CONSECUENCIAS DE LA MUTACIÓN M105I DE α-SNAP EN SU ...

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Profesor Patrocinante Dr. Federico Bátiz Instituto de Anatomía, Histología y Patología. Facultad de Medicina
CONSECUENCIAS DE LA MUTACIÓN M105I DE α-SNAP EN
SU INTERACCIÓN CON MEMBRANAS LIPÍDICAS
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico
CRISTIÁN ANTONIO PARGA FIGUEROA
2013
ii
La culminación de este trabajo y maravillosa etapa en mi vida está dedicada a mis
padres, cuyo apoyo incondicional fue la base de lo que soy hoy.
iii
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo no podría haberse realizado sin la ayuda de una gran persona. La total
confianza que deposito en mí el Dr. Federico Bátiz, permitió que pudiera experimentar con total
libertad, a veces acertando y otras veces fallando. Gracias a su apoyo y sabios consejos, logre
cumplir cada uno de los objetivos propuestos.
Quisiera agradecer también a Zahady Velásquez, amiga y gran compañera de trabajo con
una fuente inagotable de conocimientos. Además de estar siempre dispuesta a dar acertados
consejos y propuestas, Zahady siempre veló por un excelente ambiente de trabajo. Su simpatía
y alegría fue algo invaluable a lo largo de esta investigación.
También agradezco a Loreto Ojeda y María Paz Miró que siempre estuvieron allí para
ayudarme. Aunque quizás sea algo menor, pero la limpieza y orden que había en el laboratorio
fue algo que siempre me alegraba; gracias María Paz.
A la profe Rosa Muñoz, que me enseño con mucho detalle, formas de obtener buenos
resultados.
Mención especial a mis amigos, Israel Giacaman y Stephan Schott que gracias a su
compañía y alegría fui capaz de olvidar los malos ratos (experimentos fallidos) y disfrutar de su
amistad junto a una buena cerveza.
Finalmente, quisiera agradecer a mis padres, Marco Antonio Parga Valenzuela y Paulina
Alicia Figueroa Espinoza por apoyarme en todo momento y siempre confiar en mí.
iv
3.2. αSNAP (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion (NSF) attachment protein – alpha). ... 4
3.3. αSNAP y la regulación de su actividad. ..................................................................... 8
3.4. αSNAP y su función durante el desarrollo: la mutación M105I y el ratón hyh. ................. 9
3.5. αSNAP y su Interacción con lípidos. ....................................................................... 13
3.5.1. αSNAP.M105I y su interacción con membranas: Hipótesis de trabajo. .................. 16
4. HIPOTESIS Y OBJETIVOS ..................................................................................... 19
4.1. Hipótesis general. ................................................................................................ 19
4.2. Objetivo General. ................................................................................................. 19
4.2.1. Objetivos Específicos. .................................................................................... 19
5.1.1. Genotipificación. ........................................................................................... 21
5.1.3. Reactivos. ..................................................................................................... 22
v
5.1.6. Digestión enzimática del producto de PCR obtenido. ......................................... 23
5.1.7. Geles de acrilamida y tinción con SybrSafe. ...................................................... 23
5.2. Aislamiento y manipulación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs). ................. 24
5.2.1. Materiales. .................................................................................................... 24
5.2.2. Reactivos. ..................................................................................................... 24
5.2.3. Procedimiento. .............................................................................................. 24
5.3.3. Anticuerpos. ................................................................................................. 25
5.4.1. Preparación de liposomas de lecitina de soya. .................................................. 26
5.4.2. Obtención de LP1 y P3. .................................................................................. 27
5.4.2.1. Obtención y Homogeneizado de tejido cerebral de ratón. ................................ 27
5.4.2.1.1. Materiales. ......................................................................................................................... 27
5.4.2.1.2. Reactivos. ......................................................................................................................... 27
5.4.2.1.3. Procedimiento. ................................................................................................................. 27
5.4.2.2.2. Reactivos. ........................................................................................................................ 28
5.4.2.2.4. Obtención de LP1. .......................................................................................................... 29
vi
5.4.3. Eliminación de proteínas periféricas e integrales de LP1. .................................... 30
5.4.3.1. Carbonatación de LP1 – Eliminación de proteínas periféricas. .......................... 30
5.4.3.2. Tripsinización de LP1 – eliminación de proteínas integrales (eliminación
incompleta) ............................................................................................................. 31
5.5. Cuantificación de proteínas mediante método DC ProteinAssay (Bio-Rad)....................... 32
5.5.1. Materiales y equipos. ..................................................................................... 32
5.5.2. Reactivos. ..................................................................................................... 32
5.5.3. Procedimiento. .............................................................................................. 32
5.6. SDS-PAGE, Western Blot, tinción con nitrato de plata. ............................................. 34
5.6.1. Materiales y equipos. ..................................................................................... 34
5.6.2. Reactivos. ..................................................................................................... 35
5.6.3. Procedimiento. .............................................................................................. 36
5.6.3.1. Electroforesis. ............................................................................................ 36
5.6.3.2. Electrotransferencia. ................................................................................... 37
5.8. Ensayo de Flotación. ............................................................................................ 39
5.8.1. Protocolo A. .................................................................................................. 39
5.8.2. Protocolo B. .................................................................................................. 40
5.9. Ensayo de láminas de membrana plasmática. .......................................................... 41
vii
5.10. Proteínas Recombinantes .................................................................................. 43
6.1. Localización de αSNAP en MEFs. ........................................................................... 46
6.1.1. La mutación M105I de αSNAP provoca una menor localización de ésta en membrana
plasmática de fibroblastos embrionarios de ratón. .......................................................... 46
6.2. Interacción de αSNAP con láminas de membrana plasmática. .................................... 49
6.2.1. αSNAP.M105I interacciona menos con láminas de membrana plasmática de células
PC12 en comparación con αSNAP WT. .......................................................................... 49
6.3. Interacción de αSNAP WT y αSNAP.M105I con lípidos. .............................................. 53
6.3.1. αSNAP WT y αSNAP.M105I no interaccionan con lecitina de soya – Protocolo A. ... 53
6.3.2. No existen diferencias significativas en la interacción de αSNAP WT respecto a
αSNAP.M105I con lípidos obtenidos de cerebro de ratón (LP1) – Protocolo A. .................... 59
6.3.3. No existen diferencias significativas en la interacción de αSNAP WT respecto a
αSNAP.M105I con lípidos obtenidos de cerebro de ratón (LP1) – Protocolo B. .................... 66
6.3.4. αSNAP.M105I interacciona menos con liposomas LP1 en comparación con αSNAP
WT, pero su interacción con liposomas P3 no se ve alterada. ........................................... 73
7. Discusión ................................................................................................................ 85
7.1. La asociación de αSNAP.M105I con membrana plasmática de fibroblastos embrionarios
de ratón esta reducida. ................................................................................................... 85
7.2. αSNAP.M105I interacciona menos con membrana plasmática. ................................... 86
viii
7.3. La mutación M105I de αSNAP provoca una disminución en la interacción con lípidos de
membrana plasmática. .................................................................................................... 87
7.4. αSNAP posiblemente interacciona con algún lípido en específico. ............................. 90
7.5. Posibles consecuencias bioquímicas de la mutación M105I de αSNAP. ....................... 91
7.6. ¿Cómo es que αSNAP.M105I pierde la habilidad de interaccionar con LP1? ................. 96
7.7. Implicancias de la mutación M105I en la función de αSNAP. ...................................... 97
7.8. Conclusiones. .................................................................................................... 100
8. REFERENCIAS ..................................................................................................... 101
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Modelo de la fusión de membranas mediada por el complejo SNARE (trans). 5
Figura 2. Reciclaje de complejos SNAREs. 7
Figura 3. La Metionina 105 de la proteína αSNAP es altamente conservada en diferentes
organismos. 11
Figura 4. Dominio de αSNAP que permite su interacción con lípidos. 15
Figura 5. Producción y purificación de proteínas recombinates alfa-SNAP.wt y alfa-
SNAP.M105I. 45
Figura 6. Expresión de αSNAP en fibroblastos embrionarios (MEFs) WT y hyh. 48
Figura 7. Ensayos de interacción en láminas de membrana. 50
Figura 8. Ensayos de flotación de αSNAP – Sin lípidos. 54
Figura 9. αSNAP WT y αSNAP.M105I no interaccionan con lecitina de soya – (Protocolo
A). 57
Figura 10. Tratamiento de fracciones LP1 con carbonato de sodio a pH básico y tripsina. 60
Figura 11. Flotación de αSNAP WT y αSNAP.M105I con LP1 tratada. 64
Figura 12. Recolección inapropiada de los lípidos en un ensayo de flotación aleatorio –
Protocolo A. 67
Figura 13. Recolección correcta de lípidos – Protocolo B. 68
Figura 14. αSNAP WT y αSNAP.M105I interaccionan con liposomas de lecitina de soya
utilizando el protocolo B. 71
Figura 15. Flotación de αSNAP WT o αSNAP.M105I con LP1 tratada utilizando el protocolo
B. 72
Figura 16. Flotación de αSNAP WT o M105I con Liposomas obtenidos de fracciones LP1 o
P3 de cerebro de ratón. 75
Figura 17. αSNAP.M105I posee una interacción reducida con LP1, pero no con P3. 78
x
Figura 18. αSNAP.M105I interacciona menos con LP1 en comparación con αSNAP WT. 80
Figura 19. αSNAP.M105I interacciona significativamente menos con LP1 que αSNAP WT.82
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I. Preparación de curva de calibración para determinación de proteínas. 33
Tabla II. Anticuerpos utilizados para hibridación en el método de inmunoblot. 38
xi
ABREVIACIONES
ACRS-PCR: Sitio de restricción creado artificialmente mediante PCR.
ATP: adenosin trifosfato.
DAPI: 4,6-diamidino-2-phenylindole.
kDa: Kilo Daltons.
PMSF: Fluoruro de fenilmetilsulfonilo.
