêutico disponível, novas propostas têm surgido com o

intuito de acelerar a cicatrização, minimizar os riscos e as complicações, melhorar a

qualidade de vida do paciente e reduzir os custos despendidos com o tratamento.

Neste contexto, a literatura destaca a β-glucana insolúvel, obtida a partir do

fungo Saccharomyces cerevisiae, um polissacarídeo capaz de estimular o processo de

cicatrização, através da ativação de células imunes, principalmente macrófagos e

linfócitos, com conseqüente liberação de citocinas, como a interleucina 1 β (IL-1 β),

interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fatores de crescimento e

outros mediadores importantes para a angiogênese, proliferação de fibroblastos e síntese

de colágeno, além do aumento da atividade fagocítica (BROWN; GORDON, 2003;

CHEN; SEVIOUR, 2007).

Pesquisadores do Laboratório de Imunologia Clínica da Universidade Federal do

Rio Grande do Norte (UFRN) vêm desenvolvendo estudos com a β-glucana insolúvel.

Em um dos trabalhos realizados, após a indução de um modelo experimental de sepse

letal em camundongos, foi observado, com a aplicação da β-glucana por via

intraperitoneal, o aumento do número de leucócitos no lavado peritoneal, a elevação dos

níveis séricos de TNF-α e interleucina 10 (IL-10), além de infiltrado de macrófagos,

células epitelióides e linfócitos no fígado e baço (FREITAS, 2004). No estudo

desenvolvido por Sales (1989) em pacientes com câncer de pulmão em estadio

avançado, foi evidenciado, após o tratamento com a β-glucana insolúvel por via

17

intravenosa, melhora no estado geral, ausência de eventos adversos e ação adjuvante à

quimioterapia, proporcionando um aumento na sobrevida dos pacientes.

Assim, de acordo com os trabalhos apresentados na literatura e os desenvolvidos

no Laboratório de Imunologia Clínica da UFRN, os quais destacam a importância da β-

glucana na indução da cicatrização, no aumento da resistência a infecções e na ausência

de eventos adversos, justifica-se a realização desta pesquisa com o intuito de verificar se

este imunomodulador, por via tópica, atua na cicatrização de úlceras venosas em

humanos.

18

2 REVISÃO DE LITERATURA___________________________________________

2.1 ÚLCERA VENOSA

O sistema venoso dos membros inferiores é constituído por veias superficiais e

profundas que se comunicam através de veias perfurantes. Em condições normais, o

fluxo sangüíneo tem um único sentido, do sistema superficial para o profundo, guiado

por válvulas existentes no interior das veias e impulsionado pelo músculo gastrocnêmio.

Em posição ortostática, a pressão venosa nos membros inferiores está compreendida

entre 80 mmHg e 90 mmHg e, durante a deambulação, essa pressão é reduzida para

aproximadamente 30 mmHg, permitindo um fluxo sangüíneo livre (DEODATO, 2007).

Entretanto, esse sistema pode apresentar anormalidades no seu funcionamento,

sendo tais alterações causadas por incompetência valvular, associada ou não à obstrução

do fluxo venoso, refluxo ou combinação de ambos, bem como pela falência do músculo

gastrocnêmio. Isso configura um quadro de insuficiência venosa crônica, a qual está

relacionada com o surgimento da hipertensão venosa. A pressão elevada no interior dos

vasos provoca alterações na microcirculação, acarretando aumento da permeabilidade

capilar com liberação de macromoléculas para o espaço extravascular, como o

fibrinogênio e a hemoglobina, que se transformam em fibrina e hemossiderina,

respectivamente. Como conseqüência desse processo, é possível observar alterações

cutâneas sob a forma de edema, eczema, hiperpigmentação, lipodermatoesclerose e

ulceração do tecido (ABBADE; LASTÓRIA, 2005).

As úlceras venosas são lesões cutâneas que correspondem a 80-85% das úlceras

que acometem os membros inferiores (SIMON; DIX; MCCOLLUM 2004). Surgem

geralmente de forma espontânea e podem ocorrer também em função de traumatismos e

infecções. Na maioria das vezes, localizam-se na região maleolar, entretanto, acometem

outras regiões do membro inferior. São caracterizadas pela perda circunscrita ou

irregular da epiderme ou derme, e podem atingir o tecido subcutâneo e subjacente.

Possuem bordas irregulares, leito vermelho vivo e em alguns casos apresentam necrose

do tipo esfacelo. São bastante exsudativas, recidivantes e em geral compreendem uma

área extensa. A dor é variada, melhorando com a elevação do membro, e é mais intensa

na presença de edema e infecção (SILVA et al., 2005).

A doença venosa crônica é um grave problema de saúde pública, não só por sua

alta prevalência, mas também por seu impacto socioeconômico. Apesar da mortalidade

19

praticamente inexistente, as úlceras venosas cursam com elevada morbidade,

comprometendo significativamente a qualidade de vida do paciente em função da dor

crônica, perda de auto-estima, isolamento social, inabilidade para o trabalho, gerando

aposentadorias por invalidez, além do grande número de atendimentos ambulatoriais e

hospitalizações (NUNES, 2006).

Na Europa, a prevalência de insuficiência venosa crônica na faixa etária de 30 a

70 anos varia entre 5% e 15%, sendo que 1% da população apresenta a úlcera venosa.

Nos Estados Unidos da América, em torno de 7 milhões de pessoas têm a IVC e mais de

600 mil possuam esse tipo de lesão. (FRANÇA; TAVARES, 2003). Maffei et al (1986),

em estudo epidemiológico das alterações venosas de membros inferiores realizado na

cidade de Botucatu (SP), estimaram uma prevalência de varizes em 35,5% da população

e de formas graves de IVC com úlcera aberta ou cicatrizada em 1,5%.

O diagnóstico de úlcera venosa é predominantemente clínico, sendo necessária a

obtenção de informações, tais como: ano de ocorrência da primeira úlcera, localização

de úlceras anteriores, número de recorrências, tempo livre de úlcera e tratamentos

anteriores, uma vez que esses dados são importantes para o direcionamento da terapia.

Podem ser realizados ainda exames complementares, como Doppler de ondas contínuas,

ultra-sonografia (eco-Doppler), plestimografia venosa e flebografia, com o propósito de

diagnosticar precisamente as alterações anatômicas e funcionais do sistema venoso

(AGUIAR et al., 2005; FRANÇA; TAVARES, 2003).

Em 1994, a comissão internacional do Fórum Venoso Americano, liderada por

Andrew Nicolaides, elaborou o primeiro documento de consenso para classificação da

doença venosa crônica, o qual unificou os critérios das classificações de Widmer e de

Porter utilizados até então. Esta classificação leva em consideração as manifestações

clínicas (C), etiologia (E), distribuição anatômica (A) e fisiopatologia (P), recebendo

assim a denominação de classificação CEAP, sendo mundialmente adotada (Figura 1)

(EKLÖF, et al., 2004).

