PROSEDUR PCR - habibi.staff.ub.ac.idhabibi.staff.ub.ac.id/files/2012/11/prosedur-pcr.pdf · 4....
2
Heni Endrawati, S.Si Page 1 PROSEDUR PCR Vivantis DNA amplification kit 1. Bersihkan tempat kerja dengan ethanol 70% 2. Siapkan sarung tangan, pipet tips, eppendorf tubes steril pada tempat bersih (seringlah mengganti sarung tangan) 3. Siapkan Vivantis DNA amplification kit dari -20 kemudian thawing pada RT 4. Penyiapan primer a. Proses pengenceran primer Β_actin_F ditambah dengan 378 µL water free RNAse Β_actin_R ditambah dengan 354 µL water free RNAse Jagged 1_F ditambah dengan 394 μL water free RNAse Jagged 1_R ditambah dengan 374 μL water free RNAse Dipipeting supaya homogen dan divortex b. Proses aliquot primer Diambil 10 μL masing-masing primer dimasukkan pada ependof yang berbeda dan dilabel 5. Labeli 200 μL PCR tube sesuai jumlah sampel Label 1 = K14P label 2 = K24P Label 3 = K34P label 4 = K42P Label 5 = K54P label 6 = K64P Label 7 = K74P label 8 = K84P Label 9 = K94P Untuk penulisan dengan tinta biru menggunakan primer “Jagged 1” dan tinta hitam “Β_actin” (karena pada penelitian ini hanya menggunakan 2 primer tersebut) 6. Penyiapan reagen PCR mix reaksi Ikutilah prosedur pada table dibawah ini Prosedure PCR Reaction Tabel 1. Mix Reaksi No. Mix Reaksi PCR 1 x Reaksi 1/7 X Reaksi 12X Reaksi 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Water nuclease-free 10 x Vi Buffer A 2mM dNTP mix 50mM MgCl 2 10μM Forward Primer 10μM Reverse Primer Taq DNA Polymerase Control DNA/sample DNA 38,1 μL 5 μL 2 μL 1,5 μL 1 μL 1 μL O,4 μL 1 μL 5,443 μL – 5,386 μL 0,714 μL 0,286 μL 0,214 μL 0,143 μL 0,143 μL 0,057 μL 0,143 μL – 0,2 μL 64,632 μL 8,568 μL 3,432 μL 2,568 μL 1,716 μL 1,716 μL O,684 μL @ 0,2 μL total 50 μL 7,143 μL Catatan : a. Untuk menentukan x reaksi: 1. perhitungkan total volume yang diperlukan cukup untuk percobaan selanjutnya (Elektroforesis Horisontal/DNA), contoh 1/7 x reaksi,
Transcript of PROSEDUR PCR - habibi.staff.ub.ac.idhabibi.staff.ub.ac.id/files/2012/11/prosedur-pcr.pdf · 4....
Heni Endrawati, S.Si Page 1
PROSEDUR PCR Vivantis DNA amplification kit
1. Bersihkan tempat kerja dengan ethanol 70%
2. Siapkan sarung tangan, pipet tips, eppendorf tubes steril pada tempat bersih (seringlah
mengganti sarung tangan)
3. Siapkan Vivantis DNA amplification kit dari -20 kemudian thawing pada RT
4. Penyiapan primer
a. Proses pengenceran primer
Β_actin_F ditambah dengan 378 µL water free RNAse
Β_actin_R ditambah dengan 354 µL water free RNAse
Jagged 1_F ditambah dengan 394 µL water free RNAse
Jagged 1_R ditambah dengan 374 µL water free RNAse
Dipipeting supaya homogen dan divortex
b. Proses aliquot primer
Diambil 10 µL masing-masing primer dimasukkan pada ependof yang berbeda dan
dilabel
5. Labeli 200 µL PCR tube sesuai jumlah sampel
Label 1 = K14P label 2 = K24P
Label 3 = K34P label 4 = K42P
Label 5 = K54P label 6 = K64P
Label 7 = K74P label 8 = K84P
Label 9 = K94P
Untuk penulisan dengan tinta biru menggunakan primer “Jagged 1” dan tinta hitam
“Β_actin” (karena pada penelitian ini hanya menggunakan 2 primer tersebut)
6. Penyiapan reagen PCR mix reaksi
Ikutilah prosedur pada table dibawah ini
Prosedure PCR Reaction
Tabel 1. Mix Reaksi
No. Mix Reaksi PCR 1 x Reaksi 1/7 X Reaksi 12X Reaksi
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Water nuclease-free
10 x Vi Buffer A
2mM dNTP mix
50mM MgCl2
10µM Forward Primer
10µM Reverse Primer
Taq DNA Polymerase
Control DNA/sample DNA
38,1 µL
5 µL
2 µL
1,5 µL
1 µL
1 µL
O,4 µL
1 µL
5,443 µL – 5,386 µL
0,714 µL
0,286 µL
0,214 µL
0,143 µL
0,143 µL
0,057 µL
0,143 µL – 0,2 µL
64,632 µL
8,568 µL
3,432 µL
2,568 µL
1,716 µL
1,716 µL
O,684 µL
@ 0,2 µL
total 50 µL 7,143 µL
Catatan :
a. Untuk menentukan x reaksi:
1. perhitungkan total volume yang diperlukan cukup untuk percobaan selanjutnya
(Elektroforesis Horisontal/DNA), contoh 1/7 x reaksi,
Heni Endrawati, S.Si Page 2
2. kemudian kalikan dengan jumlah sampel ditambah 3 atau 4, contoh 12 x reaksi = 9
sampel + 3
b. untuk Taq DNA polymerase harus segera di aliquot 20 µL pada beberapa ependdof,
labellah dan segera disimpan dalam -20oC
7. Siapkan/masukkan 6,943 µL Mix reaksi PCR kedalam masing tube eppendorf (v 200 µL)
sampel yg telah disiapkan (no. 5)
8. Pipetlah 0,2 µL DNA template atau DNa Sampel
9. Campurlah dengan mix reaksi PCR yang sidah siap dalam tube eppendorf dengan cara
dipepeting (jangan divortex) kemudian spin down
10. Bawalah tube pada mecin PCR dan gunakan mengikuti kondisi siklus pada table 2
Tabel 2. cycling condition PCR
PCR Cycle step Temperature Time (minutes) Number of cycle
Initial denaturation 95 OC 3 1
Denaturation 95 OC 30 sec 40
Anneling 52 OC 30 sec
Extention 72 OC 30 sec
Final extention 72 OC 5 1
Hold 12 OC Indefinitely 1
11. Setelah proses PCR sampel bisa disimpan dalam 4oC, atau langsung di elektroforesis
Horisontal/DNA.
