AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL …repository.unair.ac.id/25755/1/LABIQAH,...

AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL ISOLAT 7 BAKTERI XILANOLITIK SISTEM ABDOMINAL RAYAP TANAH

SKRIPSI

AMALIAH LABIQAH

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI

UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA

2012

ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga

Skripsi Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah.

Amaliah Labiqah

iii

LEMBAR PENGESAHAN SKRIPSI

Judul : Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7

Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah

Penyusun : Amaliah Labiqah

NIM : 080810521

Pembimbing I : Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si

Pembimbing II : Dr. Sri Sumarsih, M.Si

Tanggal seminar : 16 Juli 2012

Disetujui oleh :

Pembimbing I,

Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si NIP. 19630615 198701 2 001

Pembimbing II,

Dr. Sri Sumarsih, M.Si NIP. 19600110 198810 2 001

Mengetahui,

Ketua Departemen Kimia

Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga

Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP 19671115 199102 2 001



Amaliah Labiqah

iv

PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI

Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam

lingkungan Universitas Airlangga. Diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi

kepustakaan, tetapi pengutipan seijin penulis dan harus menyebutkan sumbernya

sesuai kebiasaan ilmiah.

Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga



Amaliah Labiqah

v

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat serta

karunia yang telah diberikan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan

judul “Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri

Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap” dengan tepat waktu.

Skripsi ini disusun dengan dukungan dan bantuan berbagai pihak. Oleh

karena itu dalam kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I

dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si selaku dosen pembimbing II yang telah dengan

sabar meluangkan waktu dan pikiran untuk memberikan bimbingan

kepada penulis hingga skripsi ini dapat terselesaikan.

2. Drs. Ali Rohman selaku penguji proposal, Dr. Purkan, M.Si selaku dosen

penguji skripsi dan Drs. Handoko Darmokoesoemo, DEA selaku dosen

penguji skripsi sekaligus dosen wali yang telah memberikan masukan dan

pengarahan kepada penulis.

3. A. A. Istri Ratnadewi S.Si, M.Si yang telah memberikan projek penelitian.

4. Seluruh staf pengajar program studi S1 Departemen Kimia Fakultas Sains

dan Teknologi yang telah memberikan bekal ilmu yang semoga

memberikan manfaat di kemudian hari.

5. Kedua orang penulis yang selalu memberikan kasih sayang, semangat dan

do’a sehingga penulis mampu sampai pada tahap ini.



Amaliah Labiqah

vi

6. Kelompok peneliti Laboratorium Proteomik yang telah memberikan ilmu

dan bimbingan di Laboratorium.

7. Teman-teman kelompok penelitian Biokimia dan teman-teman S1, S2 dan

S3 Kimia Universitas Airlangga yang saling memberikan semangat,

dukungan dan saran dalam proses penyusunan skripsi.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh

karena itu kritik dan saran yang sifatnya membangun untuk menyempurnakan

sangat diperlukan oleh penulis. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat

bagi penulis dan pembaca.

Surabaya, 30 Juli 2012

Penulis

Amaliah Labiqah



Amaliah Labiqah

vii

Amaliah Labiqah, 2012, Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah. Skripsi ini di bawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si dan Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Departemen Kimia, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga, Surabaya.

ABSTRAK

Enzim-enzim xilanolitik berperan penting dalam mengolah limbah-limbah pertanian yang sebagian besar mengandung hemiselulosa dengan xilan sebagai komponen utamanya. Salah satu enzim xilanolitik yang mampu mendegradasi xilan adalah enzim endo-1,4-β-xilanase. Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah. Amplifikasi dilakukan dengan metode PCR menggunakan sepasang primer forward dan primer reverse yang didesain masing-masing dengan nama endoF dan endoR. Hasil elektroforesis produk PCR menunjukkan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dapat teramplifikasi dengan ukuran sekitar 0,5bp.

Kata kunci :bakteri xilanolitik, rayap tanah,endo-1,4-β-xilanase, amplifikasi, PCR



Amaliah Labiqah

viii

Amaliah Labiqah, 2012, Amplification Gene Encoding Endo-1,4-β-xylanase From Xylanolytic Bacterial Isolate 7 of Soil Termite Abdominal System. Script is under the guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si and Dr. Sri Sumarsih, M.Si, Department of Chemistry, Faculty of Science and Technology, Airlangga University, Surabaya.

ABSTRACT

Xylanolytic enzymes play an important role in the processing of agricultural wastes which contain most of the hemicelluloses with xylan as its mainc omponent. Oneof enzyme that is able to degrade xylan is endo-1 ,4-β-xylanas enzyme. In this research the amplification of the gene encoding endo-1 ,4-β-xylanase was isolated from xylanolytic bacterial isolates 7 of soil termite abdominal system. Performed by PCR amplification using the primer pair of forward and reverse primers designe drespectively by name endoF and EndoR. PCR product electrophoresis showed genes encoding endo-1,4-β-xylanase can be amplified in size about 0,5 bp.

Keywords : xilanolitic bacteria, soil termite, endo-1,4-β-xilanase, amplification, PCR



Amaliah Labiqah

ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i LEMBAR PERNYATAAN ............................................................................. ii LEMBAR PENGESAHAN ............................................................................. iii LEMBAR PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI ...................................... iv KATA PENGANTAR ...................................................................................... v ABSTRAK................................................................................................ ........ vii ABSTRACT................................................................................................ ...... viii DAFTAR ISI ..................................................................................................... ix DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xi DAFTAR LAMPIRAN............................................................................. ....... xii DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. xiii

BAB I PENDAHULUAN ................................................................................ 1

1.1 Latar Belakang Masalah .................................................................. 1 1.2 Rumusan Masalah ........................................................................... 3 1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................. 4 1.4 Manfaat Penelitian ........................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................... 5 2.1 Rayap ............................................................................................... 5 2.2 Xilan ................................................................................................ 8 2.3 Enzim-enzim xilanase ..................................................................... 9

2.3.1 Enzim Ekso-xilanase ............................................................ 9 2.3.2 Enzim Endo-1,4-β-xilanase .................................................. 9 2.3.3 Enzim β-xilosidase ............................................................... 11 2.3.4 Enzim α-L-arabinofuranosidase ........................................... 11

2.4 Polimeration Chain Reaction ........................................................... 12 2.4.1 Langkah dan Komponen PCR ....................................... ..... 12 2.4.2 Desain Primer PCR .............................................................. 14

2.5 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa ......................... 18 2.6 Sekuensing DNA .............................................................................. 19 2.7 Sequence Aligment dan Program BLAST ........................................ 20

BAB III METODE PENELITIAN ................................................................. 22 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ......................................................... 22

3.2 Sampel, Bahan dan Alat Penelitian ................................................. 22 3.2.1 Sampel Penelitian ............................................................... 22 3.2.2 Bahan Penelitian .................................................................. 22 3.2.3 Alat Penelitian ..................................................................... 23

3.3 Prosedur Penelitian ......................................................................... 23 3.3.1 Pembuatan Media ................................................................ 23

3.3.1.1 Pembuatan LB cair .................................................. 23 3.3.1.2 Pembuatan LB padat .............................................. 23



Amaliah Labiqah

x

3.3.2 Peremajaan Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Isolat 7 ...................................................................... 24

3.3.3 Isolasi DNA Kromosom ...................................................... 24 3.3.4 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa ............. 25 3.3.5 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan

Teknik PCR ......................................................................... 26 3.3.6 Purifikasi Produk PCR ....................................................... 27 3.3.7 Sekuensing Amplikon dengan Metode Sanger ................... 27

3.4 Skema Kerja .................................................................................... 28

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Isolasi DNA Kromosom Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal

Rayap Tanah Isolat 7 ....................................................................... 29 4.2 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode

PCR ................................................................................................. 31 4.3 Purifikasi atau Pemurnian DNA Produk PCR ................................. 41 4.4 Analisis Urutan Basa Nukleotida Gen Penyandi Endo-1,4-β-

xilanase Asal Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah .................................................................................... 42

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan ....................................................................................... 44 5.2 Saran ................................................................................................. 44

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................. 45



Amaliah Labiqah

xi

DAFTAR GAMBAR

Nomor Judul Gambar Halaman

2.1 Rayap .......................................................................................... 6

2.2 Sistem enzimatis dan aspek metabolisme rayap ......................... 7

2.3 Struktur xilan tumbuhan dan lokasi kerja enzim xilanolitik ....... 9

2.4 Siklus PCR .................................................................................. 14

2.5 Peta plasmid pYES2 .................................................................... 18

4.1 Hasil elektroforesis DNA kromosom ........................................... 30

4.2 Hasil alignment Bacillus subtilis............................................... 32

4.3 Analisis primer forward (endoF) ................................................. 34

4.4 Analisis primer reverse (endoR) .................................................. 35

4.5 Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus

subtillis dengan primer endoF dan primer endoR ................................. 36

4.6 Hasil elektroforesis PCR menggunakan primer endoF dan endoR. 38

4.7 Analisis primer forward dan primer reverse desain 2.................. 39

4.8 Desain primer 2...................................................................... 40

4.9 Hasil elektroforesis PCR menggunakan desain primer 2............. 41

4.10 Hasil elektroforesis amplikon PCR yang telah dimurnikan.......... 42



Amaliah Labiqah

xii

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Lampiran Halaman

1 Pembuatan Larutan TE............................................................... 49

2 Pembuatan Larutan Lisosim ......................................................... 49

3 Pembuatan Larutan STEP ............................................................ 50

4 Pembuatan Na-Asetat 3 M ........................................................... 50

5 Electropherogram hasil sekuensing ............................................. 50



Amaliah Labiqah

xiii

DAFTAR SINGKATAN

bp : base pair

ddH2O : double destilateH2O

DNA : Deoxyribo Nucleic Acid

dNTP : deoksiribonukleotida

EtBr : Etidium Bromide

GH :Glikosida Hidrolase

STEP : SDS-TrisCl-EDTA-Proteinase K

LB : Luria Bertani

TAE : Tris base-Asam Asetat-EDTA

TE : Tris Cl, EDTA

Tm : Melting Temperature

PCR : Polimeration Chain Reaction

RNA : Ribo Nucleic Acid



Amaliah Labiqah

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Negara Indonesia memiliki kekayaan alam yang berlimpah, termasuk sektor

agroindustri. Produk dari sektor agroindustri menghasilkan limbah-limbah

pertanian yang diakumulasikan kurang baik di lingkungan dan terbuang sebagai

sampah. Limbah-limbah tersebut diantaranya adalah tongkol jagung, ampas tebu,

dedak padi dan jerami yang memiliki kandungan hemiselulosa. Komponen

penyusun hemiselulosa berdasarkan monomer penyusun gulanya terbagi menjadi

xilan, arabinan, manan dan arabinogalaktan (Beg et al, 2001). Jika dihidrolisis,

hemiselulosa memiliki potensi untuk menghasilkan produk yang bermanfaat.

