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Universidade de São Paulo

Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”

Bioprospecção de xilanase e -amilase por meio de métodos independentes

e dependentes de cultivo microbiano em um solo de manguezal

Mylenne Calciolari Pinheiro da Silva

Tese apresentada para a obtenção do título de Doutora em

Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola

Piracicaba

2015

1

Mylenne Calciolari Pinheiro da Silva

Licenciada em Ciências Biológicas

Bioprospecção de xilanase e -amilase por meio de métodos independentes e

dependentes de cultivo microbiano em um solo de manguezal

versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011

Orientadora:

Profa. Dra. SIMONE POSSEDENTE DE LIRA

Tese apresentada para a obtenção do título de Doutora em

Ciências. Área de concentração: Microbiologia Agrícola

Piracicaba

2015

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação

DIVISÃO DE BIBLIOTECA - DIBD/ESALQ/USP

Silva, Mylenne Calciolari Pinheiro da

Bioprospecção de xilanase e -amilase por meio de métodos independentes e dependentes de cultivo microbiano em um solo de manguezal / Mylenne Calciolari Pinheiro da Silva. - - versão revisada de acordo com a resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2015.

97 p. : il.

Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”.

1. Endoamilase 2. Isolamento 3. Endoxilanase 4. Sequenciamento I. Título

CDD 631.46 S586b

“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”

3

À minha família:

- meus pais, Marcos e Maria

- meus irmãos, Mayna e Marcos

- meus sobrinhos, Lucas e Noah

Ofereço

Ao meu amor Cristiano

Pelo companheirismo, apoio e paciência,

DEDICO

4

5

AGRADECIMENTOS

À Deus por caminhar sempre ao meu lado e por me conceder saúde e força para concluir

este trabalho.

À minha amada família pelo apoio em todos os momentos da minha vida, pelo carinho,

amor e paciência.

Ao meu pai e minha mãe por todas as orações, pelos abraços reconfortantes, pelos beijos

carinhosos, pela paciência, pela compreensão e pelos pensamentos positivos que me

impulsionaram até aqui.

Ao meu “namorido” Cristiano Andrade Jorge que acompanhou minha trajetória desde o

mestrado e que me ajudou a enfrentar todos os obstáculos que surgiram no meio do caminho.

Agradeço o carinho, paciência e compreensão. Sem você, eu não chegaria até aqui.

A Universidade de São Paulo (ESALQ) e à Universidade de Groningen pela

oportunidade de estudo.

Ao programa de pós-graduação em Microbiologia Agrícola e a secretária Maria Fernanda

pelo auxílio na parte burocrática.

À agência de fomento CAPES, pela concessão das bolsas de doutorado e doutorado

sanduíche.

In memoriam à Profa. Dra. Aline Aparecida Pizzinari-Kleiner, agradeço o voto de

confiança e a orientação mesmo que por curto período de tempo.

À Profa. Dra. Simone Possedente de Lira pela orientação, apoio, incentivo e pelas

conversas que me tranquilizaram. Muito Obrigada!

Ao Prof. Dr. Fernando Dini Andreote, pelos ensinamentos acadêmicos e conselhos

essenciais para a conclusão do meu projeto. “Bons professores corrigem erros, professores

brilhantes ensinam a pensar”. Muito obrigada!

Ao Prof. Dr. André Oliveira de Souza Lima, sempre solícito, pelas sugestões e

ensinamentos, e pela motivação que em momentos difíceis me fez ver que tudo valeria a pena.

À Profa. Dra. Maria Carolina Quecine Verdi, pela disposição em me ajudar sempre que

precisei.

Ao professor Jan Dirk van Elsas, pela orientação no período do meu doutorado

sanduíche.

À Profa. Dra. Joana Falcão Salles, pelo apoio e pelo churrasco brasileiro em solos

Holandeses.

6

À minha querida estagiária Kelly, pela ajuda no desenvolvimento de parte do meu

projeto, pelas discussões e sugestões sobre o trabalho.

Aos técnicos de laboratório Dê e Fernandinho, que possuo grande carinho e admiração,

com os quais convivi 8 anos. Agradeço as dicas, conversas, risadas e conselhos.

As “meninas da positividade”, Danice, Júlia e Juliana, com as quais dividi momentos

inesquecíveis de muita descontração e que tornaram o doutorado mais colorido e alegre.

Aos meus grandes amigos: Bianca, Bruna Fahrat, Carla, Gustavo, Luciano, Marcela, Nara

e Rebeca, que deixaram esses quatro anos mais leves, divertidos e amorosos. Muito obrigada

por me suportarem nos meus dias insuportáveis e me darem forças quando pensei em

fraquejar.

Ao casal Maju e Francisco que me ajudaram de todas as formas possíveis, conselhos,

orientações, conversas e mais conversas, brincadeiras, puxões de orelha, mudanças, risadas,

enfim, por tudo.

As “meninas do futebol”: Ana, Bia, Bruna, Carol, Erika, Fernanda, Melzinha, Pito e Van,

ainda que não entendessem muito do meu trabalho, se preocuparam em me ajudar da melhor

forma possível, me ouvindo, encorajando e acreditando em minha capacidade.

Ao Polezito (Marcus), pelo apoio e ajuda principalmente na reta final do doutorado, uma

das fases mais difíceis.

Aos colegas de laboratório de Microbiologia do Solo: Ademir, Alessandra, Armando,

Cristiane, Danielle, Diogo, Dorotéia, Fábio, Filipe, Joelma, Julia, Juliana, Luana, Lucas,

Marcus, Michele, Pedro, Simone, Sonia e Thiago.

Aos colegas de laboratório da Universidade de Groningen: Britt, Cirus, Diego, Felipe,

Francisco, Irene, Irshad, Jolanda, Larisa, Maju, Maryam, Miao, Miaozhi, Pilar, Pu, Stemphani

e Tahir.

A todas as pessoas que contribuíram diretamente ou indiretamente para que eu chegasse

até aqui e que participaram do meu crescimento pessoal e profissional. Sem vocês, eu nada

seria. Muito Obrigada!

7

Espírito Santo, o que vamos fazer juntos hoje?

Maria Rosália - Mãe

8

9

SUMÁRIO

RESUMO ................................................................................................................................... 11

ABSTRACT ............................................................................................................................... 13

1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................................... 15

1.1 Revisão Bibliográfica ........................................................................................................... 15

1.1.1 O ecossistema de manguezal ............................................................................................. 15

1.1.2 Fluxo de carbono no manguezal ........................................................................................ 17

1.1.3 Principais constituintes orgânicos das plantas ................................................................... 19

1.1.4 Hidrólise enzimática da hemicelulose ............................................................................... 20

1.1.5 Hidrólise enzimática do amido .......................................................................................... 23

1.1.6 Aplicações das xilanases e α-amilases .............................................................................. 24

1.1.7 Estudo das comunidades microbianas ............................................................................... 25

Referências ................................................................................................................................. 27

2 TRIAGEM FUNCIONAL DE GENES CODIFICADORES DA ENZIMA XILANASE EM

BIBLIOTECAS METAGENÔMICAS DE MANGUEZAL..................................................34

Resumo ....................................................................................................................................... 34

Abstract ....................................................................................................................................... 34

2.1 Introdução ............................................................................................................................. 35

2.2 Desenvolvimento .................................................................................................................. 36

2.2.1 Material e Métodos ............................................................................................................ 36

2.2.1.1 Área de estudo e amostragem ........................................................................................ 36

2.2.1.2 Biblioteca Metagenômica ............................................................................................... 38

2.2.1.3 Triagem funcional .......................................................................................................... 38

2.2.1.4 Extração do DNA fosmidial dos clones positivos .......................................................... 39

2.2.1.5 Preparo e sequenciamento das amostras via Ion Torrent ............................................... 40

2.2.1.6 Tratamento das sequências, montagem e anotação dos contigs ..................................... 41

2.2.1.7 Anotação taxonômica e funcional detalhada do contig MgrBr135 ................................ 43

2.2.1.8 Subclonagem em vetor de expressão .............................................................................. 43

2.2.1.9 Teste de expressão do transformante .............................................................................. 47

2.3 Resultados e Discussão ......................................................................................................... 48

2.3.1 Biblioteca Metagenômica .................................................................................................. 48

2.3.2 Triagem funcional e extração do DNA fosmidial ............................................................. 48

2.3.3 Tratamento das sequências, montagem e anotação inicial dos contigs ............................. 50

10

2.3.4 Anotação taxonômica e funcional detalhada do contig MgrBr135 ................................... 53

2.3.5 Subclonagem e expressão heteróloga do gene alvo .......................................................... 59

2.4 Conclusões do capítulo ........................................................................................................ 62

Referências ................................................................................................................................. 63

3 ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS

XILANOLÍTICAS DE UMA ÁREA DE MANGUEZAL..................................................69

Resumo....................................................................................................................................... 69

Abstract ...................................................................................................................................... 69

3.1 Introdução ............................................................................................................................ 70

3.2 Desenvolvimento ................................................................................................................. 72

3.2.1 Material e Métodos ........................................................................................................... 72

3.2.1.1 Área de estudo e amostragem ........................................................................................ 72

3.2.1.2 Isolamento e purificação de bactérias xilanolíticas ........................................................ 72

3.2.1.3 Determinação do potencial enzimático: método qualitativo .......................................... 73

3.2.1.4 Determinação do potencial enzimático: método quantitativo ........................................ 74

3.2.1.5 Extração do DNA genômico total dos isolados ............................................................. 75

3.2.1.6 Amplificação por PCR do gene 16S rRNA ................................................................... 76

3.2.1.7 Purificação dos produtos de PCR para sequenciamento ................................................ 76

3.2.1.8 Reação de sequenciamento ............................................................................................ 77

3.2.1.9 Análise das sequências ................................................................................................... 77

3.3 Resultados e Discussão ........................................................................................................ 78

3.3.1 Isolamento das bactérias xilanolíticas ............................................................................... 78

3.3.2 Determinação do potencial enzimático: método qualitativo e quantitativo ...................... 79

3.3.3 Caracterização molecular dos isolados ............................................................................. 85

3.4 Conclusões do capítulo ........................................................................................................ 89

Referências ................................................................................................................................. 90

4 CONSIDERAÇÕES FINAIS .................................................................................................. 97

11

RESUMO

Bioprospecção de xilanase e -amilase por meio de métodos independentes e

dependentes de cultivo microbiano em um solo de manguezal

A xilanase e a α-amilase são enzimas responsáveis por degradar parte da matéria orgânica

nos solos, atuando na mineralização da hemicelulose e do amido, respectivamente. Do ponto

de vista biotecnológico, estas enzimas, assim como os subprodutos gerados pela sua ação

enzimática, podem ser utilizados em diversos setores industriais. Os manguezais podem

representar uma fonte promissora e inexplorada para a busca de enzimas microbianas em

função das altas quantidades de matéria vegetal em decomposição presente neste ecossistema,

onde ocorrem condições ambientais únicas, representadas pela combinação da anaerobiose e

salinidade. No presente trabalho, métodos independentes e dependentes de cultivo microbiano

foram utilizados para a bioprospecção de enzimas xilanolíticas e amilolíticas em um ambiente

de manguezal. A partir da triagem funcional de uma biblioteca metagenômica foram obtidos 3

clones xilanolíticos. Estes foram sequenciados e os reads utilizados para montagem dos

contigs e posterior anotação dos genes. Uma das ORFs geradas da anotação do contig

MgrBr135 foi utilizada para subclonagem em vetor de expressão demonstrando atividade

amilolítica. A análise filogenética do contig MgrBr135 mostrou afiliação da mesma ao filo

Planctomycetes. Por meio do método dependente de cultivo, foram isolados 44 bactérias

xilanolíticas do solo de manguezal. Destas, 73% apresentaram índices enzimáticos (IE)

elevados quando submetidos ao teste qualitativo (cup plate). A estirpe bacteriana 11 foi a que

se destacou das demais por ter apresentado IE de 10,9. Quando submetidas ao teste

quantitativo, o isolado 39 se destacou produzindo uma atividade enzimática de 0,43 U/mL. O

sequenciamento parcial do gene 16S rRNA das estirpes permitiu a identificação dos isolados

como pertencentes a dois gêneros: Bacillus e Paenibacillus. Estes resultados destacam a

importância de estudos sobre as bactérias encontradas nos manguezais, e indicam os grupos

bacterianos que hospedam estas características, o que deve dar maior suporte a exploração

deste recurso como ferramentas biotecnológicas, a serem utilizadas na degradação da

hemicelulose e amido.

Palavras-chave: Endoamilase; Isolamento; Endoxilanase; Sequenciamento

12

13

ABSTRACT

Bioprospecting of xylanase and amylase through culture dependent and independent

methods in a mangrove soil

Xylanase and α-amylase are enzymes that degrade organic matter, acting in the

mineralization of hemicellulose and starch, respectively. These enzymes, as well as the

byproducts generated by them, can be used in various industrial sectors. Mangroves represent

a promising and untapped source of microbial enzymes due to the high content of

decomposing organic matter present in this ecosystem, where unique environmental

conditions prevail, represented by the combination of anaerobiose and salinity. In this study,

independent and dependent microbial cultivation methods were used for bioprospecting

xylanolytic and amylolytic enzymes in a mangrove environment. Through the functional

screening of a metagenomic library, 3 xylanolytic clones were obtained. These clones were

sequenced, and the reads were used for contig assembly followed by gene annotation. One of

the ORFs generated by the annotation of contig MgrBr135 was used for subcloning into the

expression vector, showing later amylase activity. Phylogenetic analysis of contigs MgrBr135

indicated its affiliation to the phylum Planctomycetes. Through the cultivation dependent

method, 44 xylanolytic bacteria were isolated from mangrove soil. From these, 73% had

considerable enzymatic index (EI) when subjected to the qualitative test (cup plate). The

bacterial strain 11 was the one that stood out from the others because it presented the highest

EI, 10.9. When subjected to quantitative test, the isolated 39 stood out producing an enzyme

activity of 0.43 U/mL. The partial 16S rRNA gene sequencing of the strains allowed the

characterization of two genera: Bacillus and Paenibacillus. These results highlight the

importance of studying the bacterial community found in mangroves, and indicate the

bacterial groups hosting these features, supporting further exploitation of this resource as

biotechnological tools that can be used in the degradation of hemicellulose and starch.

Keywords: ndoamylase; Isolation; Endoxylanase; Sequencing

14

15

1 INTRODUÇÃO

Os manguezais são ecossistemas costeiros peculiares, que se posicionam na interface

entre ambientes marinhos e terrestres e ocupam as regiões tropicais e subtropicais. O Brasil

possui uma das maiores extensões de manguezais do mundo, desde o Cabo Orange no

Amapá, até a cidade de Laguna em Santa Catarina. O termo manguezal é utilizado para se

referir as plantas e a comunidade associada, a qual é composta por bactérias, fungos,

microalgas, crustáceos, invertebrados, pássaros e mamíferos.

A comunidade microbiana presente neste ecossistema participa ativamente dos ciclos

biogeoquímicos. Ela é responsável por degradar a matéria orgânica depositada no solo e a

transformá-la em fontes de nitrogênio, fósforo, carbono e outros nutrientes que podem ser

usados pelas plantas e organismos. Enzimas como a xilanase e a α-amilase são responsáveis

por esta transformação, atuando na mineralização da hemicelulose e do amido,

respectivamente. Numa visão biotecnológica, estas enzimas podem ser utilizadas para gerar

produtos de valor agregado a partir da degradação do material lignocelulósico, além de serem

úteis nas indústrias alimentícia e farmacêutica.

As técnicas dependentes e independentes de cultivo podem ser utilizadas para a

bioprospecção de micro-organismos e genes capazes de produzir estas enzimas. Baseado no

cultivo microbiano é possível obter isolados produtores das enzimas de interesse. Este tipo de

análise se complementa com análises baseadas na extração do DNA de amostras ambientais e

clonagem em vetores para construção das bibliotecas metagenômicas. Esta técnica é

reconhecidamente eficiente na busca por genes que codifiquem hidrolases com características

especiais, resultantes da evolução microbiana nos diferentes ambientes.

Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de realizar a prospecção de genes

codificadores de xilanases e amilases em uma biblioteca metagenômica construída a partir de

amostras de solo de manguezal, em combinação com o isolamento e caracterização de

bactérias xilanolíticas encontradas no mesmo ambiente.

1.1 Revisão Bibliográfica

1.1.1 O ecossistema de Manguezal

Os manguezais estão distribuídos amplamente nas regiões tropicais e subtropicais de todo

o planeta (HOLGUIN et al., 1999). Segundo Giri et al. (2010), a área total dos manguezais no

16

mundo, estimada no ano de 2000, era de 137.760 km2, distribuída em 118 países. Esta

estimativa é 12 % menor que a última feita pela FAO (Food and Agriculture Organization of

the United Nations) no ano de 2007. A área total de manguezal é responsável por 0,7 % do

total de florestas tropicais do mundo, porém essa estimativa não fornece informações sobre a

sua qualidade. A maior área encontra-se na Ásia (42 %), seguido pela África (20%), América

Central e Norte (15%), Oceania (12 %) e América do Sul (11 %). Aproximadamente 75% dos

manguezais estão concentrados em apenas 15 países (Tabela 1.1).

Tabela 1.1 – Os 15 principais países ricos em área de manguezal, sua respectiva metragem e continente de

ocorrência (GIRI et al., 2010)

Países Área (m2) Continente

Indonésia 3.112,989 Ásia

Austrália 977,975 Oceania

Brasil 962,683 América do Sul

México 741,917 América Central e Norte

Nigéria 653,669 África

Malásia 505,386 Ásia

Mianmar 494,584 Ásia

Papua Nova Guiné 480,121 Oceania

Bangladesh 436,570 Ásia

Cuba 421,538 América Central e Norte

Índia 368,276 Ásia

Guiné Bissau 338,652 África

Moçambique 318,851 África

Madagascar 278,078 África

Filipinas 263,137 Ásia

O Brasil possui uma das maiores extensões de manguezais do mundo, abrangendo uma

área ao longo do litoral, desde o Cabo Orange no Amapá, até o município de Laguna em

Santa Catarina. Na região da baixada santista no estado de São Paulo, encontra-se uma das

maiores concentrações de manguezais, formada pelos municípios de Bertioga, Cubatão,

Guarujá, Itanhaém, Monganguá, Peruíbe, Praia Grande, Santos e São Vicente (CURY, 2002).

Devido às características ambientais inerentes a este ecossistema, sua vegetação possui

adaptações morfológicas e fisiológicas. As plantas presentes neste ambiente resistem às

alterações de salinidade, variações de maré, ventos fortes, alterações de temperatura e solos,

com constante variação nas concentrações de oxigênio (apesar do predomínio da anaerobiose)

(GIRI et al., 2010). A vegetação de mangue na costa brasileira é predominantemente

composta pelas seguintes espécies: Laguncularia racemosa (mangue branco), Avicennia

schaueriana (mangue preto) e Rhizophora mangle (mangue vermelho) (DIAS et al., 2012).

17

A importância dos manguezais está diretamente associada à grande produtividade

biológica deste ecossistema, representada pela alta biodiversidade de peixes, crustáceos,

moluscos, aves, répteis e mamíferos. Sua função ecológica consiste em manter a base

alimentar da cadeia trófica, evitar a erosão do solo pelas marés, reduzir o assoreamento dos

portos e diminuir os impactos decorrentes da lixiviação de compostos químicos (GIRI et al.,

2010). Embora sejam protegidos por lei (Lei 4771 de 15 de setembro de 1965 do código

florestal), os manguezais têm sofrido ações antrópicas na sua exploração com fins econômicos

e agrícolas, pesca predatória e depósito de lixo (EYSINK & POFFO, 2002). No litoral sudeste

de São Paulo, este ecossistema é frequentemente atingido por vazamentos de petróleo, metais

pesados, esgotos, depósito de lixo urbano-industrial e desmatamento para a implantação de

indústrias e domicílios (FASANELLA et al., 2012).

