Análisis de alimentos con columnas Shodex€¦ · · 2018-01-16Fig. 2-2 Influencia de la...

Sacáridos, ácidos orgánicos, vitaminas, ácidos grasos y aminoácidos

Análisis de alimentos con columnas Shodex

CUADERNO TÉCNICO

No.3

Contenido

1. Introducción

2. Sacáridos

2-1. Mecanismo de separación

2-2. Monosacáridos y disacáridos

2-3. Sacáridos y alcohol de azúcar

2-4. Fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua

2-5. Sacáridos con aminoácidos o ácidos orgánicos

2-6. Polisacáridos

2-7. Endulzantes

3. Ácidos orgánicos


3-2. Ácidos orgánicos

4. Vitaminas

4-1. Vitaminas solubles en grasas

4-2. Vitaminas solubles en agua

5. Otros ingredients en los alimentos

5-1. Ácidos grasos superiores

5-2. Ácidos nucleicos como componentes del gusto

5-3. Aminoácidos

6. Apéndice

A. Lista de volumen de elución de sacáridos (todas las columnas)

B. Lista de volumen de elución de sacáridos y ácidos orgánicos

(concentración de eluente, SH1011)

C. Lista de volumen de elución de ácidos orgánicos

(concentración de eluente, KC-811)

D. Lista de volumen de elución de ácidos orgánicos

(temperatura de la columna, KC-811)

1

1

2

4

8

9

10

11

11

12

12

14

16

17

19

21

21

22

23

24

24

26

27

28

1. IntroducciónEn los últimos años, se han realizado una gran variedad de análisis de alimentos, entre ellos, de residuos agroquímicos y aditivos alimentarios, con un interés cada vez mayor en su seguridad. Este cuaderno técnico describe los análisis de ingredientes en los alimentos, especialmente de aquellos basados en la cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

2. SacáridosLos análisis de sacáridos y alcoholes de azúcar basados en HPLC se realizan de diferentes modos, como de fase normal, de intercambio de ligandos, por exclusión de tamaño e intercambio iónico. Existen dos series de columnas Shodex para los análisis de sacáridos: las que se aplican principalmente en modo de intercambio de ligandos (series SUGAR) y en modo de fase normal (columnas amino polimericas Asahipak NH2P-50). En las columnas de series SUGAR, se utiliza como material base un copolimero duro de estireno y divinilbenceno diseñado para el análisis de sacáridos y una resina de intercambio cationico fuerte que incorpora sulfogrupos funcionales asociados con contraiones metalicos como empaque. Las columnas de series SUGAR se encuen-tran disponibles en 14 tipos, según el contraión, el tamaño de los poros, la estructura de los poros, y con selec-tividad diferencial para los diferentes sacáridos. Por otra parte, las columnas Asahipak NH2P-50 comprenden un gel de polímero hidrofílico [poly(vinyl)alcohol] y una poliamina estable y quimicamente unida al gel. Como tales, estas amino columnas con base de silice tienen excelente durabilidad sin el problema del deterioro con el tiempo. Ambas series son adecuadas para la separacion de sacáridos, análisis de alimentos, áreas de bioquímica y sustancias naturales. Columnas como las Asahipak GS-220 HQ empacadas con polímeros para el modo de exclusión por tamaño analizan fibras dietéticas de bajo peso molecular y solubles en agua; y las colum-nas OHpak SB-800 HQ empacadas con polímeros para el modo de exclusión por tamaño analizan polisacáridos, como las columnas SUGAR KS-800. La tabla 1 muestra la alineación de las columnas Shodex empacadas para el análisis de sacáridos.

*1 : SEC (exclusión por tamaño), IEX (exclusión iónica), LEX (intercambio de ligandos), NP (fase normal)*2 : La cifra entre ( ) es por valor estimado.

Tabla 2-1. Columnas para análisis de sacáridos (1)

Código deproducto Nombre del producto Contraión Modo de

separación*1

Limite de exclusión (pululano)

Número de plato teórico (PT/columna)

Tamaño de la partícula

(µm)

Diámetro x largo

(mm)

- 1 -

F6378100F6378101F6700080F6378102F6378103F6700090F6378105F6700081F7001400F6700120F7001300F6700110F6378010F6378020F6378025F6378035F6378050F6378060F6700020F6378070F6700021F7600005F6710019F7630002F7630001F6710016F7630006F6713000F6710100

F6379230

SUGAR SH1011SUGAR SH1821SUGAR SH-GSUGAR SC1011SUGAR SC1821SUGAR SC-LGSUGAR SP0810SUGAR SP-GSUGAR SC1211SUGAR SC-GSUGAR SZ5532SUGAR SZ-GSUGAR KS-801SUGAR KS-802SUGAR KS-803SUGAR KS-804SUGAR KS-805SUGAR KS-806SUGAR KS-GSUGAR KS-807SUGAR KS-807GAsahipak GS-220 HQAsahipak GS-2G 7BAsahipak NH2P-50 4DAsahipak NH2P-50 4EAsahipak NH2P-50G 4AAsahipak NH2P-50 2DAsahipak NH2P-50G 2AAsahipak NH2P-LF

USPpak MN-431

SEC + IEXSEC + IEX

—SEC + LEXSEC + LEX

—SEC + LEX

—NP + LEX

—NP + LEX

—SEC + LEXSEC + LEX

SECSECSECSEC—

SEC—

SEC—NPNP—NP——

SEC + LEX

1.00010.000

Guarda columna1.000

10.000Guarda columna

1.000Guarda columna

— Guarda columna

— Guarda columna

1.00010.00050.000

400.0005.000.000

(50.000.000)*2

Guarda columna(200.000.000)*2

Guarda columna3.000

Guarda columna— —

Guarda columna—

Guarda columnaFiltro lineal

—

> 17.000> 17.000

> 13.000 > 13.000

— > 11.000

— > 5.500

— > 5.500

— > 17.000 > 17.000 > 17.000 > 17.000

> 9.000> 9.000

—> 4.000

—> 19.000

> 5.000> 7.500

> 3.500

> 4.000

66

1066

107

106

10666667

1717103030

6955555

—

—

8,0 x 3008,0 x 3006,0 x 508,0 x 3008,0 x 3006,0 x 508,0 x 3006,0 x 506,0 x 2504,6 x 106,0 x 1504,6 x 108,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3008,0 x 3006,0 x 508,0 x 3008,0 x 507,5 x 3007,5 x 504,6 x 1504,6 x 2504,6 x 102,0 x 1502,0 x 108,0 x 75

4,0 x 250

H+

H+

H+

Ca2+

Ca2+

Ca2+

Pb2+

Pb2+

Ca2+

Ca2+

Zn2+

Zn2+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

Na+

——

——————

Ca2+


2-1-1. Separación de anómeros en sacáridosLos azucares reductores pueden adoptar diversas estruc-turas cíclicas, así como estructuras lineales. En dichos casos, se producen dos tautómeros, tipo α y tipo β, ya que los átomos de carbonilo se vuelven asimétricos. La relación entre el tipo α y el tipo β se denomina “anómero”. (Fig. 2-1)

Fig. 2-1 Anómeros

Fig. 2-2 Influencia de la separación de anómeros en el análisis de sacáridos

α-D(+)-glucosa

Glucosa

25˚C

Separación de anómeros

70˚C

No separación de anómeros

Galactosa Manosa Xilosa Arabinosa

tipo α

β-D(+)-glucosa

tipo β

- 2 -

En condiciones donde el índice de conversión de tautómeros es bajo, los anómeros α y β son separados por la columna, haciendo que los picos máximos se dividan o amplíen. (Fig. 2-2)

Existen dos métodos para evitar la separación de anómeros.*Análisis a temperatura alta*Análisis bajo condiciones alcalinas fuertes

F6429100

F6429101

F6429102

F6429103

F6429104

F6429105

F6429106

F6709430

F6429108

F6709431

OHpak SB-802 HQ

OHpak SB-802.5 HQ

OHpak SB-803 HQ

OHpak SB-804 HQ

OHpak SB-805 HQ

OHpak SB-806 HQ

OHpak SB-806M HQ

OHpak SB-G

OHpak SB-807 HQ

OHpak SB-807 G

4.000

10.000

100.000

1.000.000

4.000.000

(20.000.000)*1

(20.000.000)*1

Guarda columna

(500.000.000)*1

Guarda columna

> 12.000

> 16.000

> 16.000

> 16.000

> 12.000

> 12.000

> 12.000

—

> 15.000

—

8

6

6

10

13

13

13

10

35

35

0

100

100

75

75

75

75

75

75

75

0

75

75

75

75

75

75

75

75

75

0

100

100

100

100

100

100

100

100

100

8,0 x 300

8,0 x 300

8,0 x 300

8,0 x 300

8,0 x 300

8,0 x 300

8,0 x 300

6,0 x 50

8,0 x 300

6,0 x 50

Muestra: 1% c/u, 5μL

Columna : Shodex SUGAR SC1211Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,7ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : (A) 70°C, (B) 25°C

*1 : La cifra entre ( ) es un valor estimado.

Tabla 2-2. Columnas para análisis de sacáridos (2)

Códigode producto

Nombre del productoLímite deexclusión(Pululano)

Solventes orgánicos utilizables (Máx. %) Número de plato teórico(PT/columna)


(μm)

Diámetro x largo (mm)Metanol Acetonitrilo DMF

2-1-3. Shodex Asahipak NH2P-50 seriesLas series Shodex Asahipak NH2P-50 son amino columnas que no solo mantienen el gran rendimiento de separación de las amino columnas convencionales con base de sílice, sino que también solucionan el problema de la disminución de retención con el tiempo. Esto se debe a la unión estable de la poliamina con el gel de polímero hidrofílico. A continuación se mencionan otras ventajas.

* Es posible el análisis bajo condiciones moderadas (pH de 7 aproximadamente y temperatura ambiente).* Se pueden obtener picos cerrados y casi simétricos para una gran variedad de sacáridos.* Se puede realizar una determinación cuantitativa adecuada.* Se puede utilizar una gran variedad de eluentes, como diferentes soluciones buffer, alcalinas o ácidas. * Es posible el lavado alcalino de las columnas.