Xilan merupakan komponen utama penyusun hemiselulosa yang bisa dihidrolisis

menjadi xilosa dan xilooligosakarida. Hidrolisis xilan dilakukan dengan bantuan

biokatalis enzim yaitu enzim xilanase. Kelompok utama enzim xilanase yang

memutus ikatan glikosidik pada xilan terbagi menjadi endo-1,4-β-xilanase dan β-

xilosidase (Girio et al, 2010). Endo-1,4-β-xilanase berfungsi untuk memutus

ikatan β-1,4 pada rantai utama xilan menjadi xilooligosakarida. Sedangkan β-

xilosidase menghidrolisis xilooligosakarida menjadi xilosa. Pemanfaatan enzim

endo-xilanase dalam dunia industri diantaranya adalah untuk industri makanan,

farmasi, kertas, prebiotik serta bahan bakar yang dapat diperbaharui (Sriyapai et

al, 2010).

1



Amaliah Labiqah

2

Enzim endo-xilanase telah diisolasi dan dikarakterisasi dari bermacam

mikroorganisme termasuk bakteri, ragi dan jamur berfilamen (Zhang et al, 2009).

Salah satu jenis organisme di alam yang melakukan aktivitas pendegradasi endo-

xilanase adalah rayap yang mendegradasi hemiselulosa dengan enzim xilanolitik

dari tubuh rayap itu sendiri atau oleh mikroorganisme yang bersimbiosis dengan

rayap (Purwadaria et al, 2004; Faulet et al, 2006). Tarumingkeng (1971),

menyebutkan bahwa protozoa flagellata atau bakteri dalam intestin rayap

menghasilkan enzim-enzim untuk membantu rayap memanfaatkan selulosa dalam

sistem pencernaannya. Protozoa flagellata dalam intestin bagian belakang dari

berbagai jenis rayap (terutama rayap tingkat rendah seperti Mastotermitidae,

Kalotermitidae, dan Rhinotermitidae) berperan sebagai simbion untuk memecah

selulosa sehingga dapat dicerna dan diserap oleh rayap.

Ratnadewi dkk. (2007), telah melakukan penelitian tentang isolasi,

purifikasi serta karakterisasi untuk mendapatkan enzim endo-xilanase dari bakteri

xilanolitik sistem abdominal rayap tanah yang disebut sebagai isolat 7 dan telah

diidentifikasi secara mikrobiologis memiliki homologi dengan Bacillus subtillis.

Bacillus subtillis merupakan bakteri penghasil enzim endo-xilanase GH11. Pokok

riset saat ini telah mengarah pada kebutuhan akan suatu isolat dan identifikasi

organisme yang merupakan penghasil utama (hyper-producer) sebagai produsen

enzim xilanolitik baru. Berhubungan dengan hal tersebut penelitian yang banyak

dikembangkan diantaranya amplifikasi gen, kloning, karakterisasi dan ekspresi.

Amplifikasi merupakan proses pengambilan gen tertentu dari suatu DNA

kromosom yang dilakukan secara in vitro melalui teknik PCR (Brown, 2001).



Amaliah Labiqah

3

Amplifikasi gen, dapat memperkaya sekuens fragmen gen DNA secara berlimpah

dan dapat digunakan untuk memperkuat gen spesifik sebelum diklon. Cara kerja

dari amplifikasi menggunakan teknologi PCR sangat spesifik. PCR membutuhkan

suatu primer spesifik yang akan membantu DNA polimerase menambahkan basa

nukleotida pada DNA cetakan sehingga fragmen DNA dapat diperbanyak dengan

proses yang sangat cepat.

Pada penelitian ini dilakukan amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase yang berasal dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat

7. Gen endo-1,4-β-xilanase diamplifikasi dengan metode PCR menggunakan

sepasang primer yang akan didesain berdasarkan urutan basa nukleotida gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase asal Bacillus subtilis GH 11 dari Genbank. Primer

untuk mengamplifikasi gen penyandi enzim endoxilanase yaitu endoF untuk

primer forward dan endoR untuk primer reverse. Hasil amplifikasi PCR ini

kemudian dianalisis urutan basa nukleotida penyusunnya dengan melakukan

sekuensing.

1.2 RumusanMasalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan maka dapat dirumuskan

masalah penelitian : apakah gen penyandi endo-xilanase dari bakteri xilanolitik

sistem abdominal rayap tanah isolat 7 dapat diamplifikasi dengan metode PCR?



Amaliah Labiqah

4

1.3 Tujuan Penelitian

Berdasarkan latar belakang masalah dan rumusan masalah yang telah

dikemukakan, maka tujuan dari penelitian ini adalah mengamplifikasi gen

penyandi endo-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah

isolat 7 dengan metode PCR.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini yaitu memberikan informasi ilmiah mengenai proses

amplifikasi dan urutan sekuens gen penyandi endo-1,4-β-xilanase dari bakteri

xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7. Untuk selanjutnya dapat

dikembangakan penelitian yang bebabasis kloning dan ekspresi gen penyandi

enzim endo-xilanase.



Amaliah Labiqah

5

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Rayap

Rayap merupakan serangga pemakan selulosa yang berukuran sedang,

merupakan ordo Isoptera yang terdiri dari kira-kira 1900 jenis di dunia.Rayap

hidup dalam kelompok-kelompok yang terpadu.Walaupun rayap secara populer

disebut sebagai semut putih, rayap bukanlah semut.Rayap paling erat

kekerabatannya dengan kecoak. Rayap bertubuh lunak dan berwarna putih, sayap

depan dan belakang sama ukurannya dan diletakkan datar di atas abdomen saat

tidur.Rayap seringkali membersihkan satu sama lain dengan bagian mulut mereka

sebagai satu akibat dari daya tarik sekresi yang biasanya dapat diperoleh pada

tubuhnya. Makanan rayap terdiri dari kupasan kulit dan tinja individu-individu

lain, tumbuhan, kayu-kayuan dan bahan-bahan lain yang mengandung

selulosa.Semula agak mengherankan para pakar bahwa rayap mampu mencerna

selulosa karena manusia sendiri tidak mampu mencernakan selulosa, sedangkan

rayap mampu melumatkan dan menyerapnya sehingga sebagian besar hanya

tinggal lignin saja. Keadaan menjadi jelas setelah ditemukan berbagai protozoa

flagellata dalam usus bagian belakang dari berbagai jenis rayap (terutama rayap

tingkat rendah: Mastotermitidae, Kalotermitidae dan Rhinotermitidae), yang

ternyata berperan sebagai simbion untuk melumatkan selulosa sehingga rayap

mampu mencernakan dan menyerap selulosa. Bagi yang tak memiliki protozoa

seperti famili Termitidae, bukan protozoa yang berperan tetapi bakteri dan bahkan

5



Amaliah Labiqah

6

pada beberapa jenis rayap seperti Macrotermes, Odontotermes dan Microtermes

memerlukan bantuan jamur perombak kayu (Tarumingkeng, 2001). Klasifikasi

dari rayap adalah sebagai berikut

Gambar 2.1 Rayap (Wikipedia, 2011)

Domain : Eukariota

Kerajaan : Animalia

Sub Kerajaan : Metazoan

Filum : Artropoda

Kelas : Serangga

Ordo : Isoptera

Famili : Mastotermitidae

Kalotermitidae

Termopsidae

Hodotermitidae

Rhinotermitidae

Serritermitidae

Termitid



Amaliah Labiqah

7

Adapun sistem enzimatis dan aspek metabolisme dalam tubuh rayap

ditunjukkan pada Gambar2.2 berikut.

Gambar 2.2. Sistem enzimatis dan aspek metabolisme rayap (Radek, 1999)

Berdasarkan lokasi sarang utamanya, rayap digolongkan menjadi sebagai

berikut (Tarumingkeng, 2001) :

a. Rayap pohon, yaitu jenis-jenis rayap yang menyerang pohon yang masih

hidup, bersarang dalam pohon dan tak berhubungan dengan tanah, misalnya

Neotermes tectonae (Kalotermitidae) yang merupakan hama pohon jati.

b. Rayap kayu lembab, yaitu rayap yang menyerang kayu mati dan lembab,

bersarang dalam kayu, tak berhubungan dengan tanah, misalnya jenis-jenis

rayap genus Glyptotermes spp. (Kalotermitidae).

c. Rayap subterranean, yaitu rayap yang umumnya hidup di dalam tanah yang

mengandung banyak bahan kayu yang telah mati atau membusuk, serta

tunggak pohon baik yang telah mati maupun masih hidup.

Selulosa

native Kelenjar saliva (endoglukanase, sellobiase)

Perut bagian tengah

(endoglukanase,

sellobiase)

Perut bagian utama

Flagellata

anaerob

Asam amino

Hidrogenosom

CO2, H2,

asetil

Ko-A Piruvat Glukosa Selulase

Selulosa

As. Org. asetat

Mono-,di-, & oligosakarida

Bakteri metanogeni

k

Bakteri pereduksi CO2

asetogenik Asetat

Asetat

Pakan

prectodeal

Lingkungan

anaerobik

Bakteri

fakultatif &

obligat

anaerob

Bakteri fermentatif

Bakteri fiksasi N2 heterotrofik



Amaliah Labiqah

8

d. Rayap kayu kering, yaitu rayap yang hidup dalam kayu mati yang telah

mengering dengan sarang yang tidak berhubungan dengan tanah karena

habitatnya yang kering, misalnya Cryptotermes sp (Kalotermitidae).

e. Rayap tanah, yaitu rayap yang bersarang dalam tanah terutama dekat

bahanorganik yang mengandung selulosa seperti kayu, serasah, dan humus,

misalnya yang terdapat di Indonesia adalah famili Termitidae.

