1

CURS BIOLOGIE MOLECULARĂ

Reglarea Iniţierii Transcripţiei

Prof. Dr. Marieta Costache

2

Controlul genetic la bacterii: modelul Jacob-Monod

3

Model experimental pentru evidenţierea

secvenţelor care acţionează în cis

IPTG is a common

abbreviation for

Isopropyl β-D-1-

thiogalactopyranoside

4

Model experimental pentru evidenţierea

secvenţelor care acţionează în trans

5

Inducerea operonului lac conduce la creşterea sintezei

ARNm lac

6

Concluzii

Multe proteine bacteriene sunt inductibile, sinteza lor fiind dependentă de

statusul nutriţional al celulelor. Expresia diferenţială a genelor care codifică astfel

de proteine apare cel mai adesea la nivelul iniţierii transcripţiei;

În concordanţă cu modelul Jacob şi Monod privind controlul

transcripţiei, transcripţia operonului lac, care codifică trei proteine inductibile este

represată de legarea proteinei represoare lac la secvenţa operator. În absenţa

lactozei sau a altor inductori represia este înlăturată şi operonul lac este transcris;

Mutaţiile la nivelul promotorului, la care se leagă ARN polimeraza, sau la

nivelul operatorului acţionează în cis; aceasta înseamnă că ele afectează numai

expresia genelor de pe aceeaşi moleculă de ADN în care apare mutaţia;

Mutaţiile în secvenţa unui operator care scad legarea unui represor au

drept rezultat o transcripţie constitutivă. Mutaţiile în secvenţa promotorului, care

afectează afinitatea de legarea a ARN polimerazei, pot fie să scadă (mutaţie

“down”) fie să crească (mutaţie “up”) transcripţia;

Represorii şi activatorii acţionează în trans; ei afectează expresia genelor

reglate de ei indiferent de poziţionarea moleculei de ADN în celulă.

7

Inţierea transcripţiei la bacterii

ARN polimeraza iniţiază transcripţia majorităţii genelor la

nivelul unei poziţii unice situată în amonte de secvenţa codantă;

Perechea de baze la nivelul căreia se iniţiază transcripţia este

denumită “situs de iniţiere a transcripţiei” sau Punct START;

Prin convenţie, situl de iniţiere a transcripţiei de pe secvenţa

ADN este desemnată cu poziţia +1, bazele situate în sensul transcripţiei

(downstream) sunt desemnate cu numere pozitive iar cele poziţionate în

sens opus (upstream) sunt asimilate cu numere negative;

Diferitele proteine (ARN polimeraze, activatori, represori)

interacţionează cu ADN la nivelul promotorului sau în vecinătatea

acestuia pentru a regla iniţierea transcripţiei

8

Interacţiunile proteine-ADN identificate prin

tehnica “footprinting”

9

Identificarea interacţiilor proteine-ADN prin

tehnica “gel-shift assays”

10

Evidenţierea poziţionării ARN

polimerazei la nivelul regiunii

control a represorului lac prin

tehnica “footprint”

11

Regiunea control a operonului lac conţine 3 situri

critice “cis-acting”

12

ARN polimeraza se fixează specific la nivelul

secvenţelor promotorului pentru a iniţia transcripţia

Fiecare subunitate are o funcţie specifică

13

Diferenţele de la nivelul secvenţelor promotorului E. coli

afectează frecvenţa iniţierii transcripţiei

14

Majoritatea secvenţelor operator sunt scurte

repetiţii inversate

Operatorul lac

15

Majoritatea represorilor bacterieni sunt structuri

dimere care conţin elice care se inserează în fosele

majore adiacente ale ADN

16

Modificările conformaţionale induse de liganzi

modifică afinitatea multor represori pentru ADN

Legarea triptofanului induce o

modificare conformaţională la

nivelul aporepresorului pentru

triptofan

17

Controlul pozitiv al

operonului lac este

exercitat de către

cAMP-CAP

CAP = catabolite

activator protein

18

Legarea cooperativă a cAMP-CAP şi a ARN polimerazei

la regiunea de control a lac activează transcripţia

19

Model de legare a cAMP-CAP la secvenţa

promotoare lac promoter

20

Transcripţia de la nivelul unor promotori este

iniţiată de factorii sigma () alternativi

21

Activarea subunităţii 54 a

ARN polimerazei la nivelul

promotorului glnA de către

NtrC

22

Vizualizarea buclei

ADN şi a

interacţiilor legării

NtrC şi subunităţii

54 a polimerazei

23

Multe răspunsuri

bacteriene sunt

controlate de sisteme

reglatoare bi-

componente

Sistemul bi-component

de reglare PhoR/PhoB

la E. coli

24

Concluzii (I)

