RÉSISTANCE AUX -LACTAMINES À LARGE SPECTRE CHEZ LES BACTÉRIES

À GRAM NÉGATIF Épidémiologie et diagnostic

Mémoire

MARILYSE VALLÉE

Maîtrise en microbiologie-immunologie Maître ès sciences (M.Sc.)

Québec, Canada

© Marilyse Vallée, 2015

β

iii

Résumé

La résistance des bactéries à Gram négatif aux céphalosporines de troisième génération

(C3G) et aux carbapénèmes constitue une menace de santé publique majeure à l’échelle

mondiale. Ces β-lactamines à large spectre d’action sont spécifiquement utilisées dans le

traitement des infections résistantes potentiellement mortelles causées par des bactéries

multirésistantes. Le principal mécanisme de résistance aux C3G et aux carbapénèmes est

l’acquisition de gènes encodant respectivement des β-lactamases à spectre étendu (BLSE)

et des carbapénémases. Plusieurs études ont répertorié les principales β-lactamases

responsables des épidémies dans de nombreux pays à savoir les types TEM, SHV et CTX-

M pour les bactéries productrices de BLSE, et plus récemment les types IMP, KPC, NDM,

OXA-48 et VIM pour les bactéries productrices de carbapénémases.

L’Organisation mondiale de la Santé a recommandé des mesures contrôle et prévention et

de contrôle afin de réduire le risque de transmission des bactéries à Gram négatif

productrices de BLSE ou de carbapénémases. Ces stratégies incluent l’identification des

bactéries productrices de BLSE et de carbapénémases par des méthodes diagnostiques

rapides de même que la mise en place d’une surveillance épidémiologique des principaux

gènes de résistance encodant à ces enzymes.

Ce mémoire de maîtrise se présente en 2 volets. D’une part, le développement d’un essai

PCR en temps réel pour la détection rapide et sensible des gènes encodant les principales

carbapénémases. D’autre part, la réalisation d’une étude épidémiologique dans deux

hôpitaux de la ville de Québec sur les principaux gènes de BLSE chez des souches

cliniques résistantes aux céphalosporines de 3e génération. Ces résultats démontrent que ces

approches moléculaires pourraient être utilisées dans les laboratoires de microbiologie

clinique afin de faciliter la détection et la surveillance des bactéries productrices de BLSE

et de carbapénémases.

v

Abstract

The resistance of Gram-negative bacteria against third-generation cephalosporins (3GC)

and carbapenems is a major public health threat worldwide. These antibiotics are used

specifically in the treatment of life-threatening infections caused by multidrug-resistant

bacteria. The acquisition of genes encoding for extended-spectrum β-lactamases (ESBL)

and carbapenemases is the main mechanism of resistance to 3GC and carbapenems,

respectively. Several studies have identified the main β-lactamases responsible for

epidemics in many countries namely TEM, SHV, and CTX-M for ESBL-producing

bacteria, and more recently IMP, KPC, NDM, OXA-48-type, and VIM for bacteria

producing carbapenemases.

The World Health Organization has recommended preventives measures to control and

reduce the risk of transmission of Gram-negative bacteria producers of ESBL and

carbapenemases. These strategies include the identification of ESBL and carbapenemases

with rapid diagnostic methods as well as the establishment of epidemiological surveillance

of major resistance genes for these enzymes.

This master’s thesis is presented in two parts. On one hand, the development of a real-time

PCR assay for rapid and sensitive detection of key genes encoding carbapenemases. On the

other hand, an epidemiological study in two hospitals in Quebec City of genes coding for

ESBL in clinical strains resistant to third generation cephalosporins. These results

demonstrate that these molecular approaches could be used in clinical microbiology

laboratories to facilitate the detection and monitoring of ESBL- and carbapenemases-

producing bacteria.

vii

Table des matières

Résumé ................................................................................................................................. iii 

Abstract .................................................................................................................................. v 

Table des matières ............................................................................................................. vii 

Liste des tableaux ................................................................................................................. xi 

Liste des figures ................................................................................................................. xiii 

Liste des abréviations ....................................................................................................... xvv 

Dédicace .............................................................................................................................. xix

Avant-Propos ...................................................................................................................... xxi 

Chapitre 1 Introduction générale ....................................................................................... 1 

1. Historique .......................................................................................................................... 3 

  Ère pré-antibiotique ................................................................................................ 3 

  Ère antibiotique ....................................................................................................... 4 

  Impacts globaux ...................................................................................................... 5 

  Infections causées par les bactéries à Gram négatif ............................................... 7 

  Antibiotiques ........................................................................................................... 8 

1.5.1  Mode d’action ............................................................................................... 10 

1.5.2  β-lactamines .................................................................................................. 11 

1.5.2.1  Céphalosporines de 3ième génération ......................................................... 14 

1.5.2.2  Carbapénèmes ........................................................................................... 14 

1.5.2.3  Mode d’action des β-lactamines ............................................................... 15 

  Résistance des bactéries aux antibiotiques ........................................................... 17 

1.6.1  Résistance naturelle ...................................................................................... 18 

1.6.2  La résistance acquise .................................................................................... 19 

1.6.2.1  Structures d'ADN qui assurent la transmission de la résistance aux antibiotiques .............................................................................................................. 19 

1.6.2.1.1  Plasmides ............................................................................................ 19 

1.6.2.1.2  Éléments génétiques transposables .................................................. 20 

1.6.2.1.3  Intégrons ............................................................................................ 20 

viii

1.6.3  Facteurs responsables de l’augmentation de la résistance aux antibiotiques 20 

1.6.4  Résistance aux β-lactamines chez les bactéries à Gram négatif ................... 23 

1.6.4.1  Les β-lactamases ...................................................................................... 24 

1.6.4.1.1  Mode d’action ................................................................................... 24 

  Classification des β-lactamases ............................................................................ 25 

1.7.1  β-lactamases à spectre étendu ...................................................................... 29 

1.7.1.1.1  TEM ................................................................................................... 30 

1.7.1.1.2  SHV .................................................................................................... 30 

1.7.1.1.3  CTX-M ............................................................................................... 30 

1.7.1.2  Carbapénémases ....................................................................................... 32 

1.7.1.2.1  Carbapénémases de classe A ........................................................... 33 

1.7.1.2.2  Carbapénémases de classe B ............................................................ 34 

1.7.1.2.3  Carbapénémases de classe D ........................................................... 36 

  Méthode de détermination de la sensibilité à un antibiotique .............................. 37 

1.8.1  Méthodes phénotypiques .............................................................................. 37 

1.8.1.1  La concentration minimale inhibitrice (CMI) .......................................... 38 

1.8.1.2  Méthodes phénotypiques pour la détection de la production de BLSE ... 39 

1.8.1.2.1  Test de double synergie ...................................................................... 39 

1.8.1.2.2  Bandelettes Etest® BLSE ................................................................... 40 

1.8.1.2.3  Méthode des disques combinés ........................................................ 41 

1.8.1.2.4  Méthodes automatisées ..................................................................... 42 

1.8.1.3  Méthodes phénotypiques pour la détection de la production de carbapénémases ........................................................................................................ 42 

1.8.1.3.1  Test de Hodge modifié ...................................................................... 43 

1.8.1.4  Limitations associées aux méthodes phénotypiques ................................ 44 

1.8.2  Méthodes génotypiques ................................................................................ 45 

1.8.2.1  Réaction de polymérisation en chaîne (PCR) .......................................... 45 

1.8.2.1.1  PCR en temps réel ............................................................................ 45 

1.8.2.1.1.1  PCR multiplex en temps réel .................................................... 46 

1.8.2.1.1.2  Tests PCR pour la détection des carbapénémases .................. 46 

  Impacts de la résistance aux antibiotiques : Ère post-antibiotique ....................... 47 

Chapitre 2 Problématique, objectifs de recherche et contributions scientifiques ....... 49 

ix

  Problématique ....................................................................................................... 51 

  Objectifs de recherche .......................................................................................... 52 

2.2.1  Objectifs spécifiques ..................................................................................... 52 

Chapitre 3 Développement d’un essai PCR multiplex en temps réel pour la détection rapide et sensible des gènes codant pour les carbapénémases ........................................ 55 

  Abstract ................................................................................................................. 61 

  Introduction ........................................................................................................... 62 

  Materials and methods .......................................................................................... 64 

3.3.1  Bacterial strains ............................................................................................. 64 

3.3.2  Phenotypic confirmation tests ....................................................................... 64 

3.3.3  DNA extraction and purification from bacterial strains ............................... 65 

3.3.4  Multiplex primer and probe design ............................................................... 65 

3.3.5  Multiplex PCR for the detection of blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like blaIMP, and blaVIM ...................................................................................................................... 66 

3.3.6  Internal control (IC) ...................................................................................... 66 

3.3.7  Validation of the multiplex PCR assay ......................................................... 67 

3.3.8  Limit of detection (LOD) .............................................................................. 67 

3.3.9  Analytical performance of the MHT and RDS test ...................................... 68 

  Results ................................................................................................................... 68 

3.4.1  Analytical performance of the multiplex PCR assay .................................... 68 

3.4.2  Analytical performance of the MHT and RDS test ...................................... 69 

  Discussion ............................................................................................................. 70 

  Conclusions ........................................................................................................... 74 

  Acknowledgments ................................................................................................ 74 

  Contributions ........................................................................................................ 74 

  References ............................................................................................................. 75 

Chapitre 4 Épidémiologie moléculaire des β-lactamases à spectre étendu chez les bactéries à Gram négatif dans deux hôpitaux de la ville de Québec .............................. 85 

  Abstract ................................................................................................................. 91 

  Introduction ........................................................................................................... 92 

  Materials and methods .......................................................................................... 93 

4.3.1  Bacterial strains ............................................................................................. 93 

4.3.2  Identification and antimicrobial susceptibility testing .................................. 93 

x

4.3.3  Molecular characterization of resistance genes ............................................ 93 

4.3.4  PCR detection of the Escherichia coli clonal complex O25b-ST131. ......... 93 

  Detection of ISEcp1 ............................................................................................. 94 

4.3.5 .......................................................................................................................... 94 

  Results .................................................................................................................. 94 

  Conclusions .......................................................................................................... 98 

  References ............................................................................................................ 99 

  Acknowledgments ................................................................................................ 99 

Chapitre 5 Conclusions et perspectives ........................................................................ 101 

Bibliographie ..................................................................................................................... 105 

xi

Liste des tableaux

Tableau 1. Les postulats de Koch. .......................................................................................... 4 

Tableau 2. Micro-organismes producteurs d'antibiotiques. .................................................... 9 

Tableau 3. Mécanismes d’action des principaux agents antimicrobiens. ............................. 10 

Tableau 4. Spectre d’activité des principales classes de β-lactamines. ................................ 13 

Tableau 5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques. ...................................................... 18 

Tableau 6. Facteurs contribuant à l'augmentation de la résistance aux antibiotiques. .......... 21 

Tableau 7. Phénotypes de résistance aux β-lactamines associés à la production des principales BLSE de types SHV, TEM et CTX-M. ...................................................... 29 

Tableau 8. Phénotypes de résistance aux β-lactamines associés à la production des principales carbapénémases de types IMP, KPC, NDM, OXA-48 type et VIM. ......... 33

Tableau 9. Exemples de tests moléculaires rapides visant la détection de gènes de résistance associés à la production de carbapénémases chez les bactéries à Gram négatif.......…47

xiii

Liste des figures

Figure 1. Inhibition de la croissance d'une culture de Staphylococcus aureus par la moisissure Penicillium notatum……………………………………………..5

Figure 2. Structure du noyau β-lactame……………………………………………...……11

Figure 3. Structures générales des principales classes de β-lactamines………...…………12

Figure 4. Structure de la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif…………...………15

Figure 5. Représentation schématique de la structure du peptidoglycane d’une bactérie à Gram négatif……………………………...……………………...…………17

Figure 6. Réaction d’inactivation d’une β-lactamine par l’action d’une β-lactamase……..25

Figure 7. Schéma révisée de la classification d’Ambler………………………….........…..26

Figure 8. Répartition mondiale des différents variants de l’enzyme CTX-M……….....…..31

Figure 9. Distribution géographique des bactéries productrices de NDM-1……….…...…36

Figure 10. Test de double synergie………………………………………………...…...….40

Figure 11. Bandelettes Etest® BLSE………………………………………………….….41

Figure 12. Méthode des disques combinés ……………………………………….………42

Figure 13. Test de Hodge modifié………………………………………….……..………43

Figure 14. Test de Rosco Diagnostica Neo-Sensitabs™………………………………….44

xv

Liste des abréviations

ABPA Acide aminophénylboronique

ADN Acide désoxyribonucléique

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adénosine triphosphate

BSA Bovine serum albumin

BLSE β-lactamase à spectre étendu

BPC Bactéries productrices de carbapénémases

Caz Ceftazidime

CDC Centers for Disease Control and Prevention (Atlanta, GA)

°C Degré Celcius

CHUL Centre hospitalier de l'Université Laval

CLSI Clinical Laboratory Standard Institute

Cla Acide clavulanique

CMI Concentration minimale inhibitrice

Ctx Céfotaxime

CTX-M Céfotaximase-Munich

D-Ala-D-Ala D-alanyl-D-alanine

DPA Acide dipicolinique

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EUCAST European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing

FN Faux négatif

FP Faux positif

GES Guiana extended-spectrum

I Intermédiaire

IMI Imipénème

IMP Imipénémase

IUCPQ Institut de Cardiologie et de Pneumologie de Québec

KCl Chlorure de potassium

KPC Klebsiella pneumoniae carbapenemase

xvi

MBLs Métallo-β-lactamases

MgCl2 Chlorure de magnésium

MIC Minimal inhibitory concentration

min Minute

mL Millilitre

Na+ Ion sodium

NAG N-acétyl-glucosamine

NAM N-acétyl-muramique

NaCl Chlorure de sodium

NCBI National Center for Biotechnology Information

NDM New-Deli metallo-β-lactamase

nt Nucléotide

LSPQ Laboratoire de santé publique du Québec

MALDI-TOF Matrix-assisted laser desorption/ionisation-time-of-flight mass spectrometry (Spectromètre de masse couplant une source d’ionisation laser assistée par une matrice et un analyseur à temps de vol)

MLST Multilocus sequence typing

NMC Non-metallo-carbapenemase

OMS Organisation mondiale de la Santé

Pb Paire de bases

PCR Polymerase chain reaction

PBP Penicillin-binding protein

R Résistant

RUCLANAP Rapid Universal Cell Lysis and Nucleic Acids Preparation

PLP Protéine liant la pénicilline

S Sensible

SHV Sulfhydryl variable

SME Serratia marcescens enzyme

TEM Temohiera

USI Unités de soins intensifs

UFC Unité formatrice de colonies

μL Microlitre

xvii

μm Micromètre ou micron

µM Micromolaire

μg Microgramme

VIM Verona integron-encoded

VN Vrai négatif

VP Vrai positif

VPP Valeur prédictive positive

VPN Valeur prédictive négative

xix

À mes parents, ma sœur Émilie, je vous aime

xxi

Avant-propos

Je tiens à communiquer mes plus sincères remerciements à tous ceux qui ont contribué

d'une quelconque manière à la réalisation de ce projet, de ce défi personnel. Ces trois

dernières années ont été enrichissantes à plusieurs égards, et j'en ressors

professionnellement changée et humainement grandie. Ce mémoire est issu d'énormément

d'efforts, mais est également empreint de belles journées, de souvenirs impérissables et de

beaucoup de rires.

D'abord, j'aimerais souligner ma profonde reconnaissance à mon directeur de recherche, Dr.

Michel G. Bergeron. Votre vision et votre passion ont su nourrir mon intérêt afin de

pleinement m’investir dans vos recherches. Mon admiration envers vos accomplissements

est absolue. Mille mercis de m’avoir offert cette opportunité.

Évidemment, je tiens à remercier profondément ma co-directrice, Dre Ann Huletsky, une

femme qui m’a inspirée quotidiennement. J'ai énormément de respect non seulement pour

sa carrière professionnelle extraordinaire, mais également pour ses qualités et ses valeurs

personnelles. Grâce à elle, j’ai pu approfondir mes connaissances scientifiques, développer

un regard critique sur mes recherches et présenter mes travaux de façon claire. Cette

formation m’aura certainement permis d’accroître ma confiance en moi et aura assurément

établi des bases solides pour ma carrière professionnelle. Merci de m'avoir montré à me

surpasser en recherchant toujours l’excellence ainsi que de m'avoir permis de me faire une

place dans ce monde scientifique. Je suis reconnaissante de l’énergie et du temps que tu as

voués à mon encadrement. J’ai eu beaucoup de plaisir à travailler et j’ai grandement

apprécié apprendre de toi.

Nul projet ne serait possible à réaliser sans le soutien de Dominique Boudreau. Ton

expérience et tes conseils judicieux ont apporté beaucoup à mon apprentissage. Bien que ta

présence contribue à résoudre les différents problèmes qui ne manquent pas de faire surface

lors de la réalisation d'un tel projet, c’est ta personnalité qui te distingue avant tout. Tu es

un élément primordial de l’équipe.

xxii

Je désire également remercier Dr. Maurice Boissinot pour son soutien scientifique et sa

rigueur qui m’ont permis de développer mon potentiel scientifique. La richesse de l'équipe

de diagnostic moléculaire repose sur la diversité des gens et la complémentarité des

connaissances. Je tiens également à remercier mes autres collègues, actuels et ancients,

Marie-Claude Hélie, Lucile Belley-Montfort, Isabelle Martineau, Catherine Ouellette,

Johanne Frenette, Martine Bastien, Ève Bérubé, Luc Bissonnette, Gale Stewart, Martin

Gagnon, Jean-Luc Simard, Marthe Bernier, Hélène Morin, Éric Martel, Richard Giroux et

Amin Ouameur. Évidemment, une équipe n'est jamais complète sans les autres étudiants.

Laurie, merci de ton enthousiasme contagieux, Rana de ton positivisme et Karel de ton

écoute. Les liens d'amitiés qui nous unissent sauront toujours franchir les frontières qui

nous séparent. Merci Fred pour les midis divertissants remplis de «frederies». J'ai fait de

belles rencontres, j’ai eu de belles opportunités, et pour ces raisons, je me sens tellement

enrichie aujourd'hui que je recommencerais sans hésiter.

Finalement, je tiens à remercier ma famille pour leur support moral et affectif de même que

pour leurs encouragements soutenus dans tous les projets que j'ai entrepris depuis mon tout

jeune âge. Merci de m'avoir permis de partager de nombreux moments heureux avec vous

et de m'avoir épaulée lors d’épreuves plus difficiles. Mes parents m'ont transmis de belles

valeurs, dont la persévérance qui m’a grandement aidée à me rendre jusqu’ici. À travers

votre fierté et votre amour, j’ai souvent trouvé la motivation à poursuivre et à me surpasser.

Il est difficile de décrire tout ce que vous avez pu m’apporter, mais sachez que j’en suis

pleinement reconnaissante. Je remercie aussi Émilie, une grande sœur de qui j'ai tant à

apprendre. Tu es un exemple de force et de dévouement. Ayant été mon premier professeur,

tu as assurément eu une incidence dans mes accomplissements. Merci à Marc-Antoine de la

rendre aussi heureuse. Un merci à ma grande amie Justine qui a été particulièrement

présente pour discuter et rire durant ces années. Tes conseils et ta franchise m’ont

grandement fait cheminer. Je pense également à Joanny, Catherine, Anne et Stéphanie pour

leur amitié sincère et tous ces moments inoubliables.

1

Chapitre 1

Introduction générale

3

1. Historique

Ère pré-antibiotique À travers l’histoire, les maladies infectieuses ont été la principale cause de mortalité au

niveau mondial. De grandes pandémies ainsi que de multiples épidémies locales,

répertoriées depuis l’Antiquité, ont entraîné l’effondrement de plusieurs civilisations

(Kardos & Demain, 2013). À cette époque, il était admis que ces phénomènes étaient

relatifs aux miasmes, une émanation provenant de la matière organique en décomposition

dont la propagation était influencée par différents facteurs environnementaux (Koplan et

al, 1999). Ce n’est qu’au 19e siècle, qu’une série d’observations ont ciblé la présence de

«germe» en tant qu’agent responsable de ces épidémies. La corrélation entre la présence

de microorganismes et le développement de maladies infectieuses a toutefois été

formellement établie en 1869 par les travaux du chimiste et physicien français Louis

Pasteur (1822-1895). Ses observations relatives à la pébrine lui ont permis de démontrer

qu’un protozoaire parasite était l’agent responsable du développement de la maladie chez

le verre à soie et que cette dernière pouvait être contrôlée par le biais de chenilles

provenant d’œufs pondus par des papillons sains (Prescott et al. 2010). La théorie des

germes liant directement les microorganismes aux maladies infectieuses a ainsi entraîné

une évolution importante au plan de la santé humaine. Le médecin allemand Robert Koch

(1843-1910) a formalisé cette découverte en définissant quatre principes unissant les

microorganismes à certaines maladies, connus sous le nom de postulats de Koch. Ces

derniers sont brièvement présentés dans le Tableau 1. Dès lors, les recherches dans le

domaine médical se sont dirigées vers la découverte des agents causaux des différentes

maladies et enfin vers le développement de méthodes permettant d’éliminer ou de

contrôler leur présence.

4

Tableau 1. Les postulats de Koch.