Con las amino columnas, los sacáridos de mayor polaridad se eluyen primero, debido a la función de la cromatografía de fase normal. Por lo general, se usa como eluente una mezcla de acetonitrilo y agua. Cuando el índice de mezclado del acetonitrilo aumenta, la polaridad del eluente se reduce, creando una interacción fuerte entre los sacáridos y el material de empaque dando como resultado un volumen de elución mas largo.

Como las columnas NH2P-50 tienen amino grupos alcalinos débiles, la condición dentro de la columna es alcalina. Esto permite que los sacáridos sean analizados sin causar la separación de los anómeros, incluso a temperatura ambiente.

Hay columnas llamadas amido columnas que se utilizan para el análisis de sacáridos bajo las mismas condiciones de elución que las amino columnas. Aunque las amido columnas tienen grupos acrilamida, el análisis debe hacerse a una temperatura alta porque el grupo acrilamida no es alcalino. (Fig. 2-4)

2-1-2. Serie Shodex SUGARUna característica fuerte de las columnas Shodex SUGAR reside en el mecanismo de separación en el modo de intercambio de ligandos. El intercambio de ligandos se refiere al modo de separación basado en la interacción (potencial de intercambio de ligandos) entre los grupos hidroxilo y los iones metálicos que forman un complejo. Los sacáridos tienen una estructura de anillo de cinco miembros (furanosa) o de seis miembros (piranosa), con una gran cantidad de grupos hidroxilo. Estos grupos hidroxilo se unen ya sea de manera ecuatorial o axial con relación al carbono. Esta conformación de los grupos hidroxilo difiere según la clase de sacárido.La figura 2-3 muestra la relación entre la conformación del grupo hidroxilo y la interacción contraiónica.

En la figura 2-3(a), tres grupos hidroxilo forman un complejo con el ión metálico. En la figura 2-3(b), solo dos grupos hidroxilo forman un complejo con el ión metálico, debido a la conformación del grupo hidroxilo. Por lo tanto, el potencial de intercambio de ligandos es mayor para (a) que para (b).

El potencial de formación de complejos también difiere según la clase de ión metálico.

* Cuando se utiliza una columna de la serie SUGAR, el análisis se debe realizar a varias temperaturas altas para evitar la separación de anómeros. En condiciones alcalinas fuertes, es probable que los sacáridos isomeri-cen con posibilidades de descomposición de los polisacáridos.

Fig. 2-3 Diferencia de la interacción del contraión

Fig. 2-4 Efectos de temperatura en patrones de elución (comparación con la amido columna)

- 3 -

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6x250mm) Amido columna de compañía A (4,6x250mm)Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30°C, 80°C

NH2P-50 Amino columna

30˚C30˚C 80˚C

Muestra: 5mg/m c/u,10μL

1. Fructosa, 2. glucose, 3.sacarosa, 4.maltosa

- 4 -

Eluente : CH3CN/H2O=75/25 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30°C

NH2P-50 4E Amino columna con base de sílice

Las columnas NH2P-50 muestran una buena reproductibilidad por mucho tiempo, dado que la estructura química del material de empaque es estable. Con las amino columnas en base de sílice, la retención de sacári-dos se reduce con el paso de tiempo, lo que resulta en una ampliación significativa de todos los picos. Esto indica claramente el deterioro de la columna. (Fig. 2-5)

Fig. 2-5 Reproductibilidad de los cromatogramas con la columna NH2P-50 4E y la amino columna con base de sílice.

2-1-4. Detección de sacáridosEl detector utilizado más comúnmente para sacáridos es el índice refractivo (RI) diferencial, que se basa en las diferencias del índice refractivo entre los componentes de la muestra y la fase móvil. Aunque el detector RI es muy versátil, muestra poca selectividad y no es apropiado para la elución en gradiente. Otra desventaja es la tendencia a una sensibilidad menor a la de otro tipo de detectores. En casos donde se necesita una gran sensibi-lidad y selectividad, el detector de absorción ultravioleta (UV) y el detector de fluorescencia (FL) son efectivos. No obstante, cabe destacar que los sacáridos deben derivatizarse, ya que no poseen una estructura que permita la absorción UV ni la emisión de fluorescencia. Otros métodos de detección disponibles son, entre otros, el espec-trómetro de masas (MS), el detector electroquímico (EC) para sacáridos ionizados en condiciones alcalinas y el detector evaporativo de dispersión de la luz (ELS), que detecta los sacáridos mediante la evaporación de un eluente y un láser irradiante.

2-2. Monosacáridos y disacáridosEn general, el término “sacárido” se refiere a los sacáridos simples, los oligosacáridos, los polisacáridos, y los alcoholes de azúcar. Los sacáridos simples, es decir, los monosacáridos y los disacáridos, no incluyen los alcoholes de azúcar. No se permiten las etiquetas como "Muy bajo contenido de azúcar", "Baja azúcar” ni “Sin azúcar” a menos que el contenido del tipo relevante de azúcar no supere los 5 gramos cada 100 gramos (2,5 g/100 ml para los refrescos) y ni los 0,5 gramos por 100 gramos (0,5 g/100 ml para los refrescos), respectiva-mente. Los estándares que regulan las etiquetas de información nutricional en Japón especifican el uso de una amino columna (4,6 mm de diámetro interior x 250 mm de largo) para analizar los sacáridos simples y los oligosacáridos (figura 2-6). Shodex puede ofrecer numerosas clases de columnas para el análisis de sacáridos.

Carbohidrato

Sacárido (o azúcar) Sacárido simple (o azúcar) Monosacárido,DisacáridoOligosacárido

Alcohol de azúcar

PolisacáridoFibra dietética

Primer uso después 180hrs Primer uso después 120hrs

- 5 -

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C

Muestra: 0,1% c/u, 20µL1. Fructosa2. Sorbosa3. Galactosa4. Glucosa5. Celobiosa6. Sacarosa7. Lactosa8. Maltosa

Altu

ra d

el p

ico

(µV

)

Altu

ra d

el p

ico

(µV

)

Concentración de la muestra (mg/ml)

Concentración de la muestra (mg/mL)

Fructosa

Sacarosa

Lactosa

Maltosa

meso-eritritol

Xilitol

Manosa

Maltitol

0,9998

0,9999

0,9997

0,9998

0,9999

0,9999

0,9999

0,9997

Condición de la Fig. 2-8 y la Tabla 2-3

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/H2O=75/25 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C

(0,01mg/ml~10mg/ml)

Fig. 2-6 Condiciones de análisis de los sacáridos y oligosacáridos

Fig. 2-7 Sacáridos estándar con NH2P-50 4E

Tabla 2-3. Correlación para otros sacáridos (R2)

Fig. 2-8 Curvas de calibración con NH2P-50

Columna : Una columna empacada con gel de polímero o sílice unida a un amino grupo (propil) (4,6mm de diámetro x 250mm) Shodex Asahipak NH2P-50 4EEluente : CH3CN/H2O = 75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente Vol. de inyección : 20µL

Columna : Una columna empacada con gel de polímero o sílice unida a un amino grupo (propil) (4,6mm de diámetro x 250mm) Shodex Asahipak NH2P-50 4EEluente : CH3CN/H2O = 75/25Índice de flujo : 1,0ml/min Detector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente Vol. de inyección : 20µL

Monosacárido, disacárido Oligosacárido

Estándares para las etiquetas de información nutricional en Japón, ver. 3 (Ley japonesa de Sanidad Alimentaria)

50000

0

0

0

5000

10000

15000

0 0,2 0,4

5 10

Sorbitol

R2=0,9999

Glucosa

R2=0,9998

100000

150000

200000

0

12

3

4

5

6

78

5 10

min

15 20

- 6 -

Muestra : 20µL1. Fructosa2. Galactosa3. Glucosa4. Sacarosa5. Lactosa

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm) Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C

(Pretratamiento de la muestra)(1) Medir 5g de yogur en un vaso de precipitado.(2) Agregar 30ml de agua pura al yogur. Revolver la mezcla y

luego, neutralizarla con una solución acuosa de hidróxido de sodio al 10v/v%.

(3) Después de 30 minutos de extracción ultrasónica, agregar agua pura hasta que el volumen total sea 50ml.

(4) Pasar la solución (3) por un filtro de papel Nº 5B. Agregar a 3ml del líquido filtrado el mismo volumen de acetonitrilo y revolver la mezcla.

(5) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al HPLC.

Fig. 2-9 Sacáridos en yogur con azúcar agregada

Muestra : 20µLJarabe fructo-oligosacárido al 2,5%1. Fructosa2. Glucosa3. Sacarosa4. 1-Kestosa5. Nistosa6. 1F-Fructofuranosil-D-nistosa

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/H2O=70/30Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 25°C

Con las columnas NH2P-50, los sacáridos se eluyen por orden de polaridad debido a la función de la cromatografía de fase normal. La polaridad se vuelve más fuerte con cadenas más largas y la absorción se vuelve más fuerte.Con el análisis de los oligosacáridos, se recomienda un índice alto de agua de solvente para una elución temprana.

Fig. 2-11 Jarabe fructo-oligosacárido

Muestra : 20µL1. Fructosa2. Glucosa3. Sacarosa4. Maltosa

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm) Eluente : CH3CN/H2O=75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente (25°C)

(Pretratamiento de la muestra)(1) Hacer una pasta de la muestra con un procesador de

alimentos.(2) Colocar 3 g de la pasta en un vaso de precipitado y agregar 30

ml de etanol al 50%(V/V).(3) Extraer las sustancias de la pasta con un vibrador ultrasónico

durante 30 minutos.(4) Colocar la pasta y el etanol en un matraz aforado de 50 ml y

agregar etanol al 50%(V/V) para obtener una solución de 50 ml.(5) Filtrar la solución con un filtro de papel (Nº 5B) para quitar la

pasta.(6) Tomar una parte de la solución filtrada y agregar el mismo

volumen de acetonitrilo.(7) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al

HPLC.

