Altération de la réponse cérébrale à l'insuline chez les ...

Altération de la réponse cérébrale à l'insuline chez les souris transgéniques exprimant l'allèle ε4 de

l'apolipoprotéine E humaine

Mémoire

Marie-Thérèse Traversy

Maîtrise en sciences pharmaceutiques Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Marie-Thérèse Traversy, 2015

iii

Résumé

La maladie d’Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative incurable, dont le principal facteur de

risque génétique est l’isoforme epsilon-4 du gène de l’apolipoprotéine E (APOE4). La littérature rapporte

une insulinorésistance cérébrale chez les patients atteints de la MA, associe APOE4 à des particularités

dans la signalisation de cette hormone et montre que les patients APOE4 ne bénéficient pas d’un traitement

intranasal à l’insuline, contrairement aux autres génotypes APOE. L’hypothèse que nous avons émise est

qu’il y aurait des différences dans la réponse cérébrale à l’insuline entre les souris transgéniques APOE3 et

APOE4. Nous avons vérifié l’effet d’une injection d’insuline sur leur comportement et sur la concentration de

différentes protéines impliquées dans la signalisation de l’hormone et le développement de la MA. Nos

résultats suggèrent une altération dans la réponse cérébrale à l’insuline chez les souris APOE4, qui pourrait

entraîner l’hyperphosphorylation de la protéine tau, un marqueur neuropathologique de la MA.

v

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is a incurable neurodegenerative disorder for which epsilon-4 isoform of

apolipoprotein E gene (APOE4) is the main genetic risk factor. Previous studies have shown cerebral insulin

resistance in AD patients and an association between APOE4 genotype and insulin brain signaling defects.

Intranasal insulin treatment improves cognition in non-carriers of APOE4 but has no beneficial effects on

APOE4 carriers. We hypothesized that brain insulin response would differ between APOE3 and APOE4

transgenic mice. We verified the effect of a single acute insulin injection on the behaviour and concentration

of different proteins involved in insulin signaling and AD development in these mice. The results of our study

suggest an altered cerebral insulin response in transgenic mice expressing the human APOE4 isoform, that

could possibly lead to tau hyperphosphorylation, a neuropathological marker for AD.

vii

Table des matières

Résumé .......................................................................................................................................................................... iii Abstract .......................................................................................................................................................................... v Table des matières ........................................................................................................................................................ vii Liste des tableaux.......................................................................................................................................................... ix Liste des figures ............................................................................................................................................................ xi Liste des abréviations ................................................................................................................................................... xiii Remerciements ............................................................................................................................................................ xix Avant-propos ................................................................................................................................................................ xxi Chapitre 1 : Introduction ................................................................................................................................................. 1

1.1) La maladie d’Alzheimer ....................................................................................................................................... 1 1.1.1) Facteurs de risque ....................................................................................................................................... 1

1.1.1.1) Génétiques ........................................................................................................................................... 1 1.1.1.2) Environnementaux ............................................................................................................................... 3

1.1.2) Neuropathologie .......................................................................................................................................... 4 1.1.3) Traitements pharmacologiques ................................................................................................................... 7

1.2) Le facteur de risque APOE4 ............................................................................................................................... 8 1.2.1) Impact sur la cognition ............................................................................................................................... 11 1.2.2) Interaction avec les marqueurs neuropathologiques de la MA .................................................................. 12

1.2.2.1) Clairance déficiente et accumulation d’Aβ ......................................................................................... 12 1.2.2.2) Accumulation de tau hyperphosphorylé ............................................................................................. 13

1.2.3) Interaction avec les facteurs de risque environnementaux de la MA ......................................................... 14 1.2.4) Impact sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique ......................................................................... 15 1.2.5) Interaction avec la signalisation cérébrale de l’insuline ............................................................................. 16

1.3) L’insuline ........................................................................................................................................................... 18 1.3.1) La résistance à l’insuline ........................................................................................................................... 20 1.3.2) La résistance à l’insuline dans la MA ......................................................................................................... 20 1.3.3) L’insuline comme traitement dans la MA ................................................................................................... 21

1.4) Problématique, objectifs et hypothèses ............................................................................................................ 24 Chapitre 2 : Altered cerebral insulin response in transgenic mice expressing the epsilon-4 allele of human apolipoprotein E gene. .................................................................................................................................................. 27

2.1) Résumé............................................................................................................................................................. 27 2.2) Abstract ............................................................................................................................................................. 29 2.3) Introduction ....................................................................................................................................................... 30 2.4) Materials and methods ...................................................................................................................................... 32

2.4.1) Animals ...................................................................................................................................................... 32 2.4.2) Insulin sensitivity ........................................................................................................................................ 33 2.4.3) Brain capillary isolation .............................................................................................................................. 33 2.4.4) Tissue preparation for post-mortem analyzes ........................................................................................... 34 2.4.5) Western immunoblotting ............................................................................................................................ 34 2.4.6) Behavioural assessment ........................................................................................................................... 35

2.4.6.1) Recognition memory assessment ...................................................................................................... 35 2.4.6.2) Anxiety assessment ........................................................................................................................... 35 2.4.6.3) Locomotor activity assessment .......................................................................................................... 36

2.4.7) Statistical analysis ..................................................................................................................................... 36 2.5) Results .............................................................................................................................................................. 36

2.5.1) APOE genotype does not modulate peripheric insulin sensitivity in APOE mice ....................................... 36 2.5.2) Insulin does not modulate memory, anxiety and motor functions in APOE mice ....................................... 37 2.5.3) APOE4 have higher cortical pAKT concentration than APOE3 mice following an acute insulin injection .. 37

viii

2.5.4) Insulin does not influence proteins involved in Aβ brain transport ............................................................. 38 2.5.5) APOE4 have higher tau pSer202 concentration than APOE3 mice following an acute insulin injection ... 38 2.5.6) Insulin has no effect on its signaling in brain capillaries of APOE mice ..................................................... 39

2.6) Discussion ......................................................................................................................................................... 39 2.6.1) Greater brain response to insulin in APOE4 mice ..................................................................................... 40 2.6.2) Increase in tau phosphorylation could contribute to the progression of AD-like pathology in APOE4 mice ............................................................................................................................................................................. 40 2.6.3) Enhanced insulin response might contribute to raise tau phosphorylation in APOE4 mice ....................... 41 2.6.4) Insulin as a therapeutical tool in AD .......................................................................................................... 41

2.7) Author’s contribution ......................................................................................................................................... 42 2.8) Acknowledgments and conflict of interest disclosure ........................................................................................ 42 2.9) References ........................................................................................................................................................ 43 2.10) Figures and legends ....................................................................................................................................... 49 2.11) Supplementary material .................................................................................................................................. 56

Chapitre 3 : Matériel et méthodes : notes supplémentaires ......................................................................................... 57 3.1) Modèle animal ................................................................................................................................................... 57 3.2) Test de tolérance à l’insuline ............................................................................................................................ 58 3.3) Tests comportementaux ................................................................................................................................... 59

3.3.1) Test de reconnaissance d’objets ............................................................................................................... 59 3.3.2) Test de la boîte à deux compartiments ...................................................................................................... 60 3.3.3) Test d’activité en champ libre .................................................................................................................... 61

3.4) Sacrifice des animaux ....................................................................................................................................... 61 3.5) Technique de déplétion capillaire...................................................................................................................... 62 3.6) Technique d’extraction protéique ...................................................................................................................... 63 3.7) Immunobuvardage de type Western ................................................................................................................. 63 3.8) Analyses statistiques ........................................................................................................................................ 64

Chapitre 4 : Discussion ................................................................................................................................................. 65 4.1) Retour sur les résultats ..................................................................................................................................... 65

4.1.1) Effet de l’insuline sur le comportement ...................................................................................................... 65 4.1.2) Réponse à l’insuline .................................................................................................................................. 66

4.1.2.1) En périphérie ...................................................................................................................................... 66 4.1.2.2) Au cerveau ......................................................................................................................................... 66

4.1.3) Effet de l’insuline sur la phosphorylation de la protéine tau ....................................................................... 67 4.1.4) Effet de l’insuline sur les concentrations de RAGE et LRP1 ...................................................................... 68

4.2) Interprétation des résultats ............................................................................................................................... 69 4.2.1) Augmentation de la réponse cérébrale à l’insuline chez les souris APOE4 .............................................. 69 4.2.2) L’augmentation de la phosphorylation de tau chez les souris APOE4 pourrait contribuer à la progression d’une pathologie s’apparentant à la MA ............................................................................................................... 70 4.2.3) L’altération de la réponse cérébrale à l’insuline pourrait contribuer à augmenter la phosphorylation de tau chez les souris APOE4 ........................................................................................................................................ 70

4.3) Limitations et perspectives ................................................................................................................................ 71 4.4) Conclusion ........................................................................................................................................................ 73

Bibliographie ................................................................................................................................................................. 75 Annexe 1 : Projets parallèles ........................................................................................................................................ 91

ix

Liste des tableaux

Chapitre 1 Tableau 1 : Fréquences alléliques de la population générale et de la population Alzheimer pour le gène

APOE. Adapté de Farrer et al. 1997. ..................................................................................................... 3

Chapitre 2 Table 1 : Primary antibodies used in Western blot experiments................................................................... 56

xi

Liste des figures

Chapitre 1 Figure 1 : Structure des isoformes APOE3 (droite) et APOE4 (gauche) de l’apolipoprotéine E. Tiré de

Mahley et al. 2009. ................................................................................................................................. 9 Figure 2 : Schéma récapitulatif des liens établis dans la littérature entre le génotype APOE4 et divers

aspects en lien (ou potentiellement en lien) avec la MA. ..…………………………………………………18 Figure 3 : Implication des voies de signalisation de l’insuline dans la phosphorylation de la protéine tau. ..19

Figure 4 : (A) Index de reconnaissance de souris 3xTg-AD ayant reçu une injection intrapéritonéale (IP)

d'insuline (1IU/kg) ou de salin, 2h précédant le test de reconnaissance d'objets. (B) Niveau d’Aβ42 soluble dans le cortex de souris 3xTg-AD ayant reçu une injection intraveineuse (IV) d’insuline (3,8 IU/kg) ou de salin, 5 minutes précédant le sacrifice. Tiré de Vandal et al. 2014b. ............................... 22

Figure 5 : Moyenne des résultats des tests de mémoire Story Recall Test (A) et Hopkins Verbal Learning

Test (B) chez des patients non-porteurs et porteurs d’APOE4, 15 minutes après avoir reçu un placebo (salin) ou différentes doses d’insuline sur 5 matins séparés d’une à 6 semaines. Adapté de Reger et al. 2008. .................................................................................................................................................... 23

Chapitre 2 Fig. 1 : No difference in insulin sensitivity between APOE3 and APOE4 mice at 12 months of age. ........... 49

Fig. 2 : Lower object recognition memory in APOE4 compared to APOE3 mice at 12 months of age: no effect of insulin. .................................................................................................................................... 50

Fig. 3 : Response to insulin : APOE4 mice have an increased pAKT concentration in the cortex compared to

APOE3 mice at 12 months of age. ....................................................................................................... 51

Fig. 4 : No effect of insulin on phosphatases concentration in the cortex of APOE3 and APOE4 mice at 12 months of age. ..................................................................................................................................... 52

Fig. 5 : No effect of insulin on RAGE concentration in the cortex of APOE3 and APOE4 mice at 12 months

of age. .................................................................................................................................................. 53 Fig. 6 : Insulin increases tau pSer202 concentration in the cortex of APOE4 mice compared to APOE3 mice

at 12 months of age. ............................................................................................................................ 54 Fig. 7 : No effect of insulin on protein concentrations in brain capillaries of APOE3 and APOE4 mice at 12

months of age. ..................................................................................................................................... 55

xii

Chapitre 3 Figure 6 : Stratégie de remplacement génique ciblé employée pour remplacer des séquences codantes

d’APOE murin par des séquences codant pour l’APOE3 humain (huE3). Recombinaison homologue entre le locus d’APOE murin endogène (A) et la construction de ciblage (B) résultant en un gène chimérique (C) où la séquence codante du gène APOE murin a été remplacée par la région codante d’APOE3 humain équivalente. Tiré et traduit de Sullivan et al. 1997. ................................................. 57

Figure 7 : Schéma du test de tolérance à l’insuline (1 UI/kg de poids corporel). ......................................... 59

Figure 8 : Schémas des tests comportementaux : reconnaissance d’objets (A), boîte à deux compartiments (B) et activité en champ libre (C). ........................................................................................................ 61

Figure 9 : Conséquences d’une signalisation cérébrale altérée de l’insuline chez les souris APOE4 (suite à

une injection d’insuline). ..………………………………………………………………………………………71

xiii

Liste des abréviations

ε Epsilon ω-3 Oméga-3 μm Micromètre aa Acide aminé Aβ Peptide bêta-amyloïde AKT Protéine kinase B ANOVA Analysis of variance APO Apolipoprotéine APOE Apolipoprotéine E APOE3 Isoforme epsilon-3 du gène de l’APOE APOEε3 Allèle ε3 du gène de l’APOE APOE4 Isoforme epsilon-4 du gène de l’APOE APOEε4 Allèle ε4 du gène de l’APOE APP Protéine précurseur de l’amyloïde

Arg Arginine ARNm Acide ribonucléique messager BCA Acide bicinchoninique BHE Barrière hémato-encéphalique BSA Albumine de sérum bovin °C Degré Celsius 14C-DHA DHA marqué au carbone 14 DCL Déficit cognitif léger DCLa DCL de type amnésique DHA Acide docosahexaénoïque DMEM Milieu minimum essentiel de Eagle modifié par Dulbecco DT2 Diabète de type 2 ELISA Méthode immuno-enzymatique (enzyme-linked immunosorbent assay) ERK Extracellular signal-regulated kinases FBS Sérum bovin foetal Glu Acide glutamique GSK3β Glycogène synthase kinase 3-bêta HbA1c Hémoglobine glyquée HDL Lipoprotéine de haute densité HOMA Homeostasis model assessment HRP Enzyme peroxydase de raifort IDE Enzyme de dégradation de l’insuline IgIV Immunoglobuline intraveineuse IP Intrapéritonéal IRMf Imagerie par résonance magnétique fonctionnelle ITT Test de tolérance à l’insuline IV Intraveineux JNK Protéine kinase c-Jun N-terminal KCl Chlorure de potassium LDL Lipoprotéine de basse densité

xiv

LDLR Ligand du récepteur de la lipoprotéine de basse densité LRP1 Low density lipoprotein receptor-related protein 1 MA Maladie d’Alzheimer MAPK Protéine kinase activée par mitogène MCA Maladie coronarienne athérosclérotique mol/L Moles par litre mmol/L Milimoles par litre mTor Cible mammalienne de la rapamycine NaCl Chlorure de sodium NEP Néprilysine NMDA N-méthyl-D-aspartate ns Non significatif PBS Tampon phosphate salin PCIS Technique de perfusion cérébrale in situ PDK Pyruvate déshydrogénase kinase PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase PP2Ac Sous-unité catalytique de la protéine phosphatase 2A PP2B Protéine phosphatase 2B PSEN Préséniline pSer Sérine phosphorylée pThr Thréonine phosphorylée pTyr Tyrosine phosphorylée PVDF Difluorure de polyvinylidène RAGE Receptor for advanced glycation endproducts RI Résistance à l’insuline RIPA Radioimmunoprecipitation assay RO Reconnaissance d’objets SEM Erreur standard de la moyenne Ser Sérine SNPs Polymorphismes nucléotidiques Thr Thréonine UI Unité internationale VLDL Lipoprotéine de très basse densité

xv

La sagesse, c'est d'avoir des rêves suffisamment

grands pour ne pas les perdre de vue lorsqu'on les

poursuit.

Oscar Wilde

xvii

À mes parents, Ninon et Denis, pour tout l’amour qu’ils m’ont transmis.

À la mémoire de mon grand-père Mozart.

xix

Remerciements

Une multitude de gens passionnés et dévoués ont collaboré, de près ou de loin, à la réalisation de ce

mémoire et je tiens sincèrement à les remercier pour leur précieuse contribution.

D’abord, merci à mon directeur de recherche, Dr. Frédéric Calon, de m’avoir accueilli dans une si belle

équipe et d’avoir permis l’existence d’un équilibre entre encadrement et liberté. Un immense merci à Milène

Vandal pour son accompagnement et tout le temps qu’elle m’a accordé afin que je puisse mener ce projet à

terme en repoussant mes limites. Milène, tu m’as appris que presque tout est possible même si ça ne

semble pas toujours l’être. Ça me suivra très longtemps et je ne te remercierai jamais assez pour cela.

Merci à Cyntia Tremblay de m’avoir transmis des parcelles de son savoir en début de parcours et à Dr.

Vincent Émond pour ses conseils, sa présence en cas de besoin et son humour.

Remerciements à mes collègues pour leur bel esprit d’équipe et l’agréable ambiance de travail qui en

résulte. Ce fut un plaisir de vous côtoyer et de travailler en votre présence. Merci à Katherine Coulombe

d’avoir été une partenaire d’étude et une voisine de bureau toujours de bonne humeur. Une petite mention

spéciale à Marine Tournissac, Ariane Giguère-Rancourt et Jessica Virgili pour leur coup de main fort

apprécié en fin de projet.

J’aimerais également souligner le dévouement du personnel de l’animalerie du CHUL, sans qui nous ne

pourrions mettre sur pied de tels projets. Des mercis particuliers à Sonia Francoeur pour sa précieuse

assistance technique et nos petites jasettes, à Nathalie Alain pour ses bons conseils et son sourire

contagieux ainsi qu’à Stéphanie Bernard pour son temps et son attention. J’aimerais également remercier

la Faculté de pharmacie de l’Université Laval pour le soutien financier qu’elle m’a offert en m’octroyant une

bourse du Fonds de recherche et d’enseignement (FER).

Merci aux meilleurs amis du monde pour votre belle amitié, votre support constant, vos petits mots

d’encouragement. En terminant, j’aimerais dédier ce mémoire à mes amours de toujours, mes merveilleux

parents. Merci pour tout. Je vous aime infiniment.

Il y a un peu de chacun de vous dans cet ouvrage. Merci à tous!

xxi

Avant-propos

L’avant-propos suivant résume les travaux effectués au cours de mes études de deuxième cycle en

sciences pharmaceutiques, ayant comme objectif principal de vérifier les effets de l’insuline sur les

fonctions cognitives et les concentrations de protéines impliquées dans les voies de signalisation de

l’insuline et dans la maladie d’Alzheimer (MA), chez les souris transgéniques APOE3 et APOE4.

Le premier chapitre de ce mémoire est une introduction aux notions de base de mon projet de maîtrise, afin

de fournir aux lecteurs les connaissances nécessaires à une bonne compréhension de l’étude. Une revue

de la littérature concernant l’apolipoprotéine E, la MA et l’insuline ainsi que les liens unissant ces trois sujets

y est présentée. Les hypothèses de recherche ainsi que les principaux objectifs de l’étude sont mentionnés

à la fin du chapitre.

Le second chapitre présente l’article scientifique rassemblant la majorité des résultats obtenus au cours de

mes cinq sessions de maîtrise. Le manuscrit est présentement en préparation et sera éventuellement

soumis à un journal international. J’ai réalisé la totalité des expérimentations ayant mené aux résultats

présentés dans cet article et j’en suis la première auteure. Milène Vandal, étudiante au doctorat et

deuxième auteure de l’article, m’a appris à effectuer les tests de comportement, les tests de tolérance à

l’insuline et la perfusion sur les animaux ainsi que les analyses biochimiques. Elle m’a guidée dans

l’analyse statistique, la présentation des résultats et l’écriture de l’article. Elle a aussi contribué à

l’élaboration du projet et à la correction de l’article. La troisième auteure du papier, Marine Tournissac, a

réalisé des immunobuvardages de type Western afin de confirmer certains résultats. Dr. Frédéric Calon,

dernier auteur, a élaboré le projet et corrigé l’article.

En complément à l’article, le troisième chapitre détaille la méthodologie et fournit aux lecteurs des

précisions additionnelles et des explications étoffées concernant les techniques utilisées dans l’étude. Le

modèle animal, le comportement ainsi que les analyses biochimiques et statistiques y sont décrits.

Le quatrième et dernier chapitre du mémoire correspond à une discussion présentant une interprétation des

résultats obtenus ainsi que leur positionnement par rapport à ceux de précédentes études. Les limitations

du projet et quelques perspectives pour son éventuelle poursuite sont présentées en fin de chapitre.

En annexe, est joint un bref résumé des projets parallèles auxquels j’ai contribué lors de mes études de

deuxième cycle. Bonne lecture!

1

Chapitre 1 : Introduction

1.1) La maladie d’Alzheimer

En 1906, le médecin allemand Alois Alzheimer fit la première description de lésions cérébrales chez une

patiente présentant des atteintes neurologiques et de la démence. Les plaques et les enchevêtrements

neurofibrillaires, qu’il avait observés au microscope, sont aujourd’hui considérés comme étant les

principaux marqueurs neuropathologiques de la maladie qui porte son nom : la maladie d’Alzheimer (MA)

(Maurer et al. 1997 ; Blennow et al. 2006 ; Caselli et al. 2006 ; Hardy 2006). Plus d’un centenaire après ces

observations, la MA est toujours incurable. Maladie neurodégénérative la plus commune et principale cause

de démence avec le vieillissement (Ghezzi et al. 2013), elle touche plus de 35 millions d’individus dans le

monde (Querfurth & La Ferla 2010) et on prévoit que sa prévalence triplera dans les 40 prochaines années

(Brookmeyer et al. 2007).

