Isolasi Gen α-Amilase B. aquimaris MKSC 6.2

dengan Teknik Degenerate PCRdan Inverse PCR

Fernita Puspasari

-1,4-glikosidik

-1,6-glikosidik

dekstrin

oligosakarida linier

glukosa maltosa

amilopektin

amilosa

α-Amilase• Hidrolisis ikatan -1,4 glikosidik polisakarida• Protein multidomain • Aplikasi: makanan, detergen, kertas, tekstil,

bioetanol

• Hidrolisis pati: gelatinisasi suhu ↑, biaya ↑-Amilase pendegradasi pati mentah:

biaya ↓, menyederhanakan proses konversi pati.

Suspensi pati

sakarifikasigelatinisasi likuefaksi

105 oC

α-amilase termostabi

l

50-60 oC

glukoamilase

Industri Pengolahan Pati

Sampel

Bacillus aquimaris MKSC 6.2• Bakteri laut, berasosiasi dengan koral lunak

Sinularia sp. perairan P. Merak Kecil

Identifikasi bakteri: penjajaran urutan nukleotida gen 16S rRNA

1: Bacillus aquimaris MKSC 6.22: bakteri yang tidak mampu mendegradasi pati mentah

Media: marine agar plate+1% pati kentang mentah+KI/I2

Kemampuan mendegradasi pati mentah

1 hari 2 hari

1

2

5 µm 10 µm5 µm 10 µm 1 µm

5 µm 10 µm5 µm 10 µm 1 µm

jagung singkong sagu kentang beras

Scanning Electron Microscopy

• Belum ada informasi genom B. aquimaris• Bagaimana mengisolasi gen α-amilase B.

aquimaris

• Konstruksi perpustakaan genom (genomic library)

• PCR

Konstruksi Koleksi Genom Parsial

DNA genomDNA vektor

potong

ligasi

Transformasi E.coli

potong

Penapisan

. .

Enzim restriksi

Enzim restriksi

-Uji aktivitas-Hibridisasi DNA-Hibridisasi protein

Koleksi Genom Parsial B. aquimaris

plasmid

sisipan

Pemotongan dengan EcoR I

23.130 pb

9.416 pb

6.557 pb

4.361 pb

2.322 pb

2.027 pb

λ/Hind III

genom B. aquimaris/EcoR I

•Diperoleh 5000 koloni transforman•Masalah: penapisan false positive

Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)

• http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

No Clone 5’-end 3’-end

1. 66(4) Ribosomal protein (S18)-alaninine acetyltransferase (Bacillus sp. SG-1), 65% identity

Peptidase M22 glycoprotease (B. weihenstephanensis), 62% identity

2. 36(7) Aspartate aminotransferase (Bacillus sp. SG-1), 68% identity.

ATP-dependent DNA helicase/ DNA pol. III subunit ε (Bacillus sp. SG-1), 69% identity

3. 59(10) ATP-dependent DNA helicase (Bacillus sp. SG-1), 68% identity

Glycrone-kinase protein(Bacillus sp. SG-1), 72% identity

4. 10(7) N-acetylmuromoyl-L-alanine amidase (B. coahuilensis), 40% identity

Polysaccharide biosynthesis protein (Pelobacter carbinolicus), 42% identity

5. 45(13) Epidermal surface antigen (Bacillus sp. SG-1), 91% identity

Epidermal surface antigen (Bacillus sp. SG-1), 74% identity

Analisis in silico ±800 bp ±800 bp

Degenerate PCR

Komponen PCR

• Templat

• DNA polimerase

• Bufer DNA polimerase

• dNTP

• Primer forward (degenerate)

• Primer reverse (degenerate)

forward reverse

Degenerate Primer

• >< specific primer

• Campuran primer yang mirip

• Dirancang dari urutan asam amino yang telah diketahui atau hasil penjajaran gen yang sama dari beberapa organisme lain yang telah diketahui

