Post on 02-Feb-2016
Rol del Laboratorio en el Rol del Laboratorio en el Diagnóstico y Prevención de la Diagnóstico y Prevención de la
Infección por Infección por CMV en pacientes CMV en pacientes
transplantadostransplantados
Bioquímica Mariela Bioquímica Mariela MerktMerkt
CMV: Características
Familia β Herpesviridae
DNA doble cadena
Virus envuelto
Es el virus herpes más grande (240 kb)
Infección por CMV
Es común, entre el 40-100% de la población mundial
adulta es seropositiva
Muchos individuos son infectados en la infancia, y en la
mayoría de la población no causa enfermedad con
significado clínico
CMR, 13,83-121,200
CMV
INFECCION PRIMARIA ESTADO LATENTE
oreceptores de transplantesreceptores de transplantes
o pacientes HIV positivos pacientes HIV positivos
oindividuos con sistema inmune individuos con sistema inmune
inmaduroinmaduro
oMujer embarazada: infección Mujer embarazada: infección
congenitacongenita
REACTIVACION
Enfermedad clínica Severa
JCM,40,746-752,2002
Small RNA and Large Virus NEJM;357,25. 2007
Infecciones post transplante
El impacto del CMV en los transplantados es considerado como la
más importante causa de morbi-mortalidad
JCM,40,746-752,2002
Enfermedad por CMV
Primoinfección: transferencia a través del órgano transplantado
Reactivación: Infección latente
Super infección: cepa distinta a la cepa latente
Efectos del CMV
DIRECTOS
INDIRECTOS
1.Directos:• Sindrome mononucleosis like• Leucopenia o trombocitopenia• Infección del injerto• Neumonitis• Infección de TGI• Encefalitis
NEJM;338,24;1998
Efectos del CMV
2.Indirectos: Acción inmunomoduladora:• Aumenta el riesgo de infecciones oportunistas
(bacterianas, fúngicas)• Aumenta el riesgo de injuria del órgano
transplantado (agudo y crónico)• Relacionado a ateroesclerosis del corazón
transplantado
NEJM;338,24;1998
Factores de riesgo para desarrollar enfermedad por CMV
Estatus del donante y del receptor del transplante
Del grado de inmunosupresión (reactivación)
La presencia de CMV en sangre (viremia) asociado
con alto riesgo de recurrencia o enfermedad futura
La carga viral de CMV
IHMF;2002
depende del tipo de transplante
TOS (excepto corazón y pulmón) ocurren severas infecciones del tracto GI con leucopenia y trombocitopenia; la neumonía es rara.
TMO y receptores de corazón y pulmón la neumonía es la secuela más frecuente y la más fatal.
La retinitis es rara en los transplantados
Presentación clínica
IHMF;2002
Manifestaciones Clínicas
www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm
Tratamiento
Manejo antiviral de CMV
Prevención Tratamiento
Profilaxis universal
Dirigida a todos los
transplantados
Profilaxis selectiva
Dirigida a pacientes de alto riesgo
Temprano
(preemptive)
Según resultado del test
empleado
Tratamiento tardío
Se aplica una vez iniciado los síntomas
PROFILAXIS
V: No se requieren test de laboratorio para iniciar la terapia
D. Riesgo de exposición a drogas en individuos de bajo riesgo
Desarrollo de resistencia
PRE-EMPTIVE
THERAPY
V: Exposición de pocos individuos a las drogas, al igual que el tiempo de exposición
D. Requiere test de elevada sensibilidad
IHMF;2002
Por qué medir la viremia?
Diagnóstico de enfermedad
Monitoreo de la replicación viral
Monitoreo de la terapia antiviral
Tratamiento
Pre-emptive therapy
Duración del tratamiento
Evaluar resistencia
IHMF;2002
Frecuencia de monitoreo para guiar pre-emptive therapy
Semanalmente monitorear viremia usando durante
los primero 3 meses luego del transplante o durante
más tiempo dependiendo de la intensidad de la
inmunosupresión.
www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm
Riesgo de infección según serología
D-/R- D-/R+ D+/R+ D+R-
Mayor riesgo
IHMF;2002
Ensayos para la detección de CMV
1.NO MOLECULARES: Cultivo convencional, shell vial, antigenemia pp65
2. MOLECULARES:
A.Cualitativos: PCR casera, PCR Amplicor, Nuclisens pp67 (NASBA)
B. Cuantitativos: Cobas Amplicor Monitor, Híbrido de captura, Quantiplex bDNA, PCR en tiempo real
IHMF;2002
NO MOLECULARES
IHMF;2002
pp65
Detección del Ag temprano pp65 por Inmunofluorescencia
Resultados: Se informa nº de células positivas/ 200.000 leucocitos
Pp65
V: Es más sensible que los métodos de cultivo viral
D: no es útil en periodos de neutropenia (se necesita un gran número de leucocitos)
Requiere del rápido procesamiento de las muestras, y su resultado puede ser subjetivo, dependiendo de la experiencia del observador.
Cultivo viral
insume mucho tiempo, menor reproducibilidad, menor sensibilidad
Comparando métodos
IHMF;2002
Recomendaciones para el inicio de pre-emptive therapy según pp65
TOS:
Más de 10 células positivas/200.000 células observadas
TMO:
Mayor o igual a 1-2 células positivas/200.000 células observadas
El cultivo viral y el shell vial no son adecuados para guiar pre-emptive
therapy IHMF;2002
MOLECULARES
Ensayos moleculares comerciales
para la detección de la infección por CMV
IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES
Nuclisens pp67 test Tipo de muestra: plasmaEl target de ácido nucleico es RNA y no DNA (indica
infección activa)Límite de detección: aprox 700 moléculas de RNADesventaja: No es cuantitativo
IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES
Híbrido de captura CMV DNA assay
New Microbiol 1996;19:193-201
Sensibilidad de 76-100%, comparado con el shell vial 74-97% y Amplicor CMV Monitor assay 88-100 %
2. METODOS MOLECULARES
Branched-DNA (bDNA)
IHMF;2002
Ventaja
Alta reproducibilidad
Desventaja
Necesita de un alto número de PMN 2.106
Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativa
Puede ser utilizada con plasma o Leucocitos
El test utiliza el Cobas amplicor
Buena especificidad
Estrecho rango dinámico y alta demanda de tiempo para su realización.
