LAS RESPUESTAS DEL INTERFERÓN GAMMA DE CD4 Y CD8 DE CÉLULAS T SON CUANTITATIVAMENTE DIFERENTES E INDEPENDIENTES EL UNO DEL OTRO DURANTE LA INFECCIÓN PULMONAR POR MYCOBACTERIUM BOVIS BCG

ABSTRACTO

El tipo 1 respuesta inmune mediada por células T es esencial para la defensa del huésped contra la infección micobacteriana intracelular. De hecho, los anfitriones deficiente en tanto CD4 y las células T CD8 sucumben fácilmente a la infección por micobacterias (9, 13, 26, 28). Aunque las células T CD4 se cree tradicionalmente para desempeñar un papel protector importante, el CD4 y subconjuntos de células T CD8 han cada han encontrado para ser capaz de conferir protección inmune (4, 5, 20, 21, 25, 26), y una falta de células T CD8 resultados en debilitada defensa del huésped contra la infección micobacteriana   (9, 13, 26). El interferón gamma (IFN-γ) desempeña un papel fundamental en la inmunidad de las células T a través de sus efectos activadores potentes sobre Mycobacterium macrófagos infectados y formación de granulomas (2, 27,28). Aunque las células T, células NK y macrófagos son capaces de producir IFN-γ (6, 24), las células T CD4 y CD8 se considera que son las fuentes primarias de esta citocina durante la infección micobacteriana(20, 25, 26, 29) . La evidencia reciente sugiere que el IFN-γ, pero no actividad citotóxica, es necesaria para la protección inmune mediada por antimicobacteriana células T CD8 (3, 11, 20). Sin embargo, la contribución relativa de CD4 y subconjuntos de células T CD8 para IFN- respuestas durante la infección micobacteriana se ha mantenido en gran medida a determinar. Más específicamente, se queda por determinar si las células CD4 y CD8 T producen cantidades diferenciales de IFN-γ y, en caso afirmativo, si dicha producción de IFN-γ diferencial se atribuye a la diferencia de las frecuencias de antígeno específico de subconjuntos de células T, diferencial IFN- capacidades de secreción de gamma, o ambos. Además, también se entiende todavía no completamente si las células T CD4 y CD8 son dependientes uno del otro para su activación y respuestas de IFN-gamma durante la infección micobacteriana. Una mayor comprensión de la regulación y la capacidad de las células CD8 producción de células T IFN-γ durante la infección por micobacterias es importante en el desarrollo de estrategias profilácticas y terapéuticas eficaces para dirigirse a las células T CD8 en huéspedes de células T-CD4 deficientes, tales como la inmunodeficiencia humana por virus individuos infectados.

Hemos utilizado aquí un modelo de infección pulmonar por micobacterias para analizar y comparar las respuestas de IFN-γ en las células CD4 y CD8 de células T subconjuntos purificados cocultured con células presentadoras de antígeno (APC) mediante el uso de tanto inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y enzima inmunospot ligado (ELISPOT)

técnicas de ensayo para la determinación de proteína total IFN-γ en libertad en medios de cultivo, las frecuencias de células IFN-? secretoras, y la capacidad de secreción de IFN-gamma. También hemos investigado el papel de las células T CD4 en la activación de células T CD8 durante ambas infecciones micobacterianas primarias y secundarias.

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MATERIALES Y METODOSRatones.

Todas las cepas de ratones utilizados en el presente estudio tenían una H-2 b C57BL / 6 (B6) antecedentes genéticos. Mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-II) - / -, CD4 - / -, CD8 - / -, y RAG2 - / - ratones originalmente adquiridos de Taconic Farms y criados en casa y C57BL / 6 ratones adquirieron de Harlan Criadores ( Indianapolis, IN) se mantuvieron en las condiciones específicas libres de patógenos en la Instalación Animal Central de la Universidad de McMaster.

Infección por micobacterias pulmonar primaria y secundaria.

M. bovis BCG (cepa Connaught) se preparó como se ha descrito previamente (26, 28). Brevemente, el Mycobacterium cepa se cultiva en medios Middlebrook 7H9 (Difco) suplementado con enriquecimiento de Middlebrook OADC (Invitrogen), 20% de glicerol, y 0,05% de Tween 80 durante 10 a 15 días, y las muestras se dividieron en alícuotas y se almacenó a -70 ° C. BCG se lavó dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contiene 0,05% de Tween 80 y se resuspendió en PBS. A continuación, se pasó a través de una aguja de calibre 27 10 veces para dispersar grumos y después se diluyó con PBS hasta la concentración deseada antes de su uso. Un volumen de 40 l por ratón se utilizó para la inyección intratraqueal (IT). Para la infección BCG primaria, C57BL / 6 y MHC II - / - ratones fueron infectados con 0.5 millones de CFU de BCG. Para el desafío de micobacterias secundaria, los ratones infectados fueron desafiados con 1,5 millones UFC de BCG 6 semanas después de la infección primaria con BCG. El antibiótico isoniacida se administró a los ratones 3 semanas después de la infección primaria para minimizar el nivel de permanecer organismos vivos in vivo antes de la infección secundaria. Tabletas de isoniazida (100 mg) se disolvieron en 20 ml de PBS y se filtraron con filtros de 0,22 micras-de tamaño de poro antes de la inyección. Cada ratón fue inyectado intraperitonealmente con 50 mg de isoniazida / kg (peso corporal) por día durante 7 días consecutivos.