Fig. 2-10 Sacáridos en la batata, asada

0

1 2

3

4

5 10

min

15 20

0

12 3

4

5

5 10

min

15 20 25 30

0

1

2

3

4

5

6

5 10

min

15 20 25

- 7 -

Muestra : 5µLSalsa inglesa con dilución quíntuple1. Polisacáridos y anión2. Polisacáridos3. Sacarosa4. Glucosa5. Fructosa

Columna : Shodex SUGAR KS-801 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,7ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°C

Con SUGAR KS-801, los pesos moleculares altos y los compuestos aniónicos son eluidos primero, seguidos por sacáridos de bajo peso molecular. Por lo tanto, KS-801 se puede utilizar para el análisis de sacáridos sin desalinización previa de las muestras, como la salsa inglesa, que por lo general contiene grandes cantidades de cloruro de sodio y ácidos orgánicos.

Fig. 2-12 Sacáridos en la salsa inglesa

Muestra: Mermelada de frambuesa1. Oligosacárido(DP-6)2. Oligosacárido(DP-5)3. Oligosacárido(DP-4)4. Oligosacárido(DP-3)5. Maltosa6. Glucosa7. Fructosa

Columna : (izquierda); Shodex SUGAR SC1011 (derecha); Shodex SUGAR SC1821 (8,0mm de diámetro x 300mm c/u)Eluente : H2O Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°C

Se analizó la mermelada de frambuesa. Se encontró un grancontenido de oligosacáridos en la muestra. Se utilizó SUGARSC1011 o SC1821 y se obtuvo una mejor separación con SC1821por el tamaño mayor de sus poros.(Pretratamiento de la muestra)(1) Colocar 5g de mermelada de frambuesa en un vaso de

precipitado y agregar 20ml de agua pura.(2) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al

HPLC.

Fig. 2-14 Sacáridos en la mermelada de frambuesa

Muestra: Harina de soja1. Estaquiosa2. Rafinosa3. Sacarosa4. Maltosa5. Glucosa

Columna : Shodex SUGAR SP-G (6,0mm de diámetro x 50mm) + SP0810 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : H2O Índice de flujo : 0,4ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°C

(Pretratamiento de la muestra)(1) Colocar la harina de soja en un vaso de precipitado y agregar

agua pura diluida 50 veces.(2) Extraer las sustancias de la pasta en el agua con un vibrador

ultrasónico durante 30 minutos.(3) Realizar la ultrafiltración (mw : 10.000).(4) Pasar por un filtro de membrana (0,45 µm) antes de inyectar al

HPLC.

Fig. 2-13 Sacáridos en la harina de soja

0

1

2

34

5

5 10 15 min

0

1

2

3

4 5

10 20 30 40 50 60 min

Muestra: Mermelada de frambuesa2 µL

Muestra:Mermelada de frambuesa2 µL

0

1

1

2233

44

5

7 7

5

6

6

5 10 15 20 min 0 5 10 15 20 min

(SC1821)

(SC1011)

- 8 -

2-3. Sacáridos y alcoholes de azúcar

Las amino columnas (4,6mm de diámetro x 250mm) y las columnas de modo de intercambio de ligandos son algunos de los métodos oficiales de análisis de los alcoholes de azúcar. (Fig. 2-15)

Fig. 2-15 Condiciones de análisis en alcoholes de azúcares.

Columna : Una columna empacada con sílice o gel de polímero unida a un grupo amino (propil) (4,6mm de diámetro x 250mm) Shodex Asahipak NH2P-50 4EEluente : CH3CN/H2O = 75/25Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambienteVol. de inyección : 20 µL

Columna : Una columna empacada con gel de poliestireno sulfonato (Pb o Caligand) (7,8-8,0mm de diámetro x 300mm c/u) Shodex SUGAR SP0810, SC1011Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 85°CVol. de inyección : 5 µL

Alcohol de azúcar (1) Alcohol de azúcar (2)

Estándares para las etiquetas de información nutricional en Japón, ver. 3 (Ley japonesa de Sanidad Alimentaria)

Columna : Shodex SUGAR SP0810 Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm c/u)Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 85˚C

Fig. 2-16 Sacáridos estándares y alcohol de azúcar con SP0810, SC1011

Fig. 2-17 Xilitol en productos de confitería

Muestra: 1% c/u, 5 µL 1. Sacarosa 2. Glucosa 3. Xilosa 4. Galactosa 5. Fructosa 6. meso-eritritol 7. Lactitol 8. Manitol 9. Xilitol10. Sorbitol

Muestra: 1% c/u, 5 µL1. Sacarosa2. Glucosa3. Lactitol4. Fructosa5. meso-eritritol6. Manitol7. Sorbitol

Muestra: Productos de confitería 20 µL1. Sorbitol2. Xilitol

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm) Eluente : H2O/CH3CN=25/75 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30˚C

(Pretratamiento de la muestra)* Se pasó por un filtro (0,45 µm) una solución acuosa de la muestra al 2% y se agregó el mismo volumen de acetonitrilo.

0

1 234

56

78

910

10min

20 30 40 0

1

2

3

4

5 6

7

10min

20

0

1

2

5 10 min

- 9 -

Fig. 2-18 Jugo de manzana

2-4. Fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua

Por lo general, las fibras dietéticas se cuantifican mediante el método de Prosky (método enzimático-gravimétrico). No obstante, se utiliza el método HPLC enzimático para las fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua que no pueden cuantificarse mediante el método Proxy. En este análisis, la muestra se divide en dos fraccio-nes: fibras dietéticas (trisacáridos y superiores), mono y disacáridos. Posteriormente, se determina el índice del área de picos de la fracción de fibra dietética y de la glucosa (o estándar interno).

Fig. 2-19 Condiciones de análisis de fibras dietéticas solubles en agua

Columna : Columnas de cromatografía por exclusión de tamaño (Límite de exclusión MW: ca. 5.000) o columnas de intercambio de ligandos (tipo Na o Ca)

Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80°CVol. de inyección : 20 µL

Fibras dietéticas de bajo peso molecular solubles en agua

Estándares para las etiquetas de información nutricional en Japón, ver. 3 (Sociedad japonesa de salud y nutrición)

Fig. 2-20 Fibra dietética soluble en agua

Columna : Shodex Asahipak GS-220 HQ (7,5mm de diámetro x 300mm) x 2 Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C

Con GS-220 HQ, los monosacáridos, disacáridos y alcoholes de azúcar se eluyen después de la posición indicada por la flecha y es fácil dividir las dos fracciones.

Muestra: Jugo de manzana, 5 µL1. Sacarosa2. Glucosa3. Fructosa4. Sorbitol

Columna : Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : H2O Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 85°C

(Pretratamiento de la muestra)(1) Colocar 5g de jugo de manzana en un vaso de precipitado,

agregar 30 ml de agua pura y neutralizar con NaOH ac. al 10% (V/V) enfriado con hielo.

(2) Aplicar vibración ultrasónica durante 30 minutos y hacer una solución de 50 ml con agua pura.

(3) Filtrar con un filtro de membrana de 0,45 micrones.

1

2

3

4

10 20 min

0 10 20 30 40 min

- 10 -

2-5. Sacáridos con aminoácidos o ácidos orgánicos

Por lo general, los aminoácidos y los ácidos orgánicos se encuentran en los alimentos con sacáridos.

Fig. 2-23 Sacáridos y ácidos orgánicos

Muestra: 0,5% c/u, 10 µL1. Maltotriosa2. Maltosa3. Glucosa4. Ácido succínico5. Ácido láctico6. Glicerol7. Ácido acético8. EtOH

Columna : Shodex SUGAR SH1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : 5mM H2SO4 ac.Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C

Los eluentes ácidos, como los ácidos orgánicos se separan con el modo de exclusión iónica y el modo de fase reversa. Los sacáridos se separan con SEC.

Fig. 2-22 Sacáridos y aminoácidos (2)

Muestra:1. Sacarosa2. Glucosa3. Fructosa4. Taurina5. mio-Inositol

Columna : Shodex SUGAR SC1211 (6,0mm de diámetro x 250mm)

Eluente : H2O/CH3CN=60/40Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 70˚C

La taurina es un aminoácido y se conoce como uno de los ingredientes que desde hace poco tiempo se agregan a las bebidas energizantes.

Fig. 2-21 Sacáridos y aminoácidos (1)

Muestra: 0,1% c/u, 10 µL1. Maltosa2. Glucosa3. Fructosa4. Ácido glutámico5. Ácido aspártico6. Treonina7. Serina8. Glutamina9. Alanina

Columna : Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : 10mM CaSO4(pH6,0)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80˚C

Generalmente, las columnas de modo de intercambio de ligandos se utilizan con un eluente acuoso, pero la adición del mismo catión que el contraión permite la separación de muestras mediante el modo de intercambio iónico, e intercambio de ligandos. Se utiliza una solución acuosa de CaSO4 para la columna SUGAR SC1011, ya que su contraión es Ca2+. Esto significa que el intercambio de ligandos ocurre entre los contraiones del material de empaque, los grupos hidroxilo de sacáridos y el intercambio iónico que ocurren entre los grupos sulfonato y los grupos amino de los sacáridos.

0

1 23

4

5

678

9

10 20 30 min

0

1

23

4

5

8 16 24 min

0 5

12

3

4

5

6

7 8

10 15 20 25 30 min

- 11 -

2-6. Polisacáridos

Los polisacáridos se utilizan como espesantes/estabilizadores para espesar o solidificar alimentos, entre otros fines. Los polisacáridos tienen diversos pesos moleculares, por lo tanto, se realiza su análisis no sólo para su cuantificación, sino también para determinar su peso molecular.

2-7. Endulzantes

Generalmente, los aditivos alimentarios se analizan con columnas de modo de fase reversa: sin embargo, los sacáridos son difíciles de analizar debido a su gran polaridad. Por lo tanto, se recomiendan columnas para análisis de sacáridos y para analizar endulzantes.

Fig. 2-26 Acesulfamo K y sacáridos

Muestra : 10 µL1. Acesulfamo K al 0,005%2. Sacarosa al 0,5%3. Glucosa al 0,5%4. Fructosa al 0,5%

Columna : Shodex SUGAR SC1011 (8,0mm de diámetro x 300mm) Eluente : 10mM CaSO4 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI), UV (254nm)Temp. de la columna : 80˚C

La concentración de acesulfamo K es mínima, difícil de detectar con RI. Los sacáridos no tienen absorción ultravioleta, por lo tanto, no hay picos mediante detección UV.

