Heni Endrawati, S.Si Page 1

PROSEDUR PCR Vivantis DNA amplification kit

1. Bersihkan tempat kerja dengan ethanol 70%

2. Siapkan sarung tangan, pipet tips, eppendorf tubes steril pada tempat bersih (seringlah

mengganti sarung tangan)

3. Siapkan Vivantis DNA amplification kit dari -20 kemudian thawing pada RT

4. Penyiapan primer

a. Proses pengenceran primer

Β_actin_F ditambah dengan 378 µL water free RNAse

Β_actin_R ditambah dengan 354 µL water free RNAse

Jagged 1_F ditambah dengan 394 µL water free RNAse

Jagged 1_R ditambah dengan 374 µL water free RNAse

Dipipeting supaya homogen dan divortex

b. Proses aliquot primer

Diambil 10 µL masing-masing primer dimasukkan pada ependof yang berbeda dan

dilabel

5. Labeli 200 µL PCR tube sesuai jumlah sampel

Label 1 = K14P label 2 = K24P

Label 3 = K34P label 4 = K42P

Label 5 = K54P label 6 = K64P

Label 7 = K74P label 8 = K84P

Label 9 = K94P

Untuk penulisan dengan tinta biru menggunakan primer “Jagged 1” dan tinta hitam

“Β_actin” (karena pada penelitian ini hanya menggunakan 2 primer tersebut)

6. Penyiapan reagen PCR mix reaksi

Ikutilah prosedur pada table dibawah ini

Prosedure PCR Reaction

Tabel 1. Mix Reaksi

No. Mix Reaksi PCR 1 x Reaksi 1/7 X Reaksi 12X Reaksi

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

Water nuclease-free

10 x Vi Buffer A

2mM dNTP mix

50mM MgCl2

10µM Forward Primer

10µM Reverse Primer

Taq DNA Polymerase

Control DNA/sample DNA

38,1 µL

5 µL

2 µL

1,5 µL

1 µL

1 µL

O,4 µL

1 µL

5,443 µL – 5,386 µL

0,714 µL

0,286 µL

0,214 µL

0,143 µL

0,143 µL

0,057 µL

0,143 µL – 0,2 µL

64,632 µL

8,568 µL

3,432 µL

2,568 µL

1,716 µL

1,716 µL

O,684 µL

@ 0,2 µL

total 50 µL 7,143 µL

Catatan :

a. Untuk menentukan x reaksi:

1. perhitungkan total volume yang diperlukan cukup untuk percobaan selanjutnya

(Elektroforesis Horisontal/DNA), contoh 1/7 x reaksi,

Heni Endrawati, S.Si Page 2

2. kemudian kalikan dengan jumlah sampel ditambah 3 atau 4, contoh 12 x reaksi = 9

sampel + 3

b. untuk Taq DNA polymerase harus segera di aliquot 20 µL pada beberapa ependdof,

labellah dan segera disimpan dalam -20oC

7. Siapkan/masukkan 6,943 µL Mix reaksi PCR kedalam masing tube eppendorf (v 200 µL)

sampel yg telah disiapkan (no. 5)

8. Pipetlah 0,2 µL DNA template atau DNa Sampel

9. Campurlah dengan mix reaksi PCR yang sidah siap dalam tube eppendorf dengan cara

dipepeting (jangan divortex) kemudian spin down

10. Bawalah tube pada mecin PCR dan gunakan mengikuti kondisi siklus pada table 2

Tabel 2. cycling condition PCR

PCR Cycle step Temperature Time (minutes) Number of cycle

Initial denaturation 95 OC 3 1

Denaturation 95 OC 30 sec 40

Anneling 52 OC 30 sec

Extention 72 OC 30 sec

Final extention 72 OC 5 1

Hold 12 OC Indefinitely 1

11. Setelah proses PCR sampel bisa disimpan dalam 4oC, atau langsung di elektroforesis

Horisontal/DNA.