La MA peut exister sous deux formes principales, soit la forme sporadique (tardive) qui représente près de

95% des cas, soit la forme familiale (précoce) plutôt rarissime avec 5% des cas (Piaceri et al. 2013). La MA

est une maladie à progression lente qui altère les fonctions cognitives, le comportement, le langage ainsi

que les fonctions motrices des individus qui en souffrent (Tarawneh & Holtzman 2012). Il devient donc

difficile, voir impossible pour le patient de vaquer à ses occupations quotidiennes lorsqu’il atteint le stade

avancé de la maladie. Cette situation nécessite l’aide de l’entourage et de personnel soignant, engendrant

des coûts importants pour le système de la santé (Zhu & Sano 2006 ; Diamond 2006). Il est donc impératif

de mettre au point un traitement efficace contre cette maladie.

1.1.1) Facteurs de risque

1.1.1.1) Génétiques

La MA est une maladie fort complexe qui comporte de multiples causes et pour laquelle divers facteurs de

risque entrent en jeu. Les formes familiales de la MA se transmettent génétiquement de façon autosomale

dominante par le biais de mutations présentes sur les gènes impliqués dans la production du peptide bêta-

amyloïde (Aβ) (Bertram & Tanzi 2008 ; Gessel et al. 2012). Ces mutations sur les gènes des présénilines

(PSEN) 1 et 2 et du précurseur du peptide Aβ (APP) entraîneraient une agrégation accrue des peptides Aβ

2

en oligomères et en fibrilles (Jarrett et al. 1993), en raison d’une augmentation de la production d’Aβ42

et/ou du ratio Aβ42/Aβ40 (Schellenberg & Montine 2012 ; Tanzi 2012 ; Potter et al. 2013). En effet, Aβ42

s’agrège davantage qu’Aβ40 (Jarrett et al. 1993).

Les facteurs de risque génétiques des formes sporadiques de la MA sont moins bien identifiés et semblent

dépendre des variations alléliques de différents gènes (Bertram & Tanzi 2008). Il y a plus de vingt ans, un

gène a été identifié comme facteur de risque de la MA (Saunders et al. 1993 ; Strittmatter et al. 1993a) et

demeure le plus étudié à ce jour dans le développement de la maladie : il s’agit du gène de

l’apolipoprotéine E (APOE) (Tanzi 2012). Ce dernier code pour l’apoE humaine, qui s’avère être un

régulateur du transport et du métabolisme des lipides au niveau cérébral (Alaupovic 1982 ; Boyles et al.

1989 ; Hauser et al. 2011). Le gène APOE comporte de multiples polymorphismes mononucléotidiques

(SNPs), dont trois qui prédominent et mènent aux principaux isoformes d’APOE : epsilon-2 (ε2), epsilon-3

(ε3) et epsilon-4 (ε4) (Weisgraber et al. 1981). Il existe donc des variations de quelques acides aminés pour

chacun des trois allèles. Les positions 112 et 158 sont occupées par une cystéine dans le cas d’APOEε2

tandis que pour APOEε3, une cystéine et une arginine occupent respectivement ces places. Dans le cas

d’APOEε4, on retrouve une arginine aux deux positions (Weisgraber et al. 1981). Ces différences dans la

constitution allélique, minimes en apparence, sont pourtant suffisantes pour perturber la structure et la

fonctionnalité d’ApoE (Hatters et al. 2006).

L’allèle APOEε4 (APOE4) représente d’ailleurs le principal facteur de risque de la MA sous sa forme

sporadique et a également été associé à un risque accru d’être atteint de la forme familiale (Corder et al.

1993 ; Saunders et al. 1993 ; Strittmatter et al. 1993a ; Warzok et al. 1998). Cet allèle confère aux porteurs

hétérozygotes un risque de développer la maladie 3,68 fois plus élevé qu’un porteur d’APOEε3 (APOE3)

homozygote (www.alzgene.org 2011 (Bertram et al. 2007) ; Holtzman et al. 2012). Les individus

homozygotes pour APOE4, constituant environ 2% de la population (Corder et al. 1993), ont un risque

encore plus accentué avec un facteur de risque approximatif de 12 (Holtzman et al. 2012). Alors que la

variation allélique ε4 confère un risque plus élevé pour la MA, le port d’APOEε2 (APOE2) tend plutôt à être

associé à un risque moindre de développer la maladie avec un facteur de risque de 0,62 comparativement

aux porteurs d’APOE3 (www.alzgene.org 2011 (Bertram et al. 2007) ; Holtzman et al. 2012). De plus,

même en présence de la neuropathologie associée à la MA, les individus de génotype APOE2 sont

protégés sur le plan cognitif (Berlau et al. 2007 ; Berlau et al. 2009). En effet, l’allèle APOEε2 est plutôt

3

bénéfique pour la cognition, étant associé notamment à une réduction du risque de déclin cognitif (Blair et

al. 2005) et de mémoire épisodique chez les adultes âgés (Wilson et al. 2002). Cependant, pour des

raisons qui seront énoncées ultérieurement (voir section 3.1), le génotype APOE2 ne sera pas discuté en

détail dans le présent ouvrage.

Au sein de la population Caucasienne générale, l’isoforme APOE3 est le plus commun avec une

prévalence de 77,9%, alors que seulement 13,7% des individus qui la composent expriment l’isoforme

APOE4 (Tableau 1). Cependant, parmi les patients atteints de la MA, le génotype APOE4 est davantage

présent avec une fréquence avoisinant les 36,7%, ce qui met en évidence la prédominance de l’allèle ε4 au

sein de cette maladie (Farrer et al. 1997).

Tableau 1 : Fréquences alléliques de la population générale et de la population Alzheimer pour le gène APOE. Adapté de

Farrer et al. 1997.

Allèle ε2 ε3 ε4

Fréquence générale 8,4% 77,9% 13,7%

Fréquence dans la MA 3,9% 59,4% 36,7%

1.1.1.2) Environnementaux

En plus des facteurs de risque liés à la susceptibilité génétique, la forme sporadique de la MA peut être

influencée par différents facteurs environnementaux qui peuvent potentialiser son développement.

L’avancement en âge est le facteur environnemental le plus important puisque la maladie apparaît

généralement après l’âge de 65 ans. À partir de 60 ans, le risque est de 1% et la prévalence de la maladie

double tous les cinq ans, atteignant un risque de 40% vers l’âge de 85 ans (von Strauss et al. 1999).

Le diabète de type 2 (DT2) est également un facteur de risque important pour la MA (Profenno et al. 2010 ;

Cheng et al. 2012 ; Exalto et al. 2012 ; Hildreth et al. 2012 ; Wang et al. 2012). Les patients atteints de cette

maladie, caractérisée par une résistance à l’insuline (RI), peuvent être jusqu’à deux fois plus à risque de

développer la MA que les non diabétiques (Ott et al. 1996 ; Ott et al. 1999 ; Craft & Watson 2004). En effet,

l’étude de Ott et al. révèle un risque relatif de MA de 1,9 (1,2 à 3,1 ; intervalle de confiance = 95%) pour les

patients diabétiques, comparativement à ceux qui ne souffrent pas de diabète (Ott et al. 1999).

4

De plus, des niveaux de cholestérol total élevés dans le sérum et le plasma ont été suggérés représenter

un facteur de risque pour développer la MA (Pappolla et al. 2003). Toutefois, cette hypothèse n’est pas

entièrement supportée par les données révélées suite à certaines études (Wood et al. 2005 ; Daviglus et al.

2010). Alors qu’une étude montre que les niveaux de cholestérol plasmatique des patients Alzheimer

étaient approximativement 10% plus élevés que ceux des sujets contrôles (Popp et al. 2013), une étude

précédente menée par la même équipe n’avait pas rapporté de différence entre les niveaux de cholestérol

plasmatique chez ces deux groupes d’individus (Popp et al. 2012). L’usage de statines, hypolipidémiants

prescrits afin d’abaisser le taux de cholestérol, n’a d’ailleurs pas été concluant dans la prévention et le

traitement de la MA puisqu’aucun effet bénéfique, ni préjudiciable n’a été observé (McGuinness et al.

2013). L’hypothèse a été revue par Solomon et son équipe, qui en sont venus à la conclusion que présenter

des taux élevés de cholestérol plasmatique, vers l’âge de 40-45 ans, est associé à un risque accru de MA

(Solomon et al. 2009).

D’autres facteurs de risque environnementaux, comme une diète pauvre en oméga-3 (ω-3) et la

sédentarité, pourraient influencer le risque de développer la MA. En effet, plusieurs études rapportent que

la diète méditerranéenne et la consommation de poisson, apports notables en ω-3, réduiraient le risque de

MA, ou du moins auraient un impact positif sur la préservation des fonctions cognitives au cours du

vieillissement (Panza et al. 2004 ; Morris et al. 2005 ; Scarmeas et al. 2006 ; Kawas 2006). De plus,

certains résultats montrent que la pratique régulière d’activités physiques préviendrait également le déclin

cognitif (Laurin et al. 2001 ; Yaffe et al. 2001 ; Lytle et al. 2004).

1.1.2) Neuropathologie

La neuropathologie se manifeste par différents marqueurs, notamment deux types de lésions cérébrales :

les plaques séniles (pathologie amyloïde) et les dégénérescences ou enchevêtrements neurofibrillaires

(tauopathie) (Maurer et al. 1997 ; Blennow et al. 2006 ; Caselli et al. 2006 ; Hardy 2006). Tout d’abord, les

plaques séniles, dites amyloïdes, se caractérisent par des dépôts denses de peptides Aβ (Aβ40-42) qui se

localisent entre les neurones (Serrano-Pozo et al. 2011). Les peptides Aβ sont issus du clivage

enzymatique de la protéine précurseur de l’amyloïde (APP) (Gralle et al. 2006). La production, l’élimination

5

et la dégradation des peptides Aβ sont des mécanismes qui, en étant altérés, peuvent causer

l’accumulation de ces peptides au cerveau.

Les formes solubles des oligomères d’Aβ sont suspectées être en mesure d’endommager le cerveau en

perturbant le fonctionnement synaptique en premier lieu (Pham et al. 2010 ; Tomiyama et al. 2010). Il est

possible qu’une cascade menant à la mort neuronale et impliquant l’activation des cellules microgliales et

des astrocytes (Tomiyama et al. 2010), le stress oxydatif (De Felice et al. 2007) et la tauopathie (Ma et al.

2009 ; Tomiyama et al. 2010 ; Brouillette et al. 2012) soit ensuite enclenchée. Deux types de plaques

peuvent résulter de l’accumulation et de l’agrégation cérébrales des peptides Aβ. Les plaques diffuses,

principalement composées de peptides Aβ42, sont présentes chez les personnes âgées en santé

(Knopman et al. 2003) et constitueraient les précurseurs des plaques séniles (Tagliavini et al. 1988 ;

Yamaguchi et al. 1988). Les plaques neuritiques, dites séniles, sont celles qui caractérisent la pathologie

amyloïde et leur densité, dans le cerveau de patients atteints de la MA, corrèle avec les déficits cognitifs

observés chez ces individus (Tremblay et al. 2007 ; Nelson et al. 2012). D’ailleurs, les concentrations

d’Aβ42 ont été associées à l’expression clinique de la MA (Tremblay et al. 2007).

Les dégénérescences neurofibrillaires, aussi appelées enchevêtrements neurofibrillaires, sont des agrégats

intraneuronaux de protéine tau, résultant de l’hyperphosphorylation de cette protéine (Brion et al. 1985 ;

Grundke-Iqbal et al. 1986 ; Buée et al. 2000 ; Serrano-Pozo et al. 2011). Ces paires de filaments

hélicoïdaux sont présentes en quantité importante dans le cerveau des patients atteints de la MA (Kidd

1963 ; Wisniewski et al. 1976). La protéine tau, généralement sous forme d’agrégats insolubles, possède

de multiples sites de phosphorylation et est essentielle au maintien des microtubules. L’altération de sa

structure perturbe le transport axonal et, par conséquent, la communication interneuronale (Hyman &

Trojanowski 1997). La protéine possède 85 résidus qui sont sujets à être phosphorylés (Morishima-

Kawashima et al. 1995 ; Hanger et al. 2007) et sa capacité de liaison aux microtubules est contrôlée par

son degré de phosphorylation (Khatoon et al. 1994).

Toutefois, une phosphorylation excessive pourrait survenir en condition pathologique. Cette

hyperphosphorylation pourrait perturber la stabilité des microtubules (Alonso et al. 1994) en promouvant

l’agrégation de la protéine (Kopke et al. 1993 ; Khatoon et al. 1994 ; Alonso et al. 1996). Tau a également

été associée à l’expression clinique de la MA (Arriagada et al. 1992 ; Tremblay et al. 2007). Au même titre

6

que les plaques séniles, les enchevêtrements neurofibrillaires ont été reliés à des problèmes de cognition

(Nelson et al. 2012).

Selon plusieurs études, l’augmentation de la phosphorylation de tau peut contribuer, du moins en partie, à

la toxicité d’Aβ. En effet, des études réalisées sur des souris transgéniques et des cultures neuronales de

souris ont démontré que la pathologie tau est nécessaire à la progression de la neurodégénération, de la

mort neuronale et des problèmes cognitifs résultant de la neurotoxicité de la pathologie amyloïde (Rapoport

et al. 2002 ; King et al. 2006 ; Roberson et al. 2007).

Comme plusieurs études le démontrent, la MA est également caractérisée par une perte de jonctions

synaptiques (Selkoe 2002 ; Honer 2003 ; Scheff & Price 2003 ; Arendt 2009). Une réduction synaptique au

niveau du cortex et de l’hippocampe est observée dans le vieillissement normal (Bertoni-Freddari et al.

2003 ; Berchtold et al. 2013) et celle-ci progresse avec l’avancement de la MA (Masliah et al. 1992 ; Sze et

al. 1997 ; Heffernan et al. 1998 ; Sze et al. 2000 ; Julien et al. 2008 ; Scheff et al. 2011), en s’installant dès

les premiers stades de la pathologie (Masliah et al. 2001 ; Scheff et al. 2006 ; Scheff et al. 2011).

Une réduction cérébrale de la drébrine, une protéine synaptique, serait impliquée dans la MA (Julien et al.

2008). Certaines études suggèrent d’ailleurs qu’il existerait des mécanismes pouvant compenser pour la

diminution des fonctions synaptiques due à l’âge et que, chez les patients atteints de la MA, ces processus

ne seraient pas en mesure de pallier à la perte synaptique (Bertoni-Freddari et al. 1990 ; Bertoni-Freddari et

al. 2003 ; Arendt 2009).

La MA présente également une perte cellulaire, visible sur résonnance magnétique par une atrophie

corticale se traduisant par un élargissement des ventricules cérébraux (Killiany et al. 1993 ; Juottonen et al.

1998 ; Blennow 2006). La mort des neurones survient relativement tôt dans la maladie, décimant en

moyenne plus de 30% de la population neuronale en comparaison avec des individus sains (Gómez-Isla et

al. 1996 ; Terry 2000 ; Kordower et al. 2001 ; Price et al. 2001 ; Hof et al. 2003). Dans le cerveau des

patients atteints de la MA, la pathologie tau corrèle avec la perte neuronale et elles augmentent toutes deux

avec l’avancement de la maladie. Toutefois, la perte neuronale est plus importante que l’accumulation

cérébrale de dégénérescences neurofibrillaires (Gómez-Isla et al. 1997).

Bien que les mécanismes demeurent partiellement incompris, l’accumulation de peptides Aβ,

l’hyperphosphorylation de la protéine tau ainsi que les pertes synaptique et neuronale observées dans la

7

MA pourraient contribuer à son développement et jouer un rôle crucial au sein des manifestations cliniques

et pathologiques de la maladie.

1.1.3) Traitements pharmacologiques

La MA est encore incurable à ce jour. En effet, aucun traitement permettant de guérir la maladie ou d’agir

sur son évolution n’a réussi à franchir les études cliniques de phase III avec succès. Certains médicaments,

dont l’efficacité est discutable, sont toutefois disponibles pour améliorer les symptômes que présentent les

patients souffrant de la MA (Schneider 2013 ; Ghezzi et al. 2013 ; Zemek et al. 2014).

Les traitements pharmacologiques les plus répandus pour atténuer les symptômes de la MA sont les

inhibiteurs de la cholinestérase (Aisen et al. 2012). Au niveau métabolique, la MA est associée à un déficit

cérébral d’acétylcholine (Davies & Maloney 1976 ; Arendt et al. 1983 ; Kasa et al. 1997 ; Giacobini 2003),

un neurotransmetteur essentiel qui assure le bon fonctionnement de la mémoire et de la pensée. Puisque

des diminutions d’acétylcholine ont été associées à la gravité des symptômes observés dans la MA

(Wilkinson & Francis et al. 2004), la mise au point d’un traitement permettant de rétablir l’activité

cholinergique cérébrale est de mise.

De façon générale, les inhibiteurs de la cholinestérase agissent en bloquant les cholinestérases

(acétylcholinestérase et butyrylcholinestérase), enzymes responsables de la dégradation de l’acétylcholine.

Ainsi, la dégradation de l’acétylcholine est retardée et sa disponibilité est accrue dans la fente synaptique,

permettant ainsi de remédier aux déficits occasionnés par la MA (Giacobini 2003 ; Wilkinson & Francis et al.

2004 ; Birks & Flicker 2006 ; Loy & Schneider 2006 ; Birks et al. 2009 ; Aisen et al. 2012).

Trois médicaments, approuvés par Santé Canada, se basent sur ce principe thérapeutique et peuvent

actuellement être prescrits aux patients Alzheimer afin de soulager leurs symptômes (Société Alzheimer

2014). Le donépézil (AriceptMD) et la galantamine (ReminylMD) inhibent l’activité de l’acétylcholinestérase

seulement, tandis que la rivastigmine (ExelonMD) possède aussi la capacité de bloquer la

butyrylcholinestérase (Giacobini 2003 ; Wilkinson & Francis et al. 2004).

Un autre système de neurotransmetteurs est déficient dans la MA. Il s’agit du système glutamatergique,

régulant le glutamate. Au même titre que l’acétylcholine, ce neurotransmetteur est impliqué dans les

processus d’apprentissage et de mémoire (Bliss & Collingridge 1993 ; Sucher et al. 1996). Dans la MA, la

libération de glutamate est excessive et entraîne une suractivation de ses récepteurs, en particulier les

8

récepteurs NMDA (N-méthyl-D-aspartate) glutamatergiques. Cette situation occasionne des évènements

neurotoxiques qui conduisent à la mort des neurones (Greenamyre & Porter 1994 ; Hardingham & Bading

2003 ; Cummings 2004 ; Waxman & Lynch 2005 ; Pietrzik & Behl 2005).

La mémantine (EbixaMC) est un antagoniste des récepteurs NMDA non-compétitif qui serait en mesure

d’offrir une protection aux neurones contre l’excitotoxicité causée par le glutamate (Scarpini et al. 2003 ;

Tariot 2004 ; Parsons et al. 2007 ; Burns 2009 ; Xia et al. 2010). Toutefois, son efficacité semble varier en

fonction du stade de la maladie et être davantage établie dans des cas modérés à sévères de MA

(Robinson & Keating 2006).

Ces traitements peuvent apporter une amélioration symptomatique mais n’ont pas d’effet sur la

neurodégénérescence survenant dans la MA. Une compréhension plus approfondie des mécanismes

impliqués dans cette maladie est nécessaire afin de développer une solution thérapeutique efficace pour la

combattre.

1.2) Le facteur de risque APOE4

Les apolipoprotéines (APOs) sont des protéines auxquelles se fixent des lipides pour leur transport dans la

circulation sanguine jusqu’aux cellules. Elles jouent de nombreux rôles au sein du métabolisme des lipides.

Elles sont impliquées entre autres dans les processus de solubilisation, de transport et de redistribution des

lipides dans l’organisme, en plus d’être des cofacteurs lors de réactions enzymatiques et d’interagir avec

des récepteurs cellulaires (Schaefer et al. 1978). Elles sont également essentielles au maintien structurel

des lipoprotéines. Il existe plusieurs types d’APOs chez l’humain, principalement l’apoA (I, II, IV), l’apoB,

l’apoC (I, II, III) et l’apoE (Mahley et al. 1984).

L’apoE est une glycoprotéine de 34 kilos daltons (kD), composée de 299 acides aminés (aa) (Mahley

1988). Elle possède un domaine amino (N)-terminal (aa 1 à 191) et un domaine carboxy (C)-terminal (aa ~

225 à 299). La partie N-terminale contient la région de liaison au récepteur (aa 134 à 150) et la C-terminale,

la région de liaison au lipide (aa ~ 244 à 272). Les deux domaines sont liés par une région flexible

composée des aa 192 à 222 (Weisgraber 1994 ; Mahley 1988 ; Mahley & Rall 2000). Seul APOE4 a

comme propriété biophysique une interaction entre les deux domaines. En effet, dans le cas de cet

isoforme, l’arginine située à la position 112 modifie l’orientation de la chaîne latérale de l’arginine 61 du

domaine N-terminal, par rapport à celle qu’elle adopte dans les isoformes APOE2 et APOE3. Dans cette

configuration, la chaîne de l’arginine 61 peut former un pont salin avec l’acide glutamique (Glu) se trouvant

9

à la position 255 du domaine C-terminal, ce qui créé une interaction entre les domaines (Figure 1) (Dong et

al. 1994 ; Dong & Weisgraber 1996). Plus concrètement, cette particularité conformationnelle d’APOE4 a un

impact sur la classe de lipoprotéines à laquelle son domaine C-terminal se lie préférentiellement. En effet,

cet isoforme se lie de préférence aux lipoprotéines de très basse densité (VLDL), tandis que l’isoforme

APOE3 a une préférence de liaison pour les lipoprotéines de haute densité (HDL) (Dong et al. 1994 ; Dong

& Weisgraber 1996).