PVDF: Polifluoruro de vinilideno.
RPM: Revoluciones por minuto.
SDS: Dodecil-sulfato de sodio.
SNARE: SNAP Receptor.
1. RESUMEN
αSNAP es una proteína clave para el tráfico de membranas dentro de las célula, ya
que participa junto a la ATPasa NSF en la disociación de complejos cis-SNARE durante
el proceso de fusión de membranas. Aunque esta proteína es ubicua, su rol durante el
desarrollo del sistema nervioso ha comenzado a dilucidarse gracias a la aparición de
una mutación espontánea en ratones. Esta mutación, conocida como hyh
(hydrocephalus with hop gait), consiste en una sustitución de un residuo de metionina
por uno de isoleucina en la posición 105 (M105I), provocando una disminución en
niveles proteicos (hipomorfismo) en tejido nervioso e hidrocefalia. Si bien estudios
iniciales in vitro indicaban que la mutación M105I no altera la funcionalidad de αSNAP,
estudios en contexto celular sugieren la proteína mutada presenta defectos funcionales
intrínsecos. Considerando que la interacción de αSNAP con lípidos es importante para
su función, ¿puede la mutación M105I afectar la interacción con lípidos de αSNAP?
Realizando ensayos libres de célula, en láminas de membrana plasmática de células
PC12, confirmamos que αSNAP interactúa menos o menos establemente con
membrana plasmática. Por otro lado, mediante la estandarización y realización de
ensayos de flotación con liposomas y proteínas recombinantes, en esta tesis
mostramos por primera vez que la proteína αSNAP.M105I interacciona menos con
lípidos de membrana plasmática comparado a su versión wild type. Considerando que
la interacción de αSNAP con lípidos es clave para su eficiencia funcional en la
activación de NSF, esta menor interacción con lípidos podría ayudar a explicar
mecanísticamente los defectos funcionales intrínsecos que presenta la proteína
αSNAP.M105I en contexto celular.
2. SUMMARY
αSNAP is a key protein involved in intracellular membrane trafficking. It participates
together with the ATPase NSF in the dissociation of cis-SNARE complexes during
membrane fusion process. Although this protein is ubiquitous, its role on brain
development has begun to be elucidated by the appearance of a spontaneous mutation
in mice. This mutation, known as hyh (hydrocephalus with hop gait), consist in a
missense mutation that results in the substitution of a methionine residue at position 105
by one isoleucine (M105I). This, in turn, provokes a decrease in protein levels
(hypomorphism) in nervous tissue and abnormal brain development. Even though,
previous in vitro studies indicated that M105I mutation does not alter αSNAP
functionality, studies in cellular context suggest that the mutant protein show intrinsic
functional defects. Considering that the interaction of αSNAP with lipids is important to
its function, can M105I mutation alter αSNAP-lipids interaction? Using cell-free assays
with plasma membrane sheets obtained from PC12 cells, we confirm that αSNAP
interacts less or less stably with plasma membrane y this is due to intrinsic defects in the
mutant protein. On the other hand, the standardization of liposomes flotation assays
using recombinant proteins allow us to demonstrate by the first time that αSNAP.M105I
interacts less efficiently with plasma membrane lipids compared to the wild type version.
Considering that αSNAP-lipids interaction is important for the functional efficiency in
NSF activation, the defects observed in αSNAP.M105I could help (i) to mechanistically
understand the intrinsic functional deficiencies reported previously in a cellular context,
and (ii) to explain, to some extent, the hyh phenotype.
3
αSNAP (soluble N-ethylmaleimide-sensitve factor [NSF] atachment protein-alpha) es
una proteína que forma parte de la maquinaria encargada de la fusión intracelular de
membranas. Esta proteína interactúa con complejos SNARE (SNAP receptor) sirviendo
como adaptador para la posterior unión y activación de la ATPasa NSF (N-
ethylmaleimide-sensitive fusion protein). La hidrólisis de ATP provoca la disociación de
estos componentes dejándolos disponibles para otra ronda de fusión. De esta forma, se
ha descrito que αSNAP es clave en transporte desde retículo endoplasmático hacia
Golgi, tráfico membranoso intra-Golgi, fusión de vesículas sinápticas y gránulos
secretorios, y transcitosis entre membrana apical y basolateral. Durante el desarrollo
embrionario, se ha descrito que αSNAP se expresa preferentemente en el sistema
nervioso central.
La aparición de mutación espontánea en ratones que afecta al gen Napa que codifica
para αSNAP (G->A en el exón 4) y que resulta en una sustitución de una metionina
altamente conservada por una isoleucina (M105I) ha permitido estudiar el rol de esta
proteína in vivo y durante el desarrollo embrionario. De hecho, la homocigosis para esta
mutación produce un fenotipo característico conocido hydrocephalus with hop gait
(hyh), que se caracteriza por denudamiento neuroepitelial/ependimario de las paredes
ventriculares, desarrollo de hidrocefalia en útero, y otras alteraciones del desarrollo del
sistema nervioso.
4
La mutación hyh provoca una reducción en los niveles de la proteína αSNAP en
tejido nervios (hipomorfismo). Estudios in vitro sugerían que la proteína mutada no
presentaba ninguna alteración funcional en comparación a la proteína wild type (WT);
sin embargo, estudios en contexto sugieren que αSNAP.M105I presenta alteraciones
funcionales intrínsecas. ¿En qué consisten las alteraciones funcionales intrínsecas de
αSNAP.M105I?
Resultados obtenidos en nuestro laboratorio han demostrado que αSNAP WT se
encuentra preferentemente asociada a fracciones subcelulares enriquecidas en
membranas, mientras que αSNAP.M105I se encuentra predominantemente en
fracciones citosólicas. Estos hallazgos son relevantes al considerar que recientemente
se ha demostrado que la interacción directa de αSNAP con lípidos de membrana
aumenta dramáticamente la eficiencia funcional de la proteína para activar NSF y
provocar la disociación de complejos SNARE. En este contexto, ¿puede la mutación
M105I afectar la interacción de αSNAP con lípidos?
3.2. αSNAP (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive fusion (NSF) attachment
protein – alpha).
Hace aproximadamente 20 años, las SNAPs fueron descubiertas por el grupo de
James Rothman como proteínas capaces de unir NSF, evento necesario para la fusión
de membranas en el tráfico vesicular intra-Golgi (Clary et al. 1990). La mayor parte de
los eventos de fusión de membranas intracelulares son mediados por proteínas
conocidas como receptores de SNAP o SNAP receptors (SNAREs) ubicados tanto en la
vesícula (v-SNAREs) como en la membrana blanco o target (t-SNAREs) (figura 1).
5
Figura 1: Modelo de la fusión de membranas mediada por el complejo SNARE
(trans). Nótese que después del evento de fusión en f, v-SNARE (Linea roja) y t-
SNARE (Linea Azul) quedan unidas formando complejos cis-SNAREs.
6
La fusión comienza cuando los SNAREs en su configuración trans (es decir, activos y
en membranas opuestas) se juntan formando un conjunto de 4 hélices, las cuales se
enrollan desde su extremo N-terminal (extremo citosólico) hasta el extremo C-terminal
(extremo inserto en la membrana). Esto provoca el acercamiento de las membranas
provocando el evento de fusión (Jahn y Scheller 2006). Luego de este evento, los
SNAREs quedan en forma cis (enrollados entre sí y en la misma membrana) por lo cual
ya no sirven para otro evento de fusión. El mecanismo que permite la fusión de
membranas mediada por SNAREs necesita de la preactivación o priming de estos
complejos cis-SNARE inactivos. Para ello, αSNAP reconoce e interactúa con los
complejos cis-SNARE, recluta a la ATPasa NSF, formándose un complejo
SNARE/SNAP/NSF, conocido como complejo 20S (Woodman 1997; Stenbeck 1998).
NSF ahora unida a SNAP, se activa e hidroliza ATP, promoviendo la disociación del
complejo 20S y la liberación (activación) de los componentes necesarios para otra
ronda de fusión (Risselada y Grubmuller 2012) (Figura 2).
La prevención de la hidrólisis de ATP por NSF provoca la acumulación de vesículas
incapaces de fusionarse con su membrana blanco (Sollner et al. 1993; Rothman 1994).
Además de la fusión de membranas intra-Golgi descrita inicialmente por Clary y
Rothman (1990), esta maquinaria media la fusión de membranas desde el retículo
plasmático hacia Golgi, la fusión de gránulos secretorios y sinápticos con la membrana
plasmática, la fusión homotípica endosomal y otras (Stenbeck 1998).
7
Figura 2: Reciclaje de complejos SNAREs. Después del evento de fusión de
membranas, el reclutamiento de αSNAP y NSF provocan la disociación del complejo
20S (complejo SNARE), evento gatillado por hidrolisis de ATP mediada por NSF.
8
3.3. αSNAP y la regulación de su actividad.
En mamíferos existen tres isoformas de SNAP, llamadas α-, β- y γ-SNAP, codificadas
por tres genes diferentes. La expresión de α- y γ-SNAP es ubicua, mientras que la
expresión de β-SNAP está limitada sólo al sistema nervioso central y durante estadios
postnatales. Existe un 83% de homología entre α- y β-SNAP, mientras que entre α- y γ-
SNAP solo existe un 20% de homología (Whiteheart et al. 1993). Todas las SNAPs son
solubles, sin embargo se ha descrito que su función es dependiente de membranas, ya
que SNAP soluble no une a NSF (Wimmer et al. 2001). De hecho se ha informado que
la unión de SNAP con superficies hidrófobas provocaría un cambio conformacional en
SNAP haciéndola competente para la unión y activación de NSF (Clary et al. 1990).
