PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK JAMUR LINGZHI …Mekanisme molekuler terhadap RE-α dianalisis secara...

i

PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK JAMUR LINGZHI (Ganoderma

lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.) PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D :

KAJIAN AKTIVITAS SITOTOKSIK, INDUKSI APOPTOSIS DAN

EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN ALFA (RE-α)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Skolastika

NIM : 128114150

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2019

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv


v


vi

Prakata

Syukur dan pujian untuk kemuliaan nama-Mu Tuhan atas segala kasih

yang selalu mengalir, sehingga Penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulis

menyadari hanya oleh karena penyertaan dan belas kasih-Mu lewat berbagai pihak

sehingga skripsi ini boleh selesai. Ucapan syukur dan terima kasih Penulis

sampaikan kepada segenap pihak yang telah membantu dalam penyusunan skripsi,

seluruh civitas akademik Universitas Sanata Dharma, khususnya keluarga besar

Program Studi Farmasi.

Syukur dan terima kasih secara khusus Penulis sampaikan kepada Ibu

Damiana Sapta Candrasari S.Si., M.Sc., Bapak Florentinus Dika Octa Riswanto,

M.Sc. dan Ibu Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., sebagai dosen pembimbing yang

sangat sabar dan selalu mendorong penulis untuk menyelesaikan skripsi ini, juga

kepada Ibu Dr. Yustina Sri Hartini Apt., dan Ibu Dr. Christine Patramurti Apt.,

selaku Dekan dan Kaprodi Fakultas Farmasi yang telah memberikan kesempatan

khusus bagi penulis untuk menyelesaikan perkuliahan di Fakultas Farmasi Sanata

Dharma. Penulis juga bersyukur dan berterima kasih kepada orangtua, saudara

(Celin & Fisher), om dan tante, juga adik-adik yang selalu mendoakan dan

mendukung dalam keadaan apapun, juga kepada keluarga besar Focolare dan

Youth for A United World (Y4UW), keluarga Bapak Widodo, Bapak Paulus

Panjang, dan Ibu Irene yang sudah menjadi orangtua bagi Penulis selama di Jogja,

juga teman-teman OMK Babarsari, K2KAMSY, Para Frater AM, Pater Victor,

Rm. Ignas CICM, Rm Joko Pr., Tirta Svara Choir, Vocason, Interfidei, Valentina,

Xiong, dan seluruh sahabat yang tidak dapat Penulis sebutkan satu persatu.

Penulis sadar bahwa skripsi ini masih jauh dari sempurna, oleh karena itu

Penulis sangat terbuka akan kritik maupun saran yang mendukung untuk

kemajuan Penulis dan akan mempertanggung-jawabkan segala kekurangan dalam

penulisan skripsi ini. Semoga skripsi ini bisa bermanfaat bagi pembaca.

Yogyakarta, 2 Februari 2019

Penulis


vii

Daftar Isi

Halaman

PERSETUJUAN PEMBIMBING .................................................................. ii

PENGESAHAN SKRIPSI ............................................................................. iii

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ........................................................ iv

LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI......................... v

PRAKATA ..................................................................................................... vi

DAFTAR ISI .................................................................................................. vii

DAFTAR TABEL .......................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR ..................................................................................... ix

DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. x

ABSTRAK ..................................................................................................... xi

ABSTRACT ..................................................................................................... xii

PENDAHULUAN ......................................................................................... 1

METODE PENELITIAN ............................................................................... 3

HASIL & PEMBAHASAN ........................................................................... 9

KESIMPULAN .............................................................................................. 26

SARAN .......................................................................................................... 27

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 27

LAMPIRAN ................................................................................................... 31


viii

Daftar Tabel

Halaman

TABEL I Data Uji Sitotoksik .................................................................... 13

TABEL II Hasil Pengamatan Apoptosis Double Staining AO-EB ............. 18

TABEL III Distribusi Ekspresi RE-α ............................................................ 21


ix

Daftar Gambar

Halaman

GAMBAR 1. Struktur Molekul ................................................................... 11

GAMBAR 2. Morfologi Sel T47D ............................................................... 12

GAMBAR 3. Proses Pembentukan Formazan .............................................. 12

GAMBAR 4. Kristal Formazan .................................................................... 13

GAMBAR 5. Grafik Polinomial ................................................................... 14

GAMBAR 6. Morfologi Sel T47D Hasil Uji Double Staining AO-EB ....... 19

GAMBAR 7. Morfologi Sel T47D pada Uji Imunositokimia ...................... 21

GAMBAR 8. Jalur Pensinyalan RE-α........................................................... 23

GAMBAR 9. Proses metabolisme tamoxifen ............................................... 23

GAMBAR 10. Pharmacophore-Molecular Docking dari 4-OHT dan 17-β

Estradiol dengan RE-α .......................................................... 24


x

Daftar Lampiran

Halaman

LAMPIRAN 1. Surat Determinasi ................................................................ 30

LAMPIRAN 2. Ethical Clearance ................................................................ 31

LAMPIRAN 3. Pengolahan Data ................................................................. 32


xi

ABSTRAK

Kanker payudara menjadi jenis kanker yang mempunyai tingkat insidensi

tertinggi di Indonesia pada tahun 2018 dengan angka kejadian sebesar 58.256

kasus. International Agency for Reasearch on Cancer (IARC) tahun 2018

memprediksi pada tahun 2040, kasus kanker payudara meningkat menjadi 89.512

kasus. Kanker payudara memiliki karakter ekspresi tinggi reseptor estrogen

alfa (RE-α) yang dapat dihambat dengan pengobatan standar yaitu tamoxifen.

Dewasa ini muncul efek samping dan resistensi terhadap pengobatan

tamoxifen. Penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak etanolik jamur lingzhi

memiliki kemampuan sitotoksik terhadap berbagai sel kanker termasuk sel kanker

payudara MCF-7 & MDA-MB-231. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui

pengaruh ekstrak etanolik jamur lingzhi (Ganoderma lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.)

pada sel kanker payudara T47D dengan melihat aktivitas sitotoksik, induksi

apoptosis dan ekspresi reseptor estrogen alfa (RE-α). Model sel kanker payudara

yang digunakan adalah sel T47D yang mampu mengekspresikan reseptor estrogen

alfa (RE-α). Uji sitotoksisitas dianalisis menggunakan metode 3-[4,5-

dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide (MTT), dilanjutkan

dengan uji induksi apoptosis dengan metode double staining AO-EB.

Mekanisme molekuler terhadap RE-α dianalisis secara semi-kuantitatif

menggunakan metode imunositokimia.

Ekstrak etanolik jamur lingzhi memiliki kemampuan sitotoksik terhadap

sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar 284,098 g/mL, dapat

menginduksi apoptosis sebesar 97,8 ± 0,13% dan nekrosis sebesar 0,27 ± 0,01,

tetapi belum mampu menekan ekspresi RE-α, sehingga RE-α masih

terekspresikan sebesar 97-98% dengan level ekspresi RE-α yaitu di level 4+.

Kata kunci: Kanker payudara, RE- α, Ganoderma lucidum, sel T47D.


xii

ABSTRACT

Breast cancer was a type of cancer with the highest incidence rate in

Indonesia in 2018 with 58,256 number of cases. In 2018, International Agency for

Research on Cancer (IARC) has predicted that in 2040, breast cancer cases will

increase up to 89,512 cases. Breast cancer has the overexpression character of

estrogen alpha receptors (ER-α) which can be inhibited by the standard treatment

namely tamoxifen. However, resistance and side effects against tamoxifen are still

two of the major hurdles in the effective management of breast cancer. Previous

research showed that lingzhi mushroom ethanolic extracts had cytotoxic effect

against various cancer cells including MCF-7 & MDA-MB-231 breast cancer

cells. This study was conducted to determine the effect of lingzhi (Ganoderma

lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.) ethanolic extracts on T47D breast cancer cells by

study on cytotoxic activities, apoptotic induction and expression of alpha estrogen

receptors (ER-α). T47D cancer cells were used as a model of cancer cells because

they were able to activate alpha estrogen receptors. Cytotoxicity tests were carried

out using the 3 - [4,5-dimethylthiazol-2-yl] - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide

(MTT) method, followed by apoptosis trial by the AO-EB double staining

method. The molecular relationship with ER-α was analyzed semi-quantitatively

using the immunocytochemistry method.

The lingzhi mushroom ethanolic extract demonstrates cytotoxic effect on

T47D breast cancer cells with IC50 value is 284.098 µg / mL, can induce apoptosis

by 97.8 ± 0.13% and necrosis by 0.27 ± 0.01, but has not been able to suppress

ER-α expression, therefore ER-α is still expressed at 97-98% with ER-α

expression level at level 4+.

Keywords: Breast cancer, ER-α, Ganoderma lucidum, T47D cells.


1

1. PENDAHULUAN

Prevalensi penyakit kanker di Indonesia semakin meningkat. Berdasarkan

data Riset Kesehatan Dasar (RISKESDAS) tahun 2013, prevalensi kanker di

Indonesia adalah 1,4 per 1.000 penduduk atau sekitar 347.792 orang. Tahun 2018

data RISKESDAS menunjukkan kenaikan angka prevalensi kanker menjadi 1,8

per 1.000 penduduk atau sekitar 447.000 orang (Kemenkes RI, 2018). Menurut

data WHO tahun 2018, kanker payudara merupakan jenis kanker dengan tingkat

insidensi tertinggi di Indonesia sebesar 58.256 kasus dengan angka kematian

sebesar 22.692 orang dan diprediksi pada tahun 2040 akan meningkat menjadi

89.512 kasus (Globocan, 2018).

Jalur pengobatan kanker payudara cukup beragam dengan mekanisme

terjadinya yang cukup kompleks, hal ini menimbulkan banyak efek samping.

Salah satu obat yang sering digunakan adalah tamoxifen dan raloxifene.

Raloxifene hanya disetujui untuk digunakan oleh wanita setelah menopause

sedangkan tamoxifen dapat dipakai baik pada wanita premenopause dan

postmenopause. Tamoxifen memiliki efek samping seperti kelelahan, terbakar,

kanker uterus dan penggumpalan darah (American Cancer Society, 2013).

Oleh karena itu, diperlukan adanya penelitian untuk menemukan suatu senyawa

yang memiliki target aksi lebih spesifik pada sel kanker payudara untuk

meminimalkan efek samping.

Jamur lingzhi (Ganoderma lucidum) dipilih karena telah diteliti

mempunyai khasiat antikanker. Menurut Boh, Berovic, Zhang, Zhi-bin (2007) dan

Zhou et al. (2007) dalam Kao et al. (2013), senyawa aktif utama dalam jamur

lingzhi adalah senyawa golongan triterpen dan polisakarida. Penelitian ini

menunjukkan bahwa senyawa triterpen dan polisakarida dari ekstrak jamur lingzhi

(Ganoderma lucidum) secara langsung menginduksi apoptosis berbagai jenis sel

kanker pada manusia termasuk sel kanker payudara melalui berbagai mekanisme

aksi yaitu menstimulus Cytotoxic T-lymphocytes (CTL), Extracellular matrix

(ECM), menstimulus Natural Killer Cells (NK), Tumor Necrosis Factor (TNF),

menstimulus produksi Interleukin (IL), menghambat Matrix Metalloproteinase-9


2

(MMP-9), menghambat aktivasi Protein Kinase C (PKC), menghambat Reactie

Oxygen Species (ROS) melalui aktivitas enzimatik dengan peningkatan anti-

oksidasi, dan menghambat Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF).