Tableau adapté de Prescott et al. (2010).

1. Le micro-organisme doit être invariablement présent lors de la maladie mais absent des organismes sains.

2. Le micro-organisme, qui semble être responsable de la maladie, doit pouvoir être isolé et cultivé en culture pure.

3. La même maladie doit se développer lorsque le micro- organisme isolé est inoculé à un organisme sain.

4. Le même micro-organisme doit être à nouveau isolé de l'hôte malade.

Ère antibiotique Le concept de l’antibiothérapie a été établi par les recherches d’Alexander Fleming

(1881-1955) en 1928. En étudiant les propriétés antimicrobiennes des lysosomes,

Fleming a remarqué un phénomène inhabituel sur une ancienne plaque de culture de

Staphylococcus aureus (Fleming, 1929). Un champignon contaminant, Penicillium

notatum, avait inhibé la croissance bactérienne des staphylocoques en libérant un agent

antibactérien dans la zone adjacente à sa croissance (Figure 1). Il a ainsi attribué le nom

«pénicilline» à ce composé inhibiteur en raison de sa provenance. Suite à cette

découverte, Fleming a décrit les conditions nécessaires à la croissance du champignon et

a tenté de retrouver cette même production antimicrobienne chez d’autres micro-

organismes. Malheureusement, il n'a pu démontrer la valeur thérapeutique de cette

nouvelle substance en raison de l’instabilité de la molécule et de la difficulté d'extraction

de la forme active (Zaffiri et al, 2012). Ce sont les travaux d’Ernst Chain et d’Howard

Florey, en 1940, qui ont mené à l’utilisation thérapeutique de la pénicilline. Ils ont

développé une technique afin d'extraire une quantité suffisante de l’agent antimicrobien

actif à partir d’une culture microbienne. En effet, ils ont réussi à préparer une formule

stable de la pénicilline et démontrer l’efficacité de son activité antibactérienne, en

absence de toxicité chez la souris. La pénicilline a ainsi été le premier agent

thérapeutique naturel capable de détruire les bactéries in vivo, sans être éliminé dans le

5

corps, en plus d’être non toxique pour les humains (Chain et al, 1940). En 1945, le prix

Nobel de physiologie et médecine a été décerné à Chain, Fleming et Florey pour leur

découverte de la pénicilline ainsi que la mise en évidence de son effet curatif envers

plusieurs maladies infectieuses (Ligon, 2004). Cette découverte a été la première étape

vers le développement de tous les antibiotiques connus à ce jour (Kardos & Demain,

2011) et de ce fait, a mené à la naissance de l’ère antibiotique.

Figure 1. Inhibition de la croissance d'une culture de Staphylococcus aureus par la moisissure Penicillium notatum. Figure adaptée de Prescott et al. (2010).

Impacts globaux Les bénéfices les plus significatifs au plan de la santé humaine suite à l’introduction des

agents antimicrobiens ont été une diminution massive des décès relatifs aux maladies

infectieuses. En effet, le taux de mortalité globale est passé de près de 33% à environ 4%

entre la fin du 19ème et du 20ème siècle, subséquemment à l’utilisation des antibiotiques

(Kardos & Demain, 2011). Pour ces mêmes raisons, l'espérance de vie a bondi de huit ans

entre 1944 et 1972 (Kardar, 2005).

L’arrivée d'antibiotiques efficaces a également eu un impact significatif sur l'ensemble de

la médecine, permettant, entre autres, la réalisation d'opérations complexes avec un

minimum de risque d'infections, l’exécution de diverses procédures invasives et de

transplantations d'organes, de même que l’utilisation de chimiothérapies

immunosuppressives (Choffnes et al, 2010). L’introduction des antibiotiques a

Colonies normales de Staphylococcus aureus

Colonies de Penicillium notatum

Zone d’inhibition de croissance de Staphylococcus aureus

6

notamment permis de réduire le taux d’infections résultant d’une intervention

chirurgicale de 40% à 2% (Wallace et al, 2000) et a diminué de 75% la transmission de

maladie néonatale lors d’accouchement lorsque combiné avec une antibioprophylaxie

intrapartum (CDC, 1996; Davies et al, 2001). Aucun de ces progrès de la médecine

n’aurait été possible en absence d’agents antimicrobiens efficaces.

Le succès de l'antibiothérapie a rapidement convaincu de nombreux experts médicaux

qu’ils avaient enfin identifié le remède miracle dans le traitement des maladies

infectieuses qui affligeaient la population mondiale depuis des milliers d’années. En

effet, un sentiment d’optimisme général dans la communauté de l’époque s’est reflété

dans la pratique médicale, marqué par une absence de recommandations quant à

l’utilisation des antibiotiques.

Toutefois, certains scientifiques craignaient les conséquences négatives potentielles qui

pouvaient découler de cette utilisation non-contrôlée. En effet, certaines bactéries ont

présenté rapidement leur capacité à détruire l’antibiotique par dégradation enzymatique

(Abraham & Chain, 1940). De plus, Alexander Fleming lui-même, avait également mis

en garde l’utilisation non contrôlée des antibiotiques:

"The greatest possibility of evil in self-medication is the use of too small doses so

that instead of clearing up infection the microbes are educated to resist penicillin and a

host of penicillin-fast organisms is bred out which can be passed to other individuals and

from them to others until they reach someone who gets a septicaemia or pneumonia

which penicillin cannot save."

(New York Times June 26, 1945)

Seulement sept décennies plus tard, il semble que l’utilisation excessive et peu contrôlée

des antibiotiques a mené à un déclin prémédité de ce remède miracle. Ce mémoire,

abordera plus précisément la difficulté thérapeutique actuelle et grandissante des

infections causées par des bactéries à Gram négatif ayant acquis une résistance, envers les

β-lactamines, la famille d’antibiotiques la plus utilisée en pratique clinique, par la

production d’enzymes particulières, les β-lactamases.

7

Infections causées par les bactéries à Gram négatif

Les bactéries à Gram négatif constituent une large catégorie de micro-organismes qui

sont incapables de retenir une coloration de cristal violet en raison de la structure

distincte de leur paroi cellulaire. Parmi ceux-ci, les entérobactéries de même que les

bactéries non-fermentaires forment deux groupes largement responsables de plusieurs

maladies infectieuses. Les bactéries regroupées dans la famille des Enterobacteriaceae se

retrouvent principalement dans le sol, l'eau, et certaines (incluant Citrobacter sp.,

Enterobacter sp., Escherichia coli, Klebsiella sp., Proteus sp. et Serratia marcescens)

sont des constituants naturels de la flore intestinale de l’homme. Ces micro-organismes

sont d’importants pathogènes en milieux hospitaliers (Laurent et al, 2008 ; Piednoir et al,

2011) et communautaires (Arslan et al, 2005 ; Chong et al, 2011 ; Song et al, 2011). Ces

derniers se propagent facilement entre humains par le biais des mains, de l’eau et de la

nourriture contaminée de même que de sources environnementales (NIH-NIAID, 2012).

Les bactéries non-fermentaires sont également répandues dans l’environnement et sont

responsables d’infections dites opportunistes. Les principales bactéries à Gram négatif

causant des infections sont Escherichia coli et Klebsiella pneumoniae parmi les

entérobactéries ainsi que Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii parmi les

bactéries non-fermentaires.

Les infections causées par des bactéries à Gram négatif constituent une préoccupation

majeure dans les établissements de soins de santé ainsi que dans la communauté en

général. Dans certains cas, les bactéries peuvent pénétrer dans l'organisme par le biais de

cathéters, de ventilateurs respiratoires, ou directement dans une plaie. L’entrée de ces

micro-organismes peut conduire à une infections respiratoire, une infection des voies

urinaires, du site opératoire ou à une septicémie. Ces types d'infections affectent

majoritairement les personnes immunosupprimées et les personnes âgées, représentant

généralement la clientèle des établissements de soins de santé. De récentes études ont

montré que 30 % des infections nosocomiales étaient causées par des bactéries à Gram

négatif (NIH, 2009) et que ces dernières prédominaient dans les cas de pneumonies

associées à la ventilation (47%) et d’infections urinaires (45%) (Hidron et al, 2008). La

8

prévalence de ces mêmes infections a augmenté à près de 70% dans les unités de soins

intensifs (USI) (Gaynes et al, 2005).

Les différents agents antimicrobiens développés avec le temps représentent des outils

thérapeutiques de choix pour le contrôle des infections causées par ces micro-organismes.

Malheureusement, l'incidence de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries à Gram

négatif a augmenté à un rythme alarmant au niveau mondial au cours des 20 dernières

années (Cantòn et al, 2012 ; El Salabi et al, 2013 ; Nordmann et al, 2011 ; Woodford et

al, 2011) (Voir section 1.6.4).

Antibiotiques Un antibiotique (du grec anti, contre et bios, la vie) est une substance chimique naturelle

ou synthétique, ayant un mode d’action spécifique contre les bactéries. La majorité des

antibiotiques sont des molécules naturelles, produites essentiellement par des bactéries ou

certains champignons afin d’éliminer les micro-organismes sensibles (effet bactéricide)

ou d’inhiber leur croissance (effet bactériostatique) (Tableau 2) (Kohanski et al, 2010).

De plus, il existe des antibiotiques semi-synthétiques, qui sont en fait des antibiotiques

naturels modifiés par l’addition de groupements chimiques dans le but de les rendre

moins sensibles à l’inactivation par les micro-organismes (Prescott et al, 2010). Les

antibiotiques n’ont toutefois aucune action sur les virus ou les champignons. Dans ces

cas-ci, on parle plutôt respectivement d’antiviraux et d’antifongiques.

9

Tableau 2. Micro-organismes producteurs d'antibiotiques.

Tableau adapté de Prescott et al. (2010) et Walsh (2003).

Micro-organismes Antibiotiques

Bactéries

Streptomyces sp. Amphotéricine B

Carbapénèmes

Chloramphénicol

Érythromycine

Kanamycine

Néomycine

Nystatine

Rifampicine

Streptomycine

Tétracyclines

Vancomycine

Micromonospora sp. Gentamicine

Bacillus sp. Bacitracine

Mycètes

Penicillium sp. Polymyxines

Griséofulvine

Pénicilline

Cephalosporium sp. Céphalosporines

Les antibiotiques sont également classés en fonction de leur champ d’efficacité. D’une

part, on retrouve ceux ayant un spectre d’action étroit, c’est-à-dire possédant une

efficacité restreinte à une variété de micro-organismes. D’autre part, il y a ceux

caractérisés par un large spectre d’action, capable de détruire différents types de micro-

organismes. Cette caractéristique donne un avantage significatif à ce type d’antibiotique

lorsque l’identification du pathogène responsable de l’infection est inconnue.

Malheureusement, l’utilisation d’un antibiotique à large spectre a aussi un effet plus aigu

10

sur la flore normale, en perturbant l’équilibre des micro-organismes présents. Les

conséquences de cette utilisation seront discutées dans la section 1.6.

1.5.1 Mode d’action

Les mécanismes d’action des agents antimicrobiens se divisent en fonction de la cible de

l’antibiotique. Ils agissent notamment en inhibant la synthèse de la paroi cellulaire

(peptidoglycane ou membrane externe), des acides nucléiques, des protéines ou sur

l’inhibition de voies métaboliques. Le Tableau 3 présente les principaux antibiotiques

utilisés en fonction de leur mécanisme d’action. À ce jour, des milliers de molécules

d’antibiotiques naturelles ou synthétiques ont été développés. Toutefois, la toxicité de

certaines molécules les empêche d’être utilisées en médecine humaine. En somme, une

centaine d’antibiotiques sont administrés dans un contexte clinique afin de maîtriser les

maladies infectieuses causées par des agents bactériens.

Tableau 3. Mécanismes d’action des principaux agents antimicrobiens. Tableau adapté de Prescott et al. (2010)

Mécanismes d'action Agents antimicrobiens

Inhibition de la synthèse de la paroi cellulaire β-lactamines

Vancomycine

Éthionamide et isoniazide

Inhibition de la synthèse protéique Aminoglygosides ou aminosides

Tétracyclines

Chloramphénicol

Macrolides

Inhibition de la synthèse des acides nucléiques Rifampicine

Quinolones

Inhibition des voies métaboliques Sulfamides

Triméthoprime

11

1.5.2 β-lactamines

Les β-lactamines, représentent la famille d’antibiotiques la plus utilisée en

antibioprophylaxie et en antibiothérapie. L’importance de leur utilisation résulte de leur

large spectre d’action, leur faible toxicité, leur efficacité thérapeutique ainsi que le faible

coût de certaines molécules (Georgopapadakou, 1993). La résistance bactérienne

croissante à cette famille d’antibiotiques sera l’objet de ce mémoire. Les β-lactamines

regroupent les pénicillines, les monobactames, les inhibiteurs de β-lactamases, les

céphalosporines (1ère à 4ème génération) et les carbapénèmes. Elles se caractérisent par la

présence d’un élément structural commun, soit le noyau β-lactame, nécessaire à l’activité

antibactérienne de l’antibiotique (Figure 2).

Figure 2. Structure du noyau β-lactame. Le noyau β-lactame est constitué de trois

atomes de carbone et un d’azote. En raison de sa conformation, le cycle β-lactame est

fortement tendu. En effet, la liaison entre le groupe carbonyle et l'atome d'azote est

instable et rend donc la molécule réactive (Kong, 2010).

La classification des β-lactamines dépend de la chaîne latérale additionnelle ajoutée au

noyau β-lactame, induisant essentiellement des différences dans la biodisponibilité de

l’antibiotique ainsi qu’une extension du spectre d'activité à l'égard des bactéries à Gram

négatif (Mascaretti, 2003). La Figure 3 présente la structure générale des 5 classes de β-

lactamines.

12

Figure 3. Structures générales des principales classes de β-lactamines. Figure adaptée

de Wingard et al. (1991).

Le développement des différentes β-lactamines s’est fait en fonction d’une meilleure

couverture contre les bactéries à Gram négatif, tel que le démontre le Tableau 4.

13

Tableau 4. Spectre d’activité des principales classes de β-lactamines.

Tableau adapté de Mascaretti (2003).

β-lactamines Spectre d'activité

Pénicillines Actives contre les coques et les bacilles à Gram positif ainsi que les coques à Gram négatif

Monobactames Actives uniquement contre les bacilles à Gram négatif, y compris Pseudomonas aeruginosa

Inhibiteurs de β-lactamases

Actifs contre la majorité des β-lactamases à l'exception des céphalosporinases et des métallo-β-lactamases.

Céphalosporines 1ère génération (C1G)

Actives contre les coques à Gram postif et quelques bactéries à Gram négatif

Céphalosporines 2ème génération (C2G)

Actives contre les coques à Gram postif et ont une action augmentée contre les bactéries à Gram négatif par rapport aux C1G

Céphalosporines 3ème génération (C3G)

Actives contre les bactéries Gram négatif, y compris contre Pseudomonas aeruginosa. Cette couverture plus large des bactéries à Gram négatif diminue la couverture pour les bactéries à Gram positif

Céphalosporines 4ème génération (C4G)

Actives contre certaines bactéries à Gram négatif, y compris Pseudomonas aeruginosa. Elles sont stables à l'action des céphalosporinases.

Carbapénèmes Actives contre toutes les bactéries à Gram négatif, y compris Pseudomonas aeruginosa. Elles sont stables à la plupart des β-lactamases, y compris les BLSE.

Les céphalosporines de 3ème génération (C3G) et les carbapénèmes font partie des β-

lactamines ayant le plus large spectre d’action à l’égard des bactéries à Gram négatif.

Leur utilisation est spécifique à certaines situations cliniques particulières. En effet, les

C3G sont utilisées dans le traitement des infections nosocomiales graves et les

carbapénèmes sont utilisées en thérapie empirique ou comme traitement contre des

infections causées par des bactéries déjà résistantes aux C3G. Ils représentent donc un

traitement de dernière ligne. La résistance bactérienne aux C3G et aux carbapénèmes

14

limite les possibilités de traitements antimicrobiens ou mène à une impasse thérapeutique.

La résistance à ces antibiotiques sera étudiée dans le cadre de ce mémoire.

1.5.2.1 Céphalosporines de 3ième génération

L'introduction de six molécules de céphalosporines de troisième génération (C3G) au

début des années 1980 a révolutionné la pratique clinique dans la lutte contre la résistance

bactérienne. Les trois principales molécules utilisées sont la céfotaxime, la ceftazidime et

le ceftriaxone. Ces agents, comparativement aux céphalosporines de 1ère et 2ème

génération, sont caractérisés par une plus grande stabilité contre les enzymes qui

inactivent spécifiquement les β-lactamines, soit les β-lactamases (présentées à la section

1.7). Généralement, la sensibilité des bactéries à Gram négatif à l’égard des différentes

C3G est très similaire. Exceptionnellement, la ceftazidime a une activité cliniquement

significative contre Pseudomonas aeruginosa. Non seulement les C3G sont caractérisées

par leur efficacité contre les infections nosocomiales graves, mais ils ont également

l'avantage majeur d’avoir peu d'effets néphrotoxiques par rapport aux autres antibiotiques

tels les aminosides et les polymyxines (Paterson, 2005).

1.5.2.2 Carbapénèmes

Les carbapénèmes jouent, quant à eux, un rôle crucial dans l’arsenal antibiotique. Parmi

les centaines de β-lactamines, les carbapénèmes possèdent le plus large spectre d'activité

et la plus grande activité antimicrobienne contre les bactéries à Gram positif et Gram

négatif (Papp-Wallace et al, 2011). Ainsi, les carbapénèmes sont devenues des outils

essentiels dans le traitement des infections nosocomiales sévères ou acquises dans la

communauté (Patel et al, 2013). Les carbapénèmes sont utilisées lors d’un traitement

empirique ou dans le traitement d’infections par des bactéries à Gram négatif résistantes

aux C3G. Les carbapénèmes sont les seules β-lactamines dont l'efficacité est prouvée

dans les infections graves dues aux bactéries productrices de β-lactamases à spectre

étendu (BLSE), majoritairement responsables de la résistance aux C3G (Hawkey &

Livermore, 2012). Il a été suggéré que cette activité soit due aux effets combinés d’une

meilleure pénétration de la paroi bactérienne par une voie d’absorption impliquant la

porine OprD, une bonne stabilité à l’hydrolyse de la plupart des β-lactamases et une forte

15

liaison aux PLPs (Mascaretti, 2003). Cette classe d’antibiotiques comprend le

doripénème, l’ertapénème, l’imipénème et le méropénème.

1.5.2.3 Mode d’action des β-lactamines

Le mode d’action des β-lactamines se situe au niveau de l’inhibition de la synthèse de la

paroi cellulaire. La composante majeure de cette structure conservée chez toutes cellules

bactériennes est le peptidoglycane, élément essentiel pour la stabilisation des membranes

cellulaires contre les pressions osmotiques internes élevées. Son intégrité, essentielle à la

survie cellulaire, doit donc être maintenue au cours de la croissance et de la division

cellulaire. En effet, l’endommagement du peptidoglycane conduit à la lyse bactérienne.

Chez les bactéries à Gram négatif, la paroi cellulaire est plus fine que celle des bactéries à

Gram positif et présente une structure plus complexe (Figure 4). En effet, les bactéries à

Gram négatif possèdent une enveloppe cellulaire constituée d’une membrane

cytoplasmique, d'un périplasme et d'une membrane externe. Le peptidoglycane, d’une

épaisseur d’environ 5 nm, se situe dans l’espace périplasmique et constitue l’interface

entre le milieu extracellulaire et le cytoplasme bactérien.

Figure 4. Schéma représentant la paroi cellulaire des bactéries à Gram négatif. Les

bactéries à Gram négatif possèdent une couche plus fine de peptidoglycane entourée

d’une membrane externe sur laquelle sont fixés des lipopolysaccharides. Le

16

peptidoglycane est localisé dans l’espace périplasmique, entre les membranes

cytoplasmique et externe. Des porines assurant le passage de petites molécules

hydrophiles sont présentes dans la membrane externe.

Le peptidoglycane est un polymère composé d’une alternance d’unités d’acide N-acétyl-

muramique (NAM) et de N-acétyl-glucosamine (NAG). Ces composés sont reliés entre

eux par de courtes chaînes peptidiques constitués, entre autres, d’un dipeptide D-alanine-

D-alanine. L’assemblage final de ces unités, processus appelé transpeptidation, est

catalysé par des enzymes appelées protéines liant la pénicilline (PLPs), qui sont

impliquées dans la biosynthèse de la paroi bactérienne (Figure 5). Leur activité DD-

transpeptidase permet la formation des liens peptidiques croisés entre les chaînes de

polysaccharides formant le peptidoglycane. Cette catalyse se déroule en deux étapes et

débute par l’acylation de l’enzyme à un premier peptide. Lors de la seconde étape, un

deuxième peptide est lié au premier par condensation peptidique, libérant ainsi l’enzyme.

Les antibiotiques composant la famille des β-lactamines inhibent cette étape finale de la

synthèse de la paroi cellulaire à cause de leur homologie structurale avec le substrat des

PLPs, soit le D-alanine-D-alanine. Ainsi, le peptidoglycane formé est non fonctionnel et

il en résulte une mort cellulaire.

17

Figure 5. Représentation schématique de la structure du peptidoglycane d’une

bactérie à Gram négatif (Brock et al., 1994). La partie supérieure de la figure illustre

les liens entre les unités structurales au sein du peptidoglycane d’une espèce de bactéries

à Gram négatif (Escherichia coli). L’ensemble des unités sont assemblées suite à un

processus catalysé par les PLPs se terminant par le clivage du résidu D-alanine terminal.

