CONSECUENCIAS DE LA MUTACIÓN M105I DE α-SNAP EN SU ...

Profesor Patrocinante Dr. Federico Bátiz Instituto de Anatomía, Histología y Patología. Facultad de Medicina

CONSECUENCIAS DE LA MUTACIÓN M105I DE α-SNAP EN

SU INTERACCIÓN CON MEMBRANAS LIPÍDICAS

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico

CRISTIÁN ANTONIO PARGA FIGUEROA

VALDIVIA – CHILE

2013

ii

La culminación de este trabajo y maravillosa etapa en mi vida está dedicada a mis

padres, cuyo apoyo incondicional fue la base de lo que soy hoy.

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AGRADECIMIENTOS

Este trabajo no podría haberse realizado sin la ayuda de una gran persona. La total

confianza que deposito en mí el Dr. Federico Bátiz, permitió que pudiera experimentar con total

libertad, a veces acertando y otras veces fallando. Gracias a su apoyo y sabios consejos, logre

cumplir cada uno de los objetivos propuestos.

Quisiera agradecer también a Zahady Velásquez, amiga y gran compañera de trabajo con

una fuente inagotable de conocimientos. Además de estar siempre dispuesta a dar acertados

consejos y propuestas, Zahady siempre veló por un excelente ambiente de trabajo. Su simpatía

y alegría fue algo invaluable a lo largo de esta investigación.

También agradezco a Loreto Ojeda y María Paz Miró que siempre estuvieron allí para

ayudarme. Aunque quizás sea algo menor, pero la limpieza y orden que había en el laboratorio

fue algo que siempre me alegraba; gracias María Paz.

A la profe Rosa Muñoz, que me enseño con mucho detalle, formas de obtener buenos

resultados.

Mención especial a mis amigos, Israel Giacaman y Stephan Schott que gracias a su

compañía y alegría fui capaz de olvidar los malos ratos (experimentos fallidos) y disfrutar de su

amistad junto a una buena cerveza.

Finalmente, quisiera agradecer a mis padres, Marco Antonio Parga Valenzuela y Paulina

Alicia Figueroa Espinoza por apoyarme en todo momento y siempre confiar en mí.

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ÍNDICE DE CONTENIDOS

1. RESUMEN ................................................................................................................. 1

2. SUMMARY ................................................................................................................ 2

3. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 3

3.1. Planteamiento General del Problema. ....................................................................... 3

3.2. αSNAP (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion (NSF) attachment protein – alpha). ... 4

3.3. αSNAP y la regulación de su actividad. ..................................................................... 8

3.4. αSNAP y su función durante el desarrollo: la mutación M105I y el ratón hyh. ................. 9

3.5. αSNAP y su Interacción con lípidos. ....................................................................... 13

3.5.1. αSNAP.M105I y su interacción con membranas: Hipótesis de trabajo. .................. 16

4. HIPOTESIS Y OBJETIVOS ..................................................................................... 19

4.1. Hipótesis general. ................................................................................................ 19

4.2. Objetivo General. ................................................................................................. 19

4.2.1. Objetivos Específicos. .................................................................................... 19

5. MATERIALES Y METODOS ................................................................................... 21

5.1. Animales de experimentación. ............................................................................... 21

5.1.1. Genotipificación. ........................................................................................... 21

5.1.2. Materiales y equipos. ..................................................................................... 21

5.1.3. Reactivos. ..................................................................................................... 22

5.1.4. Extracción de DNA. ........................................................................................ 22

5.1.5. Reacción de PCR. .......................................................................................... 23

v

5.1.6. Digestión enzimática del producto de PCR obtenido. ......................................... 23

5.1.7. Geles de acrilamida y tinción con SybrSafe. ...................................................... 23

5.2. Aislamiento y manipulación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). ................. 24

5.2.1. Materiales. .................................................................................................... 24

5.2.2. Reactivos. ..................................................................................................... 24

5.2.3. Procedimiento. .............................................................................................. 24

5.3. Inmunocitoquímica de MEFs. ................................................................................. 25

5.3.1. Fijación de MEFs. .......................................................................................... 25

5.3.2. Permeabilización y Bloqueo. ........................................................................... 25

5.3.3. Anticuerpos. ................................................................................................. 25

5.3.4. Montaje de cubreobjetos. ................................................................................ 26

5.4. Preparación de Lípidos. ........................................................................................ 26

5.4.1. Preparación de liposomas de lecitina de soya. .................................................. 26

5.4.2. Obtención de LP1 y P3. .................................................................................. 27

5.4.2.1. Obtención y Homogeneizado de tejido cerebral de ratón. ................................ 27

5.4.2.1.1. Materiales. ......................................................................................................................... 27

5.4.2.1.2. Reactivos. ......................................................................................................................... 27

5.4.2.1.3. Procedimiento. ................................................................................................................. 27

5.4.2.2. Fraccionamiento diferencial. ........................................................................ 28

5.4.2.2.1. Materiales y equipos. .................................................................................................... 28

5.4.2.2.2. Reactivos. ........................................................................................................................ 28

5.4.2.2.3. Fracción P2 y S2. ........................................................................................................... 29

5.4.2.2.4. Obtención de LP1. .......................................................................................................... 29

vi

5.4.2.2.5. Obtención de P3. ............................................................................................................ 30

5.4.3. Eliminación de proteínas periféricas e integrales de LP1. .................................... 30

5.4.3.1. Carbonatación de LP1 – Eliminación de proteínas periféricas. .......................... 30

5.4.3.2. Tripsinización de LP1 – eliminación de proteínas integrales (eliminación

incompleta) ............................................................................................................. 31

5.4.3.3. Extracción de proteínas integrales restantes de LP1. ...................................... 31

5.5. Cuantificación de proteínas mediante método DC ProteinAssay (Bio-Rad)....................... 32


5.5.2. Reactivos. ..................................................................................................... 32

5.5.3. Procedimiento. .............................................................................................. 32

5.6. SDS-PAGE, Western Blot, tinción con nitrato de plata. ............................................. 34


5.6.2. Reactivos. ..................................................................................................... 35

5.6.3. Procedimiento. .............................................................................................. 36

5.6.3.1. Electroforesis. ............................................................................................ 36

5.6.3.2. Electrotransferencia. ................................................................................... 37

5.6.3.3. Hibridación con anticuerpos y revelado. ........................................................ 37

5.7. Tinción con nitrato de plata. .................................................................................. 39

5.8. Ensayo de Flotación. ............................................................................................ 39

5.8.1. Protocolo A. .................................................................................................. 39

5.8.2. Protocolo B. .................................................................................................. 40

5.8.3. SDS-PAGE después del ensayo de flotación...................................................... 41

5.9. Ensayo de láminas de membrana plasmática. .......................................................... 41

vii

5.9.1. Preparación de láminas de membrana plasmática. ............................................. 41

5.9.2. Inmunoensayo de las láminas de membrana. .................................................... 42

5.10. Proteínas Recombinantes .................................................................................. 43

6. RESULTADOS ........................................................................................................ 46

6.1. Localización de αSNAP en MEFs. ........................................................................... 46

6.1.1. La mutación M105I de αSNAP provoca una menor localización de ésta en membrana

plasmática de fibroblastos embrionarios de ratón. .......................................................... 46

6.2. Interacción de αSNAP con láminas de membrana plasmática. .................................... 49

6.2.1. αSNAP.M105I interacciona menos con láminas de membrana plasmática de células

PC12 en comparación con αSNAP WT. .......................................................................... 49

6.3. Interacción de αSNAP WT y αSNAP.M105I con lípidos. .............................................. 53

6.3.1. αSNAP WT y αSNAP.M105I no interaccionan con lecitina de soya – Protocolo A. ... 53

6.3.2. No existen diferencias significativas en la interacción de αSNAP WT respecto a

αSNAP.M105I con lípidos obtenidos de cerebro de ratón (LP1) – Protocolo A. .................... 59

6.3.3. No existen diferencias significativas en la interacción de αSNAP WT respecto a

αSNAP.M105I con lípidos obtenidos de cerebro de ratón (LP1) – Protocolo B. .................... 66

6.3.4. αSNAP.M105I interacciona menos con liposomas LP1 en comparación con αSNAP

WT, pero su interacción con liposomas P3 no se ve alterada. ........................................... 73

7. Discusión ................................................................................................................ 85

7.1. La asociación de αSNAP.M105I con membrana plasmática de fibroblastos embrionarios

de ratón esta reducida. ................................................................................................... 85

7.2. αSNAP.M105I interacciona menos con membrana plasmática. ................................... 86

viii

7.3. La mutación M105I de αSNAP provoca una disminución en la interacción con lípidos de

membrana plasmática. .................................................................................................... 87

7.4. αSNAP posiblemente interacciona con algún lípido en específico. ............................. 90

7.5. Posibles consecuencias bioquímicas de la mutación M105I de αSNAP. ....................... 91

7.6. ¿Cómo es que αSNAP.M105I pierde la habilidad de interaccionar con LP1? ................. 96

7.7. Implicancias de la mutación M105I en la función de αSNAP. ...................................... 97

7.8. Conclusiones. .................................................................................................... 100

8. REFERENCIAS ..................................................................................................... 101

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ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Modelo de la fusión de membranas mediada por el complejo SNARE (trans). 5

Figura 2. Reciclaje de complejos SNAREs. 7

Figura 3. La Metionina 105 de la proteína αSNAP es altamente conservada en diferentes

organismos. 11

Figura 4. Dominio de αSNAP que permite su interacción con lípidos. 15

Figura 5. Producción y purificación de proteínas recombinates alfa-SNAP.wt y alfa-

SNAP.M105I. 45

Figura 6. Expresión de αSNAP en fibroblastos embrionarios (MEFs) WT y hyh. 48

Figura 7. Ensayos de interacción en láminas de membrana. 50

Figura 8. Ensayos de flotación de αSNAP – Sin lípidos. 54

Figura 9. αSNAP WT y αSNAP.M105I no interaccionan con lecitina de soya – (Protocolo

A). 57

Figura 10. Tratamiento de fracciones LP1 con carbonato de sodio a pH básico y tripsina. 60

Figura 11. Flotación de αSNAP WT y αSNAP.M105I con LP1 tratada. 64

Figura 12. Recolección inapropiada de los lípidos en un ensayo de flotación aleatorio –

Protocolo A. 67

Figura 13. Recolección correcta de lípidos – Protocolo B. 68

Figura 14. αSNAP WT y αSNAP.M105I interaccionan con liposomas de lecitina de soya

utilizando el protocolo B. 71

Figura 15. Flotación de αSNAP WT o αSNAP.M105I con LP1 tratada utilizando el protocolo

B. 72

Figura 16. Flotación de αSNAP WT o M105I con Liposomas obtenidos de fracciones LP1 o

P3 de cerebro de ratón. 75

Figura 17. αSNAP.M105I posee una interacción reducida con LP1, pero no con P3. 78

x

Figura 18. αSNAP.M105I interacciona menos con LP1 en comparación con αSNAP WT. 80

Figura 19. αSNAP.M105I interacciona significativamente menos con LP1 que αSNAP WT.82

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla I. Preparación de curva de calibración para determinación de proteínas. 33

Tabla II. Anticuerpos utilizados para hibridación en el método de inmunoblot. 38

xi

ABREVIACIONES

αSNAP: soluble N-ethylmaleimide-sensitve factor [NSF] atachment protein-alpha.

ACRS-PCR: Sitio de restricción creado artificialmente mediante PCR.

ATP: adenosin trifosfato.

CAMKII: Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II.

DAPI: 4,6-diamidino-2-phenylindole.

dNTP: Deoxirribonucleótido trifosfato.

EDTA: Acido etilendiaminotetraacético.

hyh: Hydrocephalus with hop gait.

kDa: Kilo Daltons.

MEF: Mouse embryonic fibroblast.

NSF: N-Methylmaleimide sensitive factor.

PKA: Protein Kinase A.

PBS: buffer fosfato salino.

PCR: Reacción de la Polimerasa en cadena.

PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo.

xii

PN1: Post Natal 1 día

PVDF: Polifluoruro de vinilideno.

RPM: Revoluciones por minuto.

SDS: Dodecil-sulfato de sodio.

SDS-PAGE: Electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.

SNARE: SNAP Receptor.

TEMED: N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina.

TRIS: Tris (hidroximetil) aminometano.

WB: Western blot.

WT: Wild Type.

1

1. RESUMEN

αSNAP es una proteína clave para el tráfico de membranas dentro de las célula, ya

que participa junto a la ATPasa NSF en la disociación de complejos cis-SNARE durante

el proceso de fusión de membranas. Aunque esta proteína es ubicua, su rol durante el

desarrollo del sistema nervioso ha comenzado a dilucidarse gracias a la aparición de

una mutación espontánea en ratones. Esta mutación, conocida como hyh

(hydrocephalus with hop gait), consiste en una sustitución de un residuo de metionina

por uno de isoleucina en la posición 105 (M105I), provocando una disminución en

niveles proteicos (hipomorfismo) en tejido nervioso e hidrocefalia. Si bien estudios

iniciales in vitro indicaban que la mutación M105I no altera la funcionalidad de αSNAP,

estudios en contexto celular sugieren la proteína mutada presenta defectos funcionales

intrínsecos. Considerando que la interacción de αSNAP con lípidos es importante para

su función, ¿puede la mutación M105I afectar la interacción con lípidos de αSNAP?

Realizando ensayos libres de célula, en láminas de membrana plasmática de células

PC12, confirmamos que αSNAP interactúa menos o menos establemente con

membrana plasmática. Por otro lado, mediante la estandarización y realización de

ensayos de flotación con liposomas y proteínas recombinantes, en esta tesis

mostramos por primera vez que la proteína αSNAP.M105I interacciona menos con

lípidos de membrana plasmática comparado a su versión wild type. Considerando que

la interacción de αSNAP con lípidos es clave para su eficiencia funcional en la

activación de NSF, esta menor interacción con lípidos podría ayudar a explicar

mecanísticamente los defectos funcionales intrínsecos que presenta la proteína

αSNAP.M105I en contexto celular.

2

2. SUMMARY

αSNAP is a key protein involved in intracellular membrane trafficking. It participates

together with the ATPase NSF in the dissociation of cis-SNARE complexes during

membrane fusion process. Although this protein is ubiquitous, its role on brain

development has begun to be elucidated by the appearance of a spontaneous mutation

in mice. This mutation, known as hyh (hydrocephalus with hop gait), consist in a

missense mutation that results in the substitution of a methionine residue at position 105

by one isoleucine (M105I). This, in turn, provokes a decrease in protein levels

(hypomorphism) in nervous tissue and abnormal brain development. Even though,

previous in vitro studies indicated that M105I mutation does not alter αSNAP

functionality, studies in cellular context suggest that the mutant protein show intrinsic

functional defects. Considering that the interaction of αSNAP with lipids is important to

its function, can M105I mutation alter αSNAP-lipids interaction? Using cell-free assays

with plasma membrane sheets obtained from PC12 cells, we confirm that αSNAP

interacts less or less stably with plasma membrane y this is due to intrinsic defects in the

mutant protein. On the other hand, the standardization of liposomes flotation assays

using recombinant proteins allow us to demonstrate by the first time that αSNAP.M105I

interacts less efficiently with plasma membrane lipids compared to the wild type version.

Considering that αSNAP-lipids interaction is important for the functional efficiency in

NSF activation, the defects observed in αSNAP.M105I could help (i) to mechanistically

understand the intrinsic functional deficiencies reported previously in a cellular context,

and (ii) to explain, to some extent, the hyh phenotype.

3

3. INTRODUCCIÓN

3.1. Planteamiento General del Problema.

αSNAP (soluble N-ethylmaleimide-sensitve factor [NSF] atachment protein-alpha) es

una proteína que forma parte de la maquinaria encargada de la fusión intracelular de

membranas. Esta proteína interactúa con complejos SNARE (SNAP receptor) sirviendo

como adaptador para la posterior unión y activación de la ATPasa NSF (N-

ethylmaleimide-sensitive fusion protein). La hidrólisis de ATP provoca la disociación de

estos componentes dejándolos disponibles para otra ronda de fusión. De esta forma, se

ha descrito que αSNAP es clave en transporte desde retículo endoplasmático hacia

Golgi, tráfico membranoso intra-Golgi, fusión de vesículas sinápticas y gránulos

secretorios, y transcitosis entre membrana apical y basolateral. Durante el desarrollo

embrionario, se ha descrito que αSNAP se expresa preferentemente en el sistema

nervioso central.

La aparición de mutación espontánea en ratones que afecta al gen Napa que codifica

para αSNAP (G->A en el exón 4) y que resulta en una sustitución de una metionina

altamente conservada por una isoleucina (M105I) ha permitido estudiar el rol de esta

proteína in vivo y durante el desarrollo embrionario. De hecho, la homocigosis para esta

mutación produce un fenotipo característico conocido hydrocephalus with hop gait

(hyh), que se caracteriza por denudamiento neuroepitelial/ependimario de las paredes

ventriculares, desarrollo de hidrocefalia en útero, y otras alteraciones del desarrollo del

sistema nervioso.

4

La mutación hyh provoca una reducción en los niveles de la proteína αSNAP en

tejido nervios (hipomorfismo). Estudios in vitro sugerían que la proteína mutada no

presentaba ninguna alteración funcional en comparación a la proteína wild type (WT);

sin embargo, estudios en contexto sugieren que αSNAP.M105I presenta alteraciones

funcionales intrínsecas. ¿En qué consisten las alteraciones funcionales intrínsecas de

αSNAP.M105I?

Resultados obtenidos en nuestro laboratorio han demostrado que αSNAP WT se

encuentra preferentemente asociada a fracciones subcelulares enriquecidas en

membranas, mientras que αSNAP.M105I se encuentra predominantemente en

fracciones citosólicas. Estos hallazgos son relevantes al considerar que recientemente

se ha demostrado que la interacción directa de αSNAP con lípidos de membrana

aumenta dramáticamente la eficiencia funcional de la proteína para activar NSF y

provocar la disociación de complejos SNARE. En este contexto, ¿puede la mutación

M105I afectar la interacción de αSNAP con lípidos?