Aislamiento de esplenocitos enteros y células de ganglio linfático.

Ambos esplenocitos y células de ganglios linfáticos se aislaron y cultivaron como se ha descrito previamente (25, 26, 28). Brevemente, las células del bazo se liberan en medio RPMI por maceración bazos entre portaobjetos de vidrio. Después de lisis de glóbulos rojos

con un kit de eritrocitos de ratón de lisis (R & D Systems), los esplenocitos se filtraron y se resuspendieron en medio completo RPMI (cRPMI) (suero bovino fetal al 10%, 1% de penicilina-estreptomicina, un 1% L -glutamine). Células de los ganglios linfáticos fueron liberados de los ganglios linfáticos del mediastino en medios cRPMI.

La purificación de las células y cocultivo con APCs T CD4 y CD8.

Selecciones positivas de CD4 y las células T CD8 se llevaron a cabo con MACS utilizando imán VarioMAC, columnas LS, y CD4 o CD8a microperlas (Miltenyi Biotec) de acuerdo con el protocolo del fabricante, con la excepción de que el proceso de purificación se repitió una vez para las fracciones positivas en a fin de maximizar la pureza de la célula.En pocas palabras, por cada 10 7 se utilizaron esplenocitos totales o células de los ganglios linfáticos, 10 l de perlas magnéticas y 90 l de tampón MACS (0,5% de albúmina de suero bovino y EDTA 2 mM en PBS), y la mezcla se incubó a 4 ° C durante 15 minutos. El exceso de perlas se lavaron de distancia, y el total de células se volvieron a suspender a un 10 8 células / 500 l. Después las células se cargaron en una columna prelavado, y la fracción negativa se dejó fluir a través, seguido por tres lavados de 3 ml de la columna.Finalmente, la fracción positiva fue purgada con un émbolo y se centrifugó y se resuspendió en cRPMI para su uso posterior. La pureza de subconjuntos de células T purificadas fue consistentemente> 90%, determinada por fluorescencia de células activadas (FACS), y la viabilidad de estos subconjuntos fue> 95%.Todos los cultivos celulares se realizaron con placas de 96 pocillos de poliestireno de fondo plano. Se utilizó un volumen total de 250 l de medio cRPMI por pocillo, y las células se incubaron durante 3 días a 37 ° C.Sobrenadantes de cultivo celular (200 mu l) se recogieron de cada pocillo después de la incubación y se almacenaron a -20 ° C.

Para cocultivo de subconjuntos de células T purificadas y vehículos blindados, medio millón purificado CD4 o células T CD8 se cocultivaron con M. bovis APCs en un volumen total de 250 l BCG infectado-como se detalla anteriormente (29). Mycobacterium APCs infectados fueron siempre prepararon el día antes de la purificación de células T en placas macrófagos alveolares recién aisladas de los pulmones de ingenuo C57BL / 6 ratones en concentraciones de 4.000 células por pocillo en 100 l de penicilina-estreptomicina-libre de RPMI (suero bovino fetal al 10%, 1% L -glutamine) y se infectaron in vitro con el BCG vivo a una multiplicidad de infección de 40 CFU. Los pocillos de control incluyen las células CD4 o CD8 T solamente, APC no infectados, APC infectados, CD4 o células T CD8 cultivadas con APC no infectadas o células CD4 o CD8 T con BCG vivo, pero no hay vehículos blindados. Todos estos controles no produjo o niveles insignificantes de IFN-γ producción. Cocultivo se llevó a cabo durante 3 días antes de que se recogió el sobrenadante para la medición de citoquinas por ELISA.

Medición de la producción de IFN-γ por las células T CD4 y CD8 cultivadas.

Los niveles de IFN-gamma en los sobrenadantes de cultivo de células se evaluaron mediante kits de ELISA para IFN-γ murino (R & D Systems). La sensibilidad de detección fue de 2 pg / ml.

Determinación de la frecuencia de-micobacteriana específica de antígeno, IFN-γ liberadora de células T CD4 y CD8 mediante el ensayo ELISPOT.

El ensayo ELISPOT de IFN-gamma se llevó a cabo de acuerdo con el protocolo del fabricante con los anticuerpos de captura y detección suministrados monoclonales (MAb) y reactivos de desarrollo de color (R & D Systems) en placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (Millipore). La placa se recubrió con captura de anticuerpos que el día antes de chapado celular. Células CD4 o CD8 T (0,3 ó 0,15 millones de dólares) se cocultivaron con 0,2 millones de APCs (esplenocitos gamma-irradiado desde ingenuo C57BL / 6 ratones) y se estimularon con 2 g de Mycobacterium tuberculosis proteína de filtrado de cultivo (CFP) en un volumen total de 100 l de cRPMI por pocillo durante 1 día a 37 ° C (25). Los pocillos de control incluyen APC, APC además PPC; Las células CD4 o células T CD8 solo, CD4 o CD8 T con APC o células CD4 o CD8 T con el PPC, pero no APC. Todos estos controles generan un número mínimo de puntos de fondo que se restaron de los resultados positivos. Después del cultivo, la placa se incubó con anticuerpos de detección y se sometió a desarrollo de color de las manchas. IFN-gamma + manchas se cuantificaron, y la frecuencia de células IFN-? Secretoras se expresó como el porcentaje de IFN-γ + células entre el número total de células cultivadas en placas. Para determinar la capacidad de secreción de IFN-γ de T CD4 y CD8 subconjuntos, la cantidad de la producción de IFN-γ determinada por ELISA se dividió por el número de IFN-γ + células CD4 o CD8 T determinado mediante el ensayo de ELISPOT por cada millón de células cultivadas .