Abréviations: G : N-acétylglucosamine, M : acide N-acétylmuramique, Ala : alanine,

Gly : glycine, Glu : acide glutamique.

Résistance des bactéries aux antibiotiques

La résistance bactérienne se définit par la capacité d’un micro-organisme à se développer

en présence d’un agent antimicrobien, dont l’action empêche ou ralentit normalement sa

18

croissance (NIH, 2009). Ce phénomène de résistance résulte initialement d’un processus

normal de sélection naturelle et est à l’origine de la coexistence de bactéries et

champignons producteurs d’agents antimicrobiens avec d’autres micro-organismes dans

un même environnement. Des gènes responsables de la résistance ont été retrouvés, entre

autres, dans différents sites éloignés tel que le sol de l’Alaska, dans les profondeurs de

l’océan Pacifique et même dans des sédiments de pergélisol datant de 30 000 ans (Allen

et al, 2009; D’Costa et al, 2011; Toth et al, 2010).

La résistance bactérienne envers divers agents antimicrobiens se regroupe selon quatre

mécanismes distincts (Tableau 5).

Tableau 5. Mécanismes de résistance aux antibiotiques.

Tableau adapté de Carle S. (2009).

Mécanismes Conséquences

Diminution de la perméabilité membranaire

Empêche l'antibiotique d'atteindre sa cible

Altération des sites de liaison à l'antibiotique

Diminution de l’affinité de l’antibiotique pour son site d’action

Pompes à efflux Antibiotique éjecté de la cellule par transport actif

Inactivation enzymatique Production d’une enzyme qui inactive ou détruit l’antibiotique

La résistance aux agents antibactériens peut être une propriété intrinsèque à la bactérie.

Dans ce cas précis, on parle de résistance naturelle. Au contraire, elle peut également être

acquise soit par mutation de gènes chromosomiques préexistants ou par acquisition de

gènes.

1.6.1 Résistance naturelle

La résistance naturelle résulte de la présence d’un ou plusieurs gènes chromosomiques

communs à toutes les bactéries d’une même espèce. Ainsi, pour chaque classe

d’antibiotiques, il existe des espèces bactériennes pour lesquelles certains antibiotiques

19

sont inactifs soit en raison de l’absence ou de l’inaccessibilité à la cible, d’une faible

affinité pour celle-ci ou de la présence d’enzymes inactivant ces antibiotiques. Par

exemple, les β-lactamines sont inactives sur les mycoplasmes par l’absence de paroi

cellulaire, le site d’action de cette famille d’antibiotiques. La résistance naturelle est

stable et transmise à la descendance lors de la division cellulaire (transmission verticale).

Toutefois, elle n’est généralement pas transférable d’une bactérie à l’autre (transmission

horizontale). De ce fait, la résistance naturelle ne représente pas une problématique

majeure au niveau épidémiologique.

1.6.2 La résistance acquise

La résistance acquise à un antibiotique n’est présente que chez certaines souches d’une

espèce donnée. Cette résistance résulte d’une modification génétique par mutation ou de

l’acquisition de matériel génétique étranger. Il existe différentes structures d’ADN par

lesquels les gènes de résistance aux antibiotiques peuvent être mobilisés horizontalement

à savoir les plasmides, les éléments génétiques transposables et les intégrons.

1.6.2.1 Structures d'ADN qui assurent la transmission de la résistance aux

antibiotiques

1.6.2.1.1 Plasmides

Les plasmides sont des molécules d'ADN extrachromosomiques capables de réplication

autonome, et pouvant conférer une résistance aux principales classes d'antibiotiques

(Carattoli, 2009). Une même bactérie peut porter un ou plusieurs plasmides selon leur

compatibilité mutuelle et chacun d’eux peut contenir un ou plusieurs gènes de résistance

(Harbottle et al., 2006). Les plasmides peuvent également se transmettre à une souche

sensible principalement par conjugaison mais aussi par transformation ou transduction.

Les plasmides, en fonction de leur efficacité de conjugaison, vont permettre le transfert

horizontal de ces composantes à d’autres bactéries de différentes espèces, genres et

familles (Thomas & Nielsen, 2005). Les plasmides peuvent acquérir d’autres gènes de

résistance par l’intermédiaire d’éléments transposables et d’intégrons par exemple. La

dissémination dans les milieux hospitaliers ou dans la communauté de la résistance aux

20

β-lactamines chez les bactéries à Gram négatif est largement attribuée à ce type de

transmission.

1.6.2.1.2 Éléments génétiques transposables

Les éléments transposables sont des séquences d’ADN ayant la capacité de se déplacer et

de s’insérer à différents endroits dans un chromosome ou un plasmide par un processus

de transposition. Il existe différentes types d’éléments transposables dont les séquences

d’insertion (SI) et les transposons. Les SI sont de courtes séquences génétiques de 800 à

2000 pb qui codent uniquement pour la transposition. Les transposons codent également

pour les déterminants de la transposition ainsi que pour d’autres fonctions, notamment

celle de conférer la résistance aux antibiotiques (El Salabi et al., 2013).

1.6.2.1.3 Intégrons

L'ampleur de la diffusion de la résistance est attribuable en majeure partie par le

déplacement des gènes de résistance par le biais d’intégrons (Dominques et al. 2012). Les

intégrons sont des éléments génétiques mobiles avec une structure spécifique composée

de deux segments conservés encadrant une région centrale appelée « cassette »

(Dominques et al. 2012 ; Recchia & Hall, 1997). Les intégrons constituent un système de

capture et d’expression de gènes, dont les gènes de résistance, sous forme de cassettes.

Les cassettes sont des éléments mobiles capables d’être intégrés ou excisés par

recombinaison spécifique. Les intégrons peuvent être associés à des SI, des transposons

ou des plasmides pouvant leur conférer une mobilité (Dominques et al. 2012). Les

intégrons de classe 1 sont dominants parmi les quatre classes associées à la résistance aux

antibiotiques, et les plasmides sont des vecteurs importants pour leur transmission entre

les bactéries dans l'environnement hospitalier (Espedido et al., 2005).

1.6.3 Facteurs responsables de l’augmentation de la résistance aux

antibiotiques

Tel que mentionné, la résistance aux antibiotiques est un phénomène naturel relié à

l’évolution des espèces bactériennes. Toutefois, une variété de facteurs

21

environnementaux contribue également à l'émergence et la propagation de la résistance.

Ceux-ci sont résumés dans le Tableau 6.

Tableau 6. Facteurs contribuant à l'augmentation de la résistance aux antibiotiques.

Tableau adapté de Carle S. (2009) et Knobler et al. (2003).

Facteurs contribuant à l'augmentation de la résistance aux antibiotiques

1. Pression sélective exercée par l'utilisation d'antibiotiques

2. Sur-utilisation ou utilisation innapropriée des antibiotiques

3. Utilisation massive des antibiotiques en milieu hospitalier

4. Dissémination internationale de clones épidémiques résistants

5. Utilisation des antibiotiques dans l'industrie agroalimentaire

D’abord, les bactéries se caractérisent par une capacité d’adaptation à leur

environnement, notamment par leur reproduction rapide, la fréquence de mutation

génétique aléatoire et leur capacité à s’échanger du matériel génétique entre elles.

L’utilisation d’antibiotiques exerce une pression de sélection sur les populations

bactériennes en favorisant la survie des bactéries présentant une ou des mutations

conférant une résistance aux antibiotiques ou ayant acquis un ou des gènes de résistance à

ces antibiotiques par l’entremise d’éléments génétiques mobiles. Celles-ci continuent à se

reproduire, en transmettant à leur descendance leurs gènes de résistance, produisant

rapidement une génération de bactéries majoritairement résistantes (Hamilton-Miller,

2004; Walsh, 2003). Des bactéries dites compétentes sont aussi capables d’intégrer de

l’ADN exogène présent dans le milieu extérieur et ainsi acquérir potentiellement des

gènes de résistance aux antibiotiques provenant d’autres espèces bactériennes. Elles

peuvent ensuite transmettre à leur descendance leurs gènes de résistance lors de la

réplication produisant ainsi une population de bactéries résistantes à l’agent antibactérien

utilisé.

22

En second lieu, la surutilisation ou l’utilisation inappropriée des antibiotiques constitue

un facteur important dans l’augmentation de la résistance. Dans les pays développés, les

pratiques médicales inappropriées sont souvent favorisées par l'incertitude du diagnostic,

le manque d'opportunité pour le suivi des patients, le manque de connaissances sur les

traitements optimaux ou suite à la demande du patient (Knobler et al, 2003). Les outils

diagnostiques actuels reposent sur une identification phénotypique appuyée

principalement sur la culture du micro-organisme. Le temps nécessaire pour

l’identification ainsi que la détermination de la sensibilité de la souche envers différents

antibiotiques varie entre 48 et 72 heures. Les cliniciens vont donc fréquemment prendre

des décisions relatives au traitement sans connaître l’agent étiologique qui causent

l’infection. En absence d’informations, un agent antibactérien à large spectre est souvent

prescrit dans le cas où un antibiotique plus spécifique ou même aucun antibiotique, aurait

représenté un meilleur choix. En effet, environ 25% des prescriptions d’antibiotiques sont

données dans le traitement d’infections d’origine virale (Leekha et al, 2013). Dans le cas

des pays en voie de développement, ces problèmes surviennent généralement en raison

d’agents antimicrobiens disponibles sans prescription médicale (Knobler et al, 2003).

Certains comportements des patients jouent également un rôle dans l’émergence de la

résistance, notamment l’automédication et le non-respect des traitements recommandés.

Le non-respect survient lorsque les patients oublient de prendre leurs médicaments,

interrompent le traitement prématurément lorsque leur état s’améliore ou dans le cas où

ils ne peuvent se permettre un traitement complet. Quant à l'automédication, elle s’avère

presque toujours soit inutile, inadéquate ou avec un dosage inapproprié. Dans certains

pays, les problèmes de non-conformité et d’automédication sont amplifiés en raison de la

mauvaise synthèse d'antimicrobiens ou l’expiration de la durée de vie efficace de ceux-ci

(Knobler et al, 2003).

Diverses pratiques courantes dans les hôpitaux contribuent aussi au problème de

résistance aux antibiotiques. Les hôpitaux sont, en effet, des milieux particulièrement

fertiles pour la propagation des microbes résistants. On y retrouve un grand nombre de

patients, dont plusieurs avec un système immunitaire affaibli, en contact étroit avec les

autres patients, et traités avec une thérapie antimicrobienne intensive et prolongée. La

23

transmission des micro-organismes résistants aux antimicrobiens chez les patients peut

être aéroportée, à partir d'une source ponctuelle, tel du matériel contaminé, ou par contact

direct ou indirect avec un environnement contaminé ou les mains contaminées du

personnel (Larson, 2007). Certaines clones transfèrent plus facilement leurs éléments

génétiques mobiles et portent aussi souvent des facteurs de virulence qui facilite leur

diffusion épidémique et contribue à l’augmentation de la résistance à grande échelle

(Johnson et al, 2009).

La fréquence de voyages internationaux, le commerce et même le tourisme médical ont

contribué à la dissémination de la résistance aux antimicrobiens en permettant aux

microbes résistants de se répandre dans le monde avec facilité (Hill, 2001). Plusieurs

pays sont endémiques pour certains micro-organismes résistants et sont une source

centrale comme il sera abordé dans la section 1.7.1.

Finalement, en dehors d'un usage médical, l'utilisation de divers agents antimicrobiens

chez les animaux, que ce soit pour usage thérapeutique ou comme facteur favorisant la

croissance, peut conduire au développement de micro-organismes résistants aux agents

antimicrobiens qui sont ensuite transmis à l'homme, le plus souvent par le biais des

produits alimentaires (Vidaver, 2002).

1.6.4 Résistance aux β-lactamines chez les bactéries à Gram négatif

L‘ensemble des facteurs précédemment présentés a induit une expansion du phénomène

de résistance aux antibiotiques au point où nous faisons actuellement face à un problème

répandu de multirésistance aux antibiotiques. Cette problématique est d’autant plus

menaçant considérant le nombre très limité de nouveaux agents antimicrobiens

qui sont en développement (Boucher et al., 2009). Il y a quelques années l’importance de

la résistance étaient principalement concentrée chez les bactéries à Gram positif tel que

pour SARM (Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline) et ERV (Entérocoques

résistants à la vancomycine) (CDC, 2103). Toutefois, la résistance aux bactéries à Gram

négatif a pris de l’importance les dernières années. En effet, l’Infectious Diseases Society

of America a récemment relevé six bactéries regroupées sous le nom « ESKAPE » dont

24

Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter

baumannii, Pseudomonas aeruginosa et les espèces d’Enterobacter qui sont responsables

des deux-tiers des infections acquises en milieu hospitalier et dont les deux-tiers sont des

bactéries à Gram négatif (Boucher et al., 2009). De fait, l’OMS identifie ce phénomène

comme une menace de santé publique majeure (WHO, 2009-2010). Les antibiotiques de

la classe des β-lactamines, qui représentent à eux seuls 60% des prescriptions

d’antibiotiques notamment utilisées dans le traitement des infections causées par les

bactéries à Gram négatif (voir section 1.5.2) n’échappent pas à cette réalité, Le taux de

mortalité associé à une infection bactérienne par une souche à Gram négatif résistante

aux β-lactamines est de 2 à 4 fois plus élevé que celui associé à une infection causée par

une souche sensible (ReAct, 2012). La résistance aux β-lactamines chez les bactéries à

Gram négatif peut être causée par plusieurs mécanismes décrits de manière générale dans

le Tableau 5 mais est majoritairement causée par un mécanisme d’inactivation

enzymatique, soit par l’hydrolyse du noyau β-lactame par l’action d’une β-lactamase

(Bush et Jacoby, 2010). Au cours des 70 dernières années, l'utilisation des β-lactamines,

incluant les nouvelles β-lactamines comme les C3G et les carbapénèmes, ayant un spectre

d’action de plus en plus large envers les bactéries à Gram négatif, a sélectionné des

enzymes de type β-lactamases, chacune plus puissante que la précédente.

1.6.4.1 Les β-lactamases

Le terme β-lactamase se réfère aux enzymes produites par les micro-organismes capables

d’hydrolyser le noyau β-lactame. À ce jour, plus de 1300 β-lactamases ont été identifiées

(Bush, 2013). Chez les bactéries à Gram négatif, les gènes codant pour ces enzymes sont

soit d’origine chromosomique ou plasmidique.

1.6.4.1.1 Mode d’action

Les β-lactamases sont des enzymes bactériennes qui agissent en hydrolysant la liaison

amide du cycle β-lactame des antibiotiques de la classe des β-lactamines formant ainsi un

acyl-enzyme, qui sera dégradé en acide inactif (Figure 6). Cette action est irréversible, ce

qui entraîne donc la perte complète de l’activité antibactérienne de l’antibiotique. Les β-

lactamases sont sécrétées dans l’espace périplasmique chez les bactéries à Gram négatif.

25

Cette localisation particulière permet aux enzymes d’agir directement sur les β-

lactamines, avant que celles-ci n’aient le temps de rencontrer leurs cibles, les PLPs,

situées dans la membrane cytoplasmique. Les β-lactamases ont une vitesse d’hydrolyse

très efficace, soit de 1000 cycles β-lactame par seconde, comparativement aux PLPs

ayant une capacité d’hydrolyse d’un cycle β-lactame par heure (Ghuysen, 1990; Massova

& Mobashery, 1998; Suvorov et al, 2007).

Figure 6. Réaction d’inactivation d’une β-lactamine par l’action d’une β-lactamase.

L’ouverture du cycle à quatre membres rompt la fonction amide imitant la chaîne

peptidique (D-alanine-D-alanine) formant les liaisons dans le peptidoglycane.

Classification des β-lactamases

Les β-lactamases peuvent être divisées selon 2 classifications soit celle d’Ambler, basée

sur la structure primaire des enzymes (Ambler, 1980) ou celle élaborée par Bush-Jacoby-

Meideros qui repose sur les caractéristiques fonctionnelles des enzymes (Bush et al,

1995 ; Bush et Jacoby, 2010, http://www.lahey.org/Studies/). Les quatre classes

moléculaires (A, B, C et D) possèdent leurs propres caractéristiques relativement à la

séquence primaire de chaque β-lactamase. En contrepartie, les classes fonctionnelles

particulières à une enzyme présente l’information utile au clinicien pour la prescription

d’une antibiothérapie efficace selon leur profil de substrat et d’inhibiteurs.

La Figure 7 présente les quatre principales classes moléculaires de β-lactamases (A-D),

qui sont divisées en groupes fonctionnels.

β-lactamine active β-lactamine inactive

26

Figure 7. Schéma des classes moléculaires et fonctionnelles des principales β-

lactamases. Adapté de Bush. (2013). Les classes A, C et D présentent une homologie

structurale suffisante pour affirmer qu’ils descendent d'un ancêtre commun. Les MLBs

hydrolysent le cycle β-lactame par un processus enzymatique qui est nettement différent

de celui des β-lactamases à sérine active. Les MBLs sont donc regroupées séparément

(classe B). Les groupes fonctionnels se distinguent par un profil de substrats spécifiques à

l’enzym et possèdent un profil d’inhibition particulier. AC : Acide clavulanique Cb :

Carbapénèmes; Cf : Céphalosporines de 1ère et 2ème génération; EDTA :

β-lactamases

Sérine Site actif Métallo (Zn)

C D A B Classe moléculaire

Principaux sous-groupes fonctionnels

1 2 2d 3 Groupe fonctionnelle

1 1e 2a 2b 2be 2br 2f 2de 2df 3a 3b

Enzymes ou familles d’enzymes représentatives

Profil d’inhibition

--

AC EDTA

-- -- --

+ + + -- +/- +/- +/- ---- -- ---- -- -- -- -- + +

AmpC CMY

GC1 PC1 TEM-1SHV-1

CTX-MBLSEs (TEM, SHV)

CphA IMP, VIM, NDM

OXA-23 OXA-48

OXA-11OXA-15

KPCSME

IRTSHV-10

Substrats connus

Cf Cf Cse Pn

PnCf

Pn, Cf Cse, M

PnPn, Cf,

Cb, Cse, M

Pn, Cse, M

Pn Cb

Pn, Cf Cb, Cb

27

Ethylenediaminetetraacetic acid; Cse : Céphalosporines à spectre étendu; M :

Monobactames; Pn : Pénicillines.

Les enzymes de la classe A, C (β-lactamases AmpC) et D (β-lactamases OXA) agissent

par un mécanisme de sérine active. Les enzymes de la classe B, également appelées

métallo-β-lactamases (MBLs), contiennent un ion zinc (Zn2+) dans leur site actif pour

catalyser l’hydrolyse du cycle β-lactame. Les trois classes de β-lactamases à sérine active

ont évolué indépendamment des MBLs. Au niveau moléculaire, les MLBs sont un groupe

hétérogène de protéines, classées en trois sous-groupes soit B1, B2 et B3, selon les

similitudes de séquence et la spécificité des substrats (Galleni et al. 2001) (Garau et al.

2004). La caractéristique structurale particulière des sous-classes B1 et B3, est la

présence de deux ions Zn2+ impliqués dans l’hydrolyse des β-lactamines, tandis que la

sous-classe B2 utilise un seul ion Zn2+ pour l'activité enzymatique maximale (Valladares

et al., 1997). La sous-classe B2 a un spectre étroit de substrat limité aux carbapénèmes

(Valladares et al., 2000), tandis que les sous-classes B1 et B3 ont des spectres de substrat

plus larges, où la sous-classe B3 montre une activité préférentielle pour les

céphalosporines (Bush & Fisher, 2011; Thomson, 2010). La sous-classe B1 contient pour

sa part les enzymes IMP, VIM et NDM, codés par des gènes localisés sur des éléments

génétiques mobiles. Ces derniers sont majoritairement responsables de la diffusion des

MBLs. Une différence structurale majeure de l’enzyme NDM-1 a nécessité la division de

la sous-classe B1 en sous-groupes B1a et B1b. La β-lactamase NDM-1 est classée dans le

sous-groupe B1b tandis que les β-lactamases IMP et VIM sont classées dans le sous-

groupe B1a.

La classe moléculaire C est associée à deux sous-groupes fonctionnels, 1 et 1e, qui ont la

capacité d’hydrolyser efficacement les céphalosporines de première et deuxième

génération et sont peu affectés par les inhibiteurs de β-lactamases (Bush & Jacoby, 2010).

Les classes moléculaires A et D regroupent la classe fonctionnelle 2, constitué de

plusieurs sous-groupes qui englobent l'hydrolyse globale de toutes les β-lactamines.