2.2 Xilan

Xilan merupakan komponen utama dari hemiselulosa pada dinding sel

tanaman yang terikat kovalen dan non-kovalen pada selulosa, lignin, pektin dan

polisakarida lainnya untuk membentuk dinding sel (Zhou et al.,2008). Xilan

adalah suatu polimer dengan rantai tulang punggung homopolimer unit-unit residu

β-1,4 D-xilopiranosa yang disubtitusi oleh O-asetil, α-L-arabinofuranosil, dan

kelompok glukoronosil (Cheng et al,2008). Keberadaan xilan yang bersifat dapat

diperbaharui ini sangat berlimpah, terutama pada limbah pertanian, sehingga

mempunyai potensi yang sangat besar untuk diuraikan menjadi produk akhir yang

berguna (Puspaningsih, 2005).Untuk menghasilkan produk yang berguna,

diperlukan hidrolisis xilan.Hidrolisis xilan dengan enzim membutuhkan enzim-

enzim pendegradasi xilan.Enzim-enzim pendegradasi xilan disebut enzimxilanase.

Berikut struktur xilan pada tumbuhan beserta lokasi kerja enzim-enzim xilanolitik

yang membantu hidrolisis xilan



Amaliah Labiqah

9

Gambar 2.3 Struktur xilan tumbuhan dan lokasi kerja enzim xilanase(Beg et al,

2001)

2.3 Enzim-enzim Xilanase

2.3.1 Enzim Ekso-xilanase

Eksoxilanase adalah enzim yang mengkatalisis hidrolisis ikatan β-1,4-D-

xilosa pada kerangka utama xilan untuk menghasilkan xilobiosa pada

heteroarabinoxilan (Saha, 2003). Enzim ini mampu memutus rantai polimer xilosa

pada ujung non pereduksi, sehingga menghasilkan xilan sebagai produk utama

dan sejumlah oligosakarida rantai pendek (Richana, 2002).

2.3.2 Enzim Endo-1,4-β-xilanase

Endo-1,4-β-xilanase pada awalnya telah dilaporkan sebagai pentosanase

yang selanjutnya diperkenalkan oleh International Union of Biochemistry and

Molecular Biology (IUBMB) pada tahun 1961 dengan kode EC 3.2.1.8. Endo-1,4-



Amaliah Labiqah

10

β-D-xilanase sering disebut sebagai xilanase, endoxilanase, 1,4-β-D-xilan-

xilanohidrolase, β-1,4-xilanase dan β-xilanase (Ratnadewi,2007).Endo-1,4-β-

xilanase dapat dihasilkan oleh bakteri, fungi, actinomycetes dan beberapa lainnya

dihasilkan oleh tumbuhan dan hewan. Berdasarkan homologi asam amino sekuens

dan analisis ikatan hidrofobik endo-1,4-β-xilanase digolongkan ke dalam 2 famili

glikosil hidrolase (GHF) yaitu GH 10 dan GH 11. GHF 10 dapat ditemukan pada

tanaman, fungi, dan bakterial enzim.GHF 11dapat ditemukan pada fungi dan

bacterial enzim (Zhou et al,2008). Berdasarkan massa molekul dan titik

isoelektrik (pI), famili 10 memiliki massa molekul yang tinggi (>30 kDa) dan pI

yang rendah, sedangkan famili 11 memiliki massa molekul yang rendah (<30

kDa) dan pI yang tinggi (Sriyapai et al,2011). Perbedaan sifat katalitik dari kedua

famili tersebut adalah famili 10 mampu menyerang ikatan glikosidik di sebelah

titik cabang dan mengarah ke ujung non-pereduksi dengan menggunakan dua

residu xilopiranosil non-substitusi antara cabang-cabang, sedangkan famili 11

menggunakan tiga residu xilopiranosil non-substitusi (Puspaningsih, 2005).

Enzim xilanase merupakan kompleks enzim yang memiliki kemampuan

menghidrolisis xilan atau polimer dari xilosa dan xilooligosakarida. Oleh karena

fungsinya tersebut, enzim xilanase dimasukkan dalam golongan hidrolase. Potensi

dari aplikasi xilanase saat ini menjadi perhatian utama bagi para peneliti. Pada

pembuatan kertas dan pulp, xilanase digunakan untuk proses bleaching. Xilanase

membuat pulp kertas dengan menghidrolisis xilan dan melepaskan lignin sehingga

mengurangi penggunaan Klorin sebagai agen bleaching (Mishra and

Thakur,2011).Jika xilanase dikombinasikan dengan pektinase, bisa menjadi



Amaliah Labiqah

11

alternatifideal untuk mengurangi polusi degradasi alkalin di alam untuk

memproduksi serat dengan kualitas yang baik (Huang et al., 2006).Xilanase dalam

industri makanan banyak digunakan untuk pengembang roti, penjernihan jus,

ekstraksi kopi, minyak nabati dan pati. Industrilain yang banyak memanfaatkan

penggunaan xilanase yaitu industri farmasi, pakan ternak dan pasta gigi.

2.3.3 Enzim β-xilosidase

Enzim ini diproduksi oleh bermacam-macam bakteri dan fungi, dan

mungkin juga ditemukan di kulturfluid (Coughlan et al., 1992).Berdasarkan

persamaan runtunan N-terminalnya, maka enzim β-xilosidase dapat digolongkan

ke dalam famili glikosida hidrolase 10, 3, 39, 43, 52, dan 54 (Henrisat et al.,

2003). Enzim ini berfungsi untuk menghidrolisis 1,4- β-D-xilooligosakarida dari

ujung non-pereduksi dan melepaskan xilosa. Selain itu enzim β-xilosidase juga

mempunyai aktivitas transferase, sebagai tambahan terhadap proses hidrolisis

secara langsungdan menunjukkan kekhususan untuk gula dan ikatan.

2.3.4 Enzim α-L-arabinofuranosidase

Corral et al (2006) menyebutkan ada dua tipe enzim α-L-

arabinofuranosidaseyaitu :

a. α-L-arabinofuranosidase tipe ekso (EC 3.2.1.55) yang menunjukkan aktivitas

hidrolisisnya terhadap p-nitrofenil- α-L-arabinofuranosida dan arabinan yang

bercabang.

b. α-L-arabinofuranosidase tipe endo (EC 3.2.1.99) yang hanya dapat

menghidrolisis arabinan yang linear dan tidak menunjukkan aktivitasnya

terhadap p-nitrofenil- α-L-arabinofuranosida.



Amaliah Labiqah

12

Enzim α-L-arabinofuranosidase mempunyai fungsi untuk menghidrolisis ujung

non-pereduksi antara ikatan α-L-arabinofuranosidase dengan berbagai

polisakarida yang mengandung arabinofuranosidase(Debche et al., 2002).

Polisakarida yang mengandung arabinofuranosidase yaitu seperti arabinoxilan,

arabinogalaktan, dan L-arabinan. Aktivitas enzim endo-xilanase dan β-xilosidase

dapat dihambat oleh adanya subtituen α-L-arabinofuranosidase karena struktur α-

L-arabinofuranosidase yang cukup besar yang menyebabkan halangan ruang bagi

aktivitas enzim endo-xilanase dan β-xilosidase (Debche et al., 2002; Shallom et

al., 2002). α-L-arabinofuranosidaseyang belum melalui proses

pemurniandiketahui mempunyai berat molekul yang berkisar antara 53-495 kDa

dan nilai pI beravariasi antara 3,6 sampai 9,3 serta pH optimum sekitar 2,5 sampai

6,9 (Corral et al, 2006).

2.4 Polimeration Chain Reaction (PCR)

2.4.1 Langkah dan Komponen PCR

PCR adalah suatu metode untuk melipatgandakan suatu pita DNA secara in

vitro.Metode PCR dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1986. Yuwono

(2006) mengemukakanempat komponen utama pada proses PCR yaitu : (1) DNA

cetakan yaitu fragmen DNA yang akan dilipatgandakan, (2) oligonukleotida

primer yang digunakan untuk mengawali sintesis DNA, (3) deoksiribonukleotida

(dNTP), dan (4) enzim polimerase yang melakukan katalis.

Reaksi pelipatgandaan DNA dimulai dengan denaturasi DNA cetakan

sehingga rantai DNA untai gandaakan terpisah menjadi DNA untai



Amaliah Labiqah

13

tunggal.DNAuntai ganda didenaturasi oleh pemanasan pada reaksi dengan suhu

90°-95˚C selama 5 menit (Irawan, 2008). Untuk proses pengkopian DNA, reaksi

campuran diturunkan ke dalam suhu 50-60 °C yang disebut sebagaiproses

penempelan atau annealing. Pada proses annealing, primer akan membentuk

jembatan hidrogen dengan cetakan pada daerah sekuens yang komplementer

dengan sekuens primer. Dalam proses annealing, pemilihan suhu yang tepat

adalah hal yang kritis. Setiap sistem PCR harus dilakukan secara optimal. Jika

tidak demikian bisa jadi mengangkat DNA lain ke dalam DNA spesifik atau bisa

jadi tidak memproduksi produk amplifikasi secara keseluruhan (Walker and

Rapley,2009). Amplifikasi gen pada dasarnya akan lebih efisien jika dilakukan

pada suhu yang rendah, tetapi biasanya akan terjadi mispriming yaitu penempelan

primer pada cetakan yang salah (Yuwono,2006). Pada suhu yang lebih tinggi,

spesifitas reaksi amplifikasi akan meningkat, tetapi secara keseluruhan

efisiensinya akan menurun. Setelah dilakukan annealing,suhu dinaikkan

72°C.Pada suhu ini DNA polimerase akan melakukan polimerasi rantai DNA

yang baru berdasarkan informasi pada DNA cetakan.Setelah terjadi polimerasi,

rantai DNA yang baru akan membentuk jembatan hidrogen dengan DNA cetakan.