ARN polimerazele sunt proteine mari compuse din subunităţi beta, beta’ şi două subunităţi alfa care formează “core” polimeraza şi o subunitate sigma, din câteva alternative, care funcţionează ca factor de iniţiere; Iniţierea începe când subunitatea sigma a moleculei de polimerază se leagă la secvenţa promotor, formând un complex unit. Polimeraza separă apoi catenele pe o distanţă de 12-13 pb la nivelul situsului de start a transcripţiei, formând un complex deschis. După ce aproximativ 10 ribonucleotide au fost polimerizate, subunitatea sigma este eliberată şi “core” polimeraza continuă transcripţia matriţei; “Puterea” unui promotor se referă la cât de frecvent ARN polimeraza iniţiază transcripţia pornind de la acesta. Subunitatea sigma70, factorul major în iniţiere la E. Coli, interacţionează cu secvenţele promotor situate în regiunea –10 la –35 faţă de situsul de start; Represorii se leagă la secvenţele de ADN numite operatori, care se suprapun parţial cu regiunea promotoare la nivelul căreia se leagă ARN polimeraza. Legarea represorului interferă cu legarea ARN polimerazei şi cu iniţierea transcripţiei; Activatorii subunităţii sigma70 a ARN polimerazei se leagă, în general, la ADN pe partea opusă a helixului faţă de polimerază, în regiunea –20 la –50, sau chiar în amonte de polimerază, în apropierea –60;

25

Concluzii (II)

Activatorul cAMP-CAP stimulează transcripţia prin formarea unui complex cu ARN polimeraza care prezintă o mai mare afinitate pentru situsuri ADN specifice decât proteinele individuale. În plus faţă de stimularea legării polimerazei, activatorii pot stimula şi formarea complexului deschis şi începerea transcripţiei; Mulţi represori bacterieni sunt dimeri. Fiecare monomer conţine un alfa-helix care se inserează în fosa majoră a operatorului ADN, astfel încât dimerul se leagă la fose majore succesive. Afinitatea mare de legare este rezultatul formării multor legături de hidrogen, ionice şi van der Waals dintre proteine şi secvenţe ADN specifice; Secvenţele de ADN care leagă proteinele reglatoare dimere sunt secvenţe repetitive inverse, care reprezintă fiecare jumătaţi de situsuri care leagă un monomer; Operonii transcrişi de către subunitatea sigma54 sunt reglati prin activatori care se leagă la secvenţe “enhancer” situate la aproximativ 100 pb în amonte de situsul de iniţiere. Secvenţele “enhancer” care leagă activatori interacţionează tranzitoriu cu polimeraza echilibrată legată la nivelul promotorului, stimulând formarea unui complex deschis şi iniţierea transcripţiei; În sistemele bi-componente reglatoare, o proteină acţionează ca un senzor, monitorizând nivelul de nutrienţi din mediu. În condiţii adecvate, proteina senzor activează o a doua proteină, reglatorul răspunsului, care se leagă apoi la secvenţele reglatoare, stimulând sau represând astfel transcripţia genelor specifice.

26

Controlul genelor eucariote: scop şi principii

generale

Spre deosebire de celulele bacteriene şi eucariotele

unicelulare, celulele organismelor pluricelulare au relativ

puţine gene reglate reversibil de condiţiile de mediu;

Controlul genetic al organismelor pluricelulare este

important pentru dezvoltare şi diferenţiere şi,

În general, nu este reversibil.

27

La eucariotele superioare reglarea multor gene se

realizează prin controlul transcripţiei

Estimarea catenei în formare

(run-on) permite măsurarea

“ratei” de transcripţie a unei

anumite gene

28

Sinteza diferenţiată a 12

molecule ARNm codificate

specific de gene hepatice

29

Analiza ADN

microarray

Analizele ADN microarray ofera o vedere globala asupra

modificarilor in procesul de transcriptie, de exemplu, ca

urmare a aduagarii de SFV (ser fetal) la celulrele umane in

cultura.

Serul contine factori de crestere care stimuleaza celulele in faza

stationara catre crestere si diviziune. Prin analiza ADN

microarray se pot detecta factorii de trasncriptie relative ai

genelor in doua populatii celulare in cultura. (figura). Aceasta

analiza consta in spot-uri foarte fine de ADN atasate pe o lama

de microscop sau pe alt support. Fiecare spot consta in mai

multe copii de secvente ADN dintr-o singura gena umana. Se

realizeaza doua preparate ARN: i) un preparat de ARN, care

contine toate tipurile de ARN provenind de la celulele

stationare care au fost cultivate in fara ser care este marcat cu

molecule fluorescente verzi; ii) un preparat de ARN care

contine toate tipurile de ARN de la celulele in crestere si

diviziune cultivate pe mediu cu SFV si marcate fluorescent in

rosu. Cele doua preparate sunt amestecate si hibridizate pe

lama, unde acestea se vor imperechea cu secventele genelor lor

corespunzatoare. Spoturile verzi (ex, spot 3) indica genele care

sunt transcrise in celulele nedivizate crescute in lipsa de ser.

Spoturile rosii (ex. spot 4) indica genele care sunt transcrise in

celulele in diviziune, iar spoturile galbene (ex. spot 1 si 2)

indica genele care sunt transcrise in cele doua tipuri celulare

(stationare si in diviziune) [From V. R. Iyer et al., 1999, Science

283:83.

