4 Hasil dan Pembahasan - Perpustakaan Digital ITB ... · PDF fileProfil sekresi...
Transcript of 4 Hasil dan Pembahasan - Perpustakaan Digital ITB ... · PDF fileProfil sekresi...
4 Hasil dan Pembahasan
α-Amilase adalah enzim menghidrolisis ikatan α-1,4-glikosidik pada pati. α-Amilase
disekresikan oleh mikroorganisme, tanaman, dan organisme tingkat tinggi. α-Amilase memiliki
peranan yang penting dalam metabolisme karbohidrat (Kandra, 2003). Selama ini, telah banyak
dilakukan penelitian mengenai α-amilase. Akan tetapi, penelitian mengenai α-amilase dari
bakteri laut Vibrio sp. masih sangat sedikit. Oleh karena itu, penelitian dengan topik tersebut
merupakan hal yang sangat menarik.
Pada penelitian sebelumnya, telah dilakukan isolasi dan identifikasi bakteri laut Vibrio sp.
B10.2.8 (O. Karnaradjasa dan D. Natalia, dkk., data belum dipublikasi). Pada penelitian ini telah
dilakukan karakterisasi α-amilase yang disekresikan oleh bakteri Vibrio sp. B10.2.8.
Karakterisasi yang dilakukan meliputi profil sekresi α-amilase pada pertumbuhan Vibrio sp.
B10.2.8, identifikasi massa molekul, penentuan pengaruh pH dan suhu pada aktivitas α-amilase,
dan analisis kemampuan α-amilase dalam mendegradasi pati mentah dengan melakukan analisis
gula pereduksi yang dilepas α-amilase dalam mendegradasi pati mentah.
4.1. Sekresi α-amilase oleh Vibrio sp. B10.2.8
Uji kualitatif aktivitas α-amilase dilakukan untuk mengkonfirmasi adanya sekresi α-amilase oleh
Vibrio sp. B10.2.8 dan menentukan waktu optimum pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8. Tahapan
untuk mengkonfirmasi adanya α-amilase yang disekresikan oleh Vibrio sp. B10.2.8 dilakukan
dengan menumbuhkan Vibrio sp. B10.2.8 di media marine broth padat yang mengandung pati
dapat larut 1% selama 24 jam. Pada pengujian ini diperlukan kontrol. Kontrol yang digunakan
adalah media marine broth padat yang tidak ditumbuhkan Vibrio sp. B10.2.8. Perubahan warna
diamati setelah ke dalam media yang ditumbuhkan Vibrio sp. B10.2.8 dan kontrol dituangkan
larutan KI/I2. Reaksi I2 dengan pati akan menghasilkan warna biru.
Jika pati direaksikan dengan senyawa-senyawa makromolekul biologis seperti enzim, maka akan
terbentuk suatu senyawa kompleks (Yune Li, 2003). Dengan demikian, ketika Vibrio sp. B10.2.8
mensekresikan α-amilase, maka α-amilase akan bereaksi dengan pati dapat larut yang ada pada
media marine broth dan menghidrolisis pati dapat larut tersebut. Warna bening (Gambar 4.1)
menunjukkan adanya α-amilase yang disekresikan oleh Vibrio sp. B10.2.8. Warna bening
terbentuk karena pati dapat larut yang ada pada media telah dihidrolisis oleh α-amilase sehingga
tidak terbentuk kompleks pati dapat larut dengan I2.
A B
Gambar 4.1 Uji kualitatif sekresi α-amilase oleh Vibrio sp. B10.2.8
Keterangan: (A) media marine broth padat (pati dapat larut 1%) tanpa ditumbuhi Vibrio sp. B10.2.8. (B) media marine broth padat (pati dapat larut 1%) yang ditumbuhi Vibrio sp. B10.2.8.
4.2. Profil sekresi α-amilase pada pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8
Profil sekresi α-amilase merupakan gambaran produksi α-amilase oleh bakteri Vibrio sp. B10.2.8
pada setiap waktu pertumbuhan. Dengan mengetahui profil sekresi α-amilase oleh Vibrio sp.
B10.2.8, maka dapat ditentukan waktu optimum pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8 sehingga dapat
dihasilkan α-amilase dalam jumlah besar dan memiliki aktivitas yang maksimum. Tahapan
untuk mendapat mendapatkan profil sekresi α-amilase oleh bakteri Vibrio sp. B10.2.8 pada
setiap waktu pertumbuhan dilakukan dengan memasukkan 1 mL inokulum Vibrio sp. B10.2.8 ke
dalam media marine broth cair 100 mL dalam erlenmeyer 500 mL. Media berisi inokulum
tersebut kemudian dikocok dalam shaking incubator dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 30
°C. Proses sampling dilakukan dengan mengambil 1 mL kultur dan dimasukkan dalam tabung
Eppendorf 1,5 mL pada interval waktu 0, 3, 6, 9, 12, 15, 16, 18, 19, 22, 25 jam pertumbuhan
bakteri. Semua proses di atas harus dilakukan secara aseptik. Sampel kemudian diukur besar
29
densitas optiknya pada panjang gelombang 600 nm (OD600) untuk mengetahui jumlah sel bakteri
yang tumbuh. Aktivitas α-amilase yang disekresikan oleh Vibrio sp. B10.2.8 ditentukan dengan
menggunakan metode Fuwa (1954).