3.2. αSNAP (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion (NSF) attachment

protein – alpha).

Hace aproximadamente 20 años, las SNAPs fueron descubiertas por el grupo de

James Rothman como proteínas capaces de unir NSF, evento necesario para la fusión

de membranas en el tráfico vesicular intra-Golgi (Clary et al. 1990). La mayor parte de

los eventos de fusión de membranas intracelulares son mediados por proteínas

conocidas como receptores de SNAP o SNAP receptors (SNAREs) ubicados tanto en la

vesícula (v-SNAREs) como en la membrana blanco o target (t-SNAREs) (figura 1).

5

Figura 1: Modelo de la fusión de membranas mediada por el complejo SNARE

(trans). Nótese que después del evento de fusión en f, v-SNARE (Linea roja) y t-

SNARE (Linea Azul) quedan unidas formando complejos cis-SNAREs.

6

La fusión comienza cuando los SNAREs en su configuración trans (es decir, activos y

en membranas opuestas) se juntan formando un conjunto de 4 hélices, las cuales se

enrollan desde su extremo N-terminal (extremo citosólico) hasta el extremo C-terminal

(extremo inserto en la membrana). Esto provoca el acercamiento de las membranas

provocando el evento de fusión (Jahn y Scheller 2006). Luego de este evento, los

SNAREs quedan en forma cis (enrollados entre sí y en la misma membrana) por lo cual

ya no sirven para otro evento de fusión. El mecanismo que permite la fusión de

membranas mediada por SNAREs necesita de la preactivación o priming de estos

complejos cis-SNARE inactivos. Para ello, αSNAP reconoce e interactúa con los

complejos cis-SNARE, recluta a la ATPasa NSF, formándose un complejo

SNARE/SNAP/NSF, conocido como complejo 20S (Woodman 1997; Stenbeck 1998).

NSF ahora unida a SNAP, se activa e hidroliza ATP, promoviendo la disociación del

complejo 20S y la liberación (activación) de los componentes necesarios para otra

ronda de fusión (Risselada y Grubmuller 2012) (Figura 2).

La prevención de la hidrólisis de ATP por NSF provoca la acumulación de vesículas

incapaces de fusionarse con su membrana blanco (Sollner et al. 1993; Rothman 1994).

Además de la fusión de membranas intra-Golgi descrita inicialmente por Clary y

Rothman (1990), esta maquinaria media la fusión de membranas desde el retículo

plasmático hacia Golgi, la fusión de gránulos secretorios y sinápticos con la membrana

plasmática, la fusión homotípica endosomal y otras (Stenbeck 1998).

7

Figura 2: Reciclaje de complejos SNAREs. Después del evento de fusión de

membranas, el reclutamiento de αSNAP y NSF provocan la disociación del complejo

20S (complejo SNARE), evento gatillado por hidrolisis de ATP mediada por NSF.

8

3.3. αSNAP y la regulación de su actividad.

En mamíferos existen tres isoformas de SNAP, llamadas α-, β- y γ-SNAP, codificadas

por tres genes diferentes. La expresión de α- y γ-SNAP es ubicua, mientras que la

expresión de β-SNAP está limitada sólo al sistema nervioso central y durante estadios

postnatales. Existe un 83% de homología entre α- y β-SNAP, mientras que entre α- y γ-

SNAP solo existe un 20% de homología (Whiteheart et al. 1993). Todas las SNAPs son

solubles, sin embargo se ha descrito que su función es dependiente de membranas, ya

que SNAP soluble no une a NSF (Wimmer et al. 2001). De hecho se ha informado que

la unión de SNAP con superficies hidrófobas provocaría un cambio conformacional en

SNAP haciéndola competente para la unión y activación de NSF (Clary et al. 1990).

Mediante ensayos de microscopia electrónica y mutaciones puntuales, Marz et al.

describieron que αSNAP interacciona con SNAREs de forma antiparalela. A pesar de

que no se conoce la estructura cristalográfica de αSNAP, si se conoce la estructura de

su análogo en levaduras, la proteína sec17p. Ya que la homología de αSNAP en

distintos organismos está altamente conservada, extrapolando datos, Marz et al.

describieron que la mayor superficie de interacción de αSNAP con SNAREs era

mediante la cara cóncava de αSNAP. Utilizando mutaciones puntuales, describió que

esta interacción se basa mayoritariamente en puentes electrostáticos (residuos básicos

y ácidos). A su vez, también describió que mutaciones de residuos en la cara opuesta

de αSNAP (la cara convexa) no altero significativamente la interacción de αSNAP con

SNAREs (Marz et al. 2003).

Se ha descrito que αSNAP es fosforilada por CaMKII y PKA. Esta fosforilación

disminuye en un orden de magnitud su asociación con el complejo SNARE. Debido a

9

que observaciones previas han demostrado que la fosforilación de αSNAP incrementa

la fusión de vesículas más que disminuirla, se postuló que la liberación de αSNAP del

complejo SNARE representaba la etapa limitante de los eventos de fusión, y que esta

fosforilación provocaría una disminución en la afinidad de unión de αSNAP por el

complejo SNARE, aumentando su disociación y disponibilidad para unirse a otro

complejo (Hirling y Scheller 1996). Estos mismos autores han postulado que este nivel

de regulación sobre αSNAP mediada por fosforilación, estaría mediando los cambios

rápidos producidos en la formación de memoria a corto plazo. De esta forma, el

organismo, al fosforilar componentes que regulan la fusión de vesículas con la

membrana plasmática, podría regular la tasa de liberación de neurotransmisor al medio

y de esta forma, regular la tasa de activación de neuronas postsinápticas (Hirling y

Scheller 1996); sin embargo, en la actualidad el rol de la fosforilación de αSNAP y sus

consecuencias funcionales, no son muy claros.

3.4. αSNAP y su función durante el desarrollo: la mutación M105I y el ratón

hyh.

En el mismo año que se descubrió αSNAP (1990), se describió un nuevo modelo

murino de hidrocefalia espontánea cuyo posible gen causante se encontraba en el

extremo terminal del cromosoma 7 (Bronson y Lane 1990). Debido al fenotipo

característico de estos ratones que desarrollaban este trastorno, se los llamó hyh

(hydrocephalus with hop gait). Catorce años después, dos estudios independientes

describieron simultáneamente que el fenotipo hyh es causado por la mutación del gen

Napa (Chae et al. 2004; Hong et al. 2004). Según estos estudios, la mutación del gen

10

Napa, cuyo producto proteico es αSNAP, corresponde a una mutación missense en el

exón 4 donde cambia una G por una A, lo que se traduce en la sustitución de una

metionina altamente conservada en la posición 105 por una isoleucina (M105I) (Chae et

al. 2004; Hong et al. 2004) (Figura 3).

Esta mutación posee un patrón de herencia tipo mendeliano de tipo autosómica

recesiva, por lo que sólo aquellos individuos que presenten homocigosis para la

mutación (Napahyh/Napahyh), y no los que presenten heterocigosis (Napa+/Napahyh)

presentarán el fenotipo hyh. Este fenotipo se caracteriza por presentar severas

alteraciones a nivel del sistema nervioso, incluyendo: hidrocefalia, mal desarrollo

cerebral y medular, hipoplasia del cerebelo, agenesia del cuerpo calloso, etc; también

se ha observado reducida fertilidad en machos, trastornos del crecimiento, y trastornos

motores: marcha en salto (hop gait), entre otros. Además, investigaciones recientes

realizadas en nuestro laboratorio demuestran que los ratones hyh presentan

alteraciones en el desarrollo de los folículos ováricos y defectos en la regulación de la

glicemia (datos no publicados).

Por otro lado, se ha descrito que la mutación M105I provoca una reducción en los

niveles de αSNAP en tejido nervioso, en comparación a los niveles observados en los

controles (wild type); sin embargo, no existe consenso en cuanto a si el origen de este

hipomorfismo se debe a una menor estabilidad la proteína, de su mRNA o de ambos.

Además, estudios realizados en nuestro laboratorio han demostrado que este

hipomorfismo es variable, dependiendo del tejido analizado y del estadio del desarrollo.

11

Figura 3: La Metionina 105 de la proteína αSNAP, es altamente conservada en

diferentes organismos. En ratones hyh, esta metionina es sustituida por una

isoleucina (M105I).

12

Funcionalmente, estudios realizados in vitro por Chae et at. sugerían que la mutación

M105I no provoca alteraciones funcionales en αSNAP, ya que la proteína mutada se

une a complejos SNARE solubles y los disocia (en presencia de NSF) de una manera

similar a lo que lo hace la proteína wild type (Chae et al. 2004). De hecho, siguiendo las

mismas extrapolaciones entre αSNAP y Sec17p descritas por Marz et al. (2003), se ha

demostrado que el residuo M105 se encuentra en la cara convexa de αSNAP, que es la

cara que no participa en la interacción directa con SNAREs (Chae et al. 2004).

Sin embargo, Batiz et al. (2009) han descrito que, en un contexto más fisiológico,

αSNAP.M105I presenta alteraciones funcionales intrínsecas. Utilizando como modelo la

exocitosis acrosomal en espermatozoides permeabilizados, estos autores demostraron

que αSNAP wild type es capaz de recuperar los defectos en exocitosis que presentan

los ratones hyh, mientras que idénticas cantidades de αSNAP.M105 no. Si bien estos

estudios sugieren que la funcionalidad de αSNAP.M105I en contexto celular está

alterada, el defecto particular es desconocido.

Como se dijo anteriormente, después del descubrimiento de αSNAP en 1990, sus

funciones fueron estudiadas utilizando mutantes en levadura y Drosophila (Pryer et al.

1992; Wang et al. 2000; Babcock et al. 2004), muchas de las cuales eran letales. Sin

embargo, previo a la caracterización de los ratones hyh y el descubrimiento de que su

etiología era causada por una mutación en el gen Napa, aun no se conocía la

implicancia de αSNAP en el desarrollo embrionario en mamíferos ya que el knockout

del gen Napa es letal en estadios muy tempranos del desarrollo embrionario, lo que

impedía investigaciones para determinar su rol en el desarrollo. Así, esta mutación

natural que apareció espontáneamente en ratones hyh, provee un excelente modelo

13

animal para dilucidar los mecanismos de tráfico y fusión de membranas en los que

participa y su importancia en el desarrollo. Adicionalmente, este modelo animal nos da

una valiosa oportunidad para estudiar las implicancias funcionales de la mutación

M105I y distintos aspectos relacionados con αSNAP en condiciones normales y

patológicas.

3.5. αSNAP y su Interacción con lípidos.

En 1989 se había descrito que NSF por sí sola no interaccionaba con membranas

provenientes de Golgi, sin embargo, los autores al agregar citosol (que contenía

SNAPs) provocaban que NSF se uniera a membranas de Golgi. (Weidman et al. 1989).

Más tarde, Clary y colaboradores en 1990 describieron que NSF se podía unir a αSNAP

cuando esta última era adsorbida previamente en plástico (tubos de micro centrifuga)

(Clary et al. 1990). Inicialmente, se pensó que αSNAP era una proteína soluble, y que

era reclutada hacia la membrana plasmática por complejos cis-SNAREs (post-fusión).

Efectivamente, estudios en neuronas y células β pancreáticas sugerían que αSNAP se

encontraba mayormente en el citosol (Kiraly-Borri et al. 1996); sin embargo, otros

estudios posteriores en células cromafines (Banaschewski et al. 1998) y células tipo 2

alveolares (Abonyo et al. 2003) demostraron que αSNAP estaba fuertemente asociada

a membranas. Adicionalmente, en 1994 Morgan et al. descubrieron que la

inmovilización (adsorción) de αSNAP en plástico además de unir la ATPasa NSF,

aumentaba la actividad catalítica de esta en un 147%, comparado al 14% de activación

logrado cuando se incubó αSNAP y NSF de forma soluble (Morgan et al. 1994). Según

Morgan, la inmovilización de αSNAP en plástico sirve para activar en NSF el sitio de

14

baja afinidad por ATP, aumentando drásticamente su afinidad por ATP. Esto se debería

a que el plástico provocaría un cambio conformacional en αSNAP, tal como lo haría su

receptor SNARE en la membrana (Whiteheart et al. 1992). Sin embargo, otra posibilidad

es que el cambio conformacional lo provoque la interacción de αSNAP con los lípidos

de la membrana.

De hecho, en 1997, Steel y col. describieron por primera vez que αSNAP

interacciona directamente con membranas lipídicas (membranas biológicas y

liposomas) y que esta unión era independiente de receptores SNARE funcionales.

Además, estos autores demostraron que esta interacción incrementa la actividad

catalítica de NSF entre 2 y 3 veces y que esto se debe al aumento de la afinidad de

ATP del sitio catalítico de NSF como había descrito Morgan en 1994. Steel y col.

también describieron que, en estado estacionario, αSNAP se encontraba

mayoritariamente asociado a membranas y que probablemente esto era una

característica intrínseca de la proteína, ya que estudios bioquímicos demostraron que

αSNAP posee características hidrófobas e hidrófilas (proteína anfipática) (Steel et al.

1997). En 2009, Winter y colaboradores, utilizando la estructura cristalina de la proteína

sec17p (proteína de levadura homologa a αSNAP de mamíferos) demostraron y

descubrieron que el dominio de αSNAP encargado de conferirle la habilidad de

interaccionar con lípidos es un loop ubicado entre las α-hélices 1 y 2, que abarca del

residuo 26 hasta el 32, y que en su mayoría corresponden a aminoácidos hidrófobos,

particularmente dos fenilalaninas (posiciones 27 y 28) (Figura 4).

15

Figura 4. Dominio de αSNAP que permite su interacción con lípidos. En a se

muestra un blast comparando el extremo N-terminal de varias especies. Con flechas

negras en las posiciones 27 y 28 se destacan las fenilalaninas altamente

conservadas en las especies evaluadas. En b se muestra la estructura en cintas de

sec17, proteína de levadura homologa a αSNAP en mamíferos. Se observa que el

loop estaría en contacto directo con la membrana plasmática. Además se muestra la

estructura en cintas que adoptaría un complejo cis-SNARE (inactivo funcionalmente).

16

Cuando este loop fue eliminado (eliminando los aminoácidos del 1 al 32) o cuando

las fenilalaninas fueron mutadas por serinas, αSNAP dejó de interaccionar con lípidos.

Funcionalmente, la interacción de αSNAP con lípidos aumenta 20 veces su eficiencia

funcional (medida en términos de disociación del complejo 20S mediada por NSF) en

comparación a estudios de reconstrucción usando complejos solubles (Winter et al.

2009). Aunque los autores postulan que dos residuos de fenilalanina altamente

conservados son los responsables de esta regulación funcional, no se sabe si la

mutación M105I (ubicada en la α-hélice 5) podría tener algún efecto en la interacción de

αSNAP con membranas.

3.5.1. αSNAP.M105I y su interacción con membranas: Hipótesis de trabajo.

Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que, en extractos

de cerebro de ratones wild type, al igual que lo descrito por Steel et al. en 1997, αSNAP

se encuentra fundamentalmente asociada a fracciones enriquecidas en membranas; sin

embargo, en extractos de cerebro de ratones hyh, αSNAP (M105I) se encuentra

principalmente en las fracciones solubles. Más aun, ensayos bioquímicos de interacción

utilizando proteínas recombinantes WT y M105I demostraron que αSNAP.M105I tiene

una menor interacción con membranas y que esto es más evidente cuando se utilizan

fracciones enriquecidas en membrana plasmática. Más aún estos ensayos bioquímicos

demostraron que la menor interacción con membrana plasmática que presenta

αSNAP.M105I no se debe a alteraciones en la composición de las membranas de los

ratones hyh sino a defectos intrínsecos en la proteína mutada.

17

Considerando que, según lo descrito por Marz et al. (2003), el residuo M105 no es un

residuo clave para la interacción de αSNAP con SNAREs, existen al menos dos

posibilidades que permiten explicar la menor asociación a membranas de αSNAP.M105

en los mutantes hyh: (i) que la mutación M105I provoque una reducción en la

interacción de αSNAP con alguna proteína de membrana (SNAREs u otras) que de

alguna forma mantiene a αSNAP reclutada en la membrana, y (ii) que la mutación

M105I provoque una disminución en la interacción directa de αSNAP con membranas

biológicas (lípidos). Si bien ambas posibilidades podrían explicar por sí solas la menor

asociación a membranas de αSNAP.M105I, no se puede descartar que en condiciones

fisiológicas exista una combinación de ambas o incluso un mecanismo adicional, como

una mayor interacción de la proteína mutada a proteínas citosólicas, por ejemplo.

Considerando que (i) un experimento realizado por Steel et al. (1997) sugiere que la

mayor parte de la interacción de αSNAP con membranas es independiente de SNAREs

pero además, debido a la naturaleza del experimento donde degrada todas las

proteínas de las membranas (mediante proteasas y calor), es probable que no exista

otra proteína que participe en el reclutamiento de αSNAP a la membrana y (ii) que

ensayos previos en nuestro laboratorio han demostrado una reducción en la

hidrofobicidad de αSNAP.M105I, se formulan las siguientes preguntas: (I) ¿la mutación

αSNAP.M105I provoca una disminución de la interacción de αSNAP con membranas

lipídicas? (II) ¿La mutación M105I de αSNAP altera su función fisiológica normal? y si

esta respuesta es afirmativa, cabe preguntar (III) ¿de qué forma esta mutación altera la

interacción de αSNAP con lípidos? Y por último (IV) ¿Qué efectos, en un contexto

fisiológico, conlleva esta mutación?