30

Elementele reglatoare la eucariote

Reprezintă adesea mii de kilobaze în amonte sau în aval de

START;

Principiile de bază care controlează transcripţia la bacterii există şi

la eucariote: transcripţia este iniţiată la nivelul unei regiuni specifice şi este

controlată de legarea proteinelor “trans-activatoare” (factori de

transcripţie) la secvenţele “cis-activatoare” din structura ADN;

Elementele “cis-activatoare” sunt adesea mult mai departe de

promotorul pe care îl reglează, transcripţia la nivelul unui singur promotor

poate fi reglată prin legarea mai multor factori de transcripţie la

elementele de control alternative;

Secvenţele care controlează transcripţia pot fi identificate prin

analize de deleţie în serie la capătul 5’.

31

*Secvenţele promotoare ale mai multor gene

structurale eucariote

32

Construcţia şi analiza deleţiilor seriate în 5’

33

Sinteza moleculelor de ARN este catalizată de 3

polimeraze

I: pre-ARNr

II: ARNm

III: ARNt, ARNr 5S,

ARN cu stabilitate scăzută

34

*Structura ARN polimerazelor eucariote

determinată prin cristalografie electronică

35

Comparaţie: subunităţile

structurale ale ARN

polimerazelor de la

drojdii şi de la E. coli

36

Cea mai mare subunitate a ARN polimerazei II

conţine o repetiţie esenţială carboxi-terminală care

este fosforilată în timpul transcripţiei

Repetiţie = Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser

37

Analiza transcripţilor

marcaţi în formare

permite cartarea situsului

de iniţiere a transcripţiei

38

ARN polimeraza II iniţiază transcripţia secvenţelor ADN

corespuntătoare capătului 5 al ARNm

39

Concluzii

Principalul scop al controlului genetic în organismele multicelulare este realizarea deciziilor precise de dezvoltare astfel încât gene particulare sunt exprimate în celule particulare în timpul dezvoltării şi diferenţierii celulare; Controlul transcripţional este principalul sens al reglării expresiei genice atât la eucariote cât şi la procariote; În genoamele eucariote, elementele de control care acţionează în cis şi care reglează expresia de la nivelul promotorului sunt adesea localizate la multe kb depărtare de situsul de start. În contrast, elementele de control bacterian sunt dispuse, în general, pe o distanţă de 60 pb faţă de promotorul pe care aceştia îl reglează; Eucariotele conţin trei tipuri de ARN polimeraze nucleare. Toate trei conţin două subunităţi mari şi două subunităţi mici care constituie structura centrală omologă cu subunităţile , ’ şi ale ARN polimerazei de la E. Coli, cât şi numeroase subunităţi mai mici adiţionale. Unele dintre aceste subunităţi mici sunt comune iar altele sunt unice pentru fiecare polimerază; ARN polimeraza I sintetizează numai pre-ARNr, ARN polimeraza II sintetizează ARNm şi unele molecule mici de ARN nuclear care participă la splicingul ARNm iar ARN polimeraza III sintetizează ARNt, ARNr 5S şi multe alte molecule relativ scurte şi stabile de ARN. O secvenţă heptapeptidică, domeniul carboxi-terminal (CTD), din subunitatea cea mai mare a ARN polimerazei II este fosforilată în timpul iniţierii şi rămâne fosforilată cât timp enzima transcrie matriţa; Similară cu ARN polimerazele bacteriene, ARN polimeraza II iniţiază, de obicei, transcripţia genelor la nivelul unor perechi de baze specifice sau baze vecine alternative din ADN matriţă. Nucleotidul din 5’ căruia i se adaugă capişonul la nivelul ARNm corespunde nucleotidului de pe catena matriţă la care transcripţia este iniţiată.

40

TATA box este cel mai bine conservat promotor

la eucariote

Promotorii alternativi de la eucariote includ iniţiatori şi insule CpG

41

Identificarea elementelor de control

transcripţional cu “linker mutants”

42

Elementele din proximitatea promotorului pot

interveni în reglarea genelor eucariote

43

Transcripţia catalizată de ARN polimeraza II este adesea

stimulată de secvenţe “enhancer” depărtate

Identificarea regiunii

“enhancer” a SV40

44

Majoritatea genelor eucariote sunt reglate prin mai

multe mecanisme de control

45

Concluzii

Expresia genelor eucariote care codifică pentru proteine este reglată prin

intervenţia unor elemente multiple care acţionează sub forma unor regiuni de

control în cis. Unele elemente de control sunt localizate în apropierea situsului de

start (elemente din proximitatea promotorului), în timp ce altele sunt localizate la

distanţă (activatori sau “enhanceri”);

