Secuencias de pulsos 1DSecuencias de pulsos 1D

• Ahora tenemos muchas de las herramientas necesarias para analizar secuencias de pulsos. La mas simple, la secuencia usada para obtener un espectro 1D comun, nos sirve para hacer algunas definiciones de notacion:

Vectores:

Diagrama:

• Dependiendo de la direccion del pulso, usamos 90x or 90y (o 90φ si queremos otras fases) para indicar la direccion relativa del campo B1 con respeco a Mo en el sistema rotatorio.

• El periodo de adquisicion siempre se representa como una FID para el nucleo en observacion (el triangulo naranja).

90y 90y

n

z

x

y

z

x

Mxyy

Mo 90y

adquisicion

pulso

‘‘Inversion recoveryInversion recovery’’ - Medida de T - Medida de T11

• Medir T1 es importante, ya que la relajacion de distintos nucleos en una molecula nos da informacion acerca de la mobilidad local. No se puede medir directamente de la FID porque el T1 afecta magnetizacion que no detectamos.

• Usamos la secuencia de pulsos siguiente:

• Si analizamos despues del pulso π:

• Como estamos dejando que la señal decaiga por tiempos distintos solo bajo el efecto de relajacion longitudinal (T1), vamos a ver como distintos tD’s afectan a la intensidad de la FID, y por ende a la intensidad de la señal despues de la TF.

180y (o x) 90y

tD

z

x

y

z

x

y

180y (o x) tD

‘‘Inversion recoveryInversion recovery’’ (continuado) (continuado)

• Segun al intervalo tD que usemos veremos señales cuya intensidad varia dependiendo del tiempo de relajacion T1 del nucleo (pico) que estemos mirando.

z

x

y

tD = 0

z

x

y

tD > 0

z

x

y

tD >> 0

z

x

y

z

x

y

z

x

y

90y

90y

90y

TF

TF

TF

• Es una exponencial con constante de decaimiento igual a T1. Tambien sirve para eliminar señales dependiendo de su T1 (agua…).

‘‘Inversion recoveryInversion recovery’’ ( (……))

NN

• Graficando intensidad contra tiempo nos da la siguiente curva:

a 40oC

I(t) = I∞ * ( 1 - 2 * e - t / T1 )

inte

nsid

ad (

)

tiempo

Ecos deEcos de espin espin

• En principio, para medir T2 solo tenemos que calcular la envoltura de la FID (o el ancho de pico), ya que la señal en Mxy, en teoria, dacae solo debido a la relajacion transversal.

• El problema es que el decaimiento que vemos en Mxy no se debe solo a relajacion, pero tambien a inhomogeneidades de Bo (el defasado de la señal). La constante de decaimiento que vemos en la FID se llama T2*. Para medir T2 correctamente usamos ecos de espin.

• La secuencia de pulsos es la siguiente:

• Los ecos de espin deben ser de las primeras secuencias de pulsos inventadas, aun antes de que existiera la TF. A pesar de lo simple que son, los ecos de espin se usan como un bloque en secuencias de pulsos mas complejas para reenfocar Mxy.

180y (o x)90y

tD tD

Ecos de espinEcos de espin

• Hacemos el analisis despues del pulso de 90y:

• Ahora volvemos a coordenadas <xyz>:

z

x

y

x

y

≡ x

y

x

y

x

y

tD

180y (o x)

tD

desfasado

reenfoque

z

y

≡x

y

I(t) = Io * e - t / T2

NNa 90oC

EcosEcos de de espin espin ( (continuadocontinuado))

• Si adquirimos la FID justito despues del eco, la intensidad de la señal despues de la TF esta afectada solo por relajacion T2 y no por desfasaje debido a un mal Bo. Repetimos para diferentes tD’s y graficamos intensidaad contra 2 * tD. En este caso es un decaimiento simple, y de alli obtenemos T2.

inte

nsid

ad (

)

tiempo

AplicacionesAplicaciones de de secuencias secuencias de eco de de eco de espin espin

• Hasta ahora no dijimos como se comportan los corrimientos quimicos y los acoples en los ecos de espin. Aca es que se empieza a ver lo importante que son.

• Una de las cosas mas molestas (a veces) de los espectros es ‘corregir la fase.’ ¿Porque aparece la fase? Hay que pensar en los efectos del corrimiento quimico en distintas componentes de Mxy en un periodo de tiempo corto.

• Este periodo, que es llamado el ‘acquisition delay’ (DE), lo necesitamos porque sino los ‘restos’ del pulso de alta potencia nos dan un monton de artefactos en el espectro.