Senyawa triterpen yang banyak terdapat dalam jamur lingzhi adalah Ganoderic

acid T, Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F (Chen et al., 2010; Yue et al.,

2008; Chang et al., 2006). Ketiga senyawa ini merupakan derivat dari senyawa

lanosterol yang memiliki kemiripan struktur dengan 17-β-estradiol yang

merupakan hormon estrogen alami pada perempuan. Adanya kemiripan struktur

ini diharapkan membuat senyawa triterpen pada jamur lingzhi mampu berikatan

dengan reseptor estrogen alfa (RE-α) pada sel kanker dan menjadi kompetitor

estrogen. Pasien kanker payudara responsif estrogen harus positif merespon

pengobatan dengan antagonis reseptor estrogen alfa (RE-α) dan / atau agonis RE-

β. Pada kasus kanker payudara, ekspresi berlebih RE-α oleh 17-β estradiol

(estrogen alami) menyebabkan peningkatan proliferasi sel yang abnormal dan

memicu terjadinya kanker, karena itu kanker payudara memiliki karakter ekspresi

berlebih reseptor estrogen alfa (RE- α) (Paterni et al., 2014). Oleh karena itu,

perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk membuktikan aktivitas antikanker

ekstrak jamur lingzhi pada sel kanker payudara melalui ekspresi reseptor estrogen

alfa (RE-α).

Penelitian ini didesain untuk mengetahui efek ekstrak etanol jamur

lingzhi terkait kemampuan sitotoksik, induksi apoptosis dan pengaruh pada

ekspresi RE-α sel kanker payudara T47D. Sel kanker payudara yang digunakan

adalah sel kanker T47D yang mampu mengekspresikan RE-α (Holliday dan

Speirs, 2011). Kemampuan senyawa dalam menginduksi apoptosis diuji

menggunakan metode double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-EB).

Jalur kematian apoptosis dipilih karena tidak membawa pengaruh pada sel

sekitarnya dan memberikan terapi yang lebih selektif. Pengamatan molekuler sel

dalam menekan ekspresi RE-α dilakukan dengan metode semi-kuantitatif melalui

imunositokimia. Tamoxifen dapat digunakan sebagai obat pembanding dalam

penelitian ini karena obat ini tergolong dalam terapi hormonal yang telah terbukti

mampu menghambat ikatan antara estrogen dengan RE-α.


3

2. METODE

2.1.Bahan penelitian

Senyawa uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak etanolik

jamur lingzhi. Sel yang digunakan dalam pengujian ini adalah sel kanker payudara

T47D yang didapat dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran

Universitas Gadjah Mada. Bahan kimia yang digunakan adalah etanol 90%,

metanol pro-analis (Merck), FBS (Fetal Bovine Serum) 10%, FBS 0.5%, Media

Kultur Medium RPMI (Rosewell Park Memorial Institute) 1640 (Gibco), media

kultur medium 199 (Gibco), Tripsin EDTA 0.25%, PBS (Phosphat Buffer Saline),

Fungison (Gibco), Penisilin Streptomisin 1% v/v (Gibco), aqua bidestilata, etanol

96%, natrium bikarbonat, HEPES (N-2-Hidroxy Ethyl Piperazine-N-Ethane

SulfonicAcid) (Sigma Chem), SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) 10% dalam HCl

0.01 N, DMSO (Merck) 0.5%, biru tripan, eter, etanol (CV. Labora), akuades,

Nolvadex 20 mg (tablet tamoxifen), metanol 70%, reagen MTT 5 mg/mL,

primary monoclonal antibody antiER-α (Thermo Fisher Scientific), biotinylated

universal secondary antibody (Biocare), Mayer Hematoxylin (Dako), xylol,

substrat DAB.

2.2.Alat penelitian

Alat penelitian yang digunakan adalah Treated tissue culture dish diameter

10 cm (Iwaki), 96 well-plate (Nunc), 24 well-plate (Nunc), 6 well-plate (Nunc),

cover slip (Nunc), sentrifuge tube, object-glass, conical tube (Iwaki), eppendorfTM

tube, inkubator CO2 (Heraeus), Laminar air flow/LAF cabinet (Labconco),

mikropipet, yellow-tip, blue-tip, pinset, autoklaf (Hirayama), hemositometer

(Neubauer), ELISA reader (Zeiss MC 80), kamera DSLR Canon EOS 500D,

mikroskop cahaya, rotary evaporator (IKA), mikroskop inverted, neraca digital.

2.3.Tata cara penelitian

2.3.1. Pengumpulan tanaman & determinasi tanaman

Tanaman jamur lingzhi dibeli dari Dipokusumo Farm (Rasmala A4,

Semarang Kota, Jawa Tengah) yang dipanen pada bulan Juni 2015. Jamur lingzhi


4

yang telah diperoleh dari Dipokusumo Farm dideterminasi/diidentifikasi di

Laboratorium Sistematika Tumbuhan Fakultas Biologi UGM.

2.3.2. Pembuatan serbuk jamur lingzhi kering

Jamur lingzhi dipisahkan dari akarnya serta pengotor lain seperti tanah

yang menempel. Pencucian jamur lingzhi dilakukan dengan menggunakan air

mengalir sebanyak tiga kali, pencucian dilakukan dengan hati–hati supaya jamur

lingzhi tetap dalam kondisi utuh. Jamur lingzhi yang telah dicuci bersih

dikeringkan pada suhu 30 – 50oC selama 14 hari. Jamur yang telah kering digiling

dan diayak dengan ayakan nomor mesh 12 & 14 sehingga diperoleh serbuk halus

simplisia.

2.3.3. Pembuatan ekstrak etanolik jamur lingzhi

Serbuk simplisia jamur lingzhi sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam

labu alas bulat (LAB) 500 mL. Direfluks selama 2 jam dengan 350 mL etanol

90%. LAB didiamkan sebentar agar serbuk mengendap, lalu difiltrasi. Serbuk

yang tersaring diekstraksi lagi dengan cara yang sama sampai didapatkan filtrat

jernih. Semua filtrat digabungkan lalu dipekatkan dengan rotary evaporator.

Filtrat diambil dan diuapkan pada suhu 80oC. Setiap 10 menit filtrat dalam cawan

porselen ditimbang sampai didapatkan bobot tetap. Diperoleh residu berwarna

cokelat gelap.

2.3.4. Pembuatan larutan uji

Ekstrak total jamur lingzhi (sampel) sebanyak 10 mg dilarutkan ke dalam

100 μL DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan stok sampel sebesar

100.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat 7 seri kadar pengenceran yaitu 5 μg/mL, 10

μg/mL, 20 μg/mL, 40 μg/mL, 80 μg/mL, 160 μg/mL, dan 320 μg/mL.

Larutan kontrol positif (tamoxifen) dibuat dari 20 tablet Nolvadex yang

tiap tabletnya mengandung 20 mg tamoxifen, ditimbang kemudian digerus hingga

homogen. Sebanyak 10 mg dilarutkan ke dalam DMSO 100 μL, didapatkan

larutan stok kontrol dengan konsentrasi 100.000 μg/mL. Selanjutnya dibuat 7 seri

kadar pengenceran yaitu 0,185 μg/mL (0,5 μM); 0,371 μg/mL (1 μM); 0,743


5

μg/mL (2 μM); 1,486 μg/mL (4 μM); 2,972 μg/mL (8 μM); 5,944 μg/mL (16 μM);

11,888 μg/mL (32 μM).

2.3.5. Uji sitotoksik ekstrak etanolik jamur lingzhi pada sel T47D

2.3.5.1.Perlakuan sel T47D

Sel T47D yang telah diinkubasi selama 24 jam dikeluarkan dari inkubator

dan dipindahkan menuju LAF (Laminar Air Flow), seluruh kegiatan uji sitotoksik

dilakukan di dalam LAF yang sebelumnya telah diberi penyinaran UV (Ultra

Violet). Selanjutnya, seluruh media di dalam well-plate dibuang dan ditiriskan,

lalu segera dipipet 100 μL sampel dari setiap seri kadar dan dimasukkan ke dalam

lubang well-plate, dilakukan replikasi sebanyak tiga kali. Di dalam satu well-plate

yang berisi 96 lubang diisi oleh sampel, kontrol sel, kontrol positif (tamoxifen).

Selanjutnya, sel diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator dan setelah inkubasi

dilakukan pengamatan pada sel yang telah diberi perlakuan sampel di bawah

mikroskop inverter, tidak semua lubang diamati, hanya diambil beberapa lubang

yaitu pada konsentrasi tertinggi, tengah dan terendah, bentuk sel diamati dan

diambil gambar dengan menggunakan kamera DSLR Canon EOS 500D.

2.3.5.2.Metode MTT

Seluruh reagen MTT dipersiapkan dengan cara mencampur 1 mL MTT

dengan 10 mL media komplit (MK) ke dalam conical tube. Media komplit adalah

media yang mengandung faktor pertumbuhan seperti Fetal Bovine Serum (FBS)

dan juga Penisilin-Streptomisin sebagai antibiotik. Selanjutnya, media yang

terdapat pada sel T47D dibuang dengan membalikan plate 180o di atas tempat

pembuangan dengan jarak 10 cm kemudian tekan plate secara perlahan di atas tisu

untuk meniriskan sisa cairan. Larutan PBS dimasukkan sebanyak 100 μL ke

dalam semua sumuran yang telah berisi sel untuk mencuci sisa media yang masih

bercampur dengan sel, kemudian buang PBS dengan cara membalik plate seperti

perlakuan di atas. Ditambahkan reagen MTT yang telah dipersiapkan sebelumnya

sebanyak 100 μL ke setiap sumuran, termasuk kontrol media, dilakukan inkubasi

selama empat jam di dalam inkubator CO2. Setelah itu, diamati kondisi sel dan

kristal formazan yang terbentuk di bawah mikroskop inverted, jika formasan telah


6

terbentuk, ditambahkan 100 μL SDS 10% dalam 0,1N HCl. Plate dibungkus

menggunakan alumunium foil dan diinkubasi pada tempat gelap selama semalam

pada suhu kamar (ATCC, 2011).

2.3.5.3.Pembacaan IC50

Absorbansi ditiap sumuran dibaca dengan ELISA reader pada λ= 595 nm.

Data yang diperoleh diolah dengan membuat grafik polynomial antara konsentrasi

versus log %viabilitas menggunakan program Microsoft Excel 2010. Persamaan

polynomial dari grafik konsentrasi versus log %viabilitas digunakan untuk

menghitung IC50. Persentase sel yang hidup (%viabilitas) dihitung dengan rumus:

(Doyle dan Griffiths, 2000).