18

El siguiente trabajo está enfocado en responder la siguiente hipótesis:

“La mutación M105I de αSNAP provoca una disminución en su interacción

con lípidos”

19

4. HIPOTESIS Y OBJETIVOS

4.1. Hipótesis general.

“La mutación M105I de αSNAP provoca una disminución en su interacción con

lípidos”

4.2. Objetivo General.

1. Evaluar la interacción de αSNAP.M105I con lípidos y compararla con la interacción

de αSNAP WT.

4.2.1. Objetivos Específicos.

1. Evaluar la distribución subcelular de αSNAP en cultivos celulares primarios

- Ensayos de inmunofluorescencia en MEFs

2. Confirmar la reducción de la interacción de αSNAP.M105I con membrana plasmática

sugerida en ensayos bioquímicos.

- Ensayos de interacción mediante microscopía TIRF utilizando láminas de

membrana plasmática y proteínas recombinantes

3. Evaluar interacción directa de αSNAP WT y la mutante M105I con lípidos

- Estandarización de los ensayos de flotación de liposomas

- Ensayos de flotación con liposomas de lecitina de soya.

20

- Ensayos de flotación en fracciones enriquecidas en membranas

“desproteinizadas”

- Ensayos de flotación en liposomas preparados a partir de lípidos de cerebro

(fracciones enriquecidas en membrana plasmática y fracciones enriquecidas en

membranas livianas o intracelulares)

21

5. MATERIALES Y METODOS

5.1. Animales de experimentación.

Los experimentos realizados se llevaron a cabo en ratones de la cepa B6C3Fe-a/a-

Napahyh/J de estadio postnatal PN1 o 2-3 meses de edad con genotipos WT para

αSNAP. No se hizo distinción de sexo.

Los ratones fueron criados en el bioterio de Neurociencias del Instituto de Anatomía,

Histología y Patología, de la Universidad Austral de Chile, siendo mantenidos bajo

régimen de pellet y agua ad libitum, en un fotoperiodo 12/12 hrs de luz/oscuridad y con

una temperatura ambiental media de 25°C.

5.1.1. Genotipificación.

Previo a realizar extractos cerebrales y cortes para inmunofluorescencia, se procedió

a realizar genotipificación de los animales mediante el método ACRS-PCR descrito por

Bátiz et al. (2009).

5.1.2. Materiales y equipos.

Termomixer Vortemp 56 (Labnet), micropipetas de 10/20/200/1000µL (Biopette,

Labnet), fuente de poder Enduro 250 V (Labnet), centrífuga Biofuge Pico (Heraeus) con

rotor #3325, cámara de electroforesis Mini Protean Tetra Cell y sistema Casting Stand

(Bio-Rad), vidrios de 0.75 mm de grosor y peinetas de 10 pocillos (Bio-Rad),

transiluminador Vilber Lourmat (Arquimed), termociclador Multigene (Labnet),

microtubos para PCR de 0.2 ml (TCL Ltda.) y tubos eppendorf 1.5 ml (TCL Ltda.), hielo.

22

5.1.3. Reactivos.

Buffer TEL (Tris-HCl 50 mM pH 8.0 (Winkler); EDTA 50 mM (Bio-Rad); NaCl 100 mM

(Merck); SDS 0.5% P/V (Bio-Rad)), proteinasa K 10 mg/mL (Bioline), etanol absoluto

(Merck), agua libre de nucleasas (IDT), buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0 (Winkler);

EDTA 1 mM (Bio-Rad)), partidores IDT ‘hyh-reverse’ y ‘hyh-forward’ diseñados según

Bátiz et al. (2009), dNTPs (Invitrogen), Taq polimerasa (Gentileza CECS), buffer PCR

10x (Invitrogen), MgCl2 50mM (Invitrogen), enzima de restricción BspHI (BioLabs New

England), acrilamida/aisacrilamida 29:1 (Winkler), buffer TBE 10x (Winkler), persulfato

de amonio 10% (Winkler), TEMED (Winkler), DNA ladder Generuler 100 bp

(Fermentas), SybrSafe DNA Gel Stain (Invitrogen).

5.1.4. Extracción de DNA.

Se cortaron 2-4 mm de la parte distal de la cola de cada ratón y se depositó cada una

de ellas en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. A cada tubo se agregaron 500 μL de buffer

TEL con 10 µL de proteinasa K y se digirió en Termomixer hasta que se desintegró el

tejido a 55.5°C en agitación de 80 rpm. Luego se centrifugaron a 10000 x g por 10

minutos y se trasvasijó el sobrenadante a un tubo Eppendorf con 750 µL de etanol

100%. Se agitó suavemente por inversión y se centrifugó a 13000 x g por 25 minutos.

Se eliminó el sobrenadante, se agregaron 500 µL de etanol al 70% y se centrifugó a

10000 x g por 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se dejó secar el tubo invertido

sobre papel absorbente durante aproximadamente 30 minutos. Finalmente el pellet (que

contiene el DNA) se resuspendió en 150 µL de buffer TE, dejándose en agitación en el

Termomixer durante 90-120 minutos a 50°C.

23

5.1.5. Reacción de PCR.

Sobre hielo, se preparó mix con 5 µL de buffer 10x, 3 µL de MgCl2, 0.8 µL de cada

partidor, 2 µL de dNTPs, 1 µL de Taq polimerasa y 33.4 µL de agua libre de nucleasas,

por cada muestra a genotipificar. Luego se agregó a cada tubo de PCR 46 µL de mix ya

preparado y 4 µL de DNA previamente extraído. El programa de PCR se realizó según

lo descrito por el autor.

5.1.6. Digestión enzimática del producto de PCR obtenido.

El producto de PCR se sometió a la acción de una enzima de restricción (BspHI),

para lo cual se preparó mix con 2 µL de buffer de digestión 10X, 7.85 µL de agua libre

de nucleasas y 0.15 µL de la enzima de digestión BspHI (10000 U/ml) por cada muestra

a digerir. A cada tubo se le agregó 10 µL de mix y 10 µL del producto de PCR,

incubándose en agitación durante 6 horas a 37°C en Termomixer.

5.1.7. Geles de acrilamida y tinción con SybrSafe.

Luego de digerir el producto de PCR, se agregó a cada tubo 4 µL de buffer de carga

10x. Posteriormente se cargaron 8 µL de estas muestras en un gel poliacrilamida-TBE

al 20% siendo sometidas a electroforesis a 70 V durante 2 horas. Finalmente el gel se

tiñó con solución de SybrSafe (50 ml TBE 1X con 4 µl de SybrSafe) por 20 minutos en

oscuridad y se observó el patrón de digestión en el transiluminador, siendo interpretado

de acuerdo a lo descrito por Bátiz et al. (2009), en genotipo WT o hyh.

24

5.2. Aislamiento y manipulación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs).

5.2.1. Materiales.

Material quirúrgico estéril (tijeras finas, pinzas, hojas de afeitar), placas de Petri

estériles (10 cm de diámetro), pipetas serológicas, tubos Falcon de 50 ml (Becton-

Dickinson), centrífuga refrigerada de alta velocidad para tubos Falcon (Neofuge 15R

Speed, HealForce Bio-Meditech).

5.2.2. Reactivos.

PBS 1x estéril, medio de cultivo para MEFs (DMEM (HyClone), suero fetal bovino

(Santa Cruz Biotechnologies), solución de aminoácidos no esenciales (Gibco, Life

Technologies), solución 100x penicilina-estreptomicina (Gibco, Life Technologies))

filtrado y esterilizado en autoclave, etanol 70%, tripsina (Gibco, Life Technologies).

5.2.3. Procedimiento.

Se sacrificó una hembra preñada de 13.5 días post coito por dislocación cervical.

Se removieron los cuernos uterinos, se lavaron brevemente con etanol 70% y se

traspasaron a una placa con PBS 1x estéril. Se realizaron 3 lavados con PBS 1x estéril.

Posteriormente, se separó cada embrión de su placenta y la membrana circundante,

para traspasarlo a una placa de Petri nueva, se lavó tres veces con 10 ml de PBS 1x,

removiendo el exceso de PBS 1x con pipeta serológica. Se cortó cada cerebro e

hígado, se lavó el cuerpo del embrión con PBS 1x fresco, removiendo la mayor cantidad

de sangre posible. Se cortó el cuerpo del embrión con tijeras estériles en tamaños

grandes y se añadió 2 ml de tripsina, para volver a cortar el cuerpo en tamaños más

25

pequeños. Se agregaron 5 ml más de tripsina, se pipeteó vigorosamente y se dejó

incubar por 30 minutos a 37°C. Se transfirió la solución a un tubo Falcon de 50 ml y se

agregó 20 ml de medio de cultivo de MEF fresco, dejando que las piezas de tejido

decanten en el fondo de tubo por unos minutos y se tomó el sobrenadante, el cual fue

sometido a centrifugación de baja velocidad por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante

obtenido, el pellet fue resuspendido en medio de cultivo de MEF tibio y se traspasó a

placa de Petri de 10 cm. El medio de cultivo fue cambiado al día siguiente.

5.3. Inmunocitoquímica de MEFs.

5.3.1. Fijación de MEFs.

Después de obtener una confluencia adecuada, se eliminó la mitad del medio de

cultivo y se colocó el mismo volumen de PFA 4% en PBS 1x por 15 minutos a RT.

Posteriormente, se retiró completamente el medio y se adicionó 300 μl de PFA 4% en

PBS 1x por 15 minutos a RT. Luego se lavó 3 veces por 5 minutos cada una a RT.

5.3.2. Permeabilización y Bloqueo.

Los cubreobjetos fueron incubados con PBS 1x/0,7% carragenina/0,1% saponina,

por 60 minutos a RT.

5.3.3. Anticuerpos.

Se utilizó anticuerpo anti-αSNAP isotipo ratón, a una dilución 1/100. El anticuerpo

utilizado fue el clon 15D4 de la empresa Exalpha. Se incubo con el anticuerpo diluido

durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Posteriormente se lavó 3 veces con

26

PBS 1x y luego se incubó los cubreobjetos con el anticuerpo secundario AlexaFluor 488

anti-mouse por 1 hora a temperatura ambiente, en cámara húmeda y en oscuridad.

Luego Se lavó 3 veces con PBS 1x y se incubó con DAPI por 10 minutos a temperatura

ambiente y en oscuridad. Después se lavó 2 veces con PBS 1x.

5.3.4. Montaje de cubreobjetos.

Los cubreobjetos fueron invertidos sobre portaobjetos con una de medio de montaje

Fluoromount de la empresa Sigma Aldrich. Los bordes fueron sellados con esmalte para

uñas.

5.4. Preparación de Lípidos.

5.4.1. Preparación de liposomas de lecitina de soya.

Se disolvieron 50 µg de lecitina de soya sólida en 5 ml de buffer HBS (145 mM NaCl,

5 mM HEPES pH 7,4) por agitación magnética durante 1 hora a temperatura ambiente,

obteniéndose un estándar de 10 mg/ml de liposomas de lecitina de soya de tamaños

variados. Posteriormente, toda, o parte del estándar fueron pasados por filtros de ptfe

de 0.45 µm con ayuda de una jeringa de 5 ml. El tamaño de los liposomas resultantes

fue confirmado mediante el equipo Zetasizer Nano Series.

27

5.4.2. Obtención de LP1 y P3.

5.4.2.1. Obtención y Homogeneizado de tejido cerebral de ratón.

5.4.2.1.1. Materiales.

Material quirúrgico estéril, placas Petri de vidrio 90x15 mm, tubos Eppendorf de 1.5 ml

(TCL Ltda.), tubos Falcon de 15 ml (Becton-Dickinson). Micropipeta de 1000 µl

(Biopette, Labnet), homogenizador tipo Potter Elvehjem (Glas-Col/Clarkson Laboratory

& Supply Inc.) con pistilos de teflón y tubos para 15 ml (Thomas Scientific), hielo.

5.4.2.1.2. Reactivos.

Etanol 70%, PBS 1x, medio de homogeneización (sacarosa 320mM (Merck),

EGTA 0.5 mM (Merck), Tris-HCl 5 mM pH 7.4 (Winkler)), cocktail inhibidor de proteasas

1mg/mL (Sigma-Aldrich-p8340), PMSF 100 mM (Sigma Aldrich)

5.4.2.1.3. Procedimiento.

Los animales fueron sacrificados por decapitación, obteniendo cerebros y colas para

extractos y genotipificación respectivamente. Los cerebros se congelaron en tubos

Eppendorf a -80°C mientras se realizaba la genotipificación. Todo este procedimiento

se realizó sobre placas Petri y en hielo. Se utilizaron alrededor de 10 cerebros para la

obtención de extractos cerebrales de ratones PN1 y 5 cerebros para ratones de 2 a 3

meses de edad. Aún congelados se pesaron y se depositaron en tubos Falcon para

dejar descongelando en hielo.

28

5.4.2.2. Fraccionamiento diferencial.

La idea de este paso es obtener fracciones enriquecidas de organelos subcelulares,

tales como una fracción rica en membranas endosomales y citosol, permitiendo el

análisis de interacción proteica de αSNAP con proteínas presentes en estas fracciones

de forma exclusiva.

5.4.2.2.1. Materiales y equipos.

Centrífuga refrigerada de alta velocidad para tubos Falcon (Neofuge 15R Speed,

HealForce Bio-Meditech), ultracentrífuga, (Hitachi, CP100WX/Rotor P100AT2),

micropipeta 1000 µl (Biopette, Labnet), tubos Falcon 15 ml (Becton-Dickinson).

5.4.2.2.2. Reactivos.

Buffer de homogeneizado (mismo utilizado anteriormente), buffer A2 (buffer de

homogeneizado + NaCl 150 mM (Merck)), buffer A3 (buffer A2 + Triton X-100 2% V/V

(Sigma)), buffer para lisis de sinaptosomas (DTT 1 mM (Promega), EGTA 0.5 mM

(Merck), Tris-HCl 5 mM pH 8.1 (Winkler)) , buffer de resuspención de fracción LP1 (NB)

(HEPES 20 mM pH 7.4 (Sigma), EDTA 2 mM (USBiological), KCl 100 mM, DTT 1 mM

(Promega), Polietilenglicol 4000 1% P/V con inhibidores de proteasas (50 µL/mL de

buffer) (Sigma-Aldirch) y PMSF 1mM (Sigma-Aldrich).

29

5.4.2.2.3. Fracción P2 y S2.

Después de la obtención de pesar los cerebros cerebral, estos fueron

homogenizados con 10 veces su peso en volumen de Buffer A (sacarosa 320 mM,

EGTA 0,5 mM, Tris-HCl 5 mM pH 7,4) más inhibidores de proteasas (PMSF 1 mM,

Coctel Inhibidores 50 µl/ml de buffer). Se homogenizó a 900 rpm en un dando 12

strokes.

Una vez homogenizado el tejido, se centrifugó a 800 x g a 4°C por 10 minutos. Se

obtuvo P1 (Células no rotas y núcleos) y S1; la fracción P1 se descartó. El

sobrenadante S1 se centrifugó a 9200 x g durante 15 minutos a una temperatura de

4°C. Se obtuvo P2 (Sinaptosomas; membrana plasmática de neuronas) y S2

(membranas livianas internas: Golgi, RER, etc.). A partir de la fracción P2 obtendremos

LP1 y de la S2 obtendremos P3.

5.4.2.2.4. Obtención de LP1.

La Fracción P2 se resuspendió en el mismo volumen inicial de buffer A utilizado al

principio del protocolo y se volvió a centrifugar por 15 minutos a 9200 x g a 4°C,

obteniéndose de esta forma la fracción P2’ (sinaptosomas lavados). Para obtener

sinaptosomas puros, es decir solo la membrana plasmática (LP1), P2’ se resuspendió

con buffer de lisis (DTT 1 mM, EGTA 0,5 mM, Tris-HCl 5 mM pH 8,1) en un volumen

equivalente a 3 veces el volumen de P2’. Luego de romper los sinaptosomas mediante

shock hipoosmótico durante 30 minutos a 4°C, P2’ se centrifugó a 22000 x g por 30

minutos a 4°C. Se obtuvo el pellet LP1 (membrana plasmática de sinaptosomas) y el

30

sobrenadante S3, el cual es descartado. La fracción LP1 se resuspendió con buffer NB

(20 mM Hepes, pH 7,4; 2 mM EDTA; 100 mM KCl; 1 mM ditiotreitol; 1% w/v PEG 4000)

con inhibidores de proteasas (PMSF 1 mM, Coctel Inhibidores 50 µl/ml de buffer). El

volumen utilizado de buffer NB es variable, pero cuando se trabaja con 1.5 gramos de

cerebro, usualmente se utiliza 1 ml de buffer NB para resuspender la LP1 resultante.

5.4.2.2.5. Obtención de P3.

El sobrenadante S2 se centrifugó por 2 horas a 165.000 x g a 4°C. El pellet fue

resuspendido en buffer NB.

5.4.3. Eliminación de proteínas periféricas e integrales de LP1.

5.4.3.1. Carbonatación de LP1 – Eliminación de proteínas periféricas.

Este protocolo es adaptado de uno previamente descrito (Steel et al. 1997). La

fracción LP1 se diluyó a una razón de 1 volumen de muestra (Volumen inicial) en 4

volúmenes de buffer Na2CO3 100 mM pH 11,5 y se dejó en hielo por 30 min;

posteriormente se centrifugó a 22000 x g durante 30 minutos a 4°C. El pellet obtenido

se resuspendió en el mismo volumen inicial de buffer NB. Este proceso se repitió dos

veces para la máxima eliminación de proteínas periféricas de membrana.

31

5.4.3.2. Tripsinización de LP1 – eliminación de proteínas integrales

(eliminación incompleta)

Protocolo descrito previamente con algunas modificaciones (Steel et al. 1997). Luego

de la carbonatación de la LP1, esta se centrifugó a 22000 x g durante 30 minutos a 4°C,

para luego resuspenderla con (usualmente 2 ml) tripsina a una concentración de 0.5

mg/ml. Se dejó en incubación durante 40 minutos a 37°C. Se detuvo la actividad de la

tripsina con PMSF 1 mM durante 10 minutos en hielo. Luego se centrifugó a 10000 x g

a 4°C por 30 minutos. El pellet se resuspendió en el mismo volumen inicial de la

alícuota.