Determinación de la proliferación de células CD8 T por [3 H] timidina incorporación de ensayo.

Purificadas a partir de células T CD8 C57BL / 6 y MHC II - / - ratones después de la exposición micobacteriana secundaria se cultivaron como se describe anteriormente. A las 20 h antes de la terminación de la incubación de 3 días, 1 Ci de [3 H] timidina se añadió a cada pocillo. Los cultivos de células se sometieron entonces a la congelación y descongelación de una vez. El uso de un recolector de células, las células se lavaron, y sus contenidos se lisaron y se recogieron en placas de filtro de GFC (Perkin-Elmer). La radioactividad de los contenidos de células lisadas se midió con un lector de radiactividad Top Count.

Cell inmunotinción superficie y análisis FACS.

Todos los MAbs utilizados aquí se compraron de BD Pharmingen. Las células fueron bloqueadas durante la unión no específica de sus receptores Fc con anticuerpos anti-CD16 / CD32 durante 15 min y luego se tiñeron durante 30 min en hielo con las combinaciones apropiadas de los MAb conjugados con fluorocromo. Se utilizaron anticuerpos monoclonales conjugados con fluorocromo a CD3, CD4, CD8, CD44, CD45, CD25, CD62L y. Células sin teñir se utilizaron como control. Los datos fueron recogidos con FACScan, LSRII o FACSCanto (todo BD Biosciences) citómetros utilizando CellQuest o software FACSDiva fluyen y se analizaron con WinMDI o software FlowJo.

La transferencia de células T adoptivos.

Varios días antes de la transferencia de células T, el número deMycobacterium específicos de las células CD8 T en el bazo se predeterminado en C57BL infectada con BCG / 6 y MHC-II - / - ratones mediante ensayo ELISPOT de IFN-gamma. Esta información se utiliza para el cálculo de tal manera que RAG2 - / - ratones inmunodeficientes recibirá un número igual de células específicas de antígeno CD8 T aisladas de ambos infectados con BCG de tipo salvaje B6 y MHC-II - / -ratones. Purificadas a partir de células T CD8 C57BL infectada con BCG / 6 y MHC-II - / - ratones fueron inyectados por vía intravenosa en RAG2 - /

- ratones inmunodeficientes. Cada ratón destinatario ha recibido células T CD8 en un volumen de 200 a 300 l través de la vena de la cola.

El análisis estadístico.

El análisis estadístico se evaluó mediante el uso de software de hoja de cálculo Excel (Microsoft). Los datos se recogieron y se representan como la media de las muestras con o sin barra de error estándar. Siempre que sea aplicable, la significación estadística entre las diferencias se determinó con el Student t prueba. Un P valor de ≤0.05 se considera significativa.

RESULTADOSIFN-γ producción por los esplenocitos enteros y purificados subconjuntos CD4 y CD8 de células T durante la infección micobacteriana pulmonar.

Antes de examinar la cinética de CD4 y de células T respuestas de IFN-γ CD8, que examinó por primera vez la cinética de la producción de IFN-γ por esplenocitos enteros. No sólo el bazo servir como una ventana fiable con el tipo de pulmón 1 inmunidad después de la infección micobacteriana (25, 26, 28, 29), pero es una fuente rica de células T específicas de antígeno.   Esplenocitos se aislaron enteros en diversos momentos después pulmonar M. bovis BCG infección y se estimularon con M. tuberculosis PPC. El nivel de

IFN-γ se midió por ELISA. Los esplenocitos produjeron las mayores cantidades de IFN-γ a las 3 semanas después de la infección BCG, y los niveles de IFN-gamma respuestas disminuyeron marcadamente en las semanas 5 y 10 (Fig. (Fig.11).

FIG. 1.

Kinetic la producción de IFN-gamma por los linfocitos esplénicos enteros después de la infección micobacteriana pulmonar. C57BL / 6 ratones fueron infectados con M. bovis BCG para 3, 5, o 10 semanas.La cultura de esplenocitos se estimularon con M. tuberculosis PPC. El IFN-γ ...