DNA rantai ganda yang terbentuk dengan adanya ikatan rantai hidrogen antara

rantai DNA cetakan dengan rantai DNA baru hasil polimerasi selanjutnya akan

didenaturasi lagi dengan menaikkan suhu inkubasi menjadi 95°C, rantai DNA

yang baru selanjutnya akan berfungsi sebagai cetakan bagi reaksi polimerasi

selanjutnya. Reaksi diulang 30-40 siklus sehingga pada akhir siklus akan

didapatkan molekul DNA rantai ganda baru hasil polimerasi dalam jumlah yang



Amaliah Labiqah

14

jauh lebih banyak dibandingkan jumlah cetakanyang digunakan.Yuwono (2006)

menyebutkan beberapa aplikasi PCR dalam kehidupan yaitu untuk amplifikasi

DNA genom, menghitung jumlah mRNA, analisis sidik jari DNA, probe DNA.

Gambar 2.4 Siklus PCR (Brown,2010)

2.4.2 Desain Primer PCR

Kunci dari PCR terletak pada desain dua oligonukleotida primer. Fungsi

dari primer yaitu mengapit atau membatasi sekuens DNA yang akan

diamplifikasi. Tanpa adanya primer, reaksi polimerasi DNA tidak akan terjadi



Amaliah Labiqah

15

meskipun enzim dan komponen DNA lainnya sudah tersedia. Primer yang

digunakan dalam amplifikasi umumnya terdiri dari dua jenis primer, yaitu primer

forward dan primer reverse. Kualitas primer sangat mempengaruhi keberhasilan

pada saat PCR, untuk itu dalam mendesain primer ada beberapa parameter yang

digunakan.

Berikut beberapa hal yang perlu diperhatikan dalammendesain primer:

1) Panjang Primer

Panjang primer optimum antara 20-30 bp, Jika primer terlalu pendek

primer dapat melekat pada banyak tempat sepanjang DNA

cetakan.Sebaliknya, jika primer terlalu panjang, dapat menyebabkan

kegagalan replikasi.

2) Melting Temperature (Tm)

Suhu annealing dari PCR didasarkan pada Melting Temperatur (Tm) dari

primer.Suhu leleh atau melting temperature (Tm) adalah temperatur

dimana setengah dari duplex DNA akan terpisah menjadi utas tunggal.

Agar primer dapat menempel ke dalam cetakan, temperatur annealing

harus memenuhi Tm primer.Hasil terbaik biasanya diperoleh jika primer

memiliki 60-70 °C (White, 1997).Primer dengan nilai Tm tinggi, bisa jadi

primer tidak menempel ke dalam DNA target. Sedangkan jika terlalu

rendah, primer akan mengalami mis-annealke sekuens yang tidak

komplemen. Nilai Tm primer bisa dihitung dengan formula Tm = 2(A+T) +

4(G+C).Sepasang primer harus memiliki Tm yang nilainya



Amaliah Labiqah

16

berdekatan.Jika selisihnya lebih dari 5 °C maka bisa menyebabkan tidak

terjadinya amplifikasi.

3) GC Content

GC content (prosentase jumlah G dan C terhadap jumlah basa total pada

primer) harus berkisar antara 50% G/C dan 50% A/T

4) GC Clamp

Ketika mendesain primer biasanya kita memilih primer yang memiliki G

atau C pada posisi terakhir ujung 3′, karena bisa meningkatkan ikatan

spesifik pada ujung 3′ karena seperti kita tahu ikatan G atau C lebih kuat.

Namun perlu dihindari lebih dari 3 basa G atau C pada 5 basa terakhir

ujung 3′ karena ujung 3′-nya bisa melipat membentuk GC clamp yang

mengakibatkan ujung 3′ primer tidak terikat pada cetakan.

5) Struktur Sekunder Primer

Struktur sekunder primer dapat disebabkan oleh interaksi intra dan inter-

molekuler primer. Hal ini juga amat mempengaruhi kualitas dan kuantitas

produk PCR, karena akan mengurangi kemampuan primer menempel pada

cetakan.

Berikut ini beberapa jenis struktur sekunder primer:

i) Hairpin

Hairpins terbentuk akibat interaksi intramolekuler primer sehingga

membentuk semacam lipatan



Amaliah Labiqah

17

ii) Self Dimer

Self dimer terbentuk oleh interaksi intermolekuler antara dua

molekul primer yang sama, dimana primer homolog terhadap

dirinya sendiri. Biasanya kita menambahkan primer dalam jumlah

besar dibanding jumlah DNA cetakan, dan ketika primer lebih suka

membentuk dimer intermolekuler ketimbang berhibridisasi dengan

DNA cetakan, maka yield produk tentu akan berkurang.

iii) Cross Dimer

Primer cross dimer terbentuk karena interaksi intermolekuler antara

primer sense dan antisense, dimana keduanya memiliki homologi.

6) Runs

Runsmerupakanpengulangan satu jenis basa. Runs juga harus dihindari

karena dapat menyebabkan mispriming. Jumlah maksimum run yang dapat

diterima adalah 4 basa.

Pada desain primer basa nukleotida yang diambil juga bisa ditambahkan sisi

restriksi sehingga produk PCR yang dihasilkan bisa dimasukkan atau diinsersikan

ke dalam suatu plasmid. Urutan sisi pengenal enzim restriksi yang ditambahkan



Amaliah Labiqah

http://sciencebiotech.net/wp-content/uploads/2010/04/cross_dimer.jpg

18

adalah sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada multiple cloning side

(MCS) pada vektor plasmid yang diinginkan dan tidak terdapat pada hasil

aligment daerah lestari yang diambil primernya. Pada penelitian ini akan

ditambahkan urutan sisi pengenal enzim restriksi yang terdapat pada plasmid

pYES2. Berikut peta plasmid pYES2 pada Gambar 2.5

Gambar 2.5 Peta Plamid pYES2

2.5 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Elektroforesismerupakan suatu metode yang digunakan untuk

menganalisis DNA.Gel yang digunakan tersusun atas agarosa atau poliakrilamida.

Agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen-fragmen DNA yang ukurannya



Amaliah Labiqah

19

mempunyai rentang beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa.Sedangkan

poliakrilamida digunakan untuk fragmen-fragmen DNA yang lebih kecil.Gel

agarosa merupakan jaring-jaring kompleks molekul polimer. Molekul DNA yang

bermuatan negatif bergerak melalui gel dengan kecepatan yang berbeda sesuai

ukuran. Elektroforesis gel agarosa seringkali dilaksanakan dengan menggunakan

fragmen-fragmen DNA penanda yang ukurannya sudah diketahui sehingga

memungkinkan ditentukannya ukuran DNA dengan cara interpolasi. Pita-pita

DNA dalam gel terwarnai dengan zat warna etidium bromida.Pita DNA dapat

dilihat dengan bantuan sinar UV (Old and Primrose, 1989).

Beberapa faktor yang mempengaruhi perpindahan DNA dalam gel agarosa

yaitu ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, besarnya voltase yang

digunakan, arah medan listrik, suhu dan komposisi basa, komposisi buffer

elektroforesis(Sambrooket al, 1989).

2.6 Sekuensing DNA

Sekuensing DNA merupakan metode yang digunakan untuk membaca

urutan nukleotida pada molekul DNA yang ditentukan. Ada dua metode yang

digunakan dalam DNA sekuensing yaitu secara enzimatik (pengakhiran rantai)

oleh F. Sanger dan A.R. Coulsan dan cara degradasi kimiawi oleh A. Maxam dan

W. Gilbert (Brown, 2005 ;Smith and Wood, 1991).

Langkah pertama pada eksperimen dengan metode enzimatik dikatalis

oleh fragmen Klenov DNA polimerase I. primer bergabung dengan vektor pada

posisi yang berdekatan dengan poli penghubung. Reaksi sintesis untai DNA



Amaliah Labiqah

20

komplementer dimulai dengan penambahan polimerase Klenow dan masing-

masing dari keempat deoksinukleotid (dATP, dTTP, dGTP,dCTP).Masing-masing

dATP, dTTP, dGTP,dCTPbersama dengan dNTP membentuk suatu untai DNA

dengan bantuan DNA polimerase dan primer. Dari reaksi tersebut fragmen yang

kesemuanya berakhir dengan satu macam basa dideoksiribosa dibagian ujung

karena basa ini tidak bisa membentuk ikatan fosfodiester. Fragmen-fragmen yang

terbentuk dianalisis dengan elektroforesis gel poliakrilamid. Satu lajur hanya

bermakna satu basa nukleotida.

Metode kedua yaitu metode sekuensing secara degradasi kimiawi dengan

menggunakan piperidin, dimetil sulfat dan hidrazin yang secara selektif

menyerang purin dan pirimidin sehingga menghasilkan fragmen-fragmen.Dalam

proses reaksi tersebut, dimetil sulfat dan piperidina memotong guanin (G),

sedangkan Dimetilsulfat dan Piperidina dalam Asam format akanmemotong kedua

Guanin (G) dan Adenin (A). Demikian pula, hidrazin dan piperidina akan

memotong kedua Timin dan Sitosin sedangkan hidrazin dan piperidina dalam

NaClmemotong Sitosin (C). DNA target sebelumnya dilabeli dengan radioaktif

dan dapat dianalisis melalui autidiograf. Jika fragmen diidentifikasi melalui

elektroforesis gel poliakrilamid akan membentuk empat jalur yaitu jalur 1 basa G,

jalur 2 basa G dan A, jalur 3 basa T dan C dan jalur 4 basa C.