20

Figura 1. Classificação CEAP da doença venosa de acordo com o Fórum Venoso Americano (EKLÖF, et al., 2004).

Classificação Clínica (C):

• Classe 0: Sem sinais visíveis ou palpáveis de doença venosa.

• Classe 1: Telangiectasias e/ou veias reticulares.

• Classe 2: Veias varicosas.

• Classe 3: Edema.

• Classe 4: Alterações cutâneas

* Classe 4a: Hiperpigmentação ou eczema

* Classe 4b: Lipodermatosclerose ou atrofia branca

• Classe 5: Classe 4 com úlcera cicatrizada.

• Classe 6: Classe 4 com úlcera ativa.

Classificação Etiológica (E):

• EC: Congênita

• EP: Primária

• ES: Secundária (pós-trombótica)

• EN: Sem causa venosa definida

Classificação Anatômica (A):

• AS: Veias Superficiais

• AD: Veias Profundas

• AP: Veias Perfurantes

• AN: Sem localização venosa definida

Classificação Fisiopatológica (P):

• PR: Refluxo

• PO: Obstrução

• PR,O: Refluxo e Obstrução

• PN: Sem fisiopatologia venosa definida

21

2.2 FISIOLOGIA DO PROCESSO DE CICATRIZAÇÃO

A cicatrização de feridas consiste em um processo sistêmico e bastante

complexo, que envolve a ativação, produção e inibição de uma série de constituintes

celulares e moleculares para que ocorra o reparo tecidual. Não havendo qualquer

obstáculo, esse processo pode ser compreendido em três grandes fases conforme

descrito a seguir (MANDELBAUM, S; DI SANTIS; MANDELBAUM, M, 2003a).

- Fase Inflamatória ou Exsudativa

Após a injúria tecidual, os vasos sanguíneos sofrem vasoconstricção reflexa, por

cerca de 5 a 10 minutos, sendo este efeito promovido pela norepinefrina e serotonina.

Ocorre a ativação da cascata de coagulação e agregação plaquetária, resultando na

conversão do fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel, cujas moléculas se polimerizam

e formam uma rede que, juntamente com as plaquetas e as hemácias, originam o

coágulo. Este, uma vez formado, além de limitar a perda de constituintes circulatórios,

fornece uma matriz provisória para a migração celular (GURTNER, et al., 2008).

Com a ativação plaquetária, há a liberação de mediadores vasoativos, de fatores

de crescimento, como o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator de

crescimento epidérmico (EGF), o fator de crescimento e transformação alfa (TGF-α), o

fator de crescimento e transformação beta (TGF-β) e de outras proteínas como a

fibronectina e a tromboplastina. Essas moléculas se difundem pela matriz provisória e

criam um gradiente quimiotático para as células inflamatórias (BALBINO; PEREIRA;

CURI, 2005).

Nas primeiras 24 a 48 horas, há um predomínio de um infiltrado celular

neutrofílico, seguido pela migração dos monócitos, os quais se diferenciam, no tecido,

em macrófagos e, posteriormente, dos linfócitos. Os neutrófilos amplificam a resposta

inflamatória em função da liberação de aminas vasoativas, auxiliam no controle da

infecção via fagocitose e produção de substâncias bactericidas, e participam do

debridamento de tecido desvitalizado por meio da produção de enzimas proteolíticas,

como as elastases, colagenases e hidrolases ácidas. Os neutrófilos também liberam

citocinas pró-inflamatórias, como TNF- α, IL-1 β e IL-6, além do fator estimulador de

colônias de granulócitos-monócitos (GM-CSF) (PARK; BARBUL, 2004; WERNER;

GROSE, 2003).

22

Os macrófagos são responsáveis pela degradação e remoção dos componentes

do tecido conjuntivo danificado, como colágeno, elastina e proteoglicanas, participando

ainda da fagocitose de neutrófilos senis e bactérias. Quando ativados, os macrófagos

liberam substâncias vasoativas, intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio, como

o peróxido de hidrogênio, ânion superóxido e óxido nítrico, além de citocinas como IL-

1 β, IL-6, interleucina 8 (IL-8), TNF-α, TGF-α e TGF-β, e fatores de crescimento como

o PDFG, EGF, fator de crescimento fibroblástico (FGF) e o fator de crescimento do

endotélio vascular (VEGF). Estes mediadores propiciam o aumento da atividade

fagocítica dos macrófagos e estimulam células imunes e outras células não imunes

essenciais para a formação do novo tecido. (PARK; BARBUL, 2004; SINGER;

CLARK, 1999).

Os linfócitos T e B além de produzirem citocinas e fatores de crescimento, o que

contribui para a ativação de diversos tipos celulares, atuam como células reguladoras

(linfócitos T), células apresentadoras de antígenos e produtoras de anticorpos (linfócitos

B) (BOYCE et al., 2000; IWATA et al., 2009).

- Fase Proliferativa ou Fibroblástica

Na fase proliferativa ocorre a reepitelização, com a migração de células

epiteliais para a área ulcerada em resposta aos processos de angiogênese e de

fibroplasia. Dessa maneira, há a formação de um tecido brilhante, vermelho vivo, com

ondulações granulosas, denominado tecido de granulação. A produção deste novo tecido

é dependente do acúmulo de macrófagos. Estas células imunes quando ativadas,

estimulam o recrutamento, proliferação e diferenciação dos fibroblastos, os quais

sintetizam colágeno, elastina, fibronectina, glicosaminoglicana e proteases

(componentes da matriz extracelular), contribuindo para a formação do tecido

conjuntivo frouxo (fibroplasia), além de estimular a angiogênese (SINGER; CLARK,

1999).

O processo de angiogênese ocorre pela formação de novos vasos sangüíneos a

partir dos vasos preexistentes, em função da estimulação mitogênica e migração das

células endoteliais em resposta a citocinas e fatores de crescimento, como VEGF, TGF-

β e FGF. A formação de novos vasos é necessária para suprir as células com nutrientes e

oxigênio, aumentando assim a taxa metabólica das mesmas (FRANTZ, et al., 2009).

23

- Fase de Maturação ou Remodelação

A fase de maturação é caracterizada pelo aumento da força de tensão, pela

diminuição do tamanho da cicatriz e do eritema. Nesta fase, ocorre a reorganização da

matriz extracelular e a maturação dos componentes nela presentes. A neovasculatura

diminui e tardiamente a cicatriz é considerada avascular. Uma cicatrização normal tem

aproximadamente 70% da força de tensão original, é plana e não é volumosa

(BALBINO; PEREIRA; CURI, 2005).