Le gène APOE a été séquencé chez 18 espèces, mais on retrouve l’Arg-61 uniquement chez l’humain. Les

autres espèces possèdent plutôt une thréonine à cette position (Weisgraber 1994). Certaines études ont

montré que la permutation de l’Arg-61 pour une thréonine ou de Glu-255 pour une alanine, empêchait

l’interaction entre les domaines et transformait APOE4 en une forme similaire à celle d’APOE3 (Dong et al.

1994 ; Dong & Weisgraber 1996). Dans l’APOE murin, on retrouve une arginine à l’équivalent de la position

112 chez l’humain et une Thr-61 remplace l’Arg-61 (Weisgraber 1994). L’APOE de souris serait donc

fonctionnellement équivalent à l’APOE3 humain, puisqu’il n’y a pas d’interaction entre les domaines en

raison de l’absence d’Arg à la position 61. L’interaction entre les domaines peut toutefois être introduite en

remplaçant la Thr-61 par une arginine, puisque l’APOE murin possède l’équivalent de la Glu-255 (Raffaï et

al. 2001).

Figure 1 : Structure des isoformes APOE3 (droite) et APOE4 (gauche) de l’apolipoprotéine E. Tiré de Mahley et al. 2009.

10

L’apoE est le principal transporteur de lipides, particulièrement du cholestérol, pour la croissance et la

réparation de cellules nerveuses au niveau cérébral (Alaupovic 1982). Constituant des VLDL, l’apoE est un

ligand du récepteur de la lipoprotéine de basse densité (LDLR) et de la protéine apparentée au récepteur

de la lipoprotéine de basse densité (LRP). En s’associant à l’apoE, les lipides peuvent être introduits dans

les cellules via ces récepteurs (Mahley & Innerarity 1983). Cette APO est principalement produite au niveau

du foie et en moins grande quantité au niveau du système nerveux central par les astrocytes et les

neurones. Après sa synthèse, elle est distribuée dans le système lymphatique et captée par les

chylomicrons pour assurer le transport des lipides au cerveau (Elshourbagy et al. 1985 ; Pitas et al 1987).

Le gène codant pour cette protéine est situé sur le chromosome 19, est constitué de 4 exons et présente 3

variations alléliques ou polymorphismes, comme mentionné précédemment (Weisgraber et al. 1981).

Rappelons que l’allèle ε4, dont environ 14% de la population est porteuse (Farrer et al. 1997), constitue le

principal facteur de risque génétique pour être atteint de la forme sporadique de la MA (Corder et al. 1993 ;

Saunders et al. 1993 ; Strittmatter et al. 1993a ; Warzok et al. 1998). En effet, les résultats obtenus au fil

des ans, chez l’animal et l’humain, suggèrent qu’APOE4 puisse contribuer à la MA de différentes façons,

que ce soit indépendamment ou en combinaison avec d’autres facteurs.

Plusieurs modèles de souris APOE ont été créés afin de permettre l’étude de mécanismes associés aux

actions pathogènes d’APOE4. Il existe des souris transgéniques exprimant différents isoformes d’APOE

dans les neurones ou les astrocytes (Jain et al. 2013), d’autres montrant une expression neuronale des

fragments neurotoxiques d’APOE4 (Harris et al. 2003) et certaines possédant un isoforme humain d’APOE

en remplacement de la forme murine du gène (Sullivan et al. 1997). Le gène APOE est exprimé dans

différents types cellulaires comme les neurones (Beffert & Poirier 1996 ; Xu et al. 1998) et les astrocytes

(Boyles et al. 1985 ; Poirier et al. 1991), et au niveau cérébral sous certaines conditions physiologiques

et/ou pathophysiologiques. Ces modèles murins permettent donc d’étudier les rôles des différents

isoformes d’APOE au sein de maladies comme la MA et peuvent être utile dans l’élaboration de thérapies

ciblant les effets néfastes d’APOE4 (Huang 2011).

Il existe plusieurs différences entre l’APOE3 et l’APOE4, que ce soit au niveau de l’homéostasie et du

transport des lipides (Gregg et al. 1986 ; Chouinard-Watkins & Plourde 2014), des effets sur la carence des

récepteurs aux androgènes (Raber et al. 2002), sur la neurodégénération (Buttini et al. 1999 ; Buttini et al.

2002), la fonction mitochondriale (Chang et al. 2005) et les fuites lysosomales (Ji et al. 2002) ainsi qu’au

niveau de la susceptibilité des isoformes à la protéolyse (Huang et al. 2001 ; Harris et al. 2003 ; Brecht et

11

al. 2004 ; Chang et al. 2005). Dans les prochaines sections, nous traiterons des effets d’APOE4 sur la

cognition, l’accumulation et la clairance des peptides Aβ, la phosphorylation de la protéine tau, les facteurs

de risque environnementaux de la MA, l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et la

signalisation de l’insuline au cerveau, afin de mieux comprendre les potentielles implications de ce

génotype au sein de la MA.

1.2.1) Impact sur la cognition

Plusieurs études ont établi une association entre le génotype APOE4 et la présence de problèmes cognitifs.

Chez l’humain, plusieurs études tendent à démontrer que les porteurs d’APOE4, âgés de 40 ans et plus,

présentent un déficit cognitif en comparaison avec les non-porteurs (Caselli et al. 2009 ; Liu et al. 2010).

Les déficits cognitifs observés en fonction des mesures de delayed recall et spatial attention (Bondi et al.

1999 ; Greenwood et al. 2005a) ne concernent pas exclusivement les sujets APOE4 âgés (Baxter et al.

2003 ; Scarmeas et al. 2005), puisqu’ils peuvent apparaître plus d’une décennie avant l’apparition des

symptômes de la MA tardive, c’est-à-dire vers l’âge de 35-40 ans (Greenwood et al. 2005b). Des études

montrent que le taux d’atrophie cérébrale est accéléré chez les porteurs d’APOE4 en comparaison avec les

non-porteurs de cet allèle (Jak et al. 2007 ; Chen et al. 2007 ; Filippini et al. 2009). Cette perte de volume

au niveau du cerveau, à un plus jeune âge, pourrait être due à une protection du cerveau et à des

mécanismes de réparation cérébrale plus faibles chez la population APOE4 (Luchsinger et al. 2002 ;

Laitinen et al. 2006). Chez les souris ayant subi un remplacement du gène APOE murin par l’allèle ε4

humain, un déclin de la mémoire a aussi été rapporté (Bour et al. 2008 ; Siegel et al. 2012). Par exemple,

les souris APOE4 âgées de 6 mois présentent des dysfonctions au niveau de la mémoire et du

comportement exploratoire lorsque comparées avec des souris portant plutôt l’allèle ε3 humain. De plus,

ces dysfonctions s’aggravent avec l’âge (Raber et al. 1998).

Chez les individus APOE4, la fonction d’apoE est altérée et la concentration cérébrale totale en apoE est

réduite (Bales et al. 1997 ; Beffert et al. 1999 ; Ong et al. 2014). En comparaison avec les autres génotypes

APOE, les niveaux d’apoE sont aussi plus bas chez les souris APOE4 âgées de 4 et 13 mois (Vandal et al.

2014a).

12

1.2.2) Interaction avec les marqueurs neuropathologiques de la

MA

1.2.2.1) Clairance déficiente et accumulation d’Aβ

Puisque la surproduction et la déposition d’Aβ semblent être impliquées dans la pathogénèse de la MA

(Selkoe 2001) et qu’apoE est associée avec les plaques amyloïdes neuritiques in vivo (Namba et al. 1991 ;

Wisniewski & Frangione 1992 ; Strittmatter et al. 1993a), nous allons survoler l’incidence du génotype

APOE sur la clairance et l’accumulation d’Aβ au cerveau.

Chez les humains à risque de développer la MA et chez les modèles animaux, le génotype APOE4 a

précédemment été caractérisé par une clairance déficiente des peptides Aβ, du cerveau à travers la BHE

(Deane et al. 2008 ; Castellano et al. 2011). Par conséquent, une accumulation cérébrale accentuée d’Aβ

chez l’humain porteur d’APOE4 a été rapportée (Drzezga et al. 2009 ; Morris et al. 2010 ; Risacher et al.

2013). Chez ces individus, la déposition des plaques amyloïdes peut se produire dès l’âge de 30 ans (Kok

et al. 2009). Lors d’une étude menée récemment chez des individus âgés cliniquement normaux, il était

plus probable que les sujets présentant des niveaux élevés d’Aβ soient de génotype APOE4 que ceux

présentant de faibles niveaux d’Aβ. Les individus APOE4 présentant des niveaux élevés d’Aβ ont montré

un déclin cognitif davantage marqué en comparaison aux autres groupes, suggérant qu’une interaction

APOE4-Aβ pourrait promouvoir un déclin au niveau de la cognition (Mormino et al. 2014).

ApoE semble se lier à Aβ différemment en fonction de son isoforme. En effet, apoE3 et apoE4, dépourvus

de lipide, sont en mesure de former un complexe stable avec les peptides Aβ in vitro. Lorsque les isoformes

d’apoE pauvres en lipides sont issus de milieu de culture tissulaire et sont incubés avec Aβ, apoE3 se lie à

Aβ avec une affinité 20 fois plus grande que apoE4 (LaDu et al. 1994). La plus forte affinité d’apoE3 pour

Aβ pourrait favoriser la clairance du complexe et ainsi prévenir la conversion d’Aβ en une forme

neurotoxique (LaDu et al. 1995). Cette liaison préférentielle d’apoE3 à Aβ est toutefois atténuée, voire

abolie par le processus de purification (LaDu et al. 1995). En effet, lorsque les isoformes sont purifiés, c’est

apoE4 qui se lie plus rapidement et plus efficacement à Aβ sous certaines conditions (Strittmatter et al.

1993b ; Cho et al. 2001). L’augmentation de la formation de fibrilles amyloïdes en lien avec apoE4 pourrait

être un facteur déclencheur ou amplificateur de la neurodégénération et du développement de la MA

(Huang 2011).

13

L’accumulation de plaques amyloïdes est d’ailleurs plus faible chez les souris transgéniques APP qui

expriment APOE3 en comparaison avec celles exprimant APOE4 (Holtzman et al. 2000), et APOE3 assure

la protection des neurones hippocampiques de rats contre la neurotoxicité induite par Aβ (Jordan et al.

1998). L’expression d’APOE4 a également été associée avec une régulation à la hausse de RAGE

(receptor for advanced glycation endproducts), un transporteur favorisant le passage d’Aβ de la circulation

sanguine vers le cerveau, chez des souris homozygotes pour cet allèle comparativement à des souris

homozygotes pour APOE3 (Donahue et al. 2008).

Certaines études suggèrent que l’apoE humaine stimule la clairance d’Aβ puisque les souris ayant subi un

remplacement de l’apoE murine par un allèle APOEε3 ou APOEε4 humain, montrent une déposition moins

importante d’Aβ que les souris exprimant l’apoE murine. Les souris APOE4 ont toutefois montré une

clairance plus faible d’Aβ comparativement aux APOE3 (Holtzman et al. 2000 ; Bien-Ly et al. 2011). Une

étude a révélé que la forme d’apoE4 tronquée en C-terminal, que l’on retrouve dans les cerveaux de

patients Alzheimer (Huang et al. 2001 ; Harris et al. 2003), n’est pas en mesure d’effectuer une clairance

efficace d’Aβ et qu’elle entraîne des déficits neuronaux et comportementaux chez les souris transgéniques,

malgré de faibles niveaux d’Aβ (Bien-Ly et al. 2011). D’après une étude réalisée chez les souris

transgéniques hAPP-V717I, il semble que l’apoE4 neuronal, mais non l’apoE4 glial, puisse stimuler la

déposition d’Aβ et la formation de plaques dans les régions de l’hippocampe et du cortex (Van Dooren et al.

2006). Cependant, les résultats d’une autre étude sur les souris transgéniques ne montrent pas d’effet

d’une surexpression d’apoE4 dans l’astroglie et les neurones sur la déposition d’Aβ (Lesuisse et al. 2001).

Puisque l’agrégation d’Aβ-40 est dépendante de l’isoforme d’apoE et qu’elle est plus importante pour

APOE4 que pour APOE3 et APOE2, une récente étude a conclu que le rôle délétère d’APOE4 dans la MA

pouvait être en lien avec la stabilisation d’oligomères et d’intermédiaires d’Aβ solubles ainsi que des fibrilles

(Garai et al. 2014).

1.2.2.2) Accumulation de tau hyperphosphorylé

L’hyperphosphorylation de la protéine tau est à l’origine des dégénérescences neurofibrillaires qui sont des

marqueurs neuropathologiques de la MA (Querfurth & La Ferla 2010). Concernant la MA, la part de risque

reliée au génotype APOE est plus importante chez la femme que chez l’homme, et ce risque accru est

suggéré avoir un lien avec la pathologie tau (Altmann et al. 2014).

14

Plusieurs études ont montré une augmentation de la phosphorylation de la protéine tau chez les souris

transgéniques qui expriment l’APOE4 dans les neurones, mais pas chez celles l'exprimant au niveau des

astrocytes (Tesseur et al. 2000a ; Tesseur et al. 2000b ; Brecht et al. 2004), et cette phosphorylation

augmentée semble être associée avec l’activation de la voie ERK (extracellular signal-regulated kinases)

(Harris et al. 2004). Par exemple, une accumulation accentuée de tau hyperphosphorylé a précédemment

été rapportée dans les neurones de souris APOE4 au niveau de l’hippocampe (Liraz et al. 2013). Les

fragments d’apoE4, résultant de sa troncature en C-terminal, ont la capacité de causer la dégénération des

neurones ainsi que des problèmes de comportement chez les souris transgéniques (Huang et al. 2001 ;

Harris et al. 2003 ; Brecht et al. 2004). Ces fragments sont toxiques lorsqu’ils sont exprimés dans les

neurones in vitro puisqu’ils engendrent la phosphorylation de tau et la formation d’inclusions s’apparentant

aux dégénérescences neurofibrillaires (Huang et al. 2001 ; Ljungberg et al. 2002). La neurotoxicité induite

par lesdits fragments est en lien avec la tauopathie, puisque chez les souris transgéniques, enlever tau

prévient les déficits neuronaux et comportementaux occasionnés par les fragments d’apoE4 (Andrews-

Zwilling et al. 2010).

1.2.3) Interaction avec les facteurs de risque environnementaux

de la MA

En plus des liens entre APOE4 et les marqueurs neuropathologiques de la MA, cet allèle semble aussi être

en lien avec certains facteurs de risque environnementaux de la maladie. Par exemple, être porteur

d’APOE4 est lié à un risque accru de développer le DT2 (Profenno et al. 2010 ; De Felice 2013), qui est un

facteur de risque connu de la MA (Profenno et al. 2010 ; Cheng et al. 2012 ; Exalto et al. 2012 ; Hildreth et

al. 2012 ; Wang et al. 2012).

De plus, les porteurs d’APOE4 ne bénéficient pas de l’effet positif d’une consommation d’ω-3 sur la

cognition comme c’est le cas pour les non-porteurs de cet allèle (Huang et al. 2005 ; Samieri et al. 2011).

Une étude menée chez des sujets atteints de la MA tardive a d’ailleurs montré que le seul groupe chez

lequel on observait un ralentissement du taux de changement cognitif, comparativement au groupe

placebo, était celui composé de patients non-porteurs d’APOE4 qui étaient traités à l’acide

docosahexaénoïque (DHA) (Quinn et al. 2010).

15

Les résultats de plusieurs études renforcent l’évidence d’une perturbation de l’homéostasie des acides gras

chez les porteurs d’APOE4 en comparaison aux non-porteurs. Chez les souris âgées de 4 mois, la

captation cérébrale de DHA marqué au carbone 14 (14

C-DHA) est 18% plus faible chez les souris APOE4

que chez les souris APOE2. L’écart est encore plus marqué entre les deux génotypes à l’âge de 13 mois,

avec une captation cérébrale 24 % plus basse chez les APOE4 (Chouinard-Watkins & Plourde 2014). Les

concentrations en acides gras ω-3 à longues chaînes, en acide alpha-linolénique et en DHA, dans le foie et

le tissu adipeux, sont plus faibles chez les souris APOE4 comparativement aux APOE3 (Chouinard-Watkins

& Plourde 2014). La différence dans la distribution des acides gras dans la lipoprotéine est potentiellement

en lien avec la concentration sanguine d’apoE réduite chez les porteurs d’APOE4 en comparaison aux non-

porteurs (Gregg et al. 1986). Le fait qu’APOE4 se lie aux VLDL de façon préférentielle et moins aux HDL,

comparativement à APOE3, pourrait également expliquer la perturbation homéostatique (Gregg et al.

1986). La captation d’acides gras comme le DHA, par les cellules hépatiques, pourrait donc être influencée

par ces mécanismes, ce qui expliquerait la différence de réponse observée sur le plan cognitif entre les

individus APOE4 et non-APOE4 suite à leur consommation de DHA (Chouinard-Watkins & Plourde 2014).

Un taux élevé de cholestérol total dans le sérum semble être un facteur de risque environnemental de la

MA, particulièrement chez les individus âgés entre 40 et 45 ans (Solomon et al. 2009). L’allèle APOEε4 a

été associé à un risque accru de développer une complication cardiovasculaire. Selon une méta-analyse,

être porteur d’au moins un allèle ε4 pour le gène APOE confère un risque 42% plus élevé de développer

une maladie coronarienne athérosclérotique (MCA) (Song et al. 2004). Une autre étude a par ailleurs

démontré qu’en contrôlant le LDL (lipoprotéines de basse densité) et le HDL cholestérol, le génotype APOE

n’avait pas d’incidence sur le risque de MCA (Ward et al. 2009). Le risque augmenté chez les individus

APOE4 semble donc être lié à des perturbations dans l’homéostasie des lipides, surtout en ce qui a trait

aux triglycérides, au cholestérol et au métabolisme des LDL (Chouinard-Watkins & Plourde 2014).

1.2.4) Impact sur l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique

L’intégrité de la BHE semble être compromise lorsqu’un déclin cognitif est observé, et cette atteinte pourrait

être impliquée dans la MA tardive. Chez les souris, l’expression de l’allèle APOEε4 humain est liée à une

dysfonction de la BHE (Bell et al. 2012 ; Hawkes et al. 2012 ; Alata et al. 2014b). De plus, la BHE des

souris APOE4 serait plus perméable que celle des APOE3 (Nishitsuji et al. 2011). APOE4 est aussi associé

à une réduction du transport cérébral d’acides gras polyinsaturés (Vandal et al. 2014a).

16

Une étude menée chez les animaux propose que l’intégrité de la BHE serait compromise par une

insuffisance d’apoE, ce qui conduirait à une rupture de la BHE via l’activation d’une voie pro-inflammatoire

dans les péricytes, celle de la cyclophiline A (Bell et al. 2012). Tel que mentionné précédemment, les

concentrations d’apoE sont plus faibles chez les individus (Bales et al. 1997 ; Beffert et al. 1999 ; Ong et al.

2014) de même que chez les souris APOE4 (Vandal et al. 2014a), ce qui pourrait expliquer que la

perméabilité de la BHE soit plus importante chez les souris APOE4 comparativement aux APOE3 (Bell et

al. 2012). Chez les humains, les porteurs d’APOE4 âgés présentent des niveaux de marqueurs de

détérioration de la BHE plus élevés que les non-porteurs de même âge ou que les jeunes porteurs

d’APOE4 (Halliday et al. 2013).

Tel que mentionné dans l’étude de Chouinard-Watkins & Plourde, les résultats précédents suggèrent un

lien entre le déclin cognitif et l’existence d’une pathologie vasculaire au niveau de la BHE, association

possiblement influencée par le génotype APOE (Chouinard-Watkins & Plourde 2014).

1.2.5) Interaction avec la signalisation cérébrale de l’insuline

Puisque les patients atteints de la MA présentent une résistance cérébrale à l’insuline (voir section 1.3.2)

(Kuusisto et al. 1997 ; Talbot et al. 2012), certaines études se sont penchées sur la possible implication de

l’allèle APOEε4 dans la RI. Les conclusions qui en ressortent ne vont pas toutes dans la même direction et

le statut du lien APOE4-RI n’est toujours pas clarifié à ce jour.

Chez les patients non-diabétiques présentant un déficit cognitif léger (DCL), la RI a été associée à un déclin

cognitif, exclusivement chez les porteurs d’APOE4 (Kim et al. 2014). Une autre étude n’a cependant

rapporté aucune interaction d’APOE4 avec la RI sur le risque de MA (Schrijvers et al. 2010). Certains

travaux antérieurs ne rapportent aucune association entre la RI et le génotype APOE (Meigs et al. 2000 ;

Ragogna et al. 2012) tandis que VanFossen et son équipe ont observé que les patients porteurs d’APOE4

présentaient des indices HOMA (homeostasis model assessment) plus bas, indiquant une plus faible RI

comparativement aux non-porteurs (VanFossen et al. 2010). Une association entre le port d’APOE4 et la RI

a également été établie, particulièrement au sein d’hommes issus d’une population chinoise âgée (Elosua

et al. 2003). De plus, une association positive entre le génotype APOE4 et la présence d’hyperglycémie a

été mise en lumière dans cette étude (Elosua et al. 2003). Dans le même ordre d’idées, d’autres résultats

mettent de l’avant une plus forte probabilité d’hyperglycémie chez les hommes porteurs d’APOE4

17

comparativement aux hommes porteurs d’APOE3, tandis qu’aucune différence dans le taux de glucose

sanguin à jeun n’a été observée entre eux (Tao et al. 2011). Dans le vieillissement normal, APOE4

contribue d’ailleurs au ralentissement du métabolisme cérébral du glucose (Jagust & Landau 2012 ; Reiman

et al. 2004). Chez les patients atteints du DT2, les plus hauts niveaux d’hémoglobine glyquée (HbA1c) ont

été reliés à une performance cognitive moindre chez les porteurs d’APOE4 uniquement, suggérant que les

individus APOE4 ont une susceptibilité accrue aux dommages découlant d’un pauvre contrôle glycémique

(Ravona-Springer et al. 2014). L’ensemble de ces résultats suggère que la signalisation cérébrale de

l’insuline pourrait être déficiente chez les porteurs d’APOE4 et pourrait mener à une hyperglycémie et,

ultimement à une hyperinsulinémie qui pourrait promouvoir l’apparition de désordres neurodégénératifs. La

signalisation de l’insuline chez les porteurs d’APOE4 nécessite donc davantage de compréhension.