5.4.3.3. Extracción de proteínas integrales restantes de LP1.

Para una eliminación completa de proteínas residuales de la LP1 carbonatada y

tripsinizada, esta se centrifugó a 22000 x g por 30 minutos a 4°C. 100 mg de proteína

(La LP1 tratada se cuantificó con un kit de cuantificación de proteínas, y se ocupó el

equivalente a 100 mg) se resuspendió en 25 ml de una proporción cloroformo:metanol

2:1 y se homogenizó a temperatura ambiente por agitación o con ayuda de un

homogenizador. Luego se centrifugó a 5000 x g durante 10 minutos a temperatura

ambiente, obteniéndose una fase solvente (aprox 20 ml) y una acuosa (buffer NB en

este caso). A la fase solvente, se le agregó 4 ml NaCl 0,9% p/v y se agitó por inversión.

Se dejó reposar para que las fases se separen y se extrajo la fase acuosa, la que

contiene proteínas residuales y contaminantes no lipídicos. Esta extracción se realizó 3

veces más utilizando NaCl 0,9%/cloroformo/metanol en una proporción 50:3:47.

Posteriormente, los lípidos fueron desecados bajo una corriente de Nitrógeno gaseoso

32

(N2) y resuspendidos con cloroformo:metanol (1:4). Un tubo nuevo se taró en una

balanza analítica, para luego verter en él la solución con los lípidos disueltos en

cloroformo:metanol. El solvente orgánico es evaporado con nitrógeno gaseoso y el tubo

se pesó nuevamente. Los lípidos son resuspendidos en el volumen de buffer que se

desee. En este trabajo, obtuvimos un estándar de LP1 8.95 mg/ml y un estándar de P3

10 mg/ml. Después, los lípidos fueron pasados 10 veces por un filtro de 0,2 µm

utilizando un extrusor.

5.5. Cuantificación de proteínas mediante método DC ProteinAssay (Bio-Rad)


Espectrofotómetro (SP830, Metertek), cubetas plásticas para espectrofotometría,

tubos Eppendorf de 1.5 ml (TCL Ltda.), micropipetas 10/20/200/1000 µl (Biopette,

Labnet), Vortex (Genie 2, Scientific Industries), planillas Excel para cálculos finales.

5.5.2. Reactivos.

DC ProteinAssay (Bio-Rad Laboratories).


Se construyó una curva de calibración de acuerdo a lo descrito en el inserto del

reactivo DC Protein Assay. Para ello, se preparó una solución de 2 mg/ml de BSA como

solución estándar y se dispuso de 7 tubos Eppendorf de 1.5 ml (con sus respectivos

duplicados). Para preparar las diluciones correspondientes, se procedió de acuerdo a la

tabla I.

33

Tabla I. Preparación de curva de calibración para determinación de proteínas.

Tubo Concentración

(µg/mL)

Tomar Agregar

Buffer

(µL)

Volumen Cant.

Prot. (µg) µL Del tubo Pre-dil Post dil

1 2000 160 Stock

BSA

0 160 50 40 2 1500 60 1 20 80 55 30

3 1000 50 1 50 100 55 20

4 750 25 2 25 50 50 15

5 500 45 3 45 90 50 10

6 250 40 5 40 80 50 5

7 125 30 6 30 60 60 2,5

34

Antes de cuantificar la concentración de proteínas totales obtenidas, las muestras

fueron diluidas con buffer A (o buffer A2, dependiendo de la muestra) en razón 4:16 y

en algunos casos 2:18, lo que varía según qué tan concentrada esté la muestra. Luego

se agregaron 100 µl de reactivo A, 4 µl de reactivo S y 800 µl de reactivo B,

homogenizando en vórtex inmediatamente cada tubo Eppendorf. Las muestras se

incubaron por 15 minutos en oscuridad y posteriormente se procedió a medir la

absorbancia a la longitud de onda de 750 nm. Finalmente, se calculó la concentración

proteica obtenida, interpolando en la curva de calibración construida y multiplicando por

el factor de dilución de las muestras. La preparación de las muestras para

concentración proteica, se realizaron en duplicado.

5.6. SDS-PAGE, Western Blot, tinción con nitrato de plata.


Electroforesis: tubos Falcon de 50 y 15 ml (Becton-Dickinson), micropipetas de

10/20/200/1000 µl (Biopette, Labnet), vidrios de 1.5 mm de grosor con su vidrio de

cubierta (BioRad Laboratories), sistema Mini Protean Casting Stand with clamp para

preparación de geles (BioRad Laboratories), peinetas de 1.5 mm con 10 ó 15 pocillos

(BioRad Laboratories), vortex (Genie 2, Scientific Industries), estanque de Corrida Mini

Protean Tetra Cell (BioRad Laboratories), fuente de poder Enduro 250 V (Labnet),

Termobloque.

Electrotransferencia: estanque de Transferencia Mini Trans Blot Cell (BioRad

Laboratories), membranas de PVDF 0.45 µm (Immobilon-P Transfer Membrane,

35

Millipore Corp, USA), sistema de cassette, peineta verde (ambos de BioRad

Laboratories).

Hibridación con anticuerpos: recipientes plásticos para hibridación, estufa con

agitación (Shake´N´Bake, Hybridization Oven, Model 136400, (Boekek Scientific)),

micropipetas 10/20/200/1000 µl (Biopette, Labnet), cassette para exposición de

películas, transparencias limpias y secas, películas para autorradiografia (Kodak

Biomax MR Film), sala oscura.

Tinción con nitrato de plata: material de vidrio (probetas graduadas de 100 y 250 ml

(TCL Ltda.)), probeta de plástico de 100 ml (TCL Ltda.), fuentes de vidrio, micropipetas

de 1000 µl (Biopette, Labnet), agitador (GCA/Precision Scientific), papel aluminio,

purificador de agua (Barnstead Easypure II, Thermo Scientific).

5.6.2. Reactivos.

Electroforesis: buffer de corrida (Tris 25 mM pH 8.3 (Winkler), glicina 192 mM (Bio-

Rad), SDS 1% (Bio-Rad)), acrilamida-bisacrilamida 30% (Sigma Aldrich), persulfato de

amonio 10% (Winkler), TEMED (Winkler), stacking buffer (Tris 25 mM (Winkler), SDS

0,2% (Bio-Rad)), Tris-HCl 1,5 mM pH 6,8 (WInkler), SDS 10% (Bio-Rad)), agua

destilada, buffer de carga 2x (agua destilada, Tris 1 M pH 6.8 (Winkler), glicerol (Sigma),

SDS 10% (Bio-Rad), β-mercaptoetanol (Sigma), azul de bromofenol (Merck)), marcador

de peso molecular (Prestained molecular weight, Fermentas).

Electrotransferencia: metanol absoluto (Merck), buffer de transferencia (Tris 25 mM

pH 8.3 (Winkler), Glicina 192 mM (Bio-Rad) Metanol 20% (Merck)), Hielo.

36

Hibridación con anticuerpos y revelado: PBS 1x, buffer de anticuerpo (BSA 1% P/V

(Santa Cruz Biotechnologies)), Tween 20 1% V/V (Winkler), PBS 1x), anticuerpos

primarios (ver Tabla 2), anticuerpo secundario goat Anti–mouse IgG 1:40000 conjugado

a HRP (ThermoScientific), anticuerpo secundario goat Anti–rabbit IgG 1:40000

conjugado a HRP (ThermoScientific), kit de quimioluminiscencia (Immobilon Western

Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore), solución de revelado D-72 y solución

fijadora U3.

Tinción con nitrato de plata: metanol absoluto (Merck), ácido acético glacial (Merck),

tiosulfato de sodio (Merck), nitrato de plata (Merck), revelador (formaldehido 37% 50

µl/100 ml (Winkler), carbonato de sodio 3 g/100 ml (Merck)), tiosulfato de sodio (0.2 g/L)

2 ml/100 ml (Merck), EDTA (Merck) y agua ultrapura.


5.6.3.1. Electroforesis.

Se prepararon geles SDS-PAGE al 10% de 1.5 mm de espesor y con 15 pocillos. Se

realizó una mezcla en razón 1:1 con buffer de carga 2x y la muestra a analizar, dejando

en termoblock a una temperatura y tiempo dependientes del ensayo (análisis de

extractos: 70°C por 3 minutos; análisis de CoIP: 90°C por 5 minutos; Pulldown: 60°C

por 3 minutos). Luego de esto, se procedió a cargar el gel: en el primer carril del gel se

cargaron 5 µl del estándar de peso molecular y en los siguientes carriles se cargaron

los extractos o ensayos a analizar. Finalmente, los geles se corrieron a 80-100 V

constantes en buffer de corrida durante 2-2.5 horas.

37

5.6.3.2. Electrotransferencia.

Se cortaron trozos de membrana de PVDF de 8.5 x 5.5 cm y se secaron a 37°C

durante 30 minutos en estufa de hibridación. Luego, se incubaron en metanol absoluto

durante 15 segundos y posteriormente 15-30 minutos en buffer de transferencia para

equilibrarlas. Terminada la corrida electroforética, se humedecieron los geles con buffer

de transferencia y se procedió al armado del “sándwich” con la precaución de no dejar

burbujas entre el gel y la membrana. Se transfirió a 0.25 Amperios constantes durante 2

horas con unidad refrigerante. Al terminar la transferencia, las membranas se incubaron

nuevamente en metanol absoluto por 15 segundos y se secaron a 37°C en estufa de

hibridación por alrededor de 15 minutos.

5.6.3.3. Hibridación con anticuerpos y revelado.

Una vez seca la membrana, se incubó con el anticuerpo primario en la dilución

correspondiente en buffer de anticuerpo, durante 2 horas a 37°C sobre estufa de

hibridación en agitación continua. Luego, se sometieron a 3 lavados con PBS 1x

durante 5 minutos cada uno y luego se incubaron con el anticuerpo secundario por 30

minutos en estufa de hibridación. Nuevamente, se realizaron 3 lavados con PBS 1x. Los

anticuerpos realizados se resumen en la tabla II.

Para el revelado, se utilizó el kit de quimioluminiscencia, incubándose con 1mL de

cada solución en oscuridad durante 5 minutos en agitación. Se colocaron las

membranas en transparencias limpias y se expusieron en oscuridad sobre film

fotográficos Kodak. Finalmente, las películas se revelaron con solución D-72 y se fijaron

con solución fijadora U3.

38

Tabla II. Anticuerpos utilizados para hibridación en el método de inmunoblot.

Anticuerpo Peso

Molecular

Características Dilución Proveedor

Anti αSNAP

clones 4E4 y 15D4

35 kDa IgG1 de ratón,

monoclonal

1:800 Exalpha

Anti N-Cadherina 136 kDa IgG de ratón,

monoclonal

1:800 Invitrogen

Anti Sintaxina 35 kDa IgG de conejo,

policlonal

1:1000 Santa Cruz

Biotechnologies

Anti Rabbit

conjugado a

peroxidasa

- IgG de cabra,

policlonal

1:40000 Thermo Scientific

Anti Mouse

conjugado a

peroxidasa

_ IgG de cabra,

policlonal

1:40000 Thermo Scientific

39

5.7. Tinción con nitrato de plata.

Al haber terminado con la corrida electroforética, el gel se sumergió en una fuente de

vidrio que contenía una solución de metanol 50% y ácido acético al 10%, incubándola

por 30 minutos. Se descartó esta solución y se incubó por 15 minutos con metanol 5%.

Luego de esto, se procedió a lavar tres veces con agua ultrapura por 5 minutos o, en

caso de no poder continuar, se dejó en agua ultrapura hasta volver a retomar el

protocolo. Se incubó con tiosulfato de sodio 0.2 g/L durante 120 segundos, se

realizaron 3 lavados de 30 segundos con agua ultrapura, para luego incubar con nitrato

de plata 0.2 g/100 ml durante 25 minutos. Posteriormente, se realizaron 3 lavados por

30 segundos con agua ultrapura y se incubó con revelador hasta desarrollar la señal

óptima. Se detuvo el desarrollo con EDTA 14 g/L por 10 minutos y finalmente se lavó

con agua destilada. Para obtener las imágenes de los geles, éstos se colocaron entre

dos transparencias limpias y se procedió a escanear o tomar fotografías.

5.8. Ensayo de Flotación.

En este trabajo, utilizamos dos protocolos de flotación, uno llamado “A” (el primero

que utilizamos) descrito por Hofer et al. (2010) y el otro llamado “B”, descrito por Steel

et al. (1997).

5.8.1. Protocolo A.

En un tubo centrifuga de aproximadamente 1 ml, se incubaron los lípidos (en este

caso, liposomas de lecitina de soya, LP1 carbonatada y tripsinizada o liposomas de LP1

40

pura) junto con la proteína recombinante a evaluar (αSNAP WT o αSNAP.M105I). En

todos los ensayos se agregó 3,6 µg de proteína recombinante y una cantidad específica

de lípidos (descrita en resultados). Se completó un volumen de 300 µl con el buffer

utilizado, que para el protocolo antiguo fue buffer HBS. Luego de incubar por 5 minutos

a 37°C, se agregó 200 µl de sacarosa 75% (p/v) en buffer HBS y se mezcló

vigorosamente con los 40 µl anteriores, obteniéndose 500 µl de una solución de

sacarosa 30% (p/v). Luego, cuidadosamente se agregó 400 µl de una solución

sacarosa 25% (p/v) en buffer HBS para luego adicionar en la parte superior, 100 µl de

buffer HBS. Luego se centrifugó a 240000 x g durante 4 horas a 37°C. Luego se

obtuvieron 10 fracciones de 100 µl desde arriba del gradiente de densidad. Este

gradiente de sacarosa fue solamente utilizado en primer experimento de flotación con

lecitina de soya observado en la figura 3. Luego se cambió por una 60%/50%/0 descrito

en el aparato materiales y métodos 2.3.2.

5.8.2. Protocolo B.

En esencia, este protocolo es idéntico al anterior, en el cual solamente cambia el

gradiente de densidad y las condiciones de centrifugación. Se incubó 3,6 µg de

proteínas recombinante con una cantidad determinada de lípidos y se completaron 40 µl

con buffer NB; se incubó a 37°C por 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 160 µl de

una solución 75% sacarosa (p/v) en buffer NB. Se mezcla vigorosamente, obteniéndose

200 µl de una solución 60% sacarosa (p/v). Después se agregó 700 µl de sacarosa 50%

(p/v) en buffer NB y se agregó en la superficie, 100 µl de buffer NB solo. Luego los

41

tubos fueron centrifugados a 140000 x g durante 1.5 horas a 37°C. Luego se obtuvieron

10 fracciones de 100 µl desde arriba del gradiente de densidad.

5.8.3. SDS-PAGE después del ensayo de flotación.

Después de obtenidas las fracciones en el ensayo de flotación, estas fueron corridas

en condiciones especiales. Se preparó un gel de acrilamida al 10% utilizando un gel

stacking al 4% sin SDS. Se tomaron exactamente 22,5 µl de cada fracción y se les

agregó 7,5 µl de buffer de carga que no contenía SDS. Es muy importante este detalle,

ya que un exceso de SDS, junto con los lípidos presentes en las muestras, puede

causar la agregación de αSNAP y verse un patrón característico en el gel. El buffer de

corrida y el gel separador si fueron hechos con SDS. Las muestras fueron corridas a

80v durante aproximadamente 2,5 horas. Luego, los geles fueron visualizados mediante

tinción de plata o Western blot.

5.9. Ensayo de láminas de membrana plasmática.

5.9.1. Preparación de láminas de membrana plasmática.

Protocolo previamente descrito por Barszczewski et al. (2008). Se cultivaron células

PC12 en cubre objetos previamente tratados con poli-lisina y se esperó una confluencia

de aproximadamente 80%. El cubre objetos se montó en una cámara llena con Buffer

K-Glu (ice cold, 20 mM HEPES pH 7.2, 120 mM de glutamato de potasio, 20 mM de

acetato de potasio, 2 mM EGTA) que contiene además: 10 mM 1,3-diamino-2-propanol-

N,N,N’,N’-tetraacetic acid (DPTA), 2 mM ATP, 4 mM MgCl2, y 0.5 mM dithiothreitol

42

(DTT). Con un sonicador previamente encendido, Se sumergió la punta de éste dentro

de la cámara y se dieron pequeños pulsos (de 0.5 segundos aprox.). Usualmente se

requirió un solo pulso. Luego, estas células previamente transfectadas con

sinaptofisina-GFP, fueron observadas en microscopio de TIRF. Después de obtenidas

las láminas de membrana, se cambia el buffer K-Glu ice cold, por un K-Glu a

temperatura ambiente.

5.9.2. Inmunoensayo de las láminas de membrana.

Protocolo adaptado de uno previamente descrito (Barszczewski et al. 2008). Las

láminas de membrana se incubaron con 2 µM de αSNAP recombinante a 37°C por 5

minutos, en una cámara húmeda con buffer K-Glu (20 mM HEPES pH 7.2, 120 mM de

glutamato de potasio, 20 mM de acetato de potasio, 2 mM EGTA) con 10 mM DPTA, 2

mM ATP, 4 mM MgCl2 y 0.5 mM DTT. Posteriormente, se lavó con PBS durante 10

minutos a 37°C. Estas luego se fijaron con PFA 4% durante 60-90 minutos a

temperatura ambiente. Se interrumpió la fijación con 50 mM NH4Cl en PBS por 20

minutos a temperatura ambiente. Se lavó 3 veces con PBS, 10 minutos cada vez. Se

incubó a temperatura ambiente por 60 minutos con anticuerpo primario (Anti-αSNAP,

mouse), con una dilución 1:200. Se lavó 3 veces con PBS por 10 minutos. Después, se

incubó con anticuerpo secundario (Alexa 594 Anti-mouse) con una dilución 1:400 por 60

minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Todo el proceso se llevó a cabo en

una cámara húmeda. Posteriormente, las láminas de membrana fueron visualizadas

utilizando un microscopio TIRF.