Inúmeros fatores podem retardar o processo de cicatrização, sejam eles locais ou

sistêmicos, tais como: infecção, edema, tecido necrótico, hipertensão arterial sistêmica,

diabetes mellitus, nefropatia, hepatopatia, neoplasias malignas. Além disso, a idade do

paciente, o tipo de nutrição, os cuidados pessoais e a utilização de alguns

medicamentos, principalmente imunossupressores e antiinflamatórios podem dificultar

este processo (DEALEY, 2009).

2.3 TRATAMENTO DA ÚLCERA VENOSA

O tratamento da úlcera venosa deve contemplar a cicatrização da lesão e evitar a

recorrência da mesma. Neste contexto, destacam-se a terapia compressiva, a terapia

tópica, os medicamentos sistêmicos e o tratamento cirúrgico da anormalidade venosa

(ABBADE; LASTÓRIA, 2005). A compressão atua na macrocirculação aumentando o

retorno venoso profundo, diminuindo o refluxo no momento da deambulação,

aumentando o volume de ejeção quando da ativação do músculo gastrocnêmio e

promovendo a reabsorção do edema. Além disso, age na microcirculação diminuindo a

saída de líquidos e macromoléculas dos capilares e vênulas para o interstício, podendo

estimular também a atividade fibrinolítica. Para o tratamento compressivo dispõe-se de

bandagens ou ataduras elásticas e inelásticas, bem como meias elásticas. Dentre as

ataduras inelásticas a mais comumente utilizada é a bota de Unna, que é capaz de

formar um molde semi-sólido para a realização da compressão externa (O’MEARA;

CULLUM; NELSON, 2009).

A utilização de substâncias no local da ulceração inicia-se com a limpeza da

lesão, onde se recomenda apenas solução de cloreto de sódio 0,9%, uma vez que

substâncias antissépticas como clorexidina, iodo-povidona e ácido acético são

citotóxicas (DEALEY, 2009). Na presença de tecido inviável há necessidade de

24

debridamento, pois esse tipo de tecido, além de favorecer a ocorrência de infecção, não

permite a formação do tecido de granulação. O debridamento pode ser realizado de três

formas: autolítico, químico ou mecânico. O primeiro é alcançado com a utilização de

curativos oclusivos, pela ação das enzimas presentes no próprio exsudato que

permanece em contato com a úlcera. São exemplos desses curativos os hidrogéis e os

hidrocolóides. O debridamento químico se faz mediante a aplicação tópica de enzimas,

como a colagenase e a papaína. Para o debridamento mecânico são utilizados

instrumentos cirúrgicos (ABBADE, LASTÓRIA, 2005; IRION, 2005).

A quantidade de exsudato também deve ser controlada, pois o seu excesso, além

de favorecer infecções e maceração da pele perilesional, traz desconforto para o

paciente. Por outro lado, a desidratação do leito da úlcera deve ser evitada, pois

favorece a formação de tecido desvitalizado. Nas úlceras com excesso de exsudato são

indicados curativos compostos por alginatos e hidropolímeros (MANDELBAUM, S; DI

SANTIS; MANDELBAUM, M, 2003b).

Para estimular a granulação tecidual da úlcera podem ser utilizados ácidos

graxos essenciais (AGE), fatores de crescimento, dentre outros (MANDELBAUM, S;

DI SANTIS; MANDELBAUM, M, 2003b). Os medicamentos sistêmicos, pertencentes

à classe farmacológica dos flebotônicos, são importantes como terapia adjuvante

(MARTINEZ, et al., 2008), enquanto o tratamento cirúrgico tem por finalidade eliminar

ou diminuir a hipertensão venosa (ZAMBONI, et al., 2003).

A terapia compressiva pode ser realizada em associação com os produtos

anteriormente citados, devendo-se destacar que a escolha do tratamento adequado

depende de uma série de fatores como: grau de contaminação da ferida, presença e tipo

de exsudato, ocorrência de necrose, recursos financeiros, materiais e humanos

disponíveis para o cuidado desse tipo de ferida (COLERIDGE-SMITH, 2009).

Devido à complexidade, os custos inerentes ao tratamento das úlceras venosas

são relativamente elevados, estando distante da realidade socioeconômica da maioria da

população. Em função dessas variáveis é notória a necessidade de mais estudos com

agentes terapêuticos capazes de acelerar o processo de cicatrização.

2.4 IMUNOTERAPIA COM β-GLUCANAS

Glucanas são polissacarídeos constituídos por monômeros de glicose, cuja

cadeia principal apresenta ligações glicosídicas do tipo α ou β, podendo dispor ou não

25

de ramificações laterais. Estão amplamente distribuídas na natureza, sendo encontradas

em uma variedade de organismos como fungos, bactérias, algas e plantas, porém não

detectadas em mamíferos (CHEN; SEVIOUR, 2007).

Nos fungos, as β-glucanas são os principais componentes estruturais da parede

celular. Estão normalmente ligadas às proteínas, aos lipídios e a outros sacarídeos, como

a manana. O papel da glucana no fungo não está completamente elucidado, entretanto,

acredita-se que sua principal função é manter a rigidez e integridade da parede celular

(SILVA, et al., 2006).

Nos mamíferos, estes biopolímeros podem ser reconhecidos pelo sistema imune

como padrões moleculares associados aos patógenos (PAMPs). Receptores para β-

glucanas foram primeiramente descritos em monócitos humanos (CZOP; AUSTEN,

1985) e estudos desenvolvidos posteriormente evidenciaram a presença de receptores

em uma variedade de leucócitos, incluindo macrófagos, neutrófilos, linfócitos,

eosinófilos e células natural killer (células NK), além de células não imunes, como

células endoteliais (LOWE, et al., 2002) células do epitélio alveolar e fibroblastos

(WEI, et al., 2002). Até o momento, é sugerida a participação dos seguintes receptores

no processo de reconhecimento das β-glucanas: dectin-1, receptor de complemento tipo

3 (CR3), lactosilceramida, receptor scavenger e receptores toll-like 2 e 4

(GOODRIDGE; WOLF; UNDERHILL, 2009).

As β-glucanas fazem parte dos agentes modificadores da resposta biológica e

atuam no sistema imune do hospedeiro participando intensamente da ativação

leucocitária, estimulando a fagocitose, a citotoxicidade e a atividade antimicrobiana,

incluindo a produção de intermediários reativos do oxigênio e nitrogênio. Além disso,

estimulam a produção de mediadores inflamatórios, citocinas e quimiocinas, como IL-

1β, IL-6, IL-8, interleucina 12 (IL-12) e TNF-α (BROWN; GORDON, 2003).