2.7 Sequence Aligment dan Program BLAST

Suatu proses penyusunan atau pengaturan dua atau lebih sekuens sehingga

persamaan sekuens-sekuens disebut sebagai sequence aligment. Metode ini



Amaliah Labiqah

21

digunakan untuk mempelajari evolusi sekuens-sekuens dari sekuens yang ada

sebelumnya. Ketidakcocokan dalam aligment diasosiasikan dengan proses mutasi,

sedangkan kesenjangan diasosiasikan dengan proses insersi atau delesi. Selain itu

sequence aligment juga digunakan untuk mencari sekuens yang sama dalam basis

data sekuens. BLAST adalah salah satu metode alignment yang sering digunakan

dalam penelusuran basis data sekuens. BLAST menggunakan alogaritma heuristik

dalam penyusunan aligmnet. Kelompok program dari NCBI BLAST terdiri dari :

1. Blastp, membandingkan sekuens asam amino dengan sekuens protein

database

2. Blastn, membandingkan sekuens suatu nukleotida dengan database sekuens

nukleotida lain

3. Blastx, membandingkan sekuens nukleotida dengan database asam amino

4 . tBlastn, pencarian database nukleotida yang telah ditranslasikan dengan

pertanyaan (query) suatu protein

5. tBlastx, pencarian database nukleotida yang telah ditranslasikan dengan

pertanyaan (query) nukleotida yang telah ditranslasikan pula.

Program BLAST dapat juga digunakan untuk beberapa tujuan diantaranya yaitu

mengidentifikasi suatu spesies, melokasikan domains, membuat pohon

filogenetik, mencocokkan DNA serta membandingkan spesies yang masih

memiliki kekerabatan.



Amaliah Labiqah

22

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Proteomik Institude of Tropical

Disease (ITD) Universitas Airlangga. Penelitian dimulai pada bulan Januari

sampai dengan Juni 2012.

3.2 Sampel, Bahan dan Alat Penelitian

3.2.1 Sampel Penelitian

Sampel penelitian yang digunakan dalam penelitian yaitu bakteri sistem

abdominal rayap tanah isolat 7 dari penelitian Ratnadewi dkk. (2007).

3.2.2 Bahan Penelitian

Bahan penelitian yang digunakan dalam penelitian yaitu primer forward

(endoF), primer reverse (endoR), DNA Taq Polimerase, dNTP, Buffer Taq,

dNTP, MgSO4, Tris Cl, Tris HCl, MgCl2, (NH4)2SO4, ddH2O, KIT QIAGEN (QI

Aquick Gel Extraction Kit 50), media Luria Bertani (LB) padat dengan

komposisi: tripton 1%, NaCl 1%, yeast ekstract 0.5% dan bacto-agar 2%. LB

cair yaitu LB tanpa penambahan bacto-agar, buffer TE (50 mM tris HCl pH 8 dan

50 mM EDTA), larutan lisozim, larutan STEP (SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8,

proteinase K ), fenol jenuh, Na-asetat, etanol absolut, etanol 70%, TAE (Tris

base, Asam Asetat, EDTA pH 8), agarosa, Buffer Loading (campuran Bromofenol

biru dan sukrosa).

22



Amaliah Labiqah

23

3.2.3 Alat Penelitian

Peralatan yang digunakan dalam penelitian yaitu pH meter, autoklaf, (OSK

6508 Steam pressure apparatus Ogawa Seiki Co., LTD), laminair air flow cabinet

(Kottermann 8580), sentrifuga Beckman (tipe TJ-6), timbangan analitik (Mettler

Toledo), oven (Memmert, Jerman), rotary shaker, lemari pendingin -20 0C (Royal

Chest Freezer BD195), eppendorf, mikro pipet, waterbath, shaker incubator

(Heidolph Polymax 1040), thermocycler, UV transluminator dan alat-alat gelas

yang biasa digunakan di laboratorium.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Pembuatan Media

3.3.1.1 Pembuatan LB Cair

Media LB cair dibuat dengan melarutkan yeast extract 0,5% (b/v), bacto

trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) dalam akuades sampai 100 mL dalam

Erlenmeyer. Bahan yang sudah dicampur kemudian disterilkan menggunakan

autoklaf 121 oC selama 15 menit.

3.3.1.2 Pembuatan LB Padat

Media LB padat dibuat dengan melarutkan bacto-agar 2% (b/v), yeast

extract 0,5% (b/v), bacto trypton 1% (b/v), NaCl 1% (b/v) ke dalam akuades

sampai 100 mL dalam Enlemeyer. Campuran bahan kemudian disterilkan

menggunakan autoklaf 121 oC selama 15 menit. Media yang masih hangat-hangat

kuku kemudian dipindah ke dalam cawan petri steril hingga memadat.



Amaliah Labiqah

24

3.3.2 Peremajaan Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap

Tanah

Bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7 diremajakan

dengan cara ditumbuhkan pada media LB padat. Koloni Bakteri xilanolitik sistem

abdominal rayap tanah diambil dari biakan lama dengan menggunakan kawat ose.

Kawat ose kemudian digoreskan pada media LB padat lalu diinkubasi pada suhu

37 ˚C selama ±18 jam. Pemindahan biakan bakteri pada media LB ini dilakukan

pada laminar dengan proses yang steril.

3.3.3 Isolasi DNA Kromosom

Koloni bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah isolat 7

diinokulasikan ke dalam 100 ml LB cair dan diinkubasi pada shaker incubator

pada suhu 37 0C dengan kecepatan 150 rpm selama 18 jam. Suspensi sel

kemudian disentrifugasi 6.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4˚C. Pellet sel

disuspensikan dengan 5 ml buffer TE (Tris HCL EDTA) yang merupakan

campuran tris HCl pH 8 50 mM dan EDTA 50 mM. Pellet yang diperoleh

dibekukan pada suhu -20˚C selama ±30 menit. Setelah itu ditambahkan larutan

lisozim 10 mg/ml sebanyak 500 μL ke dalam sel beku dan kemudian dicairkan

pada suhu kamar (23˚C). Larutan yang sudah mencair dipindahkan ke dalam

penangas es selama 45 menit. Suspensi sel ditambahkan larutan STEP fresh (SDS

1%, Tris Cl, EDTA pH 8, Proteinase K) sebanyak 1 ml dan dicampur dengan

baik. Campuran dipanaskan dalam waterbath 50˚C selama 1 jam sambil digoyang

perlahan. Suspensi sel kemudian ditambahkan 6 ml fenol jenuh dalam buffer tris

kemudian campur perlahan selama 5 menit hingga terbentuk emulsi. Campuran



Amaliah Labiqah

25

disentrifugasi 12.000 rpm selama 5 menit. Fasa paling atas dipindahkan pada

tabung eppendorf baru yang steril. Selanjutnya ditambahkan larutan Natrium

Asetat 0,3 M sebanyak 0,1 kali dari volume total, lalu dicampur perlahan.

Kemudian ditambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2 kali volume larutan

kemudian tabung dibolak-balik agar tercampur dengan baik. Setelah itu, campuran

diinkubasi pada suhu -20oC semalam. Campuran disentifugasi pada 12000 rpm

selama 5 menit, kemudian supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan 0,6 ml

etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali pada 12000 rpm selama 10 menit.

Pelet diambil kemudian dilarutkan ke dalam ddH2O. Kadar larutan DNA dapat

diukur dengan Spektrofotometer nano-drop pada panjang gelombang A260/A280

nm.

3.3.4 Analisis DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa

Gel agarosa dibuat dengan melarutkan 0,4 gr agarosa dalam 40 ml buffer

TAE, kemudian dididihkan. Setelah larut sempurna, larutan gel dicetak pada

wadah elektroforesis yang telah diberi pencetak sumur, kemudian ditunggu

sampai mengeras. Analisis DNA menggunakan elektroforesis gel agarosa

dilakukan dengan mengambil buffer loading sebanyak 3 µL, lalu

menghomogenkannya dengan 4 µL DNA yang akan dielektroforesis. Sebelumnya

telah dilakukan persiapan pada perangkat elektroforesis yaitu dengan

menambahkan buffer TAE pada wadah elektroforesis sampai gel agarosa benar-

benar tercelup. Campuran DNA dan buffer loading yang telah homogen

kemudian dimasukkan dalam sumur pada gel agarosa. Gel agarosa yang sudah



Amaliah Labiqah

26

dielektroforesis dicelupkan dalam larutan EtBr untuk pewarnaan. Pita DNA dapat

dilihat di atas UV transluminator.

3.3.5 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR

Untuk melakukan PCR dibutuhkan sepasang oligonukleotida primer.

Primer didesain dengan menggunakan program computer yang bernama clone

manager. Untuk mendesain primer dibutuhkan urutan basa nukleotida penyandi

gen endo-1,4-β-xilanase yang didapat dari Genbank, www.ncbi.nlm.nih.gov.

Setelah didapatkan urutan gen penyandi endo-1,4-β-xilanase kemudian dicari

homologinya. Daerah yang konserv diambil bagian ujung depan sebagai primer

forward ujung belakang sebagai primer reverse.

Komposisi PCR terdiri DNA kromosom 10 μl, primer forward 2 μl, primer

reverse 2 μl, MgSO4 1 μl, Taq polimerase 2 μl, buffer Taq 2 μl dan dNTP 1 μl

sehingga menghasilkan komposisi campuran total sebanyak 20 μl. Proses

amplifikasi gen endo-1,4-β-xilanase dari bakteri xilanolitik sistem abdominal

rayap tanah isolat 7 dilakukan pada kondisi PCR sebagai berikut: denaturasi pada

suhu 94 oC selama1 menit, annealing pada variasi suhu 52 oC; 55 oC; 58 oC; 62 oC

dan 64 oC selama 1 menit dan elongasi pada suhu 72 oC selama 1 menit dengan

jumlah siklus 30 kali. Proses amplifikasi diawali dengan pra-denaturasi pada suhu

94 oC selama 5 menit dan diakhiri dengan pasca elongasi yang dilakukan pada

suhu 72 oC selama 10 menit. Produk PCR kemudian dianalisis menggunakan

elektroforesis gel agarosa.