Promotorii determină situsul de iniţiere a transcripţiei şi legarea directă a

ARN polimerazei II. Au fost identificate trei tipuri de secvenţe promotor pentru

ADN de la eucariote. TATA box, tipul cel mai comun este dominant pentru genele

transcrise rapid. Promotorii de tip iniţiator sunt reprezentaţi cu o frecvenţă

scăzută în anumite gene în timp ce insulele CpG sunt caracteristice genelor

transcrise;

Elementele din proximitatea promotorului sunt localizate într-un interval

de 200 pb faţă de situsul de start. Multe astfel de elemente, conţinând mai puţin de

20 pb, pot fi utile în reglarea unei gene particulare;

Activatorii, care au de obicei o lungime de aproximativ 100-200 pb, conţin

mai multe elemente control de 8 la 20 pb. Acestea pot fi localizate de la 200 pb la

10 kb în amonte sau în aval de promoter, în interiorul unui intron, sau în aval de

exonul final al genei;

Elementele din proximitatea promotorului şi activatorii sunt adesea

specifici unui tip celular, funcţionând numai tipuri celulare diferenţiate specific.

46

Factorii implicaţi în transcripţie sunt identificaţi prin

tehnici biochimice

47

Determinarea “in vitro” a activităţii

factorilor de transcripţie

48

Identificarea genetică a genelor

care codifică pentru factori de

transcripţie

Ex: serii de mutanţi Gal4

purtători de deleţii-

demonstrează că factorii

de transcripţie sunt

compuşi din domenii

separate de legare şi de

activare

49

Activatorii transcripţionali sunt proteine modulare

compuse din domenii funcţionale distincte

50

Domeniile de legare la ADN pot fi clasificate în

mai multe tipuri structurale

Proteine care conţin homeodomenii

Proteine “Zinc-finger”

Proteine “Winged-helix (forkhead)”

Proteine “Leucine-zipper”

Proteine “Helix-loop-helix”

51

Homeodomeniile

proteinei “engrailed”

care interacţionează cu

domeniile specifice din

structura ADN

52

*Interacţia ADN-Proteine

Modelul ”helix-turn-helix” (HTH)

Dimerul CAP-AMPc

53

*Interacţia ADN-Proteine

Modelul HTH (represorul 434 al bacteriofagullui P22)

54

*Interacţia ADN -

Proteine

Modelul HTH (represorul TRp de la E. Coli)

55

Interacţiile domeniilor C2H2 şi C4 “zinc-finger” cu ADN

56

Interacţia dintre proteina

C6 “zinc-finger”(Gal4) şi

ADN

57

Interacţia proteinei homodimere “leucine-zipper” şi

ADN

58

Interacţia proteinei homodimere “helix-loop-helix” şi

ADN

59

Factorii transcripţionali heterodimeri cresc opţiunile

controlului genetic

60

Domeniile de activare manifestă o considerabilă

diversitate structurală

61

Complexele multiproteice acţionează la nivelul

“enhancer”-ilor

62

Mulţi represori interacţionează cu activatorii

Transcripţia de la eucariote este reglată de represori

cât şi de activatori ;

Situsurile de legare a represorilor pot fi

identificate şi represorii purificaţi prin aceleaşi tehnici folosite

pentru activatori;

Mulţi represori din sistemele eucariote posedă două

domenii: un domeniu de legare a ADN şi un domeniu represor.

63

Concluzii Factorii de transcripţie, care stimulează sau reprimă transcripţia, se leagă la elemente situate în proximitatea promotorului şi la “enhancers”(activatori) din structura ADN la eucariote;

Activatorii sunt în general proteine modulare, care conţin un singur domeniu de legare şi unul sau mai multe domenii activatoare; diferitele domenii sunt adesea legate prin regiuni polipeptidice flexibile. Acestea permit domeniilor diferiţilor activatori să interacţioneze chiar şi când domeniile de legare la ADN recunosc situsuri separate de zeci de perechi de baze;

Activatorii conţin, în general, mai multe situsuri de legare pentru factorii de transcripţie

grupate sub formă de clustere. Legarea cooperativă a mai multor activatori la situsuri învecinate din structura unui element activator formează un complex multi-proteic numit “complex activator”. Asamblarea acestuia necesită adesea proteine mici care se lreagă la fosa minoră a ADN şi determină curbarea rapidă a secventei permitând proteinelor de pe fiecare parte a curburii să interacţioneze mult mai bine;

Majoritatea represorilor de la eucariote sunt proteine modulare. Similar cu activatorii, aceştia conţin de obicei un singur domeniu de legare şi unul sau mai multe domenii represoare, şi pot controla transcripţia când sunt legaţi la situsuri situate la sute sau mii de baze faţă de situsul de start;

Domeniile de legare la ADN ale factorilor de transcripţie de la eucariote exprimă o varietate de structuri. Printre cele mai comune motive structurale sunt homeodomeniile, domeniile bazice “fermoar de leucină” (leucine zipper), HLH şi diferite tipuri de degete zinc (zinc finger). În general una sau mai multe alfa-elice din domeniul de legare la ADN interacţionează cu fosa majoră la nivelul unor situsuri de recunoaştere;

Capacitatea anumitor factori de transcripţie de a forma heterodimeri creşte numărul de situsuri ADN pe care aceşti factori le pot controla şi modalităţile prin care le pot controla;

Deşi anumite domenii de activare şi de represare sunt bogate în aminoacizi particulari, aceste domenii funcţionale manifestă o varietate de secvenţe de aminoacizi şi structuri proteice caracteristice diferiţilor factori transcripţie.