Empat Daerah Lestari Keluarga -Amilase

A CB

B. coahulensisBacillus sp. SG-1B. weihestephanensisB. coahuilensis

B. weihestephanensisB. coahuilensisB. coahuilensisBacillus sp. SG-1B. licheniformisB. subtilis

Ac. No. Organisme I II IV V

ZP_03225714 B. coahuilensis

MKVILDFVVNHVG

IDGYRLDTVRHV

FIDNHD

PIVYYGSEIALNG

ZP_01861961.1 Bacillus sp. SG-1

MKIVLDFIVNHVG

IDGYRLDTVRHV

FIDNHD

PILYYGSEIALSG

YP_001646639

B. weihenstephanensis

IKVMLDAVFNHSG

IDGWRLDVANEV

LLDSHD

PCIYYGDEIGMDG

ZP_03225711 B. coahuilensis

IKVMLDAVFNHSG

IDGWRLDVANEV

LIGSHD

PCIYYGDEIGLTG

Daerah Lestari berbagai Bacillus

Primer Region Urutan nt ambg Tm

F1 I GAYTTYRTYGTSAATCAYGTYGG 23 7 55.6460

F2 II GAYGGRTAYCGTCTRGATACYG 22 5 58,9562

R1 II CRGTATCYAGACGRTAYCCRTC 22 5 58,9562

R2 IV AATCGWMYCATATCATGGTTATC 23 3 55,6460

R3 V CGYTTAAAGCAATTTCWGATCC 22 2 57,0860

R4 V CAGATCCRTAGTAAASAATSGG 22 3 56.2260

Rancangan Primer

Perancangan Degenerate Primer

• Panjang: ~20 (18-24)

• Ujung 3’: G/C

• 3 basa di ujung 5’ dan 3’ tidak boleh komplemen

• %GC: 40-60, Tm: ~60oC

• Ujung 3’: hindari degenerate, dipillih basa yang pasti

5 4 3 2 1x normal

Variasi jumlah primer

Pengaruh jumlah primer

Primer yang diperlukan pada degenerate PCR jauh lebih banyak daripada PCR biasa (5-10X)

Normal: 20 pmol/50 μL reaksiDegenerate: 100-200 pmol/50 μL reaksi

14371

536

658

238

320

442

307-329 523-544 820-842 943-964

For 1 For 2

Rev 1

Rev 2 Rev 3

928-949

Rev 4

643

427

643 pb

307 949

Isolasi gen α-amilase: degenerate PCR

Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1

Inverse PCR

Komponen PCR

• Templat

• DNA polimerase

• Bufer DNA polimerase

• dNTP

• Primer forward (spesifik)

• Primer reverse (spesifik)

643 pb

forwardreverse

Inverse PCR

kromosom

Enzim restriksi

Self-ligasi

PCRHasil PCR

1523

427949

11-30 117-136

155-160

165-184 388-407

Cla I

Harus ada daerah yang telah diketahui urutannya dengan pasti: menentukan enzim restriksi, merancang primer spesifik