Amaliah Labiqah

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

27

3.3.6 Purifikasi Produk PCR

Produk PCR yang dihasilkan dielektroforesis menggunakan gel agarosa

1% (0.6 gr agarosa dalam 60 mL buffer TAE). Elektroforesis dilakukan dengan

mencampur produk PCR dengan buffer loading dan dilakukan pada 50V selama

±1 jam. Gel yang mengandung pita DNA kemudian dipotong dengan cutter steril

dan dimasukkan ke dalam tabung eppendrof untuk dilakukan purifikasi dengan

menggunakan QI Aquick Gel Extraction KIT 50. Gel yang berada dalam tabung

eppendorf ditambahkan dengan larutan capture buffer (asam asetat dan chaotropic

agent) dengan perbandingan berat gel : buffer adalah 0.3 gram : 0,9 ml. campuran

diinkubasi pada 50˚C selama 10 menit. Tiap 5 menit dikocok agar gel tercampur

rata dengan buffer. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam tabung KIT dengan

menggunakan mikro pipet. Campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12.000

rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang dan residu yang tertinggal dalam kolom

ditambahkan dengan buffer washing (buffer Tris HCl pH 8, EDTA 1 mM dan

etanol absolut). Kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 15 menit.

Campuran disentrifugasi kembali dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit.

Residu yang tertinggal dalam kolom dielusi menggunakan 25 μl ddH2O steril dan

ditampung dalam tabung eppendorf steril. Larutan diinkubasi pada suhu kamar

selama 1-5 menit dan disentrifugasi kembali 12.000 rpm selama 2 menit. Produk

purfikasi yang dihasilkan disimpan dalam -20˚C.

3.3.7 Sekuensing Amplikon dengan Metode Sanger

Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystem 3730XL di

Laboratorium Macrogen Singapore.



Amaliah Labiqah

28

3.4 Skema Kerja

Isolasi DNA kromosom dari bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah

isolat 7

Amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xylanase dengan

teknologi PCR

Purifikasi produk PCR

Sekuensing produk PCR

Desain Primer PCR (sepasang primer endoF dan

endoR)



Amaliah Labiqah

29

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Isolasi DNA Kromosom Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Isolat 7

Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode Sambrook et

al(1989). Koloni isolat 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah

ditumbuhkan dalam media LB cair selama semalam. Suspensi sel yang dihasilkan

disentrifugasi dan diambil pelet selnya untuk diresuspensi dengan buffer TE dan

kemudian ditambahkan dengan lisozim untuk merusak dinding sel bakteri.

Larutan STEP yang terdiri dari SDS 1%, Tris Cl, EDTA pH 8 dan proteinase K

ditambahkan ke dalam suspensi sel untuk menyempurnakan kerusakan dinding

dan membran sel bakteri. EDTA mampu menghambat kerja-kerja enzim yang

merusak DNA serta membentuk ion kompleks dengan magnesium sehingga ion

magnesium yang penting untuk mempertahankan struktur dinding sel

hilang.Proteinase K mampu memecah polipeptida menjadi unit yang lebih kecil

dan lebih mudah didenaturasi oleh fenol (Brown, 2001). Untuk itu, fenol

ditambahkan guna mempresipitasi protein, larutan DNA akanterlarut pada fasa

cair. Sebagian RNA akan tetap bersama DNA dalam fasa cair. Fasa cair yang ada

pada bagian atas ini diambil dengan menggunakan mikropipet secara hati-hati dan

ditambahkan dengan Natrium Asetat dan etanol absolut. Kedua larutan ini

berfungsi untuk mempresipitasi DNA. Dengan adanya garam (kation monovalen

Na+) pada temperatur -20 Co etanol absolut akan mempresipitasiasam nukleat



Amaliah Labiqah

30

polimerik. Larutan DNA kemudian diambil pelet selnya untuk dilarutkan ke

dalam ddH2O. Absorbansi ultraviolet dapat digunakan untuk mengetahui

kemurnianDNAdengan menggunakan Spektrofotometri nanodrop yang langsung

bisa mengukur absorbansi pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.Panjang

gelombang maksimum yang diserap oleh DNA dan RNA adalah 260 nm.

Sedangkan protein menyerap panjang gelombang maksimum 280 nm (Tearae et

al, 1997). Pengukuran absorbansi pada panjnag gelombang A260/A280 nmini

berfungsi untuk mengetahui rasio kemurnian DNAterhadap protein. Pada isolasi

DNA ini didapatkan rasio absorbansilarutan DNA isolat 7 pada adalah sebesar

1,89. Larutan DNA ini bisa dikatakan murni karena rasio absorbasi DNA lebih

besar dari 1,8 (Brown, 2001).

Gambar 4.1 Hasil elektroforesis DNA kromosom



Amaliah Labiqah

31

4.2 Amplifikasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase dengan Metode PCR

Amplifikasi gen dengan teknik PCR membutuhkan sepasang primer yang

sesuai. Pada penelitian ini didesain sepasang primer forward(endo F) dan primer

reverse (endoR) dengan menggunakan software clone manager.Primer didesain

berdasarkan pada urutan basa nukleotidagen penyandi endo-1,4-β-xilanase yang

diambil dari Genbank.Urutan basa nukleotida gen penyandiendo-1,4-β-xilanase

yang diambil berasal dari kelompok hidrolase famili 11 Bacillus subtillis

disebabkan karena bakteri xilanolitik dari sistem abdominal rayap isolat 7 telah

diidentifikasi secara mikrobiologis memiliki homologi dengan Bacillus subtilis.

Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal

isoalt 7 bakteri xilanolitik sistem abdominal rayap tanah didesain berdasarkan gen

penyandi endo-1,4-β-xilanase dari beberapa GH famili 11 yaituBacillus

subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl (DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1

xylanase gene (EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl

(DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1). Keempat jenis

bakteri tersebut mengandung gen penyandi enzim endo-xilanase dengan ukuran

rata-rata ± 600 bp dilakukan aligmentsehingga dihasilkan suatu daerah lestari

seperti yang dapat dilihat pada Gambar 4.2



Amaliah Labiqah

32

Gambar 4.2 Hasil aligmentBacillus subtilisgalur BD403 endo1,4beta-xyl (DQ100306.1), Bacillus subtilisgalur G1 xylanase gene (EU848308.1), Bacillus subtilisgalur MW10 endo-1,4-beta-xyl (DQ100307.1), dan Bacillus subtilisgalur R5 xyl (AB457186.1)



Amaliah Labiqah

33

Sambrook and Russel(2001), menyebutkan beberapa hal yang perlu

diperhatikan untuk mendesain primer yaitu panjang nukleotida antara 18-25,

memiliki 40-60% basa GC, tidak terjadi hairpin maupun dimer serta pada ujung

3’ tidak boleh lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan

primer reverse ataupun sebaliknya. Pada penelitian ini diambil basa nukleotida

dengan urutan tertentudan ditambah urutan sisi pengenal enzim restriksi yang

terdapat pada multiple cloning side(MCS) pada vektor plasmid pYES2 sehingga

dapat diinsersikan pada plasmid pYES2.Dari hasil analisis, urutan sisi pengenal

enzim restriksi yang sesuai pada MCS pYES2dan tidak terdapat padahasil

aligmentdi atas adalah SacI dan XhoI. Maka selanjutnya primer forward didesain

dengan penambahan sisi restriksi SacI (GAGCTC)dengan kodon start ATG pada

ujung 5’ dan primer reverse dengan penambahan sisi restriksi XhoI

(CTCGAG)pada ujung 3’ dengan stop kodon TAA.Untuk melengkapi %GC

primer ditambahkan basa GC sebagai pijakan. Primer forward endoF didesain

dengan panjang basa nukleotida sebesar 39bp dengan urutan basa 5’

GGGGAGCTCTCCATGTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT 3’. Primer

forward endoF memiliki Tm sebesar 67°C, 30% GC, tidak terjadi dimers dan

harpains serta serta pada ujung 3’ tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer

forward komplemen dengan primer reverse ataupun sebaliknya. Sedangkan

primer reverse endoR memiliki 23 panjang basa nukleotida dengan urutan basa 5’

GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC 3’. Primer reverse endoR memiliki Tm

sebesar 64°C, 52% GC, tidak terjadi dimers dan harpains serta serta pada ujung 3’

tidak lebih dari 3 nukleotida dari primer forward komplemen dengan primer



Amaliah Labiqah

34

reverse ataupun sebaliknya. Gambar 4.3 dan 4.4 menunujukkan hasil analisis

desain primer forward endoF dan reverseendoR.

Gambar 4.3 Analisis Primer Forward (endoF)



Amaliah Labiqah

35

Gambar 4.4 Analisis Primer Reverse (endoR)

Analisis primer oleh program Clone manager pada Gambar 4.3 dan 4.5

menunjukkan primer reverse memenuhi kriteria primer PCR yang disarankan oleh

program Clone manager. Sedangkan primer forwardmemiliki beberapa kriteria

yang disarankan oleh program Clone manageryang tidak terpenuhi. Primer

forward memiliki panjang primer sepanjang 39 dan 30% GC. Dalam teorinya,

jika suatu primer terlalu panjang maka dapat menyebabkan kegagalan replikasi

(Irawan, 2008 ; Yuwono, 2006). Namun, dalam penelitian(Paice, et al., 1986) dan

(Huang et al., 2005) pernah melakukan amplifikasi gen penyandi xilanase dengan

panjang basa 39 basa nukleotida. Urutan primer forward yang digunakan yaitu

5’CGAATTCCATGTTTAAGTTTAAAAAGAATTTCTTAGTT 3’. Primer

tersebut sama seperti primer forwardendoF yang digunakan pada penelitian ini

dengan penambahan GC dan penambahan sisi restriksi yang berbeda. Primer



Amaliah Labiqah

36

forward Primer forward endoF dan primer reverse endoR kemudian di-alignment

dengan gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis(Gambar 4.5).