Estudos em animais e no homem têm demonstrado que a terapia com a β-

glucana é capaz de alterar a progressão de neoplasias malignas (DI LUZIO, et al., 1979;

SALES, 1989; LIU, et al., 2009; WEITBERG, 2009;), de infecções causadas por

diversos patógenos, como bactérias (HETLAND, 2000; FREITAS, 2004) e fungos

(SATO, et al., 2006), e também do processo de cicatrização de diversos tipos de feridas.

A imunoterapia com β-glucana melhorou a cicatrização de feridas por aumentar

o infiltrado de macrófagos, estimular a granulação tissular e promover a deposição de

colágeno, com conseqüente reepitelização e aumento da força de tensão tecidual. A

mesma apresentou a capacidade de ativar duas famílias de fatores de transcrição: a

26

proteína ativadora 1 (AP-1), envolvida na regulação de genes de citocinas

imunorregulatórias e a proteína específica 1 (SP-1), que interage com o fator nuclear 1

(NF-1), o qual atua como regulador transcricional do procolágeno humano α1 e α2

(WEI; WILLIAMS; BROWDER, 2002).

A cicatrização de feridas em animais de laboratório tratados com glucana por

via tópica demonstrou aumento da proliferação fibroblástica, o que contribuiu para a

reepitelização (WOLK; DANON, 1985). A β-(1→3) glucana fosfatada foi administrada

por via intravenosa em animais submetidos a anastomose do cólon e incisão total da

pele. Neste estudo foi observado que nos grupos tratados com a glucana, houve aumento

da força de tensão das feridas, indicando uma correlação positiva entre tratamento com

glucana, força tênsil e biossíntese de colágeno (PORTERA; LOVE; MEMORE, 1997).

A β-(1→3) glucana aminada foi capaz de estimular a cicatrização de feridas

cutâneas induzidas em camundongos diabéticos quando aplicada por via tópica

(BERDAL et al., 2007). Em modelo de anastomose colônica em ratos, verificou-se que

os animais tratados com β-(1→3) glucana por via oral apresentaram aumento

significativo no número de macrófagos e fibroblastos (DINC, et al., 2006). Na pesquisa

desenvolvida por Lee et al. (2003), pele artificial obtida a partir de cultura de

fibroblastos e queratinócitos em meio contendo β-(1→3), (1→6) glucana e gelatina foi

utilizada em feridas induzidas experimentalmente em camundongos atímicos,

verificando-se que a glucana foi capaz de promover o aumento da reepitelização.

Delatte et al (2001) utilizaram a β-glucana associada a uma matriz de colágeno

no tratamento de queimaduras parciais em crianças e observaram a indução da formação

de uma barreira contra contaminação bacteriana, diminuição da dor, menor necessidade

de trocas do curativo e retorno precoce às atividades diárias.

27

3 OBJETIVOS_________________________________________________________

3.1 OBJETIVO GERAL

Verificar se a glucana insolúvel, por via tópica, atua no processo de cicatrização

de úlceras venosas em humanos.

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

* Caracterizar quimicamente a glucana insolúvel obtida a partir do

Saccharomyces cerevisiae;

* Avaliar a resposta inflamatória nas úlceras tratadas com a glucana por via

tópica;

* Investigar angiogênese, proliferação fibroblástica e produção de colágeno nas

referidas úlceras;

* Averiguar alterações hematológicas, hepáticas e renais em função da

aplicação da glucana por via tópica.

28

4 CASUÍSTICA E METODOLOGIA______________________________________

4.1 DELINEAMENTO DA PESQUISA

A pesquisa seguiu o modelo de um ensaio clínico não-randomizado intragrupo,

no qual para a avaliação do efeito do tratamento cada participante serviu como seu

próprio controle (HULLEY, S. B et al, 2003). O estudo foi aprovado pelo Comitê de

Ética em Pesquisa (CEP) do Hospital Universitário Onofre Lopes (HUOL/UFRN) sob

nº de protocolo 147/07 (ANEXO 1), respeitando-se o Capítulo III da Resolução 196/96

do Conselho Nacional de Saúde (CNS) sobre as Diretrizes e Normas Regulamentadoras

de Pesquisa Envolvendo Seres Humanos.

O grupo de estudo foi constituído por pacientes atendidos no Ambulatório de

Angiologia e Cirurgia Vascular do HUOL/UFRN. Antes das intervenções, os mesmos

receberam orientações acerca do objetivo da pesquisa e assinaram o Termo de

Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) (APÊNDICE 1).

Para ser incluído no estudo, o paciente deveria ter idade compreendida entre 18 e

75 anos, não havendo restrição quanto ao sexo, e apresentar pelo menos uma úlcera

venosa por no mínimo dois meses. Foram excluídos os pacientes com transtornos

psiquiátricos, sinais clínicos de comprometimento arterial no membro inferior,

neoplasia, doença auto-imune, insuficiência renal, cardíaca ou hepática.

Os pacientes incluídos na pesquisa foram submetidos à avaliação clínica pelo

cirurgião vascular pertencente à equipe. Para tanto, foi elaborado um instrumento de

avaliação do portador de úlcera venosa (APÊNDICE 2), de acordo com as Diretrizes da

Sociedade Brasileira de Angiologia e Cirurgia Vascular – SBAVC (AGUIAR et al.,

2005).

4.2 OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DA GLUCANA

A glucana foi extraída no Laboratório de Imunologia Clínica e no Laboratório de

Desenvolvimento de Medicamentos da Faculdade de Farmácia da UFRN, a partir do

fermento biológico (Saccharomyces cerevisiae), (Fleischmann®, Rio de Janeiro), de

acordo com o método descrito por Hassid; Joslyn; Mccready (1941) com modificação

na temperatura de extração, a qual foi de 80°C.

29

A concentração de açúcares totais foi determinada pelo método de Dubois et al

(1956), tendo como padrão a D-glicose. A concentração total de proteínas foi

mensurada pelo método de Bradford (SPECTOR, 1978) utilizando-se a albumina sérica

bovina (BSA) como padrão e a concentração de compostos fenólicos foi obtida pelo

método colorimétrico Folin-Ciocalteu adotando-se como padrão o ácido gálico (COSTA

et al., 2010). Os polímeros foram hidrolisados (5 M TCA, 100ºC, 2 h) e a composição

de açúcar foi determinada por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (Merck

Hitachi Elite LaChrom®) em coluna LichroCART®250-4. Arabinose, galactose, glicose,

fucose, manose, ramnose e xilose foram utilizadas como referência. Os ensaios acima

descritos foram realizados no Laboratório de Biopolímeros, Departamento de

Bioquímica do Centro de Biociências/UFRN.

