Rol del Laboratorio en el Diagnstico y Prevencin de la Infeccin por CMV en pacientes transplantadosBioqumica Mariela Merkt

CMV: CaractersticasFamilia Herpesviridae DNA doble cadenaVirus envueltoEs el virus herpes ms grande (240 kb)

Es comn, entre el 40-100% de la poblacin mundial adulta es seropositiva

Muchos individuos son infectados en la infancia, y en la mayora de la poblacin no causa enfermedad con significado clnico

Infeccin por CMVCMR, 13,83-121,200

CMV

INFECCION PRIMARIA ESTADO LATENTE

receptores de transplantes pacientes HIV positivos individuos con sistema inmune inmaduroMujer embarazada: infeccin congenitaREACTIVACIONEnfermedad clnica SeveraJCM,40,746-752,2002

Small RNA and Large Virus NEJM;357,25. 2007

Infecciones post transplante

El impacto del CMV en los transplantados es considerado como la ms importante causa de morbi-mortalidadJCM,40,746-752,2002

Enfermedad por CMVPrimoinfeccin: transferencia a travs del rgano transplantado

Reactivacin: Infeccin latente

Super infeccin: cepa distinta a la cepa latente

Efectos del CMV DIRECTOSINDIRECTOSDirectos:Sindrome mononucleosis likeLeucopenia o trombocitopeniaInfeccin del injertoNeumonitisInfeccin de TGIEncefalitisNEJM;338,24;1998

Efectos del CMVIndirectos: Accin inmunomoduladora:Aumenta el riesgo de infecciones oportunistas (bacterianas, fngicas)Aumenta el riesgo de injuria del rgano transplantado (agudo y crnico)Relacionado a ateroesclerosis del corazn transplantadoNEJM;338,24;1998

Factores de riesgo para desarrollar enfermedad por CMVEstatus del donante y del receptor del transplanteDel grado de inmunosupresin (reactivacin)La presencia de CMV en sangre (viremia) asociado con alto riesgo de recurrencia o enfermedad futuraLa carga viral de CMV

IHMF;2002

depende del tipo de transplanteTOS (excepto corazn y pulmn) ocurren severas infecciones del tracto GI con leucopenia y trombocitopenia; la neumona es rara.TMO y receptores de corazn y pulmn la neumona es la secuela ms frecuente y la ms fatal.La retinitis es rara en los transplantadosPresentacin clnicaIHMF;2002

Manifestaciones Clnicas

www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm

TratamientoManejo antiviral de CMVPrevencinTratamientoProfilaxis universalDirigida a todos los transplantadosProfilaxis selectivaDirigida a pacientes de alto riesgoTemprano (preemptive)Segn resultado del test empleadoTratamiento tardoSe aplica una vez iniciado los sntomas

PROFILAXISV: No se requieren test de laboratorio para iniciar la terapiaD. Riesgo de exposicin a drogas en individuos de bajo riesgoDesarrollo de resistenciaPRE-EMPTIVETHERAPYV: Exposicin de pocos individuos a las drogas, al igual que el tiempo de exposicinD. Requiere test de elevada sensibilidadIHMF;2002

Por qu medir la viremia?Diagnstico de enfermedad

Monitoreo de la replicacin viral

Monitoreo de la terapia antiviralTratamientoPre-emptive therapyDuracin del tratamiento Evaluar resistenciaIHMF;2002

Frecuencia de monitoreo para guiar pre-emptive therapySemanalmente monitorear viremia usando durante los primero 3 meses luego del transplante o durante ms tiempo dependiendo de la intensidad de la inmunosupresin.

www.pps.co.uk/ihmfwelcome.htm

Riesgo de infeccin segn serologaD-/R- D-/R+ D+/R+ D+R-Mayor riesgoIHMF;2002

Ensayos para la deteccin de CMVNO MOLECULARES: Cultivo convencional, shell vial, antigenemia pp65

2. MOLECULARES: Cualitativos: PCR casera, PCR Amplicor, Nuclisens pp67 (NASBA)

B. Cuantitativos: Cobas Amplicor Monitor, Hbrido de captura, Quantiplex bDNA, PCR en tiempo realIHMF;2002

NO MOLECULARES

IHMF;2002

pp65Deteccin del Ag temprano pp65 por InmunofluorescenciaResultados: Se informa n de clulas positivas/ 200.000 leucocitos

Pp65 V: Es ms sensible que los mtodos de cultivo viralD: no es til en periodos de neutropenia (se necesita un gran nmero de leucocitos) Requiere del rpido procesamiento de las muestras, y su resultado puede ser subjetivo, dependiendo de la experiencia del observador.