64

Complexul ARN polimerazic II de iniţiere a

transcripţiei

Iniţierea de către Pol II necesită factori generali de

transcripţie, care poziţionează Pol II la nivelul situsului de

iniţiere şi sunt necesari pentru transcrierea marii majorităţi

a genelor transcrise de către această polimerază;

Factorii generali de transcripţie sunt structuri

multimere şi înalt conservate;

Proteinele cuprinse în complexul Pol II de iniţiere a

transcripţiei se asamblează într-o ordine specifică “in vitro”

dar majoritatea proteinelor se pot combina pentru a forma un

complex holoenzimatic “in vivo”.

65

Etapele procesului de asamblarea a complexului Pol II de

iniţiere a transcripţiei in vitro

66

In vitro assembly of RNA

polymerase II preinitiation

complex

Factorii de transcriptie generali se leaga secvential la

ARN polimeraza II purificata (Pol II), la nivelul

secventei ADN TATAbox pentru a forma complexul de

preinitiatiere. Hidroliza ATP furnizeaza energia

pentru desfacerea moleculelor de ADN la situsul de

start prin legarea subunitatii TFIIH subunit. Initierea

transcriptiei de catre Pol II conduce la formarea

complexului deschis, iar polimeraza se deplaseaza de

la nivelul promotorului iar domeniul CTD este

fosforilat. In vitro, factorii generali de transcriptie (cu

exceptia TBP) disociaza de complexul TBP si

promotor, dar nu se stie inca care dintre factori

raman asociati cu regiunea promotoare pentru fiecare

runda de initiere a transcriptiei, in vivo.

67

Domeniile C-terminale conservate ale TBP de legare

la TATA-box DNA

TBP este o subunitatea TFIID

68

Modelul structural al complexului promotor ADN,

TBP, TFIIB, şi Pol II

69

Concluzii

ARN polimeraza II necesită mai mulţi factori generali de transcripţie pentru a

localiza clar punctul de start la nivelul matriţei ADN şi a iniţia transcripţia. Acestea includ

TFIID care se leagă la TATA-box prin intermediul TBP;

Transcripţia genelor care codifică pentru proteine este controlată de către ARN

polimeraza II care poate fi iniţiată in vitro prin legarea secvenţială a factorilor: TBP, care se

leagă la TATA-box; TFIIB; un complex Pol II şi TFIIF; TFIIE; şi final TFIIH;

Activităţile helicazice ale celor două subunităţi TFIIH separă catenele la nivelul

situsului de start la majoritatea promotorilor, un proces care necesită hidroliza ATP. După

ce pol II începe transcrierea dincolo de situsul de start, elementele CTD sunt fosforilate de

către o altă subunitate a TFIIH;

Iniţierea de către Pol II in vivo necesită un complex multimediator multiproteic,

care se asociază cu elementele CTD nefosforilate ale Pol II, formând un mare complex

holoenzimatic care include şi majoritatea factorilor de transcripţie. Se crede că această

holoenzimă preasamblată se leagă la ADN promotor într-o singură etapă in vivo;

Complexul de iniţiere a transcripţiei care se asamblează la nivelul promotorilor in

vivo poate cuprinde 60-70 polipeptide cu o masă totală similară cu cea a unui ribozom.

70

Formarea heterocromatinei încetineşte expresia la nivelul

telomerilor şi altor regiuni

Mecanismele moleculare ale controlului transcripţional

la eucariote

Concentraţia şi activitatea activatorilor şi represorilor reglează structura

cromatinei şi acetilarea-deacetilarea histonelor, cât şi asamblarea complexelor de

iniţiere a transcripţiei şi viteza cu care transcripţia este iniţiată

Genele silenţioase în controlul tip mating la drojdii

71

Genele de pe cromozomul III implicate în controlul conjugării (mating) la drojdii (S. Cerevisiae)

Genele silenţioase (ne-exprimate) implicate în conjugare (fie a sau alfa în funcţie de suşă) sunt localizate pe locusul

HML. Genele de tip opus sunt prezente pe locusul silenţios HMR. O dată la fiecare diviziune celulară, secvednţa

ADN de pe HML este transferată locusului MAT; în diviziunile celulare alternative, secvenţa ADN de pe HMR este

transferată locusului MAT. Când secvenţele alfa şi a sunt prezente la locusul MAT, ele pot fi transcrise în ARNm ale

căror proteine codificate sunt factori de transcripţie care reglează expresia genelor specifice implicate în conjugare.