Fasa pertumbuhan bakteri terdiri atas tiga tahap, yaitu fasa lag, fasa log, dan stasioner. Fasa lag
merupakan tahap dimana bakteri beradaptasi dengan lingkungan, dalam hal ini adalah media
pertumbuhan. Fasa lag biasanya terjadi pada jam ke-0 sampai jam ke-2 waktu pertumbuhan.
Fasa log adalah tahap dimana terjadi pertumbuhan bakteri dalam jumlah besar. Pada tahap ini,
jumlah nutrisi akan berkurang dalam jumlah yang cukup besar karena digunakan bakteri untuk
proses pertumbuhan. Memasuki fasa stasioner, bakteri-bakteri mulai mengalami kematian. Akan
tetapi, pada tahap ini juga masih mungkin terjadi lahirnya bakteri dengan jumlah yang hampir
sama dengan bakteri yang mati. Salah satu penyebab kematian bakteri tersebut adalah karena
kurangnya jumlah nutrisi. Bentuk adaptasi bakteri-bakteri yang lahir pada tahap ini adalah
dengan meminimalisasi proses metabolisme (Wai et al., 1999).
Pada Vibrio sp. B10.2.8, fasa lag terjadi dalam waktu yang singkat. Hal ini disebabkan karena
inokulum yang dimasukkan ke dalam media telah diinokulasi pada media yang sama sehingga
tidak memerlukan waktu yang lama untuk beradaptasi dengan lingkungan yang baru. Fasa log
terjadi sekitar jam ke-3 sampai jam ke-13 waktu pertumbuhan. Fasa stasioner mulai terjadi
setelah jam ke-13 waktu pertumbuhan (Gambar 4.2).
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0 3 6 9 12 15 16 18 19 22 25
Waktu pertumbuhan (jam)
OD60
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Aktiv
itas a
-amila
se (U
/mL)
Pertumbuhan bakteriAktivitas alfa-amilase
Gambar 4.2 Pola pertumbuhan Vibrio sp. B10.2.8 dan profil α-amilase yang disekresikan
30
Produksi α-amilase meningkat seiring dengan waktu pertumbuhan dan mencapai nilai
maksimum pada akhir fasa log. Akan tetapi, peningkatan produksi dan aktivitas α-amilase yang
disekresikan berada dalam keadaan konstan ketika sel mulai memasuki fasa stasioner (Gambar
31
4.2). Adanya proses minimalisasi proses metabolisme oleh bakteri pada tahap ini menyebabkan
enzim yang disekresikan menjadi kurang stabil dan aktivitasnya (Wai et al., 1999).
Hasil yang didapat pada penelitian ini sesuai dengan penelitian yang telah dilakukan sebelumnya
(Najafi et al., 2005). Menurut penelitian tersebut, Vibrio sp. mensekresikan α-amilase pada
setiap fasa pertumbuhannya. Produksi dan aktivitas α-amilase yang disekresikan meningkat
seiring waktu pertumbuhan dan mencapai nilai maksimum pada akhir fasa log.
4.3. Produksi α-amilase
Produksi α-amilase oleh Vibrio sp. B10.2.8 dilakukan dengan menggunakan media marine broth
cair. Dari 225 mL kultur diperoleh α-amilase dengan kadar protein total 3,93 µg/mL. Aktivitas
total dari kultur supernatan α-amilase oleh Vibrio sp. B10.2.8 adalah 27263,25 Unit. Kultur
supernatan α-amilase ini kemudian difraksinasi 0-70% (NH4)2SO4 dan didialisis. α-Amilase hasil
fraksinasi 0-70% (NH4)2SO4 dan dialisis ini kemudian disebut dengan fraksi 70%.
Pada akhir fraksinasi dan dialisis, didapatkan fraksi 70% α-amilase sebanyak 27 mL, dengan
kadar protein total 11,91 µg/mL. Aktivitas total fraksi 70% α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 adalah
sebesar 2364,12 Unit.
4.4. Pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
Aktivitas suatu enzim dipengaruhi oleh keadaan lingkungan. Salah satu faktor yang dapat
mempengaruhi aktivitas enzim adalah pH. Perubahan pH dapat menyebabkan perubahan
aktivitas enzim. Pada proses katalisis oleh α-amilase, keadaan pH yang terlalu rendah (suasana
asam) dapat menyebabkan proses protonasi oleh Asp tidak dapat berjalan dengan baik.
Sebaliknya, pada keadaan pH yang terlalu tinggi (suasana basa), proses deprotonasi hidrogen
donor (Glu) tidak dapat berlangsung dengan sempurna. Dengan demikian, bisa disimpulkan
bahwa profil pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase bergantung dari pKa kedua sisi aktif
enzim tersebut (Nielsen et al., 2001). Gambaran pengaruh lingkungan pada nilai pKa kedua sisi
aktif enzim tersebut dapat dilihat pada Gambar 4.6.