Os solos dos manguezais são predominantemente lodosos e possuem baixos teores de

oxigênio, devido à frequente inundação pelas marés (LI et al., 2010). Embora sejam ricos em

matéria orgânica, são deficientes em nutrientes, devido à baixa taxa de decomposição dos

compostos orgânicos em condições limitantes de oxigênio. Neste contexto, a atividade

microbiana possui um papel essencial neste ecossistema (ANDREOTE et al., 2012). Ela é

responsável por transformar a matéria orgânica em fontes de nitrogênio, fósforo, carbono e

outros nutrientes que podem ser usados pelas plantas e organismos (BASHAN & HOLGUIN,

2002). As bactérias estão diretamente envolvidas neste processo, como por exemplo, fixação

biológica do nitrogênio, amonificação e desnitrificação, manutenção do fluxo de carbono e

ciclagem de nutrientes nestes solos (HOLGUIN et al., 2001; TAKETANI et al., 2010).

1.1.2 Fluxo de carbono no manguezal

O ciclo do carbono, em termos globais, ocorre por meio da ciclagem deste elemento

dentre dos principais reservatórios de carbono da Terra: a atmosfera, ambientes aquáticos, os

sedimentos, rochas e as biomassas. O manguezal armazena até quatro vezes mais carbono do

que outras florestas tropicais do mundo (DONATO et al., 2011). Esta capacidade se deve em

parte ao seu solo, que é rico em matéria orgânica proveniente das folhas, galhos, carcaças de

animais, ervas marinhas e comunidades bentônicas e planctônicas. Estes fornecem entradas

significativas de carbono orgânico para este ambiente (ALONGI, 1998; DONATO et al.,

2011). O regime de marés também influencia diretamente no fluxo deste elemento no

manguezal. Toda matéria orgânica que é trazida do oceano e que não é exportada por sua

18

ação, é integrada aos solos dos manguezais via processo degradativo intermediado por micro-

organismos (KRISTENSEN et al., 2008).

O processo de fotossíntese é outro responsável pelo aporte de carbono neste ambiente,

realizado pelas plantas, algas e bactérias autotróficas presentes no ambiente de manguezal.

Esses organismos fotossintéticos são responsáveis por capturar o dióxido de carbono (CO2) da

atmosfera e utilizá-lo na síntese de compostos orgânicos, como amido, celulose, hemicelulose

e lignina. Após sua senescência, esta biomassa junto com os resíduos animais, retorna ao solo

e fornece o carbono orgânico necessário aos organismos heterotróficos. Neste processo de

decomposição da matéria orgânica são geradas duas principais formas de carbono, CH4 e CO2

(WAGNER & WOLF, 1999).

Em alguns locais do manguezal onde não há presença de oxigênio, pode ocorrer a

metanogênese. Esse processo é realizado por um grupo específico de Archaea anaeróbios

estritas, e é essencial para o ciclo do carbono neste ecossistema. Estes micro-organismos

utilizam o dióxido de carbono, ou formas específicas do carbono orgânico, como aceptor final

de elétrons na respiração anaeróbica, reduzindo-o a metano. Este gás é altamente insolúvel,

sendo, portanto, facilmente transportado a fração do solo onde existe a presença de oxigênio.

Ali, ele é oxidado a CO2 pelos organismos metanotróficos. Sendo assim, todo carbono

orgânico eventualmente retorna à forma de CO2, a partir do qual o metabolismo autotrófico

reinicia o ciclo do carbono (Figura 1.1) (MADGAN et al., 2010).

19

Respiração

óxico

anóxico

Respiração anaeróbica

Fermentação

Matéria orgânica

Matéria orgânica

Metanotrofia

Metanogênese

Fotossíntese oxigênica

Fotossíntese anoxigênica

(CH2O)n

(CH2O)n

CH4CO2

Figura 1.1 – Ciclo do carbono aeróbico e anaeróbico. A Figura diferencia os processos autotróficos (CO2 –

compostos orgânicos) e heterotróficos (compostos orgânicos – CO2). As setas amarelas indicam as

oxidações; as setas vermelhas indicam as reduções (MADGAN et al., 2010)

1.1.3 Principais constituintes orgânicos de plantas

A celulose é considerada o constituinte orgânico mais abundante na natureza, sendo

fixada em uma quantidade de 1011

toneladas de CO2 anualmente devido ao processo

fotossintético (LESCHINE, 1995). Possui função estritamente estrutural, sendo o principal

componente da parede primária das plantas. É um polímero linear de alto peso molecular

formado pela unidade de D-glicose unida por ligações glicosídicas β -1,4, formando cadeias

longas e paralelas. O número de unidades de glicose no polímero é que irá determinar seu

grau de polimerização podendo variar de 2000 a 27000 (KHANDEPARKER & NUMAN,

2008). A unidade básica da celulose é a celobiose, formada pela junção de duas moléculas de

glicose. Quando fusionadas, estas moléculas causam a eliminação da água através das

hidroxilas ligadas ao carbono 1 e 4 formando uma fita altamente cristalina (SIQUEIRA &

FILHO, 2010).

Em estreita associação com a celulose na parede celular está a hemicelulose, porém,

presente no material vegetal em menor grau de polimerização. É composta por um grupo de

polissacarídeos heterogêneos, de alta massa molecular, insolúveis em água, mas solúveis em

20

soluções alcalinas (NAKAMURA, 2003). Em geral, a hemicelulose é constituída de 80 a 200

unidades de resíduos de açúcar e também possui função estrutural. Esta molécula possui um

menor peso molecular quando comparada à celulose. São geralmente classificadas de acordo

com os principais resíduos de açúcares presentes na cadeia principal do polímero estrutural.

Entre as unidades de açúcares que a compõe destacam-se as pentoses (D-xilose, L-arabinose e

L-ramnose), hexoses (D-glicose, D-manose e D-galactose) e ácidos urônicos (ácidos 4-O-

metil-D-glucurônico) (CANETTIERE, 2004). A quantidade destes componentes pode variar

bastante dependendo da planta e do tipo de célula.

A lignina confere à parede celular das plantas, além de suporte estrutural,

impermeabilidade, resistência contra patógenos e estresses oxidativos. Ela possui uma

estrutura extremamente complexa, constituída de compostos fenólicos associados a diferentes

radicais. Esta molécula tridimensional e altamente ramificada pode ser encontrada

abundantemente na lamela média. Sua estrutura apresenta grupos aromáticos e alifáticos, com

anéis fenilpropânicos ligados por ligações covalentes (ROWELL & HAN, 2000).

O amido é um constituinte orgânico encontrado nas raízes, caules e folhas das plantas, e é

utilizado pelas mesmas como molécula de armazenamento de glicose. É composto por

unidades de D-glicose, ligadas entre si por ligações glicosídicas. Geralmente se organizam na

forma de dois tipos de polímeros: amilose e amilopectina. A estrutura mais comum do amido

é formada por interações entre cadeias destas duas moléculas formando duplas-hélices que

podem se associar. A amilose possui uma cadeia longa, linear e insolúvel em água. É

composta em média por 500 a 20.000 unidades de D-glicose unidas por ligações α-1,4.

Dependendo da origem botânica, este polímero pode ser encontrado em diferentes tamanhos e

estruturas. A média de conteúdo de amilose nas fontes de amido encontradas na natureza é de

aproximadamente 25%. A amilopectina compõe 75% ou mais do amido, sendo assim, é o

componente mais abundante. Sua molécula possui ramificações e estrutura formada por

aproximadamente 95% de ligações glicosídicas α-1,4 e 5% de ligações α-1,6 (TESTER &

XIN QI, 2004; ZEEMAN et al., 2010).

1.1.4 Hidrólise enzimática da hemicelulose

A xilana é o principal polissacarídeo que compõe a hemicelulose. É considerado o

segundo componente mais abundante encontrado na natureza, correspondendo à

aproximadamente um terço da fonte de carbono renovável do planeta (COLLINS et al., 2005).

21

Apresenta uma cadeia linear constituída de D-xilose unidas por ligações glicosídicas β- 1,4.

De acordo com as ramificações encontradas no esqueleto da xilana, esta pode ser denominada

homoxilana, arabinoxilana, glicuronoxilana ou glicuronoarabinoxilana (SHALLOM &

SHOHAM, 2003).

Dependendo de sua complexidade, a quebra total da xilana requer a ação de endoenzimas,

que atuam internamente na cadeia principal, e exoenzimas, que clivam oligossacarídeos e

produzem monossacarídeos (KALOGERIS et al., 2001). A enzima mais importante na

despolimerização da xilana é a endo 1,4-β-xilanase, que age sobre a sua cadeia principal e

gera xilo-oligossacarídeos de baixo grau de polimerização. Esta enzima foi relatada pela

primeira vez em 1995 (WHISTLER & MASEK, 1955), denominada inicialmente como

pentosanase. Em 1961 foi reconhecida pela União Internacional de Bioquímica e Biologia

Molecular (IUBMB) quando os pesquisadores atribuíram seu código, EC 3.2.1.8. O seu nome

oficial é endo 1,4-β-xilanase, porém, também é usualmente designada como xilanase,

endoxilanase, 1,4- β-D-xilana-xilanohidrolase, endo 1,4-β-D-xilanase, β-1,4-xilanase e β-

xilanase.

Os xilo-oligossacarídeos gerados pela despolimerização da xilana são degradados à β-D-

xilopiranosil (xilose) pela ação da enzima a β-xilosidase (EC 3.2.1.37) que age através do

terminal não redutor (JEFFRIES, 1994; BEG et al., 2001). Algumas enzimas como α-

arabinofuranosidases (EC 3.2.1.55), α-glucuronidases (EC 3.2.1.139) e acetil xilana esterases

(EC 3.1.1.72), também são necessárias para a quebra das cadeias laterais presentes na

estrutura heterogênea da xilana (Figura 1.2) (SUBRAMANIYAN & PREMA, 2002;

POLIZELI et al., 2005; SOUZA, 2013).

22

endo 1,4-b -xilanase

B-xilosidase xilose

arabinofuranosidase

glucuronidaseacetil xilana esterase

esterase de ácido ferúlico

Figura 1.2 - Composição e degradação da hemicelulose por enzimas xilanolíticas (SUN et al., 2012)

A xilana pode sofrer hidrólise enzimática completa por meio dos complexos xilanolíticos

produzidos por fungos, bactérias (ELEGIR et al., 1994), leveduras, protozoários e vegetais

(UFFEN, 1997). Alguns dos mais importantes produtores de enzimas xilanolíticas incluem o

Aspergillus, Trichoderma, Phanerochaete, Ruminococcus, Fibrobacteres, Clostridium e

Bacillus (SUBRAMANIYAN & PREMA, 2002; SUNNA & ANTRANIKIAN, 1997). As

xilanases microbianas são mais vantajosas em relação às obtidas de fontes vegetais e animais

devido a sua maior disponibilidade, estabilidade estrutural e fácil manipulação genética

(POORNA & PREMA, 2006).

As xilanases têm sido classificadas em 6 diferentes famílias glicosil hidrolase (5, 7, 8, 10,

11 e 43) de acordo com sua sequência de aminoácidos, estrutura do domínio catalítico e

mecanismo de ação (COLLINS, et al., 2005). As pertencentes à família GH 10 e GH 11 são

mais bem estudadas na literatura e se diferem tanto na estrutura quanto nas propriedades

catalíticas. Enquanto as xilanases pertencentes à família 10 são caracterizadas pelo alto peso

molecular (> 30 kDa) e ponto isoelétrico ácido, as pertencentes a família 11, tem um baixo

peso molecular (aproximadamente 20 kDa) e ponto isoelétrico de base, embora exceções

ocorrem em alguns casos (LAGAERT et al., 2009; WONG et al., 1988). Em termos

catalíticos, as xilanases da família 10 possuem baixa especificidade ao substrato demonstrada

pela habilidade de hidrolisar além de xilana a celulose. Já as enzimas da família 11 não

conseguem reconhecer este biopolímero (BIELY et al., 1997; COLLINS et al., 2005).

23

1.1.5 Hidrólise enzimática do amido

As amilases são as enzimas responsáveis por degradar o amido em polímeros menores,

composto por unidades de D-glicose. Para que haja a conversão eficiente deste polissacarídeo

em produtos de baixa massa molecular, é necessária a ação coordenada das enzimas: α-

amilases (endoamilases), β-amilases (exoamilases), enzimas desramificadoras e as

glucoamilases (amiloglucosidases) (Figura 1.3) (GUPTA et al., 2003). Estas enzimas são

classificadas de acordo com a maneira em que a ligação glicosídica é quebrada. Elas podem

ser encontradas nas famílias glicosil hidrolases (GH) 13, 14 e 15 (COUTINHO &

HENRISSAT, 1999; HENRISSAT, 1991).

-amilase

alfa dextrina

oligossacarídeo lineares

maltose glicoseglicosemaltose

b-amilase glicoamilase

enzimas desramificadoras

oligossacarídeo lineares

glicose

maltose

maltotriose

Figura 1.3 - Representação esquemática da ação das enzimas amilolíticas. Círculos representam resíduos de

glicose e círculos preenchidos destacam extremidade redutora (adaptado de DANIEL, 2010)

A α-amilase é considerada a enzima mais importante (GUPTA et al., 2003), pertencente à

família glicosil hidrolase 13 sendo responsável por quebrar as ligações glicosídicas α-1,4 do

amido (MACGREGOR et al., 2001). Além desta denominação, esta enzima também pode ser

reconhecida como glicogenase, α amilase, endoamilase, taka-amilase A e 1,4-α- D- glucana

glucanohidrolase. Seguindo a recomendação da Internacional Union of Biochemistry and

Molecular Biology (IUBMB), o número da Comissão de Enzimas (EC) da α-amilase é

3.2.1.1.

Estas enzimas são produzidas por uma grande variedade de micro-organismos e a

principal vantagem de utilizá-los é devido a sua capacidade de produção em grandes

quantidades e fácil manipulação para se obter enzimas com características bioquímicas

24

desejadas (LONSANE et al., 1990; REDDY et al., 2003). A α-amilase é produzida por fungos

e bactérias (PANDEY et al., 2000). Entre as espécies de fungos que produzem altos níveis

desta enzima destacam-se: Aspergillus niger, Aspergillus oryzae (AUNSTRUP, 1979) e

Thermomyces lanuginosus (ARNESEN et al., 1998). Em relação a bactérias, o gênero

Bacillus possui grande importância para a indústria, por exemplo, B. subtilis, B. licheniformis

(EL-BANNA et al., 2007). Este gênero de bactéria tem sido amplamente utilizado para a

produção comercial e industrial de α-amilase.

Ambas as enzimas -amilase e xilanase são classificadas como glicosil hidrolases

responsáveis por hidrolisar as ligações glicosídicas entre dois ou mais carboidratos, ou entre

um agrupamento carboidrato e um não-carboidrato (RUBINI, 2009).

1.1.6 Aplicação das xilanases e α-amilases

As enzimas xilanolíticas e amilolíticas apresentam aplicações biotecnológicas de extrema

importância para os setores industriais. As xilanases começaram a ter aplicação

biotecnológica na década de 80 e hoje são responsáveis por 20% do mercado mundial de

enzimas, juntamente com celulases e pectinases (POLIZELI et al., 2005). Os subprodutos

gerados pela degradação enzimática da xilana podem ser utilizados em diversos setores.

Destes, destacam-se seus usos nas indústrias alimentícias (alimentos funcionais, probióticos,

aditivos em ração de animais domésticos e peixes), farmacêuticas (controle da obesidade,

tratamento de infecções gastrointestinais, agente ativo contra osteoporose, otite e disfunções

na pele e cabelo) e na agricultura (estimulante e acelerador do crescimento) (VÁZQUEZ et

al., 2001).

O emprego de enzimas xilanolíticas em indústrias muito se deve a esta diversidade de

aplicações biotecnológicas. Segundo Beg et al. (2001), estas enzimas podem ser utilizadas

para o pré-branqueamento de polpa kraft, melhoria da qualidade do pão (devido ao aumento

no seu volume específico ocasionado pelo uso de xilanases) e em associação com celulases e

pectinases podem auxiliar no clareamento e aromatização de vinhos e sucos. Em conjunto

com outras enzimas como manases, ligninases, xilosidases, glucanases e glicosidases, as

xilanases podem ser utilizadas para gerar biocombustíveis a partir de compostos

lignocelulósicos, como etanol e xilitol.

As amilases representam aproximadamente 25% do mercado de enzimas participando de

todos os processos industriais que envolvem a hidrólise parcial ou completa do amido

25

(SAXENA et al., 2007). Dentre as suas inúmeras aplicações destacam-se a produção de amido

hidrolisado na forma de xaropes de glicose e frutose (PANDEY et al., 2000; VAN DER

MAAREL et al., 2002), a indústria de panificação (VAN DAM & HILLE, 1992; GUPTA et

al., 2003), a indústria de bebidas alcoólicas (LIU et al., 2004), a indústria de detergentes e

produtos de limpeza (GUPTA et al., 2003) e a produção de bioetanol a partir de amido

(SÁNCHEZ & CARDONA, 2008).

1.1.7 Estudo das comunidades microbianas

A necessidade de métodos que possibilitem o acesso à riqueza de informações contidas

nos diversos ecossistemas deve-se à importância dos micro-organismos nos sistemas

biológicos, assim como seu inestimável potencial biotecnológico. A descrição de novos

organismos e a caracterização de suas funções pode ser acessada por métodos tradicionais de

isolamento e cultivo a partir de amostras ambientais. Tal abordagem também é utilizada para

a busca de novas enzimas aplicáveis a processos industriais. Este método é baseado nas

diferenças metabólicas, morfológicas e fisiológicas dos micro-organismos, descritas, por

exemplo, por meio do isolamento e cultivo em meio de cultura com diferentes fontes de

carbono e nitrogênio (HOLT, 1994).

A utilização de técnicas dependentes de cultivo foi de extrema importância para a

consolidação e o avanço da microbiologia. A maior parte das informações contidas

atualmente em livros-texto veio do estudo de organismos em cultura pura (HANDELSMAN,

2004). A principal limitação desta técnica é subestimar o número e composição microbiana

nas amostras em estudo devido ao fato de apenas 1 % dos micro-organismos serem

cultiváveis, e também à dificuldade de se reproduzir em laboratório as mesmas condições

ambientais onde estes são encontrados (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). Em contrapartida, a

grande vantagem deste método em relação às técnicas modernas moleculares, é o fato de

fornecer ao pesquisador material microbiano biologicamente ativo que pode ser usado em

estudos posteriores (AL-AWADHI et al., 2013).

Nas últimas décadas, as abordagens moleculares têm sido desenvolvidas e utilizadas

como métodos alternativos (HEAD et al., 1998; MUYZER & SMALLA 1998; AL-AWADHI

et al., 2013). Os métodos moleculares embasam um grupo de métodos chamados de

‘independentes de cultivo’, que fornecem uma nova visão sobre a diversidade microbiana e

permitem uma descrição mais rápida das comunidades microbianas (DAHLLÖF et al., 2000).

Porém, assim como qualquer outro método, este também tem suas limitações. Metodologias

26

moleculares são geralmente mais caras do que os métodos tradicionais. Alguns destes

métodos utilizados para estimar a diversidade microbiana, como sequenciamentos de nova

geração, podem apresentar mais de uma desvantagem como a demora na obtenção dos

resultados, a alta biodiversidade no solo leva a obtenção de muitos genomas incompletos,

exigindo habilidade com bioinformática, análise computacionais intensivas, entre outros

(PODAR et al., 2007; MANICHANH et al., 2008). Destaca-se também a limitação destes

métodos em representar de maneira adequada os grupos microbianos presentes em menores

frequências nas amostras analisadas. Neste caso, devido a competição por representação, tais

grupos são comumente excluídos da análise.