Se analizó la carboximetilcelulosa con OHpak SB-806M HQ (una columna para separación de GFC). Se calcularon Mw y Mn como pululano.

Fig. 2-24 Alginato de sodio

Muestra: Alginato de sodio al 0,1%, 100 µl

Columna : Shodex OHpak SB-806M HQ (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 0,1M NaNO3 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C

Columna : Shodex OHpak SB-806M HQ (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2 Eluente : 0,1M NaCl ac.Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C

500-600cp

Fig. 2-25 Carboximetilcelulosa

Muestra : Carboximetilcelulosa (CMC) al 0,1%Viscosidad media, 200 µl

En el apéndice A, se muestran las tablas de volumen de elución de los sacáridos con cada columna.

150-300cp

6 10 14 18 22 26 min

6 10 14 18 22 26 min

Mw = 101 x 104

Mn = 10,5 x 104

Mw/Mn = 9,6

0 4 8 12 16 20 24 28min

0

1

2

34

5 10 15 min

- 12 -

F6378030

F6700030

F6700010

F7008140

F6700510

F7001004

F7001005

F7009030

F7001006

F6700150

F7001007

F6700151

F6378100

F6378101

F6700080

F6995244

F6995245

F6709620

RSpak KC-811

RSpak KC-G

RSpak KC-LG

RSpak NN-814

RSpak NN-G

RSpak DE-613

RSpak DE-413

RSpak DE-413L

RSpak DE-413S

RSpak DE-G

RSpak DE-213

RSpak DE-SG

SUGAR SH1011

SUGAR SH1821

SUGAR SH-G

IC SI-90 4E

IC SI-50 4E

IC SI-90G

IEX+RP

IEX+RP

IEX+RP

IEX+RP

IEX+RP

RP

RP

RP

RP

RP

RP

RP

SEC + IEX

SEC + IEX

-

AEC

AEC

AEC

> 17.000

(Guarda columna)

(Guarda columna)

> 9.000

(Guarda columna)

> 7.000

> 11.000

> 17.000

> 3.000

(Guarda columna)

> 8.000

(Guarda columna)

> 17.000

> 17.000

(Guarda columna)

> 5.000

> 10.000

(Guarda columna)

6

10

12

10

10

6

4

4

4

10

4

4

6

6

10

9

5

9

8,0 x 300

6,0 x 50

8,0 x 50

8,0 x 250

6,0 x 50

6,0 x 150

4,6 x 150

4,6 x 250

4,6 x 50

4,6 x 10

2,0 x 150

2,0 x 10

8,0 x 300

8,0 x 300

6,0 x 50

4,0 x 250

4,0 x 250

4,6 x 10

*1 : (Exclusión por tamaño), IEX (Exclusión iónica), RP (Fase reversa) , AEC (Intercambio aniónico)

Tabla 3-1. Columnas Shodex para el análisis de ácidos orgánicos

Código deproducto

Nombre del productoModo de

separación*1

Número deplato teórico(PT/columna)


(µm)

Diámetro x largo (mm)

RSpak KC-811

RSpak NN-814

RSpak DE-413

SUGAR SH1011

SUGAR SH1821

IC SI-90 4E

IC SI-50 4E

Exclusión iónica + fase reversa

Exclusión iónica + fase reversa

Fase reversa

Exclusión por tamaño + exclusión iónica

Intercambio aniónico

Ácidos orgánicos generales

Ácidos orgánicos aromático

Ácidos orgánicos generales

Ácidos orgánicos y aniones

Ácidos orgánicos y aniones

Tabla 3-2. Selección de columnas para las muestras

Columna Modo de separación Muestra

3. Ácidos orgánicos

Los ácidos orgánicos son sustancias ácidas débiles con grupos carboxilo en su estructura molecular; también se les llama “ácidos carboxílicos”. Cuando se analizan ácidos orgánicos, se utilizan la exclusión iónica, la fase reversa, el intercambio iónico (cromatografía iónica), la exclusión por tamaño y otros tipos de cromatografía. Las columnas Shodex para el análisis de ácidos orgánicos incluyen RSpak KC-811 (una combinación del modo de exclusión iónica y fase reversa), RSpak DE-413 (columna de polímero de fase reversa) e IC SI-50 4E (columna de cromatografía aniónica), así como SUGAR SH1011 (columna para el análisis de sacáridos y ácidos orgánicos, descripta en la sección 2). La tabla 3-1 muestra una alineación de columnas de empaque Shodex para el análisis de ácidos orgánicos.


Shodex puede ofrecer diversas columnas para el análisis de ácidos orgánicos según las sustancias de la mues-tra. (Tabla 3-2)

3-1-1. Modo de exclusión iónicaEn el análisis de ácidos orgánicos, se utiliza una resina de alto intercambio catiónico con grupos sulfo unidos a la superficie del empaque. Los ácidos débiles, como los orgánicos, sólo muestran una disociación parcial cuando se disuelven en agua. En un estado de disociación (con carga negativa), la carga positiva del catión se neutraliza y es excluida por la carga negativa de los grupos sulfo en la superficie de la resina. No es de interés la absorción de ácido orgánico en la resina. En estado de no disociación, por otra parte, no ocurre la exclu-sión iónica, sino que tiene lugar la absorción hidrofóbica en el sustrato de la resina, para permitir la retención de ácidos orgánicos por parte de la resina (Figura 3-1).

Por lo tanto, los ácidos orgánicos se eluyen en orden de pKa ascendente (orden de acidez descendente) y en orden descendente de polaridad. El sustrato del empaque de KC-811 es de un copolímero de estireno-divinilbenceno, por lo tanto, se recomienda utilizar NN-814 para analizar ácidos orgánicos aromáticos de baja polaridad, ya que tiene un sustrato de empaque de mayor polaridad que la columna KC-811. El sustrato de empaque de NN-814 es poli(hidroximetacrilato).

- 13 -

3-1-2. Modo de fase reversaEs el modo de separación de HPLC más comúnmente utilizado. Este modo se basa en la interacción hidrofóbica entre la porción de baja polaridad del empaque y la porción de baja polaridad de la muestra. Por lo tanto, la elución ocurre en orden descendente de polaridad. Una clave para un análisis exitoso de ácidos orgánicos en modo de fase reversa es suprimir totalmente la disociación de los ácidos orgánicos y reducir la polaridad de la muestra. Generalmente, los ácidos orgánicos no se disocian cuando el eluente tiene un pH de 1,5 menos que el pKa.

3-1-3. Modo de intercambio aniónicoLa superficie de resina se carga positivamente. El catión de la resina es mezclado por el anión de la fase móvil consti-tuyente y el anión del ácido orgánico (anión); la elución ocurre en orden ascendente de absortividad.

3-1-4. Modo de exclusión por tamañoLos ácidos orgánicos se eluyen en orden ascendente según el tamaño molecular. Las moléculas más grandes que el tamaño del poro de la resina se eluyen en posición V0.

3-1-5. Detección de ácidos orgánicosEl grupo funcional compartido por los ácidos orgánicos es el grupo carboxilo, que tiene una absorción UV de entre 200 y 210nm, lo que permite el uso de un detector UV. No obstante, dado que muchas otras sustancias orgánicas tienen la misma longitud de onda para la absorción UV, y también porque el coeficiente de extinción molar es de 50 a 70, es posible que la detección de ácidos orgánicos sea influida por las impurezas. El detector RI carece de selectivi-dad y sigue siendo algo problemático respecto de la sensibi-lidad. La detección con el detector de conductividad (CD) es propensa a la variación de sensibilidad según la clase de ácido orgánico. Como método de detección selectiva de ácidos orgánicos, se encuentra disponible el método post-columna con indicador de pH, que emplea un espectrosco-pio de absorción visible (VIS). (Fig. 3-2)

Fig. 3-2 Comparación de cromatogramas con diversos detectores

Fig. 3-1 Modo de exclusión iónica

Columna : Shodex RSpak KC-G (6,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm)x2 Eluente : 3mM HClO4 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minTemp. de la columna : 50˚C

Muestra:1. Ácido cítrico 800ppm2. Ácido tartárico 900ppm3. Ácido málico 800ppm4. Ácido succínico 700ppm5. Ácido láctico 1.100ppm6. Ácido fórmico 600ppm7. Ácido acético 700ppm8. Ácido levulínico 1.500ppm9. Ácido piroglutámico 1.500ppm

Método post-columnaVIS (430nm)

UV(210nm)

Detector de conductividad (CD)

Índice de refracción (RI)

resina

Estado de no disociación

Exclusión iónica

Estado de disociación

5

1

1

1

1

2

2

2

2

3

3

3

3

4

4

4

4

5

5

5

5

6

6

6

6

7

7

7

7

8

8

8

8

9

9

9

9

10

5 10

15 20 min

15 20 min

5 10 15 20 min

5 10 15 20 min

Ka: constante de disociación de ácidos

- 14 -

Muestra:1. Ácido cítrico2. Ácido tartárico3. Ácido pirúvico4. Ácido málico5. Ácido succínico6. Ácido glicólico7. Ácido láctico8. Ácido fumárico9. Ácido acético10. Ácido levulínico11. Ácido piroglutámico12. Ácido propiónico13. Ácido isobutírico14. Ácido n-butírico

Columna : Shodex RSpak KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 6mM HClO4 ac.Reactivo : ST3-R diluido 10 veces (para el método de post-columna)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : VIS (430nm)Temp. de la columna : 50 °C

Se analizaron los ácidos orgánicos generales con el método de postcolumna. Después de la separación con la columna KC-811, se agregó un reactivo y se detectó con 430nm.