Mediante ensayos de microscopia electrónica y mutaciones puntuales, Marz et al.
describieron que αSNAP interacciona con SNAREs de forma antiparalela. A pesar de
que no se conoce la estructura cristalográfica de αSNAP, si se conoce la estructura de
su análogo en levaduras, la proteína sec17p. Ya que la homología de αSNAP en
distintos organismos está altamente conservada, extrapolando datos, Marz et al.
describieron que la mayor superficie de interacción de αSNAP con SNAREs era
mediante la cara cóncava de αSNAP. Utilizando mutaciones puntuales, describió que
esta interacción se basa mayoritariamente en puentes electrostáticos (residuos básicos
y ácidos). A su vez, también describió que mutaciones de residuos en la cara opuesta
de αSNAP (la cara convexa) no altero significativamente la interacción de αSNAP con
SNAREs (Marz et al. 2003).
Se ha descrito que αSNAP es fosforilada por CaMKII y PKA. Esta fosforilación
disminuye en un orden de magnitud su asociación con el complejo SNARE. Debido a
9
que observaciones previas han demostrado que la fosforilación de αSNAP incrementa
la fusión de vesículas más que disminuirla, se postuló que la liberación de αSNAP del
complejo SNARE representaba la etapa limitante de los eventos de fusión, y que esta
fosforilación provocaría una disminución en la afinidad de unión de αSNAP por el
complejo SNARE, aumentando su disociación y disponibilidad para unirse a otro
complejo (Hirling y Scheller 1996). Estos mismos autores han postulado que este nivel
de regulación sobre αSNAP mediada por fosforilación, estaría mediando los cambios
rápidos producidos en la formación de memoria a corto plazo. De esta forma, el
organismo, al fosforilar componentes que regulan la fusión de vesículas con la
membrana plasmática, podría regular la tasa de liberación de neurotransmisor al medio
y de esta forma, regular la tasa de activación de neuronas postsinápticas (Hirling y
Scheller 1996); sin embargo, en la actualidad el rol de la fosforilación de αSNAP y sus
consecuencias funcionales, no son muy claros.
3.4. αSNAP y su función durante el desarrollo: la mutación M105I y el ratón
hyh.
En el mismo año que se descubrió αSNAP (1990), se describió un nuevo modelo
murino de hidrocefalia espontánea cuyo posible gen causante se encontraba en el
extremo terminal del cromosoma 7 (Bronson y Lane 1990). Debido al fenotipo
característico de estos ratones que desarrollaban este trastorno, se los llamó hyh
(hydrocephalus with hop gait). Catorce años después, dos estudios independientes
describieron simultáneamente que el fenotipo hyh es causado por la mutación del gen
Napa (Chae et al. 2004; Hong et al. 2004). Según estos estudios, la mutación del gen
10
Napa, cuyo producto proteico es αSNAP, corresponde a una mutación missense en el
exón 4 donde cambia una G por una A, lo que se traduce en la sustitución de una
metionina altamente conservada en la posición 105 por una isoleucina (M105I) (Chae et
al. 2004; Hong et al. 2004) (Figura 3).
Esta mutación posee un patrón de herencia tipo mendeliano de tipo autosómica
recesiva, por lo que sólo aquellos individuos que presenten homocigosis para la
mutación (Napahyh/Napahyh), y no los que presenten heterocigosis (Napa+/Napahyh)
presentarán el fenotipo hyh. Este fenotipo se caracteriza por presentar severas
alteraciones a nivel del sistema nervioso, incluyendo: hidrocefalia, mal desarrollo
cerebral y medular, hipoplasia del cerebelo, agenesia del cuerpo calloso, etc; también
se ha observado reducida fertilidad en machos, trastornos del crecimiento, y trastornos
motores: marcha en salto (hop gait), entre otros. Además, investigaciones recientes
realizadas en nuestro laboratorio demuestran que los ratones hyh presentan
alteraciones en el desarrollo de los folículos ováricos y defectos en la regulación de la
glicemia (datos no publicados).
Por otro lado, se ha descrito que la mutación M105I provoca una reducción en los
niveles de αSNAP en tejido nervioso, en comparación a los niveles observados en los
controles (wild type); sin embargo, no existe consenso en cuanto a si el origen de este
hipomorfismo se debe a una menor estabilidad la proteína, de su mRNA o de ambos.
Además, estudios realizados en nuestro laboratorio han demostrado que este
hipomorfismo es variable, dependiendo del tejido analizado y del estadio del desarrollo.
11
Figura 3: La Metionina 105 de la proteína αSNAP, es altamente conservada en
diferentes organismos. En ratones hyh, esta metionina es sustituida por una
isoleucina (M105I).
12
Funcionalmente, estudios realizados in vitro por Chae et at. sugerían que la mutación
M105I no provoca alteraciones funcionales en αSNAP, ya que la proteína mutada se
une a complejos SNARE solubles y los disocia (en presencia de NSF) de una manera
similar a lo que lo hace la proteína wild type (Chae et al. 2004). De hecho, siguiendo las
mismas extrapolaciones entre αSNAP y Sec17p descritas por Marz et al. (2003), se ha
demostrado que el residuo M105 se encuentra en la cara convexa de αSNAP, que es la
cara que no participa en la interacción directa con SNAREs (Chae et al. 2004).
Sin embargo, Batiz et al. (2009) han descrito que, en un contexto más fisiológico,
αSNAP.M105I presenta alteraciones funcionales intrínsecas. Utilizando como modelo la
exocitosis acrosomal en espermatozoides permeabilizados, estos autores demostraron
que αSNAP wild type es capaz de recuperar los defectos en exocitosis que presentan
los ratones hyh, mientras que idénticas cantidades de αSNAP.M105 no. Si bien estos
estudios sugieren que la funcionalidad de αSNAP.M105I en contexto celular está
alterada, el defecto particular es desconocido.
Como se dijo anteriormente, después del descubrimiento de αSNAP en 1990, sus
funciones fueron estudiadas utilizando mutantes en levadura y Drosophila (Pryer et al.
1992; Wang et al. 2000; Babcock et al. 2004), muchas de las cuales eran letales. Sin
embargo, previo a la caracterización de los ratones hyh y el descubrimiento de que su
etiología era causada por una mutación en el gen Napa, aun no se conocía la
implicancia de αSNAP en el desarrollo embrionario en mamíferos ya que el knockout
del gen Napa es letal en estadios muy tempranos del desarrollo embrionario, lo que
impedía investigaciones para determinar su rol en el desarrollo. Así, esta mutación
natural que apareció espontáneamente en ratones hyh, provee un excelente modelo
13
animal para dilucidar los mecanismos de tráfico y fusión de membranas en los que
participa y su importancia en el desarrollo. Adicionalmente, este modelo animal nos da
una valiosa oportunidad para estudiar las implicancias funcionales de la mutación
M105I y distintos aspectos relacionados con αSNAP en condiciones normales y
patológicas.
3.5. αSNAP y su Interacción con lípidos.
En 1989 se había descrito que NSF por sí sola no interaccionaba con membranas
provenientes de Golgi, sin embargo, los autores al agregar citosol (que contenía
SNAPs) provocaban que NSF se uniera a membranas de Golgi. (Weidman et al. 1989).
Más tarde, Clary y colaboradores en 1990 describieron que NSF se podía unir a αSNAP
cuando esta última era adsorbida previamente en plástico (tubos de micro centrifuga)
(Clary et al. 1990). Inicialmente, se pensó que αSNAP era una proteína soluble, y que
era reclutada hacia la membrana plasmática por complejos cis-SNAREs (post-fusión).
Efectivamente, estudios en neuronas y células β pancreáticas sugerían que αSNAP se
encontraba mayormente en el citosol (Kiraly-Borri et al. 1996); sin embargo, otros
estudios posteriores en células cromafines (Banaschewski et al. 1998) y células tipo 2
alveolares (Abonyo et al. 2003) demostraron que αSNAP estaba fuertemente asociada
a membranas. Adicionalmente, en 1994 Morgan et al. descubrieron que la
inmovilización (adsorción) de αSNAP en plástico además de unir la ATPasa NSF,
aumentaba la actividad catalítica de esta en un 147%, comparado al 14% de activación
logrado cuando se incubó αSNAP y NSF de forma soluble (Morgan et al. 1994). Según
Morgan, la inmovilización de αSNAP en plástico sirve para activar en NSF el sitio de
14
baja afinidad por ATP, aumentando drásticamente su afinidad por ATP. Esto se debería
a que el plástico provocaría un cambio conformacional en αSNAP, tal como lo haría su
receptor SNARE en la membrana (Whiteheart et al. 1992). Sin embargo, otra posibilidad
es que el cambio conformacional lo provoque la interacción de αSNAP con los lípidos
de la membrana.
De hecho, en 1997, Steel y col. describieron por primera vez que αSNAP
interacciona directamente con membranas lipídicas (membranas biológicas y
liposomas) y que esta unión era independiente de receptores SNARE funcionales.
Además, estos autores demostraron que esta interacción incrementa la actividad
catalítica de NSF entre 2 y 3 veces y que esto se debe al aumento de la afinidad de
ATP del sitio catalítico de NSF como había descrito Morgan en 1994. Steel y col.
también describieron que, en estado estacionario, αSNAP se encontraba
mayoritariamente asociado a membranas y que probablemente esto era una
característica intrínseca de la proteína, ya que estudios bioquímicos demostraron que
αSNAP posee características hidrófobas e hidrófilas (proteína anfipática) (Steel et al.
1997). En 2009, Winter y colaboradores, utilizando la estructura cristalina de la proteína
sec17p (proteína de levadura homologa a αSNAP de mamíferos) demostraron y
descubrieron que el dominio de αSNAP encargado de conferirle la habilidad de
interaccionar con lípidos es un loop ubicado entre las α-hélices 1 y 2, que abarca del
residuo 26 hasta el 32, y que en su mayoría corresponden a aminoácidos hidrófobos,
particularmente dos fenilalaninas (posiciones 27 y 28) (Figura 4).