Secvenţe silenţioase de legare a proteinelor situate lângă HML şi HMR leagă proteinele care sunt critice pentru

represia acestor loci silenţioşi.Diferite experimente au demonstrat că represia locilor HML şi HMR este rezultatul

condensării structurale a cromatinei care blochează steric interacţia factoriilor de transcripţie cu ADN. ADN din

structura locilor silenţioşi este inaccesibil proteinelor in general (nici macar metilazei), inclusiv factorilor de

transcripţie şi ARN polimerazei. Studii asupra regiunilor N-terminale ale histonelor H3 şi H4 au evidenţiat că acestea

derepresează locii silenţioşi, lasând de exemplu Dam metilaza să aiba acces la secvenţele GATC din strunctura HML

şi HMR. Aceste rezultate indică că interacţiile specifice care implică regiunile N-terminale ale histonelor H3 şi H4

sunt necesare pentru represia la nivelul locilor silenţioşi de conjugare.

Aranjament al locilor de conjugare pe cromozomul III de drojdie

72

Numeroase gene codifică proteine care leagă locii silenţioşi

specific la nivelul telomerilor de drojdii

73

Model schematic al “silencing” la telomerii de drojdii (1)

The heterochromatin structure at each telomere encompasses ≈4 kb of DNA neighboring the RAP1-binding

sites, irrespective of its sequence. Association of several condensed telomeres forms higher-order

heterochromatin complexes, such as those shown in Figure 11-29, that sterically block other proteins from

interacting with the DNA. See the text for more details. [Adapted from M. Grunstein, 1997, Curr. Opin. Cell

Biol. 9:383.]

Schematic model of

silencing mechanism at

yeast telomeres. Multiple

copies of RAP1 bind to a

simple repeated sequence at

each telomere region, which

lacks nucleosomes (top). This

nucleates the assembly of a

multiprotein complex

(bottom) through protein-

protein interactions between

RAP1, SIR2, SIR3, SIR4, and

the hypoacetylated N-terminal

tails of histones H3 and H4 of

nearby nucleosomes. SIR2

deacetylates the histone tails.

74

Mai multe copii ale RAP1 se leaga la o

secventa simpla repetitiva de la nivelul

fiecarei regiuni telomere care este lipsita de

nucleozomi (sus). Acestea determina

asamblarea unui complex multiproteic

(jos) printr-un mecanism de interactie

proteina-proteina dintre RAP1, SIR2,

SIR3, SIR4 si cozile N-terminale

hipoacetilate H3 si H4 ale nucleozomilor

invecinati. SIR2 are rolul de a deacetila

cozile histonelor. Structura

heterocromatinica pentru fiecare telomer

contine aproximativ 4kb ADN din

vecinatatea situsurilor de legare RAP1

indiferent de secventa. Asocierea mai

multor telomeri condensati formeaza

complexe de cromatina inalt-ordonate care

blocheaza steric alte proteine in interactia

cu ADN [Adapted from M. Grunstein,

1997, Curr. Opin. Cell Biol. 9:383.]

• Model schematic al “silencing” la

telomerii de drojdii (2)

75

Histonele pot fi usor cross-legate la ADN, in vivo, daca se

foloseste un agent chimic care asigura de cros-linkare

reversibila si pentru care celula este permeabila. In

figura, nucleosomii cu cozile histonelor acetilate sunt

marcati in verde. Etape: 1) Cromatina cross-linkata este

izolata si taiata la o lungime medie care corespunde la 2-3

nucleozomi; ii) se foloseste un anticorp fata de secventa

aunei cozi histonice pentru recunoastere; iii) nucleozomii

care se leaga sunt imunoprecipitati; iv) ADN din

fragmentele de cromatina imunoprecipitate este eliberat

prin reversarea cross-linkarii si apoi este cuantificat

folosind o metoda PCR sensibila. Metoda poate fi folosita

pentru analiza asocierii in vivo a oricarei proteine cu o

secventa specifica de ADN prin folosirea de anticorpi fata

de proteina de interes din aceea etapa. [See S. E. Rundlett

et al., 1998, Nature 392:831.]

Metoda de

imunoprecipitare a

cromatinei evidentiaza

starea de acetilarea a

histonelor din structura

cromatinei

76

Analiza stării de acetilare a histonelor în cromatina

asociată cu regiuni specifice ale genomului

77

Represorii şi activatorii pot orienta

deacetilarea histonelor genelor specifice

78

Proposed mechanism of histone

deacetylation and

hyperacetylation in yeast

transcriptionn control

a) Deacetilarea cozilor N-terminale ale histonelor

controlata de represori. Domeniul de legare la ADN

(DNA-binding domain - DBD) al represorului UME6

interactioneaza cu elementrul specific de control situat

in amonte (upstream control element - URS1) al

genelor pe care le regleaza. Domeniul de represie (RD)

al UME6 se leaga la SIN3, o subunitate a unui

complex multiproteic care include RPD3, care este o

deacetilaza a histonelor. Deacetilarea cozilor N-

terminale ale histonelor din nucleozomi in regiunea de

legare a UME6- (binding site) inhiba accesul factorilor

generali de transcriptie TATA box, reprimand astfel

expresia genelor (b) Hiperacetilarea coordonata de

activatori a cozilor N-terminale a ale histonelor.

