Presentado por: Gabriela Álvarez Oviedo

METODOS PARA SEPARACIÓN Y PURIFICACIÓN DE

BIOMOLECULAS

PROTEÍNAS

¿QUÉ ES UNA PROTEÍNA?

• Las proteínas son macromoléculas formadas por cadenas lineales de aminoácidos.

• El término proteína proviene de la palabra francesa protéine y esta del griego πρωτε ος (proteios), que ῖsignifica 'prominente, de primera calidad‘

• Son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo.

• Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes, entre las que destacan:• Estructural. Esta es la función más importante de una

proteína (Ej: colágeno),• Inmunológica (anticuerpos),• Enzimática (Ej: sacarasa y pepsina),• Contráctil (actina y miosina).• Homeostática: colaboran en el mantenimiento del pH (ya

que actúan como un tampón químico),• Transducción de señales (Ej: rodopsina)• Protectora o defensiva (Ej: trombina y fibrinógeno)

Una célula contiene millones de proteínas distintas, separarlas y determinar su estructura es extremadamente difícil.

La purificación depende de lo que se va a determinar en una proteína:• Peso Molecular• Punto isoeléctrico• numero de subunidades• numero de aminoácidos• tipo de aminoácidos• secuencia de aminoácidos

• La fracción que nos interesa debe ser en principio separada, para posteriormente proceder a aislar y purificar la biomolécula contenida en la misma.

• En la tabla se muestra un resumen de los principales métodos empleados para purificar y aislar biomoléculas, estos métodos normalmente se combinan para lograr la forma pura de las biomoléculas (sin contaminación de otras).

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNASPara estudiar detalladamente las propiedades de cualquier proteína es preciso contar con una muestra homogénea que sólo contenga moléculas de un tipo.

Las técnicas de separación se concentran en el tamaño, la carga y la polaridad, que es donde residen las diferencias de las moléculas.

Se aplican muchas técnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura de la proteína de interés.

El porcentaje de recuperación indica cuánto de la proteína de interés se ha conservado en cada paso.

AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS

Para estudiar detalladamente las proteínas se necesita extraer las proteínas de la células y orgánulos subcelulares.Homogeneización: Ruptura de la célula.Moler el tejido en una licuadorahomogeneizador Potter-elvejhem.

CENTRIFUGACIÓN DIFERENCIAL

Después de la homogeneización, las células se someten a centrifugación diferencial, la muestra se hace girar a unas 500 veces la fuerza de la gravedad (500 x g).

Si la proteína deseada no se consigue, entonces la velocidad aumenta, por ejemplo a 10 000 x g, para separar las mitocondrias y así hasta obtener las proteínas deseadas para su investigación.

Una vez solubilizadas, se someten a una purificación burda, comúnmente hecha con el sulfato de amonio y a esto se le conoce como precipitación por sales.

AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS DE CÉLULAS

Las proteínas se mantienen disueltas gracias a sus interacciones con el agua. Cuando se añade sulfato de amonio a una solución de proteína, una parte del agua forma enlaces ion-dipolo con la sal.

Al haber menos agua disponible para hidratar las proteínas, éstas comienzan a interactuar hidrofóbicamente entre ellas. A una concentración definida de sulfato de amonio, se forma un precipitado que contiene las proteínas contaminantes.

Se separa por centrifugación y se desechan. Luego se añade más sal hasta que se precipita un grupo distinto de proteínas, donde se consigue la proteína de interés.

CROMATOGRAFÍA

• La etimología de la palabra cromatografía, viene del griego khromatos, que significa color, y graphia, que quiere decir escritura.

• La cromatografía es un método de separación de diferentes componentes de una muestra, logra la separación de los mismos a través del paso de una muestra por una fase estacionaria con la ayuda de la fase móvil, cada componente de la muestra tiene propiedades particulares que permitirá su interacción en forma diferente entre las fases.

• El objetivo principal de un estudio cromatografía es lograr la separación de todos los componentes en una muestra.

* Cromatografía

de columna

Esta técnica comenzó a usarse a principios del siglo XX para separar pigmentos vegetales cuyos colores se distinguían con facilidad, pero en la actualidad es posible separar compuestos incoloros; se basa en el hecho de que diferentes compuestos pueden distribuirse en distinto grado entre diferentes fases, o porciones separables de materia, se compone de 2 fases, estacionaria y la móvil que fluye sobre el material estacionario y se lleva consigo la muestra a separar.

El material que se constituye en la fase estacionaria se empaca en una columna, la fase móvil se pasa a través de la columna.

* Cromatografía de columna

CROMATOGRAFÍA POR FILTRACIÓN EN GEL

También llamada por excusión de tamaño, separa moléculas con base en su tamaño, es útil para ordenar proteínas con pesos moleculares variados.

En esta forma de cromatografía la fase estacionaria consiste en partículas de gel que forman enlaces cruzados, están en forma de granulado y consisten en uno o dos tipos de polímeros. Uno de carbohidrato como dextrano o agarosa y el segundo puede ser una poliacrilamida y la estructura creada con enlaces cruzados de estos polímeros crea poros en el material.

CROMATOGRAFÍA POR AFINIDAD

aprovecha las propiedades especificas de unión de muchas proteínas, también se usa un material polimérico como fase estacionaria, se distingue porque el polímero esta unido por enlaces covalentes con algún compuesto, llamado ligando, que se une específicamente a la proteína deseada.

Las demás ´proteínas de la muestra no se unen en la columnas y se eluyen con facilidad con amortiguador, mientras que la proteína unida permanece en la columna.

Electroforesis

Etimología:Del griego ἤλεκτρον ("ámbar") y φόρησις ("transporte") La electroforesis se basa en el movimiento de partículas cargadas en un campo eléctrico, hacia un electrodo con carga opuesta. La movilidad de las macromoléculas depende de su carga, forma y tamaño.

Aunque se han usado muchos medios de soporte para electroforesis, que incluyen papel y líquidos, el soporte más común es un polímero de agarosa o acrilamida similar a los empleados en cromatografía de columna.

Se aplica una muestra a depresiones moldeadas en el medio de soporte. Se hace pasar una corriente eléctrica por el medio, a un voltaje controlado, para lograr la separación deseada, una vez que las proteínas se separan en el gel se tiñe para revelar la ubicación de las proteínas.

*Electroforesis

Electroforesis Bidimensional

Determinación de la estructura primaria de

una proteína

DETERMINACIÓN DE LA ESTRUCTURA PRIMARIA DE UNA PROTEÍNA

Determinar la sucesión de aminoácidos de una proteína es una operación rutinaria, aunque no trivial, en bioquímica clásica. Las distintas partes se deben efectuar cuidadosamente para obtener resultados correctos. El primer paso es averiguar que aminoácidos están presentes y en que proporciones.

Basta calentar una solución de la proteína en ácido, por lo regular HCL 6 m a 100-110°C durante 12-36 horas para hidrolizar los enlaces pepiticos.