O aperfeiçoamento destas metodologias independentes do cultivo microbiano, como

extração de ácidos nucleicos, amplificação por PCR, clonagem e sequenciamento, têm sido

feito por otimização e adaptação de suas deficiências. Dentro deste contexto surgiu a

metagenômica, definida como a análise genômica da comunidade de micro-organismos de um

determinado ambiente. Esta ferramenta gera uma quantidade maior de informações genéticas

do que aquela verificada na diversidade microbiana cultivada (GIOVANNONI et al., 1990;

WARD et al., 1990; HANDELSMAN, 2004), permite o estudo detalhado da biodiversidade

presente em um ecossistema, além de fornecer informações sobre as suas funções (PODAR et

al., 2007; MANICHANH et al., 2008).

A construção de bibliotecas metagenômicas foi um avanço na utilização de técnicas

independentes de cultivo para o estudo dos micro-organismos, que consiste nas seguintes

etapas: fragmentação do DNA extraído da amostra ambiental por enzimas de restrição ou

quebra mecânica, inserção dos fragmentos de DNA em um sistema de vetor adequado e

transformação do vetor recombinante em um hospedeiro apropriado. O screening de

bibliotecas metagenômicas tem sido largamente utilizado para busca de novos

biocatalizadores. Duas abordagens gerais, análise funcional e análise baseada na sequência,

têm emergido para extrair informação biológica de bibliotecas metagenômicas.

A triagem baseada na sequência consiste na busca de genes em bibliotecas

metagenômicas pela utilização de PCR ou hibridização de sondas utilizando primers/sondas

degeneradas baseados em sequências consenso de genes homólogos. Esta forma de triagem

tem como principal limitação à impossibilidade de identificarmos genes efetivamente novos,

uma vez que essa técnica se baseia em semelhanças de sequências com genes já conhecidos

(MORIMOTO & FUJII, 2009; TANG et al., 2008; MARZORATI et al., 2007). Esta

abordagem pode ser usada para identificar âncoras filogenéticas tais como genes 16S rRNA

27

(QUAISER et al., 2003; LILES et al., 2003) e genes que codificam enzimas com domínios

altamente conservados tal como policetídeos sintase (GINOLHAC et al., 2004). A triagem

funcional é baseada na identificação de um clone que expressa uma característica distinguível

no meio de cultivo, seguido da caracterização dos clones ativos pelo sequenciamento de DNA

e análises bioquímicas. É a forma mais direta de se obter genes com a atividade desejada,

sendo aplicada principalmente a estudos biotecnológicos (UCHIYAMA & MIYAZAKI,

2009).

Triar bibliotecas metagenômicas na busca de vias metabólicas utilizando expressão

gênica induzida por substrato é uma forma elegante de otimizar a triagem funcional. Ela se

baseia no fato de genes envolvidos em vias metabólicas normalmente estarem organizados em

operons que são induzidos pelos substratos da via (UCHIYAMA et al., 2005). Quando ocorre

a expressão da enzima, o seu substrato, contido no meio, é degradado formando um halo ao

redor da colônia, que poderá ser visualizado utilizando um corante específico, como no caso

da celulase, ou sem coloração, quando o meio é opaco como o do leite para seleção de

proteases (THIMOTEO, 2011). Para que a construção e triagem funcional de uma biblioteca

metagenômica seja eficiente há a dependência de alguns fatores como: sistema hospedeiro-

vetor, tamanho do gene alvo, abundância do gene na biblioteca, método do ensaio sendo

utilizado e eficiência da expressão heteróloga (UCHIYAMA & MIYAZAKI, 2009).

Ambas as abordagens, cultivo microbiano e metagenômica, são de extrema importância

em estudos sobre a composição, diversidade e funcionalidade de comunidades microbianas no

ecossistema de manguezal. A combinação de métodos independentes e dependentes de cultivo

constitui uma boa ferramenta na busca de micro-organismos responsáveis por produzir

enzimas envolvidas na degradação da matéria orgânica nos solos de manguezais.

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34

2 TRIAGEM FUNCIONAL DE GENES CODIFICADORES DA ENZIMA XILANASE

EM BIBLIOTECAS METAGENÔMICAS DE MANGUEZAL

Resumo

Os micro-organismos possuem uma imensa variabilidade genética, responsável pela

codificação de enzimas relacionadas a funções únicas. Dentre elas, destaca-se a produção de

enzimas extracelulares que auxiliam na mineralização da matéria orgânica e ciclagem de

nutrientes nos mais diferentes ambientes. As xilanases compõem um destes grupos e são

responsáveis por degradar a parte do material lignocelulósico composto pela hemicelulose.

Estas enzimas apresentam diversas aplicações nas indústrias de alimentos, bebidas, de papel e

biocombustíveis. O ambiente de manguezal pode representar uma excelente fonte para busca

de novas enzimas devido as suas características peculiares, como variação de salinidade, alta

diversidade microbiana, condições aeróbio-anaeróbias e grande quantidade de matéria

orgânica. A metagenômica proporcionou um avanço nos estudos em microbiologia por meio

de técnicas independentes do cultivo microbiano. A criação de bibliotecas metagenômicas

ofereceu a oportunidade para a bioprospecção de genes de interesse biotecnológico de micro-

organismos não cultiváveis. Neste contexto, o objetivo foi realizar a triagem funcional de

genes codificadores da enzima xilanase em uma biblioteca metagenômica de manguezal,

gerada a partir de amostras de solo de uma área impactada com derramamento de petróleo,

localizada no município de Bertioga, São Paulo. Uma biblioteca construída com insertos de

aproximadamente 40 kb e composta de 12.960 clones foi utilizada para a triagem funcional

para a atividade xilanolítica. Utilizando esta técnica foi possível identificar 3 clones

potencialmente positivos, nomeados como MgrBr18, MgrBr61 e MgrBr135. Estes foram

sequenciados via Ion Torrent, e os reads gerados com aproximadamente 50 a 200 pb foram

trimados e utilizados para posterior montagem dos contigs. Ao todo foram obtidos 34 contigs

para o clone MgrBr18, 3 para o clone MgrBr61 e 2 para o clone MgrBr135. Os maiores

contigs foram utilizados para proceder a anotação dos genes por meio dos programas RAST,

Pfam e Blastp. Uma das ORFs geradas, encontrada no clone MgrBr135, que possivelmente

possuía a região codificadora da enzima de interesse foi utilizada para realizar uma análise

mais detalhada da sequência. Foi possível identificar por meio dos softwares Conserved

Domain Database (CDD) e dBCAN que a sequência possuía um domínio catalíco para α-

amilase e que pertencia a família 13 das glicosil hidrolases. Também foi possível identificar a

presença de um domínio de módulo de ligação ao carboidrato da família 48 (CBM 48). A

sequência foi clonada no vetor pBAD-MycHisB e transformada em Escherichia coli TOP 10.

Após teste de expressão gênica foi possível identificar que o gene clonado possuía atividade

amilolítica. A afiliação taxonômica do contig MgrBr135 foi feita pela comparação das ORFs

geradas no servidor RAST com as presentes no banco de dados GenBank por meio do

programa Blastx. Destas, 87% das 30 sequências se afiliaram ao filo Planctomycetes. Uma

análise filogenética da ORF alvo do estudo indicou sua afiliação ao mesmo filo, com 75% de

identidade e 99% de similaridade com uma ORF homóloga do gênero Candidatus Jettenia.

Palavras-chave: Screening; Hemicelulase; Subclonagem; Expressão gênica

Abstract

Microorganisms have an immense genetic variability responsible for encoding enzymes

related to unique functions. Among them, the production of extracellular enzymes that

mineralize organic matter and nutrient cycling in many different environments is essencial.

35

Xylanases comprise one of these groups and are responsible for the degradation of the

lignocellulosic material composed of hemicellulose. These enzymes have various applications

in food, beverage, biofuels and paper industries, among others. The mangrove environment

represent an excellent source for finding new enzymes due to its peculiar features, such as

changes in salinity, high microbial diversity, aerobic-anaerobic conditions and large amounts

of organic matter. Metagenomics allowed great advances in microbiological studies through

culture-independent techniques. The creation of metagenomic libraries offered the

opportunity to bioprospecting genes of biotechnological interest from non-cultivable

microorganisms. In this context, the study aimed to perform functional screening of genes

encoding xylanase enzyme in a metagenomic library from sediment samples of a mangrove,

in the municipality of Bertioga, São Paulo. A library constructed of approximately 40 kb

inserts and consisting of 12,960 clones was used for the functional screening for xylanolytic

activity. Using this technique it was possible to identify three potentially positive clones

named as MgrBr18, MgrBr61 e MgrBr135. These were sequenced via Ion Torrent, generating

reads with approximately 50-200 bp, which were trimmed and used for contig assembly.

Altogether 34 contigs were obtained for clone MgrBr18, 3 for clone MgrBr61 and 2 to clone

MgrBr135. The larger contigs were used for annotation of genes using RAST database, Pfam

and Blastp. One of the ORFs generated, found in clone MgrBr135, which possibly had the

coding region of the enzyme of interest was used to perform a more detailed analysis of the

sequence. Through the Conserved Domain Database software (CDD) and dBCAN it was

found that the sequence had a catalytic alpha amylase domain belonging to family 13 of

glycosyl hydrolases. It was also identified a binding domain of module family 48

carbohydrate (48 CBM). The sequence was cloned in pBAD-MycHisB vector and

transformed into Escherichia coli TOP 10. After gene expression tests it was observed that the

cloned gene had amylase activity. Taxonomic affiliation of the contig MgrBr135 was

performed by comparing the ORFs generated in RAST server with those present in GenBank

database through Blastx program. Results showed that 87% of the 30 sequences were

affiliated to the phylum Planctomycetes. A phylogenetic analysis of the target ORF indicated

affiliation to the same phylum, with 75% identity and 99% similarity to a homologous ORF

affiliated to Candidatus Jettenia.

Keywords: Screening; Hemicellulase; Sub-cloning; Gene expression

2.1 Introdução

A utilização de enzimas hidrolíticas como agentes catalíticos é bastante explorada

industrialmente. Dentre as carboidrases, o interesse comercial pelas enzimas xilanolíticas tem

aumentado significativamente devido à sua aplicabilidade (ZHANG et al., 2006). Estas

enzimas são glicosidases responsáveis pela hidrólise da xilana, principal componente da

hemicelulose. As xilanases participam ativamente do ciclo biogeoquímico do carbono,

convertendo parte do material lignocelulósico em nutrientes de fácil assimilação para outros

organismos vivos. Estas enzimas têm aplicações em uma vasta gama de processos industriais,

abrangendo setores de alimentos, ração animal, combustível e têxtil (COLLINS et al., 2005).

36

Com a evolução da biologia molecular, houve um avanço nos estudos em microbiologia

por meio de técnicas independentes do cultivo microbiano. Dentro deste contexto, surgiu a

metagenômica, análise genômica da comunidade de micro-organismos de um determinado

ambiente (HANDELSMAN, 2004). O melhor acesso ao potencial biotecnológico e a

diversidade dos micro-organismos presente nos ambientes tornou-se possível por meio da

construção de bibliotecas metagenômicas, que consiste na fragmentação do DNA extraído de

uma amostra ambiental, inserção dos fragmentos de DNA em um sistema de vetor adequado e

transformação do vetor recombinante em um hospedeiro apropriado (DANIEL, 2005).

Dentre as amostras ambientais utilizadas para construção de bibliotecas metagenômicas, o

manguezal é considerado um ecossistema promissor como fonte na busca de novos

biocatalizadores. Devido às suas características como, por exemplo, anaerobiose/aerobiose,

altas quantidades de matéria orgânica e a frequente contaminação por derramamentos

acidentais de petróleo e trânsito de embarcações cargueiras, a comunidade microbiana ali

presente é diretamente afetada pela presença de diversos compostos de alta recalcitrância

(ZANARDI, 1996). Estes micro-organismos adaptados podem expressar enzimas capazes de

degradar moléculas complexas. Neste contexto, o nosso objetivo foi realizar a triagem

funcional de genes codificadores da enzima xilanase em uma biblioteca metagenômica de

manguezal, sequenciar os insertos positivos, realizar uma análise filogenética dos contigs e

dos genes encontrados em cada um deles, subclonar as possíveis regiões codificadoras da

enzima em vetores de expressão e avaliar sua expressão gênica.

2.2 Desenvolvimento

2.2.1 Material e Métodos

2.2.1.1 Área de estudo e amostragem

O manguezal onde foi realizada a amostragem do solo está localizado no município de

Bertioga, no Estado de São Paulo (Figura 2.1). A água de inundação deste ambiente é

composta por uma mistura entre água do mar e do Rio Iriri. Este ecossistema sofreu um

impacto causado por um derramamento de aproximadamente 35 milhões de litros de petróleo

no ano de 1983, e as consequências da contaminação continuam presentes (ANDREOTE et

al., 2012). A mata nativa é composta principalmente por Laguncularia racemosa, que

37

demonstra ser mais resistente ao impacto causado pelo derramamento do petróleo. Também é

possível observar a espécie Rhizophora mangle em locais com menor acúmulo do petróleo. A

área de amostragem foi georreferenciada com o auxílio de um GPS (Sistema de

Posicionamento Global) e possui a seguinte coordenada central: latitude 23º53’49’’S e

longitude 46º12’28’’W.

Ponto 1

Ponto 2

Ponto 3

Mar/Rio

Continente

Figura 2.1 - Local de coleta das amostras de solo do manguezal impactado com derramamento de petróleo

localizado em Bertioga, São Paulo. Adaptado de Dias et al. (2012)

As amostras foram coletadas pela equipe técnica da Embrapa Meio Ambiente, em

novembro de 2010, no âmbito do Projeto “Biodiversidade e atividades funcionais de

microrganismos de manguezais do Estado de São Paulo” (Processo FAPESP nº 04/13910-6).

Foram coletadas amostras de três pontos, em triplicatas, que se diferenciaram um dos outros

pelos efeitos do derramamento de petróleo. O ponto 3 devido sua proximidade ao continente

sofre menos interferência das marés, sendo assim, é o mais impactado. A concentração do

petróleo é decrescente à medida que se aproxima do mar, região que sofre influência direta da

maré e do Rio Iriri.

As amostras foram coletadas de uma profundidade de 30 cm da superfície do solo, com o

auxílio de tubos de polipropileno esterilizados, os quais foram totalmente preenchidos com o

solo para evitar a entrada de ar. A coleta foi realizada no decorrer de um transecto,

previamente desenhado, considerando-se a posição intermediária entre o Mar/Rio e o

continente. Alíquotas de 50 g de cada uma das 9 amostras foram agrupadas para compor uma

amostra composta. Esta foi homogeneizada e posteriormente utilizada para a extração de

DNA genômico utilizando o protocolo desenvolvido por Tsai e Olson (1991), com

modificações feitas por Vasconcellos et al. (2010).

38

2.2.1.2 Biblioteca Metagenômica

A construção da biblioteca metagenômica foi realizada pela equipe da Drª. Valéria Maia

de Oliveira, utilizado o kit “Cloning-Ready Copy Control pCC2FOS” (Epicentre®) (OTTONI,

2015; DOMINGOS, 2014). Inicialmente foi realizada a extração do DNA total da amostra de

manguezal. Fragmentos de DNA com elevado peso molecular (~40 kb) foram selecionados

após visualização em gel de agarose 1%, e eletroforese em gel de campo pulsado (Pulsed

Field Gel Electrophoresis - PFGE) a 9 V cm-1

, “switch” de 0,5 - 0,5 por 5 horas, ângulo de

120º, temperatura de 12ºC (HÅRDEMAN & SJÖLING, 2007; VASCONCELLOS et al.,

2010). Os fragmentos de DNA foram cortados do gel e procedeu-se a reação de reparo e

fosforilação das extremidades (end-repair), ligação do inserto no vetor pCC2FOS,

empacotamento dos fosmídeos em fago lambda e transformação em Escherichia coli

EPI300™-T1R. Para a etapa de preservação, os clones foram replicados em placas de 96

poços, preenchidos com 150 µL de meio Lúria Bertani líquido (LB: 10 g.L-1

triptona; 5 g.L-1

extrato de levedura; 5 g.L-1

NaCl; pH 7.0), 12,5 µL/mL de cloranfenicol e armazenadas em

freezer a -80ºC. Depois de pronta foi realizada uma cópia desta biblioteca metagenômica, e

esta foi utilizada nas próximas etapas do trabalho.

2.2.1.3 Triagem funcional

A triagem dos clones produtores de xilanase foi realizada pelo método qualitativo

baseado na função. Para isto, os clones obtidos por meio da construção de uma biblioteca

metagenômica foram inoculados, com auxílio de um carimbo metálico, em placas de Petri

contendo meio de cultivo de sais com 0,2% de xilana de beechwood (SIGMA) e antibiótico

cloranfenicol em uma concentração de 12,5 g/mL (Tabela 2.1).

39

Tabela 2.1 - Composição do meio de cultivo de sais com xilana utilizado para a triagem funcional de uma

biblioteca metagenômica de manguezal. *MX: meio de sais com xilana de beechwood

CONSTITUINTE MX*

NaNO3 (g.L-1

) 0,5

K2HPO4 (g.L-1

) 1,0

MgSO4.7H2O (g.L-1

) 0,5

FeSO4 (g.L-1

) 0,01

Extrato de levedura (g.L-1

) 1,0

Cloranfenicol (g.mL-1

) 12,5

Xilana (SIGMA) (g.L-1

) 2,0

pH 7

Agar (g.L-1

) 15

As placas foram incubadas por 72 horas à temperatura de 37°C. Após esse período, a

atividade da enzima foi observada por meio da presença de zonas claras indicando halos de

hidrólise ao redor das colônias. Os halos foram evidenciados com a adição de uma solução de

iodo e posterior lavagem das placas com NaCl 2 M (KASANA et al., 2008).

2.2.1.4 Extração do DNA fosmidial dos clones positivos

Primeiramente foi realizada a reativação dos clones que mostraram atividade no ensaio

anterior, estriando-os por esgotamento em placas de Petri contendo meio de cultura Luria

Bertani sólido (LB: 10 g.L-1

triptona, 5 g.L-1

extrato de levedura e 5 g.L-1

NaCl, 15 g.L-1

ágar e

pH 7,0) com 12,5 μg/mL de cloranfenicol. As placas foram incubadas a 37ºC. Após 12 h de

cultivo foi retirada uma única colônia isolada para inoculação em tubos de ensaio contendo 5

mL de meio LB líquido com 12,5 μg/mL de cloranfenicol (cultura inicial). Os tubos foram

mantidos sob agitação de 150 rpm a 37ºC. Após 12h de cultivo 1 mL da cultura inicial foi

inoculada em frascos Erlemeryers contendo 500 mL de meio LB líquido com 12,5 μg/mL de

cloranfenicol. Os frascos foram mantidos novamente sob agitação de 150 rpm a 37ºC durante

o período de 8 h. A partir do crescimento final, as células foram recolhidas por centrifugação

a 6.000 rpm por 15 minutos a 4ºC. O pelltet formado foi utilizado para a extração do DNA

fosmidial utilizando o Kit Qiagen Large-Construct, seguindo recomendações do fabricante.

Após obtenção do DNA fosmidial utilizou-se o marcador GeneRuler DNA Ladder 1kb

40

(Invitrogen), como padrão de tamanho das bandas formadas e MassRuler Low Range DNA

Ladder (Invitrogen) para averiguar a concentração do DNA.