Muestra:1. Ácido succínico2. Ácido láctico3. Ácido fórmico4. Ácido acético5. Ácido propiónico6. Ácido isobutírico7. Ácido n-butírico8. Ácido isovalérico9. Ácido n-valérico

Muestra: Salsa de soja1. Ácido cítrico2. Ácido pirúvico3. Ácido málico4. Ácido succínico5. Ácido láctico6. Ácido fórmico7. Ácido acético8. Ácido piroglutámico

Columna : Shodex RSpak KC-LG (8,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2 Reactivo : ST3-R diluido 10 veces (para el modo de post-columna)Índice de flujo : (Eluente);1,0ml/min (Reactivo); 0,5ml/minDetector : VIS (430nm)Temp. de la columna : 47˚C

El tiempo de elución de los ácidos orgánicos con hidrofobicidad fuerte puede acortarse agregando 10% del acetonitrilo al eluente.

Columna : Shodex RSpak KC-G (6,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2 Eluente : 3mM HClO4 ac. Índice de flujo : 1,0ml/minTemp. de la columna : 50˚C

Para muestras reales de alimentos que contienen aminoácidos, azúcares, NaCl, iones, sustancias orgánicas, etc., se recomienda el método de post-columna, ya que permite un análisis altamente selectivo. La detección UV (210 nm) detecta numerosas sustancias que no son ácidos orgánicos y la detección de conductividad produce un pico importante de iones de CI no incluidos en la posición correspondiente a 10 minutos aproximadamente. Por lo tanto, la cuantificabilidad de los ácidos orgánicos se ve afectada con estos métodos. En el caso de la detección RI, los ácidos orgánicos son difíciles de cuantificar, ya que se detectan casi todos los componentes, entre ellos, los azúcares.

Fig. 3-3. Análisis de ácidos orgánicos con método de post-columna

Fig. 3-4 Efecto de elución de ácidos orgánicos con adición de acetonitrilo

Fig. 3-5 Comparación de los resultados de la salsa de soja con diversos detectores

Eluente : 2mM HCIO4

Eluente : 2mM HCIO4/CH3CN=90/10

3-2. Ácidos orgánicos

10

1

2

3

4 56 8

9

10

11

12

13 14

7

20 30 min

15 20

20

1

2 3 45

6 7 8 9

25 30 35 40

25 30 min

Método post-columnaVIS(430nm)

UV(210nm)

Detector deconductividad (CD)

Índice de refracción (RI)

3 µL salsa de soja1 µL salsa de soja

10 µL salsa de soja1 µL salsa de soja

5

1

1

12

5

5

7

8

2

212

3

44

5

4

5

6

6

7 7

78

8 8

10 15 20 25 min

min5 10 15 20 25

min5 10 15 20 25 30

5 10 15 20 25 30 min

- 15 -

Muestra: Vino, 10 µL1. Ácido cítrico2. Ácido tartárico3. Ácido málico4. Ácido succínico5. Ácido láctico6. Ácido fumárico7. Ácido acético8. Ácido piroglutámico

Columna : Shodex RSpak KC-LG (8,0mm de diámetro x 50mm) + KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 3mM HClO4 ac.Reagent : 1/10 ST3-R (para el método de post-columna)Índice de flujo : (Eluente); 1,0ml/min (Reactivo); 0,7ml/minDetector : VIS (430nm)Temp. de la columna : 45˚C

Las uvas son ricas en ácido málico. Se sabe que el vino se añeja como resultado de la conversión del ácido málico en ácido láctico por la acción de las enzimas durante la fermentación maloláctica. La reserva de vinos tienen casi todo el ácido málico convertido en ácido láctico.

Muestra:1. Ácido glioxílico, 1,78mg/ml2. Ácido tartárico, 1,95mg/ml3. Ácido málico, 2,06mg/ml4. Ácido láctico, 2 µL/mL5. Ácido malónico, 1,95mg/ml6. Ácido láctico, 2 µL/mL7. Ácido succínico, 2,05mg/ml8. Ácido levulínico, 1,95mg/ml9. Ácido propiónico, 2 µL/mL

Muestra: Cerveza diluida 10 veces, 30 µL 1. Ácido acético 2. H2PO4

-, Ácido succínico Ácido piroglutámico 3. Ácido láctico, ácido pirúvico 4. Cl-

5. Ácido málico, Br-

6. NO3-

7. Ácido oxálico 8. Ácido cítrico 9. SO4

2-

10. Ácido tartárico

Columna : Shodex RSpak DE-413 (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : 10mM H3PO4 aq.FÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 50˚C

Cuando se utiliza el agua como eluente con una solución buffer al 100%, la vida de las columnas ODS por lo general se acorta. Dado que el material del empaque de RSpak DE-413 es químicamente estable, se puede lograr una larga vida de la columna y resultados estables incluso cuando se usa el agua como eluente en una solución buffer al 100%.

Columna : Shodex IC I-524A (4,6mm de diámetro x 100mm) Eluente : 1,5mM de ácido ftálico + 1,38mM de tris(hidroximetil) aminometano (pH4,0) + 300mM de ácido bóricoÍndice de flujo : 1,2ml/minDetector : Detector de conductividad (CD)Temp. de la columna : 40˚C

El eluente utilizado aquí es apropiado para el análisis simultáneo de aniones inorgánicos y ácidos orgánicos dibásicos y tribásicos con IC I-524A. Los ácidos orgánicos se encuentran en la cerveza e interfieren en la cuantificación de aniones. Cl-, NO3

- y SO42- pueden ser separados sin la

interferencia de los ácidos orgánicos. Los ácidos orgánicos, el ácido oxálico y el ácido cítrico también pueden analizarse sin interferencia.

Fig. 3-6 Ácidos orgánicos en el vino blanco

Fig. 3-7 Ácidos orgánicos (modo de fase reversa)

Fig. 3-8 Ácidos orgánicos y aniones en la cerveza (modo de intercambio aniónico)

Vino de alta calidad Vino de mesa

En los apéndices B, C y D se muestra la tabla de volumen de elución de los ácidos orgánicos con cada columna.

10 15 20 25 min 10 15 20 25 min

2

2

1

5

5 6

7

783

3

44

0 1

1

2

2

3

3

4

4

5

5

6

6

7

7

8 min

98

0

1

2

4

3

5 67

89

5 10 15 20 min

- 16 -

F7621001F7621002F7620002F7620001F6710001F6710023F7620004F7620003F6710022F7620009F6713001F7001004F7001005F7009030F7001006F6700150F7001007F6700151F7630002F7630001F6710016F7630006F6713000F6650050F6650051

Asahipak ODP-40 4DAsahipak ODP-40 4EAsahipak ODP-50 6DAsahipak ODP-50 6EAsahipak ODP-50G 6AAsahipak ODP-50 4BAsahipak ODP-50 4DAsahipak ODP-50 4EAsahipak ODP-50G 4AAsahipak ODP-50 2DAsahipak ODP-50G 2ARSpak DE-613RSpak DE-413RSpak DE-413LRSpak DE-413SRSpak DE-GRSpak DE-213RSpak DE-SGAsahipak NH2P-50 4DAsahipak NH2P-50 4EAsahipak NH2P-50G 4AAsahipak NH2P-50 2DAsahipak NH2P-50G 2ASilica 5SIL 4DSilica 5SIL 4E

> 11.000> 17.000> 9.000> 14.000

(Guarda columna)> 2.500> 9.000> 14.000

(Guarda columna)> 5.000

(Guarda columna)> 7.000> 11.000> 17.000> 3.000


(Guarda columna)> 5.500> 7.500



> 15.000

445555555556444

10445555555

4,6 x 1504,6 x 2506,0 x 1506,0 x 2506,0 x 104,6 x 504,6 x 1504,6 x 2504,6 x 102,0 x 1502,0 x 106,0 x 1504,6 x 1504,6 x 2504,6 x 504,6 x 102,0 x 1502,0 x 104,6 x 1504,6 x 2504,6 x 102,0 x 1502,0 x 104,6 x 1504,6 x 250

Tabla 4-1. Columnas Shodex para análisis de vitaminas(Absorción y partición)

Fig. 4-1 Categorías de las vitaminas

Código deproducto

Nombre del productoNúmero de plato

teórico(PT/columna)


(μm)

Diámetro x largo

(mm)

4. Vitaminas

Existen dos tipos de vitaminas, la vitamina soluble en grasa y la vitamina soluble en agua. (Fig. 4-1) Es posible analizar las vitaminas de manera simultánea, aunque muchos métodos oficiales muestran los respectivos métodos de análisis. Los principales análisis mediante HPLC son el de fase reversa o el de fase normal; además, puede aplicarse la cromatografía por exclusión de tamaño. La tabla 4-1 muestra la alineación de las columnas empacadas de Shodex para análisis de vitaminas con modos de separación.

Vitaminas solubles en grasas

Vitaminas solubles en agua

A

D

E

K

B1

B2

B3

B5

B6

B12

B13

BT

C

H

M

Retinol, β-Caroteno

Ergocalciferol (D2), Colecalciferol (D3)

α, β, γ, δ-Tocoferol

Filoquinona (K1), Menaquinona (K2), Menadiona (K3)

Tiamina

Riboflavina

Niacina (ácido nicotínico), Niacinamida (Niacinamida)

Ácido pantoténico

Piridoxina, piridoxal, piridoxamina

Cianocobalamina

Ácido orótico

Carnitina

Ácido ascórbico

Biotina

Ácido fólico

Diámetro xlargo(mm)

β

α β γ δ

- 17 -

F6028010

F6700300

GPC KF-801

GPC KF-G

> 18.000

(Guarda columna)

6

8

1.500 8,0 x 300

4,6 x 10

( Exclusión por tamaño )

Código deproducto Nombre del producto

Número de plato teórico

(PT/columna)


Número de plato teórico

(PT/columna)

Tamaño de la partícula(μm)

Límite deexclusión

(poliestireno)

Tamaño dela partícula

(μm)

Diámetro xlargo(mm)

F7008140

F7008150

F6700510

F7008160

RSpak NN-814

RSpak NN-614

RSpak NN-G

RSpak NN-414

> 9.000

> 4.000

(Guarda columna)

> 6.000

10

10

10

10

8,0 x 250

6,0 x 150

6,0 x 50

4,6 x 150

( Multi modo )

Muestra : 20 μL1. Menadiona (Vitamina K3)2. Retinol (Vitamina A)3. Acetato de retinol (acetato de Vitamina A)4. Menadiona (Vitamina D2)5. Colecalciferol (Vitamina D3)6. α-tocoferol acetato (acetato de Vitamina E)7. α-tocoferol (Vitamina E)8. Filoquinona (Vitamina K1)