• Lo que sucede debido a esto es que todos los espines tienen oportunidad de evolucionar bajo los efectos de corrimiento quimico, y por lo tanto cuando prendemos el detector todos van a estar a estar a cierta fase con respecto a la portadora. Va a ser una mezcla de señales absortivas/dispersivas…

x

y

x

y

...≡

LaLa fase fase del del espectro espectro

• Osea, la fase de las lineas va a ser una combinacion de señales absorptivas o reales (cosenos) y dispersivas o imaginarias (senos) en la FID. Dependiendo de la frecuencia de las lineas, tendremos mas o menos componentes seno o coseno:

S(ω)x = Σ cosenos(ω) - espectro real

S(ω)y = Σ senos(ω) - espectro imaginario

• Lo que queremos es un espectro absortivo puro, y lo que podemos hacer es combinar distintas proporciones de la señal real con la imaginaria obtenidas por el detector. La combinacion va a depender de la frecuencia del espectro:

S(ω) = S(ω)x + [ φo + φ1(ω) ] * S(ω)y

• A φo se le llama la fase de orden cero, y a φ1 la fase de primer orden. La correccion se hace generalmente a mano. En algunos casos (nucleos con bajo γ) es imposible…

• Hay un experimento con ecos de espin que teoricamente nos deja eliminar estos efectos. Despues veremos que en realidad no sirve para mucho...

EcosEcos de de espin espin y y corrimientos quimicos corrimientos quimicos

• De vuelta a los ecos de espin. Despues del pulso de π / 2, los efectos sobre elementos de Mxy con un offset respecto a la frecuencia de B1 son similares a los que se ven para para una señal que se desfasa por inhomogeneidad de campo:

• Despues de un tiempo tD, la magnetizacion precesiona en el plano <xy> por ωeff * tD radianes (φ), donde ωeff = ω - ωo. Luego del puslo π y el segundo tD, Mxy precesiona la misma cantidad pero volviendo al eje x.

• Aparte de estar patas para arriba, no hay desfasaje de la señal si adquirimos la FID justito despues del segundo tD. En principio, esta secuencia nos da espectros absortivos puros…

z

x

y

x

y

≡ x

y

tD

φ

ωeff

x180 tDx

y

φ

y

ωeff

≡

EcosEcos de de espin espin y y acople heteronuclear acople heteronuclear

• A cosas mas interesantes/utiles. Vamos a considerar un 13C acoplado a un 1H:

• Si miramos el espectro 13C vemos un doblete ya que hay acople con 1H. Los 1JCH’s son de 50 a 250 Hz, complican el espectro, y vemos señales superpuestas. Generalmente desacoplamos 1H, lo que significa que saturamos las transiciones de 1H. Las señales de 13C ahora son singuletes:

αCαH

αCβH

βCαH

βCβH

I

J (Hz)

I

1H

13C

1H

13C

13C

13C

1H

1H

αCαH

αCβH

βCαH

βCβH

EcosEcos de de espin espin y y acople heteronuclear acople heteronuclear ( (……))

• Modificamos el eco de espin para incluir desacople:

• Ahora analizamos lo que esta secuencia de puslos hace con magnetizacion de 13C en distintos casos. Primero consideramos un CH. Despues del pulso π / 2, Mxy evoluciona bajo el efecto de acople J. Se dice que cada vector esta marcado por los estados de espin del 1H con el cual esta acoplado, α y β:

• Acordarse que bajo acople J tenemos φ = π * tD * J.

180y (o x)90y

tD tD

{1H}1H:

13C:

x

y

≡ x

y

tD

φ

J / 2

z

x

y

- J / 2(α)

(β)

EcosEcos de de espin espin y y acople heteronuclear acople heteronuclear ( (……))

• Ahora aplicamos el puslo π, que invierte la magnetizacion, y empezamos a desacoplar 1H. Esto remueve las marcas de los dos vectores, y en practica los ‘frena.’ Se colapsan en en uno, y las componentes con signo opuesto se cancelan:

• En este caso el segundo tD durante el desacople de 1H esta para reenfocar el corrimiento quimico y obtener buena fase…

• Vemos que la señal va a variar en intensidad segun tD. Ahora, si tomamos espectros para distintos valores tD’s y graficamos la intensidad obtenemos algo asi para el CH:

x

y

x

y

≡x

y

≡

tD

tD= 1 / 2J tD= 1 / J

EcosEcos de de espin espin y y acople heteronuclear acople heteronuclear ( (……))

• La intensidad de la señal varia con el coseno de tD, es cero para valores de tD multiplos de 1 / 2J, y maxima en multiplos de 1 / J.

• Si consideramos un CH2, el analisis es similar, y obtenemos la siguiente grafica de amplitudes contra tD:

• De forma similar, para un CH3 tenemos:

tD

tD= 1 / 2J

tD

tD= 1 / 2J tD= 1 / J

tD= 1 / J

EcosEcos de de espin espin y y acople heteronuclear acople heteronuclear ( (……))

• Ahora, si asumimos que todos los acoples 1JCH son mas o menos iguales (verdad hasta cierto punto), y usamos la secuencia de pulsos en la siguiente molecula con un tD igual a 1 / J, obtenemos:

• El experimento puede discriminar entre C, CH, CH2, y CH3, e identificamos todos los tipos de carbono en la molecula.