2.2.1.5 Preparo e sequenciamento das amostras via Ion Torrent

O sequenciamento de DNA foi realizado via Ion Torrent (Life Technologies, EUA)

utilizando o sequenciador modelo PGM (Personal Genome Machine). Este equipamento

detecta a incorporação dos nucleotídeos por meio de um chip semicondutor. A técnica é

considerada simples, cada microchip semicondutor contém aproximadamente um milhão de

cópias de uma molécula de DNA. O sequenciador inunda o chip com um nucleotídeo de cada

vez (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e, se algum deles for complementar a sequência de DNA,

será incorporado na molécula liberando no meio o íon de hidrogênio. Isso faz com que haja

uma alteração no pH da solução que é detectada por um transistor ISFET (Ion Sensitive Field

Effect Transitor) e convertida em um sinal digital (ROTHBERG et al., 2011).

Para o preparo das amostras foram necessárias duas etapas iniciais: construção da

biblioteca e enriquecimento da amostra. Ambas foram desenvolvidas segundo os protocolos

disponíveis na “Ion Community”. Para a construção da biblioteca foi utilizado o Kit ION

Xpress DNA Fragment Library, que é constituído das seguintes etapas: i) Fragmentação; ii)

Purificação; iii) Ligação dos barcodes/adaptadores; iiii) Amplificação. Após a construção da

biblioteca foi utilizado o Kit ION XpressTM Template v 2.0 para realização do enriquecimento

das amostras utilizando o “mini robô” ION Touch. O objetivo deste procedimento foi preparar

as amostras para serem sequenciadas. Para isto, beads metálicas foram ligadas com os

fragmentos. Estas microesferas, também chamadas de Ion Sphere Particle (ISP), possuíam

um primer universal ligado à sua superfície. Os fragmentos da biblioteca, por sua vez,

possuíam em suas extremidades sequências que hibridizavam com o primer da microesfera.

Desta forma, durante a reação de PCR por emulsão, novas cadeias de DNA fita simples foram

amplificadas, gerando alvos fisicamente ligados às beads. A suspensão de microesferas

carregadas com amostras foi adicionada de primers e polimerase de sequenciamento para

então serem injetadas no chip de sequenciamento.

No presente trabalho foi utilizado um chip 316 com capacidade para gerar até 100 Mb de

sequências (reads) com tamanho entre 50 a 200 pb. Este procedimento foi realizado com a

colaboração da equipe do Laboratório de Microbiologia Ambiental da Embrapa Meio

41

Ambiente. O Workflow do preparo e sequenciamento das amostras pode ser visualizado na

Figura 2.2.

barcode primer

bead

DNA fosmidial

Fragmentação

Carregamento do chip 316 no

sequenciador

Beads + primers + polimerase

depositadas no chip

Figura 2.2 - Representação esquemática do preparo e sequenciamento das amostras de DNA dos clones positivos

por meio da plataforma Ion Torrent

2.2.1.6 Tratamento das sequências, montagem e anotação dos contigs

Os processos de remoção das sequências de baixa qualidade e montagem dos contigs dos

clones positivos obtidos após o sequenciamento via plataforma Ion Torrent foram realizados

pelo software CLC Genomics Workbench-Qiagen (http://www.clcbio.com/products/clc-

genomics-workbench). As análises foram realizadas separadamente para cada clone positivo.

Na primeira etapa os dados gerados no formato FASTQ foram importados (Upload File) para

o software CLC por meio da ferramenta Import Data. Com o auxílio do programa Create

Sequencing QC Report as sequências foram filtradas e as de baixa qualidade foram

descartadas. Esta ferramenta converte os índices de qualidade para a escala de Phred. Foram

considerados somente os nucleotídeos com valor de qualidade de sequenciamento equivalente

a um Phred maior do que 20.

Na segunda etapa, as sequências de melhor qualidade foram trimadas (Trim Sequences

Adapter List) a fim de se remover os adaptadores e barcodes utilizados no sequenciamento

dos clones positivos. Foi realizado então, o mapeamento por referência (Maps Reads to

Reference) dos reads com o objetivo de remover as sequências referentes ao vetor (fosmídeo

pCC2FOS) e as referentes a Escherichia coli (EPI-300). As sequências afiliadas a estes

moldes foram descartadas e as restantes foram utilizadas para a montagem dos contigs.

Utilizou-se a ferramenta “De Novo Assembly” seguindo as seguintes etapas: i) Mismatch Cost

42

(3); ii) Insertion Cost (3); iii) Deletion Cost (3); iv) Lenght Fraction (0.3); v) Similarity

Fraction (0.6) e vi) Word size (40).

Após montagem, os contigs foram submetidos à anotação dos genes. A predição de genes

contidos em um contig é realizada com base nas ORFs (fase de leitura aberta, do inglês, open

reading frame). Uma ORF corresponde a uma região genômica definida por um códon de

início e um códon de término, grande o bastante para codificar uma proteína (PEVSNER,

2009). Para a anotação foram considerados apenas os contigs de melhor qualidade e maiores

do que 20kb.

Após exportar os contigs do CLC em formato FASTA, estes foram depositados no

servidor RAST - Rapid Annotation using Subsystem Technology (http://rast.nmpdr.org) para

posterior anotação. Este servidor é um sistema de código aberto desenvolvido para processar

automaticamente as sequências de genomas e metagenomas, fazendo comparações com bases

de dados existentes, o que permite computar reconstruções filogenéticas e classificar

funcionalmente os potenciais genes presentes no contig (MEYER et al., 2008). Para uma

melhor predição dos possíveis genes codificadores de enzimas xilanolíticas, as sequências dos

quadros abertos de leitura geradas e anotadas no RAST também foram comparadas com os

bancos de dados Pfam (Protein Families Database) e no banco de dados GenBank por meio

do programa Blastp. O workflow da limpeza, montagem e anotação dos contigs pode ser

visualizado na Figura 2.3.

Import data

(FASTQ)

Trim Sequence

(Adaptadores e barcodes)

Map reads to a reference

(pCCFOS2 e E. coli)

Map reads to

ReferenceFosmídeo

(pCC2FOS)

Escherichia coli

(EPI-300)De Novo Assemble Annotation

Reads

Figura 2.3 - Workflow das etapas necessárias para limpeza dos reads gerados pelo sequenciamento via Ion

Torrent, montagem dos contigs utilizando o software CLC Genomics Workbench-Qiagen e

posterior anotação utilizando o servidor RAST - Rapid Annotation using Subsystem Technology,

Pfam e Blastp

43

2.2.1.7 Anotação taxonômica e funcional detalhada do contig MgrBr135

O contig formado com as sequências (reads) do clone MgrBr135 foi selecionado para dar

continuidade às próximas etapas do trabalho. A fim de identificar taxonomicamente o inserto

metagenômico, as sequências de nucleotídeos de todas as ORFs geradas pela anotação

funcional por meio do servidor RAST foram comparadas com as presentes no banco de dados

GenBank por meio do programa Blastx (ALTSCHUL et al., 1997).

Apenas uma delas foi selecionada para realizar a etapa de subclonagem em vetor de

expressão, pois esta possivelmente continha a região codificadora da enzima de interesse.

Além dos bancos de dados utilizados para anotação funcional, para esta sequência foi

realizada uma análise mais detalhada utilizando os softwares Conserved Domain Database

(CDD) e dBCAN (http://csbl.bmb.uga.edu/dbCAN/), com a finalidade de inferir sobre a

presença de possíveis domínios catalíticos, módulos de ligação ao carboidrato, e também, a

afiliação à família glicosil hidrolase.

Com o objetivo de aprofundar ainda mais o estudo sobre a filogenia da ORF utilizada

para subclonagem, a sua sequência de aminoácido foi comparada com as presentes no banco

de dados GenBank por meio do programa Blastp. As sequências com maior similaridade com

as ORF obtidas foram utilizadas para a inferência com base em árvore filogenética construída

com o auxílio do programa MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0).

A árvore foi construída pelo alinhamento das sequências realizado pelo Muscle,

posteriormente convertido numa matriz de distância determinada pelo parâmetro Kimura-2

(KIMURA, 1980) e agrupada pelo método de Neighbor-Joining. A consistência da estrutura

da árvore foi determinada pela análise de bootstrap, feita com base em 1000 sub-amostragens

na matriz de distância.

2.2.1.8 Subclonagem em vetor de expressão

Para amplificar toda região codificadora da enzima de interesse da amostra de DNA

fosmidial do clone positivo foi desenhado um par de primers com os sítios de restrição XhoI e

XbaI. Por meio do software CLC Genomics Workbench-Qiagen foi possível identificar quais

enzimas de restrição não clivariam o gene de interesse. Sendo assim, a escolha foi baseada na

ausência das mesmas no fragmento a ser amplificado e na sua presença no vetor de expressão

utilizado nesta etapa de clonagem (Tabela 2.2).

44

Tabela 2.2 - Primers com seus respectivos sítios de restrição (sublinhados) utilizados para a amplificação da

região codificadora da enzima de interesse

PRIMER SEQUÊNCIA ER*

FORWARD (F) 5’ CAGTCTCGAGGAACAAAAAGCAGAAAAAGC 3’ XhoI

REVERSE (R) 5’ TCTCATATCTAGAGCCCCTTCATGTCTGA 3’ XbaI

*enzima de restrição

O par de primers foi analisado quanto ao tamanho (lenght), porcentagem de guanina e

citosina (%GC), temperatura de melting (Tm) e peso molecular, por meio do programa

OligoAnalyzer 3.1 (http://www.idtdna.com/calc/analyzer). Após esta etapa foi feita a síntese

dos mesmos e estes foram testados em diferentes reações em cadeia da polimerase (PCR), a

fim de se padronizar a temperatura ideal de anelamento à sequência e as concentrações

necessárias dos reagentes. A reação de PCR ideal para amplificação do fragmento consistiu na

seguinte mistura (volume final 25 µL): 1 µL de DNA fosmidial (~50 ng), 3,0 µL MgCl2 (25

mM), 2 µL de dNTP’s (2,5 mM), 1 µL dos primers F e R (100 mM), 2,5 µL Taq Buffer (10

X), 0,1 µL de Taq DNA polimerase (5 U.µL-1

) e 14,40 µL de água milli-Q autoclavada.

A amplificação foi realizada em um termociclador Gene Pro Thermal Cycler utilizando a

seguinte programação: desnaturação inicial a 94ºC por 4 minutos, 30 ciclos de desnaturação

(94ºC por 1 minuto), anelamento (50ºC por 45 segundos), extensão (72ºC por 1 minuto e 30

segundos) e uma extensão final a 72ºC por 10 minutos. Os produtos gerados foram

purificados utilizando o Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Madison,

WI, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Alíquotas de 5 µL do produto de PCR

foram avaliadas em gel de agarose a 1 % em tampão TAE 1 X (400 mM Tris, 20 mM ácido

acético glacial, 1 mM EDTA). Utilizou-se o marcador GeneRuler DNA Ladder 1kb

(Invitrogen), como padrão de tamanho das bandas formadas e MassRuler Low Range DNA

Ladder (Invitrogen) para averiguar a concentração do DNA.

O vetor de expressão utilizado no presente trabalho para clonagem do gene de interesse

foi o plasmídeo pBAD/Myc-HisB (Invitrogen) que contém as seguintes características: cauda

de histidina (His-tag), promotor pBAD, gene regulador araC, sítio múltiplo de clonagem,

resistência a ampicilina (marcador de seletividade) e diferentes sítios de restrição (Figura 2.4).

45

Figura 2.4 - Demonstração das principais características plasmídeo pBAD/Myc-HisB (Invitrogen) utilizado no

presente trabalho como vetor de expressão

Inicialmente o plasmídeo pBADMyc-HisB foi transformado em Escherichia coli DH5

por eletroporação com o objetivo de propagar e estocar o vetor de expressão. Os

transformantes foram cultivados em placas de Petri com o meio LB sólido contendo 100

μg/mL do antibiótico ampicilina. As colônias formadas foram inoculadas em frascos

Erlenmeyer contendo meio LB líquido acrescido do mesmo antibiótico e mantidos a uma

agitação de 150 rpm a 37ºC. A suspensão de bactérias foi utilizada para posterior extração do

DNA plasmidial utilizando o kit Invisorb® Plasmid Midi, seguindo as recomendações do

fabricante. Após extração do DNA plasmidial uma alíquota de 1 μL foi digerido com a

enzima de restrição PvuII durante 1h a 37ºC, a fim de se confirmar o sucesso na extração.

Alíquotas de 10 µL da digestão foram avaliadas em gel de agarose a 1 % em tampão TAE 1 X

(400 mM Tris, 20 mM ácido acético glacial, 1 mM EDTA). Utilizou-se como marcador o

GeneRuler DNA Ladder 1kb (Invitrogen). Os transformantes foram estocados em tubos

previamente esterilizados contendo glicerol numa proporção de 850 L da cultura overnight

para 150 L de glicerol. Os tubos foram armazenados no freezer a - 20ºC e - 80ºC.

O DNA plasmidial do vetor de expressão e o produto de PCR previamente amplificado

foram digeridos com as enzimas XhoI e XbaI separadamente em microtubos diferentes

segundo protocolo descrito na Tabela 2.3. O tampão Tango (10 X) e as enzimas utilizadas

foram provenientes da Invitrogen. Uma unidade enzimática (U) é definida como a quantidade

de enzima requerida para a digestão de 1 µg de DNA em 1 h a 37°C em um volume total de

50 µL. Sendo assim, os microtubos foram mantidos por 4 horas a 37°C. Todo o produto de

PCR e plasmídeo digerido foram avaliados em gel de agarose a 0,8% em tampão TAE 1X

46

(400 mM Tris, 20 mM ácido acético glacial, 1 mM EDTA). Utilizou-se o marcador

GeneRuler DNA Ladder 1kb (Invitrogen), como padrão de tamanho das bandas formadas e

MassRuler Low Range DNA Ladder (Invitrogen) para averiguar a concentração do DNA. As

bandas nas alturas desejadas foram cortadas do gel e procedeu-se a purificação com o kit

QIAEX II® Gel Extraction (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. Alíquotas de 2 μL

das amostras foram novamente avaliadas em gel de agarose quanto a qualidade, quantidade e

padrão de bandas formadas.

Tabela 2.3 - Protocolo para digestão do vetor de expressão e do produto de PCR

PROTOCOLO Volume (µL)

pBAD/Myc-HisB / Produto de PCR (100 ng/μL) 55

XhoI (10U/ μL) 3

XbaI (10U/ μL) 3

Buffer Tango (10X) 10

H2O 9

TOTAL 80

A reação de ligação do inserto no vetor de expressão foi feita seguindo a razão 3:1. O

cálculo da concentração foi realizado conforme demonstrado abaixo:

ng vetor x kb inserto x 3 inserto = ng inserto

kb vetor 1 vetor

A reação consistiu na seguinte mistura: 4,8 μL do inserto, 3,3 μL do pBAD/Myc-HisB, 4

μL do Tampão T4 DNA Ligase (10 X), 1 μL da enzima T4 DNA Ligase (Invitrogen) e 6,9 μL

de água deionizada estéril para completar o volume final de 20 μL. A reação foi incubada a

24°C overnight e após este período a transformação foi realizada em Escherichia coli TOP 10

eletrocompetentes, por eletroporação. As bactérias foram cultivadas em placas de Petri com

LB ágar e ampicilina (100 μg/mL) durante 24 h à uma temperatura de 37°C. Para confirmar o

sucesso da clonagem do gene de interesse, as colônias formadas foram coletadas com o

auxílio de palitos de madeira autoclavados e transferidas para placas de 96 poços contendo 50

μL de água e submetidas à temperatura de 95 °C por 10 minutos em termociclador Gene Pro

Thermal Cycler a fim de se promover a lise celular. Procedeu-se então a amplificação direta

do fragmento com os primers previamente desenhados. O "mix" de PCR assim como a

programação foram os mesmos utilizados previamente para amplificação do gene. Os

47

fragmentos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1 %, com o marcador

GeneRuler DNA Ladder 1 kb (Invitrogen) para determinação do padrão de tamanho das

bandas formadas, e com MassRuler Low Range DNA Ladder (Invitrogen) para averiguar a

concentração do DNA.

Os transformantes positivos foram cultivados overnight em meio LB líquido com

ampicilina (100 μg/mL). Alíquotas de 850 da cultura foram adicionadas a 150 L de

glicerol em tubos previamente esterilizados, e estocados em freezer à temperatura de -20ºC e -

80ºC.

2.2.1.9 Teste de expressão do transformante

Após análise mais detalhada da anotação da ORF de interesse pode-se perceber que

talvez se tratasse de uma região codificadora de uma enzima amilase. Desta forma, a fim de se

determinar a real atividade da enzima, o experimento de expressão do gene clonado foi

conduzido com dois meios de cultivo de sais, um contendo xilana e o outro contendo amido

como principal fonte de carbono (Tabela 2.4). Visto que cada proteína recombinante pode

possuir características que afetam sua expressão, foram testadas 3 concentrações diferentes de

L-arabinose. Inicialmente foi preparada uma solução estoque a 20% em água esterilizada que

foi utilizada para as diluições. Após preparo dos meios de cultivo foram adicionadas as

seguintes concentrações do açúcar indutor: 0,2%, 0,02% e 0,002%. Com o auxílio de palitos

de madeira esterilizados as colônias do transformante foram inoculadas em placa de Petri

contendo os meios de cultivo e mantidas por 72h à temperatura de 37°C. Após este período,

as placas foram coradas uma solução de iodo e posteriormente lavadas com NaCl 2 M para

visualização dos halos de degradação ao redor das colônias (KASANA et al., 2008) e

confirmação da atividade da enzima.

48

Tabela 2.4 - Composição dos meios de cultivo de sais utilizado para confirmação da atividade e testes de

expressão do transformante. *MX: meio de sais com xilana de beechwood. *MA: meio de sais com

amido

CONSTITUINTE MX/MA*

NaNO3 (g L-1

) 0,5

K2HPO4 (g L-1

) 1,0

MgSO4.7H2O (g L-1

) 0,5

FeSO4 (g L-1

) 0,01

Extrato de levedura (g L-1

) 1,0

Ampicilina (100 g/mL-1

) 1

Xilana (SIGMA) ou Amido (SIGMA) (g L-1

) 2,0

pH 7

Agar (g L-1

) 15

2.3 Resultados e Discussão

2.3.1 Biblioteca Metagenômica

A biblioteca metagenômica de solo de manguezal altamente impactado pelo

derramamento de petróleo originou 135 placas de 96 poços, totalizando 12.960 clones (Figura

2.5).

Figura 2.5 - Detalhe da biblioteca metagenômica construída com amostras de solo do manguezal contaminado

com derramamento de petróleo localizado em Bertioga, São Paulo.

Foto:<http://www.unicamp.br/unicamp/unicamp_hoje/ju/setembro2010/ju475_pag06.php>.

2.3.2 Triagem funcional e extração do DNA fosmidial

A triagem funcional de bibliotecas metagenômicas possui o potencial de identificar e

caracterizar um grande número de biocatalisadores e outras biomoléculas (SCHLOSS &

HANDELSMAN, 2003). É uma boa ferramenta para identificar e atribuir função para novos

genes e suas proteínas codificadas sem qualquer conhecimento prévio da sequência, além de

49

revelar informações importantes sobre o papel funcional do micro-organismo no ambiente de

estudo (DELONG & BEJA, 2010; CULLIGAN et al., 2013). Esta técnica oferece a vantagem

de poder acessar e detectar apenas enzimas ativas. Utilizando este método baseado na

identificação de um clone que expressa uma característica específica no meio de cultivo foi

possível identificar 3 clones possivelmente xilanolíticos (Figura 2.6). Os números das placas

das quais foram encontrados os clones são 18, 61 e 135; os clones positivos foram nomeados

como MgrBr18, MgrBr61 e MgrBr135, respectivamente.