Columna : Shodex Asahipak ODP-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : CH3CN/CH3OH=50/50Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : UV(280nm)Temp. de la columna : 30˚C

Muestra : 100 μL1. Palmitato de retinol (palmitato de Vitamina A)2. α-tocoferol (Vitamina E)3. Colecalciferol (Vitamina D3)4. Menadiona (Vitamina K3)

Columna : Shodex GPC KF-801 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : THFÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV(280nm)Temp. de la columna : 40˚C

Fig. 4-2 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en grasas (modo de fase reversa)

Fig. 4-3 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en grasas (modo de fase reversa)

4-1. Vitaminas solubles en grasas

0 5

1

2

3

4

5

6 7

8

10 15 20 25min

0

1

3

4

2

5 10 15 20 25min

- 18 -

Muestra: Margarina al 0,2%, 100 μL1. Palmitato de retinol (Palmitato de vitamina A)

Columna : Shodex GPC KF-801 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : THFÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (325nm)Temp. de la columna : 40˚C

El palmitato de vitamina A fue analizado con GPC KF-801. Se utilizó para la detección una longitud de onda de 325nm en una absorción UV máxima. Sólo mediante la disolución de la muestra en el eluente (THF) y filtrándola con un filtro descartable (0,45 μm), se pudo analizar el palmitato de vitamina A sin otro pretratamiento como la saponificación.

Fig. 4-4 Palmitato de vitamina A en la margarina (modo por exclusión de tamaño)

Muestra: Tocoferol1. α-Tocoferol2. β-Tocoferol3. γ-Tocoferol4. δ-Tocoferol

Columna : Shodex Silica 5SIL 4D (4,6mm de diámetro x 150mm) Eluente : n-Hexano/2-Propanol=99,5/0,5 Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV(280nm)Temp. de la columna : 30˚C

Se separaron alfa, beta, gamma y delta-tocoferol mediante el modo de fase normal con una mezcla de n-hexano/isopropanol como eluente.

Fig. 4-6 Vitamina E (modo de fase normal)

Muestra: 0,1 μg/ml c/u, 100 μL1. Ergocalciferol (Vitamina D2)2. Colecalciferol (Vitamina D3)

Columna : Shodex Asahipak ODP-50 6D (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : CH3CN/CH3OH=90/10Índice de flujo : 1,5ml/minDetector : UV (265nm)Temp. de la columna : 27˚C

La vitamina D2 y D3 se separaron con Asahipak ODP- 50 6D (columna con base de polímero) con el modo de fase reversa. Dado que el rango de pH utilizable de la columna ODP-50 es muy amplio y puede lavarse tanto con solventes ácidos como alcalinos, es de gran duración, incluso cuando se utiliza para muestras en bruto.

Fig. 4-5 Vitaminas D2 y D3 (modo de fase reversa)

0

1

5 10 15 20 25

min

0 5

1

2

10 15min

0

1

2

3

4

5 10 15 min

- 19 -

Muestra: 20 μL1. Ácido ascórbico (Vitamina C)2. Niacina (Vitamina B3)3. Piridoxina (Vitamina B6)4. Niacinamida (Vitamina B3)5. Tiamina (Vitamina B1) 6. Cianocobalamina (Vitamina B12)7. Riboflavina (Vitamina B2)

Columna : Shodex RSpak DE-413 (4,6mm de diámetro x 150mm) Eluente : (A); 1/30M Solución buffer de fosfato de potasio (pH6,8) /CH3CN=98/2 (B); H2O/CH3CN=50/50 0 min a 4 min, 100% (A) 4 min a 15 min, 100% (A) a 70% (B) Después de 15 min, 70% (B)Índice de flujo : 0,6ml/minDetector : Shodex UV (254nm)Temp. de la columna : 35˚C

Fig. 4-7 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en agua (modo de fase reversa)

Columna : Shodex RSpak NN-614 (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : 45mM KH2PO4 + 55mM Na2HPO4 ac.Reactivo : 0,01% K3Fe(CN)6 + 15% NaOHÍndice de flujo : 0,7ml/minDetector : Fluorescencia (Ex. 375nm, Em. 450nm)Temp. de la columna : 25˚C

La cantidad total de vitamina B1 fue medida con RSpak NN- 614 con un eluente de solución buffer de fosfato. La vitamina B1 separada por la columna se convierte en tiocromo con un reactivo post columna con un detector de fluorescencia. Este método fue recomendado por Métodos estándar de análisis para químicos de higiene con comentario (1990).

Fig. 4-9 Vitamina B1 (multi modo)

Muestra: 0,25% c/u, 3 μL1. Ácido pantoténico2. Ácido orótico3. Piridoxina HCI (Vitamina B6)4. Nicotinamida5. Vitamina B1

6. Vitamina B2

Columna : Shodex RSpak NN-814 (8,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : 45mM KH2PO4 + 55mM Na2HPO4 + 7% CH3OH Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (210nm)Temp. de la columna : Temp. ambiente

NN-814 es una columna multi modo (fase reversa + intercambio catiónico). Con NN-814, se puede realizar un análisis isocrático y no requiere un reactivo de par iónico.

Fig. 4-8 Análisis simultáneo de vitaminas solubles en agua (multi modo)

4-2. Vitaminas solubles en agua

Muestra: 1ng/μL hidrocloruro de tiamina, 10 μL

0

1

2

3

4 5

6

7

5 10 15 20min

0

1

2

3 4

5 6

10 20 30 min

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

ia

Vitamina B1 (ng)0

5

50 100

10

10 20 min.

Vitamina B1 (tiamina) Tiocromo

Reagent

- 20 -

Columna : Shodex Asahipak ODP-50 6D (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : 50mM Sodium phosphate buffer(pH2,0)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (254nm)Temp. de la columna : 30˚C

Los miembros de familia de la vitamina B6 son difíciles de separar, debido a su similitud estructural. Aunque el método usual de separación emplea un reactivo de par iónico, el análisis en modo de fase reversa es posible según las leves diferencias de hidrofobicidad entre las muestras individuales, siempre que la acidez sea elevada, por ejemplo, pH2,0. En realidad, fueron separados tres ingredientes en aproximadamente 5 minutos con la columna de polímero de fase reversa Asahipak ODP-50, que es estable incluso en un pH de 2,0.

Fig. 4-10 Vitamina B6 (modo de fase reversa)

Columna : Shodex RSpak NN-814 (8,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : 0,1M KH2PO4 ac.Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : Temp. ambiente

La carnitina (Vitamina BT) estándar fue separada con RSpak NN- 814 (multi-modo). El principal pico se observó a los 12 minutos y se observaron picos de impurezas a los 8 a 10 minutos.

Equilibrio: Después de pasar 60mM de ácido fosfórico en la columna a razón de 0,5ml/min durante 2 horas, se reemplaza por el eluente.

Fig. 4-12 Vitamina BT (multi-modo)

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluent : 20mM NaH2PO4+30mM H3PO4 ac. /CH3CN=20/80Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (254nm)Temp. de la columna : 30˚C

Generalmente, se utilizan amino columnas o columnas de sílice para el análisis del ácido ascórbico. El uso de amino columnas están bastante generalizado porque el ácido isoascórbico (eritórbico), al igual que el ácido ascórbico, pueden ser analizados simultáneamente. No obstante, las amino columnas convencionales con base de sílice no son químicamente estables, por lo tanto, su tiempo de vida no es prolongado.

Asahipak NH2P-50 4E tiene un tiempo de vida prolongado, dado que es una columna estable con base de polímero.

Fig. 4-11 Vitamina C (modo de fase normal)

Muestra: Carnitina (Vitamina BT)

0

1

2

3

5 min

0

O=C

ácido eritórbico

ácido L-ascórbico

OHOC

HOC

HCOH

CH3OH

HC

5

1

2

10 min

O=C

OHOC

HOC

OHCH

CH3OH

HC

Muestra : 5 µg/n1. Ery2. Aso

0 5 10 min

1 = 1µg2 = 2µg3 = 1,2µg

- 21 -

Muestra : CnH2n+1COOH, 40 µL1. Ácido cáprico (n=9)2. Ácido láurico (n=11)3. Ácido mirístico (n=13)4. Ácido palmítco (n=15)5. Ácido esteárico (n=17)6. Ácido araquídico, ácido eicosanoico (n=19)7. Ácido behénico, ácido docosanoico (n=21)

Columna : Shodex RSpak DE-413 (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : CH3CN/THF/H2O=45/20/35Índice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C

Fig. 5-1 Ácidos grasos superiores (1)

Muestra:1. EPA (ácido eicosapentaenoico)2. DHA (ácido docosahexaenoico)3. Ácido araquidónico4. Ácido linoleico

Columna : Shodex ODSpak F-411 (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : H2O/CH3CN=20/80Índice de flujo : 0,7ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30˚C

Se sabe que el EPA y el DHA, son ácidos grasos esenciales abundantes en los pescados que son efectivos para prevenir trombosis y mejorar la función cerebral.

Fig. 5-2 Ácidos grasos superiores (2)

5. Otros ingredientes en los alimentos

5-1. Ácidos grasos superiores

F7001004

F7001005

F7009030

F7001006

F6700150

F7001007

F6700151

F6604112

F6605110

F6604113

RSpak DE-613

RSpak DE-413

RSpak DE-413L

RSpak DE-413S

RSpak DE-G

RSpak DE-213

RSpak DE-SG

ODSpak F-411

ODSpak F-511

ODSpak F-411/S

> 7.000

> 11.000

> 17.000

> 3.000

(Guarda columna)

> 8.000

(Guarda columna)

> 8.000

> 14.000

> 10.000

6

4

4

4

10

4

4

5

5

3

—

—

—

—

—

—

—

14

14

14

6,0 x 150

4,6 x 150

4,6 x 250

4,6 x 50

4,6 x 10

2,0 x 150

2,0 x 10

4,6 x 150

4,6 x 250

4,6 x 100

Tabla 5-1. Columnas Shodex para el análisis de ácidos grasos superiores(Absorción y partición)


Número de plato teórico(PT/columna)

Contenidode carbono

(%)

Tamaño dela partícula

(µm)

Diámetrox largo(mm)

0

1 23

45

6

7

2 4 6 8 10 12 14

14

16 18 20 min

5 10

1

2

34

20 min

- 22 -

Fig. 5-3 Ácidos nucleicos como componentes del gusto

IMP, GMP y AMP (nucleótidos), ingredientes representativos del umami (Ácidos nucleicos del gusto) y todos sus metabolitos fueron analizados mediante elución isocrática con la columna Asahipak GS-320 7E. No solo el modo de exclusión por tamaño (modo principal) sino también el modo de fase reversa y el de intercambio iónico, por lo tanto, la columna GS-320 7E es capaz de separar completamente en 30 minutos un total de nueve ingredientes (nucleósidos correspondientes y algunas bases) desde IMP, GMP, AMp y otros nucleósidos.