2.3.6. Uji apoptosis double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-

EB)

2.3.6.1.Perlakuan sel

Sel T47D yang sudah 80% konfluen diambil dari inkubator CO2 dan

dipanen. Coverslip dimasukkan ke dalam 24 well-plate menggunakan pinset

dengan hati-hati. Tiap sumuran diisi dengan 1 mL suspensi sel T47D ( dengan

populasi 500.000 – 1.000.000 sel/mL), dan diinkubasi selama 24 jam di dalam

inkubator CO2. Selanjutnya, plate sel yang telah diinkubasi diambil dan

dimasukkan dalam LAF, seluruh media dalam sumuran disedot menggunakan

mikropipet dan dibuang. Selanjutnya dicuci PBS satu kali (1 mL). PBS disedot

kembali menggunakan micropipet dan dibuang. Sebanyak 1 mL sampel pada

konsentrasi IC50 dimasukkan dalam well-plate dan diinkubasi selama 24 jam.

2.3.6.2.Perlakuan double staining AO-EB

Well-plate yang telah diinkubasi dengan sampel diambil dari inkubator.

Media kultur dari tiap sumuran disedot menggunakan micropipet dan dibuang. Sel

pada well-plate dicuci menggunakan PBS sebanyak 1 mL. Kemudian, PBS ditarik

kembali menggunakan mikropipet dan dibuang. Coverslip diambil menggunakan


7

pinset dan diletakkan di atas object glass. Sebanyak 10 µL reagen campuran

akridin oranye–etidium bromida (AO-EB) diteteskan di atas coverslip dan diamati

menggunakan mikroskop fluoresen. Hasil didokumentasikan dengan kamera

DSLR Canon EOS 500D.

Pembacaan dan perhitungan sel yang mengalami apoptosis, nekrosis, dan

sel hidup dilakukan oleh 3 orang responden (blind reader). Setiap responden

menghitung jumlah sel yang mengekspresikan apoptosis, nekrosis dan sel hidup di

setiap sampel. Setiap sampel dihitung dalam 3 lapang pandang yang berbeda.

Data persentase apoptosis, nekrosis dari setiap sampel selanjutnya diuji statistik

dengan uji Shapiro Wilk untuk mengetahui normalitas distribusi data tiap

kelompok percobaan. Data yang terdistribusi normal selanjutnya diuji

menggunakan uji F dan uji T menggunakan program Microsoft Excel 2010. Data

yang tidak terdistribusi normal di uji menggunakan uji non-parametrik Kruskal-

Wallis, dan dilanjutkan dengan uji Man-Whitney. Analisis statistik data persentase

apoptosis dan nekrosis bertujuan untuk melihat adanya perbedaan yang bermakna

dari tingkat inisiasi apoptosis dan nekrosis antara kelompok perlakuan (tamoxifen

dan ekstrak jamur lingzhi).

2.3.7. Uji imunositokimia

2.3.7.1.Perhitungan sel

Sel yang berada di dalam cawan petri diberi MK hingga memenuhi

permukaan cawan. MK diambil dan di masukkan dalam conical tube. Cairan sel

diambil sedikit dan dituang di atas kaca preparat untuk menghitung jumLah sel.

Kaca preparat diletakan di atas Haemositometer (alat penghitung sel), kemudian

diamati di atas mikroskop inverter perbesaran 10 kali dan dilakukan penghitungan

dengan bantuan counter. Sel sudah sesuai dengan kriteria apabila jumlahnya

antara 50.000-100.000 sel, jika hasil perhitungan sel sudah sesuai maka

dilanjutkan dengan preparasi sel tersebut. Di masukkan 5 mL MK ke dalam

conical tube yang baru dan ditambahkan 1,25 mL sel dari conical tube awal ke

dalam conical tube yang berisi 5 mL MK.


8

2.3.7.2.Subkultur sel & perlakuan imunositokimia

Cover slip dimasukkan ke dalam well plate sesuai dengan jumlah sampel

dan kontrol yang digunakan. Campuran MK dan sel yang ada di conical tube

dimasukkan pada 24 well-plate yang telah diisi coverslip sebanyak 1 mL. Inkubasi

dilakukan selama 24 jam di dalam inkubator CO2.

MK dibuang dan diisi dengan sampel sebanyak 1 mL. Kaca preparat

digunakan untuk meletakkan dua coverslip. Coverslip dipindahkan di atas kaca

preparat yang telah diberi label. Mula–mula dilakukan pencucian dengan PBS

sebanyak dua kali lalu dilakukan fiksasi metanol selama 10 menit. Selanjutnya,

dilakukan pencucian PBS dua kali dan akuades dua kali, lalu dibuat campuran

H2O2 : H2O (1:9). Sebanyak 100 mL campuran H2O2 : H2O diteteskan di atas

coverslip. Kemudian, preparat dicuci dengan PBS sebanyak dua kali. Larutan

blocking ditambahkan 100 mL. Antibodi primer ditambahkan sebanyak 50 mL

dan didiamkan selama satu jam, lalu dibuang. Antibodi sekunder universal

ditambahkan sebanyak 100 mL dan didiamkan selama 20 menit, kemudian

dibuang. Tamoxifen ditambahkan sebanyak 100 mL, didiamkan selama 10 menit

kemudian dibuang. Proses pencucian PBS dilakukan sebanyak dua kali. Sebanyak

100 mL DAB ditambahkan dan didiamkan selama 2 menit. Akuades ditambahkan

untuk mencuci sebanyak dua kali. Perwarna hematoxilin ditambahkan sebanyak

100 mL dan didiamkan selama 5 menit, kembali dicuci akuades dua kali hingga

bersih dan warna biru dari pewarna hilang. Etanol absolut ditambahkan sampai

menggenangi preparat dan langsung dibuang kemudian digenangi xylol dan

kembali langsung dibuang. Coverslip yang ada di atas preparat dikeringkan

selama beberapa menit. Setelah kering, coverslip ditempel di atas object glass

dengan cara memberikan setetes etilen dan diratakan di atas coverslip.

Pengamatan kualitatif dilakukan dengan mengamati warna sel di bawah

mikroskop cahaya. Sel yang berwarna cokelat pada sitoplasma dan/atau pada

nukleus merupakan sel yang mengekpresikan RE-α, sedangkan yang berwarna

biru/ungu tidak mengekspresikan RE-α. Pengamatan semikuantitatif dilakukan

dengan metode scoring system. Preparat diamati pada perbesaran 400x oleh 3

orang responden (blind reader). Setiap responden menghitung jumlah sel yang


9

mengekspresikan RE-α di setiap preparat. Setiap preparat dihitung dalam 3 lapang

pandang yang berbeda. Scoring system mengikuti Vang et al. (2006) dalam

Panjalu (2015). Persentase ekspresi RE-α (%ekspresi RE-α) dihitung dengan

persamaan:

% E-α= jumlah sel berwarna cokelat

total jumlah sel satu lapang pandang x 100%

Level ekspresi RE-α ditentukan berdasarkan skala persentase ekspresi E-

α yaitu: ≤ 5% (0); 6% – 25% (1+); 26% – 50% (2+); 51% – 75% (3+); 76% –

100% (4+). Data %ekspresi RE-α yang diperoleh selanjutnya dianalisis secara

statistik dengan uji Shapiro Wilk untuk mengetahui normalitas distribusi data tiap

kelompok percobaan. Data yang terdistribusi normal selanjutnya diuji

menggunakan uji F dan uji T menggunakan program Microsoft Excel 2010. Data

yang tidak terdistribusi normal di uji menggunakan uji non-parametrik Kruskal-

Wallis, dan dilanjutkan dengan uji Man-Whitney. Analisis statistik bertujuan

untuk melihat adanya perbedaan yang bermakna dari penekanan ekspresi RE-α

antara kelompok perlakuan (tamoxifen dan ekstrak etanolik jamur lingzhi).

3. HASIL & PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh ekstrak etanolik

jamur lingzhi (Ganoderma lucidum (Ley. ex Fr.) Kar.) pada sel kanker payudara

T47D: kajian aktivitas sitotoksik, induksi apoptosis dan ekspresi reseptor estrogen

alfa (RE-α).dengan nilai IC50 ekstrak etanolik jamur lingzhi. IC50 merupakan

konsentrasi yang dapat membunuh 50% populasi sel. Aktivitas sitotoksik ekstrak

etanolik jamur lingzhi dikuantifikasi melalui uji MTT. Kemampuan ekstrak

etanolik jamur lingzhi dalam menginduksi apoptosis dievaluasi secara

semikuantitatif melalui uji double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-

EB). Pengujian imunositokimia dilakukan untuk mengidentifikasi regulasi

ekspresi reseptor estrogen alfa (RE-α). Level ekspresi RE-α ditetapkan secara

semikuantitatif dengan metode Scoring system. Tamoxifen digunakan sebagai

kontrol positif karena banyak digunakan sebagai terapi hormonal kanker payudara

yang spesifik untuk reseptor estrogen alfa (RE-α).


10

Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman

yang digunakan. Determinasi dilakukan di Laboratorium Sistematika Tumbuhan

Fakultas Biologi Universitas Gajah Mada. Hasil determinasi menunjukkan

identitas tanaman adalah jamur lingzhi dengan spesies Ganoderma lucidum (Ley.

ex Fr.) Kar. dan tergolong ke dalam keluarga Polyporaceae, genus Ganoderma

(Lampiran 1).

Metode ekstraksi yang digunakan mengacu pada paper Gao et al. (2011)

yaitu menggunakan metode refluks. Metode ini cocok digunakan untuk

mengekstraksi serbuk simplisia jamur lingzhi yang memiliki tekstur yang keras

seperti kayu. Pemanasan selama refluks akan mendorong dan memudahkan

substansi yang diinginkan untuk keluar dari matriks. Selama proses refluks

digunakan pelarut etanol 90% yang dapat melarutkan substansi yang diinginkan

yaitu senyawa golongan triterpen dalam jamur lingzhi (Ganoderic acid T,

Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F) (Gambar 1). Penggunaan etanol 90% tidak

akan merusak struktur senyawa karena memiliki titik didih lebih rendah dari titik

didih ketiga senyawa tersebut, hal ini juga memudahkan dalam pemisahan pelarut

etanol 90% dari ekstrak jamur lingzhi. Pemisahan dilakukan dengan penguapan

pada suhu 80oC dengan menimbang massa filtrat setiap 10 menit sampai

didapatkan massa yang tetap.

Ganoderic acid T, Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F merupakan

derivat dari senyawa lanosterol. Lanosterol merupakan senyawa golongan

triterpenoid tetrasiklik dihasilkan pada hewan dan fungi yang terbuat dari lemak

sterol. Ganoderic acid T, Ganoderic acid D, dan Ganoderiol F memiliki

kemiripan struktur dengan 17-β-estradiol sehingga ketiga senyawa ini diharapkan

juga memiliki kemiripan ligand binding sehingga dapat menjadi inhibitor

kompetitif 17-β-estradiol seperti tamoxifen, akibatnya pembelahan sel

(proliferasi) yang disebabkan oleh ikatan estrogen-reseptor estrogen (E2-RE)

dapat ditekan.