Figura 2.6 - Halo de hidrólise enzimático do clone MgrBr 135 após cultivo em meio de sais com xilana incubado

por 72h a 37ºC, posteriormente evidenciado pela adição de uma solução de iodo.

A técnica para a triagem funcional dos clones positivos é conceitualmente simples,

porém, o tamanho do metagenoma da amostra e o grande número de clones necessários para

cobrir toda a comunidade nativa pode tornar esse trabalho tecnicamente complicado

(DANIEL, 2005). A biblioteca metagenômica utilizada no presente trabalho possui 12.960

clones, valor inferior a alguns encontrados na literatura para realização da triagem funcional

de bibliotecas metagenômicas (IORIS, 2008; THIMOTEO, 2011). Existe a possibilidade de

ter havido uma baixa cobertura da diversidade funcional presente no ecossistema de

manguezal, gerando um número baixo de clones positivos para atividade desejada. Outro

problema deste tipo de triagem é que os genes clonados serão expressos em hospedeiros

diferentes dos hospedeiros de origem, podendo gerar problemas de expressão (DANIEL,

2005). Após a triagem, o DNA fosmidial dos clones positivos foi extraído e visualizado em

gel de agarose a 1% (Figura 2.7).

50

Figura 2.7 - Eletroforese em gel de agarose (1%) da extração do DNA fosmidial de possíveis clones xilanolíticos

obtidos a partir de triagem de biblioteca metagenômica de solo do manguezal. M1= GeneRuler DNA

Ladder 1kb (Invitrogen). M2 = MassRuler Low Range DNA Ladder (Invitrogen). A = MgrBr18, B =

MgrBr61 e C = MgrBr135

2.3.3 Tratamento das sequências, montagem e anotação inicial dos contigs

A plataforma escolhida (Ion Torrent) trata-se de um sequenciamento de nova geração,

ideal para pequenos genomas, aliando baixo custo com versatilidade de mistura de amostras

de DNA em um único chip (GLENN et al., 2011). No presente trabalho foi utilizado o chip

316 que apresentou uma cobertura de sequenciamento de 69% e um total de 2.029.977 reads,

com tamanho médio de 100 pb (Figura 2.8).

26

40

wel

ls

0

0

200

400

600

800

COBERTURA DO CHIP (69%)

10%

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

200 400 600 800

0%

A) B)

Read Lenght Histogram

Read Lenght

Co

un

t

5000

10000

15000

20000

25000

0

0 50 100 200 250 300150

Figura 2.8 - Resumo do sequenciamento via Ion Torrent do DNA fosmidial dos clones positivos. A) cobertura

em porcentagem do chip. B) número e tamanho médio dos reads (pares de bases)

A maioria das sequências geradas dos três clones apresentou uma boa qualidade

representada pelo índice de Phred. Os valores ficaram entre 20 e 30, que representa

respectivamente, 1 base errada em cada 100 e 1 base errada em cada 1000 (Figura 2.9).

51

Figura 2.9 - Qualidade das sequências determinada pelo valor de Phred. Os reads com valores inferiores a 20

foram descartados

Após esta etapa foi feito o “De Novo Assembly” para obtenção dos contigs e posterior

anotação. Ao todo foram obtidos 34 contigs para o clone MgrBr18, 3 para o clone MgrBr61 e

2 para o clone MgrBr135 (Tabela 2.5).

Tabela 2.5 - Tabela identificando as características dos contigs formados após montagem por meio da ferramenta

“De Novo Assembly” presente no software CLC Genomics Workbench

CLONES NCF* Maior Contig Menor Contig

MgrBr 18 34 13.436 pb 226 pb

MgrBr 61 3 24.865 pb 1.156 pb

MgrBr 135 2 35.966 pb 872 pb

*NCF = número de contigs formados

Priorizou-se realizar a anotação funcional mais detalhada do contig formado pelos

reads do clone MgrBr135. Este foi o que apresentou a melhor qualidade e tamanho esperado

na montagem, com aproximadamente 36 kb, valor próximo ao tamanho do inserto original

(40 kb). Além deste fato, uma das 30 ORFs geradas no servidor RAST após anotação, quando

comparada com os outros resultados obtidos, demonstrou um tamanho considerável (1944

nucleotídeos) e maior probabilidade de possivelmente conter a região codificadora da enzima

de interesse. A anotação funcional das 30 sequências dos quadros abertos de leitura geradas

no RAST e posteriormente comparadas nos bancos de dados GenBank por meio do programa

Blastp e no Pfam podem ser visualizados na Tabela 2.6. O mapa do contig MgrBr135 com as

30 ORFs em diferentes fases de leitura, sendo que as setas indicam o sentido de cada uma

delas, está representado na Figura 3.0.

52

Tabela 2.6 – Anotação funcional comparativa das 30 ORFs do clone MgrBr 135. A que possivelmente continha a

região codificadora para enzima de interesse e que foi selecionada para prosseguir com clonagem

em vetor de expressão está em destaque. *pares de base

ORF Tamanho* RAST Balstp Pfam

1 398 Regulator protein Regulator protein Regulator protein

2 2030 Cell division protein FtsH Cell division protein FtsH Cell division protein FtsH

3 1163 DXP reductoisomerase DXP reductoisomerase DXP reductoisomerase

4 2144 Intramembrane protease Probable metalloproteinase -

5 1070 UDP-3-O-[3-hydroxymyristoyl]

glucosamine N-acyltransferase

UDP-3-O-(3-hydroxymyristoyl)

glucosamine N- acyltransferase

UDP-3-O-(3-hydroxymyristoyl)

glucosamine N- acyltransferase

6 899 Proteína hipotética Proteína hipotética Proteína hipotética

7 746 Proteína hipotética Proteína hipotética Proteína hipotética

8 995 Acetoacetate metabolism Acetoacetate metabolism Acetoacetate metabolism

9 1934 Ribonucleotide reductase of class II Ribonucleotide reductase Ribonucleotide reductase

10 959 Ribonucleotide reductase of class II Ribonucleotide reductase Ribonucleotide reductase

11 311 Ribosomal protein Ribosomal protein Ribosomal protein

12 1694 Ribonuclease Ribonuclease Ribonuclease

13 674 Proteína hipotética Proteína hipotética -

14 149 Proteína hipotética Proteína hipotética -

15 1745 Phosphoenolpyruvate-protein Phosphoenolpyruvate-protein Phosphoenolpyruvate-protein

16 845 Phosphotransferase protein Phosphotransferase protein -

17 365 Probable sigma-54 modulation protein Probable sigma-54 modulation

protein

Probable sigma-54 modulation

protein

18 1079 Iron-binding protein Iron Transporter Iron Transporter

19 1325 Proteína hipotética Proteína hipotética -

20 1253 Serine hydroxymethyltransferase glycine hydroxymethyltransferase Serine

hydroxymethyltransferase

21 434 Proteína hipotética Proteína hipotética Proteína hipotética

22 1184 Proteína hipotética Proteína hipotética Proteína hipotética

23 410 Proteína hipotética Proteína hipotética -

24 803 alpha/beta hydrolase Alpha/beta hydrolase Alpha/beta hydrolase

25 542 Proteína hipotética Proteína hipotética -

26 665 Proteína hipotética Proteína hipotética Proteína hipotética

27 695 Radical SAM domain protein Radical SAM protein -

28 626 Proteína hipotética Proteína hipotética Proteína hipotética

29 1097 Trehalose synthase alpha-amylase Phosphotransferase enzyme

30 1944 1,4-alpha-glucan branching enzyme Glycogen Branching Protein Alpha amylase

53

1,4-alpha-glucan branching enzyme5` - 3`

3` - 5`

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

14

15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

0 4000 8000 12000 16000 20000 24000 28000 32000 36000

Figura 3.0 - Mapa do contig MgrBr135. A ORF em destaque (vermelho) representa a que foi utilizada

subclonagem em vetor de expressão

2.3.4 Anotação taxonômica e funcional detalhada do contig MgrBr135

Das 30 ORFs que foram submetidas à comparação contra o banco de dados GenBank por

meio do programa Blastx, 87% foram afiliadas a sequências oriundas de representantes do

filo Planctomycetes, 87% destas à classe Planctomycetia, 80% destas à ordem

Planctomycetales e 74% destas à família Planctomycetaceae (Figura 3.1).

54

Figura 3.1 - Representação da afiliação taxonomia das 30 ORFs geradas por meio do servidor RAST. As sequências foram comparadas com as presentes no banco de dados de

proteínas não redundantes (nr) por meio do programa Blastx. A) Filo B) Classe C) Ordem C) Família

55

A análise funcional mais detalhada da sequência escolhida demostrou que esta possui o

gene codificador de uma 1,4-alpha-glucan branching enzyme, composta por 647 aminoácidos.

Foi realizada a confirmação de qual frame de leitura estava localizada a CDS (Coding

Sequence), assim como, seu start (nt 32538) e stop códon (nt 34481) (Figura 3.2).

A)

ID fig|6666666.45794.peg.30

Contig contig_1

Type CDS

Function 1,4-alpha-glucan (glycogen) branching enzyme

Subsystem Glycogen metabolism, Trehalose Biosynthesis

Start 32538

Stop 34481

Length 1944

B) > 1,4-alpha-glucan branching enzyme_ amino acid sequence

METRNKKQKKPDNVLCDTSLITDHDVYLFKEGNHFKLYDKLGSHIVTVDGRKGTLFAVWAPNAERVS

VAGDFNNWNKTSHQLSVRGDGSGIWEGFIPGVGHGAVYKYYIVSRYNNYTVEKSDPFALHCEVPPKTA

SVVWDLSNTWNDREWMEKRQAFNSLDSPLSIYEVHPGSWRRVPEEDNRPLTYREMAHYLADYAKDM

GFTHVEFLPVNEHPFYGSWGYQITGYFAPTSRYGTPQNFMYLVDHLHQNGIGVILDWVPSHFPGDEHG

LVYFDGTHLYEHEDPRKGFHPDWNSYIFNYGRYEVLNFLISSAMFWLEKYHIDGLRVDAVASMLYLDY

GRRDGEWIPNQYGGKENIEAIHFLKRFNEMVYENFPDVQTIAEESTAWPMVSRPSYVGGLGFGMKWN

MGWMHDTLDYFSNDPVFRKYHHNQLTFSIWYAFSENFVLSLSHDEVVHGKGSLFGKMSGEEREKYAN

LRLLFGYMYAHPGKKLLFMGGEIAQWKEWNHEESLEWHVLQYPLHRGVHQWVKDLNHLYRAEPAL

YELDFSQEGFEWIDFHNWEQSIISFVRNGRDGSEPILVVCNFTPVPRHNYRIGVPTGGFWKEVLNSDAKE

YEGNGYGNTGGCEASPVPAHGKYHSLSLTLPPLGILFFRHEGAStop*

Figura 3.2 - A) Análise da CDS indicando sua função, frame de leitura, códons de iniciação e término e o

tamanho em pares de base da sequência. B) Composição da sequência em aminoácidos (647 aa)

A sequência de aminoácidos foi comparada contra o Conserved Domain Database (CDD)

onde foi possível identificar e confirmar um domínio catalítico para uma α-amilase

(AmyAC_Glg_BE) (Figura 3.3). Esta enzima apresenta uma estrutura tridimensional

altamente conservada, havendo homologia entre amilases de diferentes fontes. A conformação

básica da α-amilase consiste de uma cadeia polipeptídica única dobrada em três domínios: A,

B, e C (PRAKASH & JAISWAL, 2010). O domínio catalítico B atua na especificidade da

56

enzima, uma vez que o mesmo forma parte da ligação com o substrato, conferindo

flexibilidade à molécula. O domínio C atua na estabilização do domínio catalítico e na ligação

com o substrato (JANECEK et al., 1997).

O domínio catalítico A é considerado o mais conservado entre as α-amilases. Ele é

formado por uma estrutura de barril (β/α)8, a mesma encontrada em enzimas xilanolíticas da

família glicosil hidrolase 10. Esta estrutura terciária é a mais frequente dentre as glicosil

hidrolases; quase todas que possuem essa estrutura têm relação evolutiva distante (PRAKASH

& JAISWAL, 2010; NAUMOFF 2011; LOMBARD, 2013).

Alguns autores já relataram a bifuncionalidade enzimática xilanase-glucanase e xilanase-

celulase pertencente a um mesmo domínio catalítico. Porém, até o presente momento, não foi

encontrado na literatura dupla atividade para ambos os substratos xilana e amido, apesar da

similaridade na estrutura do domínio catalítico entre as enzimas α-amilase e xilanase (SHI et

al., 2010; CHANG et al., 2011; KO et al., 2013; RASHAMUSE et al., 2013).

Name Accession Description Interval E-value

AmyAc_Glg_BE cd11322 Alpha amylase catalytic domain found in the Glycogen branching enzyme 128-530 0e+00

E_set_GBE_prok_N cd02855 N-terminal Early set domain associated with the catalytic domain of prokaryotic

glycogen

32-138 1.44e-50

Alpha-amylase_C Pfam02806 Alpha amylase, C-terminal all-beta domain; Alpha amylase is classified as family 13 546-645 9.89e-23

PRK12313 PRK12313 glycogen branching enzyme; Provisional 15-647 0e+00

Figura 3.3 - Confirmação de um domínio catalítico para α-amilase (AmyAC_Glg_BE) gerado após análise de

comparação da sequência de aminoácidos contra o Conserved Domain Database (CDD)

Muitas enzimas responsáveis pela hidrólise de carboidratos, como celulose, hemicelulose

e amido, são proteínas modulares com pelo menos dois domínios distintos: o domínio

catalítico e o módulo de ligação ao carboidrato (CBM - Carbohydrate Binding Module)

(GILKES et al., 1991). Sendo assim, a sequência de aminoácidos foi depositada no servidor

dbCAN que realiza anotação automática de enzimas com base na classificação da família e do

domínio de ligação ao carboidrato por meio do banco de dados CAZy (Carbohydrate- Active

enZymes - “Enzimas Ativas em Carboidratos”). Utilizando esta ferramenta foi possível

identificar que a sequência afiliada a uma α-amilase pertencia à família 13 das glicosil

57

hidrolases (GH13) e que possuía um domínio de ligação ao carboidrato 48 (CBM 48) (Figura

3.4).

CBM 48 GH 13

38 126 193 500

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390 420 450 480

dBCAN domain architecture

Query Subject E-value Covered fraction Start End

Seq CBM48 1.4e-18 0.907894736842105 38 126

Seq GH13 7.3e-32 0.91304347826087 193 500

Figura 3.4 - Análise da sequência de aminoácidos por meio do servidor dbCAN identificando que a mesma é

uma α-amilase pertencente a família glicosil hidrolase 13 (GH 13) com o domínio de ligação ao

carboidrato 48 (CBM 48)

A α-amilase é a enzima responsável por degradar o amido a partir da catálise de ligações

glicosídicas -1,4, gerando moléculas de açúcares simples como: glicose, maltose e dextrinas

(GUPTA et al., 2003). As enzimas amilolíticas são responsáveis por 25-33% da produção

mundial de enzimas e são amplamente aplicadas em processos biotecnológicos, tais como:

indústrias têxteis, panificação, bebidas destiladas, cervejas, produção de xaropes de glicose e

preparo de gomas de dextrinas (NIELSEN & BORCHERT, 2001; KIRK et al., 2002; GUPTA

et al., 2003; SZAKACS, 2004; DEMIRKAN et al., 2005; PANDEY et al., 2005).

A α-amilase é amplamente conhecida e pode ser encontrada em uma grande variedade de

organismos representados em todos os domínios (PANDEY et al., 2000). Micro-organismos

que possuem esta enzima já foram descritos em ambiente de manguezal, e sua atividade já foi

identificada por alguns autores (DIAS et al., 2009; COUTO, 2009; PUPIN, 2013). Geralmente

possuem múltiplos domínios e aproximadamente 10% delas possuem um domínio distinto e

não catalítico responsável por facilitar a ligação e degradação do amido insolúvel. Esse

domínio de ligação do amido, conhecido como SBD (starch binding domain), parece estar

presente apenas em amilases provenientes de micro-organismos, como fungos e bactérias. Os

SBDs são atualmente caracterizados como parte da classificação baseada nas sequências dos

módulos de ligação ao carboidrato. Podem ser encontrados nas famílias CBM 20, CBM 21,

CBM 25, CBM 26, CBM 34, CBM 41, CBM 45 e, recentemente, em CBM 48 (MACHOVIC

& JANECEK, 2006).

58

O resultado da afiliação taxonômica da ORF codificadora da α-amilase corroborou com a

realizada para identificação filogenética do contig MgrBr135. A sequência também se afiliou

ao filo Planctomycetes, mais precisamente ao gênero Candidatus Jettenia conhecido na

literatura como um micro-organismo de difícil cultivo e isolamento (IZUMI et al., 2013)

(Figura 3.5).

gi|494424264|Candidatus jettenia caeni

Alfa amilase clone 135

gi|502798458|Nitrosococcus halophilus

gi|655462048|Thermodesulfovibrio thiophilus

gi|658521006|Atribacteria bacterium

gi|504619130|Anaerobaculum mobile

gi|499182894|Aquifex aeolicus

gi|771612290|Desulfonatronum thioautotrophicum

gi|500019529|Syntrophobacter fumaroxidans

gi|652935788|Desulfovibrio putealis

gi|780087642|Burkholderiales bacterium

gi|496496892|Sulfuricella denitrificans

gi|493945806|Methylobacter tundripaludum

gi|917255362|Ferrovum myxofaciens

gi|504996497|Microcoleus sp.

gi|868616460|Nitrospina sp.

gi|501214029|Chloroflexus aurantiacus

gi|750386804|Nitrolancea hollandica

gi|917988207|Sphaerobacter thermophilus

gi|506403156|Thermomicrobium roseum

gi|752809957|Anaeromyxobacter sp.

100

99

68

50

37

42

39

91

64

39

48

38

47

35

46

50

17

34

0.05

Figura 3.5 - Reconstrução filogenética demonstrando as relações entre o inserto metagenômico (aminoácidos)

com as sequências dos organismos mais similares presentes no banco de dados. A filogenia foi

determinada pelo método Neighbor joining e a relação entre as sequências foi inferida usando

método muscle. Foram utilizadas sequências com uma similaridade maior a 95%, com bit-score

acima de 860. Os valores nos ramos indicam a frequência de agrupamento dos mesmos,

determinada pelo teste de bootstrap, com replicação de 1000 vezes. A sequência de interesse esta

indicada com uma seta

59

Os Planctomycetes são encontrados em diferentes ambientes aquáticos e terrestres, tais

como: águas marinhas (FUCHSMAN et al., 2012), água doce (BONDOSO et al., 2011),

rizosfera (SHENG et al., 2012), ambientes poluídos (CHOUARI et al., 2003) e solo

(BUCKLEY et al., 2006). Este filo já foi descrito por alguns autores como pertencente à

comunidade microbiana do manguezal utilizado no presente trabalho como área de estudo

(ANDREOTE et al., 2012; LUVIZOTTO, 2013; ARAÚJO, 2014). Micro-organismos

presentes neste filo, também podem ser encontrados em ambientes com condições extremas

como: ambientes áridos (deserto do Atacama) (DREES et al., 2006), ambientes com alta

variação de salinidade (BERNHARD et al., 2012), ambientes ácidos (URBIETA et al., 2012)

e ambientes com altas temperaturas (LI et al., 2010).