Para comenzar a examinar la contribución relativa de cada subconjunto de células T a IFN-gamma respuestas en todo el esplenocitos, el mismo número de células T CD4 y CD8 purificados a partir de los esplenocitos enteros aislados en diversos momentos se analizó mediante cocultivo con Mycobacterium APCs infectados.La pureza de las células CD4 y CD8 T esplénicas aisladas utilizados para tal cocultivo fue consistentemente mayor que 90% según lo evaluado por FACS. Por ejemplo, las purezas de las células CD4 y CD8 T aisladas eran 92, 91, y 94% y 94, 92, y 95%, respectivamente, en las semanas 3, 5, y 10 (Fig. (Fig.22 y y3).3). Mediante el uso de ELISA, se encontraron células T CD4 para producir niveles mucho más altos de IFN-γ que en el mismo número de células T CD8 en todos los puntos de tiempo examinados tras la estimulación in vitro conMycobacterium infectado con-APC (Fig. (Fig.2) .2). CD4 células T aisladas a las 3 semanas después de la infección produjeron las mayores cantidades de IFN-γ, de acuerdo con altos niveles de respuestas IFN-? Por esplenocitos enteros en este momento (Fig. (Fig.11).

FIG. 2.

Comparación de la producción cinética de IFN-γ por CD4 y subconjuntos de células T CD8 después de la infección micobacteriana pulmonar. Mycobacterium infectados con C57BL / 6 ratones fueron sacrificados a los 3, 5, y 10 semanas. Células T CD4 y CD8 fueron purificados a partir de esplenocitos enteros ...

FIG. 3.

(A) Comparación de las frecuencias de antígeno específico, IFN-γ liberadora de células T CD4 y CD8. Las frecuencias de IFN + CD4 y IFN-γ + células CD8 fueron evaluados por IFN-gamma ELISPOT ensayo donde las células CD4 o CD8 purificados ...

Frecuencias y IFN-γ capacidad de secreción de células micobacterianas específicas de antígeno T CD4 y CD8 durante la infección pulmonar primaria.

Puesto que cantidades mayores de proteína IFN-γ medidos en sobrenadantes de cultivo de las células T CD4 pueden ser resultado de una mayor capacidad de producción de IFN-γ en una base por célula o de mayores frecuencias de células T específicas de antígeno o de ambos, se analizó la frecuencia de las micobacterias específicas de antígeno T CD4 y CD8 células mediante el uso de ensayo ELISPOT. En promedio, hubieron 0.3 a 0.5% de las células T CD4 IFN-γ siendo positiva entre la semana 3 y 10 en comparación a 0,1 a 0,2% de las células T CD8 siendo positivo (Fig. (Figura 3A).3A). Esto sugiere que un mayor número de células CD4 T específicas de antígeno cuenta, al menos en parte, por cantidades mucho mayores de proteína IFN-γ liberados a partir de cultivos de células T CD4 (Fig. (Fig.2).2). Por lo tanto, basado en el hecho de que siempre había el doble de células totales CD4 T como las células T CD8 en el bazo en varios momentos tal como se evaluó mediante análisis de FACS (datos no mostrados), claramente había muchas más células CD4 T específicas de antígeno por bazo que sus homólogos de células T CD8 en todos los puntos de tiempo examinados [por ejemplo, había (100 ± 4,0) x 10 3 y (40 ± 3,5) x 10 3 IFN-gamma + T CD4 células frente a (13 ± 0,2) 10 × 3y (13,5 ± 0,1) x 10 3 IFN-gamma + células T CD8 en las semanas 3 y 5, respectivamente].

Usando la información generada por los ensayos ELISA y ELISPOT, también se determinó la capacidad de secreción de IFN-γ relativo de células T CD4 y CD8 específicas de antígeno. Hemos encontrado que las células T CD4 IFN-γ-positivos tenían una capacidad mucho mayor secreción de IFN-γ que las células T CD8 IFN-gamma-positivo (Fig. (Figura 3b).3B). Esto sugiere que las células individuales específicas de antígeno T CD4 probable liberan más IFN-γ que sus homólogos de las células T CD8 individuales. Por lo tanto, no sólo no había un mayor número de células T CD4 IFN-gamma que producen, pero cada CD4 de células T activadas secretada IFN-γ más que cada célula CD8 T activado. Es de destacar que las células CD4 T aisladas a las 3 semanas producen mucho más IFN-γ que las

células T CD4 aislados en momentos posteriores (Fig. (Figura 2), 2), y sin embargo, la frecuencia de células CD4 T específicas de antígeno en las semanas 3 fue similar a los de puntos de tiempo posteriores (Fig.(figura 3A),3A), lo que sugiere que mayor producción de IFN-γ por las células T CD4 en las semanas 3 era probablemente debido a la activación de células T más pronunciada.

Papel de las células CD4 T en la activación de células T CD8 y las respuestas de IFN-gamma durante la infección micobacteriana pulmonar primaria.

