Purification and Characterization of Extracellular α-Amilase

Enzyme from Locale Bacteria Isolate Bacillus Subtilis

ITBCCB148Nama Kelompok :

1. Leonardo (11-105)2. Christiana Desi (11-106)3. Fransisca S.T. (11-107)

4. Prasetyo Hendy (11-108)5. Betzylia W. (11-109)

6. Elyn P. (11-110)7. Vincentius Henry (11-111)

8. Albertus J.P. (11-112)9. Agustine K. (11-113)

Pendahuluan

Latar Belakang • Kegunaan enzym α-amilase ?• Enzym adalah ? Fungsi enzym ?• Bacillus subtilis ?• Kromatografi Kolom ?

Rumusan Masalah 1. Bagaimana cara isolasi dan pemurnian enzim

alfa amilase dari bakteri Bacillus Subtilis ?2. Apa kegunaan enzim alfa amilase dibidang

industri ?Tujuan 3. Mengetahui cara isolasi dan pemurnian enzim

alfa amilase dari bakteri Bacillus Subtilis.4. Mengetahui kegunaan enzim alfa amilase

dibidang industri.

Manfaat Mendapat informasi cara mengisolasi dan pemurnian serta kegunaan enzim alfa amilase dari bakteri Bacillus Subtilis.

DAFTAR PUSTAKA• Bintang, M., 2010, Bikimia Teknik Penelitian,

Erlangga, Jakarta, pp. 144.• Campbell, A. N., 2002, Biologi, Erlangga,

Jakarta, pp. 98.• Guyton, 2006, Buku Ajar Fisiologi Kedokteran,

EGC, Jakarta, pp. 841.• Yuwono, T., 2008, Biologi Molekuler, Erlangga,

Jakarta, pp. 11.

Bahan dan Metode

Bahan

• Bakteri isolat lokal B. subtilis ITBCCB148• α-Amilase tipe II A (katalog nomor 6380) dari Bacillus sp.

Bahan dan MetodeMetode

Tahapan penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut:

produksiIsolasipemurnian dan mengkarakterisasi enzim yang

dimurnikan.

Produksi α-amilase

Diproduksi dalam media fermentasi yang mengandung: amilum 0,5%, ekstrak ragi 0,5%, KH2PO4 0,05%, dan 0,01% CaCl2.2H2O dengan pH 6,6. Suhu fermentasi 32 ° C, dan selama 72 jam dengan kondisi yang sama digunakan untuk isolasi protease (Yandri et al, 2007).

Isolasi α-amilaseα-Amilase pada media fermentasi dipisahkan dari sel bakteri lokal isolat B. subtilis ITBCCB148 dengan cara sentrifuge menggunakan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit untuk memperoleh ekstrak enzim baku (Yandri et al., 2007).

Pemurnian α-amilase Dilakukan dalam beberapa langkah, yaitu:

fraksinasi ekstrak baku dengan garam amonium sulfat

ion penukar kolom kromatografi dan molekul filtrasi kolom kromatografi untuk mendapatkan enzim yang dimurnikan (Yandri et al, 2007) .

Aktivitas uji α-amilase dan penentuan kadar protein

Aktivitas α-amilase dilakukan dengan metode yodium (Fuwa, 1954) dan menggunakan pereaksi asam dinitrosalycilic (Mandels et al., 1976). Kandungan protein ditentukan berdasarkan metode Lowry. (1951).

Karakterisasi pemurnian enzim

Karakterisasi pemurnian enzim meliputi: penentuan pH optimum dan suhu data kinetik berat molekul stabilitas terhadap suhu dan pH. 66

(Yandri, Tati Suhartati dan Sutopo Hadi)

Hasil dan Pembahasan

• Untuk isolasi dan pemurnian enzim α-amilase terlebih dahulu menyiapkan ekstraksi media pertumbuhan yang berisi enzim ekstraseluler yang telah disentrifugasi untuk mendapatkan ekstrak enzim mentah.