En se basant sur les études in vitro et in vivo mentionnées dans les précédentes sections, APOE4 semble

interagir avec de multiples facteurs via différentes voies de signalisation pour contribuer à la pathologie de

la MA (Figure 2). Plusieurs approches thérapeutiques ciblant les effets pathologiques d’APOE4 in vivo ont

d’ailleurs fait l’objet d’études au cours des dernières années. Les stratégies mises en place, soit pour

contrecarrer les effets toxiques en éliminant ou en neutralisant APOE4, soit pour compenser la perte de

fonction associée à APOE4 via des mécanismes compensatoires, ont montré une certaine efficacité.

Plusieurs mécanismes moléculaires et cellulaires semblent donc impliqués et devront être mieux compris

afin de mettre au point un traitement efficace contre la maladie (Michaelson 2014).

18

Figure 2 : Schéma récapitulatif des liens établis dans la littérature entre le génotype APOE4 et divers aspects en lien

(ou potentiellement en lien) avec la MA. (ApoE = Apolipoprotéine E, Aβ = bêta-amyloïde, BHE = barrière hémato-

encéphalique, DT2 = diabète de type 2, pTau = tau phosphorylé, RAGE = «receptor for advanced glycation

endproducts»)

1.3) L’insuline

L’insuline est une hormone sécrétée majoritairement par le pancréas, plus particulièrement les cellules bêta

des îlots de Langherhans (Henderson 1964). Le cerveau est aussi un site de production secondaire de

cette hormone (de la Monte & Wands 2005). Elle permet aux cellules périphériques insulinodépendantes de

capter le glucose présent dans le sang pour s’en alimenter. Lorsque le taux de glucose sanguin ou

glycémie, subit une hausse, suite à un repas par exemple, le pancréas libère de l’insuline (Henderson

1964). Les cellules insulinodépendantes, comme celles du muscle squelettique, du tissu adipeux et du foie,

possèdent des récepteurs à insuline (DeFronzo 1988 ; Simpson & Cushman 1986). Ces derniers sont aussi

présents dans le cerveau, étant particulièrement denses entre autres au niveau du bulbe olfactif, du cortex

cérébral, de l’hippocampe et de l’hypothalamus (Havrankova et al. 1978 ; Marks et al. 1990). Lorsque

l’insuline s’y lie, une cascade de signaux intracellulaires est enclenchée, ce qui résulte en une captation

accrue du glucose et une inhibition de sa production au niveau du foie, ayant pour effet de rétablir la

19

glycémie. Une fois le glucose entré dans les tissus périphériques, l’insuline stimule son oxydation via la

glycolyse ou son entreposage sous forme de triglycérides et de glycogène (Henderson 1964). Bien que le

cerveau ait longtemps été considéré comme un organe insensible à l’insuline, plusieurs études ont

démontré le contraire au cours des trente dernières années. En effet, l’insuline aurait plusieurs rôles à jouer

au niveau du système nerveux central, notamment au niveau de la régulation de l’homéostasie énergétique

périphérique (Marino et al. 2011 ; Scherer et al. 2011), de la neuroprotection (Plum et al. 2005 ; Kovacs &

Hajnal 2009 ; Ott et al. 2012 ; Bomfim et al. 2012), de la plasticité synaptique (Wan et al. 1997 ; Biessels et

al. 1996) et de la régulation de la survie neuronale (Li & Hölscher 2007). Elle serait aussi impliquée dans la

régulation des systèmes dopaminergiques (Williams et al. 2007). Certaines voies de signalisation de

l’insuline sont également impliquées dans la phosphorylation de la protéine tau (Figure 3) (Mandelkow et al.

1992 ; Ishiguro et al. 1995 ; Takashima et al. 1996 ; Illenberger et al. 1998 ; Reynolds et al. 2000 ; Reding

et al. 2003 ; Harris et al. 2004 ; Kyoung Pyo et al. 2004).

Figure 3 : Implication des voies de signalisation de l’insuline dans la phosphorylation de la protéine tau. (P =

groupement phosphate, p = phosphorylé, GSK3β = Glycogène synthase kinase 3-bêta, PI3K = Phosphatidylinositol 3-

20

kinase, AKT = Protéine kinase B, ERK = Extracellular signal-regulated kinases, MAPK = Protéine kinase activée par

mitogène, Thr = Thréonine, Ser = Sérine)

1.3.1) La résistance à l’insuline

En fonction des individus et des conditions qui les affligent, la capacité de l’insuline à stimuler l’absorption

du glucose par les cellules insulinodépendantes peut varier (Yeni-Komshian et al. 2000). C’est ce qu’on

qualifie comme le degré de sensibilité à l’insuline. Certaines pathologies comme le DT2 peuvent être

causées par une perte de sensibilité à l’insuline, entraînant un état de résistance à cette hormone (Reaven

1988). Un tel état se produit lorsque les cellules insulinodépendantes du foie, du muscle squelettique et du

tissu adipeux ne sont plus en mesure de répondre au signal insulinémique, en raison d’une perte d’affinité

de l’insuline pour son récepteur. S’ensuit une augmentation de la sécrétion d’insuline par le pancréas dans

le but de pallier à la hausse de glucose sanguin et d’éviter l’hyperglycémie chronique. Pour la plupart des

individus, ce mécanisme compensatoire réussit à stabiliser leur glycémie, mais entraîne cependant des

effets néfastes comme une dysfonction endothéliale et une dyslipidémie (Reaven 2005). Toutefois,

certaines personnes ne sont pas en mesure de maintenir une sécrétion abondante d’insuline par les

cellules pancréatiques sur une période prolongée et leur niveau de glucose sanguin augmentera jusqu’au

développement du DT2 (Reaven 1988).

1.3.2) La résistance à l’insuline dans la MA

Tout comme dans le DT2, la résistance à l'insuline est aussi présente dans la MA, notamment dans le

cerveau des patients atteints (Kuusisto et al. 1997 ; Talbot et al. 2012). En effet, en plus des

démonstrations cliniques, des niveaux plus faibles d’insuline, de facteurs de croissance de l’insuline et de

récepteurs d’insuline ont été détectés dans le cerveau des patients Alzheimer (Hoyer & Nitsch 1989 ; Steen

et al. 2005 ; Craft 2012). La résistance dans le système nerveux central serait aussi corrélée à une

résistance périphérique. D’ailleurs, une augmentation du niveau plasmatique d’insuline a été rapportée

chez les patients Alzheimer comparativement aux individus sains. Une étude récente démontre que

plusieurs biomarqueurs de résistance périphérique à l’insuline sont augmentés de façon importante dans

l’hippocampe de patients Alzheimer non-diabétiques (Talbot et al. 2012). Des dysfonctions ayant trait à la

signalisation cérébrale de l’insuline ont aussi été rapportées chez les modèles animaux de la MA (Bomfim

et al. 2012 ; Takeda et al. 2010). L’insulinorésistance apparaît tôt dans la maladie et entraîne une

21

augmentation de la susceptibilité des neurones aux dommages neurotoxiques (Aszalos 2007). Chez les

patients résistants, la dégénérescence neuronale et l’apoptose sont augmentées. De plus, la résistance a

été associée à un déclin dans la performance cognitive, en plus d'augmenter le risque de développer un

trouble cognitif (Dash 2013). Une étude post-mortem réalisée chez des patients atteints de la MA, montre

une expression atténuée des récepteurs et des gènes codant pour l’insuline dans certaines régions

cérébrales comme l’hippocampe et l’hypothalamus (Steen et al. 2005). Ces résultats sont corrélés à une

diminution dans la production d’insuline cérébrale chez les patients Alzheimer en comparaison aux

contrôles. L'appellation « diabète de type 3 » a même été proposée pour définir la MA étant donné la

ressemblance de cette maladie avec le DT2, bien qu'elle en soit distincte et plus complexe (Steen et al.

2005).

En considérant l’ensemble de ces études, la signalisation cérébrale de l’insuline est déficiente dans la MA

et pourrait contribuer au développement et/ou à l’aggravation du déclin cognitif qui lui est associé.

1.3.3) L’insuline comme traitement dans la MA

Puisqu’une altération dans la signalisation cérébrale de l’insuline semble être impliquée dans la MA,

plusieurs études se sont penchées sur l’administration de cette hormone à des fins thérapeutiques chez

des patients atteints de la maladie.

Un potentiel thérapeutique pour l’insuline, administrée de façon intranasale, dans la MA a été rapporté dans

plusieurs études (Reger et al. 2008 ; Craft et al. 2012 ; Claxton et al. 2013). Chez les modèles animaux de

la MA, l’insuline a aussi démontré des effets bénéfiques (Vandal et al. 2014b). En effet, une seule injection

importante d’insuline administrée à des souris 3xTg-AD, un modèle murin de la MA, a la capacité de

renverser les conséquences négatives d’une diète riche en gras sur la mémoire (dose de 1 UI/kg d’insuline)

et les niveaux d’Aβ soluble (dose de 3,8 UI/kg d’insuline) (Figure 4) (Vandal et al. 2014b). Une étude

précédente a d’ailleurs démontré que l’insuline intracérébroventriculaire améliore la mémoire et

l’apprentissage spatial de façon dose-dépendante chez les rats (Haj-ali et al. 2009).

22

Par ailleurs, les humains porteurs d’APOE4 ne semblent pas bénéficier de l’utilisation d’insuline à titre de

traitement. Une étude précédente a vérifié l’effet d’une administration intranasale d’insuline sur la cognition

en fonction du génotype APOE (Reger et al. 2008). Les patients évalués montraient des déficits au niveau

de la mémoire, souffrant soit d’une probable MA, d’un DCL de type amnésique (DCLa) ou d’un DCLa à

domaines multiples. Ils ont reçu une seule dose d’insuline (soit, 10, 20, 40 ou 60 unités internationales (UI))

ou de salin sur 5 matins, séparés d’une à six semaines. 15 minutes après chaque administration, une

batterie de tests de mémoire (incluant Story recall et Hopkins Verbal Learning Test) était entreprise. Chez

les patients non-porteurs d’APOE4, une amélioration de la mémoire a été observée suite à l’administration

d’insuline, tandis que chez les porteurs, c’est plutôt une détérioration mnésique qui a été rapportée. Parmi

les différentes doses à l’étude, celle de 20 UI s’est avérée optimale pour améliorer la mémoire chez les

patients non-porteurs d’APOE4 (Figure 5) (Reger et al. 2008).

Figure 4 : (A) Index de reconnaissance de souris 3xTg-AD ayant reçu une injection intrapéritonéale (IP) d'insuline

(1IU/kg) ou de salin, 2h précédant le test de reconnaissance d'objets. (B) Niveau d’Aβ42 soluble dans le cortex de

souris 3xTg-AD ayant reçu une injection intraveineuse (IV) d’insuline (3,8 IU/kg) ou de salin, 5 minutes précédant le

sacrifice. Tiré de Vandal et al. 2014b.

A

B

23

Une étude similaire a été menée et les résultats ont montré qu’une dose de 20 UI améliore le pointage du

test de mémoire delayed story memory chez les hommes et les femmes, indépendamment de leur

génotype APOE (Claxton et al. 2013). Toutefois, une dose de 40 UI, administrée aux non-porteurs

d’APOE4, améliore la mémoire chez les hommes, mais la détériore chez les femmes. Cette même dose n’a

toutefois pas d’effet sur les porteurs d’APOE4 qui demeurent stables sur le plan cognitif suite à

l’administration. Ces résultats suggèrent une résistance à une dose élevée d’insuline chez les patients

APOE4. Les mécanismes expliquant l’absence de bénéfices suite au traitement d’insuline chez les patients

APOE4 n’ont pas été identifiés par l’auteur (Claxton et al. 2013).

Les études cliniques décrites précédemment étudiaient les effets d’une administration d’insuline régulière

sur différentes fonctions cognitives en fonction du génotype APOE (Reger et al. 2008 ; Claxton et al. 2013 ;

Hanson et al. 2014). Ce type d’insuline possède une courte demi-vie et mime l’effet de l’insuline relâchée

en période post-prandiale. L’équipe de Claxton a voulu répéter l’expérience en utilisant cette fois un

analogue de l’insuline de longue durée, l’insuline détémir (Claxton et al. 2014). Cette molécule est absorbée

moins rapidement que l’insuline régulière, réduisant ainsi le risque d’épisodes hypoglycémiques (De Leeuw

et al. 2005). Les résultats d’études in vivo suggèrent que le détémir pourrait avoir une plus grande action

sur la signalisation de l’insuline au niveau du système nerveux central que l’insuline régulière (Hennige et

al. 2006). Une dose quotidienne de 20 ou 40 UI de détémir ou de salin (placebo) a été administrée par voie

intranasale à des patients atteints de DCLa ou d’une probable MA pendant une période de 21 jours. Les

A

B

Figure 5 : Moyenne des résultats des tests de mémoire Story Recall Test (A) et Hopkins Verbal Learning Test (B) chez

des patients non-porteurs et porteurs d’APOE4, 15 minutes après avoir reçu un placebo (salin) ou différentes doses

d’insuline sur 5 matins séparés d’une à 6 semaines. Adapté de Reger et al. 2008.

24

patients ont ensuite subi une série de tests cognitifs, 12h après avoir reçu la dernière dose du traitement.

La dose de 40 UI de détémir a eu pour effet d’améliorer la mémoire verbale chez les patients APOE4 et de

la détériorer chez les patients non-porteurs d’APOE4 (Claxton et al. 2014). Ce résultat diverge de

précédentes études où les porteurs d’APOE4 ne bénéficiaient pas d’un traitement à l’insuline régulière

(Reger et al. 2008 ; Claxton et al. 2013). Les auteurs évoquent les propriétés de liaison à l’albumine ainsi

que la plus grande lipophilicité du détémir pour potentiellement expliquer ce résultat. Dans le cas de la

mémoire de travail verbale et visuospatiale, la dose de 40 UI de détémir a apporté une amélioration, peut

importe le génotype APOE des individus. La dose de 20 UI n’a pas eu d’effet sur la mémoire dans cette

étude, contrairement à l’étude de Claxton utilisant de l’insuline régulière (Claxton et al. 2013), probablement

en raison de la différence entre les profils pharmacodynamiques des deux formulations d’insuline. Chez les

porteurs d’APOE4, la dose de 40 UI a été associée à une diminution de la résistance périphérique à

l’insuline, tandis que chez les non-porteurs, elle a été liée à une augmentation de celle-ci au cours des 21

jours de traitement (Claxton et al. 2014). D’autres études sont nécessaires pour vérifier la sécurité et

l’efficacité de l’insuline détémir comme traitement chez les individus atteints de problèmes de mémoire,

mais cette formulation pourrait être bénéfique pour les patients APOE4 qui sont résistants au traitement

d’insuline régulière (Claxton et al. 2014).

Bref, l’utilisation de l’insuline régulière, à titre d’outil thérapeutique dans la MA, démontre une certaine

efficacité chez les individus non-porteurs d’APOE4. Toutefois, une meilleure compréhension de la

signalisation de l’insuline chez les patients atteints de la maladie est nécessaire avant d’entreprendre

d’autres études cliniques.

1.4) Problématique, objectifs et hypothèses

La MA est une maladie complexe qui, même un centenaire après l’identification des premières lésions

cérébrales, demeure incurable. Avec le vieillissement de la population, sa prévalence continuera

d’augmenter en flèche. Les individus atteints de la MA présentent plusieurs symptômes dont des troubles

sur le plan cognitif. Certaines études ont également révélé l’existence d’une résistance à l’insuline,

notamment dans le cerveau des patients Alzheimer (Kuusisto et al. 1997 ; Talbot et al. 2012), qui serait

associée au déclin cognitif caractéristique de la maladie (Dash 2013). Pour pallier à cette

insulinorésistance, l’administration d’insuline, via différentes voies, a été étudiée et les résultats obtenus

s’avèrent prometteurs. Des améliorations significatives sur le plan cognitif ont d’ailleurs été observées.

25

Toutefois, il semble que l’efficacité du traitement à l’insuline varie en fonction du génotype APOE de

l’individu qui le reçoit. En effet, suite à cette approche thérapeutique, les patients APOE4 ne retirent pas de

bénéfices, contrairement aux non-porteurs d’APOE4. Plusieurs équipes de recherche se sont penchées sur

cette problématique pour tenter de comprendre et d’identifier les mécanismes impliqués. À ce jour,

certaines hypothèses ont été émises quant à une possible altération de la signalisation de l’insuline chez

les porteurs d’APOE4. Les résultats d’études précédentes montrent des indices HOMA-IR plus bas

(VanFossen et al. 2010), une probabilité plus élevée d’hyperglycémie (Elosua et al. 2003 ; Tao et al. 2011)

ainsi qu’une susceptibilité augmentée aux atteintes résultant d’une régulation déficiente de la glycémie

(Ravona-Springer et al. 2014) chez les patients APOE4. La signalisation de l’insuline pourrait donc être

altérée chez les porteurs d’APOE4 et potentialiser l’apparition de problèmes cognitifs. Afin de mieux

comprendre l’association entre l’absence de bénéfices d’un traitement d’insuline et être porteur d’APOE4,

nous avons étudié la signalisation de l’insuline chez des souris transgéniques APOE3 et APOE4, ayant subi

un remplacement du gène APOE murin par un allèle APOE humain.

En se basant sur les résultats présents dans la littérature, nous avons émis comme hypothèse qu’il y aurait

des différences dans la réponse cérébrale à l’insuline entre les souris APOE3 et APOE4. En effet, il a été

montré à plusieurs reprises que les patients APOE3 et APOE4 répondent différemment à l’administration de

cette hormone. Par exemple, l’étude de Reger a rapporté que l’insuline améliore la mémoire chez les

patients non-porteurs d’APOE4 tandis qu’elle la détériore chez les porteurs (Reger et al. 2008). Claxton et

son équipe ont également démontré qu’une dose d’insuline de 40 UI agit différemment sur les

performances cognitives des individus en fonction de leur génotype APOE (Claxton et al. 2013).

Afin de valider notre hypothèse, les objectifs sont les suivants :

Vérifier l’effet d’une injection d’insuline sur :

1) le comportement des souris APOE en fonction de leur génotype.

2) des protéines impliquées dans les voies de signalisation de l’insuline, chez les souris APOE.

• Muscle

• Cortex cérébral

3) des protéines impliquées dans le développement de la MA, chez les souris APOE.

• Cortex cérébral

• Cellules endothéliales

27

Chapitre 2 : Altered cerebral insulin response in

transgenic mice expressing the epsilon-4 allele of

human apolipoprotein E gene.

2.1) Résumé

La variation allélique epsilon-4 du gène de l’apolipoprotéine E (APOEε4) est le principal facteur de risque

pour développer la forme sporadique de la maladie d’Alzheimer (MA). De précédentes études ont démontré

que l’administration d’insuline par voie intranasale améliore la performance cognitive chez des patients

atteints de la MA, excepté ceux qui sont porteurs d’APOE4. Nous avons donc étudié les effets d’une

injection d’insuline aigüe sur la cognition, la signalisation de l’insuline, la phosphorylation de tau et les

protéines impliquées dans le transport d’Aβ dans le cortex et les capillaires cérébraux de souris

transgéniques APOE3 et APOE4, en fonction du leur génotype APOE. L’insuline n’a pas eu d’effet sur la

mémoire de reconnaissance, l’anxiété et l’activité locomotrice générale des souris. Suite à l’injection de

l’hormone, le ratio pAKT/AKT (pSer473), normalisé avec les valeurs des animaux injectés au salin, était

260% plus élevé dans le cortex des souris APOE4 comparativement aux APOE3. De plus, l’insuline a

augmenté de 44% la phosphorylation de tau à la sérine 202 dans le cortex des souris APOE4 par rapport

aux APOE3. Ces résultats suggèrent que l’expression d’APOE4 mène à une activation accentuée de la voie

de signalisation PI3K/AKT et à l’accumulation de tau hyperphosphorylé au cerveau. La réponse cérébrale à

l’insuline semble donc altérée chez les porteurs d’APOE4 et cette altération pourrait potentiellement

expliquer l’absence de bénéfices cognitifs chez les porteurs d’APOE4 recevant un traitement d’insuline.

28

Altered cerebral insulin response in transgenic mice expressing the epsilon-4 allele of human

apolipoprotein E gene.

Traversy Marie-Thérèse1,2; Vandal Milène1,2; Tournissac Marine1,2; Calon Frédéric1,2 *.

1Faculté de pharmacie, Université Laval, Québec, Québec, Canada.

2Axe Neurosciences, Centre de Recherche du centre Hospitalier de l’Université Laval (CRCHUL), Québec,

Québec, Canada.

Key words : APOE4, Alzheimer’s disease, insulin.