Se sabe que CD4 y subconjuntos de células T CD8 pueden afectar a la activación de cada uno en un número de modelos de enfermedades infecciosas (14, 19). Para investigar el potencial efecto regulador recíproco de subconjuntos de células T en las respuestas de cada uno de IFN-γ, que examinó por primera vez las respuestas de células T CD4 en infectada CD8 ratones de células T deficientes en 3 o 12 semanas después de la infección. Tanto la producción de IFN-γ y la frecuencia de células CD4 T específicas de antígeno no se vieron afectados por la falta de células T CD8 (datos no mostrados). Para investigar si se requieren células T CD4 para la activación de las células T óptima CD8, MHC-II-deficiente (MHC-II - / -) ratones fueron infectados con micobacterias, y las células T CD8 fueron purificados en diversos momentos y se compararon con los aislados de B6 ratones de tipo salvaje infectados. En comparación con CD4-deficiente (CD4 - / -)ratones, MHC-II - / - ratones representan "más limpia" y mejores anfitriones de células T con deficiencia de CD4 para el estudio de las respuestas de células T CD8 desde CD4 - / - se encontraron ratones para desarrollar restringidas por MHC-II aberrante CD8 + y CD4 - / CD8 - poblaciones de células T (12, 22). Por lo tanto, MHC-II - / - ratones se utiliza como un anfitrión o principal herramienta CD4 de células T deficientes en nuestro estudio. Hemos encontrado que a las 3 semanas, el nivel de producción de IFN-γ por las células T CD8 de MHC-II - / - ratones fue comparable a la de tipo salvaje las células T CD8, mientras que en los últimos tiempos parece aún mayor por las células T CD8 en MHC-II - / - ratones que en los ratones B6 de tipo salvaje (Fig. (figura 4A).4A). Además, la frecuencia de las células CD8 T específicas de antígeno examinados en diversos puntos temporales también fue similar entre los CD4 de las células T de tipo salvaje y deficientes hosts (Fig. (Figura 4B).4B). Capacidad de secreción de IFN-γ de las células T CD8 en las células CD4 anfitriones de células T deficientes se encontró que era incluso mayor en las semanas 5 y 10 (Fig. (Figura 4c), 4C), lo que explica los niveles algo más altos de IFN- la producción de γ por estas células en los momentos posteriores (Fig.(figura 4a).4A). Resultados similares también se obtuvieron con las células T CD8 purificados a partir de ratones de CD4 deficientes infectados (datos no mostrados). Tras el examen de la activación de células T y los marcadores de superficie de memoria CD45, CD25, CD44, y CD62L, se encontró que el porcentaje de células CD3 + CD8 + CD45 + o CD3 + CD8 + CD25 + (activación), CD3 + CD8 + / CD44 + (memoria efectora / activación), o CD3 + CD8 + / CD44 + CD62L + (memoria central) las células T del

bazo de infectada MHC-II - / - ratones fue comparable a la de ratones de tipo salvaje infectados (Tabla ( Tabla 1).1). Aunque hubo diferencias pequeñas pero significativas en la proporción de CD8 y CD45 + células T CD8, la intensidad de fluorescencia media, que tiene en consideración de intensidad media tinción fluorescente de todas las células positivas, no es diferente para todos los grupos de comparación entre MHC- II - / - y ratones B6 (datos no mostrados). Estos resultados juntos sugieren que durante la infección micobacteriana CD4 ayuda de células T no es necesaria para la diferenciación y activación de las células T CD8.

FIG. 4.

(A) Comparación de la producción cinética de IFN-γ por las células T CD8 generados en hosts CD4 de células T-eficientes y CD4 de células T deficientes después de la infección micobacteriana pulmonar. C57BL / 6 de tipo salvaje y MHC-II - / - ratones fueron infectados con ...

MESA 1.

Comparación de los fenotipos de activación de CD3 + células T CD8 + de tipo salvaje y MHC-II - /

- ratones

Habiendo demostrado que la falta de células T CD4 tuvo poco efecto sobre la frecuencia y el IFN-γ producción de células T CD8 específicas de antígeno, se analizó el nivel de infección micobacteriana en ratones CD4 de células T deficientes después de la infección micobacteriana pulmonar. De interés, en las semanas 3 y 5 después de la infección el nivel de infección micobacteriana pulmonar en MHC-II - / - ratones fue similar o incluso menor que en ratones B6 de tipo salvaje (Fig. (Fig.5),5), una observación de acuerdo con nuestros resultados anteriores (26). Sin embargo, aunque el nivel de infección se redujo marcadamente en el pulmón de ratones B6 de tipo salvaje en la semana 10, se mantuvo alta en los pulmones de MHC-II - / -ratones (Fig. (Fig.5).5). Tendencias similares se encuentran también en los bazos de MHC-II - / - y ratones B6 (datos no mostrados). Tales cargas bacterianas altas en los pulmones de MHC-II - / - ratones pueden haber contribuido a las

respuestas estadística y significativamente mayor de IFN-γ por las células T CD8 de MHC-II - / - ratones en la semana 10 (Fig. (Figura 4A ).4A). Estos datos sugieren que las células CD8 T activadas en la ausencia de células T CD4 podrían así controlar la infección micobacteriana primaria al menos inicialmente.

FIG. 5.

Comparación de los niveles de infección micobacteriana en los pulmones de ratones C57BL / 6 y MHC-II - / - ratones. Los ratones fueron infectados con M. bovis BCG para 3, 5, o 10 semanas. Los títulos de micobacterias CFU en los pulmones homogeneizados fueron determinadas por la formación de colonias ...

Papel de las células CD4 T en la activación de células T CD8 y las respuestas de IFN-gamma durante la infección micobacteriana pulmonar secundaria.