Parmi ces sous-groupes, les sous-groupes 2be et 2f sont composés d’enzymes

responsables d’une importante diffusion de la résistance aux β-lactamines à l’échelle

mondiale. Le sous-groupe 2be comprend les enzymes capables d’hydrolyser les

28

pénicillines et l’ensemble des céphalosporines (de la 1ère à la 4ème génération). Elles sont

inhibées par l’acide clavulanique mais sont insensibles à l’EDTA. Ce profil de résistance

correspond aux BLSE, majoritairement représentés par les enzymes de type CTX-M et

certains de type SHV et TEM. Le sous-groupe 2f comprend les enzymes capables

d’hydrolyser les pénicillines, l’ensemble des céphalosporines (de la 1ère à la 4ème

génération) et les carbapénèmes. Elles sont inhibées par l’acide clavulanique mais

présentent des niveaux variables de sensibilité à l’EDTA. L’enzyme de ce sous-groupe

d’une importance au niveau épidémiologique est KPC. La classe moléculaire D est

composé de deux sous-groupes fonctionnels soit 2de et 2df. Le sous-groupe 2de

comprend les enzymes capables d’hydrolyser les pénicillines et les céphalosporines à

large spectre (3ème et 4ème génération) tandis que les enzymes du sous-groupe 2df

hydrolysent les pénicillines et les carbapénèmes. Dans les deux cas, elles sont inhibées

par l’acide clavulanique mais présentent des niveaux variables de sensibilité à l’EDTA.

Bien que ces β-lactamases soient souvent sous-estimées, elles provoquent une résistance

sérieuse chez les bactéries telles qu’Acinetobacter baumannii et Pseudomonas

aeruginosa (Walther-Rasmussen & Høiby, 2006).

La classe moléculaire B est composé de 2 sous-groupes fonctionnels soit 3a et 3b. Le

sous-groupe 3a est caractérisé par une résistance aux pénicillines, à l’ensemble des

céphalosporines (de 1ère à la 4ème génération) et aux carbapénèmes. Ce profil de résistance

correspond aux principales carbapénémases du type IMP, NDM et VIM. Les enzymes du

sous-groupe 3b hydrolysent, pour leur part, les carbapénèmes. Dans les deux cas, les

enzymes de ces sous-groupes sont insensibles à l’acide clavulanique mais sont inhibées

par l’EDTA (Bush & Jacoby, 2010).

Relativement à l’importance épidémiologique de certaines enzymes à l’échelle mondiale

de même que leur importance clinique, mon projet de maîtrise porte principalement sur

les BLSE et les carbapénémases.

29

1.7.1 β-lactamases à spectre étendu

Les infections causées par des bactéries productrices de BLSE sont associées à un taux

d’échec thérapeutique et de mortalité élevé (Oteo et al, 2010; Tumbarello et al, 2006).

Les BLSE sont des enzymes à large spectre d’action capables d’hydrolyser les

pénicillines, toutes les générations de céphalosporines ainsi que les monobactames et sont

inhibés par l’acide clavulanique. En contrepartie, les BLSE n’ont aucune action sur la

céphamycine (β-lactamines différant des céphalosporines par la présence d’un

groupement 7α-methoxy) et les carbapénèmes. Le Tableau 7 présente le profil de

résistance aux β-lactamines conféré par les principales BLSE. Les méthodes

phénotypiques de détection de production de BLSE sont majoritairement basées sur la

résistance aux C3G et de la sensibilité aux inhibiteurs de β-lactamases (Section 1.9.1.2).

Tableau 7. Phénotypes de résistance aux β-lactamines associés à la production des principales BLSE de types SHV, TEM et CTX-M.

Tableau adapté de Livermore et al. (2012).

Des bactéries productrices de β-lactamases de types TEM-1, TEM-2 et SHV-1

caractérisées par leur capacité à hydrolyser les pénicillines et les céphalosporines de

première et deuxième génération ont été identifiées au début des années 1980. Afin de

traiter les infections causées par ces bactéries résistantes, les céphalosporines de 3e

génération ont été introduites en pratique clinique (Grall et al, 2011). Toutefois,

subséquemment à l’utilisation des C3G, une première bactérie productrice de BLSE de

l’espèce Klebsiella pneumoniae a rapidement été identifiée en Allemagne (Knothe et al,

1983). Les premières BLSE répertoriées étaient issues de substitutions d'acides aminés

dans le site actif des enzymes TEM-1, TEM-2 et SHV-1. Jusqu’à la fin des années 1990,

la majorité des BLSE de types SHV et TEM étaient responsables d’infections

Profil de résistance aux β-lactamines conféré par les BLSE

Enzymes Classe

d'Ambler Pénicillines Monobactames

C1G et C2G

C3G et C4G

Inhibiteurs de β-

lactamases Carbapénèmes

SHV/TEM/ CTX-M

A R R R R S S

30

nosocomiales et diffusaient de façon clonale entre les patients hospitalisés. Cependant, le

début des années 2000 a été marqué par l’émergence et la dissémination globale d’un

nouveau type de BLSE. En effet, la diffusion massive d’enzymes de type CTX-M a

modifié l’épidémiologie de la résistance à l’échelle mondiale.

Les BLSE de types SHV, TEM et CTX-M font toutes parties de la classe A d’Ambler.

Les gènes codant pour ces enzymes sont majoritairement portés par des éléments

génétiques mobiles, ce qui explique leur rapidité de dissémination (voir section 1.6.2.1).

1.7.1.1.1 TEM

À ce jour, plus de 200 enzymes de type TEM ont été décrites. Ce sont les mutations aux

positions 104, 164, 238 et 240 de ces enzymes qui sont principalement responsables de

leur spectre étendu. Aux États-Unis, les variants à spectre étendu de type TEM les plus

courants sont TEM-10, TEM-12 et TEM-26 (Munoz-Price & Jacoby, 2013).

1.7.1.1.2 SHV

Les enzymes de type SHV présentent également des changements d'acide aminés dans le

site actif, le plus souvent aux positions 238 et/ou 240. Plus de 160 enzymes de type SHV

ont été identifiées. Les variants les plus répandus au niveau mondial sont SHV-5 et SHV-

12 (Munoz-Price & Jacoby, 2013).

1.7.1.1.3 CTX-M

Contrairement aux enzymes de types SHV et TEM qui résultent de mutations dans le site

actif, les enzymes de type CTX-M sont un exemple de résistance obtenue par

l'acquisition d’un gène normalement retrouvé dans le chromosome du genre Kluyvera, un

micro-organisme issue de la flore normale. À ce jour, plus de 130 enzymes de type CTX-

M ont été décrites depuis la première description en 1989 (Cantón et al., 2012). Le gène

blaCTX-M a été retrouvé chez de nombreuses entérobactéries et tout particulièrement chez

Escherichia coli. En effet, la diffusion clonale d’Escherichia coli O25b-ST131 est

largement responsable de la résistance aux C3G dans plusieurs infections acquises en

milieu hospitalier et en communauté (Rogers et al., 2011). Les variants les plus communs

31

de cette enzyme sont CTX-M-15 et CTX-M-14. La Figure 8 montre l’épidémiologie

actuelle des variants de l’enzyme CTX-M dans différentes zones géographiques.

Figure 8. Répartition mondiale des différents variants de l’enzyme CTX-M. Figure

adaptée de Cantón & Coque (2006).

Certains pays, dont les États-Unis, rapportent des cas sporadiques d’isolement de CTX-

M. Toutefois, on constate une situation endémique dans la majorité des pays européens,

au Canada et en Amérique du Sud. Certaines enzymes sont spécifiques à certaines zones

géographiques; par exemple, les enzymes CTX-M-9 et CTX-M-14 sont prédominantes

dans les pays riverains de la Méditerranée et au Royaume-Uni, CTX-M-2 a été isolée

principalement en Amérique du Sud et au Japon, tandis que CTX-M-15 est répartie à peu

près partout dans le monde.

32

D’autres familles de BLSE plasmidiques, telles PER et VEB, ont été décrites. Elles sont

toutefois rares, principalement retrouvées chez l’espèce Pseudomonas aeruginosa et sont

limitées à certaines régions géographiques (Endimiani et al, 2006).

Bien que leur répartition soit mondiale, la prévalence de bactéries productrices de BLSE

varie grandement en fonction des différentes régions. En effet, une surveillance globale

réalisée en 2004 dans 28 pays a montré une prévalence des BLSE allant de 2,8 à 27,6 %

selon les différentes régions géographiques. Au Canada, les données épidémiologiques

montrent aussi une augmentation significative de 2000 à 2009 où la prévalence des BLSE

est passée de 0,1 à 1,1% pour Klebsiella pneumoniae et 0,3 à 14% pour Escherichia coli

(Lynch et al, 2013). Cette forte prévalence de BLSE a eu pour effet d’accroître

considérablement l’utilisation des carbapénèmes dans le traitement des infections

résistantes aux C3G, se traduisant donc par une pression accrue sur cette classe

d’antibiotique de dernière ligne (Bush, 2010). À ce jour, aucune donnée épidémiologique

sur les BLSE dans la ville de Québec n’était connue. Le Chapitre 4 présente les résultats

d’une étude épidémiologique sur la présence de gènes de BLSE dans deux hôpitaux de la

ville de Québec.

1.7.1.2 Carbapénémases

La dissémination mondiale des bactéries à Gram négatif productrices de BLSE a

contribué à une augmentation significative de la consommation de carbapénèmes et a

ainsi entraîné l’évolution de la résistance à ces antibiotiques. Les carbapénémases

constituent une famille de β-lactamases hétérogènes définie selon leur spectre d’activité

contre les carbapénèmes (Grall et al, 2011) et auquel est associé un taux de mortalité

entre 18 et 67%. Le Tableau 8 présente le profil de résistance aux β-lactamines conféré

par les principales carbapénémases.

33

Tableau 8. Phénotypes de résistance aux β-lactamines associés à la production des principales carbapénémases de types IMP, KPC, NDM, OXA-48 type et VIM. Tableau adapté de Livermore (2012).

Profil de résistance aux β-lactamines conféré par les carbapénémases

Enzymes Classe

d'Ambler Pénicillines Monobactames

C1G et C2G

C3G et C4G

Inhibiteurs de β-

lactamases Carbapénèmes

KPC A R R R R S R

IMP/NDM/VIM B R S R R R R

OXA-48 type D R R R S / I * R R

* Sensible à la ceftazidime, intermédiaire à la céfotaxime.

Les différentes carbapénémases appartiennent aux classes d’Ambler A, B et D. Les

multiples épidémies sporadiques et les situations endémiques répertoriées en milieu

hospitalier de même qu’en milieu communautaire sont majoritairement causées par des

bactéries productrices de carbapénémases de types IMP, KPC, NDM, OXA-48-like et

VIM, principalement en raison de leur efficacité de dissémination (Livermore, 2012). Tel

qu’observé pour les BLSE, la proportion des bactéries productrices de carbapénémases

varie grandement en fonction de la région géographique. Par exemple, on estime la

prévalence des bactéries productrices de carbapénémases autour de 3 à 5% en France,

comparativement à plus de 80% en Inde (Nordmann et al, 2011). Au Canada, on a aussi

remarqué une augmentation significative de carbapénémases entre 2008 et 2011, où 10

fois plus de cas d’infections causées par des entérobactéries productrices de

carbapénémases ont été répertoriées (Melano et al, 2012).

1.7.1.2.1 Carbapénémases de classe A

Il existe des carbapénémases de classe A chromosomiques (SME, NMC et IMI) et

plasmidiques (GES et KPC). Les enzymes de type KPC sont le plus souvent identifiées

parmi les carbapénémases de classe A et représentent une menace réelle pour l’efficacité

des traitements antibiotiques. La première bactérie de l’espèce Klebsiella pneumoniae

34

productrice de KPC a été identifiée en Caroline du Nord en 1996 (Yigit et al, 2001) et

s’est rapidement disséminée aux États-Unis, en Europe et au Moyen-Orient. Le clone

épidémique ST-258 de Klebsiella pneumoniae producteur de KPC a été identifié dans le

monde entier (Cuzon et al, 2010). D’autres clones sont répertoriés dans certaines zones

géographiques, mais dans tous les cas, le gène blaKPC est associé à un élément génétique

transposable particulier soit le transposon Tn4401 (Cuzon et al, 2010). Actuellement, la

mortalité chez les patients infectés par un micro-organisme producteurs de KPC s’élève à

plus de 50% (Borer et al., 2009; Patel et al., 2008; Schwaber et al., 2008). À ce jour, 12

variants de types KPC ont été répertoriés (KPC-2 à KPC-13). Les variants KPC-2 et

KPC-3 sont les plus fréquemment identifiés. Ces enzymes sont retrouvées parmi

différents genres de la famille des entérobactéries ainsi que chez Pseudomonas

aeruginosa et Acinetobacter baumannii.

1.7.1.2.2 Carbapénémases de classe B

Les carbapénémases de classe B, ou métallo-β-lactamases, originellement identifiées sont

des enzymes chromosomiques (BCII, Ccra, CphA et L1) présentes chez des bactéries

retrouvées dans l’environnement ou chez des pathogènes opportunistes. Toutefois,

n’étant pas transférables horizontalement, leur prévalence est demeurée aux espèces

portant ces gènes. La première MBL transférable (IMP-1) a été identifiée chez Serratia

marcescens au Japon en 1991 (Ito et al., 1995). Depuis, plusieurs MBLs transférables ont

été décrites à travers le monde dont les principales sont de types IMP, VIM et plus

récemment NDM (Livermore, 2012).

Les carbapénémases de types IMP et VIM sont désormais endémiques dans certains pays,

notamment en Grèce, à Taïwan et au Japon et sont également responsables de plusieurs

épidémies locales dans d’autres pays. La majorité des bactéries productrices de β-

lactamases de types IMP et VIM sont acquises en milieu hospitalier. Actuellement, 40

variants de IMP et 35 variants VIM ont été décrits (Jacoby & Bush, 2013-11-04). Le

variant VIM-2 est le plus fréquemment isolé. La transmission de ces gènes se fait

habituellement sous forme de cassettes incorporés à l’intérieur d’un intégron de classe 1.

35

Les β-lactamases de type NDM se distingue des autres MBLs. La première β-lactamase

de type NDM-1 a été isolée d’un patient précédemment hospitalisé à New-Delhi en 2008

(Yong et al., 2009). La dissémination de ces enzymes est alarmante, particulièrement en

raison de la présence de NDM-1 chez Escherichia coli ST-131, un clone épidémique

connu pour mobiliser efficacement la BLSE de type CTX-M-15 à l’échelle mondiale

(voir section 1.7.1.1.3). D’ailleurs, certains craignent que NDM-1 deviennent une

nouvelle CTX-M-15 d’un point de vue épidémiologique (Walsh, 2010). Actuellement, sa

présence a été notée dans les 5 continents mais plus particulièrement au Moyen-Orient

(Figure 9). D’autres facteurs justifient également la préoccupation de la santé publique

par rapport à cette enzyme, à savoir, la dimension du réservoir des porteurs

asymptomatiques au Moyen-Orient. D’autres enzymes de type NDM (2-3-4-5-6-7-8-9)

ont été identifiées mais elles demeurent toutefois moins importantes actuellement au

niveau épidémiologique. D’autres MBLs tels SPM, GIM et SIM sont répertoriées de

façon sporadique dans un périmètre restreint à leur pays d’origine (Queenan & Bush,

2007).

L’activité des MBLs est inhibée par l’EDTA, qui chélate les ions zinc présents au niveau

du site actif. Cette caractéristique est utilisée dans la détection phénotypique de

production de carbapénémases (voir section 1.8.1.3). Le taux de mortalité associé à une

infection causée par un micro-organisme producteur de MBL varie entre 18% et 67%

(Daikos et al, 2009).

36

Figure 9. Distribution géographique des bactéries productrices de NDM-1. Tiré de

Nordmann et al., 2011. Des bactéries productrices de NDM-1 ont été décrites dans cinq

continents, où la plupart des cas sont liés à des voyages en Inde, au Pakistan et au

Bangladesh.

1.7.1.2.3 Carbapénémases de classe D

Bien que les β-lactamases de la classe D aient été principalement identifiées chez

l’espèce Acinetobacter baumannii, la production de β-lactamases de type OXA-48 est

caractéristique aux entérobactéries. Le taux de mortalité associé à une infection causée

par un micro-organisme producteur d’OXA-48 est d’environ 50% (Lowman &

Schleicher, 2014)

La première identification du gène blaOXA-48 a été au sein d’une bactérie de l’espèce

Klebsiella pneumoniae isolée à Istanbul, en Turquie, en 2001 (Poirel et al. 2004). Depuis,

neuf autres enzymes de type OXA-48 (162-163-181-199-204-232-244-245-247-370) ont

été retrouvées chez d’autres espèces bactériennes et ont été rapportées en Turquie, puis en

37

Belgique, en France, au Liban, en Egypte, en Israël, au Sénégal, au Maroc et en Tunisie.

Les carbapénémases de types OXA-48 se sont propagées à partir de Klebsiella

pneumoniae à d'autres entérobactéries et des régions du Moyen-Orient vers l'Europe,

l'Asie et, plus récemment, l'Amérique du Nord (Mataseje et al., 2013 et Poirel et al.,

2013).

Le gène blaOXA-48-like est situé sur un transposon et encadré de deux SI. Ces β-lactamases

ne sont pas inhibées par l'acide clavulanique, le tazobactame et le sulbactame (mis à part

quelques exceptions), alors que leur activité peut être inhibée in vitro par le NaCl.

Mon projet de maîtrise porte principalement sur les enzymes décrites précédemment soit

SHV, TEM et CTX-M pour les BLSE et de types KPC, IMP, NDM, OXA-48 et VIM

pour les carbapénémases.

Méthode de détermination de la sensibilité à un

antibiotique

Lors d’une infection bactérienne, le médecin prescrit le prélèvement d’un échantillon

clinique approprié dans le but d’identifier le micro-organisme présent et ensuite procéder

à certains tests de sensibilité aux antimicrobiens. L'objectif des tests de sensibilité aux

antimicrobiens est d’orienter le médecin dans le choix de l’antibiotique ou de prédire le

succès ou l'échec thérapeutique in vivo de l'antibiothérapie prescrite. Cette section

présente les principales méthodes actuellement disponibles pour déterminer la sensibilité

aux antibiotiques. Elles sont divisées en deux catégories soit les méthodes phénotypiques

et les méthodes génotypiques.

1.8.1 Méthodes phénotypiques

Les différentes méthodes de microbiologie classique dont font partie les épreuves de

sensibilité aux antibiotiques actuelles continuent de s'appuyer principalement sur les

méthodes de culture basées sur des principes qui remontent à la fin du 19e siècle. En

effet, les méthodes phénotypiques de détermination de la sensibilité aux antibiotiques

sont réalisées en exposant une quantité connue de la bactérie naturellement active à une

38

concentration connue d’un agent antimicrobien. Suite à l’incubation, le niveau

d'inhibition de croissance bactérienne permet de déterminer la concentration minimale

inhibitrice (CMI) et de comparer à des valeurs préalablement établies pour chacun des

antibiotiques afin d’établir le niveau sensible, intermédiaire ou résistant de la bactérie.

L'interprétation des résultats permet de connaître le profil de sensibilité (sensible,

intermédiaire, résistant) aux antibiotiques de la bactérie.

1.8.1.1 La concentration minimale inhibitrice (CMI)

La concentration minimale inhibitrice (CMI) se définie comme la concentration la plus

faible d’un antibiotique capable d’empêcher la croissance visible d’une bactérie

particulière dans un milieu de croissance spécifique (Prescott et al., 2010). Les différents

tests permettant de déterminer ces valeurs sont effectués in vitro selon des conditions

normalisées de sorte que les résultats soient reproductibles. Les valeurs des CMI

obtenues sont ensuite comparées aux concentrations critiques de chaque antibiotique

préalablement déterminées à l’aide d’une souche contrôle par diverses institutions

nationales telles que le Clinical Laboratory Standard Institute (CLSI) aux États-Unis

(CLSI, 2013) et The European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing

(EUCAST, 2013). Ces seuils permettent de classer la bactérie testée dans l'une des

catégories cliniques suivantes soit sensible (S), intermédiaire (I) ou résistante (R). Elle

s’exprime en mg/l ou μg/ml.

- Sensible : Une souche sensible peut être atteinte par l’antibiotique par un

traitement à dose habituelle par voie générale. Les souches bactériennes

catégorisées S sont celles pour lesquelles la probabilité de succès thérapeutique

est forte.

- Intermédiaire : Une souche intermédiaire signifie que l'organisme n'est pas

complètement sensible à l’antibiotique. Les souches intermédiaires forment un

ensemble hétérogène pour lequel les résultats obtenus in vitro ne sont pas

prédictifs d’un succès thérapeutique. Le médicament peut être efficace que si des

doses plus élevées sont utilisées, le médicament est administré pendant une longue

période, ou l'infection est localisée dans une zone où peuvent être acheminés des

39

concentrations élevées de médicaments. Les souches catégorisées I sont celles

pour lesquelles le succès thérapeutique est imprévisible.

- Résistant : la bactérie est résistante à l’antibiotique lorsque sa croissance n’est pas

affectée par la présence de l’agent. Les souches catégorisées R sont celles pour

lesquelles il existe une forte probabilité d’échec thérapeutique quels que soient le

type de traitement et la dose d’antibiotique utilisée. Ainsi, un autre antibiotique

doit être utilisé pour le traitement.

1.8.1.2 Méthodes phénotypiques pour la détection de la production de BLSE

Différents tests phénotypiques spécifiques ont été mis au point pour détecter la

production de BLSE. Chacun d’entre eux est basé sur l'utilisation d’une céphalosporine

de 3e génération, habituellement la céfotaxime ou la ceftazidime, de même qu’un

inhibiteur de β-lactamase, généralement l’acide clavulanique.