Os espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 13C e 1H (1D e 2D)

foram obtidos em espectrômetro Bruker Avance DRX 400 MHz no Departamento de

Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Paraná. Glucana (50 mg)

foi dissolvida em 800 µL de ácido dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) e as amostras

foram analisadas à temperatura de 70 °C.

4.3 FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA

A glucana foi dispersa na concentração de 3% em um creme contendo crodabase

CR-2 (Croda®, Campinas), de acordo com a formulação abaixo descrita:

Crodabase CR-2--------------------------------------------------- 25%

Nipazol------------------------------------------------------------ 0,05%

Nipagin------------------------------------------------------------ 0,15%

Glicerina---------------------------------------------------------- 5,175%

Água destilada----------------qsp------------------------------- 100g

4.4 APLICAÇÃO DA GLUCANA

Inicialmente foi realizada a limpeza da úlcera com solução de cloreto de sódio

0,9% e posterior aplicação de uma fina camada da formulação anteriormente descrita.

Em seguida, a úlcera foi coberta primariamente com gaze não-aderente (100% viscose)

umedecida em solução de cloreto de sódio 0,9%, seguida por gaze de algodão e atadura

30

de crepom (ABBADE; LASTÓRIA, 2005). Este procedimento foi realizado diariamente

por um período de no mínimo dois meses (FRADE, 2003).

4.5 REGISTRO FOTOGRÁFICO E MENSURAÇÃO DA ÁREA DA ÚL CERA

A evolução do processo de cicatrização foi acompanhada pelo registro

fotográfico e pela mensuração da área da úlcera. Este procedimento foi realizado

semanalmente no Ambulatório de Angiologia e Cirurgia Vascular do HUOL/UFRN,

dispondo-se, para o primeiro, de câmera digital Sony DSC- W35 e, para o segundo, do

contorno do perímetro da úlcera sobre uma folha plástica estéril, sendo a figura obtida

analisada pelo software AutoCAD 2008®.

4.6 BIÓPSIA CUTÂNEA

Para a avaliação histopatológica das úlceras em estudo, foram realizadas, em

cada paciente, duas biópsias cutâneas. A primeira foi efetuada no pré-tratamento (dia 0)

e a segunda no trigésimo dia de tratamento (dia 30). Para executar este procedimento,

limpou-se a úlcera com solução de cloreto de sódio 0,9%, em seguida foi aplicada

anestesia local (xilocaína 2% com epinefrina) e realizada biópsia incisional em elipse

com auxílio de lâmina de bisturi nº 15, contemplando a área ulcerada e a borda da lesão

(a média dos fragmentos excisados foi de 1,0 x 0,5 x 0,5 cm). Imediatamente após a

biópsia, a glucana foi administrada. O procedimento acima descrito ocorreu no Centro

Cirúrgico do HUOL por cirurgião pertencente à equipe. O fragmento excisado, embora

elíptico, não causou dano significativo ao paciente e permitiu analisar e comparar a área

ulcerada e a borda da lesão. O material obtido foi fixado em formaldeído a 10%, por 24

horas, e encaminhado ao Laboratório de Anatomia Patológica, Departamento de

Patologia/UFRN.

4.7 PROCESSAMENTO E COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS

O processamento histológico do fragmento biopsiado incluiu a desidratação em

álcool etílico absoluto (6 passagens), diafanização em xilol (2 passagens) e impregnação

em parafina a 39ºC (2 passagens), etapas estas realizadas em disco de 12 horas em

processador automático de tecido. Em seguida, os fragmentos foram incluídos em

parafina a 45ºC. A partir do material emblocado e com uso de micrótomo, foram

obtidos cortes histológicos de 4µm, seqüenciais, distribuídos em 4 lâminas. O primeiro

31

foi corado pela hematoxilina-eosina (HE) para evidenciação da estrutura cutânea e seus

componentes celulares e teciduais; o segundo pelo tricrômico de Masson e o terceiro

pelo picrosirius red, ambos com a finalidade de identificação das fibras de colágeno.

Tanto a coloração por HE quanto as histoquímicas obedeceram a padrões estabelecidos

no Laboratório de Anatomia Patológica, Departamento de Patologia/UFRN

(APÊNDICE 3).

4.8 AVALIAÇÃO HISTOPATOLÓGICA

A avaliação histopatológica foi realizada por médico patologista pertencente à

equipe, com auxílio de microscópio óptico binocular Olympus CX31 acoplado a câmera

digital Olympus C-5060, de acordo com o descrito abaixo (FRADE, 2003):

4.8.1 Análise Qualitativa

Foram avaliados os seguintes parâmetros:

a) Padrão da Epiderme: Identificação da presença de hiperplasia epitelial ou de

atrofia.

b) Necrose: Presença ou ausência de necrose tecidual.

c) Processo Inflamatório: Presença ou ausência de processo inflamatório.

d) Angiogênese: Presença ou ausência de neoformação vascular.

e) Fibrose Colagênica: Verificação ou não do aumento das fibras de colágeno.

f) Proliferação Fibroblástica: Verificação ou não do aumento do número de

fibroblastos.

4.8.2 Análise Semiquantitaiva

O estudo semiquantitativo avaliou, pelo sistema de cruzes, os parâmetros

determinados na observação qualitativa, com exceção do padrão da epiderme.

A necrose foi considerada segundo a localização topográfica e de acordo com a

coloração por HE em:

32

NECROSE

+ Necrose no 1/3 superior da derme ++ Necrose em toda a derme

+++ Necrose até o tecido subcutâneo

O processo inflamatório e a angiogênese foram analisados em função da

coloração por HE, enquanto que, para o estudo da fibrose colagênica e da proliferação

fibroblástica, foram consideradas as três colorações.

O processo inflamatório foi avaliado com relação ao grau de comprometimento

do espécime, adotando-se:

PROCESSO INFLAMATÓRIO

+ Inflamação no 1/3 superior da derme ++ Inflamação em 2/3 do espécime

+++ Inflamação em todo o espécime

A angiogênese foi determinada levando-se em consideração o calibre dos vasos

e a disposição dos mesmos no espécime. Isso possibilitou a seguinte identificação:

ANGIOGÊNESE

+ Presença de vasos capilares de paredes finas, com uma ou duas células endoteliais, localizados na derme superficial da área ulcerada e nas margens da úlcera

++ Presença de vasos capilares com uma espessura duas vezes maior que o anterior; endotélio tumefeito e neovascularização estendendo-se até 2/3 do espécime

+++ Vasos de paredes espessas, bem constituídos, endotélio tumefeito, presente em todo o espécime

Na fibrose colagênica, considerou-se a presença, espessura e distribuição das

fibras de colágeno no espécime, atribuindo-se:

FIBROSE COLAGÊNICA

+ Fibras colágenas delicadas e ocasionais

++ Fibras colágenas delicadas e espessas, ocasionais

+++ Fibras colágenas espessas, caracterizando cicatriz

33

A proliferação fibroblástica foi avaliada obedecendo-se os seguintes aspectos:

PROLIFERAÇÃO FIBROBLÁSTICA

+ Ocasionais fibroblastos. Predomínio das alterações inflamatórias celulares agudas

++ Fibroblastos e células inflamatórias em igual proporção

+++ Predomínio fibroblástico em todo o espécime

4.8.3 Análise Quantitativa

A análise histomorfométrica das células inflamatórias: neutrófilos, linfócitos e

plasmócitos foi realizada a partir da contagem de sete campos de grande aumento por

espécime (aumento 400X). O número de células em cada campo foi contado e a média

dos campos foi calculada.