Habiendo demostrado que la falta de células T CD4 tuvo poco efecto sobre las respuestas de células T CD8-IFN-gamma durante la infección micobacteriana primaria, se investigó si esto también podría ser cierto de las respuestas de células T CD8 después de la infección micobacteriana pulmonar secundaria. Con este fin, los ratones de tipo salvaje B6 y MHC-II-deficientes fueron infectados con micobacterias, y en la semana 3 fueron tratados diariamente con el antibiótico isoniacida antimicobacteriana por un período de 7 días para reducir la infección primaria en ambos B6 y MHC- II - / - ratones. Este régimen terapéutico fue encontrado para reducir eficazmente el nivel de infección por cerca de 150 veces en el pulmón (785.250 a 900.000 CFU sin isoniazida contra 5.400 a 6.975 CFU con el tratamiento con isoniazida) y para eliminar la infección en el bazo en ambas cepas de ratón cuando se evaluó poco antes a la reinfección. En la semana 6 después de la infección primaria, estos ratones fueron reinfectados con una alta dosis de micobacterias. Los ratones se sacrificaron 7 días después de la infección secundaria, y las células T CD8 se purificaron a partir de los bazos y los ganglios linfáticos locales de drenaje y se analizaron para sus actividades después de la infección micobacteriana secundaria. Purificada células T CD8 de infectarse MHC-II - / - ratones proliferaron ex vivo a un ritmo similar o incluso superior a la de las células de los ratones B6 de tipo salvaje (Fig. (Figura 6a).6A). Además, la producción de IFN-γ por las células T CD8 y las frecuencias de específicas de antígeno, las células T CD8 IFN-? Productoras de MHC-II - / - ratones también fueron similares o incluso mayores que los de B6 de tipo salvaje T CD8 células en el bazo (Fig. (figura 6B).6B). La capacidad de secreción de IFN-γ de las células CD8 T de MHC-II - / - ratones se encontró que era mayor que la de los homólogos de tipo salvaje (Fig. (Figura 6B).6B). Ambos también se encontraron las frecuencias de las células T CD8-gamma productoras de IFN y

la capacidad de secreción de IFN-γ de estas células para ser casi idéntica entre los de tipo salvaje B6 y CD4-deficiente (CD4- / -) ratones (datos no mostrados) . Que la capacidad de secreción de IFN-γ de las células CD8 T de MHC-II- / - ratones fue mayor que la de CD4 - /

- ratones, con relación a B6 de control de tipo silvestre, probablemente refleja una mayor medida de la compensación por las células T CD8 de MHC-II - / - ratones ya que estas células son totalmente dependientes de la vía de MHC-I para la activación. En comparación, CD4 - / - ratones desarrollan restringidas por MHC-II aberrante CD8 + y CD4 - CD8 - poblaciones de células T (12, 22). También se examinaron los fenotipos de activación y / o de la memoria de las células T CD8 de infectarse MHC-II - / - ratones y encontramos que la proporción de memoria efector células T CD8 (CD44 +CD62L -) fue ligeramente

superior tanto en el bazo y en el ganglios linfáticos de drenaje de MHC-II - / - ratones (datos no presentados). Los títulos de micobacterias en el pulmón a los 7 días después de la exposición micobacteriana secundario también eran muy similares entre los de tipo salvaje B6 y MHC-II - / - o CD4 - / -

ratones (datos no presentados). Estos datos en conjunto sugieren que la falta de células T CD4 no afecta negativamente respuestas de activación de células T CD8-IFN-gamma y tras la exposición micobacteriana secundaria en huéspedes infectados previamente.

FIG. 6.

Comparación de las respuestas secundarias de la memoria las células T CD8 generados en huéspedes CD4 de células T CD4-eficiente y de células T deficientes. C57BL / 6 de tipo salvaje y MHC-II - / - ratones fueron infectados con micobacterias y a las 6 semanas después de la infección fueron desafiados ...

Protección inmune por las células CD8 T activadas generadas en el entorno de células T con deficiencia de CD4.

Habiendo mostrado que la falta de células T CD4 no resultó en cualquier deficiencia en tanto la activación de células T y IFN-gamma respuestas primarias y secundarias CD8, se examinó si las células CD8 T cebadas en ausencia de células T CD4 podrían proporcionar

protección inmune contra desafío de micobacterias en la transferencia adoptiva a un huésped inmunodeficiente. Con este fin, MHC-II - / - y de tipo salvaje ratones B6 fueron infectados con M. bovis BCG, y las células T CD8 esplénica fueron purificados a las 6 semanas. Las frecuencias de las células T CD8 específicas de antígeno fueron predeterminados por ensayo ELISPOT, y esta información se utilizó para permitir la transferencia de un número igual de células T CD8 específicas de antígeno derivados tanto de tipo salvaje B6 y MHC-II - / - ratones . Las células T CD8 purificados se transfirieron por vía intravenosa a naive inmunodeficiente RAG2 - / - ratones, que después se desafió con M.bovis BCG. El nivel de infección micobacteriana en los pulmones y bazos de Mycobacterium infectados con RAG2 - / - ratones se determinó a 5 semanas después del desafío. Las células T CD8 de imprimación por BCG MHC-II - / - ratones ofrecen una protección significativa a RAG2 desafiado-BCG - / - ratones, tanto en los pulmones y el bazo, y este nivel de protección fue incluso mejor que el alcanzado por las células T CD8 de imprimación por BCG C57BL / 6 ratones (Fig. (Fig.7).7). La mejor protección proporcionada por las células T CD8 de MHC-II - / - ratones fue probablemente debido a su mayor capacidad de producción de IFN-γ y respuestas secundarias (Fig. (Figura 4c4C y and6).6). Aunque una evaluación en un punto de tiempo adicional más allá de 5 semanas después de la exposición micobacteriana será útil, nuestros datos actuales apoyan la conclusión de que las células T CD8 generan en un entorno de CD4 de células T deficientes son por lo menos tan capaz de protección como los generados en un anfitrión de tipo salvaje (protección en un solo punto de tiempo, de 4 a 6 semanas, después del desafío, se utiliza también con frecuencia en estudios de vacunas como un índice del potencial de protección de la endógeno o células T específicas de antígeno transferidos en cuestión).