Hasil dan Pembahasan

• Dilakukan melalui beberapa tahap :Fraksinasi dengan amonium sulfatDEAE-selulosa kromatografi kolomCM-selulosa kromatografi kolomAyakan Molekuler kromatografi dengan Sephadex G-

100

- Prinsip yang mendasari fraksinasi kolom penukar ion

Kromatografi kolom penukar ion memisahkan protein berdasarkan muatan netonya (Steve, 2008)

• 3.1.4 Ayakan Molekuler kromatografi dengan Sephadex G-100- hasil percobaan- Prinsip yang mendasari kromatografi kolom filtrasi gel

molekul kecil masuk ke pori

matriks polimer

molekul besar tidak dapat masuk ke pori

Gambar 2. Pemisahan protein berbeda ukuran dengan kromatografi filtrasi gel, protein besar keluar lebih awal daripada protein lebih kecil (Steve, 2008)

• 3.1.5 tes homogenitas kemurnian enzym dengan electrophoresis SDS polyacrylamide - Hasil Percobaan - Prinsip yang mendasari elektrophoresis

3.2. Perbandingan karakteristik enzim murni dengan α-Amilase (EC. 3.2.1.1) type II dari Bacillus sp.

• Karakteristik enzim murni :– Lebih stabil pada kondisi asam dan basa– Afinitas lebih tinggi – Stabil pada kondisi panas

• Faktor-faktor yang mempengaruhi enzim:– Suhu– pH– Konsentrasi enzim– Konsentrasi substrat– Aktivator dan inhibitor

• Enzim α-amilase dapat diperoleh:– Ludah manusia– Pankreas– Isolasi Aspergillus oryzae dan Bacillus subtilis

• Hidrolisis amilosa oleh enzim α-amilase:– Degradasi amilosa menjadi maltosa dan

maltotriosa– Pembentuka glukosa dan maltosa

• α-amilase stabil pada pH 4,8 -8• α-amilase stabil pada suhu 40-600C dan 80-

1000C• Sensitif pada suhu 700C

Penentuan data kinetika dari enzim yang telah dimurnikan dengan α-amilase (EC 3.2.1.1) type II A from Bacillus sp.

v = Vmax / (1 + (Km/[S]))

• 1 / v = 1 / Vmax + Km / Vmax x 1 / [S]

• Hasil enzim yang telah dimurnikan adalah 192.3 μmol mL-1 min.-1, sedangkan nilai Km 2.5 mg mL-1. Sementara nilai Vmax dari α-amilase (EC 3.2.1.1) type II A dari Bacillus sp. adalah 227.2 μmol mL-1 min.-1, dan Km = 4.0 mg mL-1.

Stabilitas suhu dari enzim yang telah dimurnikan dan dibandingkan dengan tipe II A dari Bacillus sp.

• Hasilnya menunjukkan bahwa enzim yang telah dimurnikan memiliki aktivitas residu sebesar 11%, sementara α-amilase (EC 3.2.1.1) type II A dari Bacillus sp.memiliki aktivitas residu sebesar 1.22%.

Perubahan energi berdasar denaturasi (ΔGi) dari enzim yang telah dimurnikan dibanding α-amilase type II A

• hasilnya enzim yang dimurnikan memiliki nilai ki lebih kecil dibandingkan α-amilase type II

• A. nilai t½ dan ΔGi dari enzim yang dimurnikan juga lebih tinggi dibandingkan α-amilase type II A. Hal ini menunjukkan bahwa enzim yang telah dimurnikan lebih stabil dibanding α-amilase type II A.

kesimpulan

• Enzim α-amilase diisolasi dan dimurnikan dari bakteri lokal Bacillus sp. dan memiliki karakteristik pH optimum pada 60OC dan memiliki kemampuan bekerja pada range pH 5.0-9.0, memiliki bobot molekular 67 kDa. Enzim yang telah dimurnikan memiliki stabilitas termal pada temperatur penyimpanan 60OC selama 60 minutes memiliki aktivitas residual sebesar 11.0%; t1/2 = 21.2 min.; ki = 0.038 min-1; ΔGi = 102.3 kJ mol-1.

• Enzim α-amilase banyak digunakan di bidang industri makanan, minuman, tekstil, kulit, dan kertas.