*Correspondence and reprint requests should be addressed to :

Dr. Frédéric Calon

Centre Hospitalier de l’Université Laval (CHUL) Research Center

2705 Laurier Blvd, Québec, QC, Canada, G1V 4G2

Tel: (418) 525-4444 poste 48697

E-mail: [email protected]

mailto:[email protected]

29

2.2) Abstract

Apolipoprotein E epsilon-4 (APOEε4), an allelic variation of the apolipoprotein E (APOE) gene, is the main

genetic risk factor for developing the late-onset form of Alzheimer’s disease (AD). Since intranasal insulin

was previously reported to improve cognition in AD patients but not in APOE4 carriers, we investigated the

effects of an acute insulin injection on cognition, insulin signaling and proteins implicated in Aβ transport

and tau phosphorylation, according to APOE genotype, in the cortex and brain capillaries of APOE3 and

APOE4-targeted replacement mice. Insulin had no effect on object recognition memory, anxiety and general

locomotor activity but induced higher increases in AKT pSer473 (+260%) and tau pSer202 (+44%) cortical

concentrations in APOE4 compared to APOE3 mice. Therefore, our data suggest that APOE4 carriage

leads to an enhanced insulin-induced activation of cerebral PI3K/AKT pathway and AD-like tau

neuropathology. Our results are consistent with altered insulin signaling in APOE4 carriers and provide a

possible mechanism to explain the absence of cognitive benefit from insulin therapy in these individuals.

30

2.3) Introduction

Apolipoprotein E (APOE) protein plays a major role in brain lipid homeostasis, especially via cholesterol

transport within the central nervous system (Alaupovic 1982; Boyles et al. 1989; Hauser et al. 2011). In

humans, there are three major isoforms for the APOE gene : apoE2, apoE3 and apoE4. Each isoform is

encoded by an allele for which amino acids vary at positions 112 and 158. In apoE2, both positions are

occupied by a cysteine, whereas an arginine and a cysteine and two arginine residues are found

respectively in apoE3 and apoE4 isoforms (Weisgraber et al. 1981). ApoE3 is the most common APOE

isoform in the general Caucasian population with a frequency of 77.9% while only 13.7% express the

epsilon-4 (ε4) allele of the APOE gene (Farrer et al. 1997). Among the patients suffering from Alzheimer’s

disease (AD), the APOEε4 allele is much more frequent, reaching 36.7% (Farrer et al. 1997). Corroborating

evidence indicate that being an APOE4 carrier is the main genetic risk factor for developing sporadic and

familial AD (Corder et al. 1993; Saunders et al. 1993; Strittmatter et al. 1993; Warzok et al. 1998). In

comparison with APOE3 homozygous carriers, the risk of developing AD is increased approximately 15

times for an homozygous carrier of APOEε4 allele (Farrer et al. 1997; Holtzman et al. 2012). In addition,

APOE4 expression has been repeatedly shown to alter treatment response in series of large clinical trials,

and has thus become an unescapable pharmacogenetic feature to be considered in AD.

APOE4 is known for altering the structure and function of the protein, including an increased turnover

leading to a reduction in total brain apoE concentration (Bales et al. 1997; Beffert et al. 1999; Ong et al.

2014). APOE4-targeted replacement mice have shown impairments in memory and exploratory behaviour

compared to APOE3 at 6 months of age, a deficit known to increase with age (Raber et al. 1998). Human

APOE4 carriers also have impaired cognitive functions compared to non-carriers aged 40 years and older,

long before any diagnosis of dementia (Caselli et al. 2009; Liu et al. 2010). Studies in mice show that the

expression of human APOE4 is linked to blood-brain-barrier (BBB) dysfunction (Bell et al. 2012; Hawkes et

al. 2012) and reduced brain transport of polyunsaturated fatty acids (Vandal et al. 2014a). The expression

of the APOEε4 allele also modulates the regulation of the receptor for advanced glycation endproducts

(RAGE) as shown in a previous study that reported an upregulation of RAGE mRNA expression in

homozygous APOE4 mice compared to homozygous APOE3 (Donahue et al. 2008).

There is a wealth of AD-relevant pathogenic processes or risk factors known to be influenced by APOE

alleles. Firstly, APOE4 genotype has previously been characterized by impaired clearance of amyloid-beta

peptides (Aβ), one of the principal hallmark of AD (Querfurth, La Ferla 2010), from the brain and across the

31

BBB in humans at risk of developing AD as well as in animal models (Deane et al. 2008; Castellano et al.

2011) and with increased brain accumulation of Aβ in humans (Drzezga et al. 2009; Morris et al. 2010;

Risacher et al. 2013). In addition, an increased accumulation of hyperphosphorylated tau protein, another

hallmark of AD (Querfurth, La Ferla 2010), was found in a previous study, in hippocampal neurons of

APOE4-targeted replacement mice (Liraz et al. 2013). In women, the increased APOE-related risk of

developing AD has been suggested to be associated with tau pathology (Altmann et al. 2014). In normal

aging, APOE4 also lowers cerebral glucose metabolism (Reiman et al. 2004; Jagust and Landau 2012).

Moreover, APOE4 is related to environmental AD-risk factors. Indeed, being a carrier of that allele is

associated with increased risk of developing type 2 diabetes (T2D) (Profenno et al. 2010; De Felice et al.

2013) and an absence of clinical benefits on cognition from ω-3 polyunsaturated fatty acids consumption

(Huang et al. 2005; Quinn et al. 2010; Samieri et al. 2011).

Mounting evidence indicates that stimulating insulin pathways in the brain may have a therapeutic value on

AD-related cognitive impairment. In addition to its multiple actions in the periphery, insulin plays crucial roles

in the brain such as regulating energy homeostasis, synaptic plasticity and memory function (Biessels et al.

1998; Kamal et al. 2000; Stranahan et al. 2008; Banks et al. 2012). According to previous studies,

dysfunctions in insulin production and signaling are linked to cognitive impairment (Luchsinger et al. 2004;

Schrijvers et al. 2010; McCrimmon et al. 2012). Patients suffering from AD present cerebral insulin

resistance (IR) (Kuusisto et al. 1997; Steen et al. 2005) and alterations in brain insulin metabolism, possibly

underlying defects in energy consumption and neurodegeneration, characteristic of the disease (Watson et

al. 2003; Holscher et al. 2010; de la Monte et al. 2012). A recent clinical pilot study performed on patients

with mild cognitive impairment (MCI) or AD showed that a four-month intranasal insulin treatment of 20

international units (IU) can improve cognitive functions such as memory while preserving functional abilities

(Craft et al. 2012). Benefits of insulin have also been shown in 3xTg-AD mice, an animal model of AD, by

improving memory function and lowering brain soluble Aβ levels, 5 minutes after a single injection (Chen et

al. 2014; Vandal et al. 2014b).

However, the cognitive response to insulin has been shown to critically depend on APOE alleles. For

example, APOE4 carriers subjected to a verbal memory test display poorer recall after insulin administration

in comparison with non-carriers and healthy controls (Reger et al. 2006). Word and story recall were

improved by a low dose of insulin in non-carriers of APOE4 while they were declined in APOE4 carriers

suggesting a differential dose-response curve for intranasal administration of insulin according to APOE

32

genotype (Reger et al. 2008).

In non-diabetic patients with MCI, IR has previously been associated to cognitive decline exclusively in

APOE4 carriers (Kim et al. 2014) while another study has reported no APOE4 interaction with IR on AD-risk

(Schrijvers et al. 2010). Previous results have shown lower homeostasis model assessment-estimated IR

(HOMA-IR) values, indicating decreased IR, in APOE4 carriers compared to non-carriers (VanFossen et al.

2010) although no association between APOE genotype and IR has been detected in other studies (Meigs

et al. 2000; Ragogna et al. 2012). In an elderly Chinese population, an association between APOE4

carriership and IR has been identified especially in men (Elosua et al. 2003). This study also highlighted a

positive association between APOE4 and hyperglycemia. Other results pointed out an increased likehood of

hyperglycemia in APOE4 men compared to APOE3, while no difference has been detected in blood fasting

glucose between them (Tao et al. 2011). In patients with T2D, higher glycated hemoglobin (HbA1c) levels

were linked to lower cognitive performance in APOE4 carriers but not in non-carriers, which suggests that

APOE4 individuals have increased susceptibility to poor glycemic control damages (Ravona-Springer et al.

2014). These results suggest that brain insulin signaling is possibly impaired in APOE4 carriers leading to

hyperglycemia and ultimately to hyperinsulinemia, which could promote neurodegenerative disorders. Thus,

insulin signaling in APOE4 carriers needs further understanding before implementing insulin-based

therapeutic intervention in AD patients.

In this study, we investigated the relationships between APOE genotype, insulin sensitivity, cognitive

functions and insulin signaling in the muscle, cortex and brain capillaries of APOE3 and APOE4-targeted

replacement mice. We report no significant difference in insulin sensitivity in the periphery between APOE

genotypes. However, in the brain cortex, increases in pAKT and tau pSer202 concentration following a

single insulin injection were significantly greater in APOE4 mice. Our data revealed APOE-related

differences in protein concentrations involved in tau phosphorylation and insulin signaling following an acute

insulin injection in APOE3 and APOE4-targeted replacement mice.

2.4) Materials and methods

2.4.1) Animals

Males and females (approximate 1:1 ratio) APOE-targeted replacement mice (APOE3 and APOE4) were

used for the experiments. Murine APOE gene was targeted and replaced by human APOE 3 or 4 to create

mice (Sullivan et al. 1997). The animals were purchased from Taconic (Hudson, NY, USA) and

33

subsequently reproduced at the CHUL research center animal facilities. The mice were fed with a

commercial chow diet (Teklad 2018; Harlan Laboratories, Indianapolis, IN, USA) during their entire lifespan.

APOE4 mice have lower body and adipose tissue weight than APOE3 mice (Volcik et al. 2006; Pendse et

al. 2009). In order to minimize the impact of the anxiety generated by the experiments and allow mice to

rest and acclimate between them, the behavioural and metabolic testing started a week before animal

sacrifice, at 12 months of age. Mice were fasted for 6 hours to prevent any metabolic change related to food

intake and received an intravenous (i.v.) injection of insulin (3.8 U/kg of human insulin) or saline in the tail 5

minutes before death. This dose is known to strongly activate insulin signaling in the muscle (White et al.

2010). Mice were sacrificed by intracardiac perfusion with 40 mL of ice-cold 0.1 M phosphate buffer saline

(PBS) while deeply anesthetized with ketamine/xylazine. One brain hemisphere was rapidly collected,

dissected and kept frozen at -80C until processing for Western Blot. The other brain hemisphere of the

mice (n = 3 to 4 animals/group) was kept in ice-cold 0.1 M PBS and rapidly homogenize for brain capillary

extraction. The gastrocnemius muscle was collected, powderised and kept frozen at -80C until processing

for Western Blot. Adipose tissue was retrieved and weighed. All experiments involving animals were

approved by Laval University ethics committee. The number of animals per group is specified directly in the

graph for each experiment.

2.4.2) Insulin sensitivity

Insulin sensitivity was measured using insulin tolerance test (ITT) (n = 7 animals/group). Mice were fasted

for 6 hours to prevent any metabolic change related to food intake and received an intraperitoneal (i.p.)

injection of insulin (1U/kg of human insulin). A blood drop was taken from the saphenous vein of the mice

and glycemia was measured with a glucometer (ONETOUCH UltraMini, LifeScan, CA, USA) before and 15,

30, 45, 60 and 90 minutes after the insulin injection. We identified two APOE4 insulin-resistant mice and

both were excluded from statistical analysis.

2.4.3) Brain capillary isolation

Mouse brain microvessels were isolated by density-gradient centrifugation using the capillary depletion

technique as previously described (Do et al. 2012; Alata et al. 2014). After intracardiac perfusion, one brain

hemisphere of APOE3 and APOE4-targeted replacement mice was collected and cerebellum, meninges,

brain stem and large superficial blood vessels were removed. The resulting cortex was transferred into ice-

cold 0.1 M PBS and was gently homogenized in ice-cold Dulbecco’s Modified Eagles Medium (DMEM)

34

containing 10% fetal bovine serum (FBS) with a Potter homogenizer. The homogenate was centrifuged at

500 g for 10 minutes at 4°C and the supernatant was eliminated. The pellet was homogenized in 5 ml of

DMEM, 25% bovine serum albumin (BSA) and centrifuged at 1 500 g for 20 min at 4°C. Next, this pellet

was homogenized in DMEM containing 10% FBS and the homogenate passed through a 60-μm mesh

nylon filter to eliminate larger vessels. This filtrate was centrifuged at 12 000 g for 45 min at 4°C. The pellet

containing the microvessels was washed in ice-cold PBS and centrifuged again at 12 000 g for 20 min at

4°C. The supernatant was excluded and the pellets were stored at -80°C until processed for Western blot

analysis.

2.4.4) Tissue preparation for post-mortem analyzes

Proteins were extracted from gastrocnemius muscle, parietotemporal cortex of one brain hemisphere and

brain capillaries of the other brain hemisphere of the mice. Cortices were homogenized in eight times their

volume of Tris-buffered saline (0.05 mol/L Tris-Base, 0.138mol/L NaCl, 2.7 mol/L KCl) for the soluble

protein fraction and a RIPA buffer (150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-Cl, 0.5% sodium deoxycholate, 0.5%

sodium dodecyl sulfate, 1% Triton X-100) for the membrane soluble protein fraction. Powderized muscles

and brain capillaries were homogenized in RIPA buffer. These buffers contain a cocktail of proteases

inhibitors (CompleteTM, Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA) and phosphatases inhibitors [Phostop

(Roche Diagnostics), sodium orthovanadate, and sodium fluoride]. The samples were sonicated and

centrifuged sequentially at 100 000 g for 20 minutes at 4°C. An insoluble fraction was generated by adding

formic acid to the centrifugation sediment, as previously described (Lebbadi et al. 2011). All fractions were

kept frozen at −80°C until needed. The proteins were quantified using bicinchoninic acid assays (Pierce,

Rockford, IL, USA).

2.4.5) Western immunoblotting

Samples from the cortex of 6 to 7 animals/group and from brain capillaries of 3 to 4 animals/group,

respectively containing each 20 μg and 15 μg of protein, were loaded and separated by sodium dodecyl

sulfate-polyacrylamide electrophoresis gel and afterwards electroblotted onto a polyvinylidene difluoride

PVDF membrane (Immobilon, Millipore, MA, USA). 5% milk with 0,5% bovine serum albumin (BSA)

blocking agent was used to block the membranes for 1 hour. Subsequently, membranes were

immunoblotted with primary and then with secondary antibodies followed by chemiluminescence reagents

(LumiGLO Reserve Chemiluminescent Substrate Kit, KPL, Gaithersburg, MD, USA) and pictures were

immediately taken with KODAK. The list of primary antibodies used in our experiments is presented in the

35

supplementary material (Table 1). Intensity of the bands obtained was evaluated with a KODAK Image

Station 4000MM Digital Imaging System (Molecular Imaging Software version 4.0.5f7, KODAK, New Haven,

CT). The resistant mouse in the insulin group was excluded from statistical analysis for all post-mortem

experiments.

2.4.6) Behavioural assessment

The effects of an insulin injection on memory and anxiety-like behaviour in APOE3 and APOE4-targeted

replacement mice were verified using cognitive tests (n = 6 to 13 animals/group). Behavioural tests were

performed the week before sacrifice with an approximate recovery time of 24 hours between the tests. The

effect of insulin on recognition memory, anxiety and locomotor activity was verified by administrating a

single intraperitoneal (i.p.) insulin (1 U/kg) or saline injection 2 hours before the tests were performed, in

order to restore baseline glycemia and reduce stress. The protocols used for behavioural testing were

based on previous studies performed on 3xTg-AD mice (Arsenault et al. 2011; Bories et al. 2012; St-Amour

et al. 2014; Vandal et al. 2014b). The insulin-resistant mouse in the insulin group was excluded from

statistical analysis for all behavioural experiments.

2.4.6.1) Recognition memory assessment

Learning and recognition memory were evaluated by subjecting the mice to the novel object recognition

(NOR) test (APOE3 saline n= 7, APOE3 insulin n=6, APOE4 saline n=5, APOE4 insulin n=5). During the

familiarization phase, the mouse was introduced 5 minutes in a standard clear cage (29.2 cm x 19 cm x

12.7 cm) with two identical objects and was rapidly put back in its housing cage afterwards. An hour later, it

was put back in the same clear cage with a novel and a familiar object for another five-minute period. NOR

is based on the spontaneous tendency of rodents to interact more with a novel object than with a familiar

one. Recognition index = [Time exploring the new object/(Time exploring the new object + Time exploring

the familiar object)] X 100. The time exploring the object represents the time the mouse spent smelling or

exploring an object while subjected to the test (Arsenault et al. 2011; St-Amour et al. 2014). Animals whose

recognition index was below 30% were excluded from statistical analysis due to an exploration time, during

the familiarization phase, considered insufficient to allow recognition (1 APOE3 saline, 1 APOE4 saline and

1 APOE4 insulin were excluded on that basis).

2.4.6.2) Anxiety assessment

Anxiety-like behaviour was evaluated by subjecting the mice to a dark-light box emergence test (APOE3

saline n= 6, APOE3 insulin n=6, APOE4 saline n=6, APOE4 insulin n=6), as previously described (Latapy et

36

al. 2012; St-Amour et al. 2014). At first, the mouse was placed in the center of the dark chamber with a free

access to the illuminated chamber. The time the mouse took to enter the illuminated compartment for the

first time within 5 minutes was set as the escape latency. A longer escape latency was interpreted as

increased anxiety. Animals that stayed in the dark chamber without coming out within 5 minutes were

excluded from the statistical analysis (1 APOE3 saline and 1 APOE3 insulin were excluded on that basis).

2.4.6.3) Locomotor activity assessment

General locomotor activity was evaluated by subjecting the mice to the open field test (APOE3 saline n= 7,

APOE3 insulin n=7, APOE4 saline n=6, APOE4 insulin n=6) as previously described (St-Amour et al. 2014).

The open field apparatus is made up of ten Plexiglas cages with translucent walls (80 cm × 80 cm). Each

mouse was introduced in the center of a cage and an automated recording of photobeam breaks (San

Diego Instruments) tracked movements in order to calculate the distance traveled by the mice within an

hour.

2.4.7) Statistical analysis

Data are presented as means ± SEM. Statistical analysis and number of mice per group are specified in

each figure. Equality of the variances between the groups was determined using the Bartlett’s test. When

more than two groups were compared, one-way or two-way ANOVA were used. For one-way ANOVA with

equal variances groups, Tukey’s post hoc analysis was performed. When comparing two groups, an

unpaired Student t test was performed, with a Welch correction included if variances were not equal. When

normality wasn’t respected and variances were unequal, a non-parametric Mann-Whitney test was

performed. To compare means of the insulin group with the average saline (hypothetical value of 1), a one-

sample t test was used. Statistical significance was set at P < 0.05. All statistical analyzes were performed

with Prism 6 (GraphPad software, San Diego, CA, USA) or JMP (version 10.0.0; SAS Institute Inc., Cary, IL)

softwares.

2.5) Results

2.5.1) APOE genotype does not modulate peripheric insulin

sensitivity in APOE mice

Insulin sensitivity across APOE genotypes was first assessed in the periphery by subjecting APOE3- and

APOE4-targeted replacement mice to an ITT at 12 months of age. Initial blood glucose levels were similar in

APOE3 and APOE4 mice (Fig. 1a). No evidence of IR was detected for APOE4 during the ITT (Fig. 1b and

37

1c). To determine muscle insulin sensitivity, we compared protein kinase B (AKT) and glycogen synthase

kinase 3-bêta (GSK3β) phosphorylation in the gastrocnemius muscle from mice 5 minutes after a single i.p.

injection of either insulin or saline. We observed a massive increase in AKT phosphorylation at Ser473 in

both APOE3 (78-fold) and APOE4 (177-fold) in the gastrocnemius muscle of mice injected with insulin

compared to the saline-injected groups, indicating a comparable insulin response in both groups (Fig. 1d).

Insulin also had an effect on GSK3β phosphorylation at Ser9, increasing it 2.2-fold and 2.4-fold in APOE3

and APOE4 mice, respectively, compared to mice injected with saline (Fig. 1e).

2.5.2) Insulin does not modulate memory, anxiety and motor

functions in APOE mice

We next assessed brain apoE concentrations and behavioural indexes in APOE3 and APOE4 mice. As it is

well known that insulin is involved in memory improvement, synapse formation and synaptic remodelling

(Chiu et al. 2008; Marks et al. 2009; Nisticò et al. 2012; Vandal et al. 2014b), we verified the effects of a

single i.p. insulin injection on the behaviour of APOE3 and APOE4 mice. Memory function was evaluated by

the object recognition index (Fig. 2a and 2b), anxiety by the latency to escape from the dark chamber (Fig.

2c) and general locomotor activity by the distance traveled (Fig. 2d). Although insulin has previously been

reported to improve memory in animal models (Haj-Ali et al. 2009; Vandal et al. 2014b), we detected no

effect of insulin on the behavioural parameters investigated in our study. However, we found that the

recognition index was approximately 15% lower in APOE4 compared to APOE3 mice (Fig. 2b). These

results suggest impaired recognition memory in APOE4 mice, which is consistent with previous studies

reporting memory impairments in APOE4 mice (Raber et al. 1998; Liraz et al. 2013; Salomon-Zimri et al.

2014) and humans (Caselli et al. 2009; Liu et al. 2010). We found no significant difference in brain apoE

concentrations assessed in the TBS-soluble fractions of cortical extracts from 12-month-old APOE3 and

APOE4 mice (Fig. 2e), consistent with previous data (Sullivan et al. 2011), but not with others showing a

decrease in APOE4 mice (Riddell et al. 2008; Vandal et al. 2014a).