15
Figura 4. Dominio de αSNAP que permite su interacción con lípidos. En a se
muestra un blast comparando el extremo N-terminal de varias especies. Con flechas
negras en las posiciones 27 y 28 se destacan las fenilalaninas altamente
conservadas en las especies evaluadas. En b se muestra la estructura en cintas de
sec17, proteína de levadura homologa a αSNAP en mamíferos. Se observa que el
loop estaría en contacto directo con la membrana plasmática. Además se muestra la
estructura en cintas que adoptaría un complejo cis-SNARE (inactivo funcionalmente).
16
Cuando este loop fue eliminado (eliminando los aminoácidos del 1 al 32) o cuando
las fenilalaninas fueron mutadas por serinas, αSNAP dejó de interaccionar con lípidos.
Funcionalmente, la interacción de αSNAP con lípidos aumenta 20 veces su eficiencia
funcional (medida en términos de disociación del complejo 20S mediada por NSF) en
comparación a estudios de reconstrucción usando complejos solubles (Winter et al.
2009). Aunque los autores postulan que dos residuos de fenilalanina altamente
conservados son los responsables de esta regulación funcional, no se sabe si la
mutación M105I (ubicada en la α-hélice 5) podría tener algún efecto en la interacción de
αSNAP con membranas.
3.5.1. αSNAP.M105I y su interacción con membranas: Hipótesis de trabajo.
Estudios previos realizados en nuestro laboratorio han demostrado que, en extractos
de cerebro de ratones wild type, al igual que lo descrito por Steel et al. en 1997, αSNAP
se encuentra fundamentalmente asociada a fracciones enriquecidas en membranas; sin
embargo, en extractos de cerebro de ratones hyh, αSNAP (M105I) se encuentra
principalmente en las fracciones solubles. Más aun, ensayos bioquímicos de interacción
utilizando proteínas recombinantes WT y M105I demostraron que αSNAP.M105I tiene
una menor interacción con membranas y que esto es más evidente cuando se utilizan
fracciones enriquecidas en membrana plasmática. Más aún estos ensayos bioquímicos
demostraron que la menor interacción con membrana plasmática que presenta
αSNAP.M105I no se debe a alteraciones en la composición de las membranas de los
ratones hyh sino a defectos intrínsecos en la proteína mutada.
17
Considerando que, según lo descrito por Marz et al. (2003), el residuo M105 no es un
residuo clave para la interacción de αSNAP con SNAREs, existen al menos dos
posibilidades que permiten explicar la menor asociación a membranas de αSNAP.M105
en los mutantes hyh: (i) que la mutación M105I provoque una reducción en la
interacción de αSNAP con alguna proteína de membrana (SNAREs u otras) que de
alguna forma mantiene a αSNAP reclutada en la membrana, y (ii) que la mutación
M105I provoque una disminución en la interacción directa de αSNAP con membranas
biológicas (lípidos). Si bien ambas posibilidades podrían explicar por sí solas la menor
asociación a membranas de αSNAP.M105I, no se puede descartar que en condiciones
fisiológicas exista una combinación de ambas o incluso un mecanismo adicional, como
una mayor interacción de la proteína mutada a proteínas citosólicas, por ejemplo.
Considerando que (i) un experimento realizado por Steel et al. (1997) sugiere que la
mayor parte de la interacción de αSNAP con membranas es independiente de SNAREs
pero además, debido a la naturaleza del experimento donde degrada todas las
proteínas de las membranas (mediante proteasas y calor), es probable que no exista
otra proteína que participe en el reclutamiento de αSNAP a la membrana y (ii) que
ensayos previos en nuestro laboratorio han demostrado una reducción en la
hidrofobicidad de αSNAP.M105I, se formulan las siguientes preguntas: (I) ¿la mutación
αSNAP.M105I provoca una disminución de la interacción de αSNAP con membranas
lipídicas? (II) ¿La mutación M105I de αSNAP altera su función fisiológica normal? y si
esta respuesta es afirmativa, cabe preguntar (III) ¿de qué forma esta mutación altera la
interacción de αSNAP con lípidos? Y por último (IV) ¿Qué efectos, en un contexto
fisiológico, conlleva esta mutación?
El siguiente trabajo está enfocado en responder la siguiente hipótesis:
“La mutación M105I de αSNAP provoca una disminución en su interacción
con lípidos”
4.1. Hipótesis general.
“La mutación M105I de αSNAP provoca una disminución en su interacción con
lípidos”
4.2. Objetivo General.
1. Evaluar la interacción de αSNAP.M105I con lípidos y compararla con la interacción
de αSNAP WT.
4.2.1. Objetivos Específicos.
1. Evaluar la distribución subcelular de αSNAP en cultivos celulares primarios
- Ensayos de inmunofluorescencia en MEFs
2. Confirmar la reducción de la interacción de αSNAP.M105I con membrana plasmática
sugerida en ensayos bioquímicos.
membrana plasmática y proteínas recombinantes
3. Evaluar interacción directa de αSNAP WT y la mutante M105I con lípidos
- Estandarización de los ensayos de flotación de liposomas
- Ensayos de flotación con liposomas de lecitina de soya.
20
“desproteinizadas”
- Ensayos de flotación en liposomas preparados a partir de lípidos de cerebro
(fracciones enriquecidas en membrana plasmática y fracciones enriquecidas en
membranas livianas o intracelulares)
5. MATERIALES Y METODOS
5.1. Animales de experimentación.
Los experimentos realizados se llevaron a cabo en ratones de la cepa B6C3Fe-a/a-
Napahyh/J de estadio postnatal PN1 o 2-3 meses de edad con genotipos WT para
αSNAP. No se hizo distinción de sexo.
Los ratones fueron criados en el bioterio de Neurociencias del Instituto de Anatomía,
Histología y Patología, de la Universidad Austral de Chile, siendo mantenidos bajo
régimen de pellet y agua ad libitum, en un fotoperiodo 12/12 hrs de luz/oscuridad y con
una temperatura ambiental media de 25°C.
5.1.1. Genotipificación.
Previo a realizar extractos cerebrales y cortes para inmunofluorescencia, se procedió
a realizar genotipificación de los animales mediante el método ACRS-PCR descrito por
Bátiz et al. (2009).
5.1.2. Materiales y equipos.
Termomixer Vortemp 56 (Labnet), micropipetas de 10/20/200/1000µL (Biopette,
Labnet), fuente de poder Enduro 250 V (Labnet), centrífuga Biofuge Pico (Heraeus) con
rotor #3325, cámara de electroforesis Mini Protean Tetra Cell y sistema Casting Stand
(Bio-Rad), vidrios de 0.75 mm de grosor y peinetas de 10 pocillos (Bio-Rad),
transiluminador Vilber Lourmat (Arquimed), termociclador Multigene (Labnet),
microtubos para PCR de 0.2 ml (TCL Ltda.) y tubos eppendorf 1.5 ml (TCL Ltda.), hielo.
22
5.1.3. Reactivos.
Buffer TEL (Tris-HCl 50 mM pH 8.0 (Winkler); EDTA 50 mM (Bio-Rad); NaCl 100 mM
(Merck); SDS 0.5% P/V (Bio-Rad)), proteinasa K 10 mg/mL (Bioline), etanol absoluto
(Merck), agua libre de nucleasas (IDT), buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8.0 (Winkler);
EDTA 1 mM (Bio-Rad)), partidores IDT ‘hyh-reverse’ y ‘hyh-forward’ diseñados según
Bátiz et al. (2009), dNTPs (Invitrogen), Taq polimerasa (Gentileza CECS), buffer PCR
10x (Invitrogen), MgCl2 50mM (Invitrogen), enzima de restricción BspHI (BioLabs New
England), acrilamida/aisacrilamida 29:1 (Winkler), buffer TBE 10x (Winkler), persulfato
de amonio 10% (Winkler), TEMED (Winkler), DNA ladder Generuler 100 bp
(Fermentas), SybrSafe DNA Gel Stain (Invitrogen).
5.1.4. Extracción de DNA.
Se cortaron 2-4 mm de la parte distal de la cola de cada ratón y se depositó cada una
de ellas en un tubo Eppendorf de 1.5 ml. A cada tubo se agregaron 500 μL de buffer
TEL con 10 µL de proteinasa K y se digirió en Termomixer hasta que se desintegró el
tejido a 55.5°C en agitación de 80 rpm. Luego se centrifugaron a 10000 x g por 10
minutos y se trasvasijó el sobrenadante a un tubo Eppendorf con 750 µL de etanol
100%. Se agitó suavemente por inversión y se centrifugó a 13000 x g por 25 minutos.
Se eliminó el sobrenadante, se agregaron 500 µL de etanol al 70% y se centrifugó a
10000 x g por 10 minutos. Se eliminó el sobrenadante y se dejó secar el tubo invertido
sobre papel absorbente durante aproximadamente 30 minutos. Finalmente el pellet (que
contiene el DNA) se resuspendió en 150 µL de buffer TE, dejándose en agitación en el
Termomixer durante 90-120 minutos a 50°C.
23
5.1.5. Reacción de PCR.
Sobre hielo, se preparó mix con 5 µL de buffer 10x, 3 µL de MgCl2, 0.8 µL de cada
partidor, 2 µL de dNTPs, 1 µL de Taq polimerasa y 33.4 µL de agua libre de nucleasas,
por cada muestra a genotipificar. Luego se agregó a cada tubo de PCR 46 µL de mix ya
preparado y 4 µL de DNA previamente extraído. El programa de PCR se realizó según
lo descrito por el autor.
5.1.6. Digestión enzimática del producto de PCR obtenido.
El producto de PCR se sometió a la acción de una enzima de restricción (BspHI),
para lo cual se preparó mix con 2 µL de buffer de digestión 10X, 7.85 µL de agua libre
de nucleasas y 0.15 µL de la enzima de digestión BspHI (10000 U/ml) por cada muestra
a digerir. A cada tubo se le agregó 10 µL de mix y 10 µL del producto de PCR,
incubándose en agitación durante 6 horas a 37°C en Termomixer.