Cultivo viralinsume mucho tiempo, menor reproducibilidad, menor sensibilidad

Comparando mtodosIHMF;2002

Recomendaciones para el inicio de pre-emptive therapy segn pp65TOS:Ms de 10 clulas positivas/200.000 clulas observadasTMO:

Mayor o igual a 1-2 clulas positivas/200.000 clulas observadas

El cultivo viral y el shell vial no son adecuados para guiar pre-emptive therapyIHMF;2002

MOLECULARES

Ensayos moleculares comercialespara la deteccin de la infeccin por CMVIHMF;2002

2. METODOS MOLECULARES Nuclisens pp67 test Tipo de muestra: plasmaEl target de cido nucleico es RNA y no DNA (indica infeccin activa)Lmite de deteccin: aprox 700 molculas de RNADesventaja: No es cuantitativo

IHMF;2002

2. METODOS MOLECULARESHbrido de captura CMV DNA assayNew Microbiol 1996;19:193-201Sensibilidad de 76-100%, comparado con el shell vial 74-97% y Amplicor CMV Monitor assay 88-100 %

2. METODOS MOLECULARESBranched-DNA (bDNA)IHMF;2002VentajaAlta reproducibilidadDesventajaNecesita de un alto nmero de PMN 2.106

Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativa

Puede ser utilizada con plasma o LeucocitosEl test utiliza el Cobas amplicorBuena especificidad Estrecho rango dinmico y alta demanda de tiempo para su realizacin.Rango: 400-1.105copias/mL plasma o por 5.106 Leucocitos2. METODOS MOLECULARESIHMF;2002

Usando plasma: 1000-5000 copias/mL en TOS TMO cercano al lmite de deteccinpara guiar pre-emptive therapyIHMF;2002Cobas Amplicor CMV Monitor (ROCHE) Cuantitativo

2. MOLECULARES

Deteccin cualitativa de ADN por PCR Tipo de muestra: Leucocitos

VentajasPermite detectar a muy bajo nivel de viremia (alta sensibilidad)Permite monitorear la eficacia del tratamiento antiviralSensibilidad cercana al 100 % DesventajasNo permite diferenciar infeccin latente de enfermedad activa.

IHMF;2002

2. METODOS MOLECULARESPCR en Tiempo RealCombina la qumica de la PCR con sondas fluorescentes para detectar el producto amplificado en la misma reaccin, permitiendo adems medir durante la amplificacin la cantidad de ADN sintetizada a cada momento, mostrando y registrando la cintica de la reaccin de la amplificacin.Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305

Hay diferentes fluorforos para la deteccinSYBER Green:Fluorforo no especficoDetecta todos DNA de doble cadena producidos durante la reaccin de amplificacin (producto especfico, inespecfico o dmeros de primer)www.roche.com

Para discriminar si las muestras son positivas o negativas se realiza una curva de desnaturalizacin (melting curve) al final de la reaccinLa reaccin se calienta desde 50 hasta 95 C monitoreando continuamente la fluorescenciaCada amplicon tiene un Tm caracterstico, lo cual depende del: tamao, contenido de CG y la secuencia.Enferm Infecc Microbio Clin 2004;22 (5): 299-305

PCR CualitativaSitio de amplificacinGen que codifica para la glicoproteina B del CMVSe informa: Detectable o no detectable.LightCycler: RocheLo realizamos en: Sangre enteraBiopsias

Control interno

LightCycler Roche

Tipo de muestra: Plasma

Se utlizan standares de cuantificacin caseros

Control internoPCR CuantitativaRango lineal: 200-200.000.000 copias

Se informa: copias/mL de plasma

2000 copias/mLSitio de amplificacinGen que codifica para la glicoproteina B del CMV