2.5.3) APOE4 have higher cortical pAKT concentration than

APOE3 mice following an acute insulin injection

We next investigated insulin signaling in the brain according to APOE genotypes by evaluating

phosphorylated kinases concentrations in the cortex after a single insulin injection. PI3K/AKT signaling

pathway is initiated as phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) is recruited and activated, inducing AKT

activation (Whiteman et al. 2002), which phosphorylates GSK3β at serine 9 (Ser9), leading to its inhibition

38

(Cross et al. 1995). On one hand, we found that pAKT/AKT (pSer473) cortical ratios, normalized with values

from saline-injected animals, were 2.6 times higher in APOE4 mice compared to APOE3 mice (Fig. 3a). No

such a difference was observed for kinases downstream from AKT in the insulin signaling pathway,

including pGSK3β (pSer9) or pMAPK (mitogen-activated protein kinases) (pThr202, pTyr204, pThr185,

pTyr187) (Fig. 3b and 3c, respectively). Insulin increased pAKT/AKT ratio in APOE4 mice (+60%; Fig. 3a),

but not in APOE3 mice when data were normalized to those of mice injected with saline. On the other hand,

we observed that insulin decreased pJNK/JNK (c-Jun N-terminal kinases) (pThr183, pTyr185) in APOE3 (-

52%), bot not APOE4 mice (Fig. 3d) when data were normalized to those of saline-injected control mice,

suggesting the JNKs/c-Jun cascade is inhibited specifically in APOE3 carriers after insulin injection. Finally,

we also evaluated levels of protein phosphatase 2A catalytic subunit (PP2Ac) and protein phosphatase 2B

(PP2B), both implicated in dephosphorylation process of tau (Saito et al. 1995), and found no difference

between groups injected either with insulin or saline (Fig. 4a and 4b). Therefore, the above results show

that insulin cerebral response differs between APOE3 and APOE4 mice, with a greater activation of the

AKT cellular cascade in APOE4 than APOE3 mice.

2.5.4) Insulin does not influence proteins involved in Aβ brain

transport

APOE4 genotype has been previously associated with Aβ cerebral accumulation (Drzezga et al. 2009) and

impaired Aβ clearance (Deane et al. 2008; Castellano et al. 2011). To probe for potential downstream effect

of insulin on Aβ clearance, we determined the cortical concentrations of RAGE and low density lipoprotein

receptor-related protein 1 (LRP1), which are transporter proteins involved respectively in the influx and

efflux of Aβ across the BBB (Deane et al. 2003; Zlokovic et al. 2010; Deane et al. 2012). We reported no

difference in RAGE or LRP1 cortical concentration between both APOE genotypes or after insulin

administration (Fig 5a-c). Our data are consistent with previous results showing no difference in cellular

clearance of Aβ between APOE3 and APOE4 (Verghese et al. 2013).

2.5.5) APOE4 have higher tau pSer202 concentration than

APOE3 mice following an acute insulin injection

Increased accumulation of hyperphosphorylated tau protein in hippocampal neurons of APOE4-targeted

replacement mice has previously been shown (Liraz et al. 2013). Also, tau pathology is thought to be

involved in the APOE-related increase in AD risk in women (Altmann et al. 2014). We thus evaluated

cortical phosphorylated tau concentration using CP13 (pSer202), AT270 (pThr181) and PHF1 (pSer396 and

39

pSer404) antibodies. Increased tau phosphorylation following insulin injection in APOE4 mice compared to

APOE3 was detected at site pSer202 (+44%, Fig. 6a) without reaching statistical significance at sites

pThr181 and pSer396, pSer404 (Fig. 6b and 6c, respectively). Our data are consistent with previous studies

showing increased tau phosphorylation at Ser202 following administration of insulin (Freude et al. 2005) or

pioglitazone, a peripheral insulin sensitizer used in T2D treatment, in APOE4 mice (To et al. 2011). Overall,

this suggests that the higher insulin response in APOE4 mice is associated with hyperphosphorylation of

tau, a key AD neuropathological marker.

2.5.6) Insulin has no effect on its signaling in brain capillaries of

APOE mice

We also studied insulin signaling in endothelial cells by evaluating phosphorylated kinases concentration in

brain capillaries of both APOE genotypes. No difference in the effect of insulin between APOE3 and APOE4

mice for pAKT (pSer473) and pGSK3β (pSer9) was observed when reported on the average concentration

of mice injected with saline (Fig. 7a and 7b, respectively). The means of APOE3 and APOE4 values were

not different from 1, the hypothetical value representing no change between saline and insulin groups. We

also evaluated the insulin receptor (INSR) and found no difference between APOE genotypes and no effect

of insulin on its concentration (Fig. 7c). These results suggest no difference in insulin signaling in

endothelial cells between APOE3 and APOE4-targeted replacement mice. Since APOE4 genotype has

previously been linked to Aβ cerebral accumulation (Drzezga et al. 2009) and impaired Aβ clearance

(Deane et al. 2008; Castellano et al. 2011), we were interested in evaluating the concentration of RAGE and

LRP1 in endothelial cells. We reported no difference in RAGE, LRP1 and RAGE/LRP1 ratio concentrations

in brain capillaries between APOE genotypes (Fig. 7d, 7e and 7f, respectively). Insulin reduced RAGE

concentration in both APOE3 and APOE4 mice (Fig. 7d), while no effect of insulin on LRP1 and

RAGE/LRP1 ratio was detected (Fig. 7e and 7f, respectively). We did not identify any effect of insulin in

endothelial cells, except for RAGE concentration. However, this result needs to be confirmed due to the

important variation between samples and the small number of animals per group. Therefore, further

experiments based on the effect of insulin on BBB Aβ transporters in brain capillaries could be relevant.

2.6) Discussion

The APOE genotype has been repeatedly shown to influence treatment outcomes in AD clinical studies

(Farlow et al. 1996; Sparks et al. 2006; Choi et al. 2008; Kennelly et al. 2012; Wang et al. 2014), and this is

the case for insulin trials as well (Reger et al. 2006; Reger et al. 2008; Claxton et al. 2013). In this study, we

40

used APOE3- and APOE4-targeted replacement mice to investigate the relationship between human APOE

genotype, cerebral insulin response, and AD-related parameters, such as Aβ transporters and tau

phosphorylation. Firstly, our results do not confirm the previously postulated hypothesis that APOE4 display

more brain insulin resistance than APOE3 carriers (Elosua et al. 2003; Claxton et al. 2013). Rather, the

brain of APOE4 mice showed an enhanced response to insulin, at least with respect to the AKT pathway.

However, the responses of APOE4 animals to acute insulin included a worsening of tau phosphorylation at

Ser202, suggesting that activation of insulin signaling pathway leads to tau hyperphosphorylation in APOE4

mice. Consistent with results of clinical studies with insulin, these data suggest that insulin-based treatment

in APOE4 carriers may be more harmful than beneficial. Therefore, it is concluded that treatment of AD

targeting brain insulin signaling should take account of APOE genotype.

2.6.1) Greater brain response to insulin in APOE4 mice

To our knowledge, brain resistance to insulin has never been investigated in APOE mice. Although AD

pathology has previously been associated with IR in mice (Kohjima et al. 2010; Mody et al. 2011) and

humans (Kuusisto et al. 1997; Steen et al. 2005), our findings are not completely consistent with this

association. While carrying APOE4 is the main genetic risk factor for late-onset AD, we would have

expected a brain resistance, or at least a lesser response to insulin in APOE4 mice. However, probing the

AKT pathway allowed us to detect an increased cellular response to insulin in the brain of APOE4-targeted

replacement mice following insulin injection. This suggests that IR at the level of its upstream players in the

signaling cascade does not explain why APOE4 carriers with AD are not taking benefits from insulin

therapy.

2.6.2) Increase in tau phosphorylation could contribute to the

progression of AD-like pathology in APOE4 mice

We next sought to determine whether AD-related events downstream from PI3K/AKT cascade responded

differently among APOE genotypes. The effect of a single acute insulin injection on the phosphorylation of

tau, which is one of the main neuropathological markers of AD (Alonso et al. 2001; Sato et al. 2002;

Querfurth, La Ferla 2010), was shown to be more prominent in APOE4 mice than in APOE3 mice. In fact,

the cortical concentration of tau pSer202 following the insulin injection was higher in APOE4 compared to

APOE3 mice. Since tau hyperphosphorylation is strongly associated to AD clinical expression (Querfurth

and La Ferla 2010), it could be acting as a promoter for AD-like pathology in APOE4 mice.

41

2.6.3) Enhanced insulin response might contribute to raise tau

phosphorylation in APOE4 mice

The change in AKT activation following insulin injection could be implicated in tau hyperphosphorylation

throughout different mechanisms. Previous studies showed that activated AKT is able to phosphorylate tau

protein at sites Thr212 and Ser214 (Ksiezak-Reding et al. 2003; Kyoung Pyo et al. 2004) and is responsible

for activating GSK3β-signaling (Cross et al. 1995). Insulin treatment was shown to be associated with lower

glucose metabolism and body temperature, which both correlate with tau phosphorylation in mice (Planel et

al. 2004). At low body temperatures, GSK3β tended to be inhibited by an increase of its phosphorylation at

Ser9, while no change in the activation of JNK and MAPK was reported (Planel et al. 2004). Therefore, the

activation of kinases targeting tau in the PI3/AKT pathway following insulin treatment had a moderate role to

play in tau phosphorylation compared to the inhibition of phosphatases during hypothermia (Planel et al.

2004). GSK3β has previously been shown to regulate tau phosphorylation (Takashima et al. 1996) notably

by phosphorylating tau at Ser202 (Mandelkow et al. 1992; Ishiguro et al. 1995; Illenberger et al. 1998;

Reynolds et al. 2000). Since we reported greater activation of PI3K/AKT pathway and tau phosphorylation

following insulin injection in APOE4 mice than in APOE3 mice, our results are consistent with the implication

of insulin signaling pathways in tau hyperphosphorylation, especially in APOE4 mice. Impaired insulin

signaling may activate strongly PI3K/AKT pathway leading to enhanced tau phosphorylation in the cortex of

APOE4 mice. Therefore, the possibility that treating AD with insulin might not be suitable for APOE4 carriers

should be seriously considered before undertaking any other clinical trials.

2.6.4) Insulin as a therapeutical tool in AD

Intranasal insulin is considered to be a promising lead as a therapeutical tool in AD (Reger et al. 2008; Craft

et al. 2012; Claxton et al. 2013). The effect of intranasal insulin administration on cognition according to the

APOE genotype has been investigated in randomized clinical trials (RCT). Study volunteers presented

impaired memory, suffering from probable AD, amnestic MCI or multiple domain MCI with amnestic

features. They received a single dose of insulin (10, 20, 40 or 60 IU) or saline on 5 separate mornings, one

to six weeks apart. Each time, a battery of memory tests, including story recall and Hopkins Verbal Learning

Test, was performed 15 minutes following insulin administration. Memory improvement, peaking at 20 IU,

was reported in non-carriers of APOE4 but a decline following intranasal insulin administration was reported

in APOE4 carriers (Reger et al. 2008). A similar study was conducted and results showed that a 20 IU dose

improved delayed story memory score in men and women independently of their APOE genotype but that

42

the 40 IU dose improved memory in men and declined it in women non-carriers of APOE4. Furthermore, 40

IU dose had no effect on APOE4 carriers who remained cognitively stable. Thus, these results suggest

resistance to a high dose of insulin in APOE4 carriers. Overall, clinical data show that APOE4 carriers do

not benefit from insulin therapy, which underscores the need to identify underlying mechanisms (Claxton et

al. 2013).

Since APOE4 is predominant in AD, representing over 36% of patients suffering from the disease (Farrer et

al. 1997), it is important to find out why they are not benefiting from insulin treatment. Animal models

provide a mean to directly tackle this question. Consistent with clinical data, intracerebroventricular insulin

injection dose-dependently improves memory and spatial learning in rats (Haj-ali et al. 2009). Furthermore,

a single acute insulin injection in 3xTg-AD mouse, an animal model of AD, reversed the negative

consequences of a high-fat diet (HFD) on memory and soluble Aβ levels (Vandal et al. 2014b). Our present

data reveal that the PI3K/AKT pathway in APOE4 mice respond more strongly to insulin, translating into a

rapid increase in tau phosphorylation at Ser202 after a single injection. At first glance, such a brain AKT

response to insulin may not fit entirely with reports in mice and humans suggesting that brain IR is actually

increased in AD (Kuusisto et al. 1997; Steen et al. 2005; Kohjima et al. 2010; Mody et al. 2011). Rather, our

data suggest that it is a faulty downstream mechanism such as tau hyperphosphorylation that makes the

action of insulin deleterious in APOE4 carriers, at least in an AD perspective. As far as these findings are

applicable to humans, they put forward a possible mechanism explaining why AD patients who are APOE4

carriers do not benefit from insulin therapy as non-carriers do.

2.7) Author’s contribution

MTT designed experiments, performed animal experiments and data analysis and wrote the first versions of

the paper. MV contributed to experiment design and manuscript writing. MT performed additional

confirmatory experiments. FC conceived the experimental design, obtained funding and wrote the paper.

2.8) Acknowledgments and conflict of interest disclosure

This study was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR), the Natural

Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) and the Canada Foundation for

Innovation (CFI). MTT is supported by a scholarship from the Fonds d’enseignement et de recherche (FER)

of Laval University’s pharmacy faculty. FC is supported by a salary award from the Fonds de la recherche

en santé du Québec (FRQ-S). The authors have no conflict of interest to declare.

43

2.9) References

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49

2.10) Figures and legends

Fig. 1 : No difference in insulin sensitivity between APOE3 and APOE4 mice at 12 months of age.

Insulin tolerance tests were performed on the mice. Initial blood glucose level (A), blood glucose levels

following intraperitoneal insulin injection (B) and the area under the curve of the graph presented in B (C).

The mice were given an insulin or saline injection 5 minutes before sacrifice. pAKT/AKT (D) and

pGSK3β/GSK3β (E) concentration ratios in membrane soluble fraction of the gastrocnemian muscle

samples were measured by western blot. Data are presented as mean ± SEM. To compare two groups, an

unpaired Student t-test was used when variances were equal and an unpaired Student t-test with Welch’s

correction was used when variances were unequal. A non-parametric Mann-Whitney test was used when

Gaussian distribution was not assumed and variances were unequal. To compare more than two groups

separately, data were compared using two-way ANOVA. *p < 0.05; ***p < 0.0001. No statistical difference

was observed between the groups in A and C.

50

Fig. 2 : Lower object recognition memory in APOE4 compared to APOE3 mice at 12 months of age: no effect of insulin. Mice were subjected to behavioural tests including object recognition, black and white box and openfield at the age of 12 months, after a single injection of either saline or insulin (1 U/kg). Object recognition memory of the mice has been evaluated using the recognition index of the object recognition test (A and B). Data expressed as a percentage of time spent exploring the novel object. Anxiety of the mice has been evaluated using the latency to escape from the dark chamber of the black and white box (C). Motor activity has been evaluated using the distance traveled by the mice during the openfield test (D). Human soluble APOE concentration, in TBS-soluble fraction of the parietotemporal cortex samples, was measured by western blot (E). Data are presented as mean ± SEM. An unpaired Student t-test was used when variances were equal and an unpaired Student t-test with Welch’s correction was used when variances were unequal. A non-parametric Mann-Whitney test was used when Gaussian distribution was not assumed and variances were unequal. *p < 0.05. No statistical difference was observed between the groups in C, D and E.

51

Fig. 3 : Response to insulin : APOE4 mice have an increased pAKT concentration in the cortex compared to APOE3 mice at 12 months of age. The mice were given an insulin or saline injection 5 minutes before sacrifice. pAKT/AKT (A), pGSK3β/GSK3β (B), pMAPK/MAPK (C), pJNK/JNK (D) concentration ratios, in TBS-soluble fraction of the parietotemporal cortex samples were measured by western blot. Each mouse injected with insulin is compared to the average of the mice injected with saline. Data are presented as mean ± SEM. To compare two groups, an unpaired Student t-test was used when variances were equal and an unpaired Student t-test with Welch’s correction was used when variances were unequal. One-sample t-tests with a hypothetical value of 1 were performed. *p < 0.05. No statistical difference was observed between the groups in B, C and D.

52

Fig. 4 : No effect of insulin on phosphatases concentration in the cortex of APOE3 and APOE4 mice at 12 months of age. The mice were given an insulin or saline injection 5 minutes before sacrifice. PP2Ac (A) and PP2B (B) concentrations, in TBS-soluble fraction of the parietotemporal cortex samples were measured by western blot. Data are presented as mean ± SEM. To compare two groups, data were compared using a Mann-Whitney unpaired t-test. No statistical difference was observed between the groups.

53

Fig. 5 : No effect of insulin on RAGE concentration in the cortex of APOE3 and APOE4 mice at 12 months of age. The mice were given an insulin or saline injection 5 minutes before sacrifice. RAGE (A) and LRP1 (B) concentrations, in membrane soluble fraction of the parietotemporal cortex samples were measured by western blot. The RAGE/LRP1 ratio is presented in (C). Data are presented as mean ± SEM. To compare two groups, an unpaired Student t-test was used when variances were equal and an unpaired Student t-test with Welch’s correction was used when variances were unequal. A non-parametric Mann-Whitney test was used when Gaussian distribution was not assumed and variances were unequal. To compare more than two groups separately, data were compared using one-way ANOVA followed by a Tukey-Kramer post-hoc analysis. No statistical difference was observed between the groups.

54

Fig. 6 : Insulin increases tau pSer202 concentration in the cortex of APOE4 mice compared to APOE3 mice at 12 months of age. The mice were given an insulin or saline injection 5 minutes before sacrifice. Tau pSer202 (A), tau pThr181 (B) and tau pSer396, pSer404 (C) concentrations, in TBS-soluble fraction of the parietotemporal cortex samples were measured by western blot. Each mouse injected with insulin is compared to the average of the mice injected with saline. Data are presented as mean ± SEM. To compare two groups, an unpaired Student t-test was used when variances were equal and an unpaired Student t-test with Welch’s correction was used when variances were unequal. One-sample t-tests with a hypothetical value of 1 were performed. *p < 0.05. No statistical difference was observed between the groups in B, C and D.

5 6 7 6

6 6

CP13AT270

PHF1

60

kDa

60

kDa

60

kDa

7 7 6 6

Actin 42

kDa

A B

C D

CP

13

in

su

lin/s

alin

e

(re

lative

OD

)

*

E3 E4 E3 E4

E3 E4 Insulin - + - +

E3 E4

AT

27

0 in

su

lin/s

alin

e

(re

lative

OD

)

PH

F1

in

su

lin/s

alin

e

(re

lative

OD

)

Actin

(re

lative

OD

)

0

1

0

1

2

0

1

2

0

2

4

Insulin - + - + Insulin - + - +

Insulin - + - +

55

Fig. 7 : No effect of insulin on protein concentrations in brain capillaries of APOE3 and APOE4 mice at 12 months of age. The mice were given an insulin or saline injection 5 minutes before sacrifice. Brain capillaries were isolated by capillary depletion technique. pAKT/AKT (A), pGSK3β/GSK3β (B), INSR/GAPDH (C), RAGE (D), LRP1 (E), RAGE/LRP1 (F) concentrations, in membrane soluble fraction of the brain capillaries samples were measured by western blot. Data are presented as mean ± SEM. For A and B, each mouse injected with insulin is compared to the average of the mice injected with saline. To compare two groups, data were compared using a Mann-Whitney unpaired t-test. One-sample t-tests with a hypothetical value of 1 were performed on A and B. No statistical difference was observed between the groups.

56

2.11) Supplementary material

Table 1 : Primary antibodies used in Western blot experiments.

57

Chapitre 3 : Matériel et méthodes : notes

supplémentaires

3.1) Modèle animal

Pour les expérimentations, nous avons eu recours à des souris transgéniques APOE3 et APOE4. La

création de ces souris résulte d’un remplacement de leur gène APOE murin par un allèle APOE humain

(soit ε3 ou ε4). Comme le gène est remplacé, on dit qu’elles sont knock-in (Sullivan et al. 1997). En effet,

les exons 2 à 4 codant pour l’APOE de souris sont substitués par leurs équivalents codant pour l’APOE

humain par recombinaison homologue, sans toutefois perturber les séquences de régulation (Figure 6). Les

animaux résultant de ces remplacements expriment l’ARN messager (ARNm) d’APOE humain dans des

niveaux et une distribution tissulaire identiques à ceux de l’ARNm d’APOE murin chez des souris wild-type.

La protéine APOE3 humaine est donc fonctionnelle chez ce modèle murin et est exprimée à des niveaux

physiologiques, permettant l’étude de la fonction de cet isoforme in vivo (Sullivan et al. 1997). Les souris

APOE4 ont également été générées en utilisant cette stratégie de remplacement génique ciblé.

Figure 6 : Stratégie de remplacement génique ciblé employée pour remplacer des séquences codantes d’APOE murin

par des séquences codant pour l’APOE3 humain (huE3). Recombinaison homologue entre le locus d’APOE murin

endogène (A) et la construction de ciblage (B) résultant en un gène chimérique (C) où la séquence codante du gène

APOE murin a été remplacée par la région codante d’APOE3 humain équivalente. Tiré et traduit de Sullivan et al. 1997.

58

Ces souris sont un modèle de choix pour notre étude puisqu’elles permettent d’étudier les effets

métaboliques et comportementaux de l’expression d’APOE3 et d’APOE4 humains in vivo. De plus, notre

laboratoire de recherche possédait une colonie déjà établie de ces souris. Au départ, le projet de recherche

incluait également des souris transgéniques APOE2. Toutefois, elles ont été exclues des analyses finales

en raison des nombreuses dysfonctions métaboliques qui les caractérisent. En effet, ces souris ont des

concentrations plasmatiques en acides gras nettement supérieures aux APOE3 et aux APOE4 ainsi qu'un

contenu en lipides du foie inférieur aux deux autres génotypes (Conway et al. 2014). Elles développent

aussi spontanément des plaques athéroscléreuses (Sullivan et al. 1998). Ces multiples anomalies, propres

aux APOE2, auraient pu occasionner certains biais au sein des données que nous avons recueillies, ce qui

justifie leur exclusion de la présente étude.