5.1.7. Geles de acrilamida y tinción con SybrSafe.
Luego de digerir el producto de PCR, se agregó a cada tubo 4 µL de buffer de carga
10x. Posteriormente se cargaron 8 µL de estas muestras en un gel poliacrilamida-TBE
al 20% siendo sometidas a electroforesis a 70 V durante 2 horas. Finalmente el gel se
tiñó con solución de SybrSafe (50 ml TBE 1X con 4 µl de SybrSafe) por 20 minutos en
oscuridad y se observó el patrón de digestión en el transiluminador, siendo interpretado
de acuerdo a lo descrito por Bátiz et al. (2009), en genotipo WT o hyh.
24
5.2. Aislamiento y manipulación de fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs).
5.2.1. Materiales.
Material quirúrgico estéril (tijeras finas, pinzas, hojas de afeitar), placas de Petri
estériles (10 cm de diámetro), pipetas serológicas, tubos Falcon de 50 ml (Becton-
Dickinson), centrífuga refrigerada de alta velocidad para tubos Falcon (Neofuge 15R
Speed, HealForce Bio-Meditech).
5.2.2. Reactivos.
PBS 1x estéril, medio de cultivo para MEFs (DMEM (HyClone), suero fetal bovino
(Santa Cruz Biotechnologies), solución de aminoácidos no esenciales (Gibco, Life
Technologies), solución 100x penicilina-estreptomicina (Gibco, Life Technologies))
filtrado y esterilizado en autoclave, etanol 70%, tripsina (Gibco, Life Technologies).
5.2.3. Procedimiento.
Se sacrificó una hembra preñada de 13.5 días post coito por dislocación cervical.
Se removieron los cuernos uterinos, se lavaron brevemente con etanol 70% y se
traspasaron a una placa con PBS 1x estéril. Se realizaron 3 lavados con PBS 1x estéril.
Posteriormente, se separó cada embrión de su placenta y la membrana circundante,
para traspasarlo a una placa de Petri nueva, se lavó tres veces con 10 ml de PBS 1x,
removiendo el exceso de PBS 1x con pipeta serológica. Se cortó cada cerebro e
hígado, se lavó el cuerpo del embrión con PBS 1x fresco, removiendo la mayor cantidad
de sangre posible. Se cortó el cuerpo del embrión con tijeras estériles en tamaños
grandes y se añadió 2 ml de tripsina, para volver a cortar el cuerpo en tamaños más
25
pequeños. Se agregaron 5 ml más de tripsina, se pipeteó vigorosamente y se dejó
incubar por 30 minutos a 37°C. Se transfirió la solución a un tubo Falcon de 50 ml y se
agregó 20 ml de medio de cultivo de MEF fresco, dejando que las piezas de tejido
decanten en el fondo de tubo por unos minutos y se tomó el sobrenadante, el cual fue
sometido a centrifugación de baja velocidad por 5 minutos. Se descartó el sobrenadante
obtenido, el pellet fue resuspendido en medio de cultivo de MEF tibio y se traspasó a
placa de Petri de 10 cm. El medio de cultivo fue cambiado al día siguiente.
5.3. Inmunocitoquímica de MEFs.
5.3.1. Fijación de MEFs.
Después de obtener una confluencia adecuada, se eliminó la mitad del medio de
cultivo y se colocó el mismo volumen de PFA 4% en PBS 1x por 15 minutos a RT.
Posteriormente, se retiró completamente el medio y se adicionó 300 μl de PFA 4% en
PBS 1x por 15 minutos a RT. Luego se lavó 3 veces por 5 minutos cada una a RT.
5.3.2. Permeabilización y Bloqueo.
por 60 minutos a RT.
5.3.3. Anticuerpos.
Se utilizó anticuerpo anti-αSNAP isotipo ratón, a una dilución 1/100. El anticuerpo
utilizado fue el clon 15D4 de la empresa Exalpha. Se incubo con el anticuerpo diluido
durante toda la noche a 4°C en cámara húmeda. Posteriormente se lavó 3 veces con
26
PBS 1x y luego se incubó los cubreobjetos con el anticuerpo secundario AlexaFluor 488
anti-mouse por 1 hora a temperatura ambiente, en cámara húmeda y en oscuridad.
Luego Se lavó 3 veces con PBS 1x y se incubó con DAPI por 10 minutos a temperatura
ambiente y en oscuridad. Después se lavó 2 veces con PBS 1x.
5.3.4. Montaje de cubreobjetos.
Los cubreobjetos fueron invertidos sobre portaobjetos con una de medio de montaje
Fluoromount de la empresa Sigma Aldrich. Los bordes fueron sellados con esmalte para
uñas.
5.4.1. Preparación de liposomas de lecitina de soya.
Se disolvieron 50 µg de lecitina de soya sólida en 5 ml de buffer HBS (145 mM NaCl,
5 mM HEPES pH 7,4) por agitación magnética durante 1 hora a temperatura ambiente,
obteniéndose un estándar de 10 mg/ml de liposomas de lecitina de soya de tamaños
variados. Posteriormente, toda, o parte del estándar fueron pasados por filtros de ptfe
de 0.45 µm con ayuda de una jeringa de 5 ml. El tamaño de los liposomas resultantes
fue confirmado mediante el equipo Zetasizer Nano Series.
27
5.4.2.1. Obtención y Homogeneizado de tejido cerebral de ratón.
5.4.2.1.1. Materiales.
Material quirúrgico estéril, placas Petri de vidrio 90x15 mm, tubos Eppendorf de 1.5 ml
(TCL Ltda.), tubos Falcon de 15 ml (Becton-Dickinson). Micropipeta de 1000 µl
(Biopette, Labnet), homogenizador tipo Potter Elvehjem (Glas-Col/Clarkson Laboratory
& Supply Inc.) con pistilos de teflón y tubos para 15 ml (Thomas Scientific), hielo.
5.4.2.1.2. Reactivos.
Etanol 70%, PBS 1x, medio de homogeneización (sacarosa 320mM (Merck),
EGTA 0.5 mM (Merck), Tris-HCl 5 mM pH 7.4 (Winkler)), cocktail inhibidor de proteasas
1mg/mL (Sigma-Aldrich-p8340), PMSF 100 mM (Sigma Aldrich)
5.4.2.1.3. Procedimiento.
Los animales fueron sacrificados por decapitación, obteniendo cerebros y colas para
extractos y genotipificación respectivamente. Los cerebros se congelaron en tubos
Eppendorf a -80°C mientras se realizaba la genotipificación. Todo este procedimiento
se realizó sobre placas Petri y en hielo. Se utilizaron alrededor de 10 cerebros para la
obtención de extractos cerebrales de ratones PN1 y 5 cerebros para ratones de 2 a 3
meses de edad. Aún congelados se pesaron y se depositaron en tubos Falcon para
dejar descongelando en hielo.
5.4.2.2. Fraccionamiento diferencial.
La idea de este paso es obtener fracciones enriquecidas de organelos subcelulares,
tales como una fracción rica en membranas endosomales y citosol, permitiendo el
análisis de interacción proteica de αSNAP con proteínas presentes en estas fracciones
de forma exclusiva.
5.4.2.2.1. Materiales y equipos.
Centrífuga refrigerada de alta velocidad para tubos Falcon (Neofuge 15R Speed,
HealForce Bio-Meditech), ultracentrífuga, (Hitachi, CP100WX/Rotor P100AT2),
micropipeta 1000 µl (Biopette, Labnet), tubos Falcon 15 ml (Becton-Dickinson).
5.4.2.2.2. Reactivos.
Buffer de homogeneizado (mismo utilizado anteriormente), buffer A2 (buffer de
homogeneizado + NaCl 150 mM (Merck)), buffer A3 (buffer A2 + Triton X-100 2% V/V
(Sigma)), buffer para lisis de sinaptosomas (DTT 1 mM (Promega), EGTA 0.5 mM
(Merck), Tris-HCl 5 mM pH 8.1 (Winkler)) , buffer de resuspención de fracción LP1 (NB)
(HEPES 20 mM pH 7.4 (Sigma), EDTA 2 mM (USBiological), KCl 100 mM, DTT 1 mM
(Promega), Polietilenglicol 4000 1% P/V con inhibidores de proteasas (50 µL/mL de
buffer) (Sigma-Aldirch) y PMSF 1mM (Sigma-Aldrich).
29
5.4.2.2.3. Fracción P2 y S2.
Después de la obtención de pesar los cerebros cerebral, estos fueron
homogenizados con 10 veces su peso en volumen de Buffer A (sacarosa 320 mM,
EGTA 0,5 mM, Tris-HCl 5 mM pH 7,4) más inhibidores de proteasas (PMSF 1 mM,
Coctel Inhibidores 50 µl/ml de buffer). Se homogenizó a 900 rpm en un dando 12
strokes.
Una vez homogenizado el tejido, se centrifugó a 800 x g a 4°C por 10 minutos. Se
obtuvo P1 (Células no rotas y núcleos) y S1; la fracción P1 se descartó. El
sobrenadante S1 se centrifugó a 9200 x g durante 15 minutos a una temperatura de
4°C. Se obtuvo P2 (Sinaptosomas; membrana plasmática de neuronas) y S2
(membranas livianas internas: Golgi, RER, etc.). A partir de la fracción P2 obtendremos
LP1 y de la S2 obtendremos P3.