FIG. 7.

La protección inmune de los ratones inmunodeficientes por las células T CD8 adoptivamente transferidas generados en Mycobacteriuminfectados con C57BL / 6 de tipo salvaje y MHC-II - /

- ratones. B6 y MHC-II - / - ratones fueron infectados con micobacterias durante 6 semanas ...

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DISCUSIÓN

Tipo 1 citocina IFN-γ inmunológico juega un papel fundamental en la defensa del huésped antimicobacteriana través de sus efectos activadores potentes sobre actividades micobactericidas macrófagos, incluyendo la producción de NO (2, 22, 27). Aunque las células, incluyendo las células T, células NK y macrófagos son capaces de producir IFN-γ (6, 24), las células T CD4 se cree que son la fuente celular principal de esta citocina durante la infección micobacteriana.   Además de sus actividades citotóxicas de linfocitos T, las células T CD8 también son capaces de producir IFN-γ (19). De hecho, estudios recientes han demostrado claramente que tanto las células CD4 y CD8 contribuyen a la inmunidad contra la infección micobacteriana. En este sentido, el papel inmunoprotectora por las células T CD8 es principalmente a través de su capacidad de producir IFN-γ y no sus actividades citotóxicas de linfocitos T (3, 10, 11, 20). Sin embargo, ha habido una falta de estudios que comparan directamente los dos subconjuntos de células T por sus contribuciones relativas a IFN- respuestas durante la infección por micobacterias pulmonar. Además, aún no está completamente entendido si la ausencia de un subconjunto de células T tiene un impacto en las funciones de activación y efectoras de la otra (diecisiete - diecinueve). Es particularmente relevante para investigar si se requieren células CD4 para las respuestas primarias y secundarias óptimas de las células T CD8. Las respuestas a estas preguntas pueden mejorar nuestra comprensión de la biología de las células T y ayudar con el desarrollo de vacunas de micobacterias antipulmonary y inmunoterapia que pretenden activar las células T CD8 en las personas infectadas por el virus de inmunodeficiencia humana que pueden sufrir diferentes grados de deficiencia de CD4 de células T .

Aunque nosotros y otros han demostrado previamente que las células tanto CD4 y / o CD8 T en ratones de tipo salvaje son capaces de la secreción de IFN-γ en el curso de la infección micobacteriana, se obtuvo la evidencia de respuestas IFN-gamma en estos subconjuntos de células T principalmente mediante el examen de las poblaciones de células mononucleares totales sin purificar con una sola técnica, tales como ARNm de detección, la inmunotinción intracelular de citoquinas, o ensayo ELISPOT (7, 16, 23, 25, 29). También se usaron métodos similares para examinar respuestas de activación de células T CD8 y IFN-gamma en ratones CD4 T-célula o MHC-II-deficiente (1, 15, 25, 26). Estos enfoques lamentablemente sólo proporcionan información cualitativa y no permiten una evaluación cuantitativa y la comparación. Por ejemplo, porcentajes similares de IFN gamma secretoras-CD4 y CD8 de células T subconjuntos determinados en el total de células mononucleares mediante el uso de citoquina intracelular inmunotinción técnicas no muestran si estos subconjuntos de células T pueden secretar cantidades similares de IFN-γ o si hay números similares de células T CD4 y CD8 IFN-? secretoras en el órgano examinaron. Una evaluación cuantitativa adecuada implica la purificación de CD4 y de

células T CD8 subconjuntos, el cocultivo de las células T purificadas con APCs micobacteriana-cargadas con antígeno, y el análisis de las respuestas de IFN-γ de células T mediante el uso de una combinación de varias técnicas para la cuantificación de la producción total de IFN-γ, las frecuencias de células T IFN-? secretoras, y las capacidades de la secreción de IFN-γ sobre una base por célula.