O filo Planctomycetes se divide em duas classes, Planctomycetacia e Phycisphaerae, cada

uma delas hospeda uma ordem, Planctomycetales e Phycisphaerales, respectivamente. A

primeira delas, ordem pela qual 80% das ORFs se afiliaram, está dividida em 11 gêneros

cultiváveis (Pirellula, Gemmata, Planctomyces, Isosphaera, Blastopirellula, Rhodopirellula,

Schlesneria, Singulisphaera, Aquisphaera, Zavarzinella, Phycisphaera) e cinco gêneros não

cultivados (Candidatus, Brocadia, Kuenenia, Scalindua, Anammoxoglobus e Jettenia)

(SCHLESNER et al., 2004; WARD et al., 2006; KULICHEVSKAYA et al., 2008; KRIEG et

al., 2008; UKUNAGA et al., 2009; BONDOSO et al., 2011).

O papel desta bactéria é conhecido na ciclagem do nitrogênio, onde atua no processo de

oxidação anaeróbica do amônio (MULDER et al., 1995). Acredita-se que o grupo dos

Planctomycetes tenha papel fundamental na ciclagem da matéria orgânica neste ambiente,

principalmente pela sua grande frequência nestes solos (quando comparado a outros solos), e

a presença de genes relacionados a este processo (FUERST & SAGULENKO, 2011;

ANDREOTE et al., 2012; IVANOVA & DEDYSH, 2012).

2.3.5 Subclonagem e expressão heteróloga do gene alvo

Após o desenho dos primers foram realizadas várias reações de PCR a fim de padronizar

o protocolo para amplificação do fragmento de interesse. Inicialmente observou-se uma baixa

concentração e especificidade do produto de PCR. Bandas inespecíficas estiveram presentes,

possivelmente atribuídas aos excessos de dNTPs, concentração do magnésio e temperatura de

anelamento dos primers. Somente quando foi empregada a temperatura de hibridização de

50ºC e ajuste da concentração dos reagentes foi possível a amplificação desejada. O produto

de PCR teve o seu tamanho concordante com o previsto, aproximadamente 2000pb.

60

Apresentou uma redução significativa em relação às bandas inespecíficas, indicando o

sucesso da otimização do PCR. Além disso, resultou em quantidades suficientes para a

clonagem em vetor de expressão (Figura 3.6).

Figura 3.6 - A) Diferentes reações a fim de se padronizar as melhores condições da reação em cadeia da

polimerase. B) Amplificação do gene de interesse (aproximadamente 2000pb) indicado pela seta

vermelha. M = GeneRuler DNA Ladder 1kb. O meio de separação foi gel de agarose 1,0 % em

tampão 1X TAE. A voltagem aplicada na separação foi 100 V por 30 min

Após amplificação do gene de interesse, o plasmídeo pBADMyc-HisB foi transformado

em E. coli DH5para propagação do vetor, extraído o seu DNA e digerido com a enzima de

restrição PvuII para confirmar o sucesso na extração (Figura 3.7).

Figura 3.7 - A) DNA plasmidial (pBADMyc-HisB) extraído a partir de um de E. coli (DH5) cultivada overnight

em meio líquido LB com adição de ampicilina. B) plasmídeo super-enrolado que foi digerido com a

enzima de restrição PvuII e analisado por electroforese num gel de agarose a 1%. M = GeneRuler

DNA Ladder 1kb

O vetor pBADMyc-HisB foi utilizado no presente trabalho por que permite um bom

controle dos níveis de expressão. O seu promotor pBAD é responsável por iniciar a expressão

do gene clonado. A regulação da expressão gênica pode ser de dois tipos possíveis, e em

ambos, se faz necessária à presença de um gene regulador como controle positivo e negativo.

No vetor pBAD/Myc-HisB, a regulação da expressão é tanto positiva como negativamente

regulado pelo produto do gene araC, uma proteína reguladora transcricional, que forma um

61

complexo com o açúcar L-arabinose. Na presença deste, a expressão do gene é ativada,

enquanto que na ausência, há baixa ou quase nenhuma expressão. Desta forma, variando a

concentração de L-arabinose, os níveis de expressão da proteína podem ser otimizados.

A seleção dos transformantes foi realizada pela capacidade de se multiplicar na presença

do antibiótico ampicilina. Foram escolhidas aleatoriamente 24 colônias dos possíveis clones

positivos e estes foram submetidas a PCR com o objetivo de confirmar o sucesso da clonagem

conforme descrito em 2.2.1.7. Foi possível observar que 5 delas apresentaram o perfil de

banda desejado de aproximadamente 2000 pb (Figura 3.8). O fato de nem todas as amostras

terem sido amplificadas pode ter relação com a concentração e qualidade do DNA na amostra

que influencia diretamente na reação de PCR. A obtenção de DNA é o primeiro passo na

utilização de técnicas moleculares. Ele é parte fundamental para a alta eficiência de

amplificação (OLIVEIRA et al., 2007).

Figura 3.8 – PCR de 24 colônias recém-transformadas a fim de se confirmar o sucesso da clonagem. A -

GeneRuler DNA Ladder 1kb. B - MassRuler Low Range DNA Ladder. C – controle do PCR

Após a confirmação da clonagem do gene codificador de uma possível α-amilase foi

realizado os testes de expressão da enzima como descrito em 2.2.1.8. A clonagem do gene foi

realizada utilizando dois diferentes sítios de restrição para que a sequência fosse inserida no

plasmídeo de forma direcionada, aumentando assim o sucesso na transcrição e tradução do

gene de interesse. Foi possível identificar halo de degradação ao redor da colônia inoculada

no meio de cultivo com amido como substrato e mantidos a 37ºC. Os halos evidenciados não

demonstraram diferença significativa quanto à variação das concentrações do açúcar indutor

(Figura 3.9). Nenhum dos transformantes demonstrou atividade enzimática quando cultivados

em meio com xilana como substrato. Diante destes resultados foi possível confirmar e

identificar que o gene clonado trata-se um codificador da enzima α-amilase.

62

Figura 3.9 - Halos de hidrólise ao redor das colônias puras dos transformantes revelados com a adição de uma

solução de iodo, indicando a degradação do substrato amido. As placas foram mantidas a 37ºC por

72h

Após anotação funcional conforme descrito em 2.2.1.6, 11 ORFs foram deduzidas como

sendo proteínas hipotéticas. Devido a não afiliação funcional em nenhum dos bancos de dados

utilizados no presente trabalho, estas foram descartadas das análises. Sendo assim, há a

possibilidade de uma destas sequências conter o gene codificador da enzima xilanase. Outro

fato importante que corrobora esta hipótese, é que após confirmação de que a ORF clonada

tratava-se de um gene codificador da enzima α-amilase, o clone inicial foi submetido a testes

enzimáticos (placa de Petri contendo meio de sais com xilana ou amido) para detecção da

atividade enzimática. Foi possível confirmar que o clone MgrBr135 possuía ambas as

atividades reforçando a ideia de que uma das ORFs nomeada funcionalmente como uma

proteína hipotética, poderia ser possivelmente a responsável por conter o gene responsável por

codificar uma enzima xilanase.

2.4 Conclusões do capítulo

Após triagem funcional de uma biblioteca metagenômica construída com solo de

manguezal foi possível identificar 3 clones potencialmente xilanolíticos.

63

Os clones positivos foram sequenciados via Ion Torrent e os reads gerados (50 a 200

pb) foram utilizados para montagem dos contigs. Ao todo foram gerados 34 contigs

para o clone MgrBr18, 3 contigs para o clone MgrBr61 e 2 contigs para o clone

MgrBr135.

O clone MgrBr135 foi selecionado para uma análise mais detalhada de uma possível

ORF codificadora da enzima de interesse. Foi possível identificar que o inserto

possuía o domínio catalítico para a enzima α-amilase, um domínio de módulo de

ligação ao carboidrato da família 48 (CBM 48) e que pertencia à família 13 das

glicosil hidrolases.

Após teste de expressão da sequência alvo clonada em vetor pBAD-Myc/HisB e

transformada em E. coli TOP 10 foi possível identificar que a mesma possuía não

apenas o gene codificador da enzima α-amilase, como também a atividade amilolítica.

A classificação taxonômica do contig MgrBr135, assim como a da ORF utilizada para

a subclonagem em vetor de expressão afiliaram-se ao filo Planctomycetes.

O presente trabalho representa um estudo inicial para a busca de possíveis

codificadores de enzimas com aplicação biotecnológica por meio da metagenômica de

uma área de manguezal altamente impactado com derramamento de petróleo.

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69

3 ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS

XILANOLÍTICAS DE UMA ÁREA DE MANGUEZAL

Resumo

O manguezal é considerado um bioma costeiro tropical localizado em uma zona de

transição entre o ambiente terrestre e marinho. Caracterizado pela inundação periódica das

marés, este ambiente possui características únicas e específicas. Possuem grande quantidade

de matéria orgânica acumulada, cuja decomposição pela microbiota ali presente torna os

nutrientes como nitrogênio, fósforo e carbono disponíveis para o início da cadeia trófica. Os

micro-organismos xilanolíticos são responsáveis por degradar parte do material

lignocelulósico composto principalmente pela celulose, hemicelulose e lignina. As xilanases

degradam principlamente a hemicelulose, composta pelo polissacarídeo xilana, em xilo-

oligossacarídeos, que podem ser utilizados em diversos setores industriais. Ambientes como

os manguezais podem representar uma fonte promissora para a busca de enzimas microbianas

com este potencial biotecnológico. Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo o

isolamento, a caracterização e a identificação de bactérias xilanolíticas provenientes de uma

área de manguezal, impactada com derramamento de petróleo, localizada no município de

Bertioga, São Paulo. Ao todo foram obtidas 44 estirpes potencialmente xilanolíticas, assim

caracterizadas com base em suas atividades enzimáticas. Por meio do método qualitativo cup

plate foi possível identificar que dos 44 isolados 43 demostraram halo de degradação

indicando atividade da enzima xilanase – com índices enzimáticos (IE) variando entre 0 e

10,9. A estirpe bacteriana 11 (Bacillus megaterium) foi a que se destacou das demais por ter

apresentado o maior IE (10,9). Quando submetidas ao teste quantitativo por meio do método

colorimétrico com ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), o isolado 39 (Bacillus stratosphericus)

se destacou produzindo uma atividade enzimática de 0,43 U/mL. O sequenciamento parcial

do gene 16S rRNA das estirpes permitiu a caracterização de dois gêneros: Bacillus e

Paenibacillus. De maneira geral, os isolados obtidos demonstram serem promissores

produtores de enzimas extracelulares de interesse industrial e biotecnológico, podendo estas

enzimas apresentarem características particulares devido a sua adaptação dentro das

condições únicas encontradas nos solos de manguezais.

Palavras-chave: Bactéria; Endo-1,4-β-xilanase; Potencial biotecnológico; 16S RNAr

Abstract

The mangrove is considered a tropical coastal biome located in a transition zone between

land and marine environment. Characterized by periodic flooding by the tides, this

environment has unique and specific characteristics. They have lots of accumulated organic

matter, and the decomposition of this organic matter by microbes present makes nutrients like

nitrogen, phosphorus and carbon available for the beginning of the food chain. The

xylanolytic microorganisms are responsible for the degradation of lignocellulosic material

mainly composed of cellulose, hemicellulose and lignin. Xylanases degrade hemicellulose,

xylan polysaccharide composed of xylooligosaccharides, which can be used in various

industrial sectors. Environments such as mangroves represent a promising source of microbial

enzymes with such biotechnological potential. In this context, this study aimed to isolate,

characterize and identify xylanolytic bacteria from a mangrove area, in the city of Bertioga,

São Paulo. We obtained 44 potentially xylanolytic bacteria, and after that, we performed the

enzymatic activity tests. Through the cup plate qualitative method it was identified that 43 of

70

the 44 isolates demonstrated degradation halo indicating xylanase enzyme activity - with

enzyme index (EI) ranging from 0 to 10.9. The bacterial strain 11 (Bacillus megaterium) was

the one that stood out from the others because it presented the highest EI (10.9). When the

isolates were subjected to a colorimetric quantitative test with 3,5-dinitrosalicílico (DNS), the

39 (Bacillus stratosphericus) stood out producing an enzyme activity of 0.43 U/mL. The

partial 16S rRNA gene sequencing of the strains allowed the characterization of two

genotypic groups: Bacillus and Paenibacillus. In general, isolates were obtained

demonstrating promising production of extracellular enzymes of industrial and

biotechnological interest, which can present unique characteristics due to their adaptation into

the conditions found in mangrove soils.

Keywords: Bacteria; Endo-1,4-β – xylanase; Biotechnological potential; 16S RNAr

3.1 Introdução

Os manguezais estão localizados em regiões tipicamente inundadas pelas marés tais como:

estuários, lagoas costeiras, margens de baías, barras e enseadas. Este ecossistema é

caracterizado pela mistura de águas doce e salgada, solos anaeróbios/aeróbios e uma

salinidade que varia de 4 e 30%, podendo chegar a até 90% (SCHAEFFER-NOVELLI et al.,

2000). Apresentam condições ambientais bastante peculiares, e estão constantemente expostos

a variações, principalmente devido ao regime de marés da região onde se encontram.

A microbiota que compõe este ambiente está adaptada a estas condições consideradas

inóspitas e extremas a outros organismos. A população bacteriana presente nos manguezais é

mais abundante do que a de fungos, sendo possível sugerir que sua atividade metabólica

exerça uma grande influência nos ciclos biogeoquímicos deste ambiente. Alguns gêneros

encontrados nos manguezais e suas respectivas funções são: Desulfovibrio (redutoras de

sulfato), Azospirillum (fixadoras de nitrogênio) e Bacillus (solubilizadoras de fosfato)

(KATHIRESAN; QASIM 2005). A comunidade bacteriana desenvolve um papel essencial na

ciclagem dos nutrientes, atuando de forma importante na degradação da matéria orgânica, e

ciclagem de seus componentes, como carbono, nitrogênio, enxofre e fósforo (ALONGI et al.,

1993) .

O material lignocelulósico presente nos manguezais é composto em sua maior parte pelos

polímeros celulose, hemicelulose e lignina (Figura 3.1). A hemicelulose é um polissacarídeo

heterogêneo, e por isso, se difere da celulose que possui apenas unidades de D-glicose. O

principal carboidrato que compõe a hemicelulose é a xilana. Sua estrutura em geral possui

uma cadeia linear composta por unidades de D-xilose unida por ligações glicosídicas β- 1,4.

71

Devido à complexidade molecular, a quebra total da xilana requer a ação de um complexo

multienzimático, composto por endo e exoenzimas (KALOGERIS et al., 2001).

celulose

lignina

hemicelulose

Figura 3.1 - Estrutura do material lignocelulósico. Celulose - polímero linear de alto peso molecular formado por

unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas β -1,4. Hemicelulose - segundo componente

mais abundante da lignocelulose formado por pentoses, hexoses e ácidos urônicos. Lignina -

composta por três componentes principais fenólicos: álcool cumarílico, coniferílico e sinapílico

(Adaptado por GRAMINHA et al., 2007).

A endo-1,4-β-xilanase, também conhecida como xilanase, é uma enzima responsável por

transformar a xilana em xilo-oligossacarídeos, moléculas de baixo grau de polimerização

passíveis de serem utilizadas para geração de produtos com valor agregado (POLIZELI et al.,

2005). A xilanase e seus produtos podem ser utilizados em diferentes setores industriais,

como: produção de bioetanol (VRIES; VISSER, 2001), ração animal (DAMIANO et al.,

2003), indústrias de papel (TAN et al., 2008), biobranqueamento (BIRIJLALL et al., 2011),

clareamento de sucos e cervejas (BIELY, 1985), bioenergia (CHIRANJEEVI et al., 2012) e

produção de pães (BEG et al., 2001).

A utilização de enzimas microbianas é mais vantajosa em relação às obtidas de fontes

vegetais e animais devido a sua maior disponibilidade, maior especificidade, menor custo de

produção, estabilidade estrutural e fácil manipulação genética. São de grande interesse pelo

fato de não gerarem resíduos tóxicos, preservando o meio ambiente e reduzindo os custos dos

processos industriais (NASCIMENTO et al., 2007). A demanda por novas enzimas com

características especiais como alta termoestabilidade e a tolerância a diferentes concentrações

72

de salinidade é requerida em alguns processos industriais (VENTOSA et al., 1998; HOUGH

& DANSON, 1999; JIANG, 2008). O estudo de novos isolados microbianos que produzam

enzimas com estas características são de extrema importância. Ambientes como os

manguezais podem representar uma fonte promissora e inexplorada para o rastreamento de

biocatalizadores microbianos com este potencial biotecnológico, devido suas características

ambientais.

Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo isolar, caracterizar e identificar

bactérias envolvidas na degradação da hemicelulose (xilana), a partir de amostras de solo de

manguezal altamente impactado por um derramamento de petróleo. Os objetivos específicos

visam: obtenção de isolados bacterianos com atividade xilanolítica a partir de amostra de solo

de manguezal; determinação da atividade enzimática em meio de cultivo específico com

xilana como substrato e posterior observação de halos de degradação; avaliação da atividade

enzimática pelo método de açúcares redutores; identificação dos isolados obtidos por meio do

sequenciamento parcial do gene 16S rRNA.

3.2 Desenvolvimento

3.2.1 Material e Métodos

3.2.1.1 Área de estudo e amostragem

A área utilizada neste capítulo foi descrita no referido item como 2.2.1.1.

3.2.1.2 Isolamento e purificação de bactérias xilanolíticas

Inicialmente, as amostras dos três pontos da área de coleta, em triplicatas, foram

homogeneizadas originando uma amostra composta. Para o isolamento das bactérias, 10 g do

solo do manguezal foram adicionados em 90 mL de solução salina esterilizada (NaCl, 0,85%)

em frascos Erlemeryers devidamente tampados, os quais foram agitados a 300 rpm durante 30

minutos. Procedeu-se então as diluições seriadas de fator 10 da suspensão bacteriana obtida

em solução salina (NaCl, 0,85%). Alíquotas de 0,1 mL das diluições 10-2

a 10-5

foram

inoculadas e espalhadas com o auxílio de uma alça de Drigalski em placas de Petri contendo o

meio de cultura de sais com adição de xilana como principal fonte de carbono (MX: 0,5 g.L-1

73

extrato de levedura; 0,5 g.L-1

nitrato de sódio; 1,0 g.L-1

fosfato de potássio; 0,01 g.L-1

sulfato

de ferro; 2,0 g.L-1

xilana beechwood da Sigma; 15 g.L-1

ágar; pH 7,0). As placas foram

mantidas à temperatura de 28°C por 48 horas.

10-1

10-210-3 10-4

100µL

Suspensão

Bacteriana

10-5

1 mL 1 mL 1 mL

1 mL

100µL

Diluição seriada

Inoculação

Incubação

Figura 3.2 - Ilustração da diluição seriada, metodologia utilizada para o isolamento e cultivo de bactérias

xilanolíticas presentes em amostras de solo de manguezal.

As colônias obtidas foram selecionadas aleatoriamente e novamente estriadas em placas

de Petri contendo o meio de cultura (MX) para a sua purificação. Antes dos isolados serem

armazenados foi realizado um teste de confirmação da atividade xilanolítica por meio da

identificação de halos de degradação ao redor da colônia pura, sendo estes evidenciados com

a adição de uma solução de iodo (KASANA et al., 2008). Como controle positivo do meio de

cultivo, foi utilizado o fungo Aspergillus sp., cedido pelo professor Edivaldo Ximenes

Ferreira da Universidade de Brasília. Após esta etapa, os isolados puros foram armazenados

em meio Luria Bertani líquido (LB: 10 g.L-1

triptona; 5 g.L-1

extrato de levedura; 5 g.L-1

NaCl;

pH 7.0) com glicerol 50% (1:1) a -20ºC (SAMBROOK & RUSSEL, 2001).