1.8.1.2.1 Test de double synergie

Le test de double synergie est la première méthode décrite pour déterminer la production

d’une BLSE chez les entérobactéries (Jarlier et al., 1988). Le test est considéré comme

positif lorsqu’il y a une augmentation nette de la zone d'inhibition d’une C3G (ex. :

ceftazidime) en direction du disque contenant de l’acide clavulanique (Figure 10). Les

valeurs de sensibilité et spécificité associées à cette méthode sont respectivement de

94.1% et 81.4% (Wiegand et al., 2007).

40

Figure 10. Test de double synergie. Le disque contenant de la ceftazidime (CAZ) et un

contenant de l’amoxiciline / acide clavulanique (AMC) sont placés à une distance de 30

mm l’un de l’autre. La zone d'inhibition autour du disque de ceftazidime est augmentée

en direction du disque d’acide clavulanique, ce qui indique une synergie entre la

ceftazidime et l’acide clavulanique.

1.8.1.2.2 Bandelettes Etest® BLSE

Les bandelettes Etest® BLSE contiennent un gradient de C3G à une extrémité de la

bande et un gradient d’une C3G combinée avec l’acide clavulanique à l'autre extrémité.

Le test est positif lorsque la valeur de la CMI de l’antibiotique testé est réduite de plus de

trois dilutions en présence de l'acide clavulanique (Cormican et al., 1996).

L’interprétation des résultats des bandes de Etest® BLSE est délicate et nécessite une

expertise particulière. Les valeurs de sensibilité et spécificité associées à cette méthode

sont respectivement de 94.1% et 84.7% (Wiegand et al., 2007).

41

Figure 11. Bandelettes Etest® BLSE. Le système E-test® se réfère à une bande calibrée

par un gradient d’antibiotiques dont la concentration de 15 dilutions est pré-établie afin

de déterminer la CMI en μg/ml d’une souche testée en milieu gélosé. Le gradient couvre

une gamme de concentrations allant de 0,016 à 256 μg/ml ou 0,002 à 32 μg/ml selon

l’antibiotique. La zone d’inhibition délimitera la valeur de la CMI.

1.8.1.2.3 Méthode des disques combinés

Le principe de la méthode des disques combinés consiste à mesurer la zone d'inhibition

autour d'un disque de céphalosporine et le diamètre d'un disque de la même

céphalosporine additionné d’acide clavulanique. Une différence de plus de 5 mm entre

les deux zones d’inhibition démontre la production d’une BLSE (Carter et al., 2000)

(Figure 12). Cette méthode est recommandée par le CLSI en raison de sa simplicité

d’exécution et d’interprétation des résultats de même qu’une meilleure performance de

sensibilité (92.9%) et de spécificité (96.6%) par rapport aux autres tests phénotypiques

(Wiegand et al., 2007).

42

Figure 12. Méthode des disques combinés. Céfotaxime (Ctx) / Ctx + Acide

clavulanique (Cla), Ceftazidime (Caz) / Caz + Acide clavulanique (Cla). Une

augmentation de > 5 mm du diamètre d’inhibition entre les disques avec et sans Cla

montre une production de BLSE.

1.8.1.2.4 Méthodes automatisées

L’essai BLSE VITEK (bioMérieux) est basé sur l'évaluation simultanée de l'activité

antibactérienne de plusieurs C3G mesurée seules ou en présence d’acide clavulanique. Le

dispositif VITEK mesure la turbidité à intervalle régulier. La proportion de la baisse de

croissance dans les puits contenant une C3G seule est comparée avec ceux où la C3G est

en présence d’un inhibiteur de β-lactamase. L’interprétation est réalisée par le système

informatisé intégré. Les valeurs de sensibilité et spécificité associées à cette méthode sont

respectivement de 85.9% et 78.0% (Wiegand et al., 2007).

1.8.1.3 Méthodes phénotypiques pour la détection de la production de

carbapénémases

Ils existent également différents tests phénotypiques pour la détection de la production de

carbapénémases. En raison de la variabilité de leurs propriétés phénotypiques, ces tests

sont, par exemple, basés sur l'inhibition de la croissance bactérienne par le tazobactame,

l'acide clavulanique ou l'acide borique pour détecter la production de carbapénémases de

classe A (KPC), l’inhibition par l’EDTA pour la détection de l’activité des MBLs (IMP,

NDM et VIM) et du NaCl pour les types OXA-48 (Livermore, 2012).

Ctx 

Caz 

Ctx+Cla

Caz+Cla

43

1.8.1.3.1 Test de Hodge modifié

Le test de Hodge modifié est la méthode actuellement recommandée par le CLSI comme

méthode phénotypique générale de détection de la production de carbapénémases. Elle

est basée sur l'inactivation d'une carbapénème par une souche productrice de

carbapénémase permettant à une souche contrôle (sensible à l’antibiotique) de prolonger

sa croissance vers le disque contenant l’antibiotique, au long de la strie de l'inoculum de

la souche testée (Figure 13).

Figure 13. Test de Hodge modifié. 1 : Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1705

(Contrôle positif), 2 : Klebsiella pneumoniae ATCC BAA-1706 (Contrôle négatif), 3 :

Souche testée présentant une production de carbapénémase.

Plusieurs autres tests ont été développés, basés sur les caractéristiques propres à chaque

classe d’enzymes. Parmi ceux-ci, on retrouve les tests de Rosco Diagnostica Neo-

Sensitabs™. Plus particulièrement, la trousse de confirmation KPC/MBL, OXA-48 ®

(Rosco Diagnostica) permet de distinguer la production de carbapénémases de la

surproduction d’une céphalosporinase ou de BLSE couplées à une modification des

porines. Quatre disques contenant respectivement du méropénème, du méropénème

couplé à de l’acide dipicolinique (DPA, inhibiteur des enzymes de classe B), du

méropénème couplé à de l’acide aminophénylboronique (ABPA, inhibiteur des enzymes

44

de classe A) et du méropénème couplé à de la cloxacilline (inhibiteur des

céphalosporinases hyperproduites) sont utilisés. Ils seront déposés sur une gélose Mueller

Hinton sur laquelle a préalablement été ensemencée en culture confluente d’une

suspension calibrée à 0.5 Mc Farland de la souche à tester. Le résultat est ensuite

déterminer en utilisant un algorithme particulier basé sur la comparaison de l’inhibition

de chacun des disques (Figure 14).

Figure 14. Test de Rosco Diagnostica Neo-Sensitabs™. MRP10 : méropénème,

MR+CL : méropénème et cloxacilline, MR+DP : méropénème et ABPA : Acide

aminophénylboronique.

1.8.1.4 Limitations associées aux méthodes phénotypiques

Les méthodes phénotypiques actuellement utilisées pour l’identification des bactéries

productrices de carbapénémases manquent de sensibilité, de spécificité et sont parfois

difficiles à interpréter. De plus, le temps requis pour obtenir un résultat (48-72h) par ces

méthodes est peu adapté pour un diagnostic rapide, une optimisation du choix de

l’antibiothérapie et une surveillance efficace de la résistance. C’est pourquoi, au cours

des dernières années, de nombreuses méthodes génotypiques pour détecter la résistance

aux antibiotiques ont été développés.

45

1.8.2 Méthodes génotypiques

Il existe plusieurs méthodes génotypiques dont la réaction de polymérisation en chaîne

(PCR) et l’hybridation sur biopuces. La méthode de PCR est celle la plus utilisée dans les

essais diagnostiques.

1.8.2.1 Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)

La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) permet d’amplifier de façon exponentielle

une séquence spécifique d’acides nucléiques. Le mélange réactionnel doit être composé

d’une ADN polymérase (Taq polymérase) et d’amorces spécifiques à la séquence à

amplifier afin de produire un brin d'ADN complémentaire agissant à titre de matrice pour

le cycle suivant. Chaque cycle comprend trois étapes qui se succèdent dans un

thermocycleur soit la dénaturation, l’hybridation et l’élongation. La dénaturation de

l'ADN repose sur une augmentation de la chaleur à 95 °C afin de séparer les deux brins

d'ADN. L'ADN passe sous forme de simple brin et chacun des brins peut alors servir de

matrice pour les prochains cycles PCR. La température est ensuite abaissée (50-65°C)

pour l'hybridation des amorces (Kàmpke et al., 2001). L'élongation se déroule

généralement à 72°C. Cette étape permet aux ADN polymérases d'allonger les amorces

en incorporant les dNTPs complémentaires (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) de la séquence

de la matrice à laquelle elle s'hybride. Le brin d'ADN est synthétisé dans le sens 5-3' (de

Mello, 2003). Les cycles sont généralement répétés de 25 à 45 fois l'un après l'autre. La

PCR permet de produire une grande quantité d'amplicons équivalant à des millions de

copies du fragment d'ADN ciblé. Ainsi, la détection d’une séquence d’acides nucléiques

qui étaient au préalable en faible quantité, peut être réalisée. L’une de ces méthodes est le

PCR en temps réel.

1.8.2.1.1 PCR en temps réel

La PCR en temps réel utilise le principe de base de la PCR classique. Toutefois, le

thermocycleur contient un détecteur de fluorescence qui mesure directement la quantité

d'amplicons produits durant les cycles d'amplification grâce à des marqueurs fluorescents

qui émettent une quantité de fluorescence proportionnelle au nombre de molécules

46

d'ADN présentes dans les échantillons. Cette technique permet de détecter la quantité

d'ADN cible en utilisant, par exemple, une sonde fluorescente de type TaqMan® qui

s'hybride sur son ADN cible (Bustin et al. 2010).

1.8.2.1.1.1 PCR multiplex en temps réel

La PCR multiplexe est une technique PCR permettant l'amplification et la détection de

différentes cibles d’ADN dans une seule et même réaction. La sélection des paires

d'amorces permettant d'amplifier les différentes cibles de même que les sondes de

détection doivent être dessinées en vue de minimiser les interactions possibles entre elles

qui pourraient affecter l’efficacité de la réaction. En effet, il est essentiel d’optimiser

chacun des paramètres dans le but de conserver les 4 paramètres cruciaux pour le

développement de tests diagnostiques soit la rapidité, la sensibilité, la spécificité et

l’ubiquité (Boissinot & Bergeron, 2002).

1.8.2.1.1.2 Tests PCR pour la détection des carbapénémases

À ce jour, il existe quelques tests développés pour détecter les gènes de carbapénémases

chez les bactéries à Gram négatif. Les gènes qui sont le plus fréquemment ciblés codent

pour les β-lactamases de types KPC, IMP, NDM, OXA-48 et VIM. Le tableau 9 présente

les différents essais PCR multiplex développés au cours des dernières années pour la

détection des principales carbapénémases.

Toutefois, malgré le fait que quelques essais PCR aient été développés pour détecter les

carbapénémases, il existe peu d’essais multiplex en temps réel rapide permettant de

détecter l’ensemble des gènes codant pour les β-lactamases KPC, IMP, NDM, OXA-48-

like, VIM et leurs variants, qui sont les plus importants au point de vue clinique, et ce,

directement à partir d’un échantillon clinique. De plus, la majorité de ces tests nécessite

plusieurs étapes et plus 3 heures avant l’obtention des résultats. Un essai PCR rapide,

sensible, ubiquitaire et spécifique a été développé pour la détection des carbapénémases

directement à partir d’échantillons de selles dans le cadre de mes travaux de maîtrise et

est présenté au Chapitre 3.

47

Tableau 9. Exemples de tests moléculaires rapides visant la détection de gènes de

résistance associés à la production de carbapénémases chez les bactéries à Gram

négatif.

Impacts de la résistance aux antibiotiques : Ère post-

antibiotique

La période entre les années 1950 et 1980 constitue l’âge d’or de la découverte de

nouvelles classes d’antibiotiques. Or, depuis 2000, seulement deux nouvelles classes

d’antibiotiques ont été introduites pour usage thérapeutique chez l’humain (Bassetti et al.,

2013). Bien que de nombreux antibiotiques semblent encore efficaces, les options

thérapeutiques pour certaines infections deviennent de plus en plus limitées, tel que le

démontre la situation actuelle des bactéries à Gram négatif multirésistantes productrices

de BLSE et de carbapénémases. Ainsi, l’important succès de l’ère antibiotique est

maintenant menacé. En effet, la situation est doublement préoccupante puisque d’un côté,

il y a propagation rapide des bactéries multirésistantes aux antibiotiques de grande

Gène de résistance Méthode moléculaire Échantillons

cliniques Références

blaIMP-1,2, blaGES, blaKPC, blaVIM-1,2, blaOXA-23(like), blaOXA-48(like) et blaNDM

PCR en temps réel à base de SYBR-Green

Non Monteiro et

al. 2011

blaKPC, blaOXA-48 (incluant blaOXA-

162,-181,-204), blaVIM (excepté blaVIM-7) et blaNDM

PCR en temps réel (Check-Direct CPE)

Selles Nijhuis et al. 2013

blaKPC, blaNDM et blaVIM PCR en temps réel (Xpert MDRO assay)

Selles Tenover et

al. 2013

blaVIM, blaIMP, blaNDM, blaKPC, et blaOXA-48

PCR en temps réel (hyplex SuperBug ID)

Sang Kasse et al.

2012

blaIMP, blaVIM, blaNDM, blaSPM, blaAIM, blaDIM, blaGIM, blaSIM, blaKPC, blaBIC et blaOXA-48

PCR en temps réel Non Poirel et al.

2011

blaNDM-1 PCR en temps réel Selles Naas et al.

2012

blaOXA-48 PCR en temps réel Selles Naas et al.

2012

48

importance clinique à l’échelle mondiale qui sont associées à un taux de mortalité et

morbidité élevé et de l’autre, un manque de nouveaux antibiotiques sur le marché pour

faire face à l’apparition de ces résistances. Plusieurs agences et sociétés professionnelles

ont attiré l’attention sur le manque flagrant de nouveaux antibiotiques (OMS, 2001;

ECDC/EMEA, 2009; IDSA, 2004), spécialement pour les bactéries à Gram négatif

multirésistantes (Bassetti et al., 2013). Selon plusieurs experts, cette situation nous

achemine vers une ère post-antibiotique.

L’Organisation mondiale de la Santé a envoyé un message clair pour signifier l’ampleur

et l’urgence du problème en consacrant la Journée mondiale de la Santé 2011 au thème

de la résistance bactérienne avec le slogan « pas d’action aujourd’hui, pas de guérison

demain ». Soixante-dix ans après l’utilisation généralisée de la pénicilline qui a

révolutionné le traitement des maladies infectieuses, de nombreux spécialistes craignent

que les antibiotiques appropriés ne soient plus disponibles afin de traiter ceux qui en ont

le plus besoin. De plus, un grand nombre d’innovations de la médecine moderne

deviendraient impossibles si survient la perte de la capacité à traiter les infections. Les

stratégies à adopter pour contrôler l’évolution de ces bactéries résistantes sont :

1. Le contrôle des infections par un diagnostic rapide

2. Une surveillance épidémiologique accrue

3. Une utilisation plus appropriée des antibiotiques actuels

4. Le développement de nouveaux antibiotiques

Ces stratégies pourraient, entre autre, mener à une utilisation des antibiotiques seulement

lorsque nécessaire et, dans ce cas précis, pourrait permettre de sélectionner l’antibiotique

approprié à la bonne dose, fréquence et durée afin d’optimiser les résultats, tout en

minimisant les effets indésirables.

49

Chapitre 2

Problématique, objectifs de recherche et contributions scientifiques

51

Problématique

Les maladies infectieuses sont répertoriées parmi les principales causes de mortalité à

travers le monde, entraînant annuellement plus de 13 millions de décès. Aux États-Unis,

deux tiers des décès associés aux infections bactériennes sont causés par des bactéries à

Gram négatif. La résistance aux antibiotiques associée à ces micro-organismes est en

constante augmentation et est attribuable à plusieurs facteurs environnementaux.

L’Organisation mondiale de la Santé reconnaît cette nouvelle réalité comme une menace

de santé publique majeure. En effet, le taux de mortalité associé à une infection causée

par une bactérie résistante à un antibiotique est de 2 à 4 fois plus élevé que celui associé à

une bactérie sensible. Margaret Chan, directrice générale de l’OMS, a prévenu que les

bactéries ont commencé à devenir résistantes aux antibiotiques communs et que cela

pourrait provoquer « la fin de la médecine moderne telle que nous la connaissons. ».

L’arrivée des bactéries multirésistantes fait croire à une possible fin de l’ère antibiotique

telle qu’on la connait. Il est donc essentiel de prioriser l’usage rationnel des antibiotiques

de même que la prévention des infections par le biais d’une détection rapide et d’une

surveillance épidémiologique. Chez les bactéries à Gram négatif multirésistantes, la

résistance aux β-lactamines est due en grande partie à la production de BLSE et de

carbapénémases. Les β-lactamines sont une classe d’une grande importance parmi les

antibiotiques utilisés dans le monde pour le traitement d’infections graves en milieu

hospitalier ou communautaire.

Actuellement, dans les laboratoires de microbiologie clinique l’identification des

bactéries et la détermination de la sensibilité aux antibiotiques requiert plusieurs jours (48

à 72 heures). Les conséquences de ce manque de rapidité sont : l’administration d’un

traitement empirique, des infections virales diagnostiquées comme bactériennes, des

antibiotiques donnés pour des infections non bactériennes et l’utilisation abusive des

antibiotiques à large spectre, tel que les C3G et les carbapénèmes. L’obtention rapide des

résultats pourrait au contraire permettre de sélectionner des antibiotiques appropriés et

d’implémenter une surveillance et des mesures de contrôle des infections plus efficaces.

Ceci aurait pour effet de réduire l’émergence et la dissémination des bactéries

productrices de BLSE et de carbapénémases.

52

Objectifs de recherche

2.2.1 Objectifs spécifiques

Les objectifs visés par ce projet de maîtrise se divisent en deux parties. Les objectifs 1 à 5

ont mené à l’écriture du Chapitre 3, portant sur le développement d’un essai multiplex

PCR en temps réel pour la détection rapide et sensible des principaux gènes codant pour

les carbapénémases. Ainsi, les objectifs sont les suivants :

1. Déterminer les gènes ayant une importance épidémiologique significative

permettant de détecter les souches productrices de carbapénémases.

2. Réaliser la conception des amorces d’amplification PCR et des sondes de

détection TaqMan ® pour la détection de tous les variants des gènes d’intérêt de

l’essai PCR multiplex en temps réel.

3. Développer et optimiser l’essai PCR multiplex.

4. Valider la performance en termes de sensibilité, spécificité et ubiquité de l’essai

multiplex PCR en temps réel.

5. Détecter les gènes ciblés dans l’essai multiplex PCR en temps réel directement à

partir d’échantillons cliniques (selles).

6. Comparer la méthode génotypique développée avec deux méthodes

phénotypiques, à savoir le test de Hodge modifié et les tests de Rosco.

53

Les objectifs 7 à 10 ont mené à l’écriture du Chapitre 4, portant sur l’épidémiologie

moléculaire des β-lactamases à spectre étendu chez les bactéries à Gram négatif dans

deux hôpitaux de la ville de Québec.

7. Déterminer les gènes ayant une importance épidémiologique significative

permettant de détecter la production de BLSE.

8. Réaliser la conception des amorces d’amplification PCR permettant de détecter et

séquencer tous les variants des gènes d’intérêt.

9. Caractériser les différentes β-lactamases à large spectre (BLSE) produites par les

isolats qui ont causé des infections acquises en milieu hospitalier.

10. Comparer les caractéristiques moléculaires et l’épidémiologie entre les isolats

récoltés en milieu hospitalier.

55

Chapitre 3

Développement d’un essai PCR multiplex en temps réel pour la détection rapide et

sensible des gènes codant pour les carbapénémases

56

57

Avant propos

Apport de l’étudiante

J’ai participé à l’élaboration du projet de recherche et à la définition des concepts à

démontrer et ainsi que la manière de les valider. J’ai réalisé la majorité des expériences et

j’ai participé à l’analyse des données expérimentales. J’ai rédigé la première version du

manuscrit et intégré les commentaires des co-auteurs.

Apport des co-auteurs

Ann Huletsky et Michel G. Bergeron ont participé à l’élaboration et à la supervision du

projet de recherche. Ann Huletsky a effectué un suivi technique de l’avancée des travaux

de même que participer à l’analyse globale des résultats. Tous les co-auteurs ont participé

à la révision.

Statut de l’article

L’article : «Rapid and Sensitive Real-Time Multiplex PCR Detection of blaKPC, blaNDM,

blaOXA-48-like, blaIMP, and blaVIM Carbapenemase Genes directly from Stools» est en

révision par les co-auteurs avant la soumission.

Commentaires sur l’article inséré dans ce mémoire

L’article sera prochainement soumis dans le Journal of Clinical Microbiology (JCM).

58

59

Résumé

Objectif La dissémination mondiale de bactéries à Gram négatif productrices de

carbapénémases (BPC) représente une menace de santé publique majeure. Les infections

causées par les BPC sont associées à un taux de mortalité élevé. Actuellement, les

méthodes phénotypiques utilisées pour la détection des BPC manquent de sensibilité et de

spécificité et sont souvent difficiles à interpréter. Cette étude décrit un essai PCR

multiplex en temps réel permettant la détection rapide des gènes codant pour les

carbapénémases les plus prévalentes.