Gambar 4.5 Hasil alignment gen endo-1,4-β-xilanase GH 11 dari Bacillus subtillis dengan primer forward endoF (F3 ENDO ORI) dan primer reverse endoR (R ENDO INVERS)



Amaliah Labiqah

37

Reaksi PCR dilakukan dengan mencampurkan primer, DNA cetakan,

MgSO4,enzim Taq DNA polimerase, dNTP serta larutan buffer. Enzim Taq DNA

polimerase memiliki aktivitas untuk memperpanjang rantai DNA yang mampu

mempertahankan aktivitasnya pada suhu tinggi (sampai 95°C) walaupun

dilakukan pemanasan beberapa kali (Bintang, 2010). Ion Mg2+ dari MgSO4

berfungsi sebagai kofaktor bagi enzim Taq polimerase. PCR kemudian dijalankan

dengan kondisi sebagai berikut : denaturasi awal 94 Co 1menit; annealing 58 Co

selama 1menit; dan elongasi 72 Co selama 1 menit. Pada suhu 94 Co yaitu pada

proses denaturasi, DNA untai ganda akan terbelah menjadi untai tunggal akibat

pemanasan yang merusak ikatan hidrogen yang menghubungkan untai DNA.

Suhu kemudian diturunkan pada proses annealing. Pada suhu ini primer akan

melekat pada segmen yang komplemen pada DNA untai tunggal. Pada awal

penelitian ini annealing dilakukan pada variasi suhu55˚C, 58˚C, 60˚C, 62˚C.

Variasi suhu dilakukan adalah untuk mencari suhu optimum yang bisa

mengamplifikasi DNA target dengan baik. Dari hasil variasi suhu tersebut, DNA

penyandi endoxilanase dari sistem abdominal rayap tanah dapat diamplifikasi

pada suhu annealing 58 Co. Amplikon PCR kemudian dianalisis menggunakan

elektroforesis gel agarosa. Agarosa biasa digunakan untuk memisahkan fragmen

DNA dengan rentang ukuran beberapa ratus hingga sekitar 20.000 kb. DNA yang

bermuatan negatif akan menuju ke kutub positif dengan adanya arus listrik yang

diberikan. DNA dengan ukuran molekul lebih kecil akan lebih cepat bermigrasi

melewati gel dibandingkan dengan DNA yang ukuran molekulnya lebih besar.

Visualisasi pita DNA dalam gel agarosa ini dapat dilihat melalui UV



Amaliah Labiqah

38

transluminator dimana sebelumnya dilakukan pewarnaan dengan Etidium

Bromide (EtBr). Amplikon PCR yang berhasil diamplifikasi pada penelitian ini

yaitu sebesar ±500 bp (Gambar 4.4)

Gambar 4.6. Hasil elektroforesis PCR menggunakan primer endoF dan endoR A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri

xilanolitik sistem abdominal rayap tanah hasil PCR

Primer forward endoF dan reverse endoR didesain dengan primer forward

menempel dari sisi ujung dengan start kodon ATG dan primer reverse endoR

menempel dari sisi ujung dengan stop kodon TAA. Kedua primer bergerak dari

ujung ke ujung pada urutan template sepanjang ±600bp sehingga pada amplifikasi

dengan primer endoF dan endoR ini dapat diperoleh PCR sebanyak sekitar 0,5bp.

Sebelumnya telah didesain pula primer forward dan reversedengan urutan primer

forward 5’- GCGAGCTCATGGCAATGGATA -3’ dan primer reverse 5’-

GCCTCGAGTTACCACACTGTTAC -3’ kedua primer ini memenuhi kriteria

250bp

500bp

1000bp

p

1500bp

p

3000bp

p

A B

± 0,5bp



Amaliah Labiqah

39

analisis primer dari software Clone Manager (Gambar 4.6). Jika dilakukan

homologi, primer forwardbergerak dari posisi tengah sedamgkan primer reverse

di sisi ujung (Gambar 4.7). Kedua primer ini berhasil mengamplifikasi fragmen

DNA pada ±200bp (Gambar 4.8). Bila dibandinngkan desain primer 2

mengamplifikasi DNA dengan ukuran yang lebih sedikit dan fragmen yang

dihasilkan lebih tipis. Oleh karena itu data yang digunakan adalah data hasil

amplifikasi dari primer endoF dan endoR dengan ukuran ±0,5bp.

Gambar 4.7 Analisis primer forward dan primer reverse desain 2



Amaliah Labiqah

40

Gambar 4.7 Hasil aligment desain primer 2

Gambar 4.8 Desain Primer 2



Amaliah Labiqah

41

Gambar 4.9 Hasil elektroforesis PCR menggunakan desain primer 2

A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri

xilanolitik sistem abdominal rayap tanah hasil PCR

4.3 Purifikasi atau pemurnian DNA Produk PCR

Purifikasi produk PCR dilakukan melalui purifikasi gel menggunakan

reagen KIT (QI Aquick Gel Extraction KIT 50). Tahap awal yang dilakukan

dalam proses purifikasi ini yaitu memasukkan produk PCR ke dalam gel agarosa

1% (0,6 gram dalam 60 ml TAE). Produk PCR dielektroforesis kemudian gel

yang mengandung pita DNA dipotong menggunakan cutter steril. Gel yang

mengandung pita DNA kemudian ditambahkan dengan buffer QC (mengandung

asam asetat dan caorotropic agent) dengan pemanasan 50 Co selama 10menit

untuk mendenaturasi protein yang tersisa selama proses PCR. Sampel kemudian

dipindahkan ke dalam kolom KIT sehingga DNA akan terperangkap ke dalam

matrix kolom. Setelah itu dilakukan penambahan buffer PE yang mengandung

250bp

500bp

1000bp

p

1500bp

p

3000bp

p

A B

± 200bp



Amaliah Labiqah

42

etanol untuk menghilangkan garam dan kontaminan. DNA produk PCR dalam

matrix kolom kemudian dielusikan dengan ddH2O steril. Hasil purifikasi dapat

dilihat pada Gambar 4.8

Gambar 4.10 Hasil elektroforesis amplikon PCR yang telah dimurnikan dengan

reagen KIT (QI Aquick Gel Extraction KIT 50 A. GeneRulerTM 1 kb DNA ladder B. Amplikon gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri

xilanolitik sistem abdominal rayap tanah 4.4 Analisis Urutan Basa Nukleotida Gen Penyandi Endo-1,4-β-xilanase Asal

Isolat 7 Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah Urutan basa nukleotida gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7

bakteri xilanolitik sitem abdominal rayap tanah dibaca dengan teknik

sequencing menggunakan primer forward endoF dan primer reverse endoR.

Sekuensing dilakukan dengan alat Applied Biosystems 3730XL squenser.

Data hasil sekuensing adalah sebagai berikut :

250bp

500bp

1000bp

p

1500bp

p

3000bp

p

A B

± 0,5bp



Amaliah Labiqah

43

a) Sekuensing dengan primer forward endoF dengan Applied Biosystems

3730XL squenser:

TCTCCCTGTACTAGGAGATCGTCAGCTTCCCACCTCTCAACTAG

ATGT

b) Sekuensing dengan primer reverse endoR dengan Applied Biosystems

3730XL squenser:

TACATCAGCCTACGTCTGTATCTTTCCGGGGCCCCACAACCAGA

GA

Kedua hasil sekuensing tidak berhasil membaca urutan basa nukleotida

gen penyandi endo-1,4-β-xilanase asal isolat 7 bakteri xilanolitik sitem abdominal

rayap tanah secara keseluruhan. Hal ini diindikasikan karena faktor kemurnian

DNA produk PCR yang dihasilkan kurang baik.



Amaliah Labiqah

47

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa gen penyandi endo-1,4-β-

xilanase dengan ukuran 0,5 bp asal isolat 7 bakteri xilanolitik sistem

abdonminal rayap tanah dapat diamplifikasi dengan metode PCR

menggunakan desain primer endoFdanendoR.

5.2 Saran

Berdasarkan penelitian yang dilakukan dapat disarankan :

1. Dilakukan pemurnian dan sekuensing ulang terhadap DNA gen

penyandi endo-1,4-β-xilanaseasalisolat7 bakteri xilanolitik sistem

abdonminal rayap tanah

2. Dilakukan amplifikasi ulang dengan primer yang berbeda atau

melakukan desain primer baru untuk urutangen penyandi endo-1,4-β-

xilanase.

44



Amaliah Labiqah

45

DAFTAR PUSTAKA Bainbridge B. W., Berna P., 1987, Genetics of Microbes, 2nd edition, Chapman &

Hall, New York. Beg Q. K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G. S., 2001, Microbial Xylanases

and their Industrial Applications : a Review, Applied Microbiology and Biotechnology, Vol. 56, p. 326-338.

Bock Ralph, 1997, Biolistic Transformation of Plants with anion-exchange-

purified Plasmid DNA, Qiagen News, Issue No. 5. Borror, Triplehorn, Johnson, 1992, Pengenalan Pelajaran Serangga, Edisi

Keenam, Alih Bahasa : Soetiyono P., Gadjah Mada University press, Yogyakarta.

Brown T.A., 2010, Gene Cloning an Introduction, 3rd edition, Chapman & Hall,

United Kingdoom. Cheng H. L., Whang P. M., Chen Y. C., Yang S., Chen Y. C., 2008, Cloning,

Characterization and Phylogenetic Relationships of stxI, a endoxylanase-encoding Gene from Streptomyces

thermonitriWcans NTU-88, Bioresource Technology, Vol. 99, p. 227-231.

Corral, O.L., Ortega, F.V., 2006, Xylanases, Advances in Agricultural and Food

Biotechnology 305-322 Coughlan, M.P. and Hazlewood, G.P., 1992, Hemicellulose and Hemicellulase,

Portland Press, London and Chapel Hill.

Debeche, T., Bliard, C., Debire, P., and O’Donohue, M.J., 2002, Probing The Catalytically Essential Residues of the α-L-arabinofuranosidase from Thermobacilus xylanilyticus, Protein Enginering 15: 21-28.