5.4.2.2.4. Obtención de LP1.
La Fracción P2 se resuspendió en el mismo volumen inicial de buffer A utilizado al
principio del protocolo y se volvió a centrifugar por 15 minutos a 9200 x g a 4°C,
obteniéndose de esta forma la fracción P2’ (sinaptosomas lavados). Para obtener
sinaptosomas puros, es decir solo la membrana plasmática (LP1), P2’ se resuspendió
con buffer de lisis (DTT 1 mM, EGTA 0,5 mM, Tris-HCl 5 mM pH 8,1) en un volumen
equivalente a 3 veces el volumen de P2’. Luego de romper los sinaptosomas mediante
shock hipoosmótico durante 30 minutos a 4°C, P2’ se centrifugó a 22000 x g por 30
minutos a 4°C. Se obtuvo el pellet LP1 (membrana plasmática de sinaptosomas) y el
30
sobrenadante S3, el cual es descartado. La fracción LP1 se resuspendió con buffer NB
(20 mM Hepes, pH 7,4; 2 mM EDTA; 100 mM KCl; 1 mM ditiotreitol; 1% w/v PEG 4000)
con inhibidores de proteasas (PMSF 1 mM, Coctel Inhibidores 50 µl/ml de buffer). El
volumen utilizado de buffer NB es variable, pero cuando se trabaja con 1.5 gramos de
cerebro, usualmente se utiliza 1 ml de buffer NB para resuspender la LP1 resultante.
5.4.2.2.5. Obtención de P3.
El sobrenadante S2 se centrifugó por 2 horas a 165.000 x g a 4°C. El pellet fue
resuspendido en buffer NB.
5.4.3.1. Carbonatación de LP1 – Eliminación de proteínas periféricas.
Este protocolo es adaptado de uno previamente descrito (Steel et al. 1997). La
fracción LP1 se diluyó a una razón de 1 volumen de muestra (Volumen inicial) en 4
volúmenes de buffer Na2CO3 100 mM pH 11,5 y se dejó en hielo por 30 min;
posteriormente se centrifugó a 22000 x g durante 30 minutos a 4°C. El pellet obtenido
se resuspendió en el mismo volumen inicial de buffer NB. Este proceso se repitió dos
veces para la máxima eliminación de proteínas periféricas de membrana.
31
(eliminación incompleta)
Protocolo descrito previamente con algunas modificaciones (Steel et al. 1997). Luego
de la carbonatación de la LP1, esta se centrifugó a 22000 x g durante 30 minutos a 4°C,
para luego resuspenderla con (usualmente 2 ml) tripsina a una concentración de 0.5
mg/ml. Se dejó en incubación durante 40 minutos a 37°C. Se detuvo la actividad de la
tripsina con PMSF 1 mM durante 10 minutos en hielo. Luego se centrifugó a 10000 x g
a 4°C por 30 minutos. El pellet se resuspendió en el mismo volumen inicial de la
alícuota.
5.4.3.3. Extracción de proteínas integrales restantes de LP1.
Para una eliminación completa de proteínas residuales de la LP1 carbonatada y
tripsinizada, esta se centrifugó a 22000 x g por 30 minutos a 4°C. 100 mg de proteína
(La LP1 tratada se cuantificó con un kit de cuantificación de proteínas, y se ocupó el
equivalente a 100 mg) se resuspendió en 25 ml de una proporción cloroformo:metanol
2:1 y se homogenizó a temperatura ambiente por agitación o con ayuda de un
homogenizador. Luego se centrifugó a 5000 x g durante 10 minutos a temperatura
ambiente, obteniéndose una fase solvente (aprox 20 ml) y una acuosa (buffer NB en
este caso). A la fase solvente, se le agregó 4 ml NaCl 0,9% p/v y se agitó por inversión.
Se dejó reposar para que las fases se separen y se extrajo la fase acuosa, la que
contiene proteínas residuales y contaminantes no lipídicos. Esta extracción se realizó 3
veces más utilizando NaCl 0,9%/cloroformo/metanol en una proporción 50:3:47.
Posteriormente, los lípidos fueron desecados bajo una corriente de Nitrógeno gaseoso
32
(N2) y resuspendidos con cloroformo:metanol (1:4). Un tubo nuevo se taró en una
balanza analítica, para luego verter en él la solución con los lípidos disueltos en
cloroformo:metanol. El solvente orgánico es evaporado con nitrógeno gaseoso y el tubo
se pesó nuevamente. Los lípidos son resuspendidos en el volumen de buffer que se
desee. En este trabajo, obtuvimos un estándar de LP1 8.95 mg/ml y un estándar de P3
10 mg/ml. Después, los lípidos fueron pasados 10 veces por un filtro de 0,2 µm
utilizando un extrusor.
5.5.1. Materiales y equipos.
Espectrofotómetro (SP830, Metertek), cubetas plásticas para espectrofotometría,
tubos Eppendorf de 1.5 ml (TCL Ltda.), micropipetas 10/20/200/1000 µl (Biopette,
Labnet), Vortex (Genie 2, Scientific Industries), planillas Excel para cálculos finales.
5.5.2. Reactivos.
5.5.3. Procedimiento.
Se construyó una curva de calibración de acuerdo a lo descrito en el inserto del
reactivo DC Protein Assay. Para ello, se preparó una solución de 2 mg/ml de BSA como
solución estándar y se dispuso de 7 tubos Eppendorf de 1.5 ml (con sus respectivos
duplicados). Para preparar las diluciones correspondientes, se procedió de acuerdo a la
tabla I.
33
Tabla I. Preparación de curva de calibración para determinación de proteínas.
Tubo Concentración
1 2000 160 Stock
BSA
0 160 50 40 2 1500 60 1 20 80 55 30
3 1000 50 1 50 100 55 20
4 750 25 2 25 50 50 15
5 500 45 3 45 90 50 10
6 250 40 5 40 80 50 5
7 125 30 6 30 60 60 2,5
34
Antes de cuantificar la concentración de proteínas totales obtenidas, las muestras
fueron diluidas con buffer A (o buffer A2, dependiendo de la muestra) en razón 4:16 y
en algunos casos 2:18, lo que varía según qué tan concentrada esté la muestra. Luego
se agregaron 100 µl de reactivo A, 4 µl de reactivo S y 800 µl de reactivo B,
homogenizando en vórtex inmediatamente cada tubo Eppendorf. Las muestras se
incubaron por 15 minutos en oscuridad y posteriormente se procedió a medir la
absorbancia a la longitud de onda de 750 nm. Finalmente, se calculó la concentración
proteica obtenida, interpolando en la curva de calibración construida y multiplicando por
el factor de dilución de las muestras. La preparación de las muestras para
concentración proteica, se realizaron en duplicado.
5.6. SDS-PAGE, Western Blot, tinción con nitrato de plata.
5.6.1. Materiales y equipos.
Electroforesis: tubos Falcon de 50 y 15 ml (Becton-Dickinson), micropipetas de
10/20/200/1000 µl (Biopette, Labnet), vidrios de 1.5 mm de grosor con su vidrio de
cubierta (BioRad Laboratories), sistema Mini Protean Casting Stand with clamp para
preparación de geles (BioRad Laboratories), peinetas de 1.5 mm con 10 ó 15 pocillos
(BioRad Laboratories), vortex (Genie 2, Scientific Industries), estanque de Corrida Mini
Protean Tetra Cell (BioRad Laboratories), fuente de poder Enduro 250 V (Labnet),
Termobloque.
35
Millipore Corp, USA), sistema de cassette, peineta verde (ambos de BioRad
Laboratories).
agitación (Shake´N´Bake, Hybridization Oven, Model 136400, (Boekek Scientific)),
micropipetas 10/20/200/1000 µl (Biopette, Labnet), cassette para exposición de
películas, transparencias limpias y secas, películas para autorradiografia (Kodak
Biomax MR Film), sala oscura.
Tinción con nitrato de plata: material de vidrio (probetas graduadas de 100 y 250 ml
(TCL Ltda.)), probeta de plástico de 100 ml (TCL Ltda.), fuentes de vidrio, micropipetas
de 1000 µl (Biopette, Labnet), agitador (GCA/Precision Scientific), papel aluminio,
purificador de agua (Barnstead Easypure II, Thermo Scientific).
5.6.2. Reactivos.
Electroforesis: buffer de corrida (Tris 25 mM pH 8.3 (Winkler), glicina 192 mM (Bio-
Rad), SDS 1% (Bio-Rad)), acrilamida-bisacrilamida 30% (Sigma Aldrich), persulfato de
amonio 10% (Winkler), TEMED (Winkler), stacking buffer (Tris 25 mM (Winkler), SDS
0,2% (Bio-Rad)), Tris-HCl 1,5 mM pH 6,8 (WInkler), SDS 10% (Bio-Rad)), agua
destilada, buffer de carga 2x (agua destilada, Tris 1 M pH 6.8 (Winkler), glicerol (Sigma),
SDS 10% (Bio-Rad), β-mercaptoetanol (Sigma), azul de bromofenol (Merck)), marcador
de peso molecular (Prestained molecular weight, Fermentas).
Electrotransferencia: metanol absoluto (Merck), buffer de transferencia (Tris 25 mM
pH 8.3 (Winkler), Glicina 192 mM (Bio-Rad) Metanol 20% (Merck)), Hielo.
36
Hibridación con anticuerpos y revelado: PBS 1x, buffer de anticuerpo (BSA 1% P/V
(Santa Cruz Biotechnologies)), Tween 20 1% V/V (Winkler), PBS 1x), anticuerpos
primarios (ver Tabla 2), anticuerpo secundario goat Anti–mouse IgG 1:40000 conjugado
a HRP (ThermoScientific), anticuerpo secundario goat Anti–rabbit IgG 1:40000
conjugado a HRP (ThermoScientific), kit de quimioluminiscencia (Immobilon Western
Chemiluminescent HRP Substrate, Millipore), solución de revelado D-72 y solución
fijadora U3.
Tinción con nitrato de plata: metanol absoluto (Merck), ácido acético glacial (Merck),
tiosulfato de sodio (Merck), nitrato de plata (Merck), revelador (formaldehido 37% 50
µl/100 ml (Winkler), carbonato de sodio 3 g/100 ml (Merck)), tiosulfato de sodio (0.2 g/L)
2 ml/100 ml (Merck), EDTA (Merck) y agua ultrapura.