2. METODOS MOLECULARESPCR en Tiempo RealVentajasAltamente sensible y especfica Mejor relacin costo-beneficio para determinar C.VPermite predecir enfermedadmonitorear la terapia antiviral Rpida 1 horaMenor riesgo de contaminacin cruzada

Aplicacin de la Cintica de la carga viral en la identificacin del paciente de riesgoCarga viral en la primera muestra positiva (carga viral inicial)

Velocidad de aumento de la carga viral FACTOR DE RIESGO

Cintica de cargas virales (CMV)

Grfico1

200

200

400

200

1200

200

Carga Viral 1

Das

copias/ml

Hoja1

fresnoCarga Viral 1

0200

3200

17400

24200

311200

38200

pelozocarga viral

0400

7200

9200

14200

218000

2424000

2957000

roquecarga viral

016500

415000

11145000

17200

soria

carga viral

02200

6200

10200

26200

651300

Hoja1

Carga Viral 1

Das

copias/ml

Hoja2

carga viral

das

copias/ml

Hoja3

carga viral

Das

copias/ml

carga viral

Das

copias/ml

Grfico2

16500

15000

145000

200

carga viral

Das

copias/ml

Hoja1

fresnoCarga Viral 1

0200

3200

17400

24200

311200

38200

pelozocarga viral

0400

7200

9200

14200

218000

2424000

2957000

roquecarga viral

016500

415000

11145000

17200

soria

carga viral

02200

6200

10200

26200

651300

Hoja1

Carga Viral 1

Das

copias/ml

Hoja2

carga viral

das

copias/ml

Hoja3

carga viral

Das

copias/ml

carga viral

Das

copias/ml

Grfico5

400

200

200

200

8000

24000

57000

carga viral

Das

copias/ml

Hoja1

fresnoCarga Viral 1

0200

3200

17400

24200

311200

38200

pelozocarga viral

0400

7200

9200

14200

218000

2424000

2957000

roquecarga viral

016500

415000

11145000

17200

soriacarga viral

02200

6200

10200

26200

651300

Hoja1

Carga Viral 1

Das

copias/ml

Hoja2

carga viral

Das

copias/ml

Hoja3

carga viral

Das

copias/ml

carga viral

Das

copias/ml

Tipos de muestraCuantificacin en distintos compartimentos celulares: sangre entera, plasma, Leucocitos, MN, PMNCarga viral en sangre entera 0.67 log ms elevada que en plasmaCarga viral en PMN y MN similar en pacientes con enfermedad activaUso de Leucocitos: carga viral baja, progresin rpida de la enfermedad (TMO).Uso de plasma: progresin lenta de la enfermedad (HIV), neutropenia.CMR, 1998,11:533-554

Qu muestra es la mas conveniente?Evaluar cada caso en particularTipo de pacienteMetodologa disponibleTodas las muestrasProveen informacin pronsticoPueden usarse para el inicio preemptive therapyPueden medir respuesta a la terapia

TratamientoGanciclovir IV:Tratamiento de 2-4 semanas en TOSIdem en TMO; con pneumonitis se agrega gammaglobulina endovenosa. No hay estudios randomizados; est basado en estudios comparativos en un pequeo grupo de pacientes.ValaciclovirFoscarnet (resistencia al ganciclovir)Cidofovir: en individuos con HIV/SIDA

NEJM;335,721-729, 1996

CONCLUSIONESSe necesitaran estudios comparativos para evaluar y poder estandarizar los ensayos moleculares para los distintos transplantes

Se necesitaran estudios que validen la carga de CMV para iniciar las estrategias del tratamiento temprano en funcin a los resultados de la carga viral

CONCLUSIONESLa baja sensibilidad del cultivo convencional y del shell vial limitan su uso en el manejo de la infeccin por CMV en este tipo de pacientes

Es necesaria la utilizacin de mtodos cuantitativos para establecer el riesgo de enfermedad y para monitoreo del tratamiento o detectar resistencia.

A pesar de que hay muchos puntos en el manejo del paciente transplantado que an no han sido dilucidados, y que falta mucho por aprender, las herramientas diagnsticas con las cuales contamos en el Laboratorio son de mucha utilidad para poder ayudar a este tipo de pacientes a prolongar su vida

Muchas Graciaswww.drstamboulian.com.ar