43

5.10. Proteínas Recombinantes

Las proteínas αSNAP WT y αSNAP.M105I utilizadas en este trabajo fueron

previamente obtenidas por mi tutor, el Dr. Federico Bátiz en colaboración con el Dr.

Gonzalo Mardones, ambos de la Universidad Austral de Chile. Para la producción de

dichas proteínas, se utilizaron construcción para proteínas de fusión con tag GST

(glutatión-S-transferasa). Como templado se utilizaron los plásmidos pcDNA3.1 para

αSNAP WT y el plásmido pET28a conteniendo el cDNA de αSNAP.M105I. Ambas

construcciones fueron secuenciadas para confirmar la fidelidad del procedimiento. Se

transformaron bacterias de Escherichia coli B834 (DE3) de alto rendimiento, se indujo la

síntesis (mediante IPTG), y luego se purificaron las proteínas mediante cromatografía

de afinidad en columnas de glutatión-Sepharose. Finalmente se analizaron las

eluciones mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Interesantemente,

se obtuvo una mayor expresión de αSNAP.M105I en comparación con su versión WT,

lo que indicaría una mayor solubilidad (Figura 5a). Ambas proteínas fueron digeridas

con la proteasa TeV para escindir el tag GST y luego purificadas mediante columnas de

(i) Superdex200, (ii) glutatión-Sepharose (eliminación de GST), y (iii) Ni-sepharose

(eliminación de TeV) (Fig. 5a-d).

45

Figura 5. Producción y purificación de proteínas recombinates alfa-SNAP.wt y

alfa-SNAP.M105I. (A) Tinción de Commassie blue de una electroforesis en gel de

poliacrilamida (NU-PAGE) de las fracciones eluidas secuencialmente (#1, #2, #3) a

partir de las columnas de Glutation-Sepharose para GST-a-SNAP.wt (carriles 2, 3 y 4)

y GST-a-SNAP.M105I (carriles 6, 7 y 8). En todos los carriles se cargó elmismo

volumen (26ul); carril 5 sin muestra. Nótese la producción relativa de a-SNAP.M105I en

comparación a a-SNAP.wt. (B) 13,4ul de un pool GST-a-SNAP.wt (#1+2; carril 2) y

2,7ul de un pool de GST-a-SNAP.M105I (#1+2; carril 4) fueron digeridos con la

proteasa TeV para escindir GST de a-SNAP, observándose que la reacción enzimática

es efectiva y que las proteínas tienen los tamaños esperados (carriles 3 y 5,

respectivamente). (C-D) Purificación de las proteínas recombinantes a-SNAP.wt (C) y

a-SNAP.M105I (D) mediante pasajes secuenciales y sucesivos a través de Superdex-

200 (carriles 5), glutation-Sepharose (carriles 6; elimina la proteína GST) y Ni-

Sepharose (carriles 7; elimina la TeV). En los carriles 2 se muestra un extracto del

cultivo crudo + IPTG; en los carriles 3 los pooles #1+2 GST-a-SNAP; y en los carriles 4

los mismos pooles +TeV.

46

6. RESULTADOS

6.1. Localización de αSNAP en MEFs.

6.1.1. La mutación M105I de αSNAP provoca una menor localización de

ésta en membrana plasmática de fibroblastos embrionarios de ratón.

αSNAP es una proteína que posee una distribución celular dependiente del tipo

celular donde se observe. Se ha descrito que αSNAP en cerebro y páncreas se

encuentra mayoritariamente a nivel citosólico (Kiraly-Borri et al. 1996); por contraparte,

en células tipo 2 alveolares y células cromafines, esta proteínas se encuentra

mayoritariamente en la periferia de la célula, es decir, en la membrana plasmática

(Banaschewski et al. 1998; Abonyo et al. 2003). Estos estudios fueron realizados en

células cuya actividad depende notoriamente en su capacidad de fusionar vesículas con

su membrana plasmática, por ende, es de esperar que una mutación en αSNAP

provoque un fuerte impacto en su función y distribución. En efecto, se ha descrito que la

mutación M105I en αSNAP provoca su hipomorfismo (menores niveles de proteína) en

tejido nervioso (Chae et al. 2004; Hong et al. 2004). Adicionalmente, estudios previos

en nuestro laboratorio demuestran que la distribución subcelular de αSNAP se

encuentra alterada en tejido nervioso, presentando una menor asociación con

membrana plasmática. Sin embargo, no se conoce si este hecho es también una

realidad en otros tejidos, especialmente en aquellos con una menor función secretoria.

Con esto en mente, se evaluó la distribución subcelular de αSNAP en fibroblastos

embrionarios de ratones (MEFs, por sus siglas en inglés) WT (αSNAP WT) y hyh

47

(αSNAP.M105I). Tal como se esperaba, αSNAP.M105I presenta una localización

alterada respecto a αSNAP WT. Se observa que αSNAP WT presenta una localización

relativamente difusa, destacando una alta inmunorreacción en la periferia de la célula,

en y/o en la proximidad de la membrana plasmática; por contraparte, y en concordancia

con lo observado en tejido nervioso, αSNAP.M105I está menos asociada a membranas,

incluso adoptando una distribución mayoritariamente perinuclear (Fig. 6).

48

WT

hyh hyh

* *

Figura 6. Expresión de αSNAP en fibroblastos embrionarios (MEFs) WT y hyh. Las

MEFs WT presentan un patrón de distribución subcelular de α-SNAP caracterizado por

la presencia de una intensa inmunorreacción en la membrana plasmática de estas

células (flechas dobles en WT e inserto). Por el contrario, en las MEFs hyh se observa

un patrón completamente anómalo, con una distribución más difusa, concentrándose

fundamentalmente en la región perinuclear (asterisco). Las barras corresponder a 10

µm. la barra del inserto corresponde a 2 µm. Medidas aproximadas.

49

6.2. Interacción de αSNAP con láminas de membrana plasmática.

6.2.1. αSNAP.M105I interacciona menos con láminas de membrana

plasmática de células PC12 en comparación con αSNAP WT.

Tal como se indicó anteriormente, estudios bioquímicos realizados en nuestro

laboratorio utilizando proteínas recombinantes habían demostrado que αSNAP.M105I

presenta una reducción en su asociación a membranas; sin embargo, dada la

naturaleza de los experimentos donde se utilizaron extractos enriquecidos en

membrana plasmática, los defectos observados podrían no ser tales en membranas

plasmáticas que mantengan la conformación y distribución de sus componentes

proteicos y lipídicos. Para estudiar esto, evaluamos la interacción de αSNAP WT

recombinante y de αSNAP.M105I recombinante con láminas de membrana plasmática

fabricadas a partir de células PC12 mediante microscopía TIRF (colaboración con el

laboratorio del Dr. Sebatián Brauchi de la Universidad Austral de Chile). Se eligieron

estas células por su gran citoplasma (es decir, posee una superficie considerable de

membrana plasmática). Brevemente, para realizar esta metodología se cultivan células

PC12 sobre cubreobjetos con poli-lisina y con ayuda de un sonicador se rompe la parte

superficial de las células, quedando solamente la membrana plasmática adherida al

vidrio. Posteriormente, las láminas de membrana se incuban directamente con αSNAP

WT o M105I recombinante, se lavan y luego se realiza una inmunofluorescencia que es

analizada en un microscopio TIRF (Fig. 7a). Se utilizaron células PC12 transfectadas

con sinaptofisina-GFP para poder identificarlas y distinguir la integridad de las láminas

luego de la sonicación. Así, previo a la realización de los ensayos, las células PC12 son

observadas por epifluorescencia para ubicarlas en el cubreobjetos.

51

Figura 7. Ensayos de interacción en láminas de membrana. A. Esquema que

muestra cómo se realiza el ensayo. Básicamente, las células (PC12) son

localizadas mediante epifluorescencia y TIRF y luego sometidas a 3 pulsos de

sonicación quedando sólo las membranas plasmáticas adheridas a los

cubreobjetos. Luego estas láminas de membranas son incubadas con proteína

recombinante αSNAP (WT o M105I), lavadas y procesadas para

inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo específico para αSNAP.

Finalmente, son analizadas mediante microscopía TIRF. B. Grupos de células (i, ii,

iii) sometidas al ensayo visualizadas mediante epifluorescencia (Epi), TIRF y TIRF

luego de la sonicación (TIRF + sonic). Los recuadros en cada imagen indican la

región que se analizó después del procesamiento (incubación con proteína

recombinante + inmunofluorescencia indirecta). Nótese que con el procedimiento,

partes de las membranas se despegan del cubreobjeto. C. Las tres imágenes

superiores corresponden a las regiones indicadas en B y son representativas de los

resultados obtenidos mediante incubación con αSNAP WT y αSNAP.M105I. Como

control se utilizaron membranas incubadas con solamente con los anticuerpos

utilizados para α-SNAP. Las imágenes inferiores corresponden a la convolución de

las imágenes superiores para realizar la cuantificación de los spots (ImageJ). D.

Cuantificación de los spots obtenidos mediante convuloción de imágenes. Las

barras representan el promedio ± SEM (n=3). * p<0,001 respecto a la incubación

con proteína WT (Student’s t-test). La barra corresponde a aproximadamente 10

µm y es representativa de las demás imágenes.

52

Posteriormente, estas son visualizadas mediante TIRF, permitiendo observar solo la

porción más cercana al vidrio, en otras palabras, se observa la membrana plasmática

inferior de las células PC12. Luego, estas son sonicadas y lavadas, quedando

solamente la membrana adherida al vidrio (Fig. 7b).

Los resultados obtenidos mediante la incubación de láminas de membrana

plasmática con proteína recombinante WT y M105I, permitieron demostrar que αSNAP

WT se asocia considerablemente más a la lámina en comparación con αSNAP.M105I

(Fig. 7c). Este hecho queda aún más de manifiesto cuando la imagen resultante se

deconvoluciona, para su posterior análisis densitométrico (Fig. 7d).

53

6.3. Interacción de αSNAP WT y αSNAP.M105I con lípidos.

6.3.1. αSNAP WT y αSNAP.M105I no interaccionan con lecitina de soya –

Protocolo A.

Todos los resultados obtenidos hasta aquí, confirman que αSNAP.M105I se asocia

menos con membrana plasmática que αSNAP WT. Sin embargo, todos los ensayos han

sido realizados utilizando membranas, lo que no permite descartar si los defectos se

deben a una reducción en la interacción directa con lípidos. Para evaluar si

αSNAP.M105I interacciona en menor grado con lípidos en comparación a αSNAP WT,

se realizaron experimentos de flotación utilizando liposomas construidos a partir de

lecitina de soya (Epikuron). Los ensayos de flotación se realizaron según Höfer et al.

con algunas modificaciones (Hofer et al. 2010). Brevemente, en un tubo de micro

ultracentrífuga se incuba una cantidad específica de proteína recombinante αSNAP con

80 veces esa cantidad en liposomas (1:80 – 3,6µg de αSNAP recombinante WT o

M105I: 288µg de liposomas de lecitina de soya). Luego de la incubación, se adiciona

cuidadosamente un gradiente de sacarosa (30%-25%-0%) hasta completar 1 ml.

Posteriormente se centrifuga a 240.000 x g por 4 horas a temperatura ambiente y se

recolectan 10 fracciones partiendo desde arriba hacia abajo (Fig. 8a). El fundamento del

experimento reside en que los lípidos/liposomas, al ser menos densos que el gradiente

de sacarosa, flotan, y si la proteína evaluada interacciona con estos liposomas, será

recolectada en las primeras fracciones (arriba, usualmente en las fracciones 1, 2 y 3).

Luego, las fracciones son analizadas mediante electroforesis en geles de poliacrilamida

para su posterior visualización con tinción con plata.

54

C

B

A

55

Figura 8. Ensayos de flotación de αSNAP – Sin lípidos. A. Esquema que muestra

en forma básica el flujo de trabajo en los ensayos de flotación utilizados en la presente

tesis. Brevemente, se incuba la proteína recombinante con lípidos específicos en el

fondo de un tubo, luego se crea un gradiente de densidad, se centrifuga y se recolectan

las fracciones para su posterior análisis. B. Análisis mediante tinción de plata de un

ensayo de flotación (análisis de 10 fracciones de un total de 10 fracciones

recolectadas). En este caso, se añadió αSNAP (3,6 μg) pero no se agregaron lípidos.

Nótese que αSNAP no “flota” a las fracciones superiores en estas condiciones. C.

Análisis densitométrico del ensayo de flotación de B. El porcentaje del total de αSNAP

de cada fracción corresponde a la normalización de cada banda por la sumatoria

densitométrica de las bandas correspondiente a las 10 fracciones.

56

Para tener una mejor comprensión del experimento, se utilizaron como control ensayos

donde solamente se hizo flotar αSNAP pero sin incubarla previamente con lípidos (1:0)

(Fig. 8b). Un análisis densitométrico de este gel nos permite observar que aunque

αSNAP no flote en estas condiciones, el total de la proteína se distribuye de forma

decreciente desde la fracción 10 hasta la fracción 7 (Fig. 8c) considerándose fracciones

no flotantes.

En la Figura 9 se muestran los resultados de los ensayos de flotación de αSNAP WT

y αSNAP.M105I con liposomas de lecitina de soya. Para considerar que hubo flotación

se debería observar un aumento de la cantidad de proteínas en las fracciones 3-1

respecto a las fracciones 6-4 (arrastre). En la figura 9a se muestran dos geles

representativos donde se observa que si bien existe un desplazamiento de αSNAP WT

(control) más allá de las fracciones no flotantes (10-7), no se observa un incremento en

los niveles de proteína en las fracciones 3-1 respecto a las 6-4, lo cual es corroborado

mediante análisis densitométrico (Fig. 9b). El hecho de que no pudiéramos obtener

flotación con nuestra proteína control (αSNAP WT) hizo cuestionar la metodología

utilizada. Incluso, la recuperación de liposomas en las primeras fracciones fue muy

difícil de obtener. Más aún, al realizar los ensayos con la proteína M105I se vio que esta

era detectada en las fracciones 3-1 en mayor proporción que la WT (Fig. 9c).

57

A

B C

% d

el

tota

l d

e

SN

AP

WT

M105I

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

F ra c c ió n

% d

el

tota

l d

e

SN

AP

1234567891 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

W T

h y h

58

Figura 9. αSNAP WT y αSNAP.M105I no interaccionan con lecitina de soya –

(Protocolo A). A. Ensayo de flotación incubando αSNAP WT o αSNAP.M105I (3,6 μg)

con liposomas de lecitina de soya (288 μg). En este experimento, se utilizó un

gradiente de densidad 30%-25%-0% de sacarosa y se centrifugó a 240.000 x g durante

4 horas a RT. La línea segmentada muestra las fracciones superiores donde se

recuperan manualmente la mayor parte de los lípidos. Las fracciones fueron analizadas

por SDS-PAGE y visualizadas mediante tinción de plata B. Análisis densitométrico de

los geles obtenidos en A. Se puede apreciar que la proteína se mantuvo

predominantemente en el fondo del tubo (últimas fracciones). C. Sumatoria de las

bandas (densitometricamente) correspondiente a las primeras tres fracciones

recolectadas (3, 2 y 1). Como la mayor parte de los lípidos son recuperados en estas

fracciones, el total de la proteína recombinante recuperada en ellas se considera

proteína flotante. A pesar de esto, se observa un arrastre de las proteínas (WT y

M105I) hacia las fracciones superiores y no una flotación asociada a lípidos, ya que en

las fracciones 6, 5 y 4 se observa la misma cantidad de proteína que en las fracciones

3, 2 y 1.

59

6.3.2. No existen diferencias significativas en la interacción de αSNAP WT

respecto a αSNAP.M105I con lípidos obtenidos de cerebro de ratón

(LP1) – Protocolo A.

En consideración los resultados anteriores, donde no se observó flotación de αSNAP

WT (aumento en fracciones 3-1 respecto a las fracciones 6-4) a pesar de que había

sido descrito que esta proteína interacciona con lípidos (Steel et al. 1997; Winter et al.

2009), pero si encontrar proteína más allá de las fracciones 10-7 o no flotantes, se

puede atribuir, por lo menos, a dos hechos: (i) que αSNAP no interacciona

adecuadamente con los lípidos que contiene la lecitina de soya y/o (ii) que el protocolo

es muy severo (velocidad de centrifugación) para una proteína anfipática como αSNAP;

de hecho, este protocolo ha sido diseñado para ser utilizado con proteínas que

interaccionan fuertemente con lípidos.

Para descartar o confirmar la posibilidad de que αSNAP interaccione con algún tipo

de lípido específico que no está presente o este poco representado en la lecitina de

soya ocupada en los experimentos, decidimos realizar los mismos experimentos pero

utilizando fracciones enriquecidas en membrana plasmática de cerebro de ratón y

reduciendo la presencia de las proteínas endógenas.

Para ello utilizamos un protocolo de centrifugación diferencial que permite la

obtención de un extracto crudo de membranas sinaptosomales o P2. Luego, los

extractos P2 fueron sometidos a una lisis hipoosmótica y centrifugación para obtener

extractos enriquecidos en membrana plasmática o LP1 (Fig. 10a). Luego, las fracciones

LP1 se trataron con un buffer de carbonato de sodio a pH básico con el fin de eliminar

la mayor parte de proteínas periféricas, incluyendo αSNAP endógena (Fig. 10b).