11

(A) (B)

(C) (D)

Gambar 1. Struktur molekul: (A) Ganoderic acid T. (B) Ganoderic acid D. (C) Ganoderiol F.

(D) 17-β-estradiol (Pubchem, 2015).

3.1.Uji sitotoksik (MTT)

Penelitian ini menggunakan sel kanker payudara T47D karena penelitian

sebelumnya menggunakan sel kanker payudara MCF-7. Adapun perbedaan antara

sel kanker payudara T47D & MCF-7 yaitu pada ekspresi protein mRNA dimana

analisis proteomik menunjukkan perbedaan protein 17β-hydroxysteroid

dehydrogenase (17 β-HSD) tipe 1 dan 12 dan reseptor androgen (RA)

diekspresikan dengan jumlah yang besar pada sel T47D dibanding MCF7. Sel

T47D memiliki bentuk elips yang dapat diamati di bawah mikroskop. Seiring

dengan peningkatan konsentrasi ekstrak etanolik jamur lingzhi dan tamoxifen,

kerapatan pertumbuhan sel T47D semakin menurun dan morfologi sel mengalami

perubahan. Sel mati akan berbentuk bulat, sedangkan sel hidup akan berbentuk

elips memanjang (Gambar 2).


12

Gambar 3. Proses perubahan MTT menjadi kristal

formazan (Terry et al., 2013)

Pengujian sitotoksik dilakukan dengan metode kolorimetrik yaitu metode

MTT. Metode ini didasarkan pada perubahan garam tetrazolium [3-94,5-

dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromide] / MTT menjadi kristal

formazan di dalam mitokondria sel hidup yang tidak dapat larut (Gambar 3).

Pada sel mati kristal formazan tidak akan terbentuk (Gambar 4). Pengujian

sitotoksik bertujuan untuk mengetahui tingkat ketoksikan ekstrak etanolik jamur

lingzhi terhadap sel kanker payudara T47D berdasarkan hubungan antara

parameter konsentrasi dengan penurunan %viabilitas sel. Kristal formasan akan

larut ketika diberikan SDS sehingga absorbansi dapat dibaca dan dihasilkan grafik

yang digunakan untuk menghitung IC50. %viabilitas sel merupakan persentase sel

hidup.

(A) (B)

Gambar 2. Morfologi sel T47D. (A). Kontrol sel T47D. (B). Tamoxifen 20µM

Keterangan: Sel T47D hidup

Sel T47D mati


13

(A) (B)

Gambar 4. Kristal formazan. (A). Kristal formazan pada kontrol sel. (B). Kristal formazan pada

perlakuan ekstrak lingzhi 300µg/mL Keterangan: Sel mati tidak menghasilkan kristal formazan

Sel hidup menghasilkan kristal formazan

Metode ini memiliki kelebihan yaitu tidak bersifat radioaktif, bisa

digunakan untuk berbagai jenis sel, dan analisis yang lengkap juga banyak dengan

metode scanning spektrofotometer. Kekurangan metode ini adalah kurang sesuai

untuk banyak jenis sel, beberapa sel yang tidak berproliferasi dapat

memetabolisme MTT dan memberikan hasil yang salah, selain itu jika sel

terkontaminasi oleh mikroplasma juga dapat memberikan hasil yang salah

(Talupula, 2011). Atas dasar prinsip, kekurangan, dan kelebihannya metode ini

Tabel I. Data Uji Sitotoksik dengan Metode MTT

Sampel C (µg/mL) % Viabilitas % Viabilitas ± SD Log % Viabilitas

Tamoxifen

0,185 98,458 98,458 ± 1,736 1,993

0,371 111,024 111,024 ± 5,986 2,045

0,743 110,925 110,925 ± 5,083 2,045

1,486 122,310 122,310 ± 6,959 2,087

2,972 121,686 121,686 ± 5,188 2,085

5,944 107,218 107,218 ± 5891 2,030

11,888 20,538 20,538 ± 1,069 1,313

Lingzhi

5 103,937 103,937 ± 1,834 2,017

10 109,318 109,318 ± 5,078 2,039

20 107,579 107,579 ± 4,424 2,032

40 108,825 108,825 ± 3,688 2,037

80 103,707 103,707 ± 5,915 2,016

160 86,516 86,516 ± 7,799 1,937

320 43,930 43,930 ± 1,997 1,643

% Viabilitas = Mean % viabilitas dari 6 replikasi


14

sesuai untuk digunakan dalam analisis viabilitas sel kanker T47D yang diberi

ekstrak etanolik jamur lingzhi.

Data pengujian sitotoksik tersaji dalam Tabel I. Berdasarkan data tersebut,

terlihat penurunan %viabilitas seiring dengan bertambahnya konsentrasi ekstrak

etanolik jamur lingzhi, hal yang serupa juga terjadi pada sel T47D yang diberi

perlakuan tamoxifen. Grafik polynomial orde 3 dari konsentrasi vs logaritma

%viabilitas sel T47D digunakan untuk menghitung IC50 karena dapat

menggambarkan perubahan sekecil apapun dari aktivitas proliferasi sel kanker

T47D oleh ekstrak etanolik jamur lingzhi dan tamoxifen (Gambar 5).

A.

B.

Gambar 5. Grafik polynomial konsentrasi vs log %viabilitas sel kanker T47D. (A) Ekstrak

etanolik jamur lingzhi. (B) Tamoxifen

y = 4E-09x3 - 6E-06x2 + 0.0002x + 2.0347 R² = 0.9997

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 50 100 150 200 250 300 350

C vs log%Via Ling-Zhi Poly. (C vs log%Via Ling-Zhi)

y = -0.0003x3 - 0.0041x2 + 0.0359x + 2.0306 R² = 0.9993

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 2 4 6 8 10 12 14

C vs log %Via Tamoxifen Poly. (C vs log %Via Tamoxifen)


15

Tujuan dari penentuan IC50 adalah untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak

etanolik jamur lingzhi yang dapat mematikan setengah dari populasi sel yang ada.

Penentuan IC50 menggunakan program Microsoft Excel 2010, didapatkan hasil

IC50 dari ekstrak etanolik jamur lingzhi sebesar 284,098 g/mL sedangkan untuk

tamoxifen sebesar 9,856 µg/mL (26,530µM). Pusat data Massachusetts General

Hospital Cancer Center tahun 2019 menulis bahwa IC50 Tamoxifen pada sel

kanker payudara T47D adalah < 2μM (Massachusetts General Hospital Cancer

Center, 2019). Nilai IC50 tamoxifen dalam penelitian ini tidak sesuai dengan

standar nilai IC50 tersebut. Hasil penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh

Bruning et al. (2010) juga Kim dan Ma (2010) dengan nilai IC50 tamoxifen

sebesar 16,150μM dan 13μM juga menunjukkan nilai IC50 lebih besar dari nilai

standar IC50 pada sel kanker payudara T47D.

Kemampuan sitotoksik ekstrak etanolik jamur lingzhi jauh lebih kecil

dibanding tamoxifen, hal ini terlihat dari perbedaan nilai IC50 yang sangat besar.

Suatu ekstrak memiliki kemampuan sitotoksik yang baik menurut American

National Cancer Institute (NIH) yaitu jika IC50 < 30 µg/mL (Sudha et al., 2012).

Nilai IC50 ekstrak etanolik jamur lingzhi > 30 µg/mL, sehingga dapat dikatakan

bahwa kemampuan sitotoksik jamur lingzhi tergolong kurang baik. Ekstrak

etanolik jamur lingzhi berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker karena

menurut Machana (2011) suatu ekstrak dikatakan tidak aktif sebagai antikanker

apabila nilai IC50 > 500 µg/mL. Nilai IC50 yang besar disebabkan oleh kandungan

senyawa dalam jamur lingzhi sangat kompleks, akibatnya antar senyawa dapat

bersifat antagonis, namun hal ini masih perlu dibuktikan (Kao et al., 2013).

Senyawa yang memiliki aktivitas antikanker memiliki persentase yang kecil

dalam ekstrak etanolik jamur lingzhi sehingga isolasi senyawa terpenoid dan

polisakarida dari jamur lingzih dapat dilakukan untuk lebih meningkatkan

aktivitas antikanker dari jamur lingzhi. Penelitian sebelumnya yang dilakukan

oleh Wu et al. (2012) dengan sel yang berbeda menunjukkan nilai IC50 komponen

etanol dan komponen asam dari jamur lingzhi yaitu sebesar 100 µg/mL pada sel

kanker MCF-7 dan 60 µg/mL pada sel kanker MDA-MB-231.


16

3.2.Uji apoptosis double staining akridin oranye–etidium bromida (AO-EB)

Apoptosis adalah jenis kematian sel terprogram yang diatur secara

genetika yang mengontrol perkembangan organisme dan jaringan multisel dengan

menghilangkan sel-sel yang berlebihan secara fisiologis, rusak secara fisik, dan

abnormal. Apoptosis ditandai dengan adanya perubahan morfologi, termasuk

penyusutan sel, membran blebbing, kondensasi kromatin, fragmentasi DNA, dan

pembentukan badan apoptosis. Kemanjuran obat antikanker diukur dari

kemampuannya untuk mendeteksi sel kanker dan secara selektif mendorong

apoptosis, hal ini dikarenakan pada nekrosis terjadi kematian sel yang tidak

terkontrol. Sel yang mati dapat membesar dan kemudian pecah atau lisis pada satu

daerah yang mengakibatkan respon inflamasi pada nekrosis sangat tinggi

dibandingkan apoptosis (Liu et. al, 2015).

Apoptosis dapat dideteksi dengan metode pengecatan akridin oranye–

etidium bromida (AO-EB). Metode ini didasarkan pada perbedaan fluorosensi

DNA sel yang hidup dan mati karena pengikatan akridin oranye–etidium bromida.

Akridin oranye akan menembus seluruh bagian sel menyebabkan nukleus akan

tampak berwarna hijau. Sedangkan etidium bromida hanya dapat berinterkalasi

dengan sel yang membrannya sudah rusak menyebabkan nukleus akan berwarna

merah. Pada sel mati warna yang ditimbulkan oleh etidium bromida lebih

dominan jika dibandingkan dengan akridin oranye sehingga nukleus pada sel mati

akan berwarna oranye. Sel hidup dengan membran yang masih utuh memiliki

nukleus dengan warna hijau yang seragam. Etidium bromida dapat masuk ke

dalam sel ketika sel mengalami proses apoptosis dan membran blebbing mulai

terjadi, sehingga memberikan warna oranye. Akridin oranye mengandung kation

sehingga dapat berinteraksi dengan DNA sel hidup yang bersifat anionik

membentuk garam terdisosiasi dan dapat memasuki sel dan mewarnai inti sel

menjadi hijau. Etidium bromida hanya dapat memasuki sel yang mengalami

kerusakan membran dan mewarnai inti sel menjadi merah. Etidium bromida

mengikat dengan cara menyisip di antara ikatan basa pada untai ganda DNA.

