Rol del Laboratorio en el Rol del Laboratorio en el Diagnóstico y Prevención de la Diagnóstico y Prevención de la

Infección por Infección por CMV en pacientes CMV en pacientes

transplantadostransplantados

Bioquímica Mariela Bioquímica Mariela MerktMerkt

CMV: Características

Familia β Herpesviridae

DNA doble cadena

Virus envuelto

Es el virus herpes más grande (240 kb)

Infección por CMV

Es común, entre el 40-100% de la población mundial

adulta es seropositiva

Muchos individuos son infectados en la infancia, y en la

mayoría de la población no causa enfermedad con

significado clínico

CMR, 13,83-121,200

CMV

INFECCION PRIMARIA ESTADO LATENTE

oreceptores de transplantesreceptores de transplantes

o pacientes HIV positivos pacientes HIV positivos

oindividuos con sistema inmune individuos con sistema inmune

inmaduroinmaduro

oMujer embarazada: infección Mujer embarazada: infección

congenitacongenita

REACTIVACION

Enfermedad clínica Severa

JCM,40,746-752,2002

Small RNA and Large Virus NEJM;357,25. 2007

Infecciones post transplante

El impacto del CMV en los transplantados es considerado como la

más importante causa de morbi-mortalidad

JCM,40,746-752,2002

Enfermedad por CMV

Primoinfección: transferencia a través del órgano transplantado

Reactivación: Infección latente

Super infección: cepa distinta a la cepa latente

Efectos del CMV

DIRECTOS

INDIRECTOS

1.Directos:• Sindrome mononucleosis like• Leucopenia o trombocitopenia• Infección del injerto• Neumonitis• Infección de TGI• Encefalitis

NEJM;338,24;1998

Efectos del CMV

2.Indirectos: Acción inmunomoduladora:• Aumenta el riesgo de infecciones oportunistas

(bacterianas, fúngicas)• Aumenta el riesgo de injuria del órgano

transplantado (agudo y crónico)• Relacionado a ateroesclerosis del corazón

transplantado

NEJM;338,24;1998

Factores de riesgo para desarrollar enfermedad por CMV

Estatus del donante y del receptor del transplante

Del grado de inmunosupresión (reactivación)

La presencia de CMV en sangre (viremia) asociado

con alto riesgo de recurrencia o enfermedad futura

La carga viral de CMV

IHMF;2002

depende del tipo de transplante

TOS (excepto corazón y pulmón) ocurren severas infecciones del tracto GI con leucopenia y trombocitopenia; la neumonía es rara.

TMO y receptores de corazón y pulmón la neumonía es la secuela más frecuente y la más fatal.

La retinitis es rara en los transplantados

Presentación clínica

IHMF;2002

Manifestaciones Clínicas

www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm

Tratamiento

Manejo antiviral de CMV

Prevención Tratamiento

Profilaxis universal

Dirigida a todos los

transplantados

Profilaxis selectiva

Dirigida a pacientes de alto riesgo

Temprano

(preemptive)

Según resultado del test

empleado

Tratamiento tardío

Se aplica una vez iniciado los síntomas

PROFILAXIS

V: No se requieren test de laboratorio para iniciar la terapia

D. Riesgo de exposición a drogas en individuos de bajo riesgo

Desarrollo de resistencia

PRE-EMPTIVE

THERAPY

V: Exposición de pocos individuos a las drogas, al igual que el tiempo de exposición

D. Requiere test de elevada sensibilidad

IHMF;2002

Por qué medir la viremia?

Diagnóstico de enfermedad

Monitoreo de la replicación viral

Monitoreo de la terapia antiviral

Tratamiento

Pre-emptive therapy

Duración del tratamiento

Evaluar resistencia

IHMF;2002

Frecuencia de monitoreo para guiar pre-emptive therapy

Semanalmente monitorear viremia usando durante

los primero 3 meses luego del transplante o durante

más tiempo dependiendo de la intensidad de la

inmunosupresión.

www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm

Riesgo de infección según serología

D-/R- D-/R+ D+/R+ D+R-

Mayor riesgo

IHMF;2002

Ensayos para la detección de CMV

1.NO MOLECULARES: Cultivo convencional, shell vial, antigenemia pp65

2. MOLECULARES:

A.Cualitativos: PCR casera, PCR Amplicor, Nuclisens pp67 (NASBA)

B. Cuantitativos: Cobas Amplicor Monitor, Híbrido de captura, Quantiplex bDNA, PCR en tiempo real

IHMF;2002

NO MOLECULARES

IHMF;2002

pp65

Detección del Ag temprano pp65 por Inmunofluorescencia

Resultados: Se informa nº de células positivas/ 200.000 leucocitos

Pp65

V: Es más sensible que los métodos de cultivo viral

D: no es útil en periodos de neutropenia (se necesita un gran número de leucocitos)

Requiere del rápido procesamiento de las muestras, y su resultado puede ser subjetivo, dependiendo de la experiencia del observador.

Cultivo viral

insume mucho tiempo, menor reproducibilidad, menor sensibilidad

Comparando métodos

IHMF;2002

Recomendaciones para el inicio de pre-emptive therapy según pp65

TOS:

Más de 10 células positivas/200.000 células observadas

TMO:

Mayor o igual a 1-2 células positivas/200.000 células observadas

El cultivo viral y el shell vial no son adecuados para guiar pre-emptive

therapy IHMF;2002

MOLECULARES

Ensayos moleculares comerciales

para la detección de la infección por CMV

IHMF;2002

2. METODOS MOLECULARES

Nuclisens pp67 test Tipo de muestra: plasmaEl target de ácido nucleico es RNA y no DNA (indica

infección activa)Límite de detección: aprox 700 moléculas de RNADesventaja: No es cuantitativo

IHMF;2002

2. METODOS MOLECULARES

Híbrido de captura CMV DNA assay

New Microbiol 1996;19:193-201

Sensibilidad de 76-100%, comparado con el shell vial 74-97% y Amplicor CMV Monitor assay 88-100 %

2. METODOS MOLECULARES

Branched-DNA (bDNA)

IHMF;2002

Ventaja

Alta reproducibilidad

Desventaja

Necesita de un alto número de PMN 2.106

Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativa

Puede ser utilizada con plasma o Leucocitos

El test utiliza el Cobas amplicor

Buena especificidad

Estrecho rango dinámico y alta demanda de tiempo para su realización.