InvF

InvR

ClaI

InvR

InvF

ClaI ClaI

ClaI InvR

InvF

ClaI

ClaI ClaI

Pemotongan dengan enzim restriksi

Self-ligasi

PCR

Isolasi gen α-amilase: inverse PCR

307 949

ClaI

949112

HindIII

112 1437

HindIII

-102 1437

15391

Rujukan penomoran: gen α-amilase Bacillus sp. SG1

643 pb

838 pb

1326 pb

1539 pb

ATGAAAAGAAGAGTACTATCTCTCATTTTAGTCCCGTTTCTTCTTTTTTACGCCCTTCCGGTAGGTGCAGTTGAAAAAGAAGAACGAAAG M K R R V L S L I L V P F L L F Y A L P V G A V E K E E R KTGGCAGGATGAAACAATTTATTTCCTAATGGTAGATCGCTTTAACAATGGTGATCCAACAAATGATAAAGAAGTGAACACAAAGGATCCC W Q D E T I Y F L M V D R F N N G D P T N D K E V N T K D PAAGGCTTACCATGGCGGTGATTTCCAAGGGGTTATCGATCGATTGGATTACATCAAAGATATGGGATTCACTTCCATATGGCTGACTCCC K A Y H G G D F Q G V I D R L D Y I K D M G F T S I W L T PGTATTTGACAACCAGCCAAAAGGATACCATGGATATTGGATTACGGACTTTTATAAGACCGACGAGCATTTCGGTACGATGGAAACGTTC V F D N Q P K G Y H G Y W I T D F Y K T D E H F G T M E T FAAAAAGCTTGTAGAAGAAGCACATAAGCGGGATATGAAAGTCGTCCTTGATTTTGTGGTTAACCATGTGGGGCCGGAGCATCCCTGGGTG K K L V E E A H K R D M K V V L D F V V N H V G P E H P W VGATGACCCTGCAAAAGAAGACTGGTTCCACGAAAAACAGCCAATGAACTTCTCCGACAAAGAAAGTCTTCAGAACGCATGGCTGTATGAC D D P A K E D W F H E K Q P M N F S D K E S L Q N A W L Y DCTTCCTGATTTAAACACAGAGAATCCCGAAGTAAGGGAATATCTCTTTGATGCTGCCAAATGGTGGATCAAAGAAACGGATGTCGACGGT L P D L N T E N P E V R E Y L F D A A K W W I K E T D V D GTATCGTCTGGACACGGTGCGCCATGTTCCACAAGATTTTTGGAGTGATTTCAGTAAAGAAGTTAAATCAGTGAAAGACGATTTTTATCTT Y R L D T V R H V P Q D F W S D F S K E V K S V K D D F Y LCTTGGTGAAGTGTTTGATCGTGACCCACAGAAGATAGCAGAATATAACGATGTGGGTATCGATGGATTCGTTAATTTCCCCCAAGCTGAA L G E V F D R D P Q K I A E Y N D V G I D G F V N F P Q A EGAATTACGTTCAGTGTTTAACAAACCTGATACTTCAATGGACAGGTTGTTCAATTTCTGGAAGTACAATGAAACATTTTATGAAGATCCT E L R S V F N K P D T S M D R L F N F W K Y N E T F Y E D PTATTTGATGGGGACTTTTATAGACAACCATGATATGGAACGTTTTACACGTTTATTGGTACAGGAAAATGTTTTCCCTGGTACCCGTTGG Y L M G T F I D N H D M E R F T R L L V Q E N V F P G T R WAAACTCGCCTTGACATATATGTACACGACTCCGGGAATACCGATTGTGTATTATGGGTCTGAAATTGCCATGGATGGCGGGGAAGACCCG K L A L T Y M Y T T P G I P I V Y Y G S E I A M D G G E D PGATAACCGGCGGTTGATGAATTTCAGGGCCGACAAAGAACTGATTGATTACATTTCAAAACTGGGCAAGGTTCGAAAGGACTATCCTGCT D N R R L M N F R A D K E L I D Y I S K L G K V R K D Y P ATTGACAAGAGGAACGATAGAGCCGTTGTATGAACAAGACGGATTGGGAATATATAAACGCGCATACAAAGATCAAACGGTGGTTGTAGCC L T R G T I E P L Y E Q D G L G I Y K R A Y K D Q T V V V AATCAATAATTCCAGTGAGACCCAAACTGTCGAACTTGATGAAGGGGAGCTTGCTGATAACAATGAACTAAAAGGGTTACTTTCAGATGAC I N N S S E T Q T V E L D E G E L A D N N E L K G L L S D DCTGGTGAGAAGCGATGAAAACGGGACGTATAAAGTCGCTTTGGATCGTGAAGAAGCAGAGATTTATCTGCTTAAAGCCAAAAGTGGACTG L V R S D E N G T Y K V A L D R E E A E I Y L L K A K S G LAACATCCCATATTTATCAGCACTTGCTGCGGTGTATGTATTATTTTTATTATTTATTTATCTAGTATGGAAACGCGGAAGAAAAAACCGC N I P Y L S A L A A V Y V L F L L F I Y L V W K R G R K N RAAATCATAA 1539 bp K S . 512 aa

Urutan Gen -Amilase B. aquimaris MKSC 6.2