5-2. Ácidos nucleicos como componentes del gusto

F7610005

F6710019

Asahipak GS-320 7E

Asahipak GS-2G 7B

7,5 x 300

7,5 x 50

Tabla 5-2. Columnas Shodex para análisis de compuestos del gusto(Multi modo)

Código deproducto

Nombre del productoDiámetrox largo(mm)

Columna : Shodex Asahipak GS-320 7E (7,5mm de diámetro x 250mm) Eluente : 10mM solución buffer de fosfato de sodio (pH5,0)Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : UV (260nm)Temp. de la columna : 30˚C

Muestra :

0

1

2

3

4

56

7 89

10 20 30 min

- 23 -

Fig. 5-4 Aminoácidos (modo de intercambio catiónico fuerte)

5-3. Aminoácidos

Columna : Shodex CXpak P-421S (4,6mm de diámetro x 150mm)Eluente : No.1; 0,12M de solución buffer de citrato de sodio (pH3,3) No.2; 0,13M de solución buffer de citrato de sodio (pH3,2) No.3; 0,11M de solución buffer de citrato de sodio (pH4,0) No.4; 1,02M de solución buffer de citrato de sodio (pH4,9) No.5; 0,2M NaOH + 10% C2H5OH (Solución de enjuague) Gradiente de presión baja 0min, No.1 1,2min, No.2 10,0min, No.3 21,2min, No.4 40,0min, No.5Índice de flujo : 0,5ml/minDetector : VIS (570nm) (Reacción de ninhidrina; 0,35ml/min, 120˚C) Temp. de la columna : 63˚C

Fig. 5-5 Aminoácidos (multi modo)

Los aminoácidos ácidos, como el ácido aspártico, se separan con por el modo de exclusión iónico y se eluyen más rápidamente. Las sustancias neutrales se separan mediante fase reversa y los aminoácidos alcalinos se separan mediante una mezcla de fase reversa (en caso de estructura hidrofóbica) y modo de intercambio iónico. Por lo tanto, los aminoácidos se eluyen en este orden: primero los aminoácidos ácidos, después los aminoácidos neutrales y por último los aminoácidos alcalinos.

Columna : Shodex RSpak NN-814 (8,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : 40mM H3PO4 ac.Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 40˚C

F6354211

F6700210

CXpak P-421S

CXpak P-GIntercambio catiónico fuerte

6

10

4,6 x 150

4,6 x 10

Tabla 5-3. Columnas Shodex para el análisis de aminoácidos(Intercambio catiónico fuerte)

Código deproducto

Nombre del producto Modo de separaciónTamaño dela partícula

(µm)


Código deproducto

Nombre del producto Modo de separaciónTamaño dela partícula

(µm)


F7008140

F7008150

F6700510

F7008160

RSpak NN-814

RSpak NN-614

RSpak NN-G

RSpak NN-414

Exclusión iónica+

Intercambio iónico+

Fase reversa

10

10

10

10

8,0 x 250

6,0 x 150

6,0 x 50

4,6 x 150

Tabla 5-3. Columnas Shodex para el análisis de aminoácidos(multi modo)

Muestra : 20 µL1. Ácido aspártico2. Glicina3. Alanina4. Valina5. Metionina6. Isoleucina

Muestra: 2,5nmol c/u, 100 µL

0

1

23

4

5

6

20 40 60 80 min

- 24 -

Apéndice

A. Volumen de elución de sacáridos

N-acetil-α-D-glucosamina

D(+)-arabinosa

D-Arabitol

Aspartamo

2-desoxi-D-glucosa

Anhídrido de difructosa III

Dulcitol

Meso-eritritol

Etanol

1-fructofuranosil nistosa

D(-)-fructosa

D(+)-fucosa

D(+)-galactosa

4'-galactosil lactosa

Ácido α-D-galacturónico

Gentiobiosa

Glucosa

Glicerol

Glicirricina

Mio-inositol

Isomaltosa

Isomaltotriosa

1-Kestosa

Kojibiosa

Lactitol

Lactosa

Lactosilfructósido

Lactulosa

Maltitol

Maltoheptaosa

Maltohexaosa

Maltopentosa

Maltosa

Maltotriosa

Mannitol

D-manosa

D(+)-melezitosa

Melibiosa

Metil-α-D-manopiranósido

Nistosa

Palatinita

8,9

10,4

15,9

-

8,8

7,1

20,2

12,7

11,1

6,1

11,1

10,5

9,7

7,4

-

7,2

8,6

-

12,8

7,7

7,1

6,8

7,6

13,3

8,1

7,1

9,1

12,2

7,9

7,5

15,8

10,7

6,9

8,2

11,1

6,4

2picos

7,8

8,9

11,3

-

7,6

6,3

12,8

10,1

11,3

5,3

8,9

8,8

8,0

6,0

6,3

6,1

7,3

-

8,9

6,3

5,8

5,8

6,2

8,1

6,5

5,9

7,0

8,3

6,3

5,9

11,1

8,2

5,8

6,5

8,9

5,5

2picos

6,7

8,2

7,6

-

7,2

5,8

7,4

7,9

10,1

4,8

7,7

8,1

7,6

5,4

4,4

5,8

7,2

-

8,0

6,0

5,3

5,3

5,9

6,1

6,0

5,3

6,2

6,0

5,9

5,4

7,2

7,6

5,2

6,0

7,8

4,9

5,9

-

5,1

7,3

-

4,3

4,3

9,5

5,7

-

31,4

5,4

4,5

6,5

19,0

-

10,5

5,9

-

12,6

10,6

21,2

13,1

9,7

16,4

10,1

14,7

9,2

13,0

8,7

13,8

8,8

5,8

13,6

11,7

4,0

20,1

2picos

4,1

5,6

8,2

34,0

4,0

*

11,3

6,3

4,3

*

5,9

5,0

5,0

*

5,6

*

4,8

2,7

7,9

*

*

*

*

6,7

4,1

*

4,7

6,8

*

*

9,0

5,0

*

4,2

4,4

*

2picos

6,7

6,2

6,3

-

6,0

7,8

7,5

5,4

-

-

6,8

5,4

8,1

21,7

-

16,4

8,6

-

10,0

15,2

27,6

20,1

14,8

11,8

13,3

19,0

10,7

11,8

14,2

25,0

7,4

7,8

19,3

14,7

4,7

31,9

12,7

17,4

14,2

17,1

16,6

16,8

17,8

15,6

14,7

15,3

15,5

15,7

15,8

14,8

14,6

14,3

16,1

15,6

14,7

SP0810Pb2+

SC1011Ca2+

KS-801Na+

SZ5532Zn2+

SC1211Ca2+ NH2P-50 4E

GS-220 HQx 2

Sustancias

Volumen de elución (ml)

Serie SUGAR Asahipak Asahipak

( - ) no se puede detectar ( * ) no se puede separar del pico del solvente.

- 25 -

Columna : Shodex SUGAR SP0810, SC1011, KS-801 (8,0mm de diámetro x 300mm c/u)Eluente : H2OÍndice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 80˚C

Columna : Shodex SUGAR SZ5532 (6,0mm de diámetro x 150mm)Eluente : H2O/CH3CN=25/75Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C

Columna : Shodex SUGAR SC1211 (6,0mm de diámetro x 250mm)Eluente : H2O/CH3CN=65/35Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 70˚C

Columna : Shodex Asahipak NH2P-50 4E (4,6mm de diámetro x 250mm)Eluente : H2O/CH3CN=25/75Índice de flujo : 1,0ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 30˚C

Columna : Shodex Asahipak GS-220 HQ (7,5mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : H2OÍndice de flujo : 0,5ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C