Erlich H. A., 1992, PCR Technology : Principles and Application for DNA Amplification, W. H. Freeman and company, USA.

Faulet B. M., Niamke S., Gonnety J. T., Kouame, L. P., 2006. Purification and

Biochemical Properties of a New Thermostable Xylanase from Symbiotic Fungus, Termitomyces sp., African Journal of Biotechnology, Vol. 5, p. 273-282.

Freifelder David, 1987, Molecular Biology, Jones and Barltlett Publisher Inc,

USA.

45 ADLN Perpustakaan Universitas Airlangga


Amaliah Labiqah

46

Girio F. M., Fonseca C., Carvalheiro F., Duarte L.C., Marques S., Lukasik L. B.,

2010, Hemicelluloses for fuel ethanol: A review, Bioresource Technology, Vol. 101, p. 4775–4800.

Goodenough, U., 1984, Genetika, Edisi Ketiga, Alih Bahasa : Adisoemarto S.,

Erlangga, Jakarta. Henrissat B., Coutinho P., Deleury E., http://www.CAZy-GH_tables.htm, 8 April

2005

Huang J., Whang G., Xiao L., 2006, Cloning, sequencing and expression of the xylanase gene from a Bacillus subtilis strain B10 in Escherichia

coli, Bioresource Technology, Vol. 97, p. 802-808. Innis M. A., Gelfan D. H., John S., PCR Protocols : A Guide to Methode

Application, 1990, Academic Press, New York. Irawan B., 2008, Genetika Molekuler, Airlangga University Press, Surabaya. Mishra M., Thakur I. S., 2011, Purification, Characterization and Mass

Spectroscopic Analysis of Thermo-alkalotolerant β-1,4- endoxylanase from Bacillus sp. and Its Potential for Dye Decolorization, International Biodeterioration & Biodegradation, Vol. 65, p. 301-308.

Old R.W., Primrose S.B., Prinsip-prinsip Manipulasi Gen,Edisi ke-4 Alih bahasa

:1995, Poorna C. Asha., Prema P., 2006, Production and partial characterization of

endoxylanase by Bacillus pumilus using agro industrial residues, Biochemical Engineering, Vol. 36, p. 106-112.

Purwadaria T., Ardiningsih P., Ketaren P. P., dan Sinurat A. P., 2004. Isolasi dan

Penapisan Bakteri Xilanolitik Mesofil dari Rayap. Jurnal Mikrobiologi Indonesia 9.

Puspaningsih N. N. T., 2004, Pencirian Enzim Xilanolitik dan Kloning Gen

Penyandi Xilosidase dari Bacillus thermoleovorans IT-08, Disertasi Program Studi Biologi Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, Institut Pertanian Bogor, Bogor.

Radek R., 1999, Flagellates, Bacteria, and Fungi Associated with Termites :

Diversity and Function in Nutrition-A Review, Ecotropica, Vol. 5 (2), p. 183-196.



Amaliah Labiqah

http://www.cazy-gh_tables.htm/

47

Ratnadewi A. A. I., Handayani W., Hadi A. F., Sa’diyah H., Budi L., 2007, Isolasi,Pemurnian dan Karakterisasi Enzim Xilanolitik Asal Mikrob Dalam Sistem Intestin Rayap Untuk Memproduksi Xilooligosakarida Sebagai Pereduksi Resiko Kanker, Uneversitas Jember, Jember.

Ratnadewi A. A. I., Puspaningsih N. N. T., Handayani W., 2011, Kloning dan

Overekspresi Gen Beta-endoxylanase Asal Bakteri Xilanolitik Sistem Abdominal Rayap Tanah dan Produksi Xilooligosakarida Sebagai Produsen Probiotik, Universitas Jember, Jember.

Russel J. Petter., 1999, Fundamentals Of Genetics, 2nd edition, Addison Wesley Longman, San Francisco.

Richana, N., 2002, Produksi dan Prospek Enzim Xilanase dalam Pengembangan

Bioindustri di Indonesia, Buletin AgroBio 5 (1) : 29-36. Saha, B. C., 2003, Hemicellulose Bioconversion. Review Paper, Journal of

Industrial Microbiology and Biotechnology 30 (5, May) : 279 -291.

Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T., 1989, Molecular Cloning, 2nd Edition,

Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Shallom, D., Belakhov, V., Solomon, G., Bassov, T., Shoham, Y., 2002, Detailed

Kinetic Analysis and Identification of The Nukleophile in α-L-Arabinofuranosidase From Geobacillus stearothermophillus T6, a Family 51 Glycoside Hydrolase, J Biol Chem, 227: 436667-43673.

Smith C. A., Wood E. J., 1991, Molecular and Cell Biochemistry : Molecular Biology and Biotechnology, Chapman and Hall, USA

Spangler B. D., 2002, Methods in Molecular Biology and Protein Chemistry :

Cloning and Characterization of an Enteroxin Subunit, John Wiley & Sons, Ltd., United Kingdoom.

Sriyapai T., Somyoonsap P., Matsui K., Kawai F., ChansiriK., 2011, Cloning of

thermostable xylanase from Actinomadura sp. S14 and its expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, Journal of Bioscience and Bioengineering, Vol. 111 No. 5, 528–536.



Amaliah Labiqah

48

Subramaniyan S., Prema P., 2002, Biotecnology of Microbial Xylanases : Enzymology, Molecular Biology, and Application, Critical Rev Biotechnol, Vol. 22, p. 33-64.

Tarumingkeng R. C., 1971, Biologi dan Pengenalan Rayap Perusak Kayu di

Indonesia. Laporan L. P. H. No. 138, Departemen Pertanian Direktorat Jenderal Kehutanan Lembaga Penelitian Hasil Hutan, Bogor.

Tarumingkeng R. C., 2001, Biologi dan Perilaku Rayap, Program Studi Ilmu

Hayati Institut Pertanian Bogor, Bogor (diakses online dari www.rudyct.com/biologi_perilaku_rayap.htm).

Teare JM et al. 1997. Measurement of nucleic acid concentrations using the DNA

quant and the genequant. Bio Techniques 22:1170-1174 Walker J. M., Rapley R., 2009, Molecular Biology and Biotechnology, 5th

edition, Royal Society of Chemistry United Kingdoom. Wirajana I. N., 2010, Ekspressi dan Sekresi α-L-arabinofuranosidase dari

E.coli DH5α/pTP510 di Saccharomyces cerevisiae, Disertasi Program Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya, Universitas Airlangga, Surabaya.

White B. A., 1997, PCR Cloning Protocols, Humana Press, New Jersey. Yuwono T., 2006, Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction : Panduan

Eksperimen PCR untuk memecahkan masalah Biologi Terkini, Penerbit Adi, Yogyakarta.

Zhang Min., Jiang Z., Yang S., Hua C., Li L., 2010, Cloning and expression of a

Paecilomyces thermophila xylanase gene in E. coli and characterization of the recombinant xylanase, Bioresource Technology, Vol. 101, p. 688–695.

Zhou C., Bai J., Deng S., Whang J., Zhu J., Wu M., Wang W., 2008, Cloning of a

xylanase gene from Aspergillus usamii and its expression in Escherichia coli, Bioresource Technology, Vol. 99, p. 831-838.

Sciencebiotech.net, tanggal akses 23 November 2011 www.wikipedia.com, tanggal akses 23 November 2011.



Amaliah Labiqah

http://www.rudyct.com/biologi_perilaku_rayap.htm

Lampiran 1. Pembuatan Larutan TE

Untuk membuat 50 mL larutan TE (50 mM Tris Cl dan 50 mM EDTA)

Pembuatan stok 500 mM Tris Cl 50 mL 0,5 M = gr Tris Clx 1000 121,14 50 mL Tris Cl = 3,0285 gram dilarutkan dalam aquades hingga 50 mL

Pembuatan stok 500 mM EDTA 25 mL 0,5 M = gr EDTA x 1000 372,24 25 mL EDTA = 4,653 gram dilarutkan dalam aquades hingga 25 mL

Pembuatan Larutan TE 50 mL = 50 mM Tris Cl dari stok 500 mM

V x 500 = 50 x 50

V = 5 mL

50 mM EDTA dari stok 500 mM

V x 500 = 50 x 50

V = 5 mL

50 TE = 5 mL Tris Cl 50 mM ditambah 5 mL EDTA 50 mM dilarutkan dalam aquades hingga volume 50 mL

Lampiran 2. Pembuatan Larutan Lisosim

Stok Lisosim 10 mg/ mL Pembuatan 1 mL lisosim = 10 mg/mL x 1 mL = 0,01 gram dilarutkan dalam aquades hingga 1 mL

Lampiran 3. Pembuatan Larutan STEP

Untuk mebuat Larutan STEP 500 μLterdiri dari SDS 0,5%; Tris Cl 50 mM pH 7,5; EDTA 0,4 M; Proteinase K

SDS 0,5% dari stok 25% = 500 μLx 0,5 = 0,0025 gram 100. 1000 μL



Amaliah Labiqah

Tris Cl 50 mM dari stok 500 mM

V x 500 = 500 x 50 V = 50μL

EDTA 0,4 M dari stok 500 mM V x 0,5 = 500 x 0,4 V = 400μL

Protinase K 1 mg/mL dari stok 20 mg/mL

500 μL x 1 mg/mL = V x 20 mg/mL

V = 25 μL

Lampiran 4. Pembuatan Na-Asetat 3 M

3 M = gr Na-Asetatx 1000 82,03 10 mL

= 2,4609 gram Na-Asetat dilarutkan dalam akuades hingga 10 mL

Lampiran 5. Electropherogram hasil sekuensing

Sekuensing menggunakan primer forward endoF :



Amaliah Labiqah

Sekuensing menggunakan primer reverse endoR :



Amaliah Labiqah

AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL …repository.unair.ac.id/25755/1/LABIQAH,...

Documents

Transcript of AMPLIFIKASI GEN PENYANDI ENDO-1,4-β-XILANASE ASAL …repository.unair.ac.id/25755/1/LABIQAH,...