5.6.3. Procedimiento.
5.6.3.1. Electroforesis.
Se prepararon geles SDS-PAGE al 10% de 1.5 mm de espesor y con 15 pocillos. Se
realizó una mezcla en razón 1:1 con buffer de carga 2x y la muestra a analizar, dejando
en termoblock a una temperatura y tiempo dependientes del ensayo (análisis de
extractos: 70°C por 3 minutos; análisis de CoIP: 90°C por 5 minutos; Pulldown: 60°C
por 3 minutos). Luego de esto, se procedió a cargar el gel: en el primer carril del gel se
cargaron 5 µl del estándar de peso molecular y en los siguientes carriles se cargaron
los extractos o ensayos a analizar. Finalmente, los geles se corrieron a 80-100 V
constantes en buffer de corrida durante 2-2.5 horas.
37
5.6.3.2. Electrotransferencia.
Se cortaron trozos de membrana de PVDF de 8.5 x 5.5 cm y se secaron a 37°C
durante 30 minutos en estufa de hibridación. Luego, se incubaron en metanol absoluto
durante 15 segundos y posteriormente 15-30 minutos en buffer de transferencia para
equilibrarlas. Terminada la corrida electroforética, se humedecieron los geles con buffer
de transferencia y se procedió al armado del “sándwich” con la precaución de no dejar
burbujas entre el gel y la membrana. Se transfirió a 0.25 Amperios constantes durante 2
horas con unidad refrigerante. Al terminar la transferencia, las membranas se incubaron
nuevamente en metanol absoluto por 15 segundos y se secaron a 37°C en estufa de
hibridación por alrededor de 15 minutos.
5.6.3.3. Hibridación con anticuerpos y revelado.
Una vez seca la membrana, se incubó con el anticuerpo primario en la dilución
correspondiente en buffer de anticuerpo, durante 2 horas a 37°C sobre estufa de
hibridación en agitación continua. Luego, se sometieron a 3 lavados con PBS 1x
durante 5 minutos cada uno y luego se incubaron con el anticuerpo secundario por 30
minutos en estufa de hibridación. Nuevamente, se realizaron 3 lavados con PBS 1x. Los
anticuerpos realizados se resumen en la tabla II.
Para el revelado, se utilizó el kit de quimioluminiscencia, incubándose con 1mL de
cada solución en oscuridad durante 5 minutos en agitación. Se colocaron las
membranas en transparencias limpias y se expusieron en oscuridad sobre film
fotográficos Kodak. Finalmente, las películas se revelaron con solución D-72 y se fijaron
con solución fijadora U3.
38
Tabla II. Anticuerpos utilizados para hibridación en el método de inmunoblot.
Anticuerpo Peso
monoclonal
monoclonal
policlonal
5.7. Tinción con nitrato de plata.
Al haber terminado con la corrida electroforética, el gel se sumergió en una fuente de
vidrio que contenía una solución de metanol 50% y ácido acético al 10%, incubándola
por 30 minutos. Se descartó esta solución y se incubó por 15 minutos con metanol 5%.
Luego de esto, se procedió a lavar tres veces con agua ultrapura por 5 minutos o, en
caso de no poder continuar, se dejó en agua ultrapura hasta volver a retomar el
protocolo. Se incubó con tiosulfato de sodio 0.2 g/L durante 120 segundos, se
realizaron 3 lavados de 30 segundos con agua ultrapura, para luego incubar con nitrato
de plata 0.2 g/100 ml durante 25 minutos. Posteriormente, se realizaron 3 lavados por
30 segundos con agua ultrapura y se incubó con revelador hasta desarrollar la señal
óptima. Se detuvo el desarrollo con EDTA 14 g/L por 10 minutos y finalmente se lavó
con agua destilada. Para obtener las imágenes de los geles, éstos se colocaron entre
dos transparencias limpias y se procedió a escanear o tomar fotografías.
5.8. Ensayo de Flotación.
En este trabajo, utilizamos dos protocolos de flotación, uno llamado “A” (el primero
que utilizamos) descrito por Hofer et al. (2010) y el otro llamado “B”, descrito por Steel
et al. (1997).
5.8.1. Protocolo A.
En un tubo centrifuga de aproximadamente 1 ml, se incubaron los lípidos (en este
caso, liposomas de lecitina de soya, LP1 carbonatada y tripsinizada o liposomas de LP1
40
pura) junto con la proteína recombinante a evaluar (αSNAP WT o αSNAP.M105I). En
todos los ensayos se agregó 3,6 µg de proteína recombinante y una cantidad específica
de lípidos (descrita en resultados). Se completó un volumen de 300 µl con el buffer
utilizado, que para el protocolo antiguo fue buffer HBS. Luego de incubar por 5 minutos
a 37°C, se agregó 200 µl de sacarosa 75% (p/v) en buffer HBS y se mezcló
vigorosamente con los 40 µl anteriores, obteniéndose 500 µl de una solución de
sacarosa 30% (p/v). Luego, cuidadosamente se agregó 400 µl de una solución
sacarosa 25% (p/v) en buffer HBS para luego adicionar en la parte superior, 100 µl de
buffer HBS. Luego se centrifugó a 240000 x g durante 4 horas a 37°C. Luego se
obtuvieron 10 fracciones de 100 µl desde arriba del gradiente de densidad. Este
gradiente de sacarosa fue solamente utilizado en primer experimento de flotación con
lecitina de soya observado en la figura 3. Luego se cambió por una 60%/50%/0 descrito
en el aparato materiales y métodos 2.3.2.
5.8.2. Protocolo B.
En esencia, este protocolo es idéntico al anterior, en el cual solamente cambia el
gradiente de densidad y las condiciones de centrifugación. Se incubó 3,6 µg de
proteínas recombinante con una cantidad determinada de lípidos y se completaron 40 µl
con buffer NB; se incubó a 37°C por 5 minutos. Posteriormente se adicionaron 160 µl de
una solución 75% sacarosa (p/v) en buffer NB. Se mezcla vigorosamente, obteniéndose
200 µl de una solución 60% sacarosa (p/v). Después se agregó 700 µl de sacarosa 50%
(p/v) en buffer NB y se agregó en la superficie, 100 µl de buffer NB solo. Luego los
41
tubos fueron centrifugados a 140000 x g durante 1.5 horas a 37°C. Luego se obtuvieron
10 fracciones de 100 µl desde arriba del gradiente de densidad.
5.8.3. SDS-PAGE después del ensayo de flotación.
Después de obtenidas las fracciones en el ensayo de flotación, estas fueron corridas
en condiciones especiales. Se preparó un gel de acrilamida al 10% utilizando un gel
stacking al 4% sin SDS. Se tomaron exactamente 22,5 µl de cada fracción y se les
agregó 7,5 µl de buffer de carga que no contenía SDS. Es muy importante este detalle,
ya que un exceso de SDS, junto con los lípidos presentes en las muestras, puede
causar la agregación de αSNAP y verse un patrón característico en el gel. El buffer de
corrida y el gel separador si fueron hechos con SDS. Las muestras fueron corridas a
80v durante aproximadamente 2,5 horas. Luego, los geles fueron visualizados mediante
tinción de plata o Western blot.
5.9. Ensayo de láminas de membrana plasmática.
5.9.1. Preparación de láminas de membrana plasmática.
Protocolo previamente descrito por Barszczewski et al. (2008). Se cultivaron células
PC12 en cubre objetos previamente tratados con poli-lisina y se esperó una confluencia
de aproximadamente 80%. El cubre objetos se montó en una cámara llena con Buffer
K-Glu (ice cold, 20 mM HEPES pH 7.2, 120 mM de glutamato de potasio, 20 mM de
acetato de potasio, 2 mM EGTA) que contiene además: 10 mM 1,3-diamino-2-propanol-
N,N,N’,N’-tetraacetic acid (DPTA), 2 mM ATP, 4 mM MgCl2, y 0.5 mM dithiothreitol
42
(DTT). Con un sonicador previamente encendido, Se sumergió la punta de éste dentro
de la cámara y se dieron pequeños pulsos (de 0.5 segundos aprox.). Usualmente se
requirió un solo pulso. Luego, estas células previamente transfectadas con
sinaptofisina-GFP, fueron observadas en microscopio de TIRF. Después de obtenidas
las láminas de membrana, se cambia el buffer K-Glu ice cold, por un K-Glu a
temperatura ambiente.
5.9.2. Inmunoensayo de las láminas de membrana.
Protocolo adaptado de uno previamente descrito (Barszczewski et al. 2008). Las
láminas de membrana se incubaron con 2 µM de αSNAP recombinante a 37°C por 5
minutos, en una cámara húmeda con buffer K-Glu (20 mM HEPES pH 7.2, 120 mM de
glutamato de potasio, 20 mM de acetato de potasio, 2 mM EGTA) con 10 mM DPTA, 2
mM ATP, 4 mM MgCl2 y 0.5 mM DTT. Posteriormente, se lavó con PBS durante 10
minutos a 37°C. Estas luego se fijaron con PFA 4% durante 60-90 minutos a
temperatura ambiente. Se interrumpió la fijación con 50 mM NH4Cl en PBS por 20
minutos a temperatura ambiente. Se lavó 3 veces con PBS, 10 minutos cada vez. Se
incubó a temperatura ambiente por 60 minutos con anticuerpo primario (Anti-αSNAP,
mouse), con una dilución 1:200. Se lavó 3 veces con PBS por 10 minutos. Después, se
incubó con anticuerpo secundario (Alexa 594 Anti-mouse) con una dilución 1:400 por 60
minutos a temperatura ambiente y en oscuridad. Todo el proceso se llevó a cabo en
una cámara húmeda. Posteriormente, las láminas de membrana fueron visualizadas
utilizando un microscopio TIRF.
5.10. Proteínas Recombinantes
Las proteínas αSNAP WT y αSNAP.M105I utilizadas en este trabajo fueron
previamente obtenidas por mi tutor, el Dr. Federico Bátiz en colaboración con el Dr.