Méthodes Des alignements multiples des séquences des gènes blaIMP, blaKPC, blaNDM,

blaOXA-48-like et blaVIM ont été réalisés à partir des séquences disponibles dans les bases de

données publiques. Un essai PCR multiplex en temps réel a été développé comprenant 11

amorces d’amplification et 5 sondes fluorescentes spécifiques à des régions hautement

conservées de ces gènes ainsi qu’un contrôle interne. L’essai PCR a été optimisé et validé

en utilisant l’ADN génomique purifié ou des extraits bruts d’ADN de souches contenant

ou non les gènes de résistance ciblés. Des selles inoculées avec des bactéries cibles ont

été utilisées pour démontrer la détection des gènes de carbapénémase directement à partir

d'échantillons cliniques.

Résultats Un total de 77 souches bactériennes à Gram négatif, incluant 20 souches

sensibles aux carbapénèmes et 57 souches non-sensibles aux carbapénémes ont été

testées. Parmi les 57 souches non-sensibles aux carbapénèmes, l’essai PCR a détecté les

32 souches contenant des gènes de carbapénèmase, dont 7 blaIMP (blaIMP-1, blaIMP-4,

blaIMP-8 et blaIMP-9), 6 blaKPC (blaKPC-1 et blaKPC-3), 7 blaNDM (blaNDM-1 et blaNDM-4), 4

blaOXA-48, 2 blaNDM-181 et 6 blaVIM (blaVIM-1, blaVIM-2 et blaVIM-8). En comparaison, le test

de Hodge modifié (MHT) et le test Rosco Diagnostica Neo- Sensitabs™ (RDS) ont

détecté respectivement 25 et 26 des 32 souches contenant des gènes de carbapénèmase

résultant à des sensibilités analytiques de 82,1 et 84,2 %. Aucune souche non-productrice

de carbapénèmase n’a été détectée par l’essai PCR, indiquant 100% de spécificité

analytique, tandis que les tests MHT et RDS ont montré respectivement 100 % et 91,2 %

de spécificité analytique. Le test PCR a montré une limite de détection de 6 à 19 copies

60

de génome par réaction PCR dépendamment des souches contenant les gènes de

carbapénémase testées. La limite de détection pour les échantillons de selles inoculées

avec des souches de CGNB contenant les gènes sélectionnés a varié entre 11 à 44

CFU/100 mg de selles en fonction de la souche contenant le gène de résistance testé.

Conclusions Nous avons développé un essai PCR en temps réel sensible permettant

d'identifier rapidement les patients infectés ou porteurs de CGNB. Ce test pourrait aider à

mieux traiter les infections causées par ces bactéries résistantes et mieux contrôler leur

diffusion.

61

Rapid and Sensitive Real-Time Multiplex PCR Detection of blaKPC,

blaNDM, blaOXA-48-like, blaIMP, and blaVIM Carbapenemase Genes directly

from Stools

Marilyse Vallée1, 2, Ann Huletsky1, 2, Michel G. Bergeron1, 2

1 Centre de recherche en infectiologie de l’Université Laval, Centre hospitalier

universitaire (CHU) de Québec, Québec, Canada and 2 Département de

microbiologie-infectiologie et d’immunologie, Faculté de médecine, Université

Laval, Québec, Québec, Canada

Abstract

Background Worldwide dissemination of carbapenemase-producing Gram-negative

bacteria (CGNB) represents a major public health problem. This issue is exacerbated by

the presence of healthy carriers in the population. Infections caused by CGNB are

associated with a high mortality rate. Phenotypic methods currently used in microbiology

laboratories for detection of CGNB lack sensitivity and specificity and are difficult to

interpret. This study describes a new real-time multiplex PCR assay which allows the

rapid and sensitive detection of the most prevalent carbapenemase-encoding genes from

bacterial isolates or directly from stools.

Methods Multiple sequence alignments of blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like, blaIMP, and

blaVIM genes were performed using sequences available in public databases. A real-time

multiplex PCR assay was developed comprising 11 primers and 5 TaqMan® probes

specific to highly conserved regions of these bla genes. The PCR assay was optimised

and validated using purified genomic DNA or crude DNA extracts from several Gram-

negative bacterial strains containing or not the target carbapenemase-encoding genes.

Stools spiked with target bacteria were used to demonstrate the detection of

carbapenemase genes directly from clinical samples.

Results A total of 77 Gram-negative bacterial strains, including 20 carbapenem-

susceptible and 57 carbapenem-non-susceptible resistant strains were tested. Among the

57 carbapenem-non-susceptible strains, the PCR assay detected 32 strains containing

62

carbapenemase genes, including 7 blaIMP (blaIMP-1, blaIMP-4, blaIMP-8 et blaIMP-9), 6 blaKPC

(blaKPC-1 et blaKPC-3), 7 blaNDM (blaNDM-1 et blaNDM-4), 4 blaOXA-48, 2 blaNDM-181 et 6

blaVIM (blaVIM-1, blaVIM-2 et blaVIM-8). In comparison, the modified Hodge test (MHT) and

the Rosco Diagnostica Neo-Sensitabs™ test (RDS) detected respectively 25 and 26 out of

32 strains containing carbapenemase genes resulting in an analytical sensitivity of 82.1

and 84.2%. Moreover, none of the non-carbapenemase producers was detected by the

PCR assay, indicating 100% analytical specificity. As for genotypic methods, the MHT

and RDS tests have shown respectively 100% and 91.2% for analytical specificity. The

PCR assay had a limit of detection of 6 to 19 genome copies per PCR reaction depending

on the tested carbapenemase gene-containing strains. The limit of detection for spiked

stool samples with CGNB containing the selected genes was 11 to 44 CFU/100 mg of

stools depending on the resistance gene-containing strain tested.

Conclusions We developed a sensitive real-time PCR assay that could rapidly identify

patients infected or carrying CGNB. This assay could help to better treat infections

caused by these resistant bacteria and to control their dissemination.

Introduction

Worldwide resistance to carbapenem increases constantly by dissemination of

carbapenemase-producing Gram-negative bacteria (CGNB), including members of the

family of Enterobacteriaceae and non-fermenters such as Pseudomonas aeruginosa and

Acinetobacter baumannii. Sporadic or endemic epidemics have been reported in hospital

environment and in community settings. The Centers for disease control and prevention

(CDC) reported that carbapenem-resistant Enterobacteriaceae increased from 1.2% in

2001 to 4.2% in 2011 (CDC, 2013). This is mainly caused by strains producing

carbapenemases of class A (KPC types), class B or metallo-β-lactamases (MBLs) (IMP,

NDM and VIM types) and the class D oxacillinases (OXA-48 type) (Carattoli, 2013).

Genes coding for carbapenemases are carried by mobile genetic elements that favors their

dissemination. Moreover, other resistance determinants are frequently associated with

carbapenemase genes conferring multiresistance and even pandrug resistance profiles to

CGNB, leaving thus few treatment options (Bush, 2013; Elemam, 2009).

63

Identification of carbapenemase production in clinical isolates is primarily based on

susceptibility testing results obtained with standard phenotypic methods (automated

systems, liquid media, and disk diffusion tests). However, some carbapenemase

producers with MICs for carbapenems lower than the established CLSI breakpoints may

not be detected (Nordmann et al., 2012). It has recently been proposed that a search for

carbapenemase production should be performed in any isolates with any slight decrease

in susceptibility to carbapenems (Nordmann et al., 2012). Several phenotypic methods

can be used to confirm carbapenemase activity. The CLSI recommends the modified

Hodge test (MHT) to screen for production of carbapenemases in Enterobacteriaceae

(Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. NCCLS (CLSI). Wayne,

PA, 2013, M100-S23), but other tests can also be performed using molecules inhibiting

carbapenemases and/or other types of β-lactamases (Nordmann et al., 2012), such as the

Rosco Diagnostica Neo SensitabsTM tests (RDS) which can also be performed with non-

fermenter species. However, both the MHT and the RDS tests are time consuming as they

require at least 24h and they often lack sensitivity and specificity (Girlich et al., 2012;

Carvalhaes et al., 2010; Doyle et al., 2012). For example, false positive results for MHT

may occur when ESBL production or surproduction of AmpC is coupled with porin loss

(Carvalhaes et al., 2010; Doumith et al., 2009).

The intestinal flora constitutes an important reservoir for antibiotic resistant Gram-

negative bacteria and plays a major role in the transmission of resistant genes (Livermore,

2012). Hence, screening of stools or rectal swabs is recommended by the Centers for

Disease Control and Prevention to identify carriers of CGNB and initiate appropriate

infection control measures (Centers for Disease Control and Prevention, 2009). To screen

for CGNB carriers, the stools or rectal swabs should first be plated on selective media

containing carbapenems (Lolans et al., 2010; Blackburn et al., 2013). Selective

chromogenic culture media are commercially available, but they often lack sensitivity or

specificity (Wilkinson et al. 2012; Girlich et al., 2013). Furthermore, these culture-based

methods have a time-to-result of 24 to 48 hours and cannot identify the type of

carbapenemase (Moran-Gilad et al., 2011; Samra et al., 2008). Carbapenemase producers

should be confirmed by susceptibility testing and carbapenemase activity by the methods

described above.

64

To overcome limitations of the phenotypic culture-based methods, several molecular

techniques (mostly simplex and multiplex PCR) which can allow detection of

carbapenemase producers and identification of carbapenemase genes have been

developed (Nordmann et al., 2012). A few PCR techniques have been designed for direct

detection of carbapenemase genes from clinical specimens such as rectal swabs or stools,

but they usually detect a single gene or a few carbapenemase genes (Naas et al. 2011;

Hindiyeh et al., 2008; Naas et al., 2013; Nijhuis et al., 2013). This study describes a new

real-time PCR multiplex assay combined with a rapid nucleic acid extraction method

which provides rapid and sensitive simultaneous detection of the most clinically

important carbapenemase genes blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like blaIMP, and blaVIM genes

directly from stools.

Materials and methods

3.5.1 Bacterial strains

The bacterial strains used in this study were obtained from the American Type Culture

Collection (ATCC), the Laboratoire de Santé Publique du Québec (LSPQ) and other

laboratories in Canada and other countries. Thirty-two well characterized carbapenemase

gene-containing strains from various Enterobacteriaceae or non-fermenter species were

used for assay validation (Table 1). An additional 25 carbapenem-non-susceptible

isolates that do not produce carbapenemases (Table 2), as well as 20 strains that were

fully susceptible to carbapenems (Table 3), were also used in this study.

3.5.2 Phenotypic confirmation tests

Minimal inhibitory concentrations (MICs) for all strains used in this study were

determined with the Etest® method according to the manufacturer’s instructions

(bioMérieux, France) (Tables 1, 2, and 3). All strains with MIC values of ≥0.5 mg/L for

ertapenem, or ≥1 mg/L for imipenem or meropenem were tested for carbapenemase

production, as suggested by Nordmann et al., 2012. The MHT was performed according

to Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines with meropenem disk.

The RDS tests (Diagnostica, Taastrup, Denmark) (KPC/MBL and OXA-48 Confirm Kit

98015) were performed according to the manufacturer’s recommendations.

65

3.5.3 DNA extraction and purification from bacterial strains

The strains (Table 1) were grown overnight at 37°C under aerobic conditions into BD

Bacto ™ Brain Heart Infusion broth medium (BD, Baltimore, MD) (BHI). A

concentration of 1 µg/mL imipenem (Ranbaxy Pharmaceutical Canada Inc., Mississauga

(Ontario), Canada) was added to the broth for growth of CGNB strains. Genomic DNA

was extracted and purified using a BioSprint 15 DNA blood kit (Qiagen, Mississauga,

Ontario, Canada) automated with a KingFisher® mL instrument (Thermo Fisher

Scientific, Waltham, MA). Genomic DNA concentration was determined using the

NanoDrop 1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Crude

DNA extracts were prepared using a glass-bead lysis method (Ke et al., 2000)..

3.5.4 Multiplex primer and probe design

Multiple sequences alignments of the blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like, blaIMP, and blaVIM

were performed with the ClustalW software (version 2.1) (Thompson et al., 1994) from

sequences available in public databases. Primers and TaqMan® probes specific for these

genes were designed by means of the OligoTM analysis software (National Biosciences

Inc, Chester, NY). These oligonucleotides are located within conserved regions of the

target genes to allow amplification and detection of all known variants of these genes.

Possible interactions between oligonucleotides were estimated in silico via Plexiglad, an

homemade software which estimates the potential of dimers formation and self-

amplification of a group of oligonucleotides (Martel, 2011). The specificity of primers

and probes was evaluated by the BLAST search program

(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). All primers and probes were also compared to

all known gene sequence variants in the database using the in-house Crosshyb software

version 2.0 (Martel, 2011). This software calculates distances between oligonucleotides

and all sequences within the database by attributing a weighting factor for a destabilizing

effect of each mismatch based as a function of their position (Martel, 2011). Various

combinations of primers and probes were tested by PCR as well as several concentrations

of each PCR reagents to obtain a sensitive, specific, and ubiquitous multiplex PCR assay.

The primers and probes selected for the PCR assay are shown in Tables 4 and 5.

66

3.5.5 Multiplex PCR for the detection of blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like

blaIMP, and blaVIM

Multiplex PCR amplification for the simultaneous detection of blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-

like, blaIMP, and blaVIM carbapenemases genes was carried out in a Rotor-Gene™ 6000

thermal cycler instrument (Qiagen/Corbett, Hiden, Germany). Each PCR reaction was

performed in a 25 μL reaction mixture containing 0.05 U/µL of HotGoldStar DNA

polymerase (Eurogentec S.A., Liege, Belgium), 150 Mm Tris-HCl pH 8, 500 mM KCl,

0.1% Tween20, 200 µM dNTPs (VWR International, Vienna, Australia), 0.3 mg/mL

BSA (Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, Ontario, Canada) and 3.5 mM MgCl2

(Sigma-Aldrich Canada Ltd.,). The forward and reverse primers were used at

concentrations of 0.4 µM (forward) and 1.0 µM (reverse) for blaIMP, 0.8 µM for blaKPC

and blaVIM, 0.6 µM for blaNDM and 0.4 µM for blaOXA-48-like in the multiplex PCR. All

probes were used at 0.1 µM. Primers and probes sequences are shown in Tables 4 and 5,

respectively. The thermal cycling for PCR amplification was 95°C for 10 min for thermal

activation step followed by 45 cycles of 3 steps consisting of 95°C for 1 s for the

denaturation step, 58°C for 20 s for the annealing step, and 72°C for 20 s for the

extension step. Negative controls contained ultrapure water or 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM

EDTA (TE) buffer instead of template DNA to ensure the absence of contamination

during preparation of PCR reactions. Positive controls for each selected resistance gene

contained 100 genome copies of purified genomic DNA from a gene-containing

reference strain to validate reagents integrity and amplification efficiency. Data

acquisition and analysis for the real-time PCR assay were performed with the Rotor-

Gene™ 6000 data analysis software (Qiagen/Corbett Research supporting programs).

Parameters such as analytical sensitivity, analytical specificity and ubiquity were

determined using purified genomic DNA or crude DNA extracts.

3.5.6 Internal control (IC)

A fragment of CAO gene of Arabidopsis thaliana was incorporated into the chromosome

of Bacillus subtilis to serve as an IC in the PCR assay. The forward primer IC-334 (5’-

CTGGGGAAGAAAAACAGAA-3’) was specific to the thyA gene of B. subtilis and the

reverse primer IC-672 (5’-ATTGTCGATAAAACAATACACGG-3’) was specific to the

67

CAO gene insert sequence. A TaqMan® probe (5’-

TCTCTTGGATCTTGCTCATGCCCC-3’) allowed specific detection of the IC (361 bp)

in the PCR assay. Purified genomic DNA of modified B. subtilis was used at a

concentration of 100 copies per PCR reaction. This IC validates the integrity of the PCR

reagents and the presence of inhibitors without interfering with the amplification of the

target genes. The IC was present in each PCR amplification reaction, including positive

and negative controls.

3.5.7 Validation of the multiplex PCR assay

The analytical sensitivity of the PCR assay, calculated by dividing the number of true

positives by the sum of the true positives and false negatives [TP/(TP+FN)] (Pont-

Kingdon et al., 2012), was determined by using crude DNA extracts (~25 genome copies)

of 32 well characterized CGNB strains containing the target resistance genes (Table 1).

The analytical specificity of the multiplex PCR assay, calculated by dividing the true

negatives by the sum of the true negatives plus false positives [TN/(TN+FP)] (Pont-

Kingdon et al., 2012), was evaluated by using ~105 genome copies of crude DNA

extracts from 45 non-carbapenemase producers including 25 carbapenem-non-susceptible

strains (Table 2) as well as 20 carbapenem-susceptible strains (Tables 3), containing or

not related resistance genes.

3.5.8 Limit of detection (LOD)

The LODs (in terms of genome copies per PCR reaction) of the multiplex PCR were

determined by testing a range of 25 to 2.5 genome copies of purified genomic DNA from

selected reference strains containing the target resistance genes (Table 6). Fifteen

replicates of each concentration were used to determine the LODs. Values were

determined with a confidence interval of 95%, with the in-house Lotlod software (version

1.2.2), using R (version 2.14.1) and glm function.

The LODs in stool samples were also determined in terms of CFU per 100 mg of stools.

Stool sample was collected from a healthy individual and frozen at -20°C. Ethical

approval for the study was obtained from the institutional review board of the Centre de

recherche du CHU de Québec. A total of 774 mg of stool was resuspended in 12 ml of

68

TE buffer. Five CGNB strains (Table 7), each containing one of the target genes, were

grown on selective agar medium (BHI agar supplemented with 1 µg/mL imipenem).

After bacterial growth at 37°C for 24 h, a 0.5 McFarland bacterial suspension was

prepared in phosphate-buffered saline (PBS). A volume of 30 µl of the bacterial

suspension was inoculated into 3 mL selective BHI broth (containing 1 µg/mL

imipenem) and incubated overnight at 37°C with agitation. A volume of 30 µl of the

overnight bacterial culture was added to 3 mL selective BHI broth and incubated until the

exponential growth phase. A 0.5 McFarland bacterial suspension was prepared from the

exponential growth phase culture in PBS. The suspension was serially diluted into BD

Phoenix ID broth (Franklin Lakes, NJ) to obtain a range of dilutions of 2.5, 5, 10, 20 and

25 CFU/mL. The bacterial concentrations of the serial dilutions were established by

bacterial colony counts onto blood agar plates (bioMérieux). Each bacterial dilution was

spiked in a volume of 2 ml of the pooled stool suspension. Crude DNA extracts from 100

µl of each spiked stool suspension were prepared using a rapid lysis method (3). The

LODs of the multiplex PCR assay in terms of CFU/100 mg of stools were evaluated by

PCR amplification of five replicates of each crude DNA extract.

3.5.9 Analytical performance of the MHT and RDS test

The analytical sensitivity and specificity of the MHT and RDS test (Table 8) were

determined using 32 well-characterized CGNB strains containing the target

carbapenemase genes (Table 1), 32 carbapenem-non-susceptible strains that do not

produce carbapenemases (Table 2) and 20 fully carbapenem-succeptible strains (Table 3).  

Results

3.6.1 Analytical performance of the multiplex PCR assay

A total of 52 primers and 25 fluorescent TaqMan® probes specific for the blaKPC, blaNDM,

blaOXA-48-like, blaIMP, and blaVIM genes were designed in this study (data not shown). A

combination of 11 primers and 5 TaqMan® probes was selected for the final multiplex

assay for optimal analytical performance (Tables 4 and 5). The 32 well-characterized

CGNB strains tested in this study, among which six produced KPC (five KPC-2 and one

KPC-3), eight produced IMP (two IMP-1, three IMP-4, one IMP-8, one IMP-9, and one

69

IMP-11), six produced NDM (five NDM-1 and one NDM-4), six produced VIM (one

VIM-1, three VIM-2, one VIM-8, and one VIM-19), and six produced OXA-48-like (four

OXA-48 and two OXA-181) were all detected by the multiplex PCR assay (Table 1),

showing an analytical sensitivity of 100%. No detection was observed with the 45 non-

carbapenemase producers including 25 carbapenem-non-susceptible strains (Table 2) as

well as 20 carbapenem-susceptible strains (Tables 3), containing or not related resistance

genes, showing an analytical specificity of 100%.

The LODs of the multiplex PCR assay were 6 to 19 genome copies per PCR reaction

(95% CI) depending on the carbapenemase gene-containing strain tested (Table 6). The

LODs of the PCR multiplex assay in stools were also evaluated with strains containing a

representative for each carbapenemase gene type spiked in stools. The LODs of the

multiplex PCR assay combined with a rapid bead lysis extraction method were 11 to 44

CFU/100 mg of stool, depending on the strain tested (Table 7).

3.6.2 Analytical performance of the MHT and RDS test

The analytical performance of the MHT as well as the RDS test for detection of

carbapenemases was also evaluated with all strains listed in tables 1, 2 and 3. The MHT

and the RDS test detected carbapenemase production for, respectively, 25 and 26, out of

the 32 strains containing carbapenemase genes. Two strains producing IMP-type (IMP-8

and IMP-9), four producing NDM-1, and one producing VIM-2 were not detected with

the MHT whereas four strains producing IMP-type (two IMP-4, one IMP-8, and one IMP-

11), and two producing VIM-type (VIM-2 and VIM-8) were not detected with the RDS

test. Two strains containing IMP-8 and VIM-2 were negative for carbapenemase

production with both the MHT and the RDS methods. The analytical sensitivities of the

MHT and the RDS test were, respectively, 78.1% and 81.3% (Table 8). The RDS test

used in this study allows specific identification of metallo-beta-lactamases (MBL), KPC,

and OXA-48 production in Enterobacteriaceae. However, one IMP-1- and one OXA-48-

producing strains were misidentified as KPC producers whereas two VIM-producing

strains (VIM-1 and VIM-19) were misidentified as OXA-48 producers. Moreover, one

KPC-producing strain was identified as producing both KPC and a metallo-β-lactamase.