4.9 AVALIAÇÕES HEMATOLÓGICAS E BIOQUÍMICAS

Para averiguar possíveis alterações hematológicas, hepáticas e renais em função

da aplicação da glucana por via tópica, os pacientes foram submetidos a coletas de 15

mL de sangue por punção venosa. Foram realizadas duas coletas: a primeira antes de

iniciada a terapia com glucana e a segunda no trigésimo dia de tratamento. A avaliação

laboratorial consistiu dos seguintes exames: hemograma, velocidade de sedimentação

das hemácias (VSH), glicemia de jejum, alanina aminotransferase (ALT), aspartato

aminotransferase (AST), gamaglutamiltransferase (GGT), proteínas totais, albumina,

uréia e creatinina. Os exames foram realizados no Laboratório Integrado de Análises

Clínicas (LIAC) da Faculdade de Farmácia/UFRN.

A determinação dos parâmetros hematológicos foi efetuada com auxílio do

contador automático de células HORIBA ABX Micros 60 OS e a contagem diferencial

dos leucócitos em microscópio óptico binocular Olympus CX31. Para a realização do

VSH, utilizou-se o método de Wintrobe e para as dosagens bioquímicas, os kits

Labtest® (seguindo-se as especificações do fabricante). Foram adotados métodos

colorimétricos para a determinação da glicemia de jejum, proteínas totais, albumina e

uréia e métodos cinéticos para a creatinina, ALT, AST e GGT.

34

4.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA

Os dados obtidos foram analisados empregando-se a estatística descritiva e o

teste não paramétrico de Wilcoxon, este último foi aplicado na mensuração das áreas

das úlceras e na análise histomorfométrica das células inflamatórias. O nível de

significância estabelecido foi de 5% (p-valor < 0,05).

58

7 CONCLUSÃO________________________________________________________

- Uma homoglucana linear insolúvel com ligações glicosídicas do tipo β-(1→3) foi

isolada partir do Saccharomyces cerevisiae;

- Foi observado ativação da resposta inflamatória cicatricial com aumento do número de

neutrófilos, linfócitos e plasmócitos, sendo estatisticamente significativo o aumento do

número de plasmócitos;

- As modificações histológicas evidenciadas na angiogênese e na fibrose colagênica

estavam relacionadas com as distintas fases do processo de cicatrização;

- Foi verificado aumento da proliferação de fibroblastos após tratamento com a β-(1→3)

glucana;

- Não foram observadas, por intermédio da avaliação laboratorial realizada, alterações

hematológicas, hepáticas e renais decorrentes da aplicação da β-(1→3) glucana

insolúvel por via tópica;

- A β-(1→3) glucana insolúvel por via tópica foi capaz de promover alterações no

processo de cicatrização das úlceras venosas tratadas.

59

REFERÊNCIAS______________________________________________________

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diagnosis and treatment. International Journal Dermatology, v. 44, p. 449-456, 2005.

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65

APÊNDICES

66

APÊNDICE 1

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (TCLE)

Este é um convite para você participar da pesquisa intitulada “Imunoterapia de

Feridas Complexas com ββββ-1,3 Glucana”, coordenada pela Profa. Dra. Valéria Soraya

de Farias Sales tendo a participação da farmacêutica-bioquímica e mestranda Sarah

Dantas Viana Medeiros.

Sua participação na pesquisa é voluntária, o que significa que você poderá

desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga

nenhum prejuízo ou penalidade.

Essa pesquisa tem por objetivo estudar a ação de uma substância denominada

glucana por via tópica (local) nas feridas de sua pele, visto que ela poderá auxiliar no

processo de cicatrização do seu ferimento. Caso decida aceitar o convite, você será

submetido (a) aos seguintes procedimentos:

1) Coleta de sangue em veia periférica no braço ou antebraço por profissionais

experientes, com auxílio de seringa e agulha descartáveis. Antes da coleta será realizada

anti-sepsia (limpeza) no local da punção com álcool a 70% e algodão. O sangue será

coletado rapidamente até o volume de 10 mL e o desconforto da coleta será mínimo.

Eventualmente uma pequena mancha roxa pode se formar no local da punção. O sangue

coletado será utilizado para realização de exames hematológicos (hemograma e VSH),

bioquímicos (dosagem de glicose, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase,

gamaglutamiltransferase, uréia, creatinina, proteínas totais e albumina) e que lhe serão

entregues depois de realizados. Essas coletas serão necessárias antes de iniciar a terapia

proposta e no trigésimo dia do seguimento terapêutico.

2) Retirada de um pequeno fragmento (biópsia) da ferida por médico cirurgião

pertencente à equipe com auxílio de lâmina de bisturi para estudo histopatológico e

realização da imunohistoquímica. Tal procedimento será realizado antes do início da

terapia e no 30º dia, sob anestesia local. Como o fragmento a ser retirado é muito

pequeno, não impossibilitará a realização de suas atividades.

67

3) Semanalmente a (s) feridas (s) serão fotografadas e com auxílio de uma folha

plástica estéril e lápis para retroprojetor, serão contornadas.

Os riscos envolvidos com sua participação são: mancha roxa (hematoma) no

local da coleta de sangue (punção), pequeno sangramento quando da realização da

retirada do fragmento da ferida (biópsia) e prurido (coceira). Tais riscos serão

minimizados através das seguintes providências: compressão e curativo no local de

retirada do fragmento e, se necessário, uso de anti-histamínico para a coceira.

Você terá os seguintes benefícios ao participar da pesquisa: possibilidade de

utilização de uma nova terapia para auxiliar no processo de cicatrização da sua ferida.

Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em

nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos

resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.

Não há despesas pessoais para o participante em qualquer fase do estudo.