Utilizamos aquí un modelo de infección por micobacterias pulmonares con vivas atenuadas M. bovis BCG y, en diversos momentos después de la infección, se cuantificó y comparó las respuestas de IFN-γ en las células CD4 y CD8 de células T subconjuntos purificados cocultured con Mycobacterium infectados con APC mediante el uso de ambas técnicas ELISA y ELISPOT para la determinación de proteína total IFN-γ liberado en medios de cultivo, las frecuencias de células IFN-? secretoras y capacidades de secreción de IFN-gamma.Encontramos que las células CD4 T en el momento reestimulación antígeno son capaces de liberar mucho más IFN-γ que en el mismo número de células T CD8 en diversos momentos después de la infección micobacteriana. Los niveles más altos de producción de IFN-γ por las células T CD4 son atribuidos tanto a un mayor número de células CD4 T específicas de antígeno y a la mayor capacidad de secreción de IFN-γ de estas células. Además, demostró que la falta de células T CD4 no afecta negativamente las respuestas de células T primarias o secundarias de IFN-γ CD8, como se demuestra por la producción de IFN-γ y la frecuencia de las células T CD8 IFN-gamma secretoras específicas de antígeno. Nuestros resultados establecen que mientras que las células tanto T CD4 y CD8 son capaces de IFN-γ producción, los primeros representan un mucho mayor fuente celular de IFN-γ. Por otra parte, durante la infección micobacteriana, la activación de células T CD8 es independiente de la activación de células T CD4.

De hecho, encontramos que no sólo las células T CD8 activadas en ausencia de células T CD4 no demostraron una respuesta de IFN-γ deteriorada pero también montado un nivel algo más alto de la respuesta de IFN-γ, sobre todo en momentos posteriores después de la infección, debido principalmente al aumento de la capacidad de secreción de IFN-γ. Estos hallazgos sugieren que primero activación de células T CD8 en la infección micobacteriana es independiente de las células T CD4 y segundo que, tal vez por la compensación por la falta de células T CD4, células T CD8 pueden someterse a un mayor grado de proliferación y activación. En efecto, hemos detectado células de dos a tres veces más esplénicas totales T CD8 en MHC-II - / - ratones que en los ratones B6 de tipo salvaje en diversos momentos después de la infección (datos no presentados). Este hecho subraya además la importancia de comparar las respuestas de células T CD8 en de tipo salvaje y CD4 de células T hosts deficientes mediante el uso de métodos cuantitativos, es decir, el uso de CD4 y de células T CD8 subconjuntos purificados y múltiples inmunoensayos, como hemos mostrado En el presente estudio. Aunque los mecanismos de este aún no se han comprendido, la falta de subconjuntos T reguladoras CD4 puede contribuir a la activación de las células T CD8

aumentada (8). Mediante el uso de un modelo de la vacunación BCG parenteral con ratones de CD4 deficiente y un método de inmunotinción-IFN γ intracelular, también hemos observado recientemente una mayor proporción de células CD8 T activadas, aunque tales células CD8 T activadas muestra inicialmente un movimiento retrasado desde linfático de drenaje los nodos a los sitios sistémicos (25). Cabe señalar que, en el presente estudio, se hizo posible la comparación cuantitativa cinética detallada en las respuestas de IFN-γ de CD4 y subconjuntos de células T CD8 en un modelo mediante el uso de virus vivos atenuados M. bovis BCG y, debido a algunas diferencias entre BCG y M. la tuberculosis, el estudio no tenía la intención de examinar completamente los acontecimientos en la infección de tuberculosis pulmonar. En estudios futuros, sería de interés comparar la activación de células T CD8 tanto en M. bovis BCG y M. tuberculosis infectados con ratones. Sin embargo, para apoyar nuestras conclusiones actuales, hemos demostrado recientemente que las células T CD8 IFN-gamma-liberación activados en las células CD4 - /

- ratones mediante la exposición BCG fueron capaces de proporcionar robusta inmunoprotección desde pulmonar M. tuberculosis desafío (25). Además, aunque de nuevo sólo se utilizaron los métodos cualitativos, estudios previos han mostrado también que el porcentaje de células T CD8 IFN-γ-positivas en los pulmones o los órganos periféricos de MHC-II - / - o CD4 - / - ratones fue similar a que en los de tipo salvaje anfitriones después de M. tuberculosis infección (1, 17, 25). En el presente estudio, hemos demostrado, además, que las células T CD8 activadas en ausencia de células T CD4, después de la transferencia adoptiva a inmunodeficientes RAG2 - / - ratones, podrían conferir protección contra desafío micobacteriano tanto en el pulmón y en el bazo. De nota, como control, las células T CD8 generados en ratones de tipo salvaje, después de la transferencia adoptiva, confirieron protección en el bazo pero no en el pulmón. Esto es probablemente debido al hecho de que, como hemos mostrado, las células T CD8 generan en un entorno de CD4 deficientes se sometió a un mayor grado de activación que los generados en un entorno CD4-eficiente de tipo salvaje y que el número de antígeno específico- las células T CD8 transferidos era limitado. Nuestro hallazgo es, de hecho, de acuerdo con un informe de Feng y Britton que purifica las células T CD8 de tipo salvaje anfitriones, después de la transferencia a ratones inmunodeficientes, siempre mucho menos protección contra M. bovis desafío BCG en el pulmón que en el bazo (5).

Creemos que nuestros resultados mejoran nuestra comprensión de los mecanismos de activación de las células T y las contribuciones relativas de CD4 y subconjuntos de células T CD8 para organizar la defensa contra la infección por micobacterias. Tal comprensión ayudará con el desarrollo futuro de las vacunas antimicobacterianos y terapéutica.