The 25 carbapenem-non-susceptible isolates that do not produce carbapenemases were all

70

negative by the MHT (Table 2). However, one (CCRI-21951) out of the 25 non-

carbapenemase producers was positive for carbapenemase production with the RDS test

(Table 2). The 20 carbapenem non-susceptible strains tested were all negative by both

methods. The analytical specificities of the MHT and RDS test for detection of

carbapenemase producers were, respectively, 100% and 97.7% (Table 8).

Overall, while 100% of strains containing the carbapenemase genes targeted were

detected with the PCR assay, 100% of strains containing blaKPC and blaOXA-48-like, 83.3%

of strains containing blaIMP, 33.3% of strains containing blaNDM, and 80% of strains

containing blaVIM genes were detected with the MHT (Table 9). The RDS test detected

carbapenemase production for 100% of strains containing blaKPC, blaNDM, and blaVIM,

50% of strains containing blaIMP, and 75% of strains containing blaOXA-48-like.

Discussion

Carbapenems (ertapenem, doripenem, imipenem and meropenem) are considered as the

last line of defense against healthcare-associated and severe community-acquired

infections. The increasing prevalence of extended-spectrum-β-lactamases (ESBLs)

worldwide contributed to the rising consumption of carbapenems and is partially

responsible for the development of resistance to these antibiotics (Hawkey et al., 2012).

The negative clinical outcome of an infection caused by a resistant strain may be

explained by the restricted therapeutic option available, failure of empirical treatment and

the delay to have effective therapy. Some parts of the world are endemic for certain types

of CGNB (Nordmann et al., 2011) and their global widespread dissemination is a serious

threat to public health. Asymptomatic carriers play a major role in the epidemiology of

CGNB and systematic surveillance is recommended by the CDC to limit their spread.

Several phenotypic tests have been described for the detection of carbapenemase activity

but most of them lack sensitivity and specificity and are time-consuming, requiring at

least 24-48h (Nordmann et al., 2012). Molecular tests such as PCR can quickly identify

infected patients or carriers of carbapenemase-producing bacteria for a better control of

the spread of resistant bacteria.

71

In this study, we developed and validated a real-time multiplex PCR assay, including an

internal control, to detect the most clinically important carbapenemase resistance genes,

blaKPC, blaNDM, blaOXA-48-like, blaIMP, and blaVIM in Gram-negative bacteria. The multiplex

PCR assay was validated against carbapenemase producers and non-carbapenemase

producers. The multiplex PCR assay detected all the strains containing carbapenemase

genes tested whereas none of the non-carbapenemase producing strains were detected by

PCR. Although we did not test all the blaKPC (17 variants), blaNDM (11 variants), blaOXA-48-

like (9 variants), blaIMP (48 variants), and blaVIM (41 variants) gene variants reported

(http://www.lahey.org/Studies/access), in silico sequence analysis revealed that most

other known variants of these genes for which sequences are publicly available should be

detected by the PCR assay since nucleotide changes in these variants are located outside

the primer and probe regions (excepted one mismatch (5'-

AATAG(A→G)GTGGCTTAATTCTC-3') in the blaIMP-3-specific probe IMP-TL1-A1).

The blaOXA genes encode β-lactamases characterized by an important genetic diversity

which include more than 400 β-lactamase variants divided in ten main OXA subgroups

(OXA-1, -2, -10, -20, -23, -40, -48, -51, -58, and -63) where each of them has a great

heterogeneity in terms of β-lactam hydrolysis spectrum (Poirel et al., 2010). Our

multiplex PCR assay specifically detects the gene variants encoding the OXA-48-like β-

lactamases subgroup (OXA-48, -162, -181, -199, -204, -232, -244, -245, and -247) with

carbapenemase properties and which are located on plasmids. The blaOXA-163 gene which

is a blaOXA-48 variant is not detected by our PCR assay because the β-lactamase encoded

by this gene has a much lower ability to hydrolyze carbapenems compared to OXA-48,

being therefore barely considered as a carbapenemase (Poirel et al., 2011). The PCR

assay has not been tested for specificity with all blaOXA genes from other subgroups,

however in silico analysis of primers and probe sequences for detection of blaOXA-48-like

genes revealed no significant homology with the other blaOXA genes. Indeed, the OXA-

48-like β-lactamases are weakly related to other class D β-lactamases, sharing only 21 to

46%, amino acid identities with β-lactamases from other OXA subgroups (Poirel et al.,

2010).

We also evaluated the performance of the MHT and RDS test for detection of

carbapenemase producers in Gram-negative bacteria. The MHT detected all strains

72

producing KPC and OXA-48-like carbapenemases as described by other groups (Girlich

et al., 2012), but failed to detect seven strains producing IMP, NDM, or VIM. The MHT

is known to perform poorly for detection of MBL-producing isolates (Nordmann et al.,

2011). MHT is known to have a low sensitivity as a screening test for NDM-1 positive

strains. It has been shown that adding ZnSO4 to the culture medium can increase the

sensitivity of MHT for carbapenemase detection (Girlich et al., 2012). Although testing

for carbapenemase production in non-fermenter Gram-negative bacilli by the MHT is not

recommended by the CLSI (CLSI, 2013), a total of 4 P. aeruginosa strains non-

susceptible to carbapenems was also included in this study to evaluate the analytical

performance of this method for these organisms. Two out the three P. aeruginosa

carbapenemases producers were detected with the MHT whereas the 11 non-

carbapenemase producers were all correctly identified. The RDS test detected all strains

producing KPC, NDM and VIM, but failed to detect three strains producing IMP and two

strains producing OXA-48-like. Doyle et al. have also report a good performance for

KPCs and NDMs but poorly for VIM, IMP and OXA-48-like. This is similar to our

findings with the exception of VIM. Globally, a total of 30 out of the 32 (93.8%)

carbapenemase-producing strains were correctly identified by either of the two

phenotypic methods. One out of the 25 non-carbapenemase producers was positive for

carbapenemase production with the RDS test. Other resistance genes less frequently

found could explain this positive result. Indeed, genes such as AIM, Sun and GIM are all

from the species Pseudomonas sp. The lack of detection of carbapenemase production in

the two strains (#CCRI-19584 and #CCRI-22260) by the phenotypic methods could be

explained by their low minimal inhibitory concentration (MIC) for meropenem which

was used for carbapenemase detection in both methods. Indeed, the MICs of all

carbapenems were below the CLSI resistance breakpoints for these two strains. Our PCR

assay showed excellent sensitivity and specificity for the detection of the tested

carbapenemase producers irrespectively to their level of carbapenem resistance. Unlike

the standard MHT method or the RDS test, our PCR test was able to identify correctly

CGNB isolates of low MIC while discriminating non-carbapenemase producer of high

MIC. The lack of detection for the low CGNB-producers may enhance their hidden and

rapid spread among clinical isolates (Nordmann and Poirel, 2013) (Souli et al., 2008).

73

The limit of detection of the multiplex PCR assay was high, detecting 6 to 19 genome

copies per PCR reaction of the CGNB strains containing the target resistance genes. We

also evaluated the limit of detection of the multiplex PCR assay in stool samples by

combining the PCR assay with a rapid and efficient lysis method. The LODs were found

to be 11 to 44 CFU/100 mg of stool, depending of the CGNB strain tested. Little is

known about the bacterial load of CGNB in stools of healthy carriers. However, this level

of sensitivity should be high enough to assure the detection of asymptomatic carriers.

Further experiments are needed to validate this multiplex PCR assay with asymptomatic

carriers. Currently, two real-time simplex PCR assays have been developed to detect

respectively, NDM-1 (Naas et al., 2011) and OXA-48 (Naas et al., 2013), directly from

stools. The limit of detection with the NDM-1 PCR assay is 1 x 101 CFU/100 mg of

stools and for the OXA-48 PCR assay is 10-50 CFU/100 mg of feces. These PCR assays

require a 2h sample preparation compared to our 5 min sample preparation. Our PCR

assay therefore requires 2 to 3 hours less than these tests. While other multiplex assays

for the detection of carbapenemases have been developed, none have been tested directly

in a clinical specimen.

Accurate detection of CGNB based on conventional susceptibility methods is time-

consuming, complex, requires technical experience and depends on technical

interpretation. For example, 48 to 72 h experiment can still lead to an undetermined

result. Real-time PCR offers an inherent benefit for this purpose; well-designed internal

controls and predefined cycle threshold values for scoring positive and negative results

allow fully objective interpretation of data (Michael W.P., 2004). In this study, our PCR

assay did not require a fastidious sample preparation step. Following lysis of bacterial

cells in stool samples, DNA extracts were used directly in the PCR reaction and the total

time analysis from sample preparation to PCR cycling ranges from 1.5 to 2 hours. In

clinical outbreaks, such rapid results should fasten the treatment, improve management

for patient isolation, and avoid unnecessary use of antimicrobials.

Precise identification of the type of carbapenemase is not actually needed for treating

patients but it is useful for epidemiology studies and for preventing hospitals outbreaks.

PCR is the only method that can identify accurately the resistance genes responsible for

the production of a KPC, NDM, VIM, IMP or OXA-48-like enzymes. This technique is

74

designed to be performed, interpreted and introduced easily in the work flow of a clinical

laboratory.

Conclusions

Gram-negative bacteria have shown an increasing level of antibiotic resistance in the past

years and the CGNB strains became a major public health concern, leaving clinicians

with few treatment options. The rapid dissemination of CGNB is enhanced by the mode

of transmission of carbapenemase genes among gram-negative bacteria and the presence

of asymptomatic carriers in the population. In this study, a sensitive and specific

multiplex PCR assay was developed for rapid detection of the most important

carbapenemase genes. The applicability of this test in clinical specimens was

demonstrated with a limit of detection of around 11-44 CFU/100 mg of stool. This is the

first test describing a method which allows rapid multiplex real-time PCR detection of

these genes from bacterial isolates or directly from clinical samples like stools. This test

shows a great potential for screening of CGNB carriers and could help to limit the spread

of these emerging resistant bacteria.

Acknowledgments

This project was funded by the Consortium québécois sur la découverte du médicament

(CQDM) and the Mitacs Accélération program (IT01756) through scholarship to

Marilyse Vallée. We thank Ève Bérubé for technical assistance and Dominique K.

Boudreau for bioinformatics assistance.

Contributions

Marilyse Vallée designed and performed experiments, analyzed data and wrote the

article. Ann Huletsky and Michel G. Bergeron supervised the project, discussed results

and revised the article.

75

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78

Table 1. Carbapenemase-producing Gram-negative bacteria used in this study

Species Strain

(CCRI) Ambler class,

carbapenemase type Carbapenemases Other β-lactamases MIC range, mg/L

Modified Hodge test

ROSCO test Multiplex PCR

Class A aERT aMER aIMP Klebsiella pneumoniae 19570 KPC-type KPC-2 > 32 > 32 > 32 + KPC + Klebsiella pneumoniae 19571 KPC-2 1 2 2 + KPC + Klebsiella pneumoniae 19580 KPC-2 16 16 24 + KPC + Klebsiella pneumoniae 19581 KPC-2 > 32 > 32 > 32 + KPC + Klebsiella pneumoniae 21485 KPC-2 8 12 > 32 + KPC + Klebsiella pneumoniae 19587 KPC-3 > 32 > 32 > 32 + KPC-MBL + Class B Klebsiella pneumoniae 19582 IMP-type IMP-1 2 1.5 3 + KPC + Pseudomonas aeruginosa 21589 IMP-1 2 3 2 + MBL + Citrobacter youngae 21591 IMP-4 2 3 2 + - + Klebsiella pneumoniae 19583 IMP-4 2 1.5 1 + MBL + Klebsiella pneumoniae 19588 IMP-4 2 2 3 + - + Klebsiella pneumoniae 19584 IMP-8 1.5 0.75 2 - - + Pseudomonas aeruginosa 21590 IMP-9 > 32 3 16 - MBL + Serratia marcescens 22262 IMP-11 1 1 1 + - + Escherichia coli 22255 NDM-type NDM-1 CTX-M-15, TEM-1 > 32 > 32 > 32 + MBL + Klebsiella pneumoniae 21711 NDM-1 > 32 > 32 > 32 - MBL + Klebsiella pneumoniae 21901 NDM-1 > 32 > 32 > 32 - MBL + Providencia stuartii 22256 NDM-1 OXA-1, CMY-6, TEM-1 1 1.5 > 32 - MBL + Proteus rettgeri 22257 NDM-1 CTX-M-15 > 32 > 32 > 32 - MBL + Klebsiella pneumoniae 22254 NDM-4 OXA-1 > 32 > 32 6 + MBL + Klebsiella pneumoniae 22258 VIM-type VIM-1 CTX-M-3 1 1 1.5 + OXA-48 + Escherichia coli 22260 VIM-2 AADA29 0.19 0.19 1.5 - - + Pseudomonas aeruginosa 21588 VIM-2 > 32 > 32 > 32 + MBL + Serratia marcescens 22261 VIM-2 CTX-M-15 > 32 > 32 > 32 + MBL + Klebsiella pneumoniae 19585 VIM-8 1 1 3 + - + Klebsiella pneumoniae 22259 VIM-19 CTX-M-3, TEM-1, SHV-1 4 > 32 > 32 + OXA-48 +

Class D Enterobacter cloacae 22266 OXA-48-type OXA-48 TEM-1, CTX-M-15, OXA-1 1.5 0.5 1.5 + OXA-48 type + Escherichia coli 22265 OXA-48 CTX-M-24, TEM-1 3 1 1 + OXA-48 type +

Klebsiella pneumoniae 22263

OXA-48 SHV2a, SHV-11 , OXA-47 ,

TEM-1, OXA-1 3 2 2 + KPC +

Klebsiella pneumoniae 21899 OXA-48 4 2 6 + OXA-48 type + Klebsiella pneumoniae 22264 OXA-181 SHV-11,CTX-M-15, OXA-1 > 32 > 32 > 32 + OXA-48 type + Proteus rettgeri 22267 OXA-181 OXA-1 6 1.5 2 + OXA-48 type +

79

Table 2. Carbapenem-non-susceptible Gram-negative bacteria (non-carbapenemase producers) used in this study

Species Strain

(CCRI) β-lactamase MIC range, mg/L

Modified Hodge test

ROSCO test Multiplex PCR

aERT aMER aIMP Enterobacter cloacae 22251 8 4 2 - AmpC - Enterobacter cloacae 22196 12 2 0.25 - - - Enterobacter aerogenes 22206 0.125 1.5 0.94 - - - Escherichia coli 21734 CTX-M-15, TEM-1 1 0.75 0.47 - - - Escherichia coli 21669 CTX-M-2 0.94 0.38 0.64 - - - Escherichia coli 19578 CTX-M-15 0.75 0.75 0.64 - - - Escherichia coli 21829 0.06 2 0.23 - - - Escherichia coli 21970 2 8 1 - AmpC - Escherichia coli 22187 0.16 4 0.19 - - - Klebsiella pneumoniae 22186 2 0.6 0.125 - - - Klebsiella pneumoniae 21610 SHV-12 0.94 0.38 0.64 - - - Klebsiella pneumoniae 19572 CTX-M-14 0.75 0.38 0.125 - - - Proteus mirabilis 21789 0.64 1.5 0.25 - - - Proteus mirabilis 21864 0.47 2 0.125 - - - Proteus mirabilis 21913 0.125 2 0.19 - - - Proteus mirabilis 21934 0.32 0.75 1.5 - - - Proteus mirabilis 21963 0.5 1.5 0.94 - - - Proteus vulgaris 21944 0.64 4 0.125 - - - Proteus vulgaris 21959 0.32 3 0.125 - - - Proteus vulgaris 21960 0.64 4 0.125 - - - Proteus vulgaris 21961 0.32 6 0.19 - - - Pseudomonas aeruginosa 21709 0.2 6 0.75 - - - Pseudomonas aeruginosa 21784 > 32 > 32 > 32 - MBL - Pseudomonas aeruginosa 21945 > 32 > 32 > 32 - MBL - Pseudomonas aeruginosa 21951 > 32 > 32 > 32 - MBL - Pseudomonas aeruginosa 21958 > 32 > 32 6 - - - Pseudomonas aeruginosa 22188 > 32 > 32 > 32 - - - Pseudomonas aeruginosa 22195 > 32 > 32 6 - - - Pseudomonas aeruginosa 22197 > 32 > 32 12 - KPC - Pseudomonas aeruginosa 22198 > 32 > 32 > 32 - MBL - Pseudomonas aeruginosa 22207 > 32 4 8 - - - Pseudomonas aeruginosa 22243 > 32 3 0.5 - - - aERT; Ertapenem, bMER; Meropenem, IMP; cImipenem

80

Table 3. Carbapenem-susceptible Gram-negative bacteria used in this study

Species Strain (#CCRI)  β-lactamase MIC range, mg/L Modified Hodge

test ROSCO test Multiplex PCR

aERT aMER aIMP

Escherichia coli 21962 CTX-M-14 0.47 0.75 0.125 - - -

Escherichia coli 21556 CTX-M-27 0.16 0.38 0.47 - - -

Escherichia coli 22027 CTX-M-24 0.32 0.38 0.64 - - -

Escherichia coli 9769 TEM-6 0.23 0.75 0.64 - - -

Escherichia coli 1193 OXA-1 0.23 0.5 0.64 - - -

Escherichia coli 22044 TEM-1, CTX-M-14 0.32 0.25 0.47 - - -

Escherichia coli 9768 TEM-3 0.16 0.5 0.64 - - -

Escherichia coli 21524 SHV-12, TEM-1 0.16 0.38 0.47 - - -

Escherichia coli 21700 CTX-M-15 0.25 0.5 0.125 - - -

Escherichia coli 21689 CTX-M-2, TEM-1 0.25 0.5 0.125 - - -

Escherichia coli 9493 TEM-78 0.12 0.38 0.23 - - -

Escherichia coli 21733 CTX-M-27 0.38 0.38 0.32 - - -

Escherichia coli 21737 CTX-M-15 0.125 0.38 0.64 - - -

Escherichia coli 21562 CTX-M-15 0.32 0.25 0.32 - - -

Klebsiella pneumoniae 22040 CTX-M-15, SHV-1,

TEM-1 0.38

0.25 0.94 - - -

Klebsiella pneumoniae 19579 CTX-M-9 0.125 0.125 0.47 - - -

Proteus mirabilis 22073 CTX-M-14 0.125 0.75 0.125 - - -

Pseudomonas aeruginosa 21958 TEM-1 0.125 0.32 0.125 - - -

Salmonella sp. 8893 CTX-M-5 0.32 0.38 0.47 - - -

Salmonella sp. 8892 CTX-M-4 0.19 0.75 0.125 - - -

81

Table 4. Primers used for real-time PCR amplification

Target gene Primer name Primer sequencea Ta (°C) Amplicon size (bp)

blaIMP blaIMP283_b 5'- CATTTTCATAGYGACAGYACGG -3' 58.9

219 blaIMP283_c 5'- CATTTCCATRGYGACAGYACRG -3' 58.9

blaIMP480 5'- CAAACYACTASGTTATCTIGAG -3' 57.1

blaKPC blaKPC272 5'- ACACACCCATCCGTTAC -3' 57.2 125

blaKPC378 5'- GGCGTTATCACTGTATTCG -3' 58.0

blaNDM blaNDM37 5'- CTGAGCACCGCATTAGC -3' 59.6 93

blaNDM112 5'- GTCGCCAGTTTCCATTTG -3' 57.6

blaOXA-48-like blaOXA48_578 5'- AAGCCATGCTGACCGAA -3' 57.2 110

blaOXA48_670 5'- CATCAAGTTCAACCCAACC -3' 58.0

blaVIM blaVIM91 5'- GGTGARTATCCGACAGTC -3' 57.6 147

blaVIM220 5'- ACTCATCASCATCRCGGA -3' 57.6 a I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, G or T; M, A or C; W, A or T

b Ta: annealing temperature

Table 5. Probes used for real-time PCR detection

Target gene Probe name Probe sequence a b Tm (°C) % GC

blaIMP IMP-TL1-A1 5'- AATAGAGTGGCTTAATTCTC -3' 54.3 35

blaKPC KPC-T2-B1 5'- AACAGGCATGACGGTGGCGGA -3' 66.5 62

blaNDM NDM-T2-G2 5'- CATTGATGCTGAGCGGGTGC -3' 64.5 60

blaOXA-48-like OXA48-T4-F2 5'- ACTAGAATCGAACCTAAGATTGGC -3' 61.2 42

blaVIM VIM-TL2-A1 5'- TGGTGTTTGGTCGCATATC -3' 58.0 47 a I, inosine; Y, C or T; R, A or G; K, G or T; M, A or C; W, A or T b Bold and underlined nucleotides represent LNA residues

82

Table 6. LOD for CGNB producing the targeted genes

Genes Limit of detection

(genome copie/PCR rx) p-value

ablaIMP 19 0.011 bblaKPC 6 0.030 cblaNDM 6 0.031 dblaOXA-48-like 9 0.048 eblaVIM 16 0.014

a blaIMP-4 from K. pneumoniae CCRI-19583; b blaKPC-2 from K. pneumoniae CCRI-19570; c blaNDM-1 from K. pneumoniae CCRI-21711; dblaOXA-48 from K. pneumoniae CCRI-21899; e blaVIM-8 from K. pneumoniae CCRI-19585.