Também não há compensação financeira relacionada com a sua participação. Em caso

de dano pessoal, diretamente causado pelos procedimentos propostos neste estudo (nexo

causal comprovado), você tem direito a tratamento médico na instituição, bem como às

indenizações legalmente estabelecidas.

Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a

respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para o responsável Profa. Dra.

Valéria Soraya de Farias Sales ou à mestranda Sarah Dantas Viana Medeiros, no

endereço: Rua Gal. Gustavo Cordeiro de Farias S/N Petrópolis – Natal/RN (2º andar da

Faculadade de Farmácia – Laboratório de Imunologia Clínica) ou pelo telefone: 3215-

4230.

Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê

de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Onofre Lopes (CEP/HUOL) no

endereço: Av. Nilo Peçanha, 620 – Petrópolis – Natal /RN ou pelo telefone: 3202-3719.

E-mail: [email protected] Consentimento Livre e Esclarecido Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e

benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa

“Imunoterapia de Feridas Complexas com ββββ-1,3 Glucana”.

68

Participante da Pesquisa:

Nome: _____________________________________________________________

Assinatura: _________________________________________________________

Pesquisador Responsável: Valéria Soraya de Farias Sales

Assinatura: __________________________________________

Endereço Profissional: Rua Gal. Gustavo Cordeiro de Farias S/N Petrópolis – Natal/RN

(2º andar da Faculadade de Farmácia – Laboratório de Imunologia Clínica).

Telefone: 3215-4230

Mestranda: Sarah Dantas Viana Medeiros

Assinatura: _____________________________________________

Comitê de Ética em Pesquisa – CEP/HUOL

Endereço: Av. Nilo Peçanha, 620 – Petrópolis – Natal /RN

Telefone: 3202-3719 ramal: 242

Natal, ______/_______/________.

69

APÊNDICE 2

INSTRUMENTO DE AVALIAÇÃO DO PORTADOR DE ÚLCERA VENO SA

DATA _____/_____/_____

IDENTIFICAÇÃO E PERFIL SÓCIO-ECONÔMICO

Nome: .............................................................................................. Nº Registro: .............

Sexo: ............ Data de Nascimento: ............/............../........... Estado Civil: .....................

Nº de Filhos: ............... Religião: ................................ Naturalidade: ............................

Escolaridade: ................................................. Profissão: ...............................................

Vínculo Empregatício: .......................................... Ocupação Atual: .................................

Renda Familiar: .................................................

HÁBITOS PESSOAIS

Etilismo: ( ) Nunca Bebeu ( ) Parou de Beber Há quanto tempo? ( ) Sim,

Tempo?

Tabagismo: ( ) Não ( ) Sim Nº de cigarros/dia: _______ Tempo de tabagismo:

EXAME GERAL

Antecedentes Pessoais Patológicos

Diabetes Mellitus:_______ anos Hipertensão Arterial: ________ anos

Outras Doenças: ...............................................................................................................

Medicamentos em Uso (Indicação/Duração do Tratamento/Posologia):

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

Exames Laboratoriais Anteriores (Tipo/Resultado):

______________________________________________________________________

______________________________________________________________________

70

EXAME DA FERIDA

Tipo da Ferida: _____________________ Tempo de Existência: ______________

Trauma Prévio: _________________ Número de Lesões: _______________

Recidiva: ( ) Não ( ) Sim, Quantas Vezes: __________

Tempo Aproximado de Cicatrização: __________________

Localização: ____________________________________

Leito da Ferida: ( ) Necrose ( ) Granulação ( ) Epitelização

Pele Circunvizinha: ( ) Saudável ( ) Bolhoso ( ) Ressecado ( ) Macerado

( ) Necrose ( ) Calor e rubor

Presença de Exsudato: ( ) Não ( ) Sim

Tipo de Exsudato: ( ) Seroso ( ) Sero-sanguinolento

( ) Sanguinolento ( ) Purulento

Odor: ( ) Ausente ( ) Discreto ( ) Acentuado

Dor: ( ) Ausente ( ) Leve ( ) Moderada ( ) Intensa

Sinais de Infecção: ( ) Calor ( ) Eritema ( ) Edema ( ) Dor

( ) Pus ( ) Linfadenopatia ( ) Linfagite

Sinais e Sintomas Locais

( ) Hiperpigmentação ( ) Claudicação

( ) Lipodermatosclerose ( ) Ausência de Pelos ( ) Edema

( ) Cianose ( ) Varizes ( ) Anidrose ( ) Rachaduras

( ) Sinais de Eczema ( ) Diminuição da Sensibilidade

( ) Deformidades ( ) Prurido ( ) Rubor à elevação

( ) Tegumento atrófico ( ) Palidez à elevação ( ) Dor ao descanço

( ) Ausência de pulso Outros: ........................................................

Área: Transparência: .............................

71

APÊNDICE 3

COLORAÇÕES HISTOLÓGICAS

HEMATOXILINA/EOSINA

1- Desparafinizar – Xilol – 03 cubas - 05 minutos cada

2- Alcoolizar – Álcool Etílico absoluto – 04 cubas - 02 minutos cada

3- Hidratar – Água Corrente – 03 minutos

4- Hematoxilina – 05 a 10 minutos

5- Água Corrente - 02 minutos

6- Diferenciar com Álcool Ácido e Lavar em Água Corrente

7- Solução Saturada de Carbonato de Lítio - 03 mergulhos

8- Lavar em Água Corrente

9- Eosina – 05 minutos

10- Desidratar – Álcool Etílico Absoluto – 4 cubas – 10 mergulhos

11- Xilol, Clarificar – 03 Cubas - 10 mergulhos

12- Montar – Lamínula e Bálsamo do Canadá.

RESULTADOS: Núcleo: Coloração Azul

Citoplasma, Fibras Colágenas, Elásticas e Neurofibrilas : Coloração Rosa a Vermelho

Hemácias: Coloração Vermelho

Fundo: Coloração Rosa Pálido

MÉTODO TRICRÔMICO DE MASSON

TECIDO CONJUNTIVO

FIXADOR: FORMALINA NEUTRA 10%

CORTES: PARAFINA

PROCEDIMENTO TÉCNICO

1-Desparafinizar e hidratar,

2-Lavar com água destilada,

3-Solução de hematoxilina de Harris – 30 segundos,

72

4-Lavar em água corrente por 10 minutos e lavar em água destilada,

5-Solução de fuccina ácida – Escarlate Briebrich - 10 minutos,

6-Lavar em água destilada,

7-Solução de ácido fosfomolíbdico-fosfotúngstico - 10 minutos

8-Lavar em água destilada,

9-Solução de azul de anilina - 5 minutos,

10- Lavar em água destilada,

11-Solução de ácido acético 1% - 3 minutos,

12- Lavar em água corrente,

13-Desidratar, clarear e montar.