60

35

28

48

63

75

130 180

100

KDa

LP1 (T) LP1 (P’) αSNAP A C LP1

B

61

Figura 10. Tratamiento de fracciones LP1 con carbonato de sodio a pH básico y

tripsina. A. Fracción LP1 sin tratamiento (T) analizada mediante SDS-PAGE y tinción

de plata. B. Análisis mediante Western blot para αSNAP, N-cadherina y sintaxina 1 de

fracciones LP1 tratadas con carbonato de sodio a pH básico (eliminación de proteínas

periféricas) y con tripsina (eliminación de dominios extra membranosos de proteínas

integrales). Este tratamiento se realizó con el propósito de eliminar la mayoría de los

dominios de interacción proteicos de estas membranas (metodología detallada en

materiales y métodos). T: LP1 sin tratamiento; P: LP1 después de dos carbonataciones

consecutivas, nótese la reducción o casi completa eliminación de αSNAP (proteína

periférica) y la persistencia de N-cadherina y sintaxina 1 luego de este tratamiento; S1:

sobrenadante de la primera extracción de proteínas periféricas con Na2CO3; S2:

Sobrenadante de la segunda extracción con Na2CO3, nótese que casi la totalidad de

αSNAP es eliminada de LP1 en el primer tratamiento; P’: LP1 carbonatada tratada con

tripsina (“LP1 tratada”). Nótese que las proteínas integrales, N-Cadherina y Sintaxina

son eliminadas después de la tripsinización de las fracciones LP1 carbonatadas. C.

Fracción “LP1 tratada” (P’) analizada mediante SDS-PAGE y tinción de plata. Se puede

observar que después de dos carbonataciones secuenciales y una tripsinización, no se

elimina la totalidad de las proteínas. Sin embargo, se logra una reducción suficiente de

las proteínas de alto-medio peso molecular, lo cual se consideró apropiado para los

ensayos de flotación posteriores.

62

Luego, este extracto de membranas carbonatadas fue tratado con tripsina, con la

intención de eliminar la mayor cantidad de dominios citosólicos (y extracelulares) de las

proteínas transmembrana, los cuales podrían servir de dominios para interacción

proteína-proteína con αSNAP e interferir en los resultados de los ensayos. Para

confirmar esto, se utilizaron como control dos proteínas transmembrana presentes en la

membrana plasmática y que se ha demostrado son capaces de interactuar con αSNAP,

como N-cadherina y sintaxina 1 (Fig. 10b). Finalmente, para chequear los efectos de los

tratamientos, muestras de LP1 tratadas fueron analizadas mediante SDS-PAGE y

tinción de plata. Los resultados demuestran que, si bien con estos tratamientos no se

eliminan todas las proteínas de LP1, gran parte de las proteínas de alto y medio peso

molecular son virtualmente eliminadas (Fig. 10c). Después de varios controles, se

determinó que utilizar el equivalente de 100 µg de proteína en LP1 tratada era la mejor

concentración para realizar este experimento.

63

Habiendo estandarizado el protocolo para la obtención de LP1 tratadas, se realizaron

ensayos de flotación utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente aunque con

otro gradiente de densidad (60%/50%/0% sacarosa).

En estos ensayos, al igual que en los de flotación ocupando liposomas de lecitina de

soya, la recuperación de LP1 en las primeras fracciones fue dificultosa, incluso

inutilizando algunos experimentos (ver más adelante). Aun así, al igual que en los

ensayos con liposomas de lecitina de soya, la mayor parte de las LP1 tratadas fueron

recuperadas en las fracciones 3-1, siendo la fracción 2 la de mayor concentración (Fig.

11a). Interesantemente, al utilizar LP1 en lugar de liposomas de lecitina de soya, se

observó que αSNAP WT presentó un perfil claramente compatible con flotación

(aumento en las fracciones 3-1 en comparación a las fracciones 6-4) (Fig. 11b). Este

patrón también se observó al utilizar αSNAP.M105I, y si bien la tendencia indica que

αSNAP.M105I tiende a interaccionar menos con lípidos (flotar), el análisis estadístico de

los estudios densitométricos no arrojó diferencias significativas entre ambas

condiciones. En efecto, la cantidad relativa de αSNAP que interactúa con LP1 (o

fracción flotante) se cuantificó mediante la razón entre la densitometría de la fracción

flotante (1+2+3) y la densitometría total (1+2+3+4….+10) expresada en porcentaje. Así,

para αSNAP WT la fracción flotante fue de 17,77% ± 3,2% (SEM) y para αSNAP.M105I:

12,4% ± 1,3% (SEM) (Fig. 11c). Estos estudios incluyeron un n=8 para αSNAP WT y

n=6 para αSNAP.M105I y el análisis estadístico mediante el t-test de Student arrojó una

p=0,0782 entre las dos condiciones.

64

F ra c c io n e s

% d

el

tota

l d

e

SN

AP

1234567891 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

W T

M 1 0 5 I

% d

el

tota

l d

e

SN

AP

WT

M105I

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

C B

A

65

Figura 11. Flotación de αSNAP WT y αSNAP.M105I con LP1 tratada. Se realizaron

ensayos de flotación incubando 3,6 μg de αSNAP WT recombinante o αSNAP.M105I

recombinante con 100 μg de proteína equivalente en LP1 tratada (más detalle en

materiales y métodos). El protocolo utilizado fue el “protocolo A”: 240.000 x g durante

4 horas a RT, sin embargo, se cambió el gradiente de densidad por uno 60%-50%-0%

de sacarosa. A. Análisis mediante tinción de plata de cuatro ensayos representativos

de flotación. La línea segmentada muestra las fracciones superiores donde se

recolectaron manualmente la mayoría de la LP1. B. Densitometría de los geles en A.

Se puede observar que tanto αSNAP WT como αSNAP.M105I “flotaron” a las

fracciones superiores. C. Sumatoria de la flotación obtenida de αSNAP (WT y M105I)

en las primeras tres fracciones recolectadas. αSNAP WT floto un promedio de 17,77%

± 3,2% SEM (n=8) y αSNAP.M105I floto un promedio de 12,4% ± 1,3% SEM (n=6). No

existen diferencias significativas entre la flotación de ambas proteínas. Análisis T de

Student (P=0,0782). La LP1 fue obtenida a partir de cerebros de ratones PN1.

66

6.3.3. No existen diferencias significativas en la interacción de αSNAP WT

respecto a αSNAP.M105I con lípidos obtenidos de cerebro de ratón

(LP1) – Protocolo B.

Con los resultados obtenidos, concluimos que la utilización de LP1 en lugar de

lecitina de soya hacía más robusto el experimento. De hecho, se observó flotación de la

proteína control (α-SNAP WT). Sin embargo, la dificultad para recuperar las fracciones

lipídicas sugería que el protocolo era demasiado severo, en términos mecánicos, como

para medir la interacción de una proteína anfipática y que solo interacciona con lípidos

en un 30% en condiciones óptimas (Steel et al. 1997). Como ejemplo, en la figura 12 se

observa como el patrón de bandeo de bajo peso molecular, característico de las LP1

tratadas, aparece en la mayoría de las fracciones, invalidando de forma inmediata el

experimento. Con estos antecedentes, decidimos ocupar un protocolo de centrifugación

más suave que el anterior. Para ello, adaptamos el protocolo utilizado por Steel et al. en

1997 a nuestros requerimientos, utilizando centrifugaciones a 140.000 x g por 1.5h a

37°C. Para comprobar si este protocolo era efectivo, se realizó un control donde se hizo

flotar LP1 sola. Tal como se esperaba, una disminución del 41.6% en la velocidad de

centrifugación (de 240.000 a 140.000 x g) y una reducción del 62.5% en el tiempo de

centrifugación hicieron que luego de la flotación, los lípidos eran totalmente visibles en

las parte superior del tubo, y su recolección fue considerablemente más fácil en

comparación con el protocolo A (Fig. 13a y b; comparar con Fig. 12).

67

Figura 12. Recolección inapropiada de los lípidos en un ensayo de flotación

aleatorio – Protocolo A. Utilizando el protocolo A, la recolección de lípidos es

extremadamente difícil. Observando el patrón característico de la tinción de plata de

una alícuota de LP1 (imagen derecha) podemos concluir que en este experimento, la

LP1 fue recolectada a lo largo de todas las fracciones, concentrándose notoriamente

en las fracciones 10, 9, 7 y 4. Gel inutilizado para posteriores análisis.

69

Figura 13. Recolección correcta de lípidos – Protocolo B. La recolección de lípidos

fue considerablemente más acotada y fácil cuando el protocolo se cambió a un más

adecuado para proteínas con interacción débil con lípidos (protocolo: 140.000 x g

durante 1,5 horas a 37°C; gradiente de densidad 60%-50%-0%). A. Ensayo de flotación

donde solo se centrifugó LP1 tratada. Utilizando tinción de plata, se observa que la LP1

agregada fue recuperada mayoritariamente en la fracción 2. B. Flotación de

αSNAP.M105I con LP1 tratada. La mayoría de los lípidos (LP1) se concentraron en las

fracciones 3, 2 y 1.

70

Los experimentos de flotación realizados de aquí en adelante fueron llevados a cabo

utilizando este nuevo protocolo (Protocolo B).

De forma destacable y en contraste con el resultado obtenido cuando αSNAP (WT o

M105I) no flotó cuando fue incubada con liposomas de lecitina de soya, cuando el

experimento fue repetido pero esta vez ocupando el protocolo B, tanto αSNAP WT

como αSNAP.M105I flotaron con lecitina de soya (Fig. 14a). Es más, αSNAP WT flotó

un 24%, mientras que αSNAP.M105I solo flotó un 14% (Fig. 14b y c). Lamentablemente

no fueron realizadas más repeticiones de este experimento y, si bien este resultado

preliminar sugiere que la utilización de liposomas de lecitina de soya puede ser una

buena herramienta para evaluar diferencias en la interacción con lípidos entre αSNAP

WT y M105I, es necesario hacer más repeticiones para poder obtener conclusiones.

Por otro lado, cuando el mismo protocolo fue utilizado incubando αSNAP con LP1

(Fig. 15), este no tuvo un mayor impacto en comparación con los resultados antes

descritos (Fig. 11b,c versus Fig. 15b,c) e incluso la variación entre resultados se

incrementó. El análisis estadístico de la densitometría no arrojó diferencias significativas

entre los ensayos con la proteína WT (n=5) y aquellos con la proteína mutada (n=4)

(p=0,3335; test t de Student) (Fig 15c).

71

Figura 14. αSNAP WT y αSNAP.M105I interaccionan con liposomas de lecitina de

soya utilizando el protocolo B. A. Ensayos de flotación donde se incubo 3,6 µg de

αSNAP WT o M105I con 288 μg de liposomas de lecitina de soya. Nótese que tanto

αSNAP WT como αSNAP.M105I flotaron con lecitina de soya utilizando el protocolo B,

en contraposición con resultados obtenidos previamente. La línea segmentada muestra

las fracciones superiores donde se recolectaron manualmente la mayoría de los

liposomas de lecitina de soya. Fracciones analizadas mediante tinción de plata B.

Análisis densitométrico de las fracciones obtenidas en A. C. Sumatoria de la flotación

obtenida en las primeras tres fracciones.

72

Figura 15. Flotación de αSNAP WT o αSNAP.M105I con LP1 tratada utilizando el

protocolo B. Se incubaron 3,6 μg de proteína recombinante αSNAP WT o

αSNAP.M105I con LP1 tratada equivalente a 100 μg de proteína y se utilizó el protocolo

B. A. Tinción de plata de resultados representativos obtenidos de ensayos de flotación.

La línea segmentada muestra las fracciones superiores donde se recuperaron la

mayoría de los lípidos manualmente. B. Análisis densitométrico de los geles obtenidos

en A. C. Sumatoria de la flotación de αSNAP WT o M105I de las primeras tres

fracciones. αSNAP WT flotó un promedio de 9,1% ± 2,1% SEM (n=5), mientras que

αSNAP.M105I flotó en promedio un 7,1% ± 3,8% SEM (n=4). No existen diferencias

significativa entre la flotación de ambas proteínas; t-student p=0,33. La LP1 fue

obtenida a partir de cerebros de ratón PN1.

73

6.3.4. αSNAP.M105I interacciona menos con liposomas LP1 en

comparación con αSNAP WT, pero su interacción con liposomas P3 no

se ve alterada.

En retrospectiva, aunque el protocolo B es un protocolo mucho más suave para este

experimento que el protocolo A, la variación observada entre los experimentos sugería

que debíamos optimizar la única variable que podía fluctuar entre un ensayo y otro: las

fracciones LP1. De hecho, tal como se mostró anteriormente, mediante carbonatación

más tripsinización de las fracciones LP1 no se elimina completamente el componente

proteico de estas fracciones (ver Fig. 10c). Además, el protocolo genera fragmentos de

membrana de diferentes tamaños y organizaciones, pudiendo diferir las características

de un ensayo a otro. Por esto, decidimos ir un paso más allá y eliminar totalmente

cualquier factor adicional que ocasionara una alteración en los resultados.

Adicionalmente, y considerando que estudios anteriores en nuestro laboratorio

mostraban que αSNAP WT estaba menos asociada a fracciones enriquecidas en

membranas livianas (fracción P3) respecto a fracciones LP1, decidimos también evaluar

la interacción de αSNAP WT y M105I con la fracción P3 (membranas livianas: Golgi,

RER, etc.) obtenida por centrifugación diferencial.

Para esto, se realizó un protocolo de preparación de liposomas a partir de lípidos de

cerebro (fracciones LP1 y P3). Básicamente, las fracciones LP1 (tratada previamente

con carbonato de sodio) y las fracciones P3, fueron sometidos a extracción de lípidos

utilizando una combinación de solventes orgánicos no polares (cloroformo) y polares

(metanol). Posteriormente, los lípidos fueron secados con nitrógeno gaseoso (se mide

su peso en seco) y rehidratados con el buffer a utilizar. Finalmente, con la mezcla de

74

lípidos obtenida se generaron liposomas de 0.2 µm mediante la utilización de un

extrusor. Así, con esta metodología se optimizó el tamaño de las partículas lipídicas y

su cantidad. De hecho, al conocer la cantidad de lípidos en miligramos, utilizamos una

proporción estable de 1:70 (3.6 µg de αSNAP: 250 µg de liposomas LP1 o P3).

En primer lugar, quisimos evaluar si αSNAP interacciona con membranas livianas

(fracción P3). Para eso, utilizamos el mismo protocolo de flotación B y comparamos los

resultados con otro experimento de flotación ocupando LP1 hecho en paralelo. Tal

como se esperaba, tanto αSNAP WT como αSNAP.M105I flotan cuando son incubadas

con P3, es decir, interaccionan con membranas livianas intracelulares (Fig.16a). Sin

embargo, y en concordancia con resultados obtenidos previamente en nuestro

laboratorio, αSNAP WT interacciona más del doble con LP1 en comparación con P3

(9.2% vs 4% respectivamente) (Fig. 16b). En comparación, αSNAP.M105I interaccionó

con P3 tan bien como lo hizo αSNAP WT (4% vs 3%). Interesantemente, αSNAP.M105I

interaccionó de la misma forma con P3 que con LP1 (3% vs 2.7%) (Fig. 16c), lo que

representa una fuerte reducción en su interacción con membrana plasmática en

comparación con αSNAP WT (9% vs 2.7%) (Fig. 16b, c). Al parecer, αSNAP.M105I

sigue interaccionando con lípidos, pero perdería de alguna forma su mayor afinidad por

membrana plasmática. Adicionalmente, se realizó un control donde se realizó un

experimento de flotación en el cual se incubo FBPasa (Fructosa 1,6 bifosfatasa, una

proteína involucrada en la gluconeogénesis en mamíferos y de la cual no se ha descrito

que interaccione con lípidos) con P3 o LP1 (Fig. 16a).

76

Figura 16. Flotación de αSNAP WT o M105I con Liposomas obtenidos de

fracciones LP1 o P3 de cerebro de ratón. Se realizaron ensayos de flotación

utilizando LP1 (membrana plasmática) o P3 (endomembranas; membranas de golgi,

RER etc.) purificadas con solventes orgánicos. Se incubó 3,6 µg de αSNAP WT o

αSNAP.M105I con 250 μg de liposomas de LP1 o P3. Adicionalmente se incubó 3,6 μg

de FBPasa, proteína utilizada como control negativo, con 250 μg de liposomas de LP1

o P3. Para todos los experimentos se utilizó el protocolo B. A. Tinción de plata de las

fracciones obtenidas de los ensayos de flotación correspondientes. En todos los casos,

los liposomas (LP1 o P3) fueron recuperados mayoritariamente en las primeras tres

fracciones (marcado por la línea segmentada). B. Comparación entre la flotación de

αSNAP WT con liposomas de LP1 o P3 en las primeras tres fracciones. C.

Comparación entre la flotación de αSNAP.M105I con liposomas de LP1 o P3 en las

primeras tres fracciones. D. Comparación de la flotación αSNAP WT, αSNAP.M105I con

liposomas de LP1 y de la flotación de FBPasa con liposomas de fabricados a partir de

LP1 o P3 de cerebro de ratón de las primeras 6 fracciones. La flotación esta expresada

en relación a la fracción numero 6 (cuyo valor fue posteriormente cambiado

arbitrariamente a 1), con el propósito de una comparación más ilustrativa. A modo de

ejemplo, es correcto decir que, en la fracción 1 de αSNAP WT con liposomas de LP1,

ésta flotó aproximadamente 8 veces más respecto a su fracción 6.

77

Tal como se esperaba, FBPasa no interaccionó con ninguno de los dos lípidos,

quedándose en el fondo del tubo tal como el experimento de la figura 8b. Estos

resultados contrastan notablemente con los obtenidos con αSNAP (Fig.16d).

Posteriormente, analizamos mediante WB las fracciones 3, 2 y 1 de los mismos

experimentos realizados en la figura 16. Las muestras fueron normalizadas con un input

que corresponde a 11,25 ng de αSNAP. En este análisis se comparó en un mismo gel

la diferencia que existía en la flotación de αSNAP WT o M105I con LP1 versus P3 (Al

igual que la figura 16). Podemos observar a simple vista que obtenemos el mismo

patrón obtenido mediante tinción de plata (Fig. 17a). Un vistazo a las figuras 17b y c,

nos indican que αSNAP WT interaccionó considerablemente más con LP1 que con P3.