Palatinosa

Panosa

L-fenilalanina

D(+)-rafinosa

D(+)-ramnosa

D(-)-ribosa

Rutinosa

Sacarina sódica

D(-)-sorbitol

D(+)-sorboss

Estaquiosa

Esteviósido

Sacarosa

α-D-Talosa

Theanderosa

Trehalosa

Trehalulosa

Xilitol

Celobiosa

D(+)-xilosa

D-Xilulosa

7,8

7,1

-

7,1

9,8

19,4

7,8

7,0

21,6

9,7

6,8

-

7,5

21,3

2picos

7,6

8,9

19,9

8,2

9,2

10,6

6,5

5,8

-

5,8

8,2

13,7

6,5

5,4

13,3

8,0

5,6

-

6,3

12,6

2picos

6,3

7,0

13,1

6,7

7,1

9,0

5,9

5,3

-

5,3

7,4

9,0

5,8

4,3

7,4

7,4

5,0

-

5,9

8,8

2picos

5,8

6,1

7,9

6,4

7,7

8,0

8,1

16,9

-

16,4

3,9

4,8

6,7

6,8

9,8

5,1

-

4,1

7,9

5,7

2picos

10,9

9,5

7,8

5,7

4,6

4,1

3,99mL

*

31,6

*

4,4

8,6

*

*

11,9

4,9

*

*

*

8,5

*

*

4,8

10,2

*

4,5

5,1

12,1

25,6

-

20,3

5,5

5,5

10,9

5,7

7,1

7,4

36,2

6,1

11,9

6,5

2picos

13,3

11,7

6,1

9,1

6,6

5,4

15,1

16,6

14,3

16,3

16,9

17,5

SP0810Pb2+

SC1011Ca2+

KS-801Na+

SZ5532Zn2+

SC1211Ca2+ NH2P-50 4E

GS-220 HQx 2

Sustancias


Serie SUGAR Asahipak Asahipak

( - ) no se puede detectar ( * ) no se puede separar del pico solvente

- 26 -

B. Volumen de elución de sacáridos y ácidos orgánicos (SH1011)

Ácido oxálico

Estaquiosa

Isomaltotriosa

Panosa

Maltotriosa

Gentiobiosa

Isomaltosa

Melibiosa

Kojibiosa

Maltosa

Trehalosa

Nigerosa

Palatinita

Palatinosa

Trehalulosa

Lactosa

Celobiosa

Maltitol

Ácido D-glucurico

Ácido cítrico

Ácido α-cetoglutárico

Ácido maleico

Lactitol

Ácido N-Acetilneuramico

Ácido tartárico

Glucosa

Ácido pirúvico

Sorbosa

5,1

5,2

5,3

5,4

5,4

5,7

5,8

5,9

5,9

5,9

5,9

5,9

6,0

6,0

6,0

6,0

6,1

6,1

6,1

6,2

6,2

6,2

6,3

6,3

6,4

6,8

6,9

6,9

5,6

5,2

5,3

5,4

5,5

5,7

5,8

5,9

5,9

5,9

5,9

5,9

6,0

5,9

6,0

6,0

6,1

6,2

6,2

6,3

6,9

7,1

6,3

6,6

6,6

6,8

7,7

6,9

MuestraEluente

5mM 20mM

Mio-inositol

Ácido málico

D-manosa

D(+)-galactosa

D(+)-xilosa

Ácido malónico

D(-)-fructosa

Ácido trans-aconítico

Manitol

D(-)-sorbitol

D(+)-ramnosa

D(+)-arabinosa

D(-)-ribosa

D-arabitol

Xilitol

D(+)-fucosa

Ácido succínico

Meso-eritritol

N-acetil-α-D-glucosamina

Ácido láctico

N-acetil-α-D-galactosamina

Ácido fórmico

Ácido acético

Ácido adípico

Ácido mesacónico

Ácido L-piroglutamico

Ácido propiónico

Etanol

7,0

7,0

7,1

7,1

7,2

7,2

7,2

7,2

7,4

7,5

7,5

7,6

7,8

7,8

8,0

8,0

8,3

8,3

8,4

8,8

9,3

9,4

10,1

10,4

11,0

11,4

11,7

14,1

7,1

7,2

7,1

7,2

7,2

7,5

7,2

7,5

7,4

7,5

7,5

7,7

7,8

7,9

8,0

8,0

8,3

8,3

8,4

8,9

9,3

9,5

10,2

10,5

11,4

11,7

11,7

14,1

MuestraEluente

5mM 20mM

Columna : Shodex SUGAR SH1011 (8,0mm de diámetro x 300mm)Eluente : 5mM or 20mM H2SO4 aq.FÍndice de flujo : 0,6ml/minDetector : Índice de refracción (RI)Temp. de la columna : 60˚C

- 27 -

C. Volumen de elución de ácidos orgánicos (KC-811)

Ácido oxálico

Ácido maleico

ácido alfa-cetoglutárico

Ácido oxalacético

Ácido pirúvico

Ácido 2-cetoglucónico

Ácido fosfórico

Ácido cítrico

Ácido tartárico

Ácido isocítrico

Ácido glucurónico


Ácido malónico

Ácido galacturónico

Ácido glucónico

Ácido glioxílico

Ácido málico

Ácido alfa-hidroxi-glutárico

Ácido ascórbico

Ácido fumárico

Ácido succínico

Ácido glicólico

Ácido itacónico

Ácido láctico

Ácido 2-hidroxi-isobutírico

Ácido adípico

Ácido beta-hidroxipropiónico

Ácido fórmico

Ácido mesacónico

Ácido úrico

Ácido piroglutámico

Ácido acético

Ácido levulínico

Ácido propiónico

CO32-,HCO3-

Ácido isobutírico

Ácido n-butírico

Ácido isovalérico

Ácido n-valérico

9,3

9,7

10,0

10,5

10,5

10,6

10,6

10,8

11,1

11,1

11,2

11,5

11,5

11,8

12,3

12,4

12,5

13,5

13,5

14,5

15,3

15,6

15,9

16,0

16,5

16,7

16,9

17,2

17,2

17,9

18,6

19,2

20,0

22,3

24,7

25,4

27,3

31,9

38,4

9,4

10,2

10,4

11,2

11,2

11,1

11,0

11,3

11,7

11,5

11,4

12,4

12,4

12,1

12,5

12,9

13,0

13,9

13,7

16,1

15,5

15,9

16,4

16,4

16,8

19,8

17,0

17,6

19,2

17,9

20,3

19,3

20,2

22,4

24,7

25,5

27,5

32,1

38,6

9,6

10,5

10,9

11,8

11,8

11,5

11,3

11,7

12,1

11,9

11,7

13,1

13,0

12,4

12,8

13,3

13,4

14,0

13,9

17,2

15,8

16,3

16,8

16,7

17,1

20,2

17,2

17,9

20,5

18,3

21,0

19,4

20,3

22,5

24,5

25,6

27,6

32,3

38,9

9,7

11,1

11,4

12,5

12,5

11,7

11,6

11,8

12,3

11,9

11,8

13,5

13,4

12,4

12,5

13,9

13,4

14,2

13,8

17,8

15,7

16,2

16,8

16,7

17,1

20,0

17,1

17,9

21,1

18,0

21,7

19,4

20,2

22,5

24,7

25,6

27,6

32,2

38,8

Sustancia


1mMHCIO4

2mMHCIO4

3mMHCIO4

5mMHCIO4

Columna : Shodex RSpak KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : HClO4 aq.Índice de flujo : 1,0ml/minTemp. de la columna : 50˚C

- 28 -

D. Volumen de elución de ácidos orgánicos (KC-811)

Ácido oxálico

Ácido maleico

Ácido fosfórico

ácido α-cetoglutárico

Ácido 2-cetogluconico

Ácido glucurónico

Ácido pirúvico

Ácido cítrico

Ácido oxalacético

Ácido isocítrico

Ácido tartárico

Ácido galacturónico

Ácido glucónico

Ácido malónico


Ácido glioxílico

Ácido málico

Ácido ascórbico

Ácido α-hidroxi-glutárico

Ácido succínico

Ácido glicólico

Ácido láctico

Ácido 2-hidroxi-isobutírico

Ácido 3-hidroxipropiónico

Ácido itacónico

Ácido fórmico

Ácido fumárico

Ácido acético

Ácido úrico

Ácido levulínico

Ácido piroglutámico

Ácido adípico

Ácido propiónico

Ácido mesacónico

CO32-,HCO3-

Ácido isobutírico

Ácido n-butírico

Ácido isovalérico

Ácido n-valérico

9,7

10,7

11,0

11,1

11,6

11,7

11,9

11,9

12,0

12,1

12,4

12,5

12,8

13,3

14,0

13,3

13,7

14,1

14,6

16,5

16,6

16,8

17,0

17,5

17,8

18,2

19,2

19,9

20,7

22,1

22,9

23,1

23,5

24,0

24,3

27,1

29,8

35,7

45,1

Sustancia


30˚C

9,6

10,7

11,1

11,0

11,5

11,7

11,8

11,8

11,9

12,0

12,2

12,4

12,8

13,1

13,5

13,3

13,5

14,0

14,3

16,1

16,4

16,8

17,1

17,3

17,3

18,0

18,0

19,7

19,3

21,1

21,8

21,4

23,0

21,9

24,5

26,4

28,7

33,9

41,8

40˚C

9,6

10,5

11,3

10,9

11,5

11,7

11,8

11,7

11,8

11,9

12,1

12,4

12,8

13,0

13,1

13,3

13,4

13,9

14,1

15,8

16,3

16,7

17,1

17,2

16,8

17,9

17,2

19,4

18,3

20,3

21,0

20,2

22,5

20,5

24,5

25,6

27,6

32,3

38,9

50˚C

9,6

10,5

11,4

10,8

11,5

11,7

11,7

11,6

11,8

11,7

12,0

12,3

12,8

12,8

12,7

13,2

13,2

13,7

13,8

15,4

16,1

16,5

16,9

17,0

16,3

17,6

16,4

19,1

17,4

19,5

20,3

19,0

22,0

19,2

24,5

24,8

26,5

30,6

36,1

60˚C

9,5

10,5

11,5

10,7

11,4

11,7

11,7

11,5

11,7

11,6

11,9

12,3

12,9

12,7

12,5

13,1

13,0

13,6

14,0

15,1

15,9

16,4

16,8

16,8

15,9

17,5

15,8

18,8

16,8

18,9

19,8

18,1

21,5

18,1

24,4

24,0

25,5

29,0

33,6

70˚C

9,5

10,4

11,7

10,6

11,4

*

11,7

11,4

11,7

11,5

11,8

12,2

12,9

12,6

12,2

13,1

12,9

*

13,9

14,8

15,7

16,2

16,7

16,6

15,5

17,3

15,3

18,6

16,2

18,3

19,3

17,3

20,7

17,3

24,2

23,1

24,5

27,5

31,3

80˚C

Columna : Shodex RSpak KC-811 (8,0mm de diámetro x 300mm) x 2Eluente : 3mM HClO4 ac.Índice de flujo : 1,0ml/min

1. Leer en su totalidad el manual de instrucciones que acompaña el producto antes de utilizar las columnas.

2. Las especificaciones para los productos están sujetas a cambios sin aviso con el propósito de realizar mejoras.

3. No se ofrece garantía acerca de las cifras que aparecen en esta hoja técnica, dichas cifras deben utilizarse solo como referencia.

4. Si bien en este manual no hay advertencias en cuanto a la seguridad o peligro de los reactivos y productos químicos, asegúrese de tomar las precauciones habituales cuando toque los productos.

5. Los productos que se describen aquí no fueron diseñados para el uso en exámenes clínicos en el área médica.

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