Struktur cincin etidium bromida adalah hidrofobik dan mirip dengan struktur

cincin DNA. Etidium bromida dapat membentuk ikatan van der Walls dengan


17

pasangan basa, hal ini menyebabkan etidium mengikat pada daerah hidrofobik

molekul DNA. Etidium bromida merusak pilin ganda (double helix) dan

menghambat replikasi DNA transkripsi, perbaikan DNA, dan rekombinasi.

Etidium bromida juga lebih mendominasi warna yang dihasilkan akridin oranye.

Pewarnaan dengan metode double staining menggunakan akridin oranye dan

etidium bromida dapat membedakan sel yang hidup, sel apoptosis dan sel

nekrosis. Sel hidup akan tampak memiliki inti sel dengan bentuk normal dan

berwarna hijau. Sel yang mengalami apoptosis akan memiliki inti sel berwarna

oranye dengan bentuk terkondensasi atau terfragmentasi. Sel yang mengalami

nekrosis akan tampak berwarna oranye kemerahan yang seragam. Metode double

staining akridin oranye–etidium bromida digunakan karena metode ini ekonomis,

mudah, dan sudah mampu untuk mendeteksi apoptosis serta nekrosis dalam sel

kanker selain itu metode ini dapat memberikan gambaran visual dari sel kanker

yang mengalami early apoptosis, late apoptosis, dan nekrosis (Liu et al., 2015).

Berdasarkan hasil pengecatan pada Tabel II, terlihat bahwa kontrol sel

100 % hidup, hal ini menunjukkan proses preparasi sel berjalan baik sehingga

tidak ada sel yang mati karena stress atau pun karena kesalahan preparasi yang

bisa memberikan hasil yang bias. Sel kanker T47D dengan perlakuan tamoxifen

memiliki angka nekrosis lebih tinggi dibandingkan dengan lingzhi, sebaliknya

angka apoptosis lingzhi lebih tinggi dibandingkan dengan angka apoptosis

tamoxifen. Uji T dengan program Microsoft Excel 2010 dilakukan untuk melihat

perbedaan kemampuan menginduksi apoptosis antara kedua kelompok data

tersebut. Nilai T hitung yang didapatkan sebesar 62,629 > dari nilai t tabel yaitu

2,776 dan nilai p hitung sebesar 3,893 x 10-7

≤ 0,05, sehingga cukup meyakinkan

untuk mengatakan bahwa jumlah sel apoptosis antara lingzhi dan tamoxifen

berbeda sangat signifikan. Ekstrak etanolik jamur lingzhi dapat menginduksi

apoptosis lebih baik dari pada tamoxifen, sedangkan untuk nekrosis tidak ada

perbedaan yang signifikan antara sel kanker T47D yang mengalami nekrosis pada

perlakuan tamoxifen dengan perlakuan ekstrak etanolik jamur lingzhi (t hitung = -

5,684 < t table = 2,776).


18

Tabel II. Hasil Pengamatan Apoptosis Double Staining Akridin Oranye–Etidium

Bromida (AO-EB) dengan Perlakuan IC50 Ekstrak Etanolik Jamur Lingzhi,

Tamoxifen dan Kontrol Sel

Sample Jenis Kematian Sel

Apoptosis (% ± SD) Nekrosis (% ± SD) Hidup (% ± SD)

Lingzhi 97,37 ± 0,13 0,27 ± 0,01 1,93 ± 0,13

Tamoxifen 42,19 ± 1,52 3,88 ± 0,97 53,93 ± 0,56

Kontrol Sel 0 0 100

Nilai % ± SD jenis kematian sel = Rerata 3 lapang pandang dari 3 pengamat

Hasil pengamatan di bawah mikroskop fluoresen menunjukkan kontrol sel

berwarna hijau merata (Gambar 6A) karena membran sel T47D dalam keadaan

utuh sehingga hanya akridin oranye yang dapat masuk ke dalam sel. Peristiwa

apoptosis terdiri dari tahap early apoptosis, late apoptosis, dan fagositosis. Tahap

early apoptosis ditunjukkan dengan warna hijau terang pada inti sel, hal ini

disebabkan karena terjadinya kondensasi kromatin di inti sel dan sel mulai

mengkerut sehingga integritas dan permeabilitas membrane sel T47D menurun

menyebabkan etidium bromida masuk ke dalam inti sel seperti pada hasil double

staining tamoxifen dengan konsentrasi IC50 (Gambar 6B). Late apoptosis terjadi

karena membran blebbing dan terjadi fragmentasi DNA sel sehingga semakin

banyak etidium bromida yang masuk ke dalam inti sel menghasilkan warna

oranye pada inti sel yang dominan terjadi pada sel T47D dengan perlakuan

ekstrak etanolik jamur lingzhi (Gambar 6C). Sel yang mengalami nekrosis

ditandai dengan warna oranye kemerahan yang merata seperti yang terjadi pada

perlakuan tamoxifen (Gambar 6B).

Ekstrak etanolik jamur lingzhi dapat menginduksi kematian sel melalui

jalur apoptosis lebih baik dibanding tamoxifen, hal ini terjadi karena lingzhi

mengandung senyawa triterpen Ganoderic acid T, Ganoderic acid D, dan

Ganoderiol F, derivat dari senyawa lanosterol yang memiliki kemiripan struktur

dengan 17-β-estradiol yang merupakan hormon estrogen alami perempuan.

Penelitian telah menunjukkan bahwa triterpen menginduksi apoptosis sel kanker

melalui jalur yang bergantung pada mitokondria, diikuti oleh aktivasi caspase


19

cascade. Jalur apoptosis intrinsik, juga dikenal sebagai jalur apoptosis yang

bergantung pada mitokondria, melibatkan penurunan potensi mitokondria, diikuti

oleh pelepasan sitokrom c dari mitokondria. Pelepasan sitokrom c ke dalam

sitosol memicu caspase cascade untuk mengarahkan ke apoptosis. Caspase

cascade meliputi caspase 9 dan caspase 3, dan caspase 7 yang diekspresikan

tinggi pada sel kanker manusia yang diobati dengan triterpen lingzhi (Kao et al.,

2013).

(A) (B)

(C)

Gambar 6. Morfologi sel kanker T47D pada uji double staining AO-EB. (A) Kontrol sel. (B) IC50

tamoxifen sebesar 9,856µg/mL (26,530µM). (C) IC50 ekstrak etanolik jamur lingzhi sebesar

284,098 µg/mL. Keterangan: Sel hidup

Early apoptosis Late apoptosis

Nekrosis

3.3.Uji imunositokimia

Uji imunositokimia dilakukan untuk menentukan level ekspresi reseptor

estrogen alfa (RE-α) pada sel T47D setelah pemberian IC50 ekstrak etanolik jamur


20

lingzhi dan tamoxifen. Imunositokimia merupakan teknik untuk mendeteksi

protein atau antigen spesifik dalam sel dengan mendeteksi reaksi antigen antibodi

dengan bantuan penanda. Penelitian ini menggunakan antibodi primer estrogen

alfa yang akan berikatan dengan reseptor estrogen alfa (RE-α) pada sel kanker

payudara T47D sehingga sel tersebut dapat mengekspresikan estrogen dengan

memberikan warna cokelat ketika diberi pewarna DAB dari reagen

imunositokimia. Penelitian ini menggunakan metode imunositokimia indirect

(tidak langsung) dengan hasil lebih sensitif karena antibodi primer dikenali oleh

antibodi sekunder yang berikatan kovalen dengan marker (sebagai penanda)

sehingga lebih mudah terdeteksi. Kelebihan metode ini adalah morfologi sel dapat

diawetkan sehingga pola pewarnaan sel dapat diamati secara berkesinambungan

dan berbagai jenis antibodi dapat digunakan sebagai pendeteksi, akan tetapi

kekurangan dari metode ini adalah proses yang cukup lama dan rumit juga mahal

dan terbatas pada penilaian semi kuantitatif karena subjektif (Ivell et al., 2014).

Reseptor estrogen alfa (RE-α) dapat berikatan langsung dengan sekuens

spesifik DNA atau secara tidak langsung dengan mengikat faktor transkripsi

lainnya. Selain itu, RE-α dapat mengaktifkan beberapa jalur pensinyalan

(mitogen-activated protein kinase (MAPK), JAK/STAT, SRC atau

phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K)) (panah biru) (Gambar 8). Sejalan dengan

aktivasi epidermal growth factor receptor (EGFR) oleh epidermal growth factor

(EGF) atau dimediasi oleh RE-α mengaktifkan MAPK, yang pada gilirannya

dapat memfosforilasi dan mungkin mengaktifkan RE-α. Protein kinase A (PKA)

dan PAK memfosforilasi dan mengaktifkan RE-α (panah merah). cAMP terlibat

dalam aktivasi reseptor RE-α dan dapat diinduksi oleh reseptor membran seperti

GPR30. Selain itu, coactivator dapat berpartisipasi dalam aktivasi RE-α dengan

crosstalk dengan jalur pensinyalan lainnya seperti koaktivator dari coactivator-

related arginine methyltransferase-1 (CARM1) mengaktifkan RE-α melalui

pensinyalan cAMP, yang mengarah ke fosforilasi RE-α. Setelah terfosforilasi, E

dan CARM1 berinteraksi dan dapat mengikat DNA untuk mengatur gen target

(Tanos et al., 2012).


21

(A) (B)

(C) (D)

Gambar 7. Morfologi sel T47D pada uji imunositokimia RE-α yang terekspresikan di dalam nukleus

dan sitoplasma. (A) Kontrol sel T47D. (B) Kontrol sel T47D dengan antibodi. (C) IC50 ekstrak etanolik

jamur lingzhi sebesar 284,098 µg/mL. (D) IC50 tamoxifen sebesar 9,856 μg/mL (26,530 µM)

Keterangan: Mengekspresikan RE-α

Tidak mengekspresikan RE-α

Tabel III. Distribusi Ekpresi RE-α pada Sel T47D dengan Perlakuan Konsentrasi

IC50 Ekstrak Etanolik Jamur Lingzhi, Tamoxifen, Kontrol Sel dan Kontrol Sel

dengan Antibodi

Perlakuan % Ekspresi RE-α Level ekspresi

Kontrol Sel 0 0

Kontrol Sel dengan Antibodi 100 4+

Lingzhi 90,37 4+

Tamoxifen 16,26 1+

Skala distribusi pengecatan (% sel positif): 0: ≤ 5% ; 1+ : 6-25% ; 2+ : 26-50% ;

3+ : 51-75% ; 4+ : 76-100%.

% Ekspresi RE-α = Rerata % ekpresi RE-α 3 lapang pandang dari 3 pengamat.