3.2.1.3 Determinação do potencial enzimático: método qualitativo

Para a determinação qualitativa do potencial enzimático das bactérias isoladas foi

utilizado o método cup plate (DINGLE et al., 1953). Este método, utilizado por diversos

autores, consiste em cultivar os isolados em meio específico para a produção da enzima e

74

avaliar posteriormente a formação de um halo de degradação ao redor da colônia de células

bacterianas (SILVA, 2011; PEREIRA, 2012; ALMEIDA, 2013; REYAD, 2013).

Inicialmente os isolados foram reativados em meio Lúria Bertani sólido e mantidos a

28ºC por 48 horas. Com o auxílio de um palito estéril, as bactérias foram repicadas, em

triplicatas, nas placas contendo o meio de sais com xilana beechwood da Sigma (MX). As

placas foram incubadas a 28ºC por 72 horas e, após este período, a atividade da enzima

xilanase foi confirmada por meio da presença de zonas claras indicando halos de hidrólise ao

redor das colônias. Os halos foram evidenciados com adição de uma solução de iodo (2,0 g de

KI e 1,0 g de iodo em 300 mL de água destilada) e posterior lavagem das placas com NaCl

5M (KASANA et al., 2008).

A atividade xilanolítica foi expressa pelo índice enzimático (IE), determinado pela razão

entre o diâmetro médio do halo de degradação (dh) e o diâmetro médio da colônia (dc) (IE =

dh/dc) (SHARMA et al., 2002). As medidas foram mensuradas com o auxilio de uma régua

milimetrada e expressas em centímetros. Os maiores índices representaram a maior atividade

(STAMFORD et al., 1998). Um dos isolados bacterianos que não demostrou atividade

xilanolítica no ensaio piloto e a bactéria Escherichia coli foram utilizadas como controles

negativos, enquanto que o fungo Aspergillus sp. foi utilizado como controle positivo.

3.2.1.4 Determinação do potencial enzimático: método quantitativo

A determinação quantitativa do potencial enzimático dos isolados foi avaliada pela

liberação de açúcares redutores, utilizando-se o método colorimétrico ácido 3,5-

dinitrosalicílico (DNS) (MILLER et al., 1959). Açúcares redutores são aqueles que possuem

uma hidroxila no carbono anomérico livre, ou seja, sem estar comprometida em uma ligação

química. O método DNS utiliza a característica redutora destes açúcares para sua

quantificação. O princípio vem por meio da molécula ácido 3,5- dinitrosalicílico, que quando

pura apresenta uma coloração amarelada. Este ácido é facilmente reduzido pelos açúcares

tornando-se ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, e passa a apresentar uma coloração avermelhada.

Por meio desta mudança de coloração é possível construir roteiros de ensaios colorimétricos e

medir a quantidade de açúcares relacionando a quantidade de DNS reduzido (MALDONADE

et al., 2013).

Inicialmente, os isolados foram cultivados por 4 dias em frascos Erlemeryers contendo 15

mL de meio de sais com xilana (MX) líquido, sob agitação de 150 rpm a 28°C. Após este

75

período, 2 mL de cada amostra foi centrifugada a 13.000 rpm por 20 minutos a 4°C. Uma

alíquota de 50 µL do sobrenadante foi retirada para ser utilizado no teste enzimático

(SAMANTA et al., 2011). O teste foi conduzido adicionando 50 µL da enzima bruta em 450

µL de uma solução de 1% de xilana de beechwood (Sigma) em tampão fosfato de sódio (100

mM). Essa mistura foi incubada por 15 minutos a 50°C em banho-maria e a reação foi

interrompida com a adição de 1 mL do reagente ácido 3,5-dinitrosalicílico. Após esse

processo, as amostras foram mantidas por 5 minutos em banho-maria fervente, resfriadas a

temperatura ambiente, adicionado 3 mL de água destilada e analisadas por leitura de

absorbância, no aparelho microplate reader Cary® 50 (Varian. Walnut Creek. CA. USA), no

comprimento de onde de 540 nm (TEIXEIRA et al., 2012).

Todo o experimento foi conduzido em triplicata. Os resultados foram obtidos segundo a

construção de uma curva padrão com concentrações conhecidas de xilose. A atividade

enzimática foi expressa em unidade de enzima (U), definida como quantidade de enzima

necessária para hidrolisar 1 µmol de açúcar redutor por mililitro por minuto em condições

normalizadas (1U = 1 µmol/mL/min).

3.2.1.5 Extração do DNA genômico total dos isolados

O DNA genômico total bacteriano dos isolados foi extraído pelo método de quebra

celular “bead beating” que consiste em: a) lise da célula; b) extração e concentração dos

ácidos nucléicos; c) precipitação de impurezas e d) purificação.

Sendo assim, os isolados foram cultivados por 48 h a 28ºC em tubos de ensaio contendo o

meio Luria Bertani (LB) líquido. Os recipientes foram mantidos em uma mesa giratória

programada para 150 rpm. Após esse período, 2 mL de cada suspensão foram centrifugadas

(10 minutos; 12.000 rpm; 4°C) e os precipitados foram ressuspendidos com 500 µL de

tampão TE (10mM Tris-HCl; 1mM EDTA; pH8,0). Para a lise das células foram adicionados

10 µL de solução de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 10% e 0,1 g de pérolas de vidro

(“beads”). As células foram agitadas por 15 minutos no vortex, e após este período, foram

adicionados 500 µL de fenol-clorofórmio-álcool isoamílico na proporção 25:24:1. A mistura

foi centrifugada a 12.000 rpm por 5 minutos e o sobrenadante foi transferido para um novo

tubo. Foram adicionados 40 µL de acetato de sódio 5M pH 5,2 e 400 µL de isopropanol

gelado. A solução foi centrifugada por 5 minutos a 12.000 rpm e o sobrenadante foi

descartado. O material precipitado foi lavado com 500 µL de etanol 70% gelado, centrifugado

76

por 2 minutos a 12.000 rpm e seco a temperatura ambiente. Após este procedimento, o

material foi ressuspenso em 50 µL de água esterilizada e armazenado a -20ºC.

A quantidade e qualidade de DNA de cada amostra foram verificadas em eletroforese em

gel de agarose a 1,0 % em tampão TAE 1X (400 mM Tris; 20 mM ácido acético glacial; 1

mM EDTA). Foi utilizado como padrão de peso molecular o MassRuler Low Range DNA

Ladder (Invitrogen). Após quantificação do DNA foi feita uma diluição do material para a

concentração final de 50 ng.μL-1

, que foi utilizada posteriormente nas reações de PCR.

3.2.1.6 Amplificação por PCR do gene 16S rRNA

O gene 16S rRNA foi parcialmente amplificado por meio da técnica de PCR (Reação em

Cadeia da Polimerase). Para isto, utilizaram-se os primers pR1387 (5’ CGG TGT GTA CAA

GGC CCG GGA ACG 3’) (HEYER et al., 1997) e pF027 (5’ GAG AGT TTG ATC CTG

GCT CAG 3’) (LANE et al., 1985). A reação de amplificação com um volume final de 50 µL

consistiu na seguinte mistura: 1 µL de DNA (~50ng), 7,5 µL MgCl2 (25mM), 4 µL de dNTP’s

(2,5mM), 0,1 µL dos primers pR1387 e pF027 (100mM), 5 µl Taq Buffer (10X), 0,5 µl de

Taq DNA polimerase (5 U.µL-1

) e 31,8 µL de água milli-Q autoclavada. A amplificação foi

realizada em um termociclador Gene Pro Thermal Cycler utilizando a seguinte programação:

desnaturação inicial a 94ºC por 4 minutos, 35 ciclos de desnaturação (94ºC por 30 segundos),

anelamento (63ºC por 1 minuto), extensão (72ºC por 1 minuto) e uma extensão final a 72ºC

por 10 minutos (ODEE et al., 2002).

Após a amplificação do gene 16S rRNA, 2 µL do produto de PCR foi avaliado em gel de

agarose a 1% em tampão TAE 1X (400 mM Tris, 20 mM ácido acético glacial, 1 mM EDTA).

Foi utilizado o marcador GeneRuler DNA Ladder 1kb (Invitrogen), como padrão de tamanho

das bandas formadas e MassRuler Low Range DNA Ladder (Invitrogen) para averiguar a

concentração do DNA.

3.2.1.7 Purificação dos produtos de PCR para sequenciamento

A purificação dos produtos de PCR (16S rRNA) para posterior sequenciamento foi

realizada segundo Sambrook e Russell (2001) com algumas modificações. Para isso, os

produtos de PCR foram transferidos para eppendorfs autoclavados com capacidade de 1,5

mL. Adicionou-se 10% do volume total de acetato de sódio 3M pH 5,2 e 80% de isopropanol

77

gelado. As amostras foram incubadas em freezer -20ºC por uma hora e após este período

foram centrifugadas a 12.000 rpm por 5 minutos à temperatura ambiente. Foram adicionados

200 L de etanol 70% gelado em cada eppendorf e estes foram novamente centrifugados a

mesma rotação e temperatura. O sobrenadante foi descartado, as amostras foram secas à

temperatura ambiente, ressuspensas em 30 µL de água ultrapura esterilizada e armazenadas a

-20ºC.

Após a purificação, 2 µL do produto de PCR foi avaliado por eletroforese em gel de

agarose a 1 % em tampão TAE 1X (400 mM Tris, 20 mM ácido acético glacial, 1 mM

EDTA). Utilizou-se GeneRuler DNA Ladder 1kb (Invitrogen) como padrão de tamanho das

bandas formadas e MassRuler Low Range DNA Ladder (Invitrogen) para averiguar a

concentração do DNA.

3.2.1.8 Reação de sequenciamento

Para a realização do sequenciamento a reação de amplificação com um volume final de

10 µL consistiu na seguinte mistura: 1,5 µL de tampão “Save Money” (200 mM Tris-HCl pH

9,0; 5mM MgCl2.6H20), 1 µL do primer pF027 (5’ GAG AGT TTG ATC CTG GCT CAG

3’), 1 µL de DNA (~80ng), 1 µL de “Big Dye” e 5,5 µL de água milli-Q autoclavada. A

amplificação foi realizada em um termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Life

Technologies) utilizando os seguintes ciclos: desnaturação inicial a 95ºC por 1 minuto, 35

ciclos de desnaturação (96ºC por 15 segundos), anelamento (50ºC por 15 segundos) e

extensão (60ºC por 4 minutos). Após o término da reação de sequenciamento, o produto de

PCR foi purificado e precipitado com acetato de sódio e etanol e posteriormente submetido ao

sequenciador automático ABI PRISM 3100 Genetic Analyser (Life Technologies), seguindo

instruções do fabricante.

3.2.1.9 Análise das sequências

Inicialmente as sequências geradas com extensão AB1 foram importadas para o programa

Codoncode Aligner v. 2.0.4 (CodonCode Corporation, Dedham, Massachusetts, USA). Por

meio da ferramenta “clip ends” as sequências foram trimadas e aquelas com baixa qualidade

foram descartadas. Foram considerados somente os nucleotídeos com valor de qualidade de

sequenciamento maior ou igual a 500, equivalente à qualidade Phred maior que 20. As

sequências válidas foram utilizadas para uma busca de similaridade por meio do programa

78

BLASTn (Basic Local Alignment Search tool) disponível no site NCBI (National Center for

Biotechnology Information – www.ncbi.nlm.nih.gov).

As sequências com maior similaridade com as obtidas no presente estudo foram

utilizadas para a inferência com base em árvore filogenética construída com o auxílio do

programa MEGA6 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 6.0). A árvore foi

construída primeiramente pelo alinhamento das sequências realizado pelo Muscle,

posteriormente convertido numa matriz de distância determinada pelo parâmetro Kimura-2

(KIMURA, 1980) e agrupada pelo método de Neighbor-Joining (SAITOU & NEI, 1987). A

consistência da estrutura da árvore foi determinada pela análise de bootstrap, feita com base

em 1000 sub-amostragens na matriz de distância. Sequências identificadas como

Streptomyces, distantemente relacionadas às encontradas no presente trabalho foram

utilizadas como out-group nesta análise filogenética.

3.3 Resultados e Discussão

3.3.1 Isolamento das bactérias xilanolíticas

O manguezal possui características físico-químicas consideradas inóspitas a outras

espécies de vida (BOOTH et al., 2002). É considerado um ambiente complexo não apenas por

sua diversidade biológica, mas principalmente devido à sua diversidade funcional. Estes

aspectos conferem a este ecossistema uma alta capacidade de resiliência e tendência a resistir

mais eficientemente às perturbações tanto naturais quanto causadas pelo homem. Neste

contexto, a escolha da área para o isolamento das bactérias xilanolíticas, do ponto de vista

biotecnológico, pode representar uma fonte promissora para a bioprospecção de micro-

organismos de interesse comercial. O presente trabalho isolou bactérias de solo de manguezal

impactado com derramamento de petróleo localizado no município de Bertioga, São Paulo.

Com isso, foi possível determinar grupos bacterianos cultiváveis, bem como avaliar o seu

potencial para a produção de enzimas.

Para realizar a busca de bactérias xilanolíticas utilizou-se um meio de cultivo específico

para identificação de micro-organismos com esta característica com xilana de beechwood

como principal fonte de carbono. Ao todo foram obtidas 44 estirpes bacterianas isoladas de

uma amostra composta de solo de manguezal.

79

Antes de serem armazenadas em glicerol 50%, as bactérias foram inoculadas no mesmo

meio de cultivo em que foram isoladas, com a finalidade de se confirmar a atividade da

enzima xilanase. Após 3 dias de cultivo a 28ºC as placas foram coradas com solução de iodo

para se revelar a formação de halos de degradação. Os resultados podem ser visualizados em

imagens como a apresentada na Figura 3.3. Dos 44 isolados apenas o isolado 39 não

apresentou formação do halo.

Figura 3.3 - Halos de hidrólise ao redor das colônias puras, revelados com a adição de uma solução de iodo,

indicando a degradação do substrato de interesse, xilana

3.3.2 Determinação do potencial enzimático: método qualitativo e quantitativo

Consultando a literatura, tem-se que algumas metodologias foram descritas de forma a

facilitar a seleção e o isolamento de micro-organismos que produzem enzimas extracelulares.

As principais delas são baseadas no cultivo da estirpe em meio sólido com o substrato de

interesse a ser degradado. Por meio da relação do diâmetro médio do halo de degradação do

substrato pelo diâmetro médio da colônia, é possível obter o índice enzimático (IE) de cada

micro-organismo; os maiores índices podem representaram a maior atividade (MACIEL,

2006; STAMFORD et al., 1998; SILVA, 2011; PEREIRA, 2012; ALMEIDA, 2013).

Sendo assim, este foi o método escolhido para avaliar qualitativamente a atividade

xilanolítica dos isolados obtidos no presente trabalho. Ao cultivá-los em um meio contendo

xilana de beechwood como principal fonte de carbono foi possível observar zonas mais claras

ao redor das colônias quando coradas com solução de iodo, correspondentes ao halo indicador

da degradação do substrato (Figura 3.4).

80

A) B)

C) D)

Figura 3.4 - A e B - Halos de atividade xilanolítica obtidos a partir do cultivo em meio de sais com xilana de

beechwood como principal fonte de carbono dos isolados 18 (Bacillus indicus) e 38 (Paenibacillus

polymyxa), respectivamente. C e D - representam os halos negativos da Escherichia coli e isolado

39 (Bacillus stratosphericus), respectivamente. Todas as placas foram incubadas por 72 horas, a

28ºC. Os testes foram realizados em triplicata

Das 44 estirpes bacterianas testadas, 43 demostraram atividade xilanolítica quando

submetidas ao teste cup plate. Apenas o isolado 39 (Bacillus stratosphericus) não demonstrou

resultado positivo. O isolado 29 (Bacillaceae bacterium) apresentou halo de degradação,

porém, devido ao seu padrão de crescimento desuniforme, não foi possível determinar o seu

índice enzimático. Os IE das estirpes variaram de 0 a 10,9. O isolado que apresentou o menor

valor foi o 33 (Bacillus sp. FJAT-21913) com 1,2; o isolado que apresentou maior valor foi o

11 (Bacillus megaterium) com um IE de 10,9 (Figura 3.5).

81

ÍNDICE ENZIMÁTICO (IE)

0 2 4 6 8 10 12

ISO

LA

DO

S

11233830351826

710

631

3121516

8273248375042

936

2514919

4254345284034461422132144332939

E. coli

Figura 3.5 - Índice enzimático (IE) dos 44 isolados bacterianos provenientes de uma amostra composta de solo

de manguezal, área de derramamento de petróleo, localizada na cidade de Bertioga, São Paulo. O IE

foi calculado pela a razão do diâmetro médio do halo de degradação e o diâmetro médio da colônia

(cm). As barras de erros indicam o desvio padrão acima da média (n = 3)

Como observado na Figura 3.6 foi encontrada uma variação nos valores dos índices

enzimáticos produzidos pelos isolados do presente estudo. Um dos fatores que pode afetar a

eficiência na produção de xilanases por bactérias, esta relacionada à escolha do substrato e a

82

otimização da composição do meio de cultivo. Além de ser utilizado pelos micro-organismos

como fonte de carbono e energia, o substrato também age como um indutor ou repressor para

a produção da enzima. Geralmente o mecanismo responsável por regular a indução das

xilanases é complexo e a resposta em termos de produção enzimática varia para cada micro-

organismo. Um indutor que leva a máxima atividade em uma estirpe pode ser o inibidor da

atividade em outra (KULKARNI et al., 1999). Assim sendo, o presente estudo buscou via

utilização de xilana como principal fonte de carbono, estimular a produção dos isolados

quando cultivados. No entanto, outras variáveis preponderantes a essa podem ocorrer durante

a ativação da produção deste tipo de enzima pelos isolados avaliados.

Segundo Lealem e Gashe (1994), micro-organismos que possuem um IE maior ou igual a

2,0 são considerados bons produtores de enzimas extracelulares em meio sólido. Este

parâmetro é utilizado por diversos autores como medida comparativa da atividade enzimática

(OLIVEIRA, 2007; FERNANDES, 2009; ASAD et al., 2011; PEREIRA, 2012; CARMO et

al., 2014). Com base nesta premissa, temos que a maioria dos isolados apresentou altos

índices de produção da enzima alvo. No entanto, se traçarmos um novo limite de seleção, com

IE maior do que 5,0 temos que 73% dos isolados ainda apresentaram valores maiores a este.

Quando comparados com os valores encontrados na literatura, os resultados de atividade

xilanolítica das estirpes também podem ser considerados promissores. Eida et al. 2012,

trabalharam com bactérias provenientes de duas compostagens (café e serragem) e obtiveram

índices enzimáticos que variaram de 0,56 a 2,84. Koroiva et al. (2013) trabalharam com o

isolamento de bactérias presentes no trato digestivo do invertebrado Stenochironomus,

responsáveis por degradar a material lignocelulósico utilizado como fonte de carbono por

estes organismos. Os autores avaliaram a atividade xilanolítica das bactérias por meio do IE e

obtiveram uma variação dos valores de 0 a 3,9. Singh et al. (2014) isolaram bactérias dos

gêneros Bacilllus, Stenotrophomonas e Pseudomonas do trato intestinal de coalas com índices

enzimáticos que variaram de 0 a 4,5. Os autores consideraram estes isolados como

promissores na utilização em processos industriais. Tendo em vista que a maioria dos isolados

obtidos no presente trabalho supera os valores encontrados na literatura, estes podem

possivelmente serem considerados bons produtores de enzimas extracelulares com possível

aplicação biotecnológica.

Além do método qualitativo (cup plate), utilizou-se o método colorimétrico ácido 3,5-

dinitrosalicílico (DNS), para determinação quantitativa da atividade xilanolítica dos isolados.

Foram utilizadas todas as estirpes bacterianas independente dos resultados prévios obtidos.