• La secuencia se llama test de protones enlazados (o attached proton test, APT). Es de las primeras secuencias de pulosos usadas por ‘quimicos’ en general. Remplazada por la secuencias INEPT y DEPT que veremos mas adelante.

2

1

43 5

67

OH

HO

1,4

2,35

6

7

0 ppm150 100 50

EcosEcos de de espin espin y y acople homonuclear acople homonuclear

• Aca veremos por que los ecos de espin no sirven para obtener un espectro de fase pura. El problema es que solo consideramos sistemas con espines no acoplados (singuletes) o sistemas con acople heteronuclear.

• Consideremos un 1H acoplado a otro 1H, y que estamos exactamente en resonancia. Despues del pulso π / 2 de la secuencia de eco de espin, y el periodo tD tenemos evolucion bajo los efectos del acople J. Cada vector va a estar marcado por el estado del otro 1H con el que esta acoplado:

• El problema ahora es que el pulso π inverte las poblaciones de todos los protones de la muestra. Por lo tanto, invertimos las marcas del proton en consideracion.

x

y

≡ x

y

tD

J / 2

z

x

y

J / 2

(α)

(β)

EcosEcos de de espin espin y y acople homonuclear acople homonuclear ( (……))

• El pulso π invierte los vectores y las marcas:

• En vez de reenfocar, los vectores se mueven en reversa, y tenemos mas separacion de las lineas del multiplete durante el segundo periodo de evolucion. Si tomamos una FID, la señal va a ser completamente dispersiva (a pesar de que esto depende del largo de los periodos tD):

x

y

J / 2

J / 2

(α)

(β)

x

y

J / 2

J / 2

(α)

(β)

180y (or x)

x

y

tD FID, TF

EcosEcos de de espin espin y y acople homonuclear acople homonuclear ( (……))

• Ahora vemos porque no es tan util. Para diferentes valores de tD obtenemos las siguientes señales para un doblete acoplado con un triplete (los dos tienen la misma J…):

• A pesar de que no es muy util en un espectro de 1H 1D, entender como funciona es crucial para entender la espec- troscopia 2DJ. El fenomeno se conoce como modulacion J.

Pulsos binomialesPulsos binomiales

• Los pulsos binomiales son un ejemplo simple de trenes de pulsos que se pueden explicar con vectores. Su uso mas tipico es para la eliminacion de picos de solvente (ver T1…).

• El mas simple es el pulso binomial 1:1, dos pulsos de π / 2 en direccion opuesta, separados por cierto intervalo td, y exactamente en resonancia con el pico a eliminar:

• El primer π / 2 en y pone todo en <xy>. Despues de td, las señales se mueven para un lado u otro de x. Todas, menos la señal que nos interesa eliminar del espectro:

90y

tD

90-y

z

y

x

y

tD

z

x

y

Mo 90y

x

Pulsos binomiales (continuado)Pulsos binomiales (continuado)

• El segundo pulso π / 2 en -y hace que todo lo que este en x vuelva al eje z. Esto incluye toda la señal correspondiente al pico a eliminar, y las componentes x de las otra señales:

• La FID resultante solo tiene señales que corresponden a picos que no estan en resonancia con la portadora. Todos estan en fase con el receptor, pero picos a cada lado de la portadora tienen signo opuesto:

• Debido al td, no solo los picos en resonancia se anulan, sino que todas las señales que esten a multiplos de 1 / (2*td) Hz (una señal con esa frecuencia da 0.5 vueltas en td…).

x

y

x

y

90-yx

y

≡

FID (y)

TFx

y

Pulsos binomiales (Pulsos binomiales (……))

• Como dije, se usan para eliminar el pico de agua, sobretodo en casos que otras secuencias perturben protones que intercambian con agua (NHs, OHs, etc.). ~ 50 mM de azucar en H2O/D2O (9 a 1).

Espectro 1H:

Espectro 1H con pulso 1:1 (td = 200 µS):

1/8 90y

tD

3/8 90-y

tD tD

3/8 90y1/8 90-y

Pulsos binomiales (Pulsos binomiales (……))

• Para evitar el cambio de signo hay otros trenes binomiales, como por ejemplo el 1:3:3:1:

• Igual dan artefactos. Ninguno de estos trenes de pulsos, o experimentos que se valen de diferencias de T1, dan resultados tan buenos como secuencias con gradientes, como por ejemplo el WEFT o WATERGATE.

• Para la misma muestra, esto es el 1H con WEFT: