Modulation der Interferon-γ vermittelten Persistenz von ... · Aus dem Institut für Medizinische...

Aus dem Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene

der Universität zu Lübeck

Direktor: Prof. Dr. med. Werner Solbach

Modulation der Interferon-γ vermittelten

Persistenz von Chlamydia pneumoniae durch

Hypoxie

Inauguraldissertation

zur

Erlangung der Doktorwürde

der Universität zu Lübeck

Aus der Sektion Naturwissenschaften

vorgelegt von

Inga Dietz

aus Bremen

Lübeck 2012

1. Berichterstatter: Prof. Dr. med. Jan Rupp 2. Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. Norbert Tautz

Tag der mündlichen Prüfung: 04.07.2012

Zum Druck genehmigt. Lübeck, den 05.07.2012

Inhaltsverzeichnis 1

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ............................................................................................ 4

1 Zusammenfassung ............................................................................................... 8

2 Einleitung ............................................................................................................ 9

2.1 Grundlagen von Chlamydien ...................................................................... 9

2.1.1 Taxonomische Einteilung ..................................................................... 9

2.1.2 Biologie des Entwicklungszyklus ....................................................... 11

2.1.3 Persistenz ........................................................................................... 12

2.1.4 C. pneumoniae assoziierte Krankheitsbilder ....................................... 13

2.2 Wechselwirkung zwischen dem Immunsystem und C. pneumoniae .......... 15

2.2.1 Typ II Interferon vermittelte Jak-STAT Signalkaskade ...................... 16

2.2.2 Indolamin 2,3-Dioxygenase ............................................................... 17

2.3 Hypoxie .................................................................................................... 19

2.3.1 Bedeutung von Sauerstoff in der Zelle ............................................... 19

2.3.2 Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1) ............................................ 20

2.3.3 C. pneumoniae-Infektionen unter Hypoxie ......................................... 21

2.4 Fragestellung ............................................................................................ 22

3 Material ............................................................................................................. 23

3.1 Geräte ....................................................................................................... 23

3.2 Verbrauchsmaterialien .............................................................................. 24

3.3 Chemikalien und Reagenzien.................................................................... 25

3.4 Puffer und Lösungen ................................................................................ 27

3.5 Zelllinien .................................................................................................. 27

3.6 Medien und Medienzusätze ...................................................................... 28

3.7 Enzyme und Kits ...................................................................................... 28

3.8 Oligonukleotide ........................................................................................ 28

3.8.1 Primer für die cDNA Synthese ........................................................... 28

3.8.2 Primer für die quantitative RT-PCR ................................................... 29

3.8.3 siRNA für RNA-Interferenz Analysen ............................................... 30

3.9 Antikörper ................................................................................................ 31

3.9.1 Antikörper für Western Blot Analysen ............................................... 31

3.9.2 Antikörper für Immunfluoreszenzfärbungen....................................... 32

3.10 Software ................................................................................................... 32

4 Methoden........................................................................................................... 33

4.1 Zellkultur ................................................................................................. 33

4.1.1 Kultivierung von Zelllinien ................................................................ 33


4.1.2 Bestimmung der Zellzahl ................................................................... 34

4.1.3 Konservierung von Zelllinien ............................................................. 34

4.2 Präparation von humanem Lungengewebe ................................................ 35

4.3 Infektionsbiologische Methoden ............................................................... 35

4.3.1 Herstellung eines Infektionsstocks von C. pneumoniae ...................... 35

4.3.2 Infektion von Zelllinien mit C. pneumoniae ....................................... 36

4.3.3 Infektion von humanem Lungengewebe ............................................. 36

4.3.4 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Tryptophan ............. 36

4.3.5 Reaktivierungs-Modell von C. pneumoniae durch Hypoxie ................ 37

4.3.6 Wiederanzucht ................................................................................... 37

4.3.7 Quantifizierung des Chlamydien-Gehalts ........................................... 38

4.4 Mikroskopie ............................................................................................. 38

4.4.1 Direkter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae ........................... 38

4.4.2 Indirekter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae ......................... 39

4.4.3 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung von α-smooth muscle actin ........ 39

4.4.4 Live Cell Imaging .............................................................................. 40

4.5 Proteinbiochemische Methoden ................................................................ 40

4.5.1 Probengewinnung .............................................................................. 40

4.5.2 SDS-PAGE ........................................................................................ 40

4.5.3 Western Blot Analyse ........................................................................ 41

4.6 Molekularbiologische Methoden............................................................... 42

4.6.1 RNA-Isolation ................................................................................... 42

4.6.2 Reverse Transkription ........................................................................ 42

4.6.3 Quantitative RT-PCR ......................................................................... 43

4.6.4 RNA-Interferenz Analysen ................................................................ 44

4.6.5 Inhibition von TGF-β ......................................................................... 45

4.6.6 Transkriptom-Analysen ..................................................................... 45

4.7 Metabolom-Analysen ............................................................................... 46

4.7.1 Aufarbeitung von Metaboliten für das FT/ICR-MS ............................ 46

4.7.2 Analyse der Metabolite ...................................................................... 47

4.7.3 Auswertung der relevanten Massen .................................................... 47

4.8 Statistik .................................................................................................... 48

5 Ergebnisse ......................................................................................................... 49

5.1 Untersuchungen der IFN-γ induzierten Persistenz von C. pneumoniae unter Hypoxie ........................................................................................... 49

5.1.1 Aufhebung der Persistenzbildung von C. pneumoniae durch Hypoxie 49

5.1.2 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Hypoxie .................. 52

5.2 Analyse von IFN-γ induzierenden Signalwegen unter Hypoxie ................. 53


5.2.1 Beeinflussung der Jak-STAT Signalkaskade durch Hypoxie .............. 53

5.2.2 Beeinflussung der IDO Expression durch Hypoxie ............................. 57

5.2.3 Beeinflussung weiterer IFN-γ regulierter Proteine durch Hypoxie ...... 61

5.3 Analyse von IL-6 unter Hypoxie ............................................................... 65

5.4 Einfluss von C. pneumoniae auf Differenzierungs-prozesse von Epithelzellen............................................................................................. 66

5.4.1 Einfluss von C. pneumoniae auf E-Cadherin ...................................... 66

5.4.2 Einfluss von C. pneumoniae auf α-smooth muscle actin (α-SMA) ...... 68

5.4.3 Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten Zellen ................... 70

5.4.4 TGF-β unabhängige C. pneumoniae vermittelte Remodelingprozesse 70

5.4.5 Beteiligung von HIF-1 an C. pneumoniae vermittelten Remodelingprozessen ........................................................................ 71

5.5 Etablierung von Transkriptom-Analysen .................................................. 75

5.6 Etablierung von Metabolom-Analysen ...................................................... 79

5.6.1 Hauptkomponentenanalyse ................................................................ 79

5.6.2 Unterschiede der Metabolite in infizierten Zellen unter Normoxie und Hypoxie ............................................................................................. 81

6 Diskussion ......................................................................................................... 83

6.1 Hypoxie verhindert die Persistenzinduktion von C. pneumoniae ............... 83

6.2 Hypoxie reduziert die Aktivität der Jak-STAT Signalkaskade ................... 85

6.3 Entzündungsvorgänge in persistent infizierten Zellen ............................... 88

6.4 C. pneumoniae vermittelt Umbauprozesse von Epithelzellen .................... 89

6.5 Weiterführende Analysen zu C. pneumoniae Infektionen unter Hypoxie ... 93

6.6 Schlussbetrachtung ................................................................................... 96

Literaturverzeichnis ................................................................................................ 98

Abbildungsverzeichnis ......................................................................................... 106

Tabellenverzeichnis .............................................................................................. 108

A Anhang ............................................................................................................ 109

A.1 Lebenslauf .............................................................................................. 109

A.2 Publikationen ......................................................................................... 110

A.3 Kongressbeiträge .................................................................................... 111

A.4 Danksagung ............................................................................................ 112

Abkürzungsverzeichnis 4

Abkürzungsverzeichnis Im Folgenden sind die in dieser Arbeit verwendeten Abkürzungen aufgelistet.

Englische Abkürzungen wurden ins Deutsche übersetzt, wenn diese im deutschen

Sprachgebrauch vorhanden sind.

°C Grad Celsius

A. dest. Destilliertes Wasser

ADP Adenosindiphosphat

ALK Activin receptor-like kinase

APS Ammoniumpersulfat

ATCC American Type Culture Collection

ATP Adenosintriphosphat

bHLH Basic helix-loop-helix

bp Basenpaare

CAP Community acquired pneumonia, ambulant erworbene Pneumonie

cDNA Complementary DNA, komplementäre DNA

COPD Chronic obstructive pulmonary disease, chronisch obstruktive Lungenerkrankung

CPAF Chlamydial protease-like activity factor

Cpn Chlamydia pneumoniae

CXCR C-X-C Chemokinrezeptor

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Deoxyribonucleic acid, Desoxyribonukleinsäure

DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

DTT 1,4-Dithiothreitol

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EK Elementarkörperchen

EMT Epithelial-mesenchymal transition

ESI Elektrospray Ionisation


et al. Und andere

Fa. Firma

FEV1 Forciertes exspiratorisches Volumen in der ersten Sekunde

FGFR2 Fibroblast-growth-factor receptor-2

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FKS Fötales Kälberserum

FSP1 Fibroblast-specific protein-1

FT/ICR-MS Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer, Fouriertransformation-Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer

GAS IFN-γ aktivierte Sequenz

GLUT Glukosetransporter

GOLD Global initiative for chronic obstructive lung disease

h Hour, Stunde

HIF-1 Hypoxia-inducible factor-1, Hypoxie-induzierbarer-Faktor-1

hpi Hours post infection

HRE Hypoxia responsive element

HRP Horseradish peroxidase, Meerrettichperoxidase

IDO Indolamin 2,3-Dioxygenase

IFN-γ Interferon-gamma

IFNGR IFN-γ Rezeptor

IFT Immunfluoreszenztest

IFU Infection forming units

IL Interleukin

iNOS Inducible nitric oxide synthase, induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase

IP-10 IFN-γ induzierbares Protein 10

IRF-1 Interferon regulierter Faktor-1

ISRE IFN-stimulated response element

Jak Januskinase

kbp Kilobasenpaare


kDA Kilodalton

KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

LDHA Laktatdehydrogenase A

LPS Lipopolysaccharid

m/z Masse-zu-Lade-Verhältnis

mmHg Millimeter-Quecksilbersäule

mRNA Messenger RNA

NEAA Non-essential amino acid, nicht-essentielle Aminosäuren

NF-κB Nuclear factor 'kappa-light-chain-enhancer' of activated B-cells

NK-Zellen Natürliche Killerzellen

NO Stickstoffmonoxid

NTP Nukleotidtriphosphat

PAMP Pathogen-associated molecular pattern, Pathogen-assoziierte molekulare Muster

PBS Phosphate buffered saline, Phosphatgepufferte Salzlösung

PCA Principal component analysis, Hauptkomponentenanalyse

PCR Polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion

PDK Pyruvatdehydrogenase Kinase

PHD Prolyl-Hydroxylase

PIAS Protein inhibitors of activated STATs

PKCδ Protein kinase C δ

PLS-DA Partial least squares-Diskriminanzanalyse

ppb Parts per million

ppm Parts per billion

PRR Pattern recognition receptors

RK Retikularkörperchen

RNA Ribonucleic acid, Ribonukleinsäure

rpm Rounds per minute

rRNA Ribosomale RNA

RSV Respiratorisches Synzytial-Virus


RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse-Transkriptase PCR

SDS-PAGE Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

Ser Serin

SH2 Src-homology 2

SHP SH2 containing phosphatase

SMA Smooth muscle actin

SMAD Small mother against decapentaplegic

SOCS Suppressor of cytokine signaling

STAT Signal transducers and activators of transcription

STRA13 Stimulated with retinoic acid 13

TBS Tris-gepufferte Saline

TEMED N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin

TGF-β Transforming growth factor β

Th T-Helferzellen

TLR Toll-like Rezeptor

Tuf Thermo unstable elongation factor

Tyr Tyrosin

U Units

VEGF Vascular endothelial growth factor

VHL Von Hippel-Lindau Protein

VIP Variable importance in the projection

Zusammenfassung 8

1 Zusammenfassung Chlamydia pneumoniae ist ein obligat intrazelluläres Bakterium, welches im Rahmen

akuter und chronisch-persistierender Infektionen in der Lunge mit dem

Krankheitsbild der COPD (chronisch obstruktive Lungenerkrankung) assoziiert wird.

Direkte Wechselwirkungen zwischen dem Erreger und pulmonalen Wirtszellen

wurden bislang hauptsächlich unter Normoxie (20% O2) untersucht. Dabei treten in

der Lunge bereits physiologisch geringere Sauerstoffkonzentrationen auf, die durch

Entzündungsreaktionen oder bei reduzierter Ventilation von Lungenabschnitten

weiter abfallen können. Es ist bekannt, dass C. pneumoniae von niedrigen

Sauerstoffkonzentrationen (Hypoxie) profitiert, indem die Infektionsrate und das

Wachstum gesteigert sind. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal das Verhalten der

Interferon-gamma (IFN-γ) vermittelten Persistenz von C. pneumoniae in

Lungenepithelzellen unter Hypoxie analysiert. Es zeigte sich, dass bei

Sauerstoffkonzentrationen ≤ 3% die antibakterielle Wirkung von IFN-γ aufgehoben

wurde. Die verhinderte Persistenzinduktion ging mit einer reduzierten Aktivität der

Jak-STAT Signalkaskade und Expression von Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) in

der frühen Phase der Infektion einher. In Zellen mit persistierender C. pneumoniae-

Infektion führte ein Abfall der Sauerstoffkonzentration zu einer Reaktivierung.

Hauptmerkmale einer COPD sind chronisch-rezidivierende Entzündungsprozesse

und fortschreitende Umbauvorgänge des Lungenepithels. Interessanterweise war ein

Entzündungsprozess, gekennzeichnet durch Interleukin-6 (IL-6), stärker in persistent

infizierten Zellen als in Zellen mit einer reaktivierten Infektion zu detektieren.

Zudem konnten zelluläre Umbauvorgänge in C. pneumoniae infizierten

Lungenepithelzellen nachgewiesen werden. Dabei wiesen persistent infizierte Zellen

unter Normoxie sowie akut infizierte Zellen unter Hypoxie einen ausgeprägten

Umbau auf. Demnach könnten Umbauprozesse, verursacht durch eine persistente

oder reaktivierte C. pneumoniae-Infektion, zur Pathogenese von chronischen

Erkrankungen beitragen. Um weitere Einblicke auf Erreger- und Wirtsseite unter

Hypoxie zu erlangen, wurden Transkriptom- und Metabolom-Analysen etabliert.

Erste Analysen des Metaboloms zeigten, dass sich dieses während einer Infektion

unter Normoxie und Hypoxie unterschied und Veränderungen z.B. im

Kohlenhydrat-, Lipid- und Aminosäure-Metabolismus zu detektieren waren. Diese

Methode könnte in Zukunft neue Ansatzpunkte für Therapien oder Biomarker

liefern.

Einleitung 9

2 Einleitung

2.1 Grundlagen von Chlamydien Chlamydien sind gramnegative Bakterien, die auf Grund ihrer obligat intrazellulären

Lebensform zuerst zu den Viren gezählt wurden. Schon 1907 entdeckten Ludwig

Halberstädter und Stanislaus von Prowazek Einschlusskörper von Chlamydien in

Konjunktivalabstrichen von Trachomen [42]. Im Jahre 1932 beschrieben Bedson

et al. den für Chlamydien charakteristischen Entwicklungszyklus [11], aber erst 1966

wurden Chlamydien den Bakterien zugeordnet [80].

Eine Vielzahl von Lebewesen wird von Chlamydien infiziert. So infiziert z.B.

Chlamydia psittaci in erster Linie Vögel, kann jedoch von diesen, bei engem

Kontakt, auf den Menschen übergehen und zur Ornithose führen [12]. Ein wichtiger

Vertreter der humanpathogenen Chlamydien ist Chlamydia trachomatis, dessen

verschiedene Serovar Infektionen des Auges sowie sexuell übertragbare Infektionen

des Urogenitaltrakts verursachen [99]. Der Fokus dieser Arbeit liegt bei dem dritten

Vertreter der humanpathogenen Chlamydien, Chlamydia pneumoniae. Dieser wurde

1965 von der Bindehaut eines Kindes aus Taiwan isoliert und seit 1971 als TW-183

bezeichnet [61]. Nach Isolation eines respiratorischen Isolats (AR-39) von einem

Studenten mit Pharyngitis in Seattle 1983 wurde es als humanpathogen eingestuft.

Zuerst wurde der Erreger, entsprechend der beiden Erstisolate, als TWAR bezeichnet

und erst 1989 wurde TWAR als dritte Spezies C. pneumoniae taxonomisch

eingeordnet [61].

2.1.1 Taxonomische Einteilung

Chlamydien werden auf Grund ihres charakteristischen, biphasischen

Entwicklungszyklus und basierend auf rRNA Analysen in eine eigene Ordnung

(Chlamydiales) eingruppiert. Die Ordnung der Chlamydiales beinhaltet die Familien

der Chlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Waddliaceae und Simkaniaceae

(Abbildung 2.1), wobei nur die Familie der Chlamydiaceae human- und

tierpathogene Organismen beinhaltet [6;15;30;84]. Bis 1999 bestand die Familie der

Chlamydiaceae nur aus der Gattung Chlamydia, die jedoch auf Grund von 18S und

23S rRNA Analysen in die Gattungen Chlamydophila und Chlamydia unterteilt

wurde [30]. Diese Einteilung wurde jedoch von vielen Wissenschaftlern abgelehnt,

Einleitung 10

da sie die biologische Bedeutung dieser Organismen nicht berücksichtigt. So wurde

vorgeschlagen ausschließlich die Gattung Chlamydia zu verwenden [100;106]. In

dieser Arbeit wurde einzig die alte Taxonomie für Chlamydia pneumoniae

verwendet.

Abbildung 2.1: Taxonomie der Ordnung Chlamydiales. Schematische Darstellung der Verwandtschaftsverhältnisse der Taxonomie von 1999 mit Angabe der typischen Wirte. Die Länge der Linien stellt nicht die tatsächlichen phylogenetischen Abstände dar. Abbildung modifiziert nach [15].

Einleitung 11

2.1.2 Biologie des Entwicklungszyklus

Chlamydien sind als obligat intrazelluläre Bakterien auf eine intakte Wirtszelle für

ihre Replikation angewiesen. Ihr charakteristischer, biphasischer Entwicklungszyklus

ist in Abbildung 2.2 dargestellt. Der Zyklus beginnt mit einem Elementarkörperchen

(EK), welches mit einer Größe von ca. 0,3 µm die infektiöse, metabolisch wenig

aktive Lebensform darstellt [120]. Bei der Infektion adhäriert ein EK an die

Wirtszelle und wird über Rezeptor-vermittelte Endozytose aufgenommen. Dabei

bilden die Chlamydien ein eigenes zelluläres Kompartiment, die sogenannte

Inklusion (Einschlusskörper). Bereits 8 h nach der Aufnahme in die Zelle erfolgt die

Dekondensation der DNA der EK, welche sich vergrößern und zu

Retikularkörperchen (RK) umwandeln. Das RK hat eine Größe von ca. 1 µm und ist

die intrazelluläre, metabolisch aktive Form der Chlamydien. Die Replikation der RK

erfolgt 12 und 24 hpi (hours post infection) mittels binärer Teilung [38]. Durch ihre

an die Wirtszelle angepasste Lebensweise, weist C. pneumoniae ein mit 1,2 Mio.

Basenpaaren reduziertes Genom auf [57]. Zwar konnten im chlamydialen Genom

Gene des Energiestoffwechsels (u.a. Glykolyse, Zitratzyklus, Atmungskette)

nachgewiesen werden [51;57], jedoch sind die Stoffwechselwege häufig

unvollständig kodiert. Daher müssen Zwischenprodukte vom Wirt bezogen werden

[76]. So weisen Chlamydien z.B. einen Adenosintriphosphat/Adenosindiphosphat

(ATP/ADP) Transporter auf, mit dem sie ATP im Austausch gegen ADP von der

Wirtszelle aufnehmen können [45].

Zwischen 48 und 72 hpi findet die Redifferenzierung der RK zurück zu den EK

statt [38]. Durch Lyse der Wirtszelle oder Abschnürung (Extrusion) des

Einschlusskörpers aus der Zelle werden die EK schließlich freigesetzt und können

neue Wirtszellen infizieren [50]. Ein vollständiger Entwicklungszyklus ist nach 72 h

abgeschlossen [38]. Des Weiteren gibt es eine Erscheinungsform, die als Persistenz

bezeichnet wird (Abschnitt 2.1.3). Durch extrazelluläre Stimuli verbleiben

Chlamydien mit atypischer Morphologie in diesem Zustand. Wird der Stimulus der

zur Persistenz führte wieder entzogen, gelangen die Chlamydien zurück in ihren

aktiven Entwicklungszyklus [10].

Einleitung 12

Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des Entwicklungszyklus von C. pneumoniae. Ein Elementarkörperchen (EK) infiziert die Wirtszelle und differenziert sich innerhalb der Inklusion zu einem Retikularkörperchen (RK). Nach einigen Teilungen redifferenzieren die RK zurück zu den EK und werden durch Extrusion oder Lyse der Zelle freigesetzt. Durch exogene und zelluläre Faktoren können die Chlamydien für lange Zeit im Stadium der Persistenz verharren (rote Pfeile), können aber auch wieder in den aktiven Entwicklungszyklus eintreten.

2.1.3 Persistenz

Die Persistenz von Chlamydien ist charakterisiert durch kleinere Einschlusskörper, in

denen vergrößerte, atypische RK mit einem veränderten Metabolismus zu finden

sind. In diesem Zustand sind sie lebensfähig, weisen jedoch kein Wachstum auf [10].

In vitro kann die Persistenz durch verschiedene Faktoren hervorgerufen werden.

Dabei sind Nährstoffmangel (z.B. von Aminosäuren, Glukose), Antibiotika

Behandlung z.B. mit Penicillin sowie Eisenentzug beschrieben [19;43;74;93]. Zudem

kann die Persistenz über Interferon-gamma (IFN-γ) induziert werden [108]. IFN-γ

führt in der Wirtszelle über die Induktion von Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) zu

Einleitung 13

einem Tryptophanabbau (Abschnitt 2.2.2). Da für Chlamydien diese Aminosäure

essentiell ist, wird das chlamydiale Wachstum gehindert und sie gelangen in das

Stadium der Persistenz [86]. Die Wirkung von IFN-γ ist dabei

konzentrationsabhängig. Eine hohe Konzentration führt zum Absterben des

Bakteriums, während bei einer niedrigen Konzentration die Persistenz von

Chlamydien induziert wird [9]. Die Aufhebung der Persistenz und damit die

Reaktivierung von Chlamydien erfolgt in vitro meist durch Wegfall des

Persistenz-stimulierenden Faktors (z.B. Entzug von IFN-γ oder Zugabe von

Tryptophan). Man nimmt an, dass persistierende Chlamydien-Infektionen über Tage

bis Wochen andauern und für chronische Krankheiten verantwortlich sein können

(Abschnitt 2.1.4).

2.1.4 C. pneumoniae assoziierte Krankheitsbilder

Persistente C. pneumoniae-Infektionen sind mit verschiedensten chronischen

Erkrankungen, wie der Arteriosklerose, Asthma und der chronisch obstruktiven

Lungenerkrankung (COPD) (Abschnitt 2.1.4.1) assoziiert [41;85;112;116]. Die

primären Zielzellen von C. pneumoniae sind Epithelzellen des Respirationstrakts,

wodurch akute respiratorische Krankheiten der oberen und unteren Atemwege wie

Pharyngitis, Sinusitis und Bronchitis hervorgerufen werden [88]. Auch ca. 10% der

ambulant erworbenen Pneumonien (CAP) gehen auf eine C. pneumoniae-Infektion

zurück [36]. Die meisten Primärinfektionen verlaufen jedoch asymptomatisch. Da

die serologische Prävalenz für C. pneumoniae schon im Kindes- und Jugendalter

hoch ist (50%) und in den höheren Altersgruppen weiter ansteigt (75%) [61] kann die

Rolle einer C. pneumoniae-Infektion an chronischen Erkrankungen schwer

eingeschätzt werden. Zudem fehlt bisher ein diagnostischer Standard, um zuverlässig

akute von persistierenden Infektionen unterscheiden zu können. In Studien zeigte

sich eine erhöhte Seroprävalenz für eine C. pneumoniae-Infektion bei

COPD-Patienten [113]. Daneben konnten Infektionen mit C. pneumoniae in 15% der

COPD-Patienten direkt mittels PCR (Polymerase-Kettenreaktion) nachgewiesen

werden [27].

Einleitung 14

2.1.4.1 Chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD)

COPD ist weltweit die vierthäufigste Todesursache [73]. Die Symptome einer COPD

sind Auswurf, Husten und Atemnot. Die Diagnose und Einstufung erfolgt nach der

GOLD Klassifikation (global initiative for chronic obstructive lung disease) und

wird anhand der Abnahme des forcierten exspiratorischen Volumens in der ersten

Sekunde (FEV1) beurteilt. Es werden dabei 4 Schweregrade von „mild“ bis „sehr

schwer“ unterschieden [91]. Wichtige Risikofaktoren für die Entstehung einer COPD

sind Tabakkonsum sowie genetische Disposition, Stäube, Chemikalien und toxische

Dämpfe [91]. Die COPD ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Lunge mit

langsam fortschreitender Atemwegsobstruktion. Persistierende Entzündungs- und

Umbauprozesse führen zur Entwicklung von chronischer Bronchitis und

Lungenemphysem, als Manifestation späterer Stadien der COPD. Zu den

Umbauprozessen einer COPD gehören fibrotische Veränderungen der

Atemwegswand, Metaplasien des Epitheliums und strukturelle Änderungen der

kleinen Atemwege [55]. Die Gesamtheit dieser Umbauprozesse wird auch als

Remodeling bezeichnet. Während der Embryonalentwicklung ist solch ein Prozess

grundlegend und wird epithelial-mesenchymal transition (EMT) genannt [55].

Remodeling bei Epithelzellen kann charakterisiert werden durch eine Abnahme von

Zell-Zell-Kontakten, was den Verlust eines organisierten Zelllayers zur Folge hat

(Abbildung 2.3). Dadurch bekommen sie den Charakter von mesenchymalen Zellen,

welche sich durch eine spindelförmige Morphologie auszeichnen. Zudem weisen

mesenchymale Zellen eine höhere Beweglichkeit als Epithelzellen auf [110].

Einleitung 15

Abbildung 2.3: Remodeling (epithelial-mesenchymal transition, EMT) von Epithelzellen. Durch Wachstumsfaktoren oder Zytokine verlieren Epithelzellen die für sie typischen Marker und zeigen Charakteristika von mesenchymalen Zellen. FGFR2: fibroblast-growth-factor receptor-2; FSP1: fibroblast-specific protein-1. Abbildung modifiziert nach [110].

Charakteristisch für eine COPD sind wiederkehrende Zyklen von akuten

Exazerbationen. Dafür ursächlich sind vor allem exogene Noxe wie virale und

bakterielle Infektionen, die zu einer Reaktivierung der Entzündung führen. Am

häufigsten werden bakterielle Infektionen mit Haemophilus influenzae, Moraxella

catarrhalis, Streptococcus pneumoniae oder Pseudomonas aeruginosa beobachtet

[117]. Daneben wurden auch C. pneumoniae-Infektionen in 34% der Patienten mit

akuten Exazerbationen nachgewiesen [58]. Die bei Exazerbationen vorherrschende

Entzündungsreaktion ist durch eine Vermehrung von Neutrophilen und CD8+

T-Lymphozyten in der Lunge gekennzeichnet [55]. Das Zytokin-Profil von COPD

Patienten entspricht dabei hauptsächlich einer Th1-vermittelten Immunantwort

(T-Helferzellen Typ 1), mit IFN-γ als vorherrschendes Zytokin [70].

2.2 Wechselwirkung zwischen dem Immunsystem und C. pneumoniae

Eine Th1-vermittelte Immunantwort spielt eine entscheidende Rolle bei der

Kontrolle einer C. pneumoniae-Infektion [92]. Die Ausbildung einer Th1-Antwort

kann über die proinflammatorischen Zytokine Interleukin-12 (IL-12), welches von

Makrophagen und IL-18, welches von Epithelzellen nach Kontakt mit

C. pneumoniae sekretiert wird, erfolgen [20;67]. Die frühe Sekretion von IFN-γ

durch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) ist dabei ebenfalls von Bedeutung [111].

Die Aktivierung des angeborenen Immunsystems erfolgt über spezielle pattern

Einleitung 16

recognition receptors (PRR), die hoch-konservierte Strukturen von C. pneumoniae,

welche als pathogen-associated molecular patterns (PAMP) bezeichnet werden,

erkennt. Der Toll-like Rezeptor-4 (TLR-4) ist ein PRR und erkennt z.B. chlamydiales

Lipopolysaccharid (LPS) [20]. In Rauchern mit COPD ist gerade die Expression von

TLR-4 reduziert, wodurch die Th1-vermittelte Immunantwort nach Infektion von

Gram-negativen Bakterien beeinträchtigt ist [60].

Droemann et al. konnten eine erhöhte Entzündung während einer akuten

C. pneumoniae Infektion, nicht in Lungengewebe von COPD Patienten mit

vermutlich persistierender Infektion nachweisen. Daher wird vermutet, dass Zyklen

von Persistenz und Reaktivierungen in die aktive Form nötig sind, um zur

Pathogenese beizutragen [27]. Mediatoren, die zu einer Reaktivierung in vivo führen,

sind jedoch bisher unbekannt. Das vorherrschende Zytokin während einer

Th1-vermittelten Immunantwort ist IFN-γ, welches durch CD4+/CD8+ T-Helferzellen

und NK-Zellen ausgeschüttet wird [95].

2.2.1 Typ II Interferon vermittelte Jak-STAT Signalkaskade

IFN-γ ist der einzige Vertreter der Typ II Interferone, welche die Jak-STAT

Signalkaskade aktivieren (Abbildung 2.4). Auch Typ I und Typ III Interferone

aktivieren diese Signalkaskade [109]. Die Signaltransduktion erfolgt jedoch über

andere Rezeptoren und wird in dieser Arbeit nicht weiter behandelt. IFN-γ bindet an

den inaktiven IFN-γ Rezeptor-Komplex (IFNGR), der aus den Untereinheiten

IFNGR1 und IFNGR2 besteht. Diese Untereinheiten sind mit der Januskinase 1

(Jak1) und Jak2 konstitutiv assoziiert [109]. Die Bindung von IFN-γ führt zu

Konformationsänderungen des IFNGR. Dadurch rücken Jak1 und Jak2 in enge

Beziehung und phosphorylieren spezifische Tyrosinreste des Rezeptors. Die Tyrosin-

Phosphorylierung der Jaks werden von dem signal transducer and activator of

transcription 1 (STAT1) über seine Src-homology 2-Domäne (SH2-Domäne)

gebunden, wodurch STAT1 am Tyrosin 701 durch eine Jak-abhängige Reaktion

phosphoryliert wird. Phosphoryliertes STAT1 dissoziiert vom Rezeptorkomplex und

bildet, durch reziproke Bindung der SH-2 Domäne mit der Tyrosin-

Phosphorylierung, ein Dimer [101]. Das Homodimer transloziert in den Nukleus und

bindet dort an eine spezifische DNA-Erkennungssequenz, die IFN-γ aktivierte

Sequenz (GAS) und initiiert damit die Expression der entsprechenden Gene [22].

Eine Phosphorylierung am Serin 727 von STAT1 trägt zu einer vollständigen

Einleitung 17

Transkriptionsaktivität des Transkriptionsfaktors bei [118]. Um eine unkontrollierte

Aktivität der Jak-STAT Signalkaskade zu verhindern, wird diese über SHP

(SH2 containing phosphatase), PIAS (protein inhibitors of activated STATs) und

SOCS (suppressor of cytokine signaling) kontrolliert. SHP und PIAS sind konstitutiv

exprimierte Proteine, wohingegen SOCS-Proteine erst über die Jak-STAT

Signalkaskade aktiviert werden [123]. Daneben wird auch die Expression von IDO

über die Jak-STAT Signalkaskade induziert, die einen Einfluss auf das Wachstum

von C. pneumoniae hat (Abschnitt 2.2.2).

Abbildung 2.4: Vereinfachte Darstellung der Jak-STAT Signalkaskade. Durch Bindung von IFN-γ an den IFN-γ Rezeptorkomplex (IFNGR) vermitteln die am Rezeptor assoziierten Jaks (Januskinasen) eine Tyrosin-Phosphorylierung des Rezeptors. STATs (Signal transducer and activator of transcription) erkennen die Phosphorylierung, binden IFNGR, woraufhin STAT phosphoryliert wird. STATs dissoziieren vom Rezeptor, bilden Homodimere und translozieren in den Nukleus, wo sie an GAS-Elemente (IFN-γ activated sequences) binden und die Transkription IFN-γ-abhängiger Gene initiieren. IDO: Indolamin 2,3-Dioxygenase, IRF-1: IFN regulierter Faktor-1. Abbildung modifiziert nach [101].

2.2.2 Indolamin 2,3-Dioxygenase

IDO ist ein ca. 45 kDA großes Protein und wird von einem ca. 15 kbp großen Gen

mit 10 Exons kodiert [59]. In der Promotorregion des Gens befindet sich ein

GAS-Element, wodurch die Expression durch IFN-γ über die Jak-STAT

Signalkaskade aktiviert wird [18]. Daneben befinden sich noch weitere Sequenzen

wie ein Homolog des IFN-stimulated response element (ISRE) in der

Promotorregion. ISRE-Sequenzen können zu einem geringen Maße direkt über die

IFN-γ induzierte Jak-STAT Signalkaskade aktiviert werden oder sekundär über den

Einleitung 18

Interferon regulierten Faktor-1 (IRF-1), welcher seinerseits ebenfalls über die IFN-γ

induzierte Jak-STAT Signalkaskade aktiviert wird [109]. Auch Typ I Interferone

induzieren Gene mit einer ISRE-Sequenz, wohingegen GAS-Elemente nur selten

aktiviert werden. Deshalb wird IDO nur schwach durch Typ I Interferone induziert,

da beide Sequenzen (GAS, ISRE) zur vollständigen Induktion der Expression

benötigt werden [18;59].

Nach der Translation liegt IDO als Apoenzym vor und benötigt für seine

Aktivität Häm als prosthetische Gruppe. Für die weitere Aktivierung wird die

Reduktion von Eisen (III) zu Eisen (II) benötigt, damit Tryptophan und Sauerstoff

das aktive Zentrum erreichen können. Dieses aktive Holoenzym ist das erste und

geschwindigkeitsbestimmende Enzym des Kynurenin-Stoffwechselwegs. Dabei wird

Tryptophan durch Spaltung des Indolrings zu N-Formylkynurenin oxidiert, aus

welchem im weiteren Verlauf L-Kynurenin entsteht [59]. IDO ist nicht

gewebsspezifisch und akzeptiert neben L-Tryptophan auch andere Indolamine [59].

IDO wirkt antimikrobiell gegen Tryptophan auxotrophe Pathogene, wie z.B.

Toxoplasma gondii, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis und

Staphylococcus aureus, da ihnen Tryptophan für viele metabolische Prozesse nicht

mehr zur Verfügung steht [68;69;90;102]. Auch das Wachstum von Chlamydien

wird durch die Aktivität von IDO beeinflusst. Dabei ist der Tryptophanabbau ein

zentraler Mechanismus der Persistenzinduktion von Chlamydien durch IFN-γ [78].

Bisherige Untersuchungen zur Jak-STAT Signalkaskade und IDO-Aktivität

sowie dessen antichlamydialer Wirkung beschränkten sich bislang auf

Untersuchungen unter atmosphärischen Sauerstoffbedingungen. Analysen zu deren

Funktionen und den Einfluss auf C. pneumoniae unter physiologischen (5-20% O2)

oder pathophysiologischen Sauerstoffverhältnissen (<5% O2) wurden bisher nicht

durchgeführt.

Einleitung 19

2.3 Hypoxie

2.3.1 Bedeutung von Sauerstoff in der Zelle

Der Sauerstoffpartialdruck im Gewebe ist niedriger als der in der atmosphärischen

Luft (Normoxie) und variiert von 4-110 mmHg (0,5-14%) (Tabelle 2.1). Eine

zusätzliche Reduzierung der Sauerstoffkonzentration kann z.B. durch gestörte

Gefäßnetze, eine verminderte Blutversorgung oder eine unzureichende

Neovaskularisierung auftreten. Diese kommen vor allem in Tumoren, ischämischen

Geweben, Wunden oder bei Entzündungsprozessen vor [14]. Bei diesen

pathophysiologischen Sauerstoffkonzentrationen übersteigt der Sauerstoffbedarf der

Zelle das Sauerstoffangebot [82]. In Zellkulturexperimenten werden im Allgemeinen

Sauerstoffkonzentrationen von 0,5-3% mit dem Begriff Hypoxie beschrieben [82].

Tabelle 2.1: Extrazelluläre Sauerstoffkonzentrationen in verschiedenen Geweben. Modifiziert nach [17;24;56].

Gewebe O2 [mmHg] O2 [%]

Luft 160 21,1

Brutschrank 151 20

Luft der Alveolen 110 14,5

Arterielles Blut 100 13,2

Bindehaut 58 7,7

Lunge 42,8 5,6

Venöses Blut 40 5,3

Herzmuskel 34 4,5

Gebärmutterhals 13-48 1,7-6,3

Vagina 3,8 0,5

Sauerstoff wird von aeroben Organismen zur Energiegewinnung benötigt. Um das

Überleben bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen zu sichern, haben Zellen

Regulationsmechanismen, die Einfluss auf die Homöostase nehmen, entwickelt. Der

wichtigste Regulator ist dabei der Hypoxie-induzierbare Faktor-1 (HIF-1).

Einleitung 20

2.3.2 Hypoxie-induzierbarer Faktor-1 (HIF-1)

Der Transkriptionsfaktor HIF-1 reguliert, wenn geringe Sauerstoffverhältnisse

vorliegen, eine Vielzahl von zellulären Prozessen von eukaryotischen Zellen

(Abbildung 2.5). HIF-1 besteht aus einer α- und β-Untereinheit, die konstitutiv

exprimiert werden. Während HIF-1β stabil im Zellkern vorliegt, unterliegt HIF-1α

unter Normoxie einem ständigen Abbau. Dabei wird HIF-1α durch eisen- und

sauerstoffabhängige Prolyl-Hydroxylasen (PHD) im Zytoplasma der Zelle

hydroxyliert. Über die Hydroxylierung interagiert das von Hippel-Lindau (VHL)

Protein mit HIF-1α, welches durch eine Polyubiquitinierung HIF-1α für die

Degradation durch das Proteasom markiert. Durch Substratmangel (O2) unter

Hypoxie wird die Prolyl-Hydroxylierung verhindert und HIF-1α transloziert in den

Nukleus, wo es mit HIF-1β dimerisiert. Dieses Heterodimer bindet an das hypoxia

responsive element (HRE) in den Promoterregionen von HIF-1 regulierten Genen

[82]. Eine Vielzahl von Prozessen, wie z.B. die Glykolyse, Angiogenese und das

Zellüberleben werden von HIF-1 reguliert [103].

Eine HIF-1α Stabilisierung innerhalb der Zelle erfolgt jedoch nicht nur aufgrund

von geringen Sauerstoffkonzentration, sondern kann auch durch eine Reihe anderer

Einflussfaktoren (z.B. Eisenentzug, LPS) unter Normoxie erreicht werden [34;44].

So ist außerdem bekannt, dass bakterielle Infektionen wozu auch Infektionen mit

C. pneumoniae gehören, HIF-1α stabilisieren [97;119].

Einleitung 21

Abbildung 2.5: Vereinfachte Darstellung der HIF-1α Stabilisierung durch Hypoxie. (A) In der Anwesenheit von Sauerstoff wird HIF-1α durch sauerstoffabhängige Prolyl-Hydroxylasen (PHD) hydroxyliert. Dies führt zur Rekrutierung des von Hippel-Lindau Proteins (VHL), welches HIF-1α durch Polyubiquitynierung zur Degradation durch das Proteasom markiert. (B) Unter hypoxischen Bedingungen sind die PHD inaktiv und HIF-1α gelangt in den Nukleus, wo es mit HIF-1β einen Komplex bildet. Durch Bindung an HRE-Sequenzen (hypoxia responsive element) in Promotorregionen von HIF-1 regulierten Genen werden diese transkribiert. GLUT: Glukosetransporter, LDHA: Laktatdehydrogenase A, PDK: Pyruvatdehydrogenase Kinase, VEGF: vascular endothelial growth factor.

2.3.3 C. pneumoniae-Infektionen unter Hypoxie

Die Interaktion von C. pneumoniae mit HIF-1α unterscheidet sich zwischen der

frühen und späten Phase des Entwicklungszyklus. In der frühen Phase einer

C. pneumoniae-Infektion wird HIF-1α unter Normoxie und Hypoxie stabilisiert.

Ohne eine HIF-1α Stabilisierung unter Hypoxie wäre eine hohe Infektionsrate nicht

möglich [97]. Neben einer erhöhten Infektionsrate weist C. pneumoniae unter

Hypoxie zudem größere Einschlusskörper und ein schnelleres Wachstum auf, woraus

eine höhere Wiederanzuchtsrate resultiert [56]. Eine Stabilisierung von HIF-1α wird

Einleitung 22

in der späten Phase der Infektion hingegen verhindert. Dabei wird HIF-1α durch die

chlamydiale Protease CPAF (chlamydial protease-like activity factor) degradiert.

Dies kommt dem Entwicklungszyklus von C. pneumoniae zugute, da Hypoxie über

die Aktivierung von HIF-1 den programmierten Zelltod initiieren kann. Durch einen

Abbau von HIF-1α in der späten Phase der Infektion unter Hypoxie unterbindet

C. pneumoniae somit aktiv die Apoptose, um den Entwicklungszyklus abzuschließen

[97]. Weitere Untersuchungen, wie z.B. zur IFN-γ induzierten Persistenz von

C. pneumoniae unter Hypoxie, wurden bislang nicht durchgeführt.

2.4 Fragestellung In dieser Arbeit sollten direkte Interaktionen zwischen C. pneumoniae und

Lungenepithelzellen in der Entstehung der COPD analysiert werden. Hauptmerkmale

einer COPD sind chronisch-rezidivierende Entzündungsprozesse und fortschreitende

Umbauvorgänge des Lungenepithels. Zu berücksichtigen ist dabei, dass bei

chronischen Entzündungsprozessen ein verminderter Sauerstoffgehalt im Gewebe

vorliegt, was das Wachstum von C. pneumoniae begünstigt. Untersuchungen zur

Persistenz von C. pneumoniae unter verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen

wurden bislang nicht durchgeführt.

Daher waren folgende Ziele Grundlage dieser Arbeit:

Der Einfluss von Hypoxie auf die IFN-γ induzierte Persistenz von

C. pneumoniae sollte morphologisch charakterisiert sowie Änderungen in

der für die Persistenz relevanten Jak-STAT Signalkaskade näher analysiert

werden.

Ein Langzeit-Modell der Persistenz von C. pneumoniae sollte entwickelt

werden und bezüglich des Wachstumsverhaltens von C. pneumoniae unter

Hypoxie analysiert werden. Weiterhin sollte dieses Modell der Untersuchung

von chronischen Entzündungsprozessen dienen.

Es sollte untersucht werden, ob zelluläre Umbauprozesse durch eine

C. pneumoniae-Infektion von Lungenepithel ausgelöst werden und ob die

Sauerstoffumgebung einen Einfluss auf diese ausübt.

Um ein umfassenderes Verständnis über eine C. pneumoniae-Infektion bei

niedrigen Sauerstoffverhältnissen zu bekommen, sollten Metabolom- und

Transkriptom Analysen etabliert werden.

Material 23

3 Material

3.1 Geräte

Blotapparatur Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Brutschränke (37°C, 5% CO2)

Forma Series II 3131 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA

Typ: BB 6220 Heraeus Instruments GmbH, Hanau

Brutschränke (37°C, 5% CO2, N2- Regulation, O2-Sensor)

Forma Series II 3141 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA

Hypoxiekammer THC08 124 Toepffer Lab Systems, Göppingen

Elektrophoresekammer Mini-Protean Tetra

Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Gewebehomogenisator Precellys 24 Bertin Technologies, Villeurbanne, Frankreich

Heizblock PCH-2 Grants-Instruments Ltd, Shepreth, Großbritannien

Imagingsystem Fusion FX7 Vilber Lourmat GmbH, Eberhardzell

Kamera AxioCam HRc Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen

LightCycler 1.0 Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Magnetrührer, RMO Gerhardt GmbH, Königswinter

Mikroskope

Axioskop 2, 25, 40 Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen

Axiovert 25 Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen

BZ-9000 Keyence, Osaka, Japan

NanoDrop 2000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA

pH-Meter MP220 Mettler Toledo, Gießen

Pippetierhilfe accu-jet Brand GmbH, Wertheim

PowerPac 3000 Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Material 24

Präzisionswaage KB Kern & Sohn GmbH, Balingen-Frommen

Sicherheitswerkbänke

EN 12469 Clean Air Techniek B.V., Woerden, Niederlande

SterilGard Hood Class II A/B3 Baker Company, Sanford, ME, USA

Taumelschüttler Polymax 1040 Heidolph Instruments GmbH, Schwalbach

Thermocycler C1000 Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Ultraschallbad Transsonic 460/H Elma GmbH & Co KG, Singen

Vortex-Schüttler REAX 2000 Heidolph Instruments GmbH, Schwalbach

Zentrifugen

Centrifuge 5417R Eppendorf AG, Hamburg

Megafuge 2.0 R Heraeus Instruments GmbH, Hanau

Multifuge 3 S-R Heraeus Instruments GmbH, Hanau

Rotina 38R Hettich Zentrifugen, Tuttlingen

Optima L-90K Beckmann Coulter, Brea, CA, USA

3.2 Verbrauchsmaterialien

6-, 24-Lochplatte Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Blotpapier Schleicher & Schuell, Dassel

Deckgläser, Ø10 mm Menzel-Gläser, Braunschweig

Gelkämme: Mini Protean 3 (1,0 mm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Glasplatten: Mini Protean 3 (1,0 mm) Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Glasschrot Karl Hecht GmbH & Co KG, Sondheim

Kryoröhrchen Nalgene Cryoware Nunc Brand Products, Rochester, NY, USA

LightCycler Kapillaren (20 µl) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Neubauer-Zählkammer Hassa Laborbedarf, Lübeck

Nitrocellulosemembran Protran Whatman Inc, Florham Park, NJ, USA

Material 25

Objektträger (76 x 26 mm) Menzel-Gläser, Braunschweig

Pipetten Eppendorf Reference 10, 100, 1000 µl

Eppendorf AG, Hamburg

Pipettenspitzen Biosphere filter tips 10, 100, 1000 µl

Sarstedt AG & Co, Nümbrecht

Pipettenspitzen, Prot/Elec tips 1-200 µl Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Precellys-Keramik-Kit 1,4/2,8 mm PEQLAB Biotechnologie GMBH, Erlangen

Reaktionsgefäße (0,5/ 1,5 ml) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht

Röhrchen (12, 15, 50 ml) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht

Transferpipetten (5, 10, 25 ml) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht

Zellkulturflaschen Cellstar Filter Top (175 cm2)

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen

Zellkulturschalen (9,6 cm2) Sarstedt AG & Co, Nümbrecht

Zellschaber TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz

3.3 Chemikalien und Reagenzien

1,4-Dithiothreitol (DTT) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Acrylamid-Bis (40%) Lösung, 19:1 Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Bambanker-Kryokonservierungsmittel Wako Chemicals GmbH, Neuss

Bromphenolblau Serva Elecrophoresis GmbH, Heidelberg

Cycloheximid Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Dinatriumhydrogenphosphat (Na2HPO4 x 12 H2O)

Merck KGaA, Darmstadt

Ethanol, absolute Merck KGaA, Darmstadt

Glycerol Merck KGaA, Darmstadt

Glycin Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Material 26

HRP-Substrat

Immobilon Western Millipore, Billerica, MA, USA

Super Signal West Femto Thermo Fisher Scientific, Waltham, MS, USA

Kaliumchlorid (KCl) Merck KGaA, Darmstadt

Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4) Merck KGaA, Darmstadt

L-Glutamin (10 mg/ml) PAA Laboratories GmbH, Cölbe Lipofectamin 2000 Invitrogen, Darmstadt

Methanol Merck KGaA, Darmstadt

Methanol LC-MS Chromasolv Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylendiamin (TEMED)

Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Natriumchlorid (NaCl) Merck KGaA, Darmstadt

Natriumhydogenphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 x H2O)

Merck KGaA, Darmstadt

PCR Nukleotid Mix (dNTP) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Prestained Protein Marker, Broad Range New England Biolabs, Ipswich, MA, USA

Rekombinantes humanes IFN-γ PeproTech GmbH, Hamburg

Saccharose Merck KGaA, Darmstadt

Sodiumdodecylsulfat (SDS) Merck KGaA, Darmstadt

TGF-β Inhibitor, SB-431542 Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis MO, USA

Titriplex III (EDTA) Merck KGaA, Darmstadt

Tris (hydroxymethyl)-aminomethan Bio-Rad Laboratories GmbH, München

Tris-HCl Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Trockenmilchpulver Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Trypanblau (0,4%) Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

Trypsin-EDTA (1x) PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Material 27

Tween-20 Serva Elecrophoresis GmbH, Heidelberg

β-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, MO, USA

3.4 Puffer und Lösungen

Blockpuffer (5%) 5 g Trockenmilchpulver, 100 ml T-TBS Puffer

Blotpuffer 3 g Tris, 14,4 g Glycin, 200 ml Methanol, ad 1 l A. dest.

Cycloheximid, Stammlösung 1 g Cycloheximid, ad 1 ml A. dest.

Elektrophoresepuffer (5x) 15 g Tris, 72 g Glycin, 5 g SDS, ad 1 l A. dest., pH8,3

Lysispuffer (Western-Blot) 3,94 g Tris HCl, 40 ml Glycerol, 8 g SDS, 20 ml DTT (1 M), Bromphenolblau, ad 200 ml A. dest., pH 7,8

PBS-Puffer 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na2HPO4 12xH2O, 2 g KH2PO4, ad 1 l A. dest., pH 7,2

Sammelgelpuffer 30 g Tris, ad 500 ml A. dest. pH 6,8

SPG-Puffer 75 g Saccharose, 2,47 g Na2HPO4, 0,36 g NaH2PO4, 0,72 g L-Glutaminsäure, ad 1 l A. dest., pH 7,3

TBS-Puffer (10x) 24,2 g Tris, 80 g NaCl, ad 1 l A. dest., pH 7,6

Trenngelpuffer 90,5 g Tris, ad 500 ml A. dest., pH 8,8

T-TBS Puffer 100 ml TBS-Puffer (10x), 1 ml Tween-20, ad 1 l A. dest.

3.5 Zelllinien Tabelle 3.1: In dieser Arbeit verwendete Zelllinien

Name Ursprung Nummer Vertrieb

A549 Lungenkarzinom ACC 107 DSMZ, Braunschweig

HEp-2 Epidermoides Larynxkarzinom CCL-23 ATCC, Manassas, USA

Material 28

3.6 Medien und Medienzusätze Sofern nicht anders angegeben, stammen die hier aufgeführten Medien und -zusätze

von der Fa. PAA Laboratories GmbH, Cölbe

Dauerkulturmedium DMEM mit Glucose (4,5 g/l) und L-Glutamin, versetzt mit 10% FKS, 20 µg/ml Gentamycin, 33,2 mM HEPES-Puffer

Transfektionsmedium Opti-MEM I (Invitrogen, Darmstadt)

Versuchsmedium 1 RPMI 1640 ohne L-Glutamin, versetzt mit 5% FKS, 0,1 mg/ml L-Glutamin, 1x NEAA

Versuchsmedium 2 RPMI 1640 ohne L-Glutamin, versetzt mit 0,1 mg/ml L-Glutamin, 1x NEAA

3.7 Enzyme und Kits

IMAGEN Chlamydia Kit Oxoid, Cambridgeshire, Großbritannien

LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I

Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

MICROBEnriche Kit Ambion, Austin, TX, USA

MICROBExpress Kit Ambion, Austin, TX, USA

Mykoplasmen-Test, Venor GeM Minerva Biolab, Berlin

NucleoSpin RNA II Macherey Nagel GmbH & Co. KG, Düren

Reverse Transkriptase, RevertAid Premium

Fermentas, St. Leon-Rot

Reverse Transkriptase, Transcriptor Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

RNase-Inhibitor, Protector Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

RNase-Inhibitor, RiboLock Fermentas, St. Leon-Rot

3.8 Oligonukleotide

3.8.1 Primer für die cDNA Synthese

Die Random Hexamer Primer p(dN)6 zur cDNA Synthese wurden von der Fa. Roche

Diagnostics GmbH, Mannheim bezogen

Material 29

3.8.2 Primer für die quantitative RT-PCR

Alle Primer wurden als Lyophilisat von der Fa. TIB MOLBIOL, Berlin bezogen.

Nach Herstellerangaben wurden diese zu einer Arbeitskonzentration von 20 µM mit

RNase-freiem H2O gelöst.

Tabelle 3.2: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für humane Sequenzen

Primerpaar Sequenz 5‘>3‘

IDO Forward GCGCTGTTGGAAATAGCTTC Reverse TTTGGGTCTTCCCAGAACC

18S rRNA Forward TCAAGAACGAAAGTCGGAGG Reverse GGACATCTAAGGGCATCACA

SOCS1 Forward TTTTTCGCCCTTAGCGTGAA Reverse GCCATCCAGGTGAAAGCG

SOCS3 Forward GAAGATCCCCCTGGTGTTGA Reverse TCCCGACAGAGATGCTGAAGA

IP10 Forward AGGAACCTCCAGTCTCAGCA Reverse CAAAATTGGCTTGCAGGAAT

Tabelle 3.3: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für chlamydiale Sequenzen


AhpC Forward AGGAAGCCCCTGATTTTGTT Reverse CAATGTCATCCACGGAACAG

AspC Forward ACCTCCCGCCATCTCTTTAT Reverse GTCAGAGCGGAGAAACGAAC

AtpE Forward CGAATCTTAATGCCGATGGT Reverse CCTGCTTGGCTTAGAGCAAC

DnaK Forward CCTGCGGTTACCATCGTAGT Reverse GAAGTCCTGAGCTTGCTTCG

Euo Forward TCCCTTACGCTCTCCTCGTA Reverse GACGCGCTGGGAAATAGATA

IncA Forward TTGTTCTGCGCTACGTCAAG Reverse TTGTTGGTGGAGGTGTTTCA

Material 30


IncB Forward AGCCGCAGCCCTAATCTTAT Reverse CCGCAAGCAGCAATAATACA

IncC Forward AGCTGTGCTTGGATTTACGG Reverse TTGTTCTGCGCTACGTCAAG

Pyk Forward AGCTTGCGGATGGAATTATG Reverse ATGCAGTTTCCCCTGACAAC

RpoA Forward TGATCTGGGTTAACGGCTTC Reverse GCAATCGAAGGGGTTATTGA

Tal Forward TAGTTTGGGGAATCCGACAG Reverse TCCTCCCATAGCTTCGAAAA

Tuf Forward ACTACGCTAACAGCGGCAAT Reverse CGGCGCCTGTAATCATATTT

TyrB Forward ATAAGCGTCCCGAAAAGGTT Reverse AAAAACCAGCTCACGCATCT

3.8.3 siRNA für RNA-Interferenz Analysen

Die im Folgenden aufgeführten siRNAs der Fa. Invitrogen, Darmstadt wurden für

RNA-Interferenz Experimente verwendet. Das Lyophilisat wurde mit DEPC-Wasser

zu einer Arbeitskonzentration von 20 µM gelöst. Für Kontroll-Experimente wurde

die stealth RNAi negativ control mit niedrigem GC-Gehalt (Invitrogen, Darmstadt)

verwendet.

Tabelle 3.4: In dieser Arbeit verwendete siRNAs

siRNA (RNA)-Sequenz 5‘>3‘

HIF-1α Stealth RNAi CCAGCCGCUGGAGACACAAUCAUAU

AUAUGAUUGUGUCUCCAGCGGCUGG

Material 31

3.9 Antikörper

3.9.1 Antikörper für Western Blot Analysen

Tabelle 3.5: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für Western Blot Analysen

Name Herkunft Hersteller Klonalität Verdünnung

Anti-β-Aktin Kaninchen Cell Signaling Technology, MA, USA

polyklon 1:2000

Anti-CPAF Kaninchen Aus dem Institut für Biochemie, Universität zu Lübeck

polyklon 1:1000

Anti-E-Cadherin Maus BD Bioscience, Heidelberg

monoklon 1:2000

Anti-HIF-1α Maus BD Bioscience, Heidelberg

monoklon 1:500

Anti-IDO Maus Chemicon, MA,USA monoklon 1:1000

Anti-phospho-STAT1 (Tyr701)

Kaninchen Cell Signaling Technology, MA, USA

polyklon 1:1000

Anti-phospho-STAT1 (Ser727)

Kaninchen Cell Signaling Technology, MA, USA

polyklon 1:1000

Tabelle 3.6: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für Western Blot Analysen


Anti-Kaninchen, HRP konjugiert

Ziege Cell Signaling Technology, MA, USA

polyklon 1:4000

Anti-Maus, HRP konjugiert

Pferd Cell Signaling Technology, MA, USA

polyklon 1:4000

Material 32

3.9.2 Antikörper für Immunfluoreszenzfärbungen

Tabelle 3.7: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für Immunfluoreszenzfärbungen

Tabelle 3.8: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für Immunfluoreszenzfärbungen


Anti-Kaninchen, FITC konjugiert

Ziege Invitrogen, Darmstadt polyklon 1:100

Anti-Maus, DyLight549 konjugiert

Esel Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA

polyklon 1:100

Anti-Maus, FITC konjugiert

Kaninchen Dako Deutschland GmbH, Hamburg

polyklon 1:250

3.10 Software

Adobe Photoshop CS2 Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA

AxioVision Rel. 4.5 Carl Zeiss MikroImaging, Göttingen

Bio1D Vilber Lourmat GmbH, Eberhardzell

BZ Analyzer Software Keyence, Osaka, Japan

Image J National Institutes of Health, USA

LightCycler Data Analysis Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Microsoft Office 2007 Microsoft Cooperation, Redmond, USA


Anti-Chlamydien-LPS

Maus Prof. H. Brade, FZ Borstel

polyklon 1:50

Anti-α-SMA Maus Sigma-Aldrich, MO, USA

monoklon 1:400

Anti-IncA Kaninchen Eurogentec, Köln polyklon 1:3000

Methoden 33

4 Methoden

4.1 Zellkultur

4.1.1 Kultivierung von Zelllinien

Die in dieser Arbeit verwendeten Zelllinien sind epitheliale Adhäsionszellen. Die

Kultivierung erfolgte mit Dauerkulturmedium in 175 cm2 Zellkulturflaschen im

Inkubator bei 37°C und 5% CO2. Die Zellen wurden alle 3-4 Tage mit Hilfe von

Trypsin/EDTA von der Zellkulturflasche gelöst. Danach wurden die Zellen entweder

in einem Verhältnis von 1:8 - 1:10 auf eine neue Zellkulturflasche verteilt oder die

Zellzahl wurde bestimmt (Abschnitt 4.1.2). Folgende Zellzahlen wurden in die

Versuchsbedingungen eingesetzt:

Tabelle 4.1: Zellkulturbedingungen in den durchgeführten Versuchen

Versuche Zellkulturplatte Zellen Volumen Medium

Persistenz-versuche

6-Loch 2,5x105 HEp-2/A549

5 ml Versuchsmedium 1

Wieder-anzucht

24-Loch 3x105 HEp-2 1 ml Dauerkultur-medium

Transfektions-experimente

6-Loch 2,5x105 A549 2 ml Versuchsmedium 2

Live-Cell Imaging

9,6 cm2 Zellkulturschale

2x105 A549 2 ml Versuchsmedium 1

Metabolom- Analysen

6-Loch 2,5x105 HEp-2 5 ml Versuchsmedium 1 (7 h), Wechsel auf Versuchsmedium 2

Transkriptom- Analysen

6-Loch 2,5x105 HEp-2 5 ml Versuchsmedium 1

Zur Induktion der Persistenz wurde zu den ausgesäten Zellen 10 U/ml IFN-γ

gegeben. Die Zellen wurden im Inkubator ohne Sauerstoffregulation (im weiteren

Verlauf Normoxie genannt) oder in einer Hypoxiekammer mit eingestellter

Sauerstoffkonzentration von 2% (im weiteren Verlauf Hypoxie genannt) bis zur

Infektion (Abschnitt 4.3.2) für 24 h inkubiert. Optional wurde, bei

Methoden 34

Sauerstoffkonzentrationen abweichend von 2%, ein Brutschrank mit

Sauerstoffregulation genutzt.

Wöchentlich wurden die Zellkulturen mittels PCR auf eine mögliche

Mykoplasmenkontamination getestet.

4.1.2 Bestimmung der Zellzahl

Um die Zellzahl zu bestimmen, wurden 10 µl Zellsuspension mit 80 µl PBS-Puffer

und 10 µl Trypanblau verdünnt. 10 µl dieser 1:10 Verdünnung wurden in eine

Neubauer-Zählkammer mit einer Tiefe von 0,1 mm pipettiert. 4 Großquadrate

wurden bei 10-facher Vergrößerung ausgezählt. Intakte Zellen wiesen dabei keine

Färbung auf, wohingegen tote Zellen blau erschienen, da der saure Farbstoff

Trypanblau durch die Zellmembran von abgestorbenen Zellen diffundiert. Die

Formel zur Berechnung der Zellzahl lautet:

푍푒푙푙푒푛 푚푙⁄ =푔푒푧äℎ푙푡푒 푍푒푙푙푧푎ℎ푙 ∗ 푉푒푟푑ü푛푛푢푛푔푠푓푎푘푡표푟 ∗ 푉표푙푢푚푒푛 ∗ 10

퐴푛푧푎ℎ푙 푔푒푧äℎ푙푡푒푟 퐺푟표ß푞푢푎푑푟푎푡푒

4.1.3 Konservierung von Zelllinien

Die Zellen einer vollbewachsenen Zellkulturflasche wurden mittels einer

Trypsin/EDTA-Lösung gelöst und bei 200 x g für 5 min zentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen. Das Zellpellet wurde in 1 ml Bambanker-

Kryokonservierungsmittel aufgenommen und in einer Styropor-Schachtel bei -80°C

bis zum nächsten Tag eingefroren. Danach wurden die Zellen in Stickstoff gelagert.

Zum Auftauen der Zellen wurde ein 37°C warmes Wasserbad verwendet. Da

DMSO in der Suspension enthalten ist, wurde dieses mit 10 ml warmen

Dauerkulturmedium verdünnt. Die Zellen wurden bei 200 x g für 5 min zentrifugiert

und das Medium verworfen. Die Zellen wurden in frisches Dauerkulturmedium auf

eine neue Zellkulturflasche verteilt.

Methoden 35

4.2 Präparation von humanem Lungengewebe Das verwendete humane Lungengewebe stammte von Patienten, bei denen im

Rahmen einer Lungenresektion Gewebe entnommen wurde (Klinik für Chirurgie des

UK-SH, Campus Lübeck, Prof. Dr. med. P. Kujath und Mitarbeiter). Vor der

Operation stimmten die Patienten einer Nutzung des Gewebes, welches für die

pathologische Begutachtung nicht benötigt wurde, zu. Ein Ethikantrag der Sektion

Medizin der Universität zu Lübeck (Az 08-131) zur Nutzung des Lungengewebes

liegt vor.

Tumorfreies Gewebe wurde vom Institut für Pathologie ausgewählt und bis zur

Verarbeitung bei 4°C gelagert. Unter sterilen Bedingungen wurden 25-30 mg große

Stücke mit Hilfe einer chirurgischen Schere zugeschnitten. Jeweils ein Stück wurde

in einem Loch einer 24-Lochplatte mit 1 ml Versuchsmedium 1 inkubiert. Direkt im

Anschluss erfolgte die Infektion (Abschnitt 4.3.3).

4.3 Infektionsbiologische Methoden

4.3.1 Herstellung eines Infektionsstocks von C. pneumoniae

Zwölf 6-Lochplatten mit je 8x105 HEp-2 Zellen pro Loch wurden ausgesät. Nach

24 h Inkubation bei Normoxie wurde das Medium verworfen und 2 ml

Dauerkulturmedium, versetzt mit 1 µg/ml Cycloheximid, zugegeben. Die Zellen

wurden mit C. pneumoniae (10 IFUs/Zelle) durch Zentrifugation bei 700 x g und

30°C für 1 h infiziert und für 72 h bei Normoxie inkubiert. Die infizierten Zellen

wurden mit einem Zellschaber vom Plattenboden abgelöst und 10 min mit Glasschrot

auf einem Rüttler aufgeschlossen. Die Zellbestandteile wurden für 5 min bei 200 x g

und 4°C abzentrifugiert. Der Überstand, welcher die Chlamydien enthielt, wurde

weitere 90 min bei 15500 x g und 4°C zentrifugiert. Das entstandene Chlamydien-

Pellet wurde in 2 ml SPG-Puffer gelöst und in 20 µl Aliquots bei -80°C gelagert. Zur

Bestimmung des Chlamydien-Gehalts wurde eine 1:2 Verdünnungsreihe in mit

HEp-2 Zellen bewachsenen Löchern einer 24-Lochplatte durchgeführt und die

Chlamydien-Einschlüsse ausgezählt (Abschnitt 4.3.7).

Methoden 36

4.3.2 Infektion von Zelllinien mit C. pneumoniae

Das entsprechende Zellmedium wurde zur Infektion mit 0,1 µg/ml Cycloheximid

versetzt. Die dadurch erzielte Hemmung der Proteinsynthese der Zelle begünstigt die

Infektion mit C. pneumoniae. HEp-2 Zellen wurden für die Persistenzversuche mit

einer Infektionsdosis von 2 IFUs pro Zelle in Versuchsmedium 1 infiziert. Dies

entspricht einer Infektionsrate von ca. 20% unter Normoxie und 70-80% unter

Hypoxie. Für die Metabolom-Analysen wurden HEp-2 Zellen mit 5,6 IFUs pro Zelle

in Versuchsmedium 2 infiziert, was einer Infektionsrate unter Normoxie von 10%

und unter Hypoxie von 60-70% entspricht. Für die Transkriptom-Analysen wurden

die HEp-2 Zellen mit 20 IFUs pro Zelle in Versuchsmedium 1 infiziert, was einer

Infektionsrate von 50-70% unter Normoxie entspricht. A549 Zellen für Persistenz-

und Transfektionsexperimente wurden mit 3 IFUs pro Zelle in Versuchsmedium 1

infiziert. Dies entspricht einer Infektionsrate von 10% unter Normoxie und 60-70%

unter Hypoxie. Nach der Zugabe von C. pneumoniae in das Medium, folgte eine

Zentrifugation für 1 h (700 x g, 30°C). Anschließend wurden die Platten bei

Normoxie oder Hypoxie inkubiert. Nach einer Inkubation von 72 hpi, wurde das

Medium gewechselt.

4.3.3 Infektion von humanem Lungengewebe

Zu den Gewebestücken wurde 0,1 µg/ml Cycloheximid ins Versuchsmedium 1

gegeben. Auf ein Lungenstück wurden 1x106 IFUs pipettiert. Die Inkubation erfolgte

unter Normoxie oder Hypoxie für 24 h.

4.3.4 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Tryptophan

Das IFN-γ haltige Medium wurde 24 hpi unter Normoxie verworfen und frisches

Medium mit einem Tryptophangehalt von 10 µg/ml zugegeben. Danach wurden die

Zellen für weitere 48 h bei Normoxie inkubiert und anschließend der

Chlamydiengehalt durch Wiederanzucht bestimmt (Abschnitt 4.3.6).

Methoden 37

4.3.5 Reaktivierungs-Modell von C. pneumoniae durch Hypoxie

Die Persistenz von C. pneumoniae wurde mit 10 U/ml IFN-γ induziert

(Abschnitt 4.1.1). Die Persistenz wurde über 144 h unter Normoxie beibehalten. Für

Reaktivierungs-Versuche wurden die persistent infizierten Zellen nach 48 h in

Hypoxie überführt und für weitere 48 h und 96 h inkubiert. Zur Kontrolle wurden

persistent infizierte Zellen parallel weiter unter Normoxie inkubiert. Das Medium

wurde alle 3 Tage durch frisches Versuchsmedium 1, versetzt mit 10 U/ml IFN-γ,

ausgetauscht. Anschließend erfolgte eine Wiederanzucht von C. pneumoniae

(Abschnitt 4.3.6) oder RNA-Isolation (Abschnitt 4.6.1).

4.3.6 Wiederanzucht

Zu dem Medium der Zellen einer 24-Lochplatte (Abschnitt 4.1.1) wurde 1 µg/ml

Cycloheximid hinzupipettiert. Die infizierten Zellen, von denen die Wiederanzucht

erfolgen sollte, wurden im Medium mit Hilfe eines Zellschabers vom Boden der

Zellkulturplatte abgeschabt und suspendiert. 2 ml der Suspension wurden in ein

10 ml Röhrchen mit 1 ml Glasschrot überführt. Für 5 min wurden die Zellen auf

einem Rüttler aufgeschlossen und die Chlamydien freigesetzt. Mit 250 µl der

Suspension wurde ein Loch der 24-Lochplatte infiziert. Weitere 250 µl wurden aus

dem ersten Loch entnommen, um das nächste Loch zu infizieren. Dieses wurde über

6 Löcher fortgeführt und es entstand eine Verdünnungsreihe von 1:5. Anschließend

wurde die 24-Lochplatte 1 h (700 x g, 30°C) zentrifugiert. Nach einer Inkubation für

72 h unter Normoxie wurde das Medium von den Zellen abgenommen und die Zellen

mit Methanol bei -20°C fixiert. Die Chlamydien wurden mit dem indirekten

Immunfluoreszenztest (IFT) (Abschnitt 4.4.2) nachgewiesen und ausgezählt

(Abschnitt 4.3.7), um so die Wiederanzuchtsrate zu bestimmen.

Methoden 38

4.3.7 Quantifizierung des Chlamydien-Gehalts

Die Einschlüsse von Chlamydien wurden mit dem indirekten IFT (Abschnitt 4.4.2)

angefärbt und wie im Folgenden beschrieben ausgezählt. Zehn Gesichtsfelder eines

Loches der Verdünnungsreihe wurden am Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher

Vergrößerung ausgezählt. Dafür wurde das Loch indem die Einschlusskörper

vereinzelt vorlagen ausgewählt. Anhand der Verdünnungsreihe war bekannt, wie viel

µl der Chlamydien-Suspension eingesetzt wurden. Unter Einbeziehung der Größe

eines Gesichtsfelds (0,139 mm2) und der Fläche eines Lochs einer 24-Lochplatte

(200 mm2), ergibt sich folgende Formel zur Bestimmung des Chlamydien-Gehalts:

퐼퐹푈푠 µ푙⁄ =퐺푒푧äℎ푙푡푒 퐸푖푛푠푐ℎ푙ü푠푠푒 ∗ 200 푚푚

퐺푒푧äℎ푙푡푒 퐺푒푠푖푐ℎ푡푓푒푙푑푒푟 ∗ 퐸푖푛푔푒푠푒푡푧푡푒 µ푙 ∗ 0,139 푚푚

4.4 Mikroskopie

4.4.1 Direkter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae

Zur Bestimmung der Infektionsrate und zur Analyse der Morphologie von Zellen und

chlamydialen Einschlüssen wurde der direkte IFT genutzt. Hierfür wurden

Deckgläser, die mit Zellen bewachsen waren, in eine 24-Lochplatte überführt und

mit Methanol bei -20°C fixiert. Das Methanol wurde anschließend verworfen und die

Deckgläser bei 37°C getrocknet. Vor der Verwendung des IMAGEN Chlamydia Kits

wurde dem Antikörper 1 ml PBS-Puffer zugefügt. Die Zellen wurden mit 10 µl des

verdünnten Antikörpers gefärbt und bei 37°C inkubiert. Die Deckgläser wurden dann

mit PBS-Puffer gewaschen und mit einem Tropfen Mountain Fluid auf einem

Objektträger, mit der bewachsenen Seite nach unten, gelegt. Zur Fixierung der

Deckgläser wurde Nagellack verwendet. Die Präparate konnten im

Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden. Zelluläre Bestandteile wurden rot und

chlamydiale Einschlusskörper grün dargestellt.

Methoden 39

4.4.2 Indirekter Immunfluoreszenztest von C. pneumoniae

Der indirekte IFT wurde in einer 24-Lochplatte durchgeführt. Das Medium der

Zellen wurde verworfen und die Zellen mit Methanol bei -20°C fixiert. Anschließend

wurde das Methanol verworfen und die Zellen einmal mit PBS-Puffer gespült. Zu

den Zellen wurden 250 µl eines Anti-Chlamydien-LPS-Antikörpers gegeben und die

Zellen mit dem Antikörper für 45 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde der

Antikörper abgenommen und die Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Es

folgte eine weitere Inkubation mit dem entsprechenden FITC konjugierten

Sekundärantikörper für 30 min. Der Sekundärantikörper wurde verworfen und die

Zellen zweimal mit PBS-Puffer gewaschen. Am Fluoreszenzmikroskop konnte die

Infektionsrate bestimmt werden (Abschnitt 4.3.7).

4.4.3 