Domeniul de legare la ADN al activatorului GCN4

interactioneaza cu secvente activatoare situate in

amonte (upstream activating sequences UAS) ale

genelor pe care le regleaza. Domeniul de activare al

GCN4 (AD) interactioneaza ulterior cu un complex

multiproteic cu activitate de acetilare a histonelor care

include subunitatea catalitica GCN5. Hiperacetilarea

ulterioara a cozilor N-terminale ale histonelor de la

nivelul nucleosomilor din vecinatatea situsului de

legare a GCN4 faciliteaza accesul factorilor generali de

transcriptie necesari pentru initiere. Represia si

activarea mai multor gene la eucariotelor superioare

apar prin mecanisme similare.

79

Examples of the histone code

Examples of the histone code. Specific post-translational modifications of the N-terminal tails in histones

H3 and H4 are found in euchromatin, which is accessible to proteins and transcriptionally active. Different

modifications are found in heterochromatin, which is condensed and thus largely inaccessible to proteins and

transcriptionally inactive. Histone tail sequences are shown in the one-letter amino acid code. CENP-A is a

variant form for H3 found in nucleosomes associated with the centromeres of mammalian chromosomes.

[Adapted from T. Jenuwein and C. D. Allis, 2001, Science 293:1074.]

80

Activatorii stimulează strânsa cooperare în

asamblarea complexelor de iniţiere

Situsurile de legare pentru activatori care controlează transcripţia genei TTR de la şoarece

81

Structure of yeast and human mediator

complexes. (a) Reconstructed image of

mediator from S. cerevisiae bound to Pol

II. Multiple electron microscopy images

were aligned and computer-processed to

produce this average image in which the

three-dimensional Pol II structure (light

blue) is shown associated with the yeast

mediator complex (dark blue).

(b) Diagrammatic representation of

mediator subunits from human cells.

Subunits shown in the same color are

thought to form a module. Subunits in

orange, yellow, and green are homologous

with subunits in the yeast mediator

complex. Genetic studies in yeast show

that mutations in one of the subunits in a

module inhibit the association of other

subunits in the same module with the rest

of the complex. [Part (a) courtesy of

Francisco J. Asturias, 2002, Mol. Cell

10:409. Part (b) adapted from S. Malik

and R. G. Roeder, 2000, Trends Biochem.

Sci. 25:277.]

82

Modelul asamblării cooperative a unui complex de iniţiere

activat la nivelul promotorului TTR

83

Represorii interferă

direct cu iniţierea

transcripţiei în mai

multe feluri

84

Hormonii

liposolubili

controlează

activităţile

receptorilor nucleari

85

Domeniile structurale ale receptorilor nucleari

86

“Response

elements” sunt

secvenţe de ADN

care leagă mai

mulţi receptori

nucleari majori

87

Translocarea “hormon-dependentă” a receptorilor

homodimeri

88

Model de activare “hormon-dependentă” a genelor

de către receptorul glucocorticoid

89

Hormonii polipeptidici semnalizează fosforilarea unor

factori de transcripţie

Model de activare genică

IFN-mediată prin fosforilarea şi

dimerizarea subunităţii Stat1

90

Concluzii

Controlul transcripţional la eucariote operează pe trei nivele: i) modularea

nivelelor şi/sau activităţilor activatorilor şi represorilor; ii) modificări în structura

cromatinei determinate de activatori şi represori; iii) influenţa directă a activatorilor şi

represorilor în asamblarea complexelor de iniţiere;

Heterocromatina se referă la regiunile de cromatină condensată în care ADN este

relativ inaccesibil factorilor de transcripţie şi altor proteine, astfel încât expresia genei este

represată;

Represarea mediată a heterocromatinei apare la nivelul telomerilor şi a locilor

implicaţi în conjugare la S. Cerevisiae. Interacţiile diferitelor proteine şi hipoacetilarea

regiunilor N-terminale ale histonelor H3 şi H4 sunt responsabile pentru represarea

structurii cromatinei în aceste regiuni;

Unii represori funcţionează parţial prin interacţia cu complexele de deacetilare a

histonelor, având drept rezultat deacetilarea histonelor din structura nucleosomilor situaţi

în vecinătate. Aceasta inhibă interacţia dintre promotorul ADN şi factorii generali de

transcripţie, represând astfel iniţierea transcripţiei;

91

Concluzii

Factorii care remodelează cromatina determină disocierea tranzitorie a ADN de

“miezul” histonic printr-o reacţie ATP-dependentă şi promovează astfel legarea altor

proteine necesare procesului de iniţiere care se desfăşoară la nivelul anumitor promotori

ADN;