22

Kontrol sel dengan antibodi memiliki sel dengan sitoplasma atau pun

nukleus berwarna cokelat (Gambar 7B). Warna cokelat pada sel terjadi karena

pewarna DAB yang bereaksi dengan H2O2 dari HRP, sehingga menimbulkan

warna cokelat, sedangkan HRP berikatan pada antibodi primer dan antibodi

sekunder yang aktif bekerja pada RE-α. Sel dengan pemberian ekstrak etanolik

jamur lingzhi memiliki warna cokelat di sitoplasma atau pun di nukleus sama

seperti kontrol sel dengan antibodi, hal ini berarti ekstrak etanolik jamur lingzhi

tidak menghambat ikatan antibodi primer (estrogen alfa) dengan RE-α pada sel

T47D, sehingga RE-α tetap diekspresikan. Sel dengan pemberian tamoxifen

didominasi warnah ungu/biru dengan warna cokelat hanya sedikit di sitoplasma

atau di nukleus sel. Distribusi ekspresi RE-α dapat diketahui dan dihitung

menggunakan metode scoring system. Metode ini memberikan gambaran terkait

level ekspresi RE-α dengan menghitung jumlah sel T47D yang mengekspresikan

RE-α dari tiga lapang pandang yang berbeda saat dilakukan pengamatan di bawah

mikroskop (Vang et al., 2006). Mekanisme perhitungan sel dilakukan dengan

blind reader oleh tiga orang pengamat independen untuk menghindari

subyektivitas. Proses perhitungan dibandingkan dengan kontrol sel dengan

antibodi dan tanpa antibodi sehingga perbedaan warna antara sel yang

mengekspresikan RE-α dengan yang tidak mengekspresikan dapat terlihat dengan

jelas.

Data distribusi ekspresi reseptor estrogen alfa (RE-α) menunjukkan

tamoxifen dapat menghambat ekspresi protein estrogen alfa yang dilihat dari

penurunan level ekspresi estrogen alfa sedangkan ekstrak etanolik jamur lingzhi

tidak menunjukkan adanya perubahan level ekspresi (Tabel III). Hasil yang sama

diperkuat oleh hasil uji T yang dilakukan dengan Microsoft Excel 2010, antara

kelompok perlakuan ekstrak etanolik jamur lingzhi dengan tamoxifen dimana

nilai t hitung (12,284) > dari nilai t kritis (2.776) dan nilai p (2,52 x 10-4) ≤ 0.05

sehingga cukup meyakinkan untuk mengatakan bahwa level ekspresi ekstrak

etanolik jamur lingzhi dengan tamoxifen pada sel kanker T47D berbeda

signifikan (Lampiran 3). Tamoxifen merupakan inhibitor kompetitif 17-β

estradiol / E2 untuk berikatan dengan RE-α sehingga dapat menghambat ekspresi


23

RE-α termasuk faktor angiogenik dan faktor pertumbuhan yang disekresikan oleh

sel kanker.

Gambar 9. Proses metabolisme tamoxifen menjadi 4-hydroxytamoxifen dan endoxifen oleh enzim

CYP2D6 dan CYP3A4/5 (Jordan, 2007).

Gambar 8. Jalur pensinyalan reseptor estrogen alfa

(RE-α) (Tanos et al., 2012)


24

Tamoxifen merupakan prodrug yang aktif setelah termetabolisme oleh

enzim CYP2D6 di dalam hati menjadi 4-hydroxytamoxifen (4-OHT). Tamoxifen

juga dapat dimetabolisme oleh enzim CYP3A4/5 menjadi N-desmethyltamoxifen

yang selanjutnya dimetabolisme oleh CYP2D6 menjadi 4-hydroxy-N-

desmethyltamoxifen (endoxifen). Metabolit 4-hydroxytamoxifen juga dapat

dimetabolisme oleh enzim CYP3A4/5 menjadi endoxifen. Kedua metabolit

tamoxifen ini (4-hydroxytamoxifen dan endoxifen) memiliki kemampuan afinitas

yang tinggi dengan reseptor estrogen alfa dan merupakan kompetitor E2 untuk

berikatan dengan ligand binding domain (LBD) (Gambar 9).

Gambar 10. (A) Pharmacophore-Molecular Docking dari 4-OHT dengan RE-α (kode PDB:

3ERT). Gugus hidrofobik, gugus kation, donor ikatan hidrogen dan akseptor ikatan hidrogen

ditunjukkan oleh warna kuning, biru, hijau dan merah. (B) Penggambaran 2D. Menggambarkan

gugus hidrofobik dengan interaksi hidrofobik dengan gugus ikatan dari residu (Muchtaridi et al.,

2017). (C) Pharmacophore-Molecular Docking dari 17-β Estradiol dengan RE-α. Ikatan hidrogen

berwarna kuning, atom oksigen dan nitrogen berwarna merah dan biru (Gonzales et al., 2019).

(C)

(A) (B)


25

Dua domain transkripsional, AF1 dan AF2, mengikat koaktivator pada

reseptor estrogen dan memulai transkripsi gen. Pengikatan E2 ke RE

menyebabkan aktivasi AF1 dan AF2, tetapi 4-OHT menghambat aktivitas AF2 di

LBD. Antiestrogen harus berikatan dengan rantai samping alkylaminoethoxy

untuk menutup aksi estrogen. Helix-12 dari RE (residu 536-544) memainkan

peran penting dalam menentukan aktivitas agonis atau antagonis sebuah ligand.

Ketika 4-OHT (antagonis) berikatan dengan LBD RE-α, helix-12 menutup jalur

pengenalan ko-aktivator menghasilkan aktivitas antagonis. Fenomena ini terjadi

karena tidak adanya ikatan hidrogen dengan His524 ketika 4-OHT terikat.

Sebaliknya, jika ikatan hidrogen terjadi antara His524 dan estradiol menghasilkan

respon agonis RE-α (Gambar 10).

Kandungan senyawa triterpenoid tetrasiklik pada jamur lingzhi (Gambar

1) yang diharapkan memiliki kemiripan ligand binding dengan 17-β-estradiol

karena kemiripan struktur, ternyata tidak dapat menghambat ekspresi reseptor

estrogen alfa (RE-α) berdasarkan hasil uji imunositokimia. Berdasarkan

pharmacophore RE-α (Gambar 10), diketahui bahwa gugus ikatan dari senyawa

triterpenoid tetrasiklik berada pada posisi yang jauh dari ligand binding RE-α

sehingga senyawa triterpenoid tetrasiklik jamur lingzhi tidak dapat berikatan

mengakibatkan ikatan hidrogen antara His524 dan estradiol tetap terjadi

menghasilkan respon agonis RE-α, tidak terjadi penekanan ekspresi reseptor

estrogen alfa.

Penelitian Jiang et al. (2006), menunjukkan reishimax mengandung

senyawa aktif biologis yang dapat menghambat proliferasi sel kanker MCF-7

disebabkan oleh penurunan ekspresi RE-α, penghambatan transaktivasi E yang

diinduksi estrogen, dan penghambatan aktivasi nuclear factor kappa (NF-κB)

yang distimulasi oleh TNF-α. Reishimax merupakan produk ekstrak Ganoderma

lucidum terstandar dari perusahaan Pharmanex. Perbedaan reishimax dengan

lingzhi yang digunakan dalam penelitian ini adalah reishimax diproduksi di Utah,

USA sedangkan jamur lingzhi dalam penelitian ini diperoleh dari Dipokusuma

Farm Semarang. Reishimax didapatkan melalui proses ekstraksi dengan metode

exclusive multi-step yang dapat meningkatkan hasil dan konsentrasi bahan aktif,


26

sedangkan esktrak etanolik lingzhi dalam penelitian ini diperoleh dari satu proses

ekstraksi dengan metode refluks menggunakan teknologi sederhana. Spora jamur

lingzhi merupakan sumber bahan aktif paling tinggi dan banyak mengandung

polisakarida dan triterpen, namun memiliki cangkang yang sangat keras dan

berlapis. Pharmanex menggunakan cracked-spore technology dalam proses

ekstraksi produk reishimax sehingga produk ini menjadi salah satu produk ekstrak

Ganoderma lucidum terstandar dengan kandungan bahan aktif tertinggi di dunia,

sedangkan teknologi ekstraksi yang digunakan dalam penelitian ini jauh lebih

sederhana dibanding teknologi cracked-spore technology yang digunakan oleh

Pharmanex, sehingga kemungkinan dalam penelitian ini bahan aktif yang

terkandung dalam spora jamur lingzhi tidak terekstraksi secara maksimal.

Perbedaan konsentrasi bahan aktif yang terkandung dalam reishimax dengan

ekstrak etanolik Ganoderma lucidum (Ley. ex Fr.) Kar. menyebabkan perbedaan

hasil penekanan terhadap reseptor estrogen alfa.

Penelitian ini membuktikan bahwa aktivitas sitotoksik ekstrak etanolik

jamur lingzhi jauh lebih kecil dibanding tamoxifen, hal ini dapat disebabkan oleh

kandungan senyawa dalam ekstrak yang cukup kompleks. Ekstrak etanolik jamur

lingzhi memiliki kemampuan yang lebih baik dalam menginduksi apoptosis

dibandingkan dengan tamoxifen, namun ekstrak etanolik jamur lingzhi pada sel

kanker T47D tidak menghambat reseptor estrogen alfa. Pemastian perlu dilakukan

untuk penelitian selanjutnya dengan menguji kandungan kimia, uji selektivitas

terhadap sel normal, dan pengujian target spesifik molekuler lain pada sel kanker

payudara.

4. KESIMPULAN

Berdasarkan data yang ada, ekstrak etanolik jamur lingzhi memiliki

kemampuan sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan IC50 sebesar

284,098 g/mL, dapat menginduksi apoptosis sebesar 97,8 ± 0,13% dan nekrosis

sebesar 0,27 ± 0,01, tetapi belum mampu menekan ekspresi RE-α, sehingga RE-α

masih terekspresikan sebesar 97-98% dengan level ekspresi RE-α yaitu di level

4+.


27

5. SARAN

Perlu dilakukan penelitian lanjutan untuk meningkatkan aktivitas

sitotoksik salah satunya dengan mengombinasikan dengan obat kanker lainnya

untuk meningkatkan IC50 dan diharapkan dapat membunuh sel kanker melalui

jalur apoptosis juga dapat melakukan fraksinasi ekstrak jamur lingzhi untuk

meningkatkan persentase senyawa yang memiliki aktivitas sitotoksik. Penelitian

untuk mengetahui target molekuler spesifik dari ekstrak etanolik jamur lingzhi

pada sel kanker payudara juga perlu dilakukan. Penggunaan metode double

staining AO-EB dalam pengujian apoptosis dapat dikombinasikan dengan metode

Annexin-V-Fluos untuk mendapatkan nilai persentase apoptosis, nekrosis, dan sel

hidup yang lebih akurat.

DAFTAR PUSTAKA

Aka, J.A., and Lin, S.X., 2012, Comparison of Fungsional Proteomic

Analyses Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF7, PLoS ONE,

7(2):e31532.

American Cancer Society, 2013, Breast Cancer, American Cancer Society,

Atlanta.

ATCC, 2011, MTT Cell Proliferation Assay, American Type Culture Collection,

USA.

Bjornstrom, L., and Sjoberg, M., 2005, Mechanisms Estrogen Receptor

Signaling: Convergence of Genomic and Nongenomic Actions on

Target Genes, Molecular Endocrinology, 19(4):833-842.

Boh, B., Berovic, M., Zhang, J., and Zhi-Bin, L., 2007, Ganoderma lucidum and

its pharmaceutically active compounds, Biotechnol Annu Rev., 13:265-

301.