83

Dos 44 isolados, dois deles (7 e 46) não multiplicaram-se quando cultivados em MX líquido,

o que fez com que este ensaio tenha gerado resultados apenas para 42 estirpes. A atividade da

enzima xilanolítica variou de 0,02 a 0,43 U/mL (Figura 3.6).

Atividade enzimática (U/ml)

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

ISO

LA

DO

S

3942383727491333351248164418322928403134193630

821254345

92310221115145126

E coli50

2643

Figura 3.6 - Atividade xilanolítica quantitativa de 42 isolados bacterianos provenientes de uma amostra

composta de solo de manguezal, área de derramamento de petróleo, localizada na cidade de

Bertioga, São Paulo. A atividade foi medida pela proporção de açúcares redutores liberados pela

hidrólise enzimática da xilana. As barras de erros indicam o desvio padrão acima da média (n = 3)

84

A partir destes resultados podemos observar que os valores do índice enzimático (IE)

nem sempre possuem correlação e capacidade de indicar os melhores micro-organismos com

potencial para a produção de enzimas, quando estimada pelo método DNS. O isolado 39

(Bacillus stratosphericus) foi inicialmente considerado um micro-organismo não xilanolítico,

pois não apresentou halo de degradação quando cultivado em MX. Porém, demostrou a maior

atividade quando submetido ao método colorimétrico DNS. Bortolazzo (2011) encontrou

resultados semelhantes ao observar que um de seus isolados fúngicos não possuía uma relação

de alto índice enzimático com uma alta produção de celulase. Este não apresentou halo de

hidrólise no teste qualitativo, porém, por meio do método quantitativo (DNS) foi descrito

como o de maior produção de enzima. Segundo Almeida (2013), alguns de seus isolados

fúngicos xilanolíticos e celulolíticos apresentaram altos índices enzimáticos, porém, menores

quantidades de enzima produzidas.

As bactérias do presente trabalho foram isoladas de um ambiente de manguezal com

características flutuantes na disponibilidade de oxigênio. Este fato pode ter influenciado na

variação das quantidades de açúcares reduzidos. Provavelmente esta bactéria que apresentou

um valor significativo para o método DNS e não para o método qualitativo, se desenvolva

melhor em condições com alta aeração (como o cultivo em meio líquido), favorecendo assim

a produção de enzimas extracelulares que consigam degradar o substrato de interesse. Além

destes fatores, variações podem ocorrer devido a produção pontual da enzima em etapas

específicas do desenvolvimento da estirpe, o que não limita sua detecção no ensaio

qualitativo, mas pode interferir de forma determinante no ensaio quantitativo.

O isolado 39 obteve o maior valor enzimático determinado pelo método DNS, com média

de 0,43 U/mL. Khianngam et al. (2012) isolaram bactérias xilanolíticas identificadas como

Paenibacillus que apresentaram uma atividade entre 1,07 a 3,20 U/mL. Seo et al. (2013)

isolaram bactérias pertencentes a espécie Bacillus licheniformis que apresentaram atividade

xilanolítica de 0,44 U/mL quando cultivados em meio com xilana. Além destes, outros

autores reportaram atividade enzimática de bactérias do gênero Bacillus e Streptomyces

alguns valores maiores àqueles encontrados no presente trabalho (SHOHAM et al., 1992;

SUBRAMANIYAN et al., 2000; DHILLON et al., 2000; BEG et al., 2000; TECHAPUN et

al., 2001).

Segundo Kulkarni et al. (1999), o rendimento na produção de xilanases em experimentos

deste tipo é governado por alguns fatores-chave, além dos parâmetros padrões utilizados.

Alguns deles possuem um efeito combinado sobre o nível da expressão gênica que dá origem

85

a enzima, como por exemplo, acessibilidade ao substrato, quantidade de liberação e natureza

química dos xilo-oligossacarídeos e quantidade de xilose liberada. As xilanases se ligam

fortemente ao substrato a ser degradado. Uma parte da enzima produzida durante o seu

desenvolvimento é muitas vezes perdida e/ou inativada durante este processo. Geralmente

estas enzimas são expressas de forma ótima no final da fase exponencial, o que faz com que

seja importante se atentar ao momento em que a coleta do extrato bruto é realizada para

determinação da produção enzimática.

Outros parâmetros que podem afetar a atividade e a produtividade de xilanase incluem o

pH, temperatura e agitação (KULKARNI et al., 1999). Amore et al. (2015) isolaram bactérias

xilanolíticas do gênero Bacillus, Lysinibacillus e Streptomyces a partir de solos húmicos com

uma atividade enzimática bruta que variou de 0,4 a 0,6 U/mL. Porém, quando alteradas as

condições de cultivo destes organismos, dois deles atingiram uma atividade máxima de 9,4 e

10,5 U/mL. Isto deixa claro que diferentes formas de cultivo devem ser avaliadas de maneira

atingir rendimentos elevados da produção enzimática (PORSUK et al., 2013; GUPTA et al.,

2013; ABO-STATE et al., 2013). Sendo assim, considerando a versatilidade nutricional que

cada estirpe pode apresentar, é possível que existam variações na produção desta enzima em

cada uma das estirpes obtidas, sendo estes fatores passíveis de serem melhores descritos em

etapas futuras.

3.3.3 Caracterização molecular dos isolados

As comunidades de bactérias presentes em manguezais têm grande importância na

manutenção deste ecossistema. Participam ativamente dos ciclos biogeoquímicos e compõe a

base metabólica responsável pelo desenvolvimento das plantas e animais. A diversidade desta

microbiota, e os grupos existentes neste ambiente, já foram estudados por diversos autores

(LIANG et al., 2007; GOMES et al., 2008; ZHOU et al., 2008; DIAS et al., 2010;

ANDREOTE et al., 2012). Porém, poucos são os estudos envolvendo a diversidade de

bactérias xilanolíticas em ecossistemas de manguezais, sendo o isolamento de organismos

provenientes deste ambiente de grande potencial para bioprospecção de enzimas de interesse

comercial.

Neste contexto, o presente trabalho teve por objetivo realizar a classificação filogenética

das 44 estirpes bacterianas provenientes de uma amostra composta de solo de manguezal

altamente contaminado com derramamento de petróleo. Esta análise permitiu a classificação

taxonômica dos isolados com atividade xilanolítica presente neste ambiente. As sequências

86

obtidas no presente trabalho foram inicialmente comparadas com as sequências do banco de

dados GenBank por meio do programa BLASTn (Tabela 3.1 e Figura 3.7).

Tabela 3.1 - Caracterização por similaridade obtida a partir da comparação das sequencias parciais do gene 16S

rRNA de bactérias xilanolíticas isoladas do solo de manguezal com as sequências contidas no banco

de dados GenBank. (fragmentos de aproximadamente 400 -1100 pares de bases)

Isolados NCBI* Nº de acesso E-value** IS (%)***

2 Bacillus thuringiensis KP419970.1 0 99% 3 Bacillus infantis KJ186076.1 0 99%

4 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 99%

6 Bacillus megaterium LC011867.1 0 99%

7 Bacillus vietnamensis AB697709.1 0 99%

8 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 99%

9 Bacillus pseudomycoides KJ767330.1 0 99%

10 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 99%

11 Bacillus megaterium LC011867.1 0 99%

12 Bacillus methylotrophicus KF217257.1 0 99%

13 Bacillus methylotrophicus KC573497.1 0 98%

14 Bacillus subtilis JQ308555.1 0 99%

15 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 95%

16 Bacillus aquimaris JQ799058.1 0 99%

18 Bacillus indicus KF791344.1 0 99%

19 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 99%

21 Bacillus vietnamensis AB999916.1 0 99%

22 Bacillus pseudomycoides KJ767330.1 0 99%

23 Bacillus aquimaris JQ799058.1 0 98%

25 Bacillus thuringiensis KP419970.1 0 99%

26 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 98%

27 Paenibacillus polymyxa HE981790.1 0 99%

28 Bacillus megaterium LC011867.1 0 99%

29 Bacillus thuringiensis KP419970.1 0 100%

30 Bacillus vietnamensis AB999916.1 0 99%

31 Bacillus thuringiensis KP419970.1 0 99%

32 Bacillus megaterium KP419970.1 0 99%

33 Bacillus sp. FJAT-21913 KM978194.1 0 99%

34 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 99%

35 Bacillus aryabhattai KT003255.1 0 99%

36 Bacillus megaterium LC011867.1 0 99%

37 Paenibacillus polymyxa HE981790.1 0 99%

38 Paenibacillus polymyxa KC189948.1 0 98%

39 Bacillus stratosphericus KT072094.1 0 99%

40 Bacillus pseudomycoides KJ767330.1 0 98%

42 Paenibacillus polymyxa HE981790.1 0 99%

43 Bacillus aquimaris JQ799058.1 0 98%

44 Bacillus sp. FJAT-21913 KM978194.1 0 99%

45 Bacillus vietnamensis AB999916.1 3.00E-180 89%

46 Bacillus pseudomycoides KJ767330.1 0 99%

48 Bacillus methylotrophicus KP019256.1 0 100%

49 Paenibacillus polymyxa HE981790.1 0 99%

50 Bacillus vietnamensis AB697709.1 0 98%

51 Bacillus sp. P5.oil.1 KJ756174.1 0 99% *National Center for Biotechnology Information; ** O valor do e-value sugere que quanto mais próximo de zero este estiver,

mais confiável é o alinhamento das sequências; ***Índice de similaridade: 0-100%

Os índices de similaridade variaram de 99% a 100% com fragmentos de

aproximadamente 400 – 1100 pares de bases. O agrupamento das sequências com as

87

pertencentes ao banco de dados GenBank revelou a afiliação dos todos os isolados bacterianos

ao filo Firmicutes. Segundo Andreote et al. (2012), no estudo da microbiota dos manguezais

por meio de análises metagenômicas, verificou que o filo Firmicutes foi o segundo mais

abundante no mesmo manguezal utilizado no presente trabalho para o isolamento das

bactérias xilanolíticas. Este grupo filogenético possui um papel essencial no processo de

degradação de matéria orgânica e de xenobióticos, uma vez que possui uma grande

capacidade de promover reações catabólicas de diversos compostos orgânicos recalcitrantes

(WINDERL et al., 2008). Devido a este fato, ao utilizarmos um meio de cultivo de sais

contendo a xilana como principal fonte de carbono para o isolamento das bactérias, podemos

ter favorecido o crescimento deste grupo bacteriano.

O gênero Bacillus, pertencente à família Bacillaceae, abrigou 89% dos isolados. Este é

composto por mais de 200 espécies que possuem a forma de bacilo, geralmente apresentam

endósporos, são aeróbios ou facultativos e, frequentemente, catalase positivos. São bactérias

ubíquas em vários ecossistemas (MOREIRA & SIQUEIRA, 2006). De acordo com a

morfologia do esporo, o gênero Bacillus é tradicionalmente dividido em três grupos. O

primeiro é composto por bactérias Gram positivas, com endósporo esférico ou ovóide na

posição central ou terminal e que não deforma o esporângio. O segundo é constituído por

espécies com Gram variável, endósporo ovóide, central ou terminal que deforma o

esporângio. O terceiro e último, é formado por espécies que apresentam endósporo esférico,

terminal ou subterminal que deforma o esporângio (FRITZE, 2004).

No início da década de 90 a comunidade científica revisou as relações filogenéticas

deste grupo de micro-organismos devido a sua heterogeneidade tanto genética quanto

fisiológica (ASH & COLLINS, 1993). Durante esses anos, algumas espécies que eram

consideradas do gênero Bacillus foram reclassificadas em mais de dez diferentes gêneros,

como por exemplo, Geobacillus e Paenibacillus. Mesmo com esta alteração, ainda há

divergências quanto à classificação de algumas espécies (HELGASON et al., 2000).

Do ponto de vista ecológico, o gênero Bacillus possui um papel fundamental para a

manutenção dos ciclos biogeoquímicos. A maior parte das espécies que o compõe participa

ativamente dos processos de decomposição de matéria orgânica. Dentro do domínio Bacteria,

o gênero Bacillus é o grupo de maior importância biotecnológica e aplicação industrial

(SCHALLMEY et al., 2004). Em particular, a utilização de algumas espécies na indústria de

conversão de biomassa tem chamado a atenção. Inúmeras enzimas hidrolíticas pertencentes a

este gênero vêm sendo caracterizadas. Entre elas destacam-se as xilanases (NAGAR et al.,

2010), celulases (ROMERO-GARCIA et al., 2009) e amilases (ASOODEH et al., 2010), com

88

algumas já sendo utilizadas em larga escala nos processos de bioconversão (MAKI et al.,

2009).

Isolado 51 Isolado 19 Isolado 08 Isolado 21 Isolado 34 Isolado 04 Isolado 45 Isolado 15 Isolado 16 Isolado 30 Isolado 43 AB999916.1 Bacillus vietnamensis JQ799058.1 Bacillus aquimaris KJ756174.1 Bacillus sp.P5.oil.1 Isolado 26 Isolado 50 Isolado 23 Isolado 10 Isolado 07 KJ767330.1 Bacillus pseudomycoides KP419970.1 Bacillus thuringiensis Isolado 29 Isolado 02 Isolado 40 Isolado 31 Isolado 25 Isolado 22 Isolado 09 Isolado 46

KT003255.1 Bacillus aryabhattai LC011867.1 Bacillus megaterium Isolado 11 Isolado 32 Isolado 06 Isolado 36 Isolado 35 Isolado 28

KJ186076.1 Bacillus infantis Isolado 03

KF791344.1 Bacillus indicus Isolado 18 KT072094.1 Bacillus stratosphericus JQ308555.1 Bacillus subtilis KF217257.1 Bacillus methylotrophicus Isolado 12 Isolado 14 Isolado 13 Isolado 48 Isolado 39

Isolado 44 Isolado 33 KM978194.1 Bacillus sp. FJAT-21913

HE981790.1 Paenibacillus polymyxa Isolado 42 Isolado 38 Isolado 37 Isolado 27 Isolado 49

AB105068.1 Streptomyces aureofaciens Y15501.1 Streptomyces griseus

KJ706218.1 Streptomyces coelicolor54

95

85

74

9944

80

60

18

31

47

40

63 40

49

40

0.05 Figura 3.7 - Reconstrução filogenética demonstrando as relações entre os isolados analisados com as sequências

dos organismos mais similares presentes no banco de dados. A filogenia foi determinada pelo

método Neighbor joining e a relação entre as sequências foi inferida usando método muscle.

Sequências de Streptomyces foram usadas como grupo externo para enraizamento da árvore. Os

valores nos ramos indicam a frequência de agrupamento dos mesmos, determinada pelo teste de

bootstrap, com replicação de 1000 vezes

89

No gênero Bacillus, são descritos diversas xilanases extracelulares com ação livre e

com multidomínios catalíticos. Segundo Schallmey et al. (2004), cepas do gênero Bacillus

continuam a ser micro-organismos dominantes para a produção de enzimas com potencial

biotecnológico. Estes organismos são uma importante fonte de enzimas xilanolíticas.

O gênero Paenibacillus, pertencente a família Paenibacellacea, abrigou os outros 11%

dos isolados bacterianos isolados no presente trabalho. Este gênero foi nomeado por Ash et al.

(1993) e é composto por mais de 100 espécies de anaeróbios facultativos, formam

endoesporos e possuem baixo porcentual de GC em sua composição genômica. As espécies

pertencentes a este gênero habitam diferentes nichos como: solos, rizosfera (trigo, milho,

sorgo, cana de açúcar e cevada) e sedimentos marinhos (HOLL & CHANWAY 1992; VON

DER WEID et al., 2000). São capazes de hidrolisar materiais lignocelulósicos, e são

frequentemente isolados e identificados a partir de amostras de solo e de planta (RIVAS et al.,

2005). Vários membros do gênero Paenibacillus secretam enzimas extracelulares como

xilanase e celulase e seu sistema enzimático tem sido cada vez mais estudado pela

comunidade científica (GALLARDO et al., 2003; PASON et al., 2006; LEE et al., 2007).

De maneira geral, este estudo permitiu descrever os grupos microbianos cultivados,

que apresentam alta capacidade xilanolítica, em amostras de solo de um manguezal

contaminado com petróleo. Isto elenca os grupos de Bacillus e Paenibacillus como potenciais

degradadores de material lignocelulósico que hospedam características enzimáticas

complementares as condições ambientais prevalentes nos solos de manguezais. Este fato,

pode possivelmente contribuir para novos estudos de atividade enzimática como alteração de

temperatura, salinidade e pH para a descrição do potencial enzimático dos isolados obtidos no

presente trabalho.

3.4 Conclusões do Capítulo

Foram isoladas 44 estirpes de bactérias potencialmente xilanolíticas a partir de uma

amostra composta de solo de manguezal altamente impactada com derramamento de

petróleo, localizada na cidade de Bertioga, São Paulo.

A maioria das bactérias selecionadas neste estudo demonstrou possuir mecanismos de

grande potencial biotecnológico para degradação da xilana, polissacarídeo de maior

abundância encontrado no polímero hemicelulose.

73% das bactérias testadas qualitativamente utilizando o método cup plate

demonstraram a atividade da enzima xilanase in vitro pela formação de halo de

90

degradação revelados com a adição de uma solução de iodo. Os resultados obtidos

superam em muito os encontrados na literatura.

O isolado 39 quanto submetidos ao método DNS se destacou por apresentar valor de

atividade muito maior do que os outros obtidos no presente trabalho.

O sequenciamento parcial do gene 16S rRNA dos 44 isolados permitiu a

caracterização de dois grupos genotípicos, Bacillus e Paenibacillus, ambos

relacionados na literatura como pertencentes a um grupo de micro-organismos capazes

de degradar material lignocelulósico.

Referências

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4 CONSIDERAÇÕES FINAIS

A evolução dos estudos em microbiologia por métodos “independentes” de cultivo

permitiu uma nova abordagem no estudo da diversidade e funcionalidade dos micro-

organismos ditos “não cultiváveis”. Neste trabalho, utilizando esta metodologia, por meio da

triagem funcional de uma biblioteca metagenômica foi possível a identificação de clones

positivos para a atividade xilanolítica. A análise destas sequências indicou sua afiliação a um

grupo bacteriano pouco conhecido, pertencente ao filo Planctomycetes (gênero Candidatus

Jettenia). A ORF escolhida para a subclonagem em vetor de expressão apresentou, após

análises mais detalhadas de sua sequência e atividade, atividade de -amilase, despertando

grande interesse em sua melhor compreensão. Muitas ORFs encontradas neste mesmo inserto

metagenômico foram anotadas como proteínas com funções desconhecidas, sendo assim,

podemos gerar a hipótese de que uma das sequências nomeadas como hipotética pudesse ser a

codificadora de uma xilanase. Ou ainda, que esta quando atuante juntamente com a ORF

clonada, dê ao organismo hospedeiro a capacidade de degradação da xilana.

Em complementação a esta análise o uso de metodologias dependentes de cultivo

resultou numa coleção de isolados bacterianos xilanolíticos deste mesmo ambiente. A maioria

destes isolados mostrou atividade (qualitativa ou quantitativa) sobre o substrato alvo. A

afiliação filogenética dos isolados não resultou (como esperado) na aproximação destes com o

inserto identificado por metagenômica. Neste caso, houve predominância dos gêneros

Bacillus e Paenibacillus.

Em conclusão, a combinação de análises independentes e dependentes de cultivo

possibilitou a confirmação da ocorrência de bactérias xilanolíticas e amilolíticas no

manguezal de estudo. Os resultados foram complementares, e deram origem a uma série de

possibilidades, a serem melhores estudadas posteriormente, na busca de uma compreensão

mais ampla sobre a funcionalidade destes micro-organismos no ecossistema de manguezal,

além identificar a capacidade destes isolados em produzir enzimas biotecnologicamente

importantes.