En contraposición, αSNAP.M105I solo flotó un poco más con LP1 que con P3;

adicionalmente, se observa nuevamente, que tanto αSNAP WT o M105I interaccionan

de la misma forma con P3. La mayor gracia de este experimento es que nos permite

estimar cuantitativamente cuanta αSNAP efectivamente flotó a las fracciones

superiores. Considerando que el input corresponde a 4 µg de αSNAP disueltos en 8000

µl de buffer NB, donde posteriormente fueron cargados 22,5 µl en un gel, los que nos

da una cantidad de 11,25ng de proteína en el carril “input” de la figura 17a. observando

las razones respecto al input de los gráficos de la figura 17 y 17c, podemos calcular que

αSNAP WT flotó 138ng en total con LP1 (cada carril de las fracciones corresponden a

22,5 µl de un volumen total por fracción de 100 µl) en comparación con P3, donde solo

flotó 24 ng. Recordemos que en cada experimento de flotación son cargados 3,6 µg

(3600 ng) por tubo.

78

Figura 17. αSNAP.M105I posee una interacción reducida con LP1, pero no con P3.

A. Análisis mediante western blot de αSNAP WT o M105I de las primeras tres

fracciones obtenidas en los ensayos de flotación de la figura 16. Se comparó entre la

flotación de LP1 vs P3 de αSNAP WT o M105I. Nótese que se mantiene el mismo

patrón obtenido mediante tinción de plata obtenido en la figura 16. B. Análisis

densitométrico del gel obtenido para αSNAP WT en A. La densitometría fue

normalizada contra input que corresponde a 11,25 ng de αSNAP WT recombinante. C.

Análisis densitométrico del gel obtenido para αSNAP.M105I en A. La densitometría fue

normalizada contra input que corresponde a 11,25 ng de αSNAP.M105I recombinante.

79

Teniendo esto en cuenta, αSNAP WT flotó un 3,8% con LP1 y un 0,6% con P3. Por su

parte, αSNAP.M105I flotó 64ng con LP1 (1,7%) y 26ng con P3 (0,7%). Siendo

rigurosos, esta técnica no nos permite comparar diferentes geles. Por lo que solo

podemos decir que αSNAP WT flotó 6,3 veces más con LP1 que con P3, mientras que

αSNAP.M105I solo floto 2,4 veces más con LP1 que con P3.

Para poder comparar resultados mediante WB, estos deben estar en un mismo gel.

Utilizando el mismo criterio anterior, en la figura 18a y b podemos ver que αSNAP WT

efectivamente interacciona más con LP1 en comparación con αSNAP.M105I. Es más, el

mismo patrón se dio cuando se comparó la interacción de estas dos proteínas con P3

(Fig. 18c). De hecho, αSNAP WT flotó 283ng con LP1 mientras que αSNAP.M105I solo

flotó 95ng, lo que es casi 3 veces menos (en términos porcentuales del total de αSNAP

ocupada por experimento, αSNAP WT flotó 7,8% mientras que αSNAP M105I flotó

2,6%). En relación a P3, se mantiene el mismo efecto donde αSNAP WT flota 3,5 veces

más en comparación a αSNAP.M105I (92ng vs 26ng; 2,5% y 0,7% de flotación

respectivamente).

80

Figura 18. αSNAP.M105I interacciona menos con LP1 en comparación con αSNAP

WT. A. Análisis mediante Western blot de αSNAP WT o M105I de las primeras tres

fracciones obtenidas en los ensayos de flotación de la figura 16. Se comparó entre la

flotación de αSNAP WT o M105I con LP1 o con P3. B. Análisis densitométrico del gel

obtenido para αSNAP WT en A. La densitometría fue normalizada contra input que

corresponde a 11,25 ng de αSNAP WT recombinante. C. Análisis densitométrico del gel

obtenido para αSNAP.M105I en A. La densitometría fue normalizada contra input que

corresponde a 11,25 ng de αSNAP.M105I recombinante.

81

Para cerrar este experimento, se realizaron varias repeticiones (n=4) utilizando

liposomas obtenidos a partir de lípidos de fracciones LP1 o P3 de cerebro de ratón y el

protocolo B. En contraste con los resultados obtenidos utilizando LP1 carbonatada y

tripsinizada, los resultados obtenidos con liposomas de LP1 son mucho más estables

(Fig. 19a y b). Considerando que los lípidos después de su flotación son recuperados

en su mayor parte en las fracciones 3, 2 y 1 con el protocolo B, αSNAP WT flotó en

promedio un 8,3% ± 0,6% en contraposición a αSNAP.M105I que solo flotó un 5,5% ±

1,2%, existiendo una diferencia entre medias de 2,7% ± 1,3% lo cual es

significativamente diferente (P=0,04) (Fig. 19c). Con un nivel de confianza del 95%,

podemos decir que en un experimento dado, el 95% de las veces αSNAP WT flotará

entre 6,9% y un 9,6% (intervalo de confianza) mientras que αSNAP.M105I el 95% de

las veces flotará entre un 1,7% y un 9,4%. Como la diferencia entre la flotación de

ambas proteínas es significativa (p=0,0356), podemos decir con un 95% de confianza,

que αSNAP WT flotará más que αSNAP.M105I en cualquier experimento de flotación

con las condiciones aquí expuestas. Lamentablemente, no podemos hacer la misma

afirmación cuando estos datos fueron analizados mediante WB, ya que se obtuvo una

diferencia significativa menor al 95% (p= 0,09) (y datos no mostrados).

83

Figura 19. αSNAP.M105I interacciona significativamente menos con LP1 que

αSNAP WT. Se realizaron varios ensayos de flotación utilizando liposomas de LP1

purificados con solventes orgánicos. Se incubó 3,6 µg de αSNAP WT o αSNAP. M105I

con 250 μg de liposomas de LP1 y se centrifugo a 140.000 x g durante 1,5 horas a

37°C. A. Resultados representativos de los ensayos de flotación revelados con tinción

de plata. La línea segmentada indica las fracciones superiores donde se recuperó la

mayoría de los lípidos (liposomas de LP1). B. Densitometría de los geles obtenidos en

A. C. Comparación entre la flotación de αSNAP WT y αSNAP.M105I normalizado

versus el total de la proteína revelada en el gel. Sumando las primeras tres fracciones,

αSNAP WT flotó un promedio de 8,3% ± 0,4% SEM (n=4) mientras que αSNAP.M105I

flotó un promedio de 5,6% ± 1,2% SEM (n=4), habiendo una diferencia significativa

entre ambos (t-student; p=0,04). La LP1 fue obtenida a partir de cerebros de ratón de

2-3 meses de edad.

84

En conclusión, αSNAP WT interacciona con mayor afinidad con LP1 en comparación

a su versión mutante, αSNAP.M105I. En términos relativos, αSNAP WT interacciona

aproximadamente de 2 a 3 veces más con LP1 respecto a M105I. Adicionalmente, y

aunque no hay un gran número de repeticiones que corroboren lo siguiente, al parecer

tanto αSNAP WT como αSNAP.M105I interaccionan de igual manera con P3, por lo que

la versión mutante de αSNAP solo presentaría una fuerte disminución en la interacción

con membranas plasmáticas.

85

7. DISCUSIÓN

7.1. La asociación de αSNAP.M105I con membrana plasmática de fibroblastos

embrionarios de ratón esta reducida.

αSNAP es una proteína que es expresada en todos los tejidos del organismo

(ubicua) cuyo rol canónico es permitir eventos de fusión vesicular, al reciclar complejos

cis-SNAREs inactivos con ayuda de la ATPasa NSF. Sin embargo, la localización de

αSNAP a nivel celular depende considerablemente de la actividad de dicha célula. Por

ejemplo, como se dijo anteriormente, se ha descrito que αSNAP en cerebro y páncreas

se encuentra predominantemente a nivel citosólico (Kiraly-Borri et al. 1996), mientras

que en células cromafines adrenales y celular alveolares tipo 2, esta proteína se

encuentra en mayor proporción en la membrana plasmática (Banaschewski et al. 1998;

Abonyo et al. 2003).

Diversos estudios demuestran que la mutación espontanea de αSNAP, donde

cambia una metionina por una isoleucina en la posición 105 (αSNAP.M105I) provoca

fuertes cambios fenotípicos a nivel cerebral, caracterizado por denudamiento de células

ependimarias (neuroepitelio) e hidrocefalia entre otros. Posteriores estudios

descubrieron que αSNAP.M105I en ratones hyh presentaba un menor nivel proteico

(hipomorfismo) respecto a ratones WT (Chae et al. 2004; Hong et al. 2004). En adición,

mediante inmunofluorescencia, nuestro laboratorio ha descrito anteriormente que esta

mutación provoca una distribución subcelular anómala de αSNAP.M105I en tejido

nervioso. Efectivamente, al evaluar la localización de αSNAP en cultivos de fibroblastos

de ratón embrionario (E14.5) mediante inmunofluorescencia, nuestros resultados

86

indican que αSNAP WT presenta una localización mayoritaria en membrana plasmática,

mientras que αSNAP.M105I se encuentra mayoritariamente a nivel perinuclear e incluso

se observa un marcado hipomorfismo de esta proteína.

7.2. αSNAP.M105I interacciona menos con membrana plasmática.

αSNAP es una proteína anfipática que en diversos ambientes se encuentra asociada

a membranas o de forma soluble en el citosol. Diversos estudios han demostrado que

αSNAP WT interacciona con membrana plasmática (Barszczewski et al. 2008), e

incluso interacciona con lípidos puros, sin proteínas asociadas (Steel et al. 1997; Winter

et al. 2009). Considerando estos hechos, la menor localización de αSNAP.M105I en la

membrana plasmática de fibroblastos de ratón embrionario puede ser causa de un

defecto intrínseco de la proteína más que un problema con sus niveles proteicos

(recordar el hipomorfismo marcado). Para evaluar esta interrogante, se incubó αSNAP

WT y αSNAP.M105I directamente con láminas de membrana plasmática de células

PC12 a una concentración fija. Sorpresivamente, αSNAP WT interaccionó fuertemente

con estas láminas de membrana plasmática mientras que αSNAP.M105I interacciono

casi un 60% menos con estas. Este resultado por si solo es sumamente interesante, ya

que nos indica que efectivamente αSNAP.M105I interacciona menos con membrana

plasmática, indicando un posible defecto en la proteína y no un efecto secundario de su

hipomorfismo en ratones hyh. Tomando en cuenta los resultados de Steel et al. (1997)

y de Winter et al. (2009) podríamos especular que αSNAP.M105I interacciona menos

con los lípidos de membrana, pero no podemos descartar aún la posibilidad de que la

menor interacción de αSNAP.M105I por membrana plasmática sea debido a una menor

87

interacción con alguna proteína presente allí. En efecto, se ha descrito que tanto NSF

como αSNAP se unen y asocian a diversas proteínas (Whiteheart y Matveeva 2004). Se

ha descrito que el mayor receptor de αSNAP en membrana plasmática es sintaxina

(Hanson et al. 1995; Hayashi et al. 1995; Kee et al. 1995; McMahon y Sudhof 1995;

Barnard et al. 1996), pero también interacciona con otras proteínas, tales como canales

iónicos TRPC3 (Singh et al. 2004), receptores inotrópicos de glutamato AMPA (Osten y

Ziff 1999; Hanley et al. 2002) e incluso con el modulador pro-apoptótico BNIP1

(Nakajima et al. 2004). Es posible que la mutación M105I de αSNAP le provoque una

disminución con la interacción de alguna de estas proteínas u otras aún desconocidas y

eso provoque una distribución anómala a nivel celular.

7.3. La mutación M105I de αSNAP provoca una disminución en la interacción

con lípidos de membrana plasmática.

En base a los resultados anteriores, no podemos decir si αSNAP.M105I interacciona

menos con los lípidos de la membrana plasmática o con alguna proteína que la ubique

allí, sin embargo, existen estudios que apuntan a la primera hipótesis.

Chae et al. (2004) y Hong et al. (2004) describieron que αSNAP.M105I en ratones

hyh se encuentra en bajas cantidades (hipomorfismo) en cerebro, pero que sin

embargo, esta proteína era tan eficiente como αSNAP WT en desarmar complejos

SNAREs in vitro, indicando que la proteína no tiene fallas funcionales y que la causa de

la hidrocefalia de los ratones hyh seria en gran parte debido al hipomorfismo

característico de αSNAP.M105I. Batiz et al. (2009) por otra parte, experimentando en un

contexto celular, descubrió que el hipomorfismo presente en cerebro no era una

88

realidad en espermatozoides de ratones hyh. Describió además que estos

espermatozoides poseían un bajo índice de reacción acrosomática cuando eran

estimulados con Ca2+ (Elemento químico que gatilla eventos de exocitosis, (Tucker y

Chapman 2002)), índice que se recuperaba si estos espermatozoides eran

permeabilizados e incubados con αSNAP WT y no con αSNAP.M105I. Estos resultados

apuntan claramente a una falla funcional intrínseca de la proteína.

Hasta la fecha se han descrito dos formas de regulación de actividad de αSNAP que

podrían están alteradas en la proteína mutante: fosforilación e interacción con lípidos.

Considerando que la fosforilación de αSNAP disminuye su afinidad por los complejos

SNAREs, acelerando el reciclaje de estos, es poco probable que afecte la localización

basal de αSNAP en la membrana plasmática. Sin embargo, un defecto en la interacción

con lípidos podría claramente afectar la distribución de αSNAP a nivel celular.

Para evaluar si la mutación M105I provoca una reducción directa en la interacción

con lípidos, realizamos ensayos de flotación incubando αSNAP WT recombinante o

αSNAP.M105I recombinante con lecitina de soya. Considerando los resultados

obtenidos con el protocolo B, estos apuntan que efectivamente αSNAP.M105I parece

interaccionar menos con lípidos de lecitina de soya respecto a αSNAP WT.

Lamentablemente, no se realizaron repeticiones para comprobar este resultado.

La lecitina de soya que utilizamos en este trabajo contiene: 50,9% fosfatidilcolina,

12,4% fosfatidiletanolamina, 2,2% lisofosfatidilcolina, <1% ácido fosfatídico y <1%

fosfatidilinositol (se desconoce la composición lipídica del porcentaje restante). Dado

que en las membranas de organelos de células animales encontramos diferentes

lípidos (e.g. colesterol) y en diferente proporción, realizamos ensayos de flotación

89

incubando αSNAP WT o αSNAP.M105I con fracciones enriquecidas en membrana

plasmática (LP1) o en endomembranas (retículo endoplasmático, aparato de Golgi) (P3)

a partir de cerebro de ratón WT. Nuestros resultados indican que αSNAP.M105I

interacciona significativamente menos con LP1 en comparación con αSNAP WT. En

primera instancia, considerando que αSNAP flotó con lecitina de soya tan bien como lo

hizo con LP1, sugiere que αSNAP no presenta preferencia por algún lípido en

específico; sin embargo, la flotación de αSNAP WT se redujo un 50% aproximadamente

cuando se hizo flotar con P3 lo que concuerda totalmente con experimentos realizados

previamente en nuestro laboratorio. Interesantemente, parece ser que la mutación

M105I solo provoca una reducción en la interacción de αSNAP con membrana

plasmática (LP1) ya que su flotación con P3 es comparable con αSNAP WT. Existen

dos posibles explicaciones para este fenómeno: i) la mutación M105I de αSNAP

provoca una pérdida de afinidad por alguna proteína presente específicamente en

membrana plasmática y ii) esta mutación M105I provoca de alguna forma que αSNAP

pierda afinidad por algún lípido específico no presente en endomembranas. Debido a

que trabajamos con extractos de membrana plasmática y endomembranas purificadas

con solventes orgánicos, eliminando todos los contaminantes proteicos, la primera

opción parece no ser correcta. Es más, Whiteheart et al. (1992) indica que la interacción

de αSNAP con Golgi depende de SNAREs funcionales y no de su composición lipídica

lo que contrasta con los resultados que indican que αSNAP WT interacciona membrana

plasmática independiente de SNAREs.

90

7.4. αSNAP posiblemente interacciona con algún lípido en específico.

Los resultados anteriores sugieren que αSNAP presenta cierta afinidad por lípidos

presentes en la membrana plasmática, pero que están en menor proporción en Golgi o

en retículo endoplasmático. Sin embargo, no existen estudios que resuelvan dicho

enigma. Considerando solo nuestros resultados obtenidos hasta el momento, podemos

decir que el colesterol presente solo en células animales parece no ser determinante en

la interacción de αSNAP con lípidos, ya que esta proteína flotó con lecitina de soya tan

bien como floto con LP1. Entonces, ¿Qué diferencias en el perfil lipídico de membrana

plasmática, aparato de Golgi o retículo endoplasmático en mamíferos explican nuestros

resultados? diversos estudios han descrito que la membrana plasmática posee

aproximadamente el doble de fosfatidilserina (10% vs 6%) y un 33% menos de

fosfatidilinositol (12% vs 8%) en comparación con Golgi y retículo endoplasmático.

Adicionalmente, la membrana plasmática está altamente enriquecida en colesterol (de 3

a 6 veces más) y en esfingomielina (aproximadamente 3 veces más) en comparación

con endomembranas (van Meer 1998; van Meer et al. 2008). Con estos antecedentes,

se puede sugerir que la reducción de la interacción de αSNAP por endomembranas es

debido a que αSNAP interaccionaría con mayor afinidad por fosfatidilserina o con

esfingomielina, mientras que fosfatidilinositol tendría un efecto negativo, reduciendo su

interacción con lípidos. Considerando que αSNAP y αSNAP.M105I flotaron con lecitina

de soya, αSNAP también podría interaccionar con PC, PE, LPC o Acido fosfatídico.

Adicionalmente, es posible plantear otra hipótesis que explique estos resultados.