Bruning et al., 2010, Tamoxifen enhances the cytotoxic effects of nelfinavir in

breast cancer cells, Breast Cancer Research, 12:R45.

Chang, U.M., 2006, Ganoderiol F, a ganoderma triterpene, induces senescence

in hepatoma HepG2 cells, Life sciences, 79(12):1129-1139.

Chen, N.H., et al., 2010, Ganoderic acid T inhibits tumor invasion in vitro and in

vivo through inhibition of MMP expression, Pharmacol Rep, 62(1):150-

163.

Covaleda A.M.S., et al., 2008, Influence of Cellular E α/E β atio on the E α-

Agonist Induced Proliferation of Human T47D Breast Cancer Cells,

Toxicological Sciences, 105(2), 303-311.

Deepalakshmi, K., Mirunalini, S., Krishnaveni, M., Arulmozhi, V., 2013, In vitro

and in vivo antioxidant potentials of an ethanolic extract of Ganoderma

lucidum in rat mammary carcinogenesis, Chin J Nat Med., 11(6):621-7.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Deepalakshmi%20K%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24345503

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Mirunalini%20S%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24345503

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Krishnaveni%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24345503

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Arulmozhi%20V%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=24345503

28

Direktorat Jenderal P.P. & P.L., 2009, Buku Saku Pencegahan Kanker

Leher Rahim dan Kanker Payudara, Jakarta, Departemen Kesehatan

Republik Indonesia, pp. 1. 11.

Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture: Laboratory

Procedure in Biotechnology, John Wiley and Sons, Singapore, pp . 62-64.

Fathima, A.T., Reenaa, M., 2016, Anticancer and Antibacterial Activity of

Ganoderma lucidum, International Journal of Current Microbiology and

Applied Sciences, 5(10): 891-909.

Gao et al., 2013, Anti-cancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients

and pathways, Functional Foods in Health and Disease, 3(2):48-65.

Gonzales et al., 2019, Homology models of mouse and rat estrogen receptor-α

ligand-binding domain created by in silico mutagenesis of a human

template: Molecular docking with 17β-estradiol, diethylstilbestrol, and

paraben analogs, Computational Toxicology, 10:1-16.

Handayani, S., 2012, Selaginella Active Fractions Induce Apoptosis On

T47D Breast Cancer Cell, Indonesian J. Pharm., 23(1), 48-50.

Hayashi, S.I., et al., 2003, The Expression and Function of Estrogen eceptor α

and β in Human Breast Cancer and Its Clinical Application, Endocrine-

Related Cancer, 10:193-202.

Holliday, D.L., and Speirs, V., 2011, Choosing The Right Cell Line for

Breast Cancer Research, Breast Cancer Research, 13:215.

International Agency for Research on Cancer, WHO, 2015, Estimated

Cancer Incidence, Mortality and Prevalence, tersedia dalam

http://globocan.iarc.fr/diakses tanggal 5 mei 2015.

Istvan, V., Haanen, C., Nakken, H., and Reutelingsperger, C., 1995, A novel assay

for apoptosis Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression

on early apoptotic cells using fluorescein labelled Annexin V, Journal of

Immunological Methods, 1, 184.

Ivell, et al., 2014, Proper Application of Antibodies for Immunohistochemical

Detection: Antibody Crimes and How to Prevent Them, Endocrinology.

155(3): 676–687.

Javois, L., 1999, Immunocytochemical Methods and Protocol,2nd

Ed., Humana

Press, USA, 3-10.

Jiang et al., 2006, Ganoderma Lucidum Inhibits Proliferation of Human Breast

Cancer Cells by Down-Regulation of Estrogen Receptor and NF-kB

Signaling, International Journal of Oncology, 29:695-703.

Jordan et al., 2007, New insights into the metabolism of tamoxifen and its role in

the treatment and prevention of breast cancer, Steroids, 72(13): 829–842.

Kao et al., 2013, Anti-cancer activities of Ganoderma lucidum: active ingredients

and pathways, Functional Foods in Health and Disease, 3(2):48-65.

Kim and Ma, 2010, Synthesis of 2- and 7- Substituted C19 Steroids Having a

1,4,6-Triene or 1,4-Diene Structure and Their Cytotoxic Effects on T47D

and MDA-MB231 Breast Cancer Cells, Molecules, 15(6), 4408-4422.

Liu et al., 2015, Dual AO/EB Staining to Detect Apoptosis in Osteosarcoma Cells

Compared with Flow Cytometry, Med Sci Monit Basic Res, 21:15–20.


https://www.sciencedirect.com/science/journal/24681113

https://www.sciencedirect.com/science/journal/24681113/10/supp/C

http://globocan.iarc.fr/diakses%20tanggal%205%20mei%202015

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3929726/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4332266/

29

Lumongga, F., 2008, Apoptosis, Departemen Patologi Anatomi Fakultas

Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan, pp. 2-4.

Macey, M., 2007, Flow cytometry: Principles and Applications, Springer Science

& Business Media, Totowa, pp. 1-2.

Machana, S., Weerapreeyakul, N., Barusrux, S., Nonpunya, A., Sripanidkulchai,

B., Thitimetharoch, T., 2011, Cytotoxic and apoptotic effects of six herbal

plants against the human hepatocarcinoma (HepG2) cell line, Chin Med.,

6(1), 1-8.

Massachusetts General Hospital Cancer Center, 2019, Genomics of Drug

Sensitivity in Cancer, tersedia dalam https://www.cancerrxgene.org/

diakses 12 Juni 2019.

Matthews, J., and Gustafsson, J.A. 2003, Estrogen Signaling: A Subtle Balance

Between E α and E β, Molecular Intervention, Volume 3, Issue 5.

Muchtaridi et al., 2017, Molecular Docking and 3D-Pharmacophore Modeling to

Study the Interactions of Chalcone Derivatives with Estrogen Receptor

Alpha, Pharmaceuticals, 1-12.

Neumann, B., and Rossi, M., 2012, Effects of Exemestane on Two-Dimensional

and Three-Dimensional T47D Breast Cancer Cell Cultures, University

of New Haven Summer Undergraduate Research Fellowship, 1-4.

Panjalu, 2015, Efek Antikanker Ekstrak Etanolik Daun Lavender (Lavandula

Officinalis Chaix) Terhadap Sel Kanker Payudara T47D melalui

Penekanan Ekspresi Reseptor Estrogen-α, Skripsi, Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.

Pubchem, NCBI, 2015, Structure of 17Beta-Estradiol, tersedia dalam

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/diakses tanggal 14 mei 2015.

Pubchem, NCBI, 2015, Structure of Ganoderic Acid D, tersedia dalam


Pubchem, NCBI, 2015, Structure Of Ganoderic Acid T, tersedia dalam


Pubchem, NCBI, 2015, Structure of Ganoderiol F, tersedia dalam


Richard, W., 2010, Immunocytochemistry: A Pratical Guide for Biomedical

Research, Springer, 1-2.

Richard, W., 2011, Control for Immunocytochemistry: An Update, JHC, 59(1), 6-

12.

Roche, 2008, Apoptosis, Cytotoxicity, and Cell Proliferation, 4th

edition, Roche

Diagnostic GmbH, German, pp. 38- 41.

Singh, R., et al., 2014, Taxonomy, physicochemical evaluation and chemical

investigation of Ganoderma applanatum and G. Brownii, International

Journal of Advanced Research, Vol. 2, Issue 5, 702-711.

Strasser, A., O’ Connor, L., and Dixit, V., 2000, Apoptosis Signaling, Annurev.

Biochem., 69 (1), 217- 245.

Suarez-Arroyo., et al., 2013, Anti-tumor effects of Ganoderma lucidum (reishi) in

inflammatory breast cancer in in vivo and in vitro models, PLoS One,

8(2):e57431.


https://www.cancerrxgene.org/%20diakses

https://www.cancerrxgene.org/%20diakses

http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Suarez-Arroyo%20IJ%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=23468988

30

Sudha, S., et al., 2012, Characterization of cytotoxic compound from marine

sediment derived actinomycete Streptomyces avidinii strain SU4, Asian

Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 2(10): 770-773.

Tanos, et al., 2012, ER and PR signaling nodes during mammary gland

development, Breast Cancer Res., 19;14(4):210.

Terry, L., et al., 2013, Cell Viability Assays, Eli Lilly & Company and the

National Center for Advancing Translational Sciences, San Fransisco.

Wan, et al., 2013, Synthesis and Biological Activity of 3-N-Substituted Estrogen

Derivatives as Breast Cancer Agents, Med Chem, 13(9): 1381–1388.

Wu, et al., 2012, Ganoderma lucidum Extract Induces G1 Cell Cycle Arrest, and

Apoptosis in Human Breast Cancer Cells, The American Journal of

Chinese Medicine, 40(3): 631–642.

Yue, Q.X., et al., 2008, Proteomics characterization of the cytotoxicity

mechanism of ganoderic acid D and computer-automated estimation of

the possible drug target network, Mol Cell Proteomics, 7(5):949-961.

Yuen, J.W., and Gohel, M.D., 2005, Anticancer effects of Ganoderma lucidum: a

review of scientific evidence, Nutr Cancer, 53(1):11-17.

Zhou, X.W., et al., 2007, Ganodermataceae: Natural products and their related

pharmacological functions, American Journal of Chinese Medicine,

35(4):559-5.


https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22809143

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/eutils/elink.fcgi?dbfrom=pubmed&retmode=ref&cmd=prlinks&id=22876946

31

LAMPIRAN 1

Surat Keterangan Determinasi Jamur Lingzhi


32

LAMPIRAN 2

Ethical Clearance


https://www.google.com/search?safe=strict&q=ethical+clearance&spell=1&sa=X&ved=0ahUKEwjO8aDY_JbgAhVCSX0KHchXDTUQkeECCCooAA

33

LAMPIRAN 3

Pengolahan data

1. Data MTT

Sampel C

(µg/mL)

% Viabilitas Mean

%Via

SD

%Via

log

%Via CV

1 2 3 4 5 6

Tamoxifen

(TMX)

0,185 99,2126 97,6378 100,7874 95,6693 99,2126 98,2283 98,4580 1,7359 1,9933 1,7631%

0,371 100,9843 107,2835 111,8110 113,7795 114,7638 117,5197 111,0236 5,9863 2,0454 5,3919%

0,743 103,5433 108,0709 111,8110 112,4016 110,8268 118,8976 110,9252 5,0828 2,0450 4,5822%

1,486 112,7953 120,2756 116,7323 127,9528 131,1024 125,0000 122,3097 6,9593 2,0875 5,6899%

2,972 112,9921 127,5591 123,6220 124,8031 118,5039 122,6378 121,6864 5,1879 2,0852 4,2634%

5,944 95,4724 109,2520 107,6772 109,4488 111,6142 109,8425 107,2178 5,8906 2,0303 5,4941%

11,888 11,0236 20,0787 26,3780 20,6693 25,9843 19,8819 20,6693 5,5650 1,3153 26,9239%

Lingzhi

(LZ)

5 101,5748 102,9528 105,9055 102,5591 105,9055 104,7244 103,9370 1,8340 2,0168 1,7645%