Table 7. Limit of detection for the CGNB producing the targeted genes spiked in stools

Targeted genes Limit of detection

(CFU/100 mg stool)

p-value

ablaIMP 44 7.3 x 10 -2 bblaKPC 40 6.6 x 10 -2 cblaNDM 39 2.6 x 10 -2 dblaOXA-48-like 11 9.3 x 10 -3 eblaVIM 34 1.1 x 10-2 a blaIMP-4 from K. pneumoniae CCRI-19583; b blaKPC-2 from K. pneumoniae CCRI-19570; c blaNDM-1 from K. pneumoniae CCRI-21711; dblaOXA-48 from K. pneumoniae CCRI-21899; e blaVIM-8 from K. pneumoniae CCRI-19585.

83

Table 8. Comparaison of the analytical sensitivity and specificity of the MHT, the RDS test and the multiplex PCR assay

Analytical sensitivity (%)(Nb strains detected/nb strains tested)

Analytical specificity (%)(Nb strains detected/nb strains tested)

Modified Hodge test RDS testa Multiplex PCR assay Modified Hodge test RDS testa Multiplex PCR assay

(25/32) 78.1% (26/32) 81.3% (32/32) 100% (45/45) 100% (44/45) 97.7% (45/45) 100% a Rosco Diagnostica Neo-Sensitabs™ test results

Table 9. Comparison of the MHT, the RDS test and the multiplex PCR assay for detection of the carbapenemases genes targeted

Carbapenemase genes targeted (Nb strains detected/nb strains tested)

blaIMP blaKPC blaNDM blaOXA48-like blaVIM MHT (5/6) 83.3 (6/6) 100 (2/6) 33.3 (6/6) 100 (4/5) 80 a RDS tests (4/8) 50 (6/6) 100 (6/6) 100 (6/8) 75 (6/6) 100

Multiplex PCR assay (8/8) 100 (6/6) 100 (6/6) 100 (6/6) 100 (6/6) 100 a Rosco Diagnostica Neo-Sensitabs™ test results

85

Chapitre 4

Épidémiologie moléculaire des β-lactamases à spectre étendu chez les bactéries à Gram négatif dans deux

hôpitaux de la ville de Québec

86

87

Avant propos

Rôle de l’étudiante

J’ai participé à l’élaboration du projet de recherche et à la définition des concepts à

démontrer ainsi que la manière de les valider. J’ai réalisé la majorité des expériences et j’ai

participé à l’analyse des données expérimentales. J’ai rédigé la première version de ce

chapitre et intégré les commentaires des co-auteurs.

Rôle des co-auteurs

Ann Huletsky et Michel G. Bergeron ont participé à l’élaboration et à la supervision du

projet de recherche. Ann Huletsky a effectué un suivi technique de l’avancée des travaux de

même que participer à l’analyse globale des résultats. Dominique K. Boudreau, Ève

Bérubé, Irina Bunescu et Richard Giroux ont contribué à certaines expériences de même

qu’à certaines analyses bio-informatiques. Jean Longtin et Yves Longtin ont fourni les

souches cliniques utilisées lors de l’étude. Tous les co-auteurs ont participé à la révision de

ce chapitre.

Statut de l’article

Le manuscrit : «Molecular Epidemiology of Extended-Spectrum Beta-lactamases in

Enterobacteriaceae in Two Hospitals of Quebec City, Canada» est en rédaction.

Commentaires sur l’article inséré dans ce mémoire

Ce chapitre a été présenté sous forme d’affiche à l’ASM 2012, San Francisco, États-Unis.

88

89

Résumé

Objectif Les β-lactamases à spectre étendu (BLSE) appartenant aux familles TEM, SHV et

CTX-M se disséminent rapidement parmi les Enterobacteriaceae à l’échelle mondiale. Les

infections causées par les bactéries productrices de BLSE sont une préoccupation

importante puisqu’elles augmentent de manière significative le taux d’échec thérapeutique

et de mortalité. L’objectif de cette étude était de déterminer la prévalence des gènes

encodant les principales BLSE chez les isolats d’entérobactéries provenant d’infections et

montrant une résistance aux céphalosporines de 3e génération (C3G). Ces isolats ont été

récoltés du 23 juin au 21 octobre 2011, à Québec, Canada.

Méthodes L’identification des souches bactériennes et la détermination de la résistance aux

antibiotiques ont été réalisées à l’aide du système Vitek® 2 (bioMérieux). Tous les isolats

ont aussi été testés pour la production de BLSE selon les recommandations du CLSI.

L’ADN génomique extrait de ces souches a été amplifié par PCR en utilisant différentes

amorces spécifiques aux gènes blaSHV, blaTEM et blaCTX-M. Tous les produits d’amplification

ont été séquencés.

Résultats Sur un total de 97 souches résistantes aux C3G, 57 (58,8%) étaient productrices

de BLSE. La plupart des souches productrices de BLSE étaient des Escherichia coli isolées

de l’urine. Les résultats de l’amplification PCR suivi du séquençage ont montré que 52

(91,2%) et 3 (5,3%) isolats produisaient des BLSE de types CTX-M et SHV-12,

respectivement. Parmi les 52 β-lactamases de type CTX-M, 35 (67,3%), 14 (26,9%) et 3

(5,8%) étaient, respectivement, CTX-M-15, CTX-M-27 et CTX-M-2. Deux souches (3.4%)

pour lesquelles aucune des BLSE SHV, TEM ou CTX-M n’a été trouvée produisaient les

BLSE VEB et PER, respectivement. Un isolat contenait deux types de BLSE (SHV-12 et

CTX-M-15) et la non-BLSE TEM-1.

Conclusion Cette étude montre que CTX-M-15 et CTX-M-27 sont les BLSE les plus

prévalents chez les Enterobacteriaceae dans la ville de Québec. La prédominance de CTX-

M-15 corrobore les études épidémiologiques globales. Toutefois, la forte prévalence de

CTX-M-27 n’a pas été observée dans d’autres régions du Canada. La découverte d'un gène

90

blaCTX-M-15 en association avec ISEcp1 souligne la propension de cette séquence

d'insertion à faciliter la propagation de ce gène de résistance.

91

Molecular Epidemiology of Extended-Spectrum Beta-lactamases in

Enterobacteriaceae in Two Hospitals of Quebec City, Canada

Marilyse Vallée1, Ann Huletsky1, Dominique K. Boudreau1, Ève Bérubé1, Irina Bunescu2

Richard Giroux1, Jean Longtin3, Yves Longtin4, Michel G. Bergeron1

Centre de Recherche en Infectiologie de l’Université Laval 1, Université d’État de Médecine « Nicolae Testemitanu », Moldova 2, Centre hospitalier de l'Université Laval 3, and Institut universitaire de cardiologie et de pneumologie de Québec 4, Québec, Québec,

Canada.

Abstract Background. Extended-spectrum β-lactamases (ESBLs) such as those belonging to the

family of TEM, SHV, and CTX-M are rapidly spreading among Enterobacteriaceae

worldwide. Infections caused by ESBL-producing bacteria are a major concern, since they

markedly increase the rates of treatment failure and death. The aim of this study was to

assess the prevalence of these ESBL-encoding genes in Enterobacteriaceae isolates

resistant to third-generation cephalosporins recovered from clinical infections from June

23rd to October 21st, 2011 in Quebec City, Canada.

Materials. Identification of bacterial strains and antibiotic resistance were determined

using the Vitek® 2 System (bioMérieux). All strains were also tested for ESBL production

according to CLSI recommendations. Crude DNA extracts were prepared from each strain

by a rapid DNA extraction method and were used for PCR amplification using different

primers specific to blaSHV, blaTEM, and blaCTX-M genes. All amplification products were

sequenced.

Results. Out of a total of 97 strains resistant to third-generation cephalosporins, 57 (58.8%)

were ESBL producers. Most ESBL producers were Escherichia coli isolated from urine.

PCR and sequencing revealed that 52 (91.2%) and 3 (5.3%) isolates were CTX-M and

SHV-12 ESBL producers, respectively. Among the 52 CTX-M producers, 35 (67.3%), 14

(26.9%) and 3 (5.8%) were, respectively, CTX-M-15, CTX-M-27, and CTX-M-2. One

92

strain (1.8%) which did not harbor any of the SHV, TEM, and CTX-M ESBLs tested, was

shown to produce VEB ESBL. All blaCTX-M-15 genes were located 49 bp downstream of the

insertion sequence ISEcp1. Three SHV-12 and 21 CTX-M producers also harbored the

non-ESBL TEM-1. One isolate (1.8%) contained SHV-12, CTX-M-15, and TEM-1.

Conclusion. This work showed that CTX-M-15 and CTX-M-27 are the most prevalent

ESBLs in Enterobacteriaceae in Quebec City. The predominance of CTX-M-15 is

consistent with global data. However, the high prevalence of CTX-M-27 has not been

observed in other regions in Canada. The finding of blaCTX-M-15 gene in association with

ISEcp1 emphasizes the propensity of this insertion sequence to facilitate the spread of this

resistance gene.

Introduction Resistance of Enterobacteriaceae to third-generation cephalosporins (3GC) is constantly

increasing worldwide through acquisition of ESBLs. Several studies described the

importance of ESBLs in hospital epidemics, especially involving ESBLs of SHV-, TEM-,

and CTX-M-types (7). Infections caused by ESBL-producing bacteria are significantly

increasing the rates of treatment failure and death by conferring resistance to all β-lactam

antibiotics except cephamycins and carbapenems. Moreover, mass dissemination of CTX-

M in Escherichia coli, a commensal bacterium, both in community and hospital settings,

has become a serious threat to public health especially as an important cause of community

onset urinary tract infections (UTIs). Major clones of E. coli easily transferring their

genetic elements, responsible for antibiotic resistance phenotypes, have been identified and

are accountable for horizontal transfer to other strains, species, or genera (4). A clonal

complex named O25b-ST131, which possesses a high level of virulence, is the most

frequent among E. coli CTX-M producers in Canada (6). Moreover, recent studies

demonstrated that in the CTX-M group, genotype blaCTX-M-15 is predominant in Canadian

hospitals (8) and around the world (2). However, little has been published on the current

situation in Quebec City, Canada. Therefore, the aim of this study was to assess the

prevalence of these ESBL-encoding genes in Enterobacteriaceae isolates resistant to 3CG

in two hospitals of Quebec City and to determine the clonal origin of these bacteria.

93

Materials and methods

4.5.1 Bacterial strains

A total of 97 unique Enterobacteriaceae isolates resistant to 3GC were collected from 2

hospitals of Quebec City, Centre hospitalier de l’Université Laval and Institut de

cardiologie et de pneumologie de Québec (IUCPQ), from June 23rd to October 21st, 2011.

4.5.2 Identification and antimicrobial susceptibility testing

Bacterial identification and antibiotic susceptibility testing was performed using the Vitek

2® System (bioMérieux). Each isolate was also tested by the standard double-disk

confirmation test to identify ESBL production in accordance with the 2011 Clinical and

Laboratory Standards Institute (CLSI) guidelines (5). E. coli ATCC® 25922 and K.

pneumoniae ATCC® 700603 were used as negative and positive controls, respectively.

4.5.3 Molecular characterization of resistance genes

Sequences of all blaSHV, blaTEM, and blaCTX-M gene variants were obtained from public

databases and used to design specific primers for PCR amplification and sequencing. PCR

reactions were performed on a PTC-200 thermocycler using crude DNA extracts. Crude

DNA extracts were prepared from strains grown on selective medium (16 µg/ml

ceftazidime) using a rapid lysis method (3). Both strands of amplicons were sequenced using

the amplification primers. Sequence data were aligned and compared with all variants of

targeted genes using the Genetics Computer Groups (GCG) programs (Wisconsin Package

version 11; Accelrys, San Diego, CA).

4.5.4 PCR detection of the Escherichia coli clonal complex O25b-ST131.

The 52 E. coli CTX-M producers were screened using a O25b-ST131 clone allele-specific

PCR for the pabB gene, as described by Clermont et al, 2009 (1).

94

4.5.5 Detection of ISEcp1

Detection of ISEcp1 was performed by PCR amplification using two primers located 49 pb

upstream of the blaCTX-M-15 gene within the ISEcp1 sequence and downstream of blaCTX-M15,

respectively.

Results The 97 3GC-resistant bacterial strains analyzed in this study are listed in Table 1.

Among the 57 ESBL-positive isolates, 4 different organisms (E. coli, K.

pneumoniae, M. morgannii, and P. mirabilis) were identified. They were isolated

from pus, blood, or urine.

Of the 57 ESBL-positive strains, 53 (93.0%) were E. coli ESBL producers. Among

these E. coli strains, 50 (94.3%) were isolated from urine.

Among the 40 ESBL-negative isolates, 5 species (C. braakii, E. cloacae, E. coli, M.

morgannii, and P. mirabilis) were identified. They were found in catheter, urine, or

wound.

E. coli represents 80% of non-ESBL producer isolates. All these strains have been

isolated from urine.

Globally, among the 85 3GC-resistant E. coli strains, 53 (62.4%) were ESBL

producers. These strains were mostly isolated from urine.

95

Table 1. Bacterial isolates analyzed in this study.

All 57 ESBL-positive strains possessed at least one ESBL-encoding gene. Distribution of

the organisms from which these genes were found is shown in Figure 1.

Sequencing revealed that 52 (89,7%) and 3 (5,2%) isolates were CTX-M and SHV-

12 ESBL producers, respectively.

Further typing of the 52 CTX-M revealed that 35 (67,3%), 14 (26,4%), and 3

(5,8%) were, respectively, CTX-M-15, CTX-M-27, and CTX-M-2.

One strain (1,8%) did not harbor any of the β-lactamase genes targeted. PCR

analysis performed on this strain to verify the presence of GES, PER, and VEB

ESBLs revealed that it produces VEB.

Three SHV-12, 21 CTX-M, and one VEB producers also harbored the non-ESBL

TEM-1.

One isolate contained SHV-12, CTX-M-15, and the non-ESBL TEM-1.

ESBL positive E. coli Blood 1 1,8E. coli Pus 2 3,5E. coli Urine 50 87,7K. pneumoniae Urine 2 3,5M. morgannii Urine 1 1,8P. mirabilis Pus 1 1,8

Total 4 3 57 100 ESBL negative C. braakii Urine 1 2,5

E. cloacae Urine 1 2,5E. cloacae Catheter 1 2,5E. cloacae Wound 2 5E. coli Urine 32 80M. morgannii Urine 1 2,5P. mirabilis Urine 2 5

Total 5 3 40 100

% of total Phenotype Organism Isolated sites No. of isolates

96

Figure 1. Distribution of the 57 ESBL-positive strains described in this study.

Figure 2 shows a comparison of the prevalence of E. coli ESBL producers between our

Quebec City 2011 study and the Canadian Ward Surveillance Study (CANWARD 2008).

The CANWARD 2008 study assessed the prevalence of antimicrobial-resistant bacteria

from January 1st to 31 December 2008 in 10 medical centers from all regions in Canada,

including two hospitals in Montreal, Québec. Bacterial isolates were collected from blood,

respiratory tracts, urine, and wound infections. E. coli was the predominant

Enterobacteriaceae bacteria isolated in the CANWARD study, mainly in blood and urine.

Of the E. coli isolates tested, 4.9% were ESBL producers in this study.

97

Both studies indicated the predominance of CTX-M-15 in E. coli ESBL producers.

CTX-M-14 was found only in the Canadian study.

A high prevalence of CTX-M-27 (26,4%) was observed in Quebec City as

compared to the Canadian study (3,5%).

SHV-2a and TEM-12 were observed only in the Canadian study whereas SHV-12

and CTX-M-2 were unique to Quebec City hospitals.

No ESBL-encoding gene has been identified in 5,5% of the E. coli ESBL producers

in the CANWARD study.

Figure 2. Comparison of the prevalence of ESBL-producing E. coli isolates from our

Quebec City 2011 study and the CANWARD 2008 study.

98

We have verified the presence of the O25b-ST131 clone in the 52 E. coli CTX-M

producers. Results are presented in Table 2.

The percentages of E. coli strains producing CTX-M-15, CTX-M-27, and CTX-

M-2 belonging to the ST131-O25b clone were 62%, 100%, and 33,3%,

respectively.

The insertion sequence ISEcp1 was found 49 pb upstream of all blaCTX-M-15

genes.

Table 2. Proportion of O25b-ST131 clone among E. coli isolates producing CTX-M.

Conclusions

The predominance of CTX-M-15 E. coli producers is comparable between Quebec

City hospitals and the Canadian study.

An increased prevalence of E. coli CTX-M-27 producers has been observed in the

Quebec City study compared to the CANWARD 2008 study.

A rapid PCR detection method showed that 62%, 100%, and 33,3% of E. coli

strains producing CTX-M-15, CTX-M-27, and CTX-M-2 belonged to clone O25b-

ST131, respectively.

These results showed a clonal dissemination of CTX-M-27 E. coli producers in the

two Quebec City hospitals.

No ESBL-producer of TEM-type has been identified in our study.

ISEcp1 seemed to be involved in the mobilization process of blaCTX-M-15 genes.

CTX-M-15 34 21 62CTX-M-27 14 14 100CTX-M-3 3 1 33,3

No. of isolates producing CTX-MCTX-M type No. of clonal complex

O25b-ST131 % of total

99

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Acknowledgments We thank Maurice Boissinot for his helpful advice on molecular typing.

101

Chapitre 5

Conclusions et perspectives

102

Ce manuscrit a d’abord présenté la situation actuelle mondiale de l’augmentation de la

résistance aux antibiotiques, et plus particulièrement des β-lactamines, chez les bactéries à

Gram négatif. Les β-lactamines à large spectre, dont les céphalosporines de troisième

génération et les carbapénèmes, généralement utilisées dans le traitement des infections

causées par des bactéries multirésistantes, n’ont pas échappé à ce phénomène croissant. En

effet, la production d’enzymes capables d’inactiver l’action de ces antibiotiques soit les β-

lactamases à spectre étendu et les carbapénémases sont majoritairement responsables de

cette résistance. L’impact de ce phénomène a une conséquence directe sur l’efficacité de

l’antibiothérapie donnée en cas d’infections causées par des bactéries à Gram négatif

multirésistantes. Actuellement, les méthodes utilisées en routine pour la détection de

résistance à ces antibiotiques sont principalement phénotypiques. Un minimum de 48 h est

généralement nécessaire avant l'obtention des résultats. Ainsi, l’Organisation mondiale de la

Santé a recommandé des mesures de contrôle et de prévention afin de réduire le risque de

transmission. Ces stratégies incluent l’identification des bactéries productrices de BLSE et

de carbapénémases par des méthodes diagnostiques rapides de même que la mise en place

d’une surveillance épidémiologique des principaux gènes de résistance encodant ces

enzymes. Les deux projets majeurs réalisés aux cours de mes recherches visaient à élaborer

deux stratégies essentielles pour contrer la transmission des bactéries résistantes, plus

particulièrement les enzymes du type BLSE et les carbapénémases. Ce travail s’inscrit donc

dans le cadre de développement d’outils moléculaires afin de faire face à cette problématique.

D’une part, un nouvel essai PCR en temps réel a été développé afin de détecter

simultanément les 5 gènes codant pour les carbapénémases les plus importantes au niveau

épidémiologique. Cet essai PCR, sensible et spécifique, permettra d’identifier rapidement

(moins de 2h) les patients infectés ou les porteurs asymptomatiques. Cet essai PCR en

temps réel permettant la détection des gènes codant pour les carbapénémases pourrait

s’appliquer :

Au dépistage de porteurs sains (sensibilité)

À la détection d’isolats résistants

À la détection dans un échantillon clinique (selles)

103

Ainsi, il serait intéressant de détecter les gènes de carbapénémases avec cet essai PCR dans

des échantillons autres que les selles tel que le sang, l’urine, etc. Ceci exigerait toutefois

l’optimisation d’autres protocoles de préparations d’échantillons compatibles avec l’essai

PCR. De plus, il serait intéressant d’intégrer l’essai PCR multiplex dans une plateforme

Point of care, une tendance dans le développement des outils de diagnotic qui va permettre

une réponse directement au chevet du patient.

D’autre part, l’étude épidémiologique moléculaire réalisée a permis l’identification des

variants et a montré que CTX-M-15 et CTX-M-27 sont les BLSE les plus fréquemment

retrouvées dans les infections causées par les Enterobacteriacae résistants aux C3G dans la

ville de Québec. La forte prévalence de CTX-M-15 corrobore les études épidémiologiques

globales. Toutefois, la forte prévalence de CTX-M-27 n’a pas été observée dans d’autres

régions du Canada. Les résultats de séquençage ont été regroupés dans un format qui

permet l’interrogation des données permettant d’établir des liens entre les variants de gènes

et :

Le site d’infection

Le site d’acquisition

Les conditions de santé du patient

Ces résultats démontrent que ces approches moléculaires pourraient être utilisées dans les

laboratoires de microbiologie clinique afin de faciliter la détection et la surveillance des

bactéries productrice de BLSE et de carbapénémases.

105

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