Ciertamente la mutación M105I en αSNAP provoca una distribución anormal a nivel

celular debido a una menor interacción con membrana plasmática. Sin embargo, con

91

los resultados aquí expuestos no podemos decir si esto es porque la mutación provoca

una disminución en la afinidad de αSNAP con algún lípido en específico ubicado

predominantemente en membrana plasmática, o de hecho, aumentaría la interacción de

αSNAP con otro lípido ubicado predominantemente en retículo endoplasmático, Golgi o

membrana nuclear. Interesantemente, en los ensayos de distribución subcelular de

αSNAP en fibroblastos de ratón (figura 6) podemos observar que αSNAP pierde su

ubicación en la periferia de la membrana plasmática y se ubica en las cercanías de la

membrana nuclear lo que apoyaría esta hipótesis.

7.5. Posibles consecuencias bioquímicas de la mutación M105I de αSNAP.

Como se discutió en la introducción, el residuo M105 es altamente conservado entre

especies (Chae et al. 2004) pero según Marz et al. (2003) y Winter et al. (2009), este

residuo no sería de importancia para la interacción directa con lípidos ni con SNAREs.

Entonces, ¿De qué forma la mutación M105I afecta la interacción de αSNAP con LP1?

Del punto anterior podemos deducir que αSNAP.M105I presentaría una reducción en la

afinidad por algún lípido en específico y eso provocaría su reducción en la interacción

con LP1, sin embargo cabe destacar que, existe la posibilidad de que αSNAP realmente

no interaccione con mayor afinidad por un lípido respecto a otro, sino que la presencia o

ausencia de aquel lípido produzca diferentes curvaturas en la membrana.

La mayoría de las membranas eucariontes contienen aproximadamente un 50% de

fosfatidilcolina, la cual al tener una forma geométrica cilíndrica se ordena

espontáneamente en una bicapa lipídica plana. Por contraparte, fosfatidiletanolamina

asume una geometría cónica y su incorporación a una bicapa compuesta de

92

fosfatidilcolina ejerce un estrés que produce curvatura (van Meer 1998). De hecho,

existen hélices anfipáticas y motivos ALPS, además de proteínas como α-sinucleina o

ArfGAP1 que censan curvatura de membrana (Bigay et al. 2005; Antonny 2011). Un

estudio reciente ha descrito que Lisofosfatidilcolina (un inductor negativo de la curvatura

de membrana) inhibe el desarme de complejos SNAREs tanto in vitro como in vivo,

mientras que colesterol (inductor positivo de la curvatura de membrana) promueve el

desarme de estos complejos (Shin et al. 2012). En concordancia con lo anterior,

variados estudios han descrito que las proteínas SNAREs se ubican en balsas lipídicas

compuesta de colesterol y que esto es fundamental para su función (Chamberlain et al.

2001; Lang et al. 2001; Gil et al. 2005; Puri y Roche 2006; Lang 2007; Chang et al.

2009; Tong et al. 2009; Vikman et al. 2009; Fraldi et al. 2010; Linetti et al. 2010). En

conclusión, es posible que la mutación M105I de αSNAP provoque una reducción en la

afinidad por algún lípido o una perdida en la sensibilidad por una curvatura de

membrana correcta. Futuros experimentos servirán para esclarecer estas dudas.

De todo lo dicho anteriormente, se desprende que posiblemente αSNAP prefiera

interaccionar con determinados lípidos o con membranas con un nivel de curvatura

específico, por lo tanto, no es de extrañar que, como se discutió con anterioridad,

αSNAP este distribuida tanto en citosol o en membrana plasmática según el tejido

(Kiraly-Borri et al. 1996; Banaschewski et al. 1998; Abonyo et al. 2003). Según varios

estudios, la composición lipídica de la membrana plasmática en diferentes tipos

celulares puede variar tremendamente. Por ejemplo, fosfatidilcolina varía desde un 27%

hasta un 50%; fosfatidiletanolamina varía entre 14% y 32,9%; fosfatidilinositol entre

5,8% y 9,6%; fosfatidilserina entre 2,8% y 6,4%; esfingomielina entre 2,8% y 29,6% y

93

colesterol entre 0,6% y 22,1% (Malviya et al. 1986; Calderon et al. 1995; Calderon y

DeVries 1997; Wubbolts et al. 2003; Brugger et al. 2006; Pankov et al. 2006; Subra et

al. 2007). Esta gran variación en el perfil lipídicos explicaría la posible diferencia en la

distribución de αSNAP WT en los distintos tejidos evaluados en la literatura. De esta

forma, αSNAP WT poseería algún mecanismo aún no descrito que le conferiría la

habilidad de interaccionar con uno o varios lípidos distintos o la habilidad para censar

una curvatura adecuada para su actividad. Según nuestros resultados, la mutación

M105I sufrida por esta proteína eliminaría este mecanismo, por lo que se perdería su

habilidad para censar estas diferencias en membranas tan distintas como membrana

plasmática o endomembranas (membrana de Golgi, Reticulo Endoplasmatico o

membrana perinuclear).

En nuestros experimentos de flotación utilizando LP1 carbonatada y tripsinizada (LP1

tratada), obtuvimos resultados muy variables en las distintas repeticiones, mientras que

cuando utilizamos liposomas de LP1 purificados con solventes orgánicos, las

repeticiones de los ensayos de flotación con αSNAP WT se estabilizaron. Una posible

explicación sería diferencias en el tamaño de los liposomas, es decir, una distinta

curvatura de membrana. Las alícuotas de LP1 tratada no fueron homogenizadas en un

tamaño fijo, por lo que se estos lípidos formaron liposomas altamente heterogéneos

(datos no analizados), explicando posiblemente porque en algunos ensayos de flotación

αSNAP interaccionó casi un 30% con lípidos, mientras que en otros ensayos casi no

interaccionaba. Si αSNAP WT realmente censa la curvatura de membrana, explicaría

por qué cuando utilizamos liposomas producidos a partir de lípidos de fracciones LP1

con un tamaño de aproximadamente 200 nm, los resultados se estabilizaron alrededor

94

de un 8% de flotación. De la misma forma, si αSNAP.M105I pierde la capacidad de

censar curvatura de membrana, explicaría porque los resultados no se estabilizaron

aunque hayamos homogenizado el tamaño de los liposomas.

Adicionalmente, existe otra posible explicación de estos resultados tan variables con

LP1 tratada. Se ha descrito que existen diferencias entre la composición lipídica de las

distintas mitades de una bicapa lipídica (Devaux y Morris 2004), como por ejemplo el

famoso caso de las señales “cómeme” donde células de mamíferos en apoptosis

mezclan ambas bicapas con ayuda de una proteína “escramblasa” exponiendo

fosfatidilserina hacia la hoja externa de la membrana (Ravichandran 2010; Suzuki et al.

2013). Es posible que en la formación de los liposomas construidos en este trabajo

hayan optado una conformación adecuada (es decir, con la hoja citosólica hacia afuera)

o una conformación inadecuada (hoja citosólica hacia adentro) para la interacción con

αSNAP, explicando la variación entre resultados. Se necesitan más experimentos para

determinar si la gran variación observada en los ensayos con LP1 tratada es causada

por tamaños de liposomas heterogéneos o por composición lipídica inadecuada.

Tomando en cuenta datos en la literatura, sumado a nuestros resultados, sugieren

que la composición lipídica, o diferencias en la curvatura de membrana (producto de la

composición lipídica) afectan la interacción de αSNAP con lípidos. Si esto es cierto,

existiría una interesante correlación entre el envejecimiento e interacción de αSNAP con

la membrana plasmática.

Se ha descrito que el perfil lipídico del cerebro cambia notoriamente con mayores o

menores cambios en las distintas regiones del cerebro a lo largo de la vida de un

individuo. Estudios en cerebros humanos han demostrado que a lo largo de los años

95

(desde los 20 hacia los 100 años) los lípidos (fosfolípidos, colesterol, gangliosidos) de la

corteza frontal y temporal disminuyen aproximadamente un 20%, mientras que en la

materia blanca de dichas zonas la reducción se incrementa en un 40% (Svennerholm et

al. 1994). Un estudio en cerebros de ratón implicando técnicas actuales de

espectroscopia de masa ha descrito que existe un fuerte cambio lipídico relacionado

con el envejecimiento. Concretamente, los niveles de fosfatidiletanolamina,

lisofosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, lisofosfatidilserina, fosfatidilinositol, y

fosfatidilcolina disminuyen significativamente en machos envejecidos en un 40, 50, 60,

50 y un 60% respectivamente en comparación con machos jóvenes. A pesar de que las

hembras también sufren cambios en el perfil fosfolipídico con la edad, los autores

recalcan que son mucho menos abruptos en comparación con machos (Rappley et al.

2009). Si αSNAP posee la habilidad de censar lípidos y/o curvatura de membrana, es

probable que interaccione de forma distinta con las membranas celulares a medida de

que el individuo envejezca. Esto podría explicar porque en algunos de nuestros

resultados αSNAP WT lograba una flotación cercana al 30% utilizando LP1 obtenida de

cerebros de ratones recién nacidos (PN1), mientras que solo obtuvimos una flotación

del 8-10% cuando utilizamos LP1 obtenida de cerebros de ratón de 2-3 meses de edad

aludiendo a una interacción diferencial de αSNAP por un perfil lipídico concreto. Sin

embargo no podemos confirmar esta hipótesis, ya que la LP1 de cerebros de ratones

PN1 fue solamente tratada con carbonato de sodio y tripsina (quedando ciertos

contaminantes proteicos) mientras que la LP1 de ratones de 2-3 meses de vida fue

purifica con solventes orgánicos (eliminando todo contaminante proteico); entonces, es

posible que la diferencia de nuestros resultados sea debido a la presencia remanente

96

de proteínas transmembrana que interaccionen con αSNAP y no a una diferencia en el

perfil lipídico de las membranas per se. Futuros experimentos resolverán esta duda.

7.6. ¿Cómo es que αSNAP.M105I pierde la habilidad de interaccionar con LP1?

Hasta ahora, hemos descrito que αSNAP.M105I pierde la capacidad de interacción

diferencial por membranas plasmáticas (fracción LP1), debido posiblemente a la perdida

de censar un perfil lipídico característico o una curvatura de membrana específica, sin

embargo ¿Cómo es que αSNAP.M105I pierde la habilidad de interaccionar con LP1?

Como se discutió en la introducción, el residuo M105I está altamente conservado

entre distintas especies, aunque su participación en la estructura o función de αSNAP

aún no se sabe con certeza. Según los estudios de Marz et al. (2003) y Winter et al.

(2009), el residuo M105 no tendría impacto alguno sobre la interacción con complejos

SNAREs o con la interacción con lípidos. En base a nuestros resultados, es tentativo

hipotetizar que la mutación M105I provoca un cambio conformacional que afecta

directamente su interacción con lípidos. Sin embargo, utilizando dicroísmo circular UV

lejano, Chae et al. (2004) describió que esta mutación no altera considerablemente la

estructura secundaria de esta proteína en comparación con αSNAP WT. También se

podría decir que la mutación M105I afecta la interacción de αSNAP con alguna proteína

que la confine en las cercanías de la membrana plasmática; no obstante, según

nuestros resultados, αSNAP.M105I interacciona menos con membranas en

comparación con αSNAP WT independiente de la presencia de proteínas (liposomas

obtenidos a partir de lípidos de fracciones LP1 de cerebro de ratón); sin embargo esto

no es completamente cierto en nuestra configuración de los experimentos.

97

Se ha descrito que el complejo 20S formado luego de la fusión vesicular, está

compuesto por un complejo SNARE, un hexámero de NSF y tres αSNAPs (Wimmer et

al. 2001). Analizando la formación e interacciones dentro del complejo 20S utilizando

técnicas de entrecruzamiento (Cross-link en inglés), Swanton et al. (1998) describió que

αSNAP interaccionaría con ella misma. A pesar de esto, no se sabe si esta

oligomerización es importante para la interacción de αSNAP con lípidos, o si la

interacción de αSNAP con lípidos produce la oligomerización observada por Swanton et

al. Sea como fuere, existe la posibilidad de que la mutación M105I altere de alguna

forma la interacción de αSNAP con otra αSNAP impidiendo su interacción con lípidos, o

quizás, esta mutación provocaría que las αSNAP dejaran de interaccionar entre ellas

haciendo que sean más solubles, lo que provocaría una disminución en la interacción

con lípidos indirecta. En efecto, resultados previos en nuestro laboratorio utilizando

técnicas de separación de fases con tritón x-114, indican que αSNAP.M105I es casi dos

veces más soluble que αSNAP WT.

7.7. Implicancias de la mutación M105I en la función de αSNAP.

A lo largo de los daños posteriores a su descubrimiento, numerosas funciones han

sido descritas para αSNAP. Su primer rol descrito fue la de fusionar vesículas entre

cisternas del Golgi (Clary et al. 1990), por lo que todas las funciones que involucraban

fusión vesicular fueron llamadas funciones “canónicas”. Dentro de algunas de estas

funciones encontramos: fusión de vesículas en la cascada secretoria de células

cromafines (Morgan y Burgoyne 1995; Xu et al. 1999), fusión de vesículas sinápticas

(Sollner et al. 1993), reacción acrosomal en espermatozoides (De Blas et al. 2005),

98

secreción de surfactante en células alveolares (Abonyo et al. 2003), y secreción de

insulina (Nagamatsu et al. 1999). A medida que se fue estudiando el mecanismo de

cómo funciona la maquinaria de fusión vesículas, diversos autores encontraron

actividades nuevas para αSNAP que no involucraban fusión de vesículas; las tan

llamadas funciones no canónicas, entre las cuales encontramos: inducción de autofagia

en epitelio humano (Naydenov et al. 2012), transporte de calcio mediado por canales

CRAC (Miao et al. 2013), activación de apoptosis (Naydenov et al. 2012), y regulador

de las uniones apicales epiteliales (Naydenov et al. 2012b).

Considerando la gran cantidad de escenarios donde participa αSNAP, no sería de

extrañar que la mutación M105I altere alguna de sus funciones normales. Sin embargo,

se ha descrito que en ensayos in vitro, αSNAP.M105I parece no tener alteraciones

funcionales ya que desarma complejos SNAREs solubles tan bien como lo hace αSNAP

WT (Chae et al. 2004). Adicionalmente, la mutación M105I no alteraría la unión ni

activación de NSF (Barnard et al. 1996). No obstante, se ha descrito que solo cuando

αSNAP estuviera inmovilizada en plásticos o formando un trímero en el complejos 20S

sería capaz de unir y activar a NSF (Morgan et al. 1994; Wimmer et al. 2001).

Interesantemente, se ha descrito que la interacción con plásticos o lípidos de

membranas aumentaría de 2 a 3 veces la eficiente de αSNAP para activar a NSF

(Morgan et al. 1994; Steel et al. 1997), además de requerir 20 veces menos

concentración molar para desarmar complejos SNAREs embebidos en vesículas en

comparación con complejos solubles (Winter et al. 2009).

Nuestros resultados indican por primera vez que αSNAP.M105I interacciona menos

con lípidos provenientes de membrana plasmática. Aunque no fue estudiado

99

directamente en el presente trabajo, considerando los datos obtenidos por Steel et al.

(1997) y Winter et al. (2009) podemos decir casi con certeza que la mutación M105I

sufrida por αSNAP provoca una disminución en la actividad ATPasa de NSF, al no

poder reclutarla a la membrana plasmática. Cabe considerar que αSNAP no presentaría

un defecto que afectara directamente la actividad de NSF, ya que la mutación M105I no

afecta el extremo C-terminal de αSNAP, dominio encargado de unir y activar a NSF

(Barnard et al. 1996).

De esta forma, es probable que todas las funciones que involucren fusión de

membranas, las llamadas funciones canónicas de αSNAP, se vean afectadas en

diferentes grados. Adicionalmente, si consideramos que la interacción de αSNAP con

lípidos produce una concentración local alta de esta proteína en la periferia de la célula

(i.e. membrana plasmática) aparte de la unión y activación de NSF, la mutación M105I

podría provocar que la disminución de la interacción con membrana plasmática

provoque un aumento en la concentración citoplasmática de αSNAP, lo que podría

alterar de alguna forma funciones no canónicas de ella.

Además, esta mutación podría afectar directamente la fusión de vesículas. Se ha

descrito que proteínas anfipáticas (tal como αSNAP) poseen la habilidad para desplazar

lípidos durante eventos de fusión, de esta forma, siendo parte de la maquinaria de

fusión entre membranas (Stegmann et al. 1989). Es probable que la mutación M105I al

impedir una correcta interacción con lípidos, impida eventos de fusión eficientes a cargo

de proteínas SNAREs.

100

7.8. Conclusiones.

Este trabajo es recién el comienzo de una gran línea de trabajo. Muchas de las

funciones de αSNAP han permanecido ocultas debido principalmente a que mutaciones

en esta proteína normalmente derivan en la muerte del individuo. El conocimiento actual

de la función de esta proteína deriva principalmente de estudios en levadura (Wang et

al. 2000) y drosophila (Babcock et al. 2004). A pesar de que nuestros resultados indican

que αSNAP.M105I interacciona menos con membranas, y esto puede derivar en una

disminución en la eficacia de la fusión vesicular, aún debe retener cierto grado de

funcionalidad, ya que de otra manera seria una mutación letal. Por consiguiente, este

modelo es realmente importante para estudiar nuevos aspectos sobre la actividad de

tan ubicua proteína. Creemos que futuros experimentos nos ayudaran a responder el

gran número de dudas que generó el presente trabajo.

101

8. REFERENCIAS

1. Abonyo, B. O., P. Wang, et al. (2003). "Characterization of alpha-soluble N-

ethylmaleimide-sensitive fusion attachment protein in alveolar type II cells:

implications in lung surfactant secretion." Am J Respir Cell Mol Biol 29(3 Pt 1):

273-282.

2. Antonny, B. (2011). "Mechanisms of membrane curvature sensing." Annu Rev

Biochem 80: 101-123.

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CONSECUENCIAS DE LA MUTACIÓN M105I DE α-SNAP EN SU ...

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