Rango: 400-1.105copias/mL plasma o por 5.106 Leucocitos
2. METODOS MOLECULARES
IHMF;2002
Usando plasma: 1000-5000 copias/mL en TOS
TMO cercano al límite de detección
para guiar pre-emptive therapy
IHMF;2002
Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativo
2. MOLECULARES
“Detección cualitativa de ADN por PCR” Tipo de muestra: Leucocitos
VentajasPermite detectar a muy bajo nivel de viremia (alta
sensibilidad)Permite monitorear la eficacia del tratamiento antiviralSensibilidad cercana al 100 %
DesventajasNo permite diferenciar infección latente de enfermedad
activa.
IHMF;2002
2. METODOS MOLECULARES
PCR en Tiempo Real
Combina la química de la PCR con sondas fluorescentes para detectar el producto amplificado en la misma
reacción, permitiendo además medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizada a cada momento, mostrando y registrando la cinética de la
reacción de la amplificación.
Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305
Hay diferentes fluoróforos para la detección
SYBER Green:
Fluoróforo no específico
Detecta todos DNA de doble cadena producidos durante la reacción de amplificación
(producto específico, inespecífico o dímeros de primer)
www.roche.com
Para discriminar si las muestras son positivas o negativas se realiza una curva de desnaturalización (“melting curve”) al final de la reacción
La reacción se calienta desde 50 hasta 95 ºC monitoreando continuamente la fluorescencia
Cada amplicon tiene un Tm característico, lo cual depende del: tamaño, contenido de CG y la secuencia.
Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305
PCR Cualitativa
Sitio de amplificación
Gen que codifica para la glicoproteina B del CMV
Se informa: Detectable o no detectable.
LightCycler: Roche
Lo realizamos en: Sangre enteraBiopsias
Control interno
LightCycler Roche
Tipo de muestra: Plasma
Se utlizan standares de cuantificación caseros
Control interno
PCR Cuantitativa
Rango lineal: 200-200.000.000 copias
Se informa: copias/mL de plasma
2000 copias/mL
Sitio de amplificación
Gen que codifica para la glicoproteina B del CMV
2. METODOS MOLECULARES
PCR en Tiempo Real
Ventajas
Altamente sensible y específica
Mejor relación costo-beneficio para determinar C.V
Permite predecir enfermedad
monitorear la terapia antiviral
Rápida 1 hora
Menor riesgo de contaminación cruzada
Aplicación de la Cinética de la carga viral en la identificación del paciente de
riesgo
Carga viral en la primera muestra positiva (carga viral inicial)
Velocidad de aumento de la carga viral
FACTOR DE RIESGO
Cinética de cargas virales (CMV)
0
500
1000
1500
0 3 17 24 31 38
Días
copias/ml
0
50000
100000
150000
200000
0 4 11 17
Días
copias/ml
0
20000
40000
60000
0 7 9 14 21 24 29
Días
copias/ml
Tipos de muestra
Cuantificación en distintos compartimentos celulares: sangre entera, plasma, Leucocitos, MN, PMN
Carga viral en sangre entera 0.67 log más elevada que en plasma
Carga viral en PMN y MN similar en pacientes con enfermedad activa
Uso de Leucocitos: carga viral baja, progresión rápida de la enfermedad (TMO).
Uso de plasma: progresión lenta de la enfermedad (HIV), neutropenia.
CMR, 1998,11:533-554
Qué muestra es la mas conveniente?
Evaluar cada caso en particular
•Tipo de paciente
•Metodología disponible
Todas las muestrasTodas las muestras
1. Proveen información pronóstico
2. Pueden usarse para el inicio preemptive therapy
3. Pueden medir respuesta a la terapia
Tratamiento
Ganciclovir IV:
•Tratamiento de 2-4 semanas en TOS
•Idem en TMO; con pneumonitis se agrega
gammaglobulina endovenosa. No hay estudios
randomizados; está basado en estudios comparativos
en un pequeño grupo de pacientes.
Valaciclovir
Foscarnet (resistencia al ganciclovir)
Cidofovir: en individuos con HIV/SIDA
NEJM;335,721-729, 1996
CONCLUSIONES
Se necesitarían estudios comparativos para evaluar y poder estandarizar los ensayos moleculares para los distintos transplantes
Se necesitarían estudios que validen la carga de CMV para iniciar las estrategias del tratamiento temprano en función a los resultados de la carga viral
CONCLUSIONES
La baja sensibilidad del cultivo convencional y del shell vial limitan su uso en el manejo de la infección por CMV en este tipo de pacientes
Es necesaria la utilización de métodos cuantitativos para establecer el riesgo de enfermedad y para monitoreo del tratamiento o detectar resistencia.
A pesar de que hay muchos puntos en el manejo del paciente
transplantado que aún no han sido dilucidados, y que falta mucho por
aprender, las herramientas diagnósticas con las cuales
contamos en el Laboratorio son de mucha utilidad para poder ayudar a este tipo de pacientes a prolongar
su vida
Muchas Gracias…
www.drstamboulian.com.ar