RESULTADOS:

NÚCLEO.................. negro

MÚSCULO, CITOPLASMA E QUERATINA......vermelho

COLÁGENO.............azul

MÉTODO PICROSIRUIS RED

PROCEDIMENTO TÉCNICO

1-Desparafinizar e hidratar,

2-Solução picrosirius – 1 hora,

3- Lavar em água corrente por 5 minutos,

4-Hematoxilina – 1 minuto,

5- Lavar em água corrente por 10 minutos,

6-Desidratar, clarear e montar.

RESULTADOS:

COLÁGENO.............vermelho

73

APÊNDICE 4

Tabela 6: Área e o percentual de redução das úlceras venosas por período de segmento terapêutico

TEMPO DE TRATAMENTO dia 0 dia 30 Redução Redução dia 0 dia 60 Redução Redução

ÚLCERA Área cm2 Área cm2 Absoluta Percentual Área cm2 Área cm2 Absoluta Percentual

1 51,49 58,02 -6,53 -12,68 51,49 57,71 -6,22 -12,08

2 18,98 18,83 0,15 0,79 18,98 19,72 -0,74 -3,90

3 13,26 10,39 2,87 21,64 13,26 23,74 -10,48 -79,03

4 16,48 16 0,48 2,91 16,48 11,2 5,28 32,04

5 27,3 25,62 1,68 6,15 27,3 15,87 11,43 41,87

6 10,61 10,78 -0,17 -1,60 10,61 12,97 -2,36 -22,24

7 14,96 7,4 7,56 50,53 14,96 6,99 7,97 53,28

8 8,38 4,84 3,54 42,24 8,38 2,92 5,46 65,16

9 16,34 7,23 9,11 55,75 16,34 3,69 12,65 77,42

10 40,5 50,35 -9,85 -24,32 40,5 57,26 -16,76 -41,38

11 66,89 50,97 15,92 23,80 66,89 37,39 29,50 44,10

12 52,33 46,56 5,77 11,03 52,33 40,42 11,91 22,76

13 20,12 26,06 -5,94 -29,52 20,12 43,82 -23,70 -117,79

MÉDIA 27,51 25,62 1,89 11,29 27,51 25,67 1,84 4,63

74

Tabela 6: Área e o percentual de redução das úlceras venosas por período de segmento terapêutico (CONTINUAÇÃO)

TEMPO DE TRATAMENTO dia 0 dia 90 Redução Redução dia 0 dia 120 Redução Redução

ÚLCERA Área cm2 Área cm2 Absoluta Percentual Área cm2 Área cm2 Absoluta Percentual

1 51,49 - - - 51,49 - - -

2 18,98 - - - 18,98 - - -

3 13,26 - - - 13,26 - - -

4 16,48 10,21 6,27 38,05 16,48 - - -

5 27,30 8,78 18,52 67,84 27,3 5,27 22,03 80,70

6 10,61 - - - 10,61 - - -

7 14,96 5,89 9,07 60,63 14,96 - - -

8 8,38 0 8,38 100,00 8,38 - - -

9 16,34 2,08 14,26 87,27 16,34 - - -

10 40,50 41,42 -0,92 -2,27 40,5 - - -

11 66,89 27,95 38,94 58,21 66,89 - - -

12 52,33 35,53 16,8 32,10 52,33 - - -

13 20,12 - - - 20,12 - - -

MÉDIA 27,51 16,48 13,915 55,23 27,51 5,27 22,24 80,84

75

APÊNDICE 5

ÚLCERA Nº 1

Figura 1: Úlcera Venosa Pré-Tratamento

Figura 2: Úlcera Venosa (dia 30)

b


76

ÚLCERA Nº 2




77

ÚLCERA Nº 3




78

ÚLCERA Nº4

Figura 10: Úlcera Venosa Pré-Tratamento Figura 11: Úlcera Venosa (dia 30)

Figura 12: Úlcera Venosa (dia 60) Figura 13: Úlcera Venosa (dia 90)

79

ÚLCERA Nº 5




80

ÚLCERA Nº 6




81

ÚLCERA Nº 7





82

ÚLCERA Nº 8



83

ÚLCERA Nº 9




84

ÚLCERA Nº 10




85

ÚLCERA Nº 11




86

ÚLCERA Nº 12

Figura 42: Úlcera Venosa Pré-Tratamento Figura 43: Úlcera Venosa Pré-Tratamento (maléolo lateral) (maléolo medial)

Figura 44: Úlcera Venosa (dia 30) Figura 45: Úlcera Venosa (dia 30) (maléolo lateral) (maléolo medial)

Figura 46: Úlcera Venosa (dia 60) Figura 47: Úlcera Venosa (dia 60) (maléolo lateral) (maléolo medial)

87

ÚLCERA Nº 12

(continuação)

Figura 48: Úlcera Venosa (dia 90) (maléolo lateral)

Figura 49: Úlcera Venosa (dia 90) (maléolo medial)

88

ÚLCERA Nº 13




89

APÊNDICE 6

VALORES DE REFERÊNCIA DOS EXAMES LABORATORIAIS REALIZADOS

HEMOGRAMA

Hematócrito: Homem: 41 a 53%; Mulher: 35 a 46%

Hemoglobina: Homem: 13,5 a 17,5 g/dL; Mulher: 12,0 a 16,0 g/dL

Hemácias: Homem: 4,5 a 5,9 milhões/mm3; Mulher: 4,0 a 5,0 milhões/mm3

Leucócitos: 4000 a 11000/mm3

Bastões: 0 a 550/mm3

Segmentados: 1600 a 7000/ mm3

Linfócitos: 1000 a 4000/mm3

Monócitos: 200 a 800/mm3

Eosinófilos: 40 a 550/mm3

Contagem de Plaquetas: 150 a 400 mil/mm3

VSH: Homem - 0 a 15 mm; Mulher – 0 a 20 mm

DOSAGENS BIOQUÍMICAS

Glicemia de Jejum: 70 a 99 mg/dL

Uréia: 15 a 40 mg/dL

Creatinina: 0,4 a 1,4 mg/dL

AST: Homem - 11 a 39 U/L; Mulher – 10 a 37 U/L

ALT: Homem - 11 a 39 U/L; Mulher – 10 a 37 U/L

GAMA GT: Homem - 7 a 58 U/L; Mulher – 5 a 39 U/L

Proteínas Totais: 6,0 a 8,0 g/dL

Albumina: 3,5 a 5,5 g/dL

90

ANEXO

91

ANEXO 1

CERTIFICADO DE APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQ UISA

IMUNOTERAPIA DE ÚLCERAS VENOSAS COM ββββ-(1 3) … · Enfermagem. À enfermeira Maria do Ó de...

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