10 107,0866 113,5827 115,7480 109,8425 108,2677 101,3780 109,3176 5,0781 2,0387 4,6453%

20 109,0551 113,1890 109,2520 108,8583 104,7244 100,3937 107,5787 4,4241 2,0317 4,1124%

40 103,7402 109,0551 110,4331 113,1890 111,4173 105,1181 108,8255 3,6878 2,0367 3,3887%

80 106,8898 101,1811 102,9528 112,9921 102,9528 95,2756 103,7073 5,9152 2,0158 5,7038%

160 77,5591 86,8110 89,9606 89,1732 97,8346 77,7559 86,5157 7,7986 1,9371 9,0141%

320 43,3071 40,3543 44,8819 44,2913 46,2598 44,4882 43,9304 1,9975 1,6428 4,5469%


34

2. Data Double Staining AO-EB Lingzhi

Lapang

Pandang

Jenis Kematian Sel

Pengamat 1 Pengamat 2 Pengamat 3

Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

1 98,67 1,33 0 98,68 1,32 0 98,76 1,24 0

2 98,51 0 1,49 98,45 0 1,55 98,52 0 1,48

3 94,45 0,79 4,76 95,24 0,79 3,97 95,04 0,83 4,13

Rerata 97,21 0,71 2,08 97,46 0,70 1,84 97,44 0,69 1,87

Rerata Tiap Pengamat

Jenis Kematian Sel

Apoptosis (%) Nekrosis (%) Hidup (%)

Pengamat 1 97,21 0,71 2,08

Pengamat 2 97,46 0,70 1,84

Pengamat 3 97,44 0,69 1,87

Rerata Keseluruhan 97,37 ± 0,13 0,27 ± 0,01 1,93 ± 0,13

3. Saphiro Wilk Test Apoptosis Lingzhi

α 0,05

No X Xi Xi - x (Xi - x )2

1 97,21 97,21 -0,16 0,0256

2 97,46 97,44 0,07 0,0049

3 97,44 97,46 0,09 0,0081

x 97,80 D 0,0386

Nilai T

i ai Xi Xn-i+1 Xn-i+1 - Xi ai(Xn-1+1 - Xi) Jumlah [ai(Xn-1+1 - Xi)2 T3

1 0,7071 97,21 97,46 0,25 0,176775 0,0312 0,80957


35

4. Saphiro Wilk Test Nekrosis Lingzhi

α 0,05


1 0,71 0,69 -0,01 1E-04

2 0,7 0,7 0 0

3 0,69 0,71 0,01 0,0001

x 0,7 D 0,0002

Nilai T


1 0,7071 0,69 0,71 0,02 0,014142 0,0002 0,999981

5. Data Double Staining AO-EB Kontrol Sel

Lapang

Pandang

Jenis Kematian Sel


Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

Apop

(%)

Nek

(%) Hid (%)

1 0 0 100 0 0 100 0 0 100

2 0 0 100 0 0 100 0 0 100

3 0 0 100 0 0 100 0 0 100

Rerata 0 0 100 0 0 100 0 0 100

Rerata Tiap

Pengamat

Jenis Kematian Sel

Apoptosis

(%)

Nekrosis

(%)

Hidup

(%)

Pengamat 1 0 0 100

Pengamat 2 0 0 100

Pengamat 3 0 0 100

Rerata

Keseluruhan 0 0 100


36

6. Data Double Staining AO-EB Tamoxifen

Lapang

Pandang

Jenis Kematian Sel


Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

Apop

(%)

Nek

(%)

Hid

(%)

1 33,34 2,08 64,58 38 0 62 39,22 0 60,78

2 3,37 2,25 94,38 3,66 2,44 93,9 3,37 2,25 94,38

3 84,76 10,48 4,76 88,57 6,67 4,76 85,44 8,74 5,82

Rerata 40,49 4.94 54,57 43,41 3,04 53,55 42,68 3,66 53,66

Rerata Tiap

Pengamat

Jenis Kematian Sel

Apoptosis

(%)

Nekrosis

(%)

Hidup

(%)

Pengamat 1 40,49 4,94 54,57

Pengamat 2 43,41 3,04 53,55

Pengamat 3 42,68 3,66 53,66

Rerata

Keseluruhan

42,19 ±

1,52

3,88 ±

0,97

53,93

± 0,56

7. Saphiro Wilk Test Apoptosis Tamoxifen

α 0,05


1 40,49 40,49 -1,70333 2,901344

2 43,41 42,68 0,486667 0,236844

3 42,68 43,41 1,216667 1,480278

Rerata 97,8 D 4,618467

Nilai T


1 0,7071 40,49 43,41 2,92 2,064732 4,263118 0,923059


37

8. Saphiro Wilk Test Nekrosis Tamoxifen

α 0,05


1 4,94 3,04 -0,84 0,7056

2 3,04 3,66 -0,22 0,0484

3 3,66 4,94 1,06 1,1236

Rerata 3,88 D 1,8776

Nilai T


1 0,7071 3,04 4,94 1,9 1,34349 1,804965 0,961315

9. F-Test Double Staining AO-EB Apoptosis Lingzhi dan Tamoxifen

Rerata %Apoptosis

Lingzhi

Rerata %Apoptosis

Tamoxifen

97,21 40,49

97,44 42,68

97,46 43,41

F-Test Two-Sample for Variances

Rerata %Apoptosis

LZ

Rerata %Apoptosis

TMX

Mean 97,37 42,19333333

Variance 0,0193 2,309233333

Observations 3 3

df 2 2

F 0,008357752

P(F<=f) one-tail 0,008288479

F Critical one-

tail 0,052631579


38

10. T-Test Double Staining AO-EB Apoptosis Lingzhi dan Tamoxifen

t-Test: Two-Sample Assuming Equal Variances

Rerata %Apoptosis LZ Rerata %Apoptosis TMX

Mean 97,37 42,19333333

Variance 0,0193 2,309233333

Observations 3 3

Pooled Variance 1,164266667

Hypothesized Mean Difference 0

df 4

t Stat 62,62891069

P(T<=t) one-tail 1,94663E-07

t Critical one-tail 2,131846786

P(T<=t) two-tail 3,89327E-07

t Critical two-tail 2,776445105

11. F-Test Double Staining AO-EB Nekrosis Lingzhi dan Tamoxifen

Rerata %Nekrosis

Lingzhi

Rerata %Nekrosis

Tamoxifen

0,69 3,04

0,7 3,66

0,71 4,94


Rerata %Nekrosis LZ Rerata %Nekrosis TMX

Mean 0,7 3,88

Variance 0,0001 0,9388

Observations 3 3

df 2 2

F 0,000106519

P(F<=f) one-tail 0,000106508

F Critical one-tail 0,052631579


39

12. T-Test Double Staining AO-EB Nekrosis Lingzhi dan Tamoxifen


Rerata %Nekrosis

LZ Rerata %Nekrosis TMX

Mean 0,7 3,88

Variance 0,0001 0,9388

Observations 3 3



df 4

t Stat -5,68431423

P(T<=t) one-tail 0,002364416


P(T<=t) two-tail 0,004728832



40

13. Data IHC

Pengamat

% Ekpresi RE-α

KS (%) KS Ab (%) LZ (%) TMX (%)

LP

1

LP

2

LP

3 LP 1 LP 2 LP 3 LP 1 LP 2 LP 3 LP 1 LP 2 LP 3

1 0 (0) 0 (0) 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 (100) 220 (96,07) 207 (92,41) 149 (81,42) 13 (15,12) 15 (21,12) 8 (12,12)

2 0 (0) 0 (0) 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 (100) 224 (97,82) 211 (94,2) 145 (79,23) 13 (15,12) 15 (21,12) 7 (10,61)

3 0 (0) 0 (0) 0 (0) 100 (100) 100 (100) 100 (100) 223 (97,38) 211 (94,2) 142 (77,6) 14 (16,23) 15 (21,12) 9 (13,64)

Total Sel 138 246 284 201 95 256 229 224 183 86 71 66

Rerata %

Ekpresi

RE-α

0% 0% 0% 100% 100% 100% 97,09% 93,60% 79,42% 15,54% 21,12% 12,12%

Level

Ekpresi

RE-α

0 0 0 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 1+ 1+ 1+

Rerata %

Ekpresi

RE-α 3

lapang

pandang

0% 100% 90.04% 16.26%


41

14. Saphiro Wilk IHC Lingzhi

α 0,05


1 97,09 79,42 -10,62 112,71361

2 93,6 93,6 3,56 12,69734

3 79,42 97,09 7,05 49,74951

Xbar 90,04 D 175,16047

Nilai T


1 0,7071 79,42 97,09 17,67 12,494457 156,111456 0,89124823

15. Saphiro Wilk IHC Tamoxifen

α 0,05


1 15,54 12,12 -4,14 17,1396

2 21,12 15,54 -0,72 0,5184

3 12,12 21,12 4,86 23,6196

Rerata 16,26 D 41,2776

Nilai T


1 0,7071 12,12 21,12 9 6,3639 40,4992232 0,98114288

16. F-Test IHC Lingzhi & Tamoxifen

% Rerata ekspresi RE-α

Lingzhi


Tamoxifen

79,42 12,12

93,6 15,54

97,09 21,12


42



LZ

% Rerata ekspresi

RE-α TMX

Mean 90,03666667 16,26

Variance 87,58023333 20,6388

Observations 3 3

df 2 2

F 4,243475073

P(F<=f) one-tail 0,190713217

F Critical one-tail 19

17. T-Test IHC Lingzhi & Tamoxifen


% Rerata

ekspresi RE-α

LZ

% Rerata

ekspresi

RE-α

TMX

Mean 90,03666667 16,26

Variance 87,58023333 20,6388

Observations 3 3



df 4

t Stat 12,28366126

P(T<=t) one-tail 0,000126142


P(T<=t) two-tail 0,000252285



43

Biografi Penulis

Skolastika dilahirkan di Pantilang, 10 Februari 1994,

anak terakhir dari 3 bersaudara dari pasangan Bapak

Amandus dan Ibu Marthina M. Penulis menempuh

pendidikan SD di Sekolah Dasar Negeri 227 Puncak

Malili, Sulawesi-Selatan dari tahun 2000–2006, dan

melanjutkan ke jenjang berikutnya di SMP 1 Malili dari

tahun 2006–2009. Penulis melanjutkan pendidikan di

SMA Negeri 3 Makale, Tana Toraja pada tahun 2009–2012. Pada tahun 2012

penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang Strata Satu (S1) di Fakultas Farmasi

Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Penulis memiliki hobi bernyanyi, oleh

karena itu selama menempuh pendidikan di Yogyakarta, penulis bergabung

diberbagai kelompok koor seperti Tirta Svara dan Vocason. Kecintaan pada anak–

anak membawa penulis pada kegiatan pendampingan anak di berbagai paroki dan

komunitas katolik di Yogyakarta.


PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK JAMUR LINGZHI …Mekanisme molekuler terhadap RE-α dianalisis secara...

Documents

Transcript of PENGARUH EKSTRAK ETANOLIK JAMUR LINGZHI …Mekanisme molekuler terhadap RE-α dianalisis secara...