Rango: 400-1.105copias/mL plasma o por 5.106 Leucocitos

2. METODOS MOLECULARES

IHMF;2002

Usando plasma: 1000-5000 copias/mL en TOS

TMO cercano al límite de detección

para guiar pre-emptive therapy

IHMF;2002

Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativo

2. MOLECULARES

“Detección cualitativa de ADN por PCR” Tipo de muestra: Leucocitos

VentajasPermite detectar a muy bajo nivel de viremia (alta

sensibilidad)Permite monitorear la eficacia del tratamiento antiviralSensibilidad cercana al 100 %

DesventajasNo permite diferenciar infección latente de enfermedad

activa.

IHMF;2002

2. METODOS MOLECULARES

PCR en Tiempo Real

Combina la química de la PCR con sondas fluorescentes para detectar el producto amplificado en la misma

reacción, permitiendo además medir durante la amplificación la cantidad de ADN sintetizada a cada momento, mostrando y registrando la cinética de la

reacción de la amplificación.

Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305

Hay diferentes fluoróforos para la detección

SYBER Green:

Fluoróforo no específico

Detecta todos DNA de doble cadena producidos durante la reacción de amplificación

(producto específico, inespecífico o dímeros de primer)

www.roche.com

Para discriminar si las muestras son positivas o negativas se realiza una curva de desnaturalización (“melting curve”) al final de la reacción

La reacción se calienta desde 50 hasta 95 ºC monitoreando continuamente la fluorescencia

Cada amplicon tiene un Tm característico, lo cual depende del: tamaño, contenido de CG y la secuencia.

Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305

PCR Cualitativa

Sitio de amplificación

Gen que codifica para la glicoproteina B del CMV

Se informa: Detectable o no detectable.

LightCycler: Roche

Lo realizamos en: Sangre enteraBiopsias

Control interno

LightCycler Roche

Tipo de muestra: Plasma

Se utlizan standares de cuantificación caseros

Control interno

PCR Cuantitativa

Rango lineal: 200-200.000.000 copias

Se informa: copias/mL de plasma

2000 copias/mL

Sitio de amplificación

Gen que codifica para la glicoproteina B del CMV

2. METODOS MOLECULARES

PCR en Tiempo Real

Ventajas

Altamente sensible y específica

Mejor relación costo-beneficio para determinar C.V

Permite predecir enfermedad

monitorear la terapia antiviral

Rápida 1 hora

Menor riesgo de contaminación cruzada

Aplicación de la Cinética de la carga viral en la identificación del paciente de

riesgo

Carga viral en la primera muestra positiva (carga viral inicial)

Velocidad de aumento de la carga viral

FACTOR DE RIESGO

Cinética de cargas virales (CMV)

0

500

1000

1500

0 3 17 24 31 38

Días

copias/ml

0

50000

100000

150000

200000

0 4 11 17

Días

copias/ml

0

20000

40000

60000

0 7 9 14 21 24 29

Días

copias/ml

Tipos de muestra

Cuantificación en distintos compartimentos celulares: sangre entera, plasma, Leucocitos, MN, PMN

Carga viral en sangre entera 0.67 log más elevada que en plasma

Carga viral en PMN y MN similar en pacientes con enfermedad activa

Uso de Leucocitos: carga viral baja, progresión rápida de la enfermedad (TMO).

Uso de plasma: progresión lenta de la enfermedad (HIV), neutropenia.

CMR, 1998,11:533-554

Qué muestra es la mas conveniente?

Evaluar cada caso en particular

•Tipo de paciente

•Metodología disponible

Todas las muestrasTodas las muestras

1. Proveen información pronóstico

2. Pueden usarse para el inicio preemptive therapy

3. Pueden medir respuesta a la terapia

Tratamiento

Ganciclovir IV:

•Tratamiento de 2-4 semanas en TOS

•Idem en TMO; con pneumonitis se agrega

gammaglobulina endovenosa. No hay estudios

randomizados; está basado en estudios comparativos

en un pequeño grupo de pacientes.

Valaciclovir

Foscarnet (resistencia al ganciclovir)

Cidofovir: en individuos con HIV/SIDA

NEJM;335,721-729, 1996

CONCLUSIONES

Se necesitarían estudios comparativos para evaluar y poder estandarizar los ensayos moleculares para los distintos transplantes

Se necesitarían estudios que validen la carga de CMV para iniciar las estrategias del tratamiento temprano en función a los resultados de la carga viral

CONCLUSIONES

La baja sensibilidad del cultivo convencional y del shell vial limitan su uso en el manejo de la infección por CMV en este tipo de pacientes

Es necesaria la utilización de métodos cuantitativos para establecer el riesgo de enfermedad y para monitoreo del tratamiento o detectar resistencia.

A pesar de que hay muchos puntos en el manejo del paciente

transplantado que aún no han sido dilucidados, y que falta mucho por

aprender, las herramientas diagnósticas con las cuales

contamos en el Laboratorio son de mucha utilidad para poder ayudar a este tipo de pacientes a prolongar

su vida

Muchas Gracias…

www.drstamboulian.com.ar