La proportion de mâles et de femelles était relativement égale dans notre étude, afin d’éviter les biais

pouvant être causés par des différences liées au sexe des animaux. Les souris provenaient initialement de

la compagnie Taconic (Hudson, NY, USA) et la reproduction a par la suite été assurée aux installations

animalières du Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l’Université Laval (CRCHUL) (Québec, QC,

CAN). La reproduction a été approuvée par le comité d’éthique de l’Université Laval. Toute la durée de leur

vie, les souris ont été nourries avec une diète commerciale (Teklad 2018 ; Harlan Laboratories,

Indianapolis, IN, USA). Le poids corporel et du tissu adipeux étaient plus bas chez les souris APOE4 que

chez les APOE3, tel que rapporté dans de précédentes études (Volcik et al. 2006 ; Pendse et al. 2009). Les

analyses comportementales et métaboliques ont débutées une semaine précédant le sacrifice des animaux

afin de minimiser l’anxiété générée par ces expérimentations et leur permettre de se reposer et de

s’adapter entre les différents tests. Les animaux étaient âgés de 12 mois au sacrifice.

3.2) Test de tolérance à l’insuline

Afin de vérifier si les souris APOE3 et APOE4 montrent une sensibilité différente à l’insuline, nous avons

mesuré ce paramètre métabolique au moyen d’un test de tolérance à l’insuline (ITT) (n=7 animaux/groupe).

Les souris ont été mises en jeûne six heures avant le test afin d’éviter tout changement métabolique en lien

avec la prise de nourriture et ont été épilées afin de bien exposer la veine saphène. Chacune des souris a

reçu une injection intrapéritonéale (IP) d’insuline humaine (Novolin) à une dose d’ 1U/kg de poids corporel.

Une goutte de sang a ensuite été prélevée à partir de la veine saphène avant l’injection puis 15, 30, 45, 60

et 90 minutes après celle-ci (Figure 7). La glycémie a été mesurée pour chaque goutte de sang à l’aide d’un

glucomètre (ONETOUCH UltraMini, LifeScan, CA, USA). La voie d’injection IP a été choisie pour des

59

raisons pratiques. Il est important de préciser que neuf souris APOE4 ont subi l’ITT et que deux d’entre

elles ont été identifiées comme résistantes à l’insuline puisque leur glycémie augmentait suivant l’injection

d’insuline. Elles furent exclues de l’analyse statistique étant considérées comme des données aberrantes.

Figure 7 : Schéma du test de tolérance à l’insuline (1 UI/kg de poids corporel).

3.3) Tests comportementaux

Différents tests de comportement ont été réalisés sur les souris APOE3 et APOE4 afin de vérifier les effets

d’une injection d’insuline sur la mémoire, l’anxiété et l’activité locomotrice de ces animaux (n = 6 à 13

animaux/groupe). Les tests de comportement ont été faits au courant de la semaine précédant le sacrifice

et un temps de repos approximatif de 24h a été alloué entre chacun d’eux. Un groupe a été injecté à

l’insuline et un autre au salin et ce, pour les deux génotypes APOE, afin de comparer l’effet de l’insuline au

contrôle que constitue le salin. Une injection d’insuline humaine (Novolin) à une dose d’1 UI/kg ou de salin a

été administrée par voie IP deux heures avant le début de chacun des tests. La période de deux heures

permet de réduire le stress causé par l’injection et de restaurer la glycémie initiale de l’animal. Les

protocoles du volet comportemental de la présente étude sont issus d’études précédentes réalisées sur les

souris 3xTg-AD, un modèle murin de la MA (Arsenault et al. 2011 ; Bories et al. 2012 ; St-Amour et al. 2014

; Vandal et al. 2014b). La voie d’injection IP a été choisie pour des raisons pratiques. Des deux souris

APOE4 résistantes à l’insuline lors de l’ITT, une seule était dans le groupe injecté à l’insuline et elle fut

exclue de l’analyse statistique, et ce pour la totalité des tests comportementaux effectués.

3.3.1) Test de reconnaissance d’objets

Le test de reconnaissance d’objets (RO) (Figure 8A) permet d’évaluer la mémoire d’apprentissage et de

reconnaissance de l’animal qui y est soumis (APOE3 salin n=7, APOE3 insuline n=6, APOE4 salin n=5,

APOE4 insuline n=5). Il se base sur la tendance spontanée qu’ont les rongeurs à interagir davantage avec

un nouvel objet qu’avec un objet qui leur est familier (Arsenault et al. 2011 ; Filali et al. 2012 ; St-Amour et

60

al. 2014). Le test de RO se fait en deux temps : en premier lieu, une phase de familiarisation ou pré-test

consiste à introduire la souris dans une cage standard (29,2 cm x 19 cm x 12,7 cm) en présence de deux

objets identiques et de noter le nombre et le temps d’observations des objets qu’elle fait pour une période

de cinq minutes. La souris est ensuite remise dans sa cage d’origine. En second lieu, une heure plus tard,

elle est réintroduite dans la cage de test en présence d’un objet auquel elle a déjà été exposée lors de la

phase de familiarisation et d’un nouvel objet pour une autre période de cinq minutes. Le nombre et le temps

d’observations des objets par l’animal sont notés dans le but d’établir son index de reconnaissance. Ce

dernier correspond au calcul suivant : Temps passé à explorer le nouvel objet/ (temps passé à explorer le

nouvel objet + temps passé à explorer l’objet familier) et est exprimé en pourcentage. Le temps passé à

explorer un objet correspond au temps pendant lequel la souris a senti ou porté attention à l’objet lorsqu’elle

était soumise au test. Les animaux qui avaient un index de reconnaissance inférieur à 30% ont été exclus

de l’analyse statistique puisque leur temps d’exploration des objets durant la phase de familiarisation a été

considéré insuffisant pour permettre la reconnaissance lors du test (1 APOE3 salin, 1 APOE4 salin et 1

APOE4 insuline ont été exclues pour cette raison).

3.3.2) Test de la boîte à deux compartiments

Le test de la boîte à deux compartiments (Figure 8B) est utilisé, entre autres, afin d’évaluer le

comportement anxieux de l’animal (Latapy et al. 2012 ; St-Amour et al. 2014) (APOE3 salin n= 6, APOE3

insuline n=6, APOE4 salin n=6, APOE4 insuline n=6). Ce test repose sur le fait que la souris est un animal

nocturne. Puisqu’elle vit la nuit et dort le jour, l’exposition à la lumière entraîne chez elle davantage

d’anxiété que l’obscurité. La boîte à deux compartiments est composée de deux chambres, une plongée

dans l’obscurité, l’autre exposée à la lumière ambiante, qui sont reliées entre elles par une petite ouverture

permettant à la souris de traverser librement d’un côté vers l’autre. Le test, d’une durée de cinq minutes,

consiste à déposer l’animal au centre du compartiment sombre et à noter le temps qu’il met pour en sortir

complètement et entrer dans le compartiment éclairé. Ce temps correspond à la latence de sortie de

l’animal. Une souris anxieuse aura donc tendance à demeurer plus longtemps dans le compartiment obscur

de la boîte qu’une souris qui a un niveau d’anxiété plus faible. Les souris qui sont restées dans le

compartiment sombre, sans le quitter durant les cinq minutes du test, ont été considérées comme des

données aberrantes et furent exclues de l’analyse statistique (1 APOE3 salin et 1 APOE3 insuline ont été

exclues pour cette raison).

61

3.3.3) Test d’activité en champ libre

Le test d’activité en champ libre (Figure 8C) permet d’évaluer l’activité locomotrice de l’animal (St-Amour et

al. 2014) (APOE3 salin n= 7, APOE3 insuline n=7, APOE4 salin n=6, APOE4 insuline n=6). Le dispositif

permettant d’effectuer ce test est composé de 10 cages de plexiglas aux parois translucides (80 cm × 80

cm) reliées à un système informatisé (San Diego Instruments). Chaque souris est introduite au centre d’une

cage différente et ses mouvements et déplacements sont captés puis enregistrés sur une période d’une

heure afin de calculer différents paramètres automatiquement, dont la distance parcourue par l’animal

durant ce temps. Une longue distance se traduit par de bonnes capacités locomotrices chez l’animal, tandis

qu’une distance plus faible est généralement associée à une capacité de déplacement limitée.

Figure 8 : Schémas des tests comportementaux : reconnaissance d’objets (A), boîte à deux compartiments (B) et

activité en champ libre (C).

3.4) Sacrifice des animaux

Six heures précédant leur sacrifice, les souris ont été mises en jeûne afin d’éviter tout changement

métabolique en lien avec la prise de nourriture. Un groupe a été injecté à l’insuline et un autre au salin et

ce, pour les deux génotypes APOE, afin de comparer l’effet de l’insuline au contrôle que constitue le salin.

Une injection d’insuline humaine (Novolin) à une dose de 3,8 UI/kg ou de salin a été administrée par voie

intraveineuse (IV) dans la queue de l’animal, cinq minutes avant son sacrifice par perfusion intracardiaque.

La voie d’injection IV a été choisie pour que l’insuline se rende rapidement au cerveau. Puisque le délai

entre l’injection et le sacrifice de l’animal est relativement court, le fait d’injecter l’insuline directement dans

la circulation sanguine permet d’activer les voies de signalisation de l’hormone avant la mort de la souris

A B C

62

(White et al. 2010 ; Vandal et al. 2014b). La dose d’insuline injectée est aussi plus importante que lors des

tests comportementaux. Étant donné qu’une telle dose est potentiellement létale ou du moins suffisante

pour porter atteinte à la santé de l’animal, une dose moindre devait être injectée avant les tests de

comportement. La dose injectée avant le sacrifice est reconnue pour activer fortement la signalisation de

l’insuline dans le muscle (White et al. 2010). Le sacrifice des animaux s’est fait par perfusion intracardiaque

sous anesthésie d’un mélange de kétamine et de xylazine. Un volume de 40 mL de tampon phosphate salin

(PBS) à une concentration de 0,1 molaire (M), avec ajouts d’inhibiteurs de protéases et de phosphatases

(sodium fluoride et sodium pyrophosphate), conservé sur glace a été employé pour la perfusion. Le cerveau

a ensuite été prélevé : un hémisphère cérébral a été disséqué puis congelé à -80C jusqu’à l’extraction

protéique puis l’autre (n = 3 à 4 animaux/groupe) a été conservé dans du PBS 0,1M froid et rapidement

homogénéisé pour l’extraction des capillaires. Le muscle gastrocnémien a également été prélevé, réduit en

poudre puis congelé à -80C jusqu’à l’extraction des protéines et le tissu adipeux gonadal a été pesé. Les

expérimentations impliquant des animaux ont été approuvées par le comité d’éthique de l’Université Laval.

Le nombre d’animaux par groupe est spécifié dans les graphiques de l’article (voir section 2.10).

3.5) Technique de déplétion capillaire

La technique de déplétion capillaire permet d’isoler les capillaires cérébraux des animaux à partir d’un

homogénat de cerveau (un hémisphère cérébral dans notre cas). La technique consiste à séparer les

cellules endothéliales des autres cellules présentes au moyen d’une série de centrifugations successives

reposant sur le principe de gradient de densité (Do et al. 2012 ; Alata et al. 2014a). Le cervelet, les

méninges, le tronc cérébral et les larges vaisseaux sanguins en superficie ont été retirés de l’hémisphère

cérébral recueilli suite à la perfusion des animaux. Le cortex résultant a été délicatement homogénéisé

dans du milieu minimum essentiel de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) contenant 10% de sérum bovin

foetal (FBS). L’homogénat a ensuite été centrifugé une première fois à 4°C, à une vitesse de 500g pendant

10 minutes. Suite à cette étape, le surnageant fut éliminé. Le culot résultant a été homogénéisé dans 5 mL

de DMEM contenant 25% d’albumine de sérum bovin (BSA) puis centrifugé à 1500g pendant 20 minutes

toujours à 4°C. Une fois le surnageant retiré, une autre homogénéisation avec du DMEM contenant cette

fois 10% de FBS fut effectuée, suivie d’une filtration à travers un filtre en nylon aux pores de 60

micromètres (μm) de diamètre, ayant pour but d’éliminer les vaisseaux plus larges. Le filtrat a subi une

centrifugation à 12 000g pendant 45 minutes à 4°C. Le DMEM est un milieu fréquemment utilisé en culture

cellulaire afin de conserver les cellules en bon état. Les différentes concentrations de FBS et de BSA qui y

63

sont ajoutées permettent d’augmenter le poids des cellules endothéliales afin de bien les séparer des

autres constituants lors des étapes de centrifugation. Le culot final contenant les capillaires cérébraux a

subi un lavage au PBS froid et a été centrifugé une dernière fois à 12 000g pendant 20 minutes à 4°C.

Après avoir éliminé le surnageant, le culot est entreposé à -80°C jusqu’à l’extraction protéique.

3.6) Technique d’extraction protéique

Les protéines des tissus animaux recueillis suite au sacrifice des souris ont été extraites pour générer

différentes fractions protéiques. Le cortex pariéto-temporal, disséqué à partir d’un hémisphère cérébral, a

d’abord été homogénéisé dans huit fois son volume de tampon Tris salin (0,05 mol/L Tris-Base, 0,138mol/L

NaCl, 2,7 mol/L KCl) afin de produire une fraction protéique soluble ou cytosolique, puis dans un tampon

Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) (150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L Tris-Cl, 0,5% déoxycholate de

sodium, 0,5% dodécyl sulfate de sodium, 1% Triton X-100) pour la fraction protéique soluble membranaire.

Les muscles gastrocnémiens préalablement réduits en poudre ainsi que les capillaires cérébraux obtenus

suite à la technique de déplétion capillaire ont été homogénéisés dans un tampon RIPA seulement. Ces

tampons contiennent un mélange d’inhibiteurs de protéases (CompleteTM, Roche Diagnostics, Indianapolis,

IN, USA) et de phosphatases (Phostop (Roche Diagnostics), orthovanadate de sodium et fluoride de

sodium). L’ensemble des échantillons a été soumis à une série de sonications et de centrifugations

séquentielles (100 000g, 20 minutes, 4°C). Une fraction insoluble a également été générée en faisant

l’ajout d’acide formique au sédiment de centrifugation (Lebbadi et al. 2011). Les fractions obtenues suite à

l’extraction protéique peuvent ensuite être dosées par la méthode de l'acide bicinchoninique (BCA) (Pierce,

Rockford, IL, USA) puis être entreposées à −80°C jusqu’aux analyses en immunobuvardage de type

Western.

3.7) Immunobuvardage de type Western

Afin de détecter et d’identifier des protéines spécifiques à partir des échantillons de cortex, de muscles et

de capillaires cérébraux, nous avons eu recours à la technique d’immunobuvardage de type Western,

mieux connue sous le nom de Western Blot. Dans un premier temps, celle-ci consiste en une

électrophorèse sur gel de polyacrylamide-sulfate dodécyl de sodium afin de séparer les protéines en

fonction de leur poids moléculaire. Les protéines sont préalablement dénaturées à haute température en

présence de laemmli. Dans un deuxième temps, un transfert sur une membrane de difluorure de

polyvinylidène (PVDF) (Immobilon, Millipore, MA, USA) est ensuite effectué. La membrane est ensuite

64

bloquée avec un mélange de lait et de BSA avant d’être exposée à un anticorps ciblant la protéine d’intérêt.

Un anticorps secondaire contenant l’enzyme peroxydase de raifort (HRP) sera ensuite utilisé, suivi d’une

exposition à un réactif chimioluminescent qui, en se liant à la HRP, s’activera pour permettre la détection

des protéines. L’intensité des bandes obtenues est évaluée en termes de densité optique, par densitométrie

à l’aide d’un KODAK Image Station 4000MM Digital Imaging System (Molecular Imaging Software version

4.0.5f7, KODAK, New Haven, CT). La souris qui se trouve dans le groupe injecté à l’insuline et qui était

résistante à l’hormone lors de l’ITT, fut exclue de l’analyse statistique, et ce pour la totalité des

expérimentations post-mortem effectuées.

3.8) Analyses statistiques

L’égalité des variances entre les groupes a été déterminée avec le test de Bartlett. Lorsque plus de deux

groupes étaient comparés, des analyses de type ANOVA à un ou à deux facteurs étaient employées. Si les

variances étaient égales et qu’un ANOVA à un facteur était employé, le test était suivi d’un test post-hoc de

Tukey-Kramer. Lorsque deux groupes étaient comparés, un test non-pairé de Student était utilisé et était

accompagné d’une correction de Welch dans le cas où les variances étaient inégales. Si la normalité de la

distribution n’était pas respectée et que les variances étaient inégales, c’est plutôt un test non-paramétrique

de Mann-Whitney qui était utilisé. Pour comparer chaque souris injectée à l’insuline à la moyenne des

souris injectées au salin pour un paramètre quelconque, un test de t à un échantillon (one-sample t test) a

été utilisé en fixant 1 comme valeur hypothétique pour la moyenne salin. La significativité statistique a été

fixée à P < 0,05. Les analyses statistiques ont été réalisées avec les logiciels Graph Pad Prism version 6

(GraphPad software, San Diego, CA, USA) et JMP (version 10.0.0; SAS Institute Inc., Cary, IL).

65

Chapitre 4 : Discussion

4.1) Retour sur les résultats

De multiples associations qui pourraient potentiellement expliquer l’implication d’APOE4 dans la MA ont été

établies par le passé chez l’animal et l’humain. De plus, l’administration d’insuline possède des bénéfices

thérapeutiques chez les patients atteints de la MA, ce qui n’est toutefois pas le cas chez ceux qui sont de

génotype APOE4. Les résultats obtenus suite à notre étude, présentés au Chapitre 2, ont permis de déceler

une altération de la réponse cérébrale à l’insuline dans le cerveau des souris transgéniques ayant subi un

remplacement du gène APOE murin par un allèle APOE4 humain. Cette altération se traduit par une

activation augmentée de la voie de signalisation PI3K/AKT chez les souris APOE4 en comparaison aux

souris APOE3.

Dans le cadre de cette étude, j’ai réalisé les ITT, les tests de comportement, le sacrifice des animaux ainsi

que les expérimentations post-mortem (extraction protéique, technique de déplétion capillaire et

immunobuvardages de type Western). J’ai également fait l’analyse statistique des résultats obtenus et

rédigé les premières versions de l’article Altered cerebral insulin response in transgenic mice expressing

the epsilon-4 allele of human apolipoprotein E gene, présenté au Chapitre 2.

4.1.1) Effet de l’insuline sur le comportement

L’insuline étant impliquée dans l’amélioration de la mémoire de reconnaissance, la formation et le

remodelage des synapses (Chiu et al. 2008 ; Marks et al. 2009 ; Nisticò et al. 2012 ; Vandal et al. 2014b),

nous avons vérifié l’effet d’une injection d’insuline sur l’anxiété, l’activité locomotrice ainsi que les capacités

mnésiques des souris APOE3 et APOE4. Nous n’avons détecté aucun effet de l’insuline sur les paramètres

comportementaux étudiés. Ces résultats ne vont pas dans le même sens que les conclusions tirées d’une

étude précédente, réalisée par notre équipe de recherche (Vandal et al. 2014b). Toutefois, il est difficile de

comparer les deux études puisque cette dernière a été réalisée avec un modèle animal différent, les souris

3xTg-AD, ce qui peut expliquer la différence de résultats. De plus, dans l’étude de Vandal et al., les

animaux parmi lesquels un effet de l’insuline a été détecté sur la mémoire, étaient nourris avec une diète

riche en gras, tandis que ceux de la présente étude étaient sur diète contrôle. Nos résultats indiquent

toutefois que l’index de reconnaissance des souris APOE4 est approximativement 15% moindre que celui

des APOE3 lorsque l’on regroupe les souris injectées au salin et à l’insuline, ce qui suggère l’existence

66

d’une altération dans la mémoire de reconnaissance chez les souris APOE4. Ce résultat confirme les

dysfonctions mnésiques rapportées dans la littérature chez les souris APOE4 (Raber et al. 1998 ; Bour et

al. 2008 ; Siegel et al. 2012) de même que chez les humains de ce génotype (Baxter et al. 2003 ; Scarmeas

et al. 2005 ; Greenwood et al. 2005b ; Caselli et al. 2009 ; Liu et al. 2010).

Concernant les concentrations corticales d’apoE humaine, aucune différence n’a été observée entre les

souris APOE3 et APOE4 dans la fraction protéique soluble. Ce résultat ne concorde pas avec une étude

précédemment réalisée par notre équipe de recherche, qui montrait une baisse d’apoE humaine chez les

souris APOE4 pour cette fraction (Vandal et al. 2014a). Afin d’expliquer cette différence, il est plausible

d’évoquer la variabilité des résultats d’une étude à l’autre. En effet, bien que les résultats de la présente

étude soient différents de ceux obtenus par Vandal et al., ils vont dans le même sens que ceux d’études

menées par d’autres groupes de recherche (Sullivan et al. 2011; Youmans et al. 2012).

4.1.2) Réponse à l’insuline

4.1.2.1) En périphérie

Dans un premier temps, l’ITT effectué chez les animaux a révélé que le génotype APOE des souris n’a pas

d’influence sur la sensibilité à l’insuline en périphérie. En effet, les deux génotypes APOE ont montré des

réponses similaires à l’insuline au niveau périphérique. Dans un deuxième temps, nous avons la certitude

que l’injection d’insuline précédant le sacrifice a été administrée avec succès, puisque la dose injectée

stimule efficacement la signalisation (White et al. 2010) et que des augmentations de la phosphorylation de

la protéine kinase B (AKT) à la sérine 473 et de la glycogène synthase kinase 3-bêta (GSK3β) à la sérine 9

ont été observées dans le muscle gastrocnémien des souris APOE3 et APOE4, comparativement aux

groupes injectés au salin.