Gambar 4.3 Pengaruh pH pada sisi aktif enzim α-amilase
Pengujian pengaruh pH terhadap α-amilase yang disekresikan oleh Vibrio sp. B10.2.8 dilakukan
dengan melakukan uji aktivitas α-amilase fraksi 70% terhadap pati dapat larut pada rentang pH 5
hingga pH 8 dengan metode Fuwa (1954). Pada pH 5, aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
masih rendah. Aktivitas ini mencapai nilai maksimum pada pH 6 dan masih relatif stabil pada
pH 6,5. Aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 mulai menurun pada pH 7 (Gambar 4.4). Dengan
demikian, bisa disimpulkan bahwa α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 memiliki pKa pada rentang pH
netral. Hasil yang diperoleh pada penelitian ini tidak beda jauh dengan hasil yang diperoleh pada
penelitian sebelumnya. Pada penelitian ini α-amilase yang disekresikan memiliki aktivitas dan
kestabilan pada rentang pH 6,5 hingga pH 7,5 (Nielsen et al., 2001).
32
0
20
40
60
80
100
120
4 5 6 7 8
pH
Aktiv
itas a
-amila
se (U
/mL)
9
Gambar 4.4 Pengaruh pH terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
4.5. Pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
Suhu merupakan faktor yang juga dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Pengujian untuk
menentukan pengaruh enzim terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 dilakukan dengan
menguji aktivitas pada suhu 30 °C hingga suhu 80 °C menggunakan metode Fuwa (1954).
Pada suhu 30 °C, α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 memiliki aktivitas yang cukup tinggi. Aktivitas
ini semakin meningkat dan mencapai nilai optimum pada suhu 50 °C. Aktivitas α-amilase Vibrio
sp. B10.2.8 mulai menurun cukup drastis pada suhu 60 °C hingga 80 °C (Gambar 4.5).
0
2040
60
80
100120
140
160
0 20 40 60 80 1
Temperatur (°C)
Aktiv
itas a
-amila
se (U
/mL)
00
Gambar 4.5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
33
Pada suhu rendah, enzim memiliki struktur yang rigid karena kurangnya energi untuk
pergerakan molekul enzim. Dengan demikian, fleksibilitas enzim untuk melakukan proses
katalisis masih rendah. Pada suhu tinggi, vibrasi molekul enzim sangat besar sehingga
mengakibatkan putusnya ikatan-ikatan yang lemah (Gianese et al., 2002). Enzim yang ada pada
keadaan ini disebut dengan enzim yang telah mengalami denaturasi.
4.6. Identifikasi berat molekul α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
Penentuan berat molekul α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 dilakukan dengan metode SDS-PAGE,
silver staining, dan zimografi. Metode SDS-PAGE dilakukan untuk memisahkan protein dalam
medan listrik. Metode silver staining dilakukan untuk mengidentifikasi keberadaan protein.
Metode silver staining kurang spesifik karena pita yang muncul bukan hanya pita α-amilase saja.
Oleh karena itu, digunakan juga metode zimografi yang sangat spesifik untuk α-amilase.
Sebelum dilakukan metode zimografi, gel elektroforesis SDS-PAGE diinkubasi dalam larutan
buffer fosfat pH 6 20 mM selama 1 jam. Proses ini bertujuan untuk merenaturasi α-amilase
Vibrio sp. B10.2.8 pada gel. Setelah itu, gel diinkubasi dalam larutan pati 1% selama 30 menit.
Adanya pita bening pada permukaan gel yang berwarna biru menunjukkan adanya α-amilase.
Pita ini terbentuk karena adanya aktivitas α-amilase menghidrolisis pati selama proses inkubasi.
1 2 3
Gambar 4.6 Identifikasi berat molekul α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
Keterangan: (1) protein penanda; (2) α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 hasil pewarnaan perak; (3) α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 hasil zimograf
34
35
4.7. Kemampuan hidrolisis pati mentah α-amilase Vibrio sp. B10.2.8
Tidak semua α-amilase mampu mendegradasi pati mentah secara langsung. α-Amilase yang
dapat menghidrolisis pati mentah adalah α-amilase yang memiliki domain pengikat pati (starch
binding domain, SBD). Dengan adanya domain ini, afinitas pati mentah terhadap enzim semakin
meningkat.
Penentuan kemampuan hidrolisis pati mentah α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 dilakukan dengan
menganalisis produk akhir α-amilase terhadap pati mentah yang digunakan. Analisis ini
dilakukan dengan metode antron. α-Amilase Vibrio sp. B10.2.8 diinkubasi dengan pati mentah
5% (b/v) pada pH 7,0 selama 96 jam dalam shaking incubator berkecepatan 150 rpm pada suhu
30 °C. Sebagai kontrol, α-amilase diganti dengan bufer fosfat pH 7,0 20 mM. Berdasarkan data
yang didapat (Lampiran F), tidak ada perbedaan kadar glukosa antara kontrol dengan sampel.
Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa α-amilase Vibrio sp. B10.2.8 tidak dapat
menghidrolisis pati mentah.