Gonzalo Mardones, ambos de la Universidad Austral de Chile. Para la producción de
dichas proteínas, se utilizaron construcción para proteínas de fusión con tag GST
(glutatión-S-transferasa). Como templado se utilizaron los plásmidos pcDNA3.1 para
αSNAP WT y el plásmido pET28a conteniendo el cDNA de αSNAP.M105I. Ambas
construcciones fueron secuenciadas para confirmar la fidelidad del procedimiento. Se
transformaron bacterias de Escherichia coli B834 (DE3) de alto rendimiento, se indujo la
síntesis (mediante IPTG), y luego se purificaron las proteínas mediante cromatografía
de afinidad en columnas de glutatión-Sepharose. Finalmente se analizaron las
eluciones mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE). Interesantemente,
se obtuvo una mayor expresión de αSNAP.M105I en comparación con su versión WT,
lo que indicaría una mayor solubilidad (Figura 5a). Ambas proteínas fueron digeridas
con la proteasa TeV para escindir el tag GST y luego purificadas mediante columnas de
(i) Superdex200, (ii) glutatión-Sepharose (eliminación de GST), y (iii) Ni-sepharose
(eliminación de TeV) (Fig. 5a-d).
44
45
Figura 5. Producción y purificación de proteínas recombinates alfa-SNAP.wt y
alfa-SNAP.M105I. (A) Tinción de Commassie blue de una electroforesis en gel de
poliacrilamida (NU-PAGE) de las fracciones eluidas secuencialmente (#1, #2, #3) a
partir de las columnas de Glutation-Sepharose para GST-a-SNAP.wt (carriles 2, 3 y 4)
y GST-a-SNAP.M105I (carriles 6, 7 y 8). En todos los carriles se cargó elmismo
volumen (26ul); carril 5 sin muestra. Nótese la producción relativa de a-SNAP.M105I en
comparación a a-SNAP.wt. (B) 13,4ul de un pool GST-a-SNAP.wt (#1+2; carril 2) y
2,7ul de un pool de GST-a-SNAP.M105I (#1+2; carril 4) fueron digeridos con la
proteasa TeV para escindir GST de a-SNAP, observándose que la reacción enzimática
es efectiva y que las proteínas tienen los tamaños esperados (carriles 3 y 5,
respectivamente). (C-D) Purificación de las proteínas recombinantes a-SNAP.wt (C) y
a-SNAP.M105I (D) mediante pasajes secuenciales y sucesivos a través de Superdex-
200 (carriles 5), glutation-Sepharose (carriles 6; elimina la proteína GST) y Ni-
Sepharose (carriles 7; elimina la TeV). En los carriles 2 se muestra un extracto del
cultivo crudo + IPTG; en los carriles 3 los pooles #1+2 GST-a-SNAP; y en los carriles 4
los mismos pooles +TeV.
6.1. Localización de αSNAP en MEFs.
6.1.1. La mutación M105I de αSNAP provoca una menor localización de
ésta en membrana plasmática de fibroblastos embrionarios de ratón.
αSNAP es una proteína que posee una distribución celular dependiente del tipo
celular donde se observe. Se ha descrito que αSNAP en cerebro y páncreas se
encuentra mayoritariamente a nivel citosólico (Kiraly-Borri et al. 1996); por contraparte,
en células tipo 2 alveolares y células cromafines, esta proteínas se encuentra
mayoritariamente en la periferia de la célula, es decir, en la membrana plasmática
(Banaschewski et al. 1998; Abonyo et al. 2003). Estos estudios fueron realizados en
células cuya actividad depende notoriamente en su capacidad de fusionar vesículas con
su membrana plasmática, por ende, es de esperar que una mutación en αSNAP
provoque un fuerte impacto en su función y distribución. En efecto, se ha descrito que la
mutación M105I en αSNAP provoca su hipomorfismo (menores niveles de proteína) en
tejido nervioso (Chae et al. 2004; Hong et al. 2004). Adicionalmente, estudios previos
en nuestro laboratorio demuestran que la distribución subcelular de αSNAP se
encuentra alterada en tejido nervioso, presentando una menor asociación con
membrana plasmática. Sin embargo, no se conoce si este hecho es también una
realidad en otros tejidos, especialmente en aquellos con una menor función secretoria.
Con esto en mente, se evaluó la distribución subcelular de αSNAP en fibroblastos
embrionarios de ratones (MEFs, por sus siglas en inglés) WT (αSNAP WT) y hyh
47
(αSNAP.M105I). Tal como se esperaba, αSNAP.M105I presenta una localización
alterada respecto a αSNAP WT. Se observa que αSNAP WT presenta una localización
relativamente difusa, destacando una alta inmunorreacción en la periferia de la célula,
en y/o en la proximidad de la membrana plasmática; por contraparte, y en concordancia
con lo observado en tejido nervioso, αSNAP.M105I está menos asociada a membranas,
incluso adoptando una distribución mayoritariamente perinuclear (Fig. 6).
48
WT
* *
Figura 6. Expresión de αSNAP en fibroblastos embrionarios (MEFs) WT y hyh. Las
MEFs WT presentan un patrón de distribución subcelular de α-SNAP caracterizado por
la presencia de una intensa inmunorreacción en la membrana plasmática de estas
células (flechas dobles en WT e inserto). Por el contrario, en las MEFs hyh se observa
un patrón completamente anómalo, con una distribución más difusa, concentrándose
fundamentalmente en la región perinuclear (asterisco). Las barras corresponder a 10
µm. la barra del inserto corresponde a 2 µm. Medidas aproximadas.
49
6.2.1. αSNAP.M105I interacciona menos con láminas de membrana
plasmática de células PC12 en comparación con αSNAP WT.
Tal como se indicó anteriormente, estudios bioquímicos realizados en nuestro
laboratorio utilizando proteínas recombinantes habían demostrado que αSNAP.M105I
presenta una reducción en su asociación a membranas; sin embargo, dada la
naturaleza de los experimentos donde se utilizaron extractos enriquecidos en
membrana plasmática, los defectos observados podrían no ser tales en membranas
plasmáticas que mantengan la conformación y distribución de sus componentes
proteicos y lipídicos. Para estudiar esto, evaluamos la interacción de αSNAP WT
recombinante y de αSNAP.M105I recombinante con láminas de membrana plasmática
fabricadas a partir de células PC12 mediante microscopía TIRF (colaboración con el
laboratorio del Dr. Sebatián Brauchi de la Universidad Austral de Chile). Se eligieron
estas células por su gran citoplasma (es decir, posee una superficie considerable de
membrana plasmática). Brevemente, para realizar esta metodología se cultivan células
PC12 sobre cubreobjetos con poli-lisina y con ayuda de un sonicador se rompe la parte
superficial de las células, quedando solamente la membrana plasmática adherida al
vidrio. Posteriormente, las láminas de membrana se incuban directamente con αSNAP
WT o M105I recombinante, se lavan y luego se realiza una inmunofluorescencia que es
analizada en un microscopio TIRF (Fig. 7a). Se utilizaron células PC12 transfectadas
con sinaptofisina-GFP para poder identificarlas y distinguir la integridad de las láminas
luego de la sonicación. Así, previo a la realización de los ensayos, las células PC12 son
observadas por epifluorescencia para ubicarlas en el cubreobjetos.
50
51
Figura 7. Ensayos de interacción en láminas de membrana. A. Esquema que
muestra cómo se realiza el ensayo. Básicamente, las células (PC12) son
localizadas mediante epifluorescencia y TIRF y luego sometidas a 3 pulsos de
sonicación quedando sólo las membranas plasmáticas adheridas a los
cubreobjetos. Luego estas láminas de membranas son incubadas con proteína
recombinante αSNAP (WT o M105I), lavadas y procesadas para
inmunofluorescencia indirecta utilizando un anticuerpo específico para αSNAP.
Finalmente, son analizadas mediante microscopía TIRF. B. Grupos de células (i, ii,
iii) sometidas al ensayo visualizadas mediante epifluorescencia (Epi), TIRF y TIRF
luego de la sonicación (TIRF + sonic). Los recuadros en cada imagen indican la
región que se analizó después del procesamiento (incubación con proteína
recombinante + inmunofluorescencia indirecta). Nótese que con el procedimiento,
partes de las membranas se despegan del cubreobjeto. C. Las tres imágenes
superiores corresponden a las regiones indicadas en B y son representativas de los
resultados obtenidos mediante incubación con αSNAP WT y αSNAP.M105I. Como
control se utilizaron membranas incubadas con solamente con los anticuerpos
utilizados para α-SNAP. Las imágenes inferiores corresponden a la convolución de
las imágenes superiores para realizar la cuantificación de los spots (ImageJ). D.
Cuantificación de los spots obtenidos mediante convuloción de imágenes. Las
barras representan el promedio ± SEM (n=3). * p<0,001 respecto a la incubación
con proteína WT (Student’s t-test). La barra corresponde a aproximadamente 10
µm y es representativa de las demás imágenes.
52
Posteriormente, estas son visualizadas mediante TIRF, permitiendo observar solo la
porción más cercana al vidrio, en otras palabras, se observa la membrana plasmática
inferior de las células PC12. Luego, estas son sonicadas y lavadas, quedando
solamente la membrana adherida al vidrio (Fig. 7b).
Los resultados obtenidos mediante la incubación de láminas de membrana
plasmática con proteína recombinante WT y M105I, permitieron demostrar que αSNAP
WT se asocia considerablemente más a la lámina en comparación con αSNAP.M105I
(Fig. 7c). Este hecho queda aún más de manifiesto cuando la imagen resultante se
deconvoluciona, para su posterior análisis densitométrico (Fig. 7d).
53
6.3. Interacción de αSNAP WT y αSNAP.M105I con lípidos.
6.3.1. αSNAP WT y αSNAP.M105I no interaccionan con lecitina de soya –
Protocolo A.
Todos los resultados obtenidos hasta aquí, confirman que αSNAP.M105I se asocia
menos con membrana plasmática que αSNAP WT. Sin embargo, todos los ensayos han
sido realizados utilizando membranas, lo que no permite descartar si los defectos se
deben a una reducción en l