In vitro, combinarea activatorilor poate stimula asamblarea complexelor de

iniţiere din vecinatatea promotorului. Se crede că acest efect direct al activatorilor apare

in vivo în urma acetilării histonelor;

In vivo, asamblarea “înalt” cooperativă a complexului de iniţiere necesită mai

mulţi activatori. O celulă trebuie să producă un set specific de activatori necesari pentru

transcripţia unei anumite gene în scopul reglării expresiei acesteia;

Unii represori inhibă competitiv legarea activatorilor sau factorilor generali de

transcripţie. Alţii interacţionează direct cu factorii generali sau cu activatorii;

Activităţile super-familiei recptorilor nucleari sunt reglate de hormonii lipo-

solubili. Legarea hormonilor la aceşti factori de transcripţie induce modificări

conformaţionale care modifică interacţiile lor cu alte proteine;

Activităţile unor factori de transcripţie sunt reglate prin fosforilare indusă de

legarea hormonilor polipeptidici la receptorii lor situaţi la suprafaţa celulelor.

92

Transcripţia initiaţiată de Pol I şi Pol III este

analogă celei realizată de Pol II

93

Alte sisteme de transcripţie

T7 şi alţi bacteriofagi înrudiţi exprimă ARN

polimeraze monomere

ADN mitocondrial este transcris de către ARN

polimeraze care prezintă similarităţi cu enzimele bacteriofagilor

sau bacteriene

Transcripţia ADN din cloroplaste se aseamănă cu

transcripţia bacteriană

Transcripţia de la archaea este mai apropiată de

transcripţia de la eucariote decât de cea de la bacterii

94

In vitro assembly of the yeast Pol I

transcription initiation complex. UAF and CF, both

multimeric general transcription factors, bind to the

upstream element (UE) and core element, respectively,

in the promoter DNA. TBP and a monomeric factor

(Rrn3p) associated with RNA polymerase I (Pol I) also

participate in forming the initiation complex. [Adapted

from N. Nomura, 1998, in R. M. Paule, Transcription of

Ribosomal RNA Genes by Eukaryotic RNA Polymerase

I, Landes Bioscience, pp. 157–172.]

95

Transcription-control elements in

genes transcribed by RNA

polymerase III. Both tRNA and 5S-

rRNA genes contain internal promoter

elements (yellow) located downstream

from the start site and named A-, B-,

and C-boxes, as indicated. Assembly of

transcription initiation complexes on

these genes begins with the binding of

Pol III-specific general transcription

factors TFIIIA, TFIIIB, and TFIIIC to

these control elements. Green arrows

indicate strong, sequence-specific

protein-DNA interactions. Blue arrows

indicate interactions between general

transcription factors. Purple arrows

indicate interactions between general

transcription factors and Pol III.

[From L. Schramm and N. Hernandez,

2002, Genes Dev. 16:2593.]

96

Concluzii

Iniţierea transcripţiei de către Pol I este dirijată de către un element promotor “core”, care

se suprapune cu situsul de start, şi o regiune de control situată în amonte (UCE). Aceata necesită doi

factori de transcripţie generali, SL1 şi UBF;

Iniţierea transcripţiei de către ARN polimeraza III este cel mai adesea dirijată de către

elemente promotoare interne. Doi factori generali de transcripţie sunt necesari pentru iniţierea

transcripţiei ARNt (TFIIIC şi TFIIIB); un factor suplimentar (TFIIIA) este necesar pentru iniţierea

transcripţiei genelor ARNr 5S;

Iniţierea transcripţiei de către toate cele trei ARN polimeraze nucleare eucariote necesită un

factor de transcripţie specific general care conţine TBP ca subunitate;

Iniţierea de către Pol I şi Pol III nu necesită ATP spre deosebire de iniţierea realizată de Pol

II care depinde de hidroliza ATP;

Bacteriofagul T7 şi bacteriofagii înrudiţi exprimă o ARN polimerază monomeră simplă.

Aceste polimeraze recunosc o regiune promotoare de 23 pb care include situsul de start;

Mitocondria conţine molecule circulare de ADN transcrise de către o ARN polimerază

codificată nuclear compusă din două subunităţi. O subunitate este omologă cu ARN polimeraza simplă

din bacteriofagul T7; cealaltă se aseamănă cu factorii bacterieni sigma;

Cloroplastele conţin ADN care este transcris de către o ARN polimerază codificată de

cloroplast omologă cu ARN polimerazele bacteriane, cu excepţia că aceasta este lipsită de factorul

sigma;

Archeobacteriile utilizează o ARN polimerază formată din mai multe subunităţi care se

aseamănă cu ARN polimerazele eucariote nucleare. Iniţierea transcripţiei în celulele de archeobacterii

necesită o proteină, omologă cu factorul eucariotic TBP, care se leagă la un element promotor bogat în

A/T situat imediat în amonte faţă de situsul de start şi o proteină omologă cu TFIIB. Aceste rezultate

susţin ipoteza că eucariotele şi acheobacteriile actuale au evoluat dintr-un strămoş comun.