4.1.2.2) Au cerveau

Suivant l’injection d’insuline, nous avons étudié la signalisation de cette hormone au cerveau via différentes

voies. La voie PI3K/AKT est amorcée par le recrutement, puis l’activation de la phosphatidylinositol 3-

kinase (PI3K), qui elle entraîne l’activation d’AKT (Whiteman et al. 2002). Cette dernière phosphoryle

GSK3β à la sérine 9, menant à son inhibition (Cross et al. 1995). En étudiant la voie PI3K/AKT, nous avons

trouvé que le ratio pAKT/AKT (pSer473) dans le cortex pariéto-temporal des souris APOE4 était

approximativement 2,6 fois plus élevé que celui des APOE3, lorsque normalisé avec les valeurs des

67

animaux injectés au salin. Cette différence n’a pas été observée avec les protéines d’autres voies de

signalisation, en aval d’AKT, qui étaient à l’étude : GSK3β (pSer9), protéine kinase activée par mitogène

(MAPK) (pThr202, pTyr204, pThr185, pTyr187) et protéine kinase c-Jun N-terminal (JNK) (pThr183,

pTyr185). De plus, l’insuline a augmenté le ratio cortical pAKT/AKT (pSer473) de 60% chez les souris

APOE4, lorsque les données ont été normalisées à celles des souris injectées au salin. Toutefois, puisque

le rapport pAKT/AKT des animaux contrôles, injectés au salin, est défavorable pour les souris APOE4, il est

important de mentionner la possibilité que cette augmentation du rapport, observée suite à l’injection

d’insuline, soit due à ce déséquilibre initial. Nous avons aussi observé que l’insuline a diminué de 52% le

ratio pJNK/JNK (pThr183, pTyr185) dans le cortex des souris APOE3, lorsque les données ont été

normalisées à celles des souris injectées au salin. Ce résultat suggère que la cascade des JNKs/c-Jun est

inhibée spécifiquement chez les porteurs d’APOE3 suite à l’injection d’insuline.

Nous avons également vérifié les concentrations corticales de deux phosphatases impliquées dans le

processus de déphosphorylation de la protéine tau : la sous-unité catalytique de la protéine phosphatase

2A (PP2Ac) et la protéine phosphatase 2B (PP2B). Aucun effet de l’insuline sur la concentration de ces

protéines n’a été détecté. Bref, l’ensemble de ces résultats montre que la réponse cérébrale à l’insuline

diffère entre les souris APOE3 et APOE4 et que la cascade cellulaire d’AKT est davantage activée dans le

cortex des souris APOE4 que dans celui des APOE3.

Au niveau des cellules endothéliales des capillaires cérébraux, aucune différence dans les voies de

signalisation de l’insuline étudiées, soit PI3K/AKT et GSK3β, n’a été rapportée. Nous avons également

vérifié la concentration de récepteurs à l’insuline dans ces cellules et aucun effet n’a été détecté suite à

l’injection de l’hormone. Ces résultats suggèrent donc qu’il n’y a pas de différence dans la signalisation de

l’insuline au niveau des cellules endothéliales entre les souris APOE3 et APOE4.

4.1.3) Effet de l’insuline sur la phosphorylation de la protéine tau

Puisqu’une accumulation accrue de tau hyperphosphorylé a été rapportée dans les neurones

hippocampiques de souris APOE4 dans une étude précédente (Liraz et al. 2013) et que la pathologie tau

semble impliquée dans l’augmentation de la part de risque associée au génotype APOE dans la MA chez

les femmes (Altmann et al. 2014), nous avons évalué la concentration de tau phosphorylé à différents sites

dans le cortex des souris APOE3 et APOE4. Une augmentation de la phosphorylation de tau à la sérine

68

202, d’approximativement 44% par rapport aux souris APOE3, a été détectée chez les souris APOE4. Les

résultats étaient similaires pour les autres sites de phosphorylation de tau (pSer396, pSer404 et pThr181),

sans toutefois atteindre la significativité. Ce résultat est en accord avec des études précédentes montrant

une phosphorylation augmentée de la protéine tau à la sérine 202 suivant l’administration d’insuline (Freude

et al. 2005) ou de pioglitazone, un sensibilisateur à l’insuline employé dans le traitement du DT2, chez les

souris APOE4 (To et al. 2011). L’augmentation de la réponse cérébrale à l’insuline chez les souris APOE4

pourrait donc être associée avec l’hyperphosphorylation de tau, un marqueur neuropathologique de la MA.

4.1.4) Effet de l’insuline sur les concentrations de RAGE et LRP1

Comme le génotype APOE4 a précédemment été associé avec une accumulation d’Aβ au cerveau

(Drzezga et al. 2009) ainsi qu’avec une clairance déficiente de ce peptide (Deane et al. 2008 ; Castellano et

al. 2011), nous avons voulu vérifier l’effet de l’insuline sur la clairance d’Aβ en évaluant les concentrations

corticales de RAGE et de LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein 1), protéines impliquées

respectivement dans l’influx et l’efflux d’Aβ au cerveau (Deane et al. 2003 ; Zlokovic et al. 2010 ; Deane et

al. 2012), chez les souris APOE3 et APOE4. Aucun effet de l’insuline, ni du génotype APOE sur ces

protéines n’a été observé dans le cortex des souris. Nos résultats suggèrent donc que l’insuline et le

génotype APOE n’ont pas d’effet sur le transport d’Aβ au niveau du cortex des souris APOE3 et APOE4.

Nous avons aussi vérifié l’effet de l’insuline sur les concentrations de RAGE et de LRP1 au niveau des

cellules endothéliales qui tapissent les capillaires cérébraux de la BHE à partir d’un hémisphère cérébral.

Puisque le cortex regroupe plusieurs types cellulaires différents, la concentration des capillaires nous

permet d’étudier ces protéines spécifiquement au niveau des cellules endothéliales. Nous avons observé

que l’insuline a réduit la concentration de RAGE chez les souris APOE3 et APOE4, ce qui suggère que

cette hormone pourrait intervenir dans la réduction du transport d’Aβ au cerveau et, par conséquent

influencer son accumulation cérébrale à la baisse. Ce résultat doit toutefois être confirmé puisqu’il y avait

une importante variation entre les différents échantillons et que nous disposions de peu d’animaux dans

chacun des groupes. Dans cette optique, il serait intéressant d’étudier l’effet de l’insuline sur les

transporteurs d’Aβ au niveau des capillaires cérébraux des souris APOE3 et APOE4 à plus grande échelle.

69

4.2) Interprétation des résultats

De précédentes études cliniques montrent l’influence du génotype APOE sur l’efficacité de certains

traitements dans la MA (Farlow et al. 1996 ; Sparks et al. 2006 ; Choi et al. 2008 ; Kennelly et al. 2012 ;

Loeffler 2013 ; Relkin 2013 ; Wang et al. 2014). En effet, les immunoglobulines intraveineuses (IgIV)

(Loeffler 2013 ; Relkin 2013), des inhibiteurs de la cholinestérase comme le donépézil (Choi et al. 2008)

ainsi que des hypocholestérolémiants comme l’atorvastatine (Sparks et al. 2006), sont des exemples

d’interventions dont la valeur thérapeutique varie en fonction du génotype APOE. L’administration d’insuline

par voie intranasale ne fait pas exception puisque les patients APOE4, contrairement aux non-porteurs, ne

retirent pas de bénéfices de cette approche (Reger et al. 2006 ; Reger et al. 2008 ; Claxton et al. 2013).

L’absence d’amélioration cognitive chez les porteurs d’APOE4 suite à ce traitement suggère un état de

résistance à l’insuline chez ces patients (Elosua et al. 2003 ; Claxton et al. 2013). Toutefois, les résultats

obtenus dans le cadre de notre étude proposent plutôt une augmentation de la réponse cérébrale à

l’insuline chez les souris de génotype APOE4 comparativement à celle de génotype APOE3, du moins en

ce qui a trait à la voie PI3K/AKT. Cette réponse amplifiée suite à l’injection d’insuline chez les souris

APOE4 était accompagnée d’une augmentation de la phosphorylation de tau à la sérine 202, suggérant que

l’activation de la signalisation de l’insuline mène à la phosphorylation de tau chez les souris APOE4.

4.2.1) Augmentation de la réponse cérébrale à l’insuline chez les

souris APOE4

À notre connaissance, la résistance cérébrale à l’insuline n’a jamais été étudiée chez les souris APOE

auparavant. Nos résultats ne reflètent pas entièrement l’association entre la MA et la résistance à l’insuline

qui a été établie précédemment chez les souris (Kohjima et al. 2010 ; Mody et al. 2011) et chez l’humain

(Kuusisto et al. 1997 ; Steen et al. 2005). En effet, en étudiant la voie PI3K/AKT, nous avons détecté une

réponse cellulaire à l’insuline augmentée dans le cerveau des souris APOE4 suivant l’injection d’insuline.

Bien que nous avions émis comme hypothèse l’existence d’une différence entre la réponse cérébrale à

l’insuline chez les souris APOE3 et APOE4, nous nous attendions davantage à une insulinorésistance ou à

une réponse diminuée chez les souris APOE4, étant donné que ce génotype constitue le principal facteur

de risque génétique de la forme sporadique de la MA. Notre étude ne permet pas d’élucider les

mécanismes impliqués dans cette altération de la réponse cérébrale à l’insuline, mais suggère que la

70

résistance à l’insuline n’est pas impliquée dans l’insuccès du traitement à l’insuline chez les patients

APOE4 atteints de la MA.

4.2.2) L’augmentation de la phosphorylation de tau chez les

souris APOE4 pourrait contribuer à la progression d’une

pathologie s’apparentant à la MA

En étudiant l’effet du génotype APOE sur les marqueurs neuropathologiques de la MA, nous avons détecté

un effet plus prononcé de l’injection d’insuline sur la phosphorylation de la protéine tau chez les souris

APOE4 que chez les APOE3. En effet, la concentration de tau phosphorylé à la sérine 202 suite à l’injection

d’insuline était plus élevée dans le cortex des souris APOE4 que dans celui des APOE3. Puisque

l’hyperphosphorylation de cette protéine dans le cortex est fortement associée à l’expression clinique de la

MA (Arriagada et al. 1992 ; Tremblay et al. 2007), cette phosphorylation plus importante de tau pourrait

potentiellement promouvoir le développement d’une pathologie s’apparentant aux dégénérescences

neurofibrillaires présentes dans la MA chez les souris APOE4.

4.2.3) L’altération de la réponse cérébrale à l’insuline pourrait

contribuer à augmenter la phosphorylation de tau chez les souris

APOE4

La suractivation de la voie AKT suivant l’injection d’insuline chez les souris APOE4 comparativement aux

APOE3 pourrait être impliquée dans l’hyperphosphorylation de la protéine tau via différents mécanismes.

Des travaux antérieurs ont montré que la forme activée d’AKT, en plus d’activer la voie de signalisation

GSK3β (Cross et al. 1995), était en mesure de phosphoryler la protéine tau à différents sites, dont la

thréonine 212 et la sérine 214 (Ksiezak-Reding et al. 2003 ; Kyoung Pyo et al. 2004). Le traitement à

l’insuline a été précédemment associé à un métabolisme du glucose et à une température corporelle plus

faibles et ces deux paramètres corrèlent avec la phosphorylation de tau chez les souris (Planel et al. 2004).

À faible température, GSK3β tend à être inhibé en raison d’une augmentation de sa phosphorylation à la

sérine 9, mais aucun changement dans l’activation des voies JNK et MAPK n’a été détecté dans cette

étude (Planel et al. 2004). L’activation, suivant l’injection d’insuline, des kinases de la voie PI3K/AKT ciblant

la protéine tau joue donc un rôle modéré dans la phosphorylation de tau comparativement à l’inhibition des

phosphatases durant l’hypothermie (Planel et al. 2004). De plus, GSK3β est en mesure de réguler la

phosphorylation de tau (Takashima et al. 1996), notamment en phosphorylant la sérine 202 de la protéine

(Mandelkow et al. 1992 ; Ishiguro et al. 1995 ; Illenberger et al. 1998 ; Reynolds et al. 2000). Nos résultats

71

montrent une activation de la voie PI3K/AKT et une phosphorylation de tau, suivant l’injection d’insuline,

plus importantes chez les souris APOE4 que chez les APOE3, ce qui est en accord avec l’implication des

voies de signalisation de l’insuline dans la phosphorylation de tau rapportée dans la littérature, en particulier

chez les souris APOE4. Des altérations dans la signalisation de l’insuline pourraient activer fortement la

voie PI3K/AKT, menant à une augmentation de la phosphorylation de tau dans le cortex des souris APOE4

(Figure 9). Si tel est le cas, administrer un traitement d’insuline à des patients atteints de la MA de génotype

APOE4 n’est probablement pas recommandé et cette piste de recherche mérite d’être approfondie avant

d’entreprendre d’éventuelles études cliniques.

Figure 9 : Conséquences d’une signalisation cérébrale altérée de l’insuline chez les souris APOE4 (suite à une injection

d’insuline). (PI3K = Phosphatidylinositol 3-kinase, AKT = Protéine kinase B, Ser = Sérine)

4.3) Limitations et perspectives

Notre étude comporte certaines limitations. D’abord, nous disposions d’un faible nombre d’animaux par

groupe, particulièrement en ce qui a trait aux expérimentations de déplétion capillaire. Ensuite, les doses

d’insuline utilisées ont été testées chez un autre modèle animal, en l’occurrence les souris 3xTg-AD. De ce

fait, les doses ne sont pas nécessairement optimales pour les souris APOE utilisées dans notre étude.

Enfin, le modèle animal choisi possède également ses propres limites. Bien que les souris APOE nous

permettent d’étudier les effets des différents isoformes de l’APOE humain in vivo, sans aucune co-

expression d’APOE murin, trois importantes limitations sont associées à leur utilisation dans un cadre

72

expérimental (Sullivan et al. 1997). Premièrement, le nombre de copies du transgène peut varier

considérablement entre des animaux de même génotype. Deuxièmement, il existe des différences

marquées au niveau de l’expression des transgènes à différents emplacements chromosomiques.

Troisièmement, la présence de protéines murines endogènes complexifie l’interprétation des résultats. En

raison de ces sources de variabilité, intrinsèques aux animaux transgéniques, les comparaisons entre les

différents isoformes d’APOE sont plus risquées (Sullivan et al. 1997). De ce fait, nos résultats ne sont pas

nécessairement applicables à l’humain.

Pour une éventuelle suite du projet, il serait souhaitable d’augmenter le nombre d’animaux par groupe,

surtout pour la technique de déplétion capillaire. De plus, afin de déterminer la dose optimale d’insuline à

injecter aux souris APOE, il serait de mise de faire une étude à dose croissante d’insuline. Un protocole

d’injections multiples pourrait également être envisagé. Il serait aussi intéressant de comparer le transport

de l’insuline au cerveau en fonction du génotype APOE de ces souris par la technique de perfusion

cérébrale in situ (PCIS) et de mesurer le taux d’insuline plasmatique des animaux en complément.

Afin de confirmer les résultats obtenus en ce qui concerne une réponse à l’insuline augmentée chez les

souris APOE4 comparativement aux APOE3, il serait important d’étudier la voie PI3K/AKT en profondeur en

évaluant la concentration d’autres protéines qui y sont reliées. D’autres voies impliquées dans la

signalisation de l’insuline, comme celles de la pyruvate déshydrogénase kinase (PDK) (Chen et al. 2001) et

de la cible mammalienne de la rapamycine (mTor) (Lee et al. 2008) mériteraient également d’être survolées

afin de mieux comprendre la signalisation de cette hormone chez les souris APOE. Puisque nous avons

étudié les transporteurs d’Aβ, c’est-à-dire RAGE et LRP1, il serait intéressant de compléter en dosant Aβ

dans le cerveau des animaux par la méthode immuno-enzymatique enzyme-linked immunosorbent assay

(ELISA). Également, il serait utile de vérifier la concentration de marqueurs de la clairance d’Aβ, tels que

l’enzyme de dégradation de l’insuline (IDE) et la néprilysine (NEP).

Les expérimentations de notre étude pourraient également être réalisées chez d’autres modèles murins.

Par exemple, les souris exprimant différents isoformes d’APOE dans les neurones ou les astrocytes (Jain et

al. 2013) se prêteraient bien aux expériences précédemment énoncées. Il serait aussi pertinent d’étudier

les mêmes paramètres chez les souris montrant une expression neuronale des fragments neurotoxiques

d’APOE4 (Harris et al. 2003), afin de les comparer aux résultats obtenus avec les souris possédant un

73

allèle APOE4 humain. Une autre avenue serait de répéter l’étude chez des souris transgéniques pour

d’autres gènes que l’APOE, comme les souris APP/PS1 ou 3xTg-AD, modèles murins de la MA.

Les possibilités d’expérimentations sont infinies et certaines d’entre elles pourraient constituer

d’intéressants compléments à nos méthodes. Par exemple, l’électrophysiologie nous permettrait de vérifier

l’intégrité des fonctions synaptiques des animaux et des techniques d’imagerie cérébrale, comme l’imagerie

par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf), nous permettraient de comparer l’activité cérébrale des

souris en fonction de la nature de l’injection qu’elles reçoivent et de leur génotype APOE notamment. En

alternative à l’insuline, il serait intriguant d’utiliser des agonistes ou différentes formulations de cette

hormone comme l’insuline détémir, afin de comparer la réponse cérébrale des souris en fonction du produit

qui leur est administré. De plus, en se basant sur les résultats que nous avons obtenus in vivo, il pourrait

être intéressant d’entreprendre des études avec des systèmes de cultures cellulaires in vitro, afin d’étoffer

nos connaissances sur les effets APOE-dépendants de l’insuline.

4.4) Conclusion

L’insuline est suggérée avoir un potentiel comme outil thérapeutique dans la MA. Plusieurs études cliniques

se sont penchées sur l’effet de l’administration intranasale de cette hormone sur la cognition en fonction du

génotype APOE (Reger et al. 2006 ; Reger et al. 2008 ; Claxton et al. 2013). Les données montrent dans

leur ensemble que les porteurs d’APOE4 ne bénéficient pas d’un traitement à l’insuline, ce qui nécessite

l’identification des mécanismes impliqués (Claxton et al. 2013). Comme le génotype APOE4 est

prédominant dans la MA relativement à la population générale (Farrer et al. 1997), il est impératif de trouver

pourquoi l’insuline n’améliore pas la condition de ces patients.

Les données de notre étude montrent que la voie de signalisation PI3K/AKT répond plus fortement à

l’insuline chez les souris APOE4, se traduisant en une rapide augmentation de la phosphorylation de tau à

la sérine 202 après une seule injection de cette hormone. À première vue, cette réponse amplifiée à

l’insuline ne correspond pas entièrement à ce que rapporte la littérature, qui suggère que la résistance

cérébrale à l’insuline est augmentée dans la MA (Kuusisto et al. 1997 ; Steen et al. 2005 ; Kohjima et al.

2010 ; Mody et al. 2011). Nos données suggèrent plutôt que l’absence d’effet ou les effets délétères de

l’insuline chez les patients APOE4 atteints de la MA seraient dus à des mécanismes en aval, comme la

phosphorylation de la protéine tau. Ces résultats, conjointement avec ceux des précédentes études

cliniques, rendent compte de l’importance de prendre le génotype APOE en considération lors de

74

traitements ciblant la signalisation de l’insuline au cerveau. Dans l’optique où nos résultats sont applicables

à l’humain, ils mettent en lumière un mécanisme possible expliquant pourquoi les patients Alzheimer

porteurs d’APOE4 ne retirent pas de bénéfices d’un traitement intranasal à l’insuline.

75

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Annexe 1 : Projets parallèles

En cours de maîtrise, j’ai eu l’opportunité de contribuer à deux projets parallèles. Puisqu’ils ont enrichi mon

cheminement en recherche, voici une brève description de mon apport à ceux-ci.

Le premier projet auquel j’ai collaboré porte sur l’intégrité de la BHE chez deux modèles de souris

transgéniques de la MA : les souris 3xTg-AD et APP/PS1. Pour ce projet, j’ai perfusé les souris 3xTg-AD,

puis réalisé la technique de déplétion capillaire pour isoler les capillaires cérébraux des animaux. J’ai

ensuite procédé à quelques immunobuvardages de type Western à partir des échantillons de capillaires

cérébraux recueillis. Cette étude a fait l’objet d’une publication dans le journal Neuropharmacology (Do &

Alata 2014) et je possède le titre de quatrième auteure.

Le second projet auquel j’ai contribué consiste à mieux comprendre le rôle de la protéine post-synaptique

Shank3 dans la MA. Des réductions en Shank3 ont été rapportées dans le cerveau de patients atteints de

la Maladie d'Alzheimer ainsi que chez la souris 3xTg-AD, un modèle murin de la maladie. De plus,

l'haploinsuffisance en Shank3 est associée au syndrome de délétion 22q13.33, s’apparentant à l’autisme.

Le but de l’étude est donc de vérifier si les deux neuropathologies établiront une synergie en croisant des

souris déficientes en Shank3 avec des souris 3xTg-AD. J’ai contribué à l’élaboration du projet, au choix du

modèle animal déficient en Shank3, à la planification des croisements ainsi qu’au génotypage des premiers

animaux. L’étude est présentement en cours et s’échelonnera sur plusieurs années.

Altération de la réponse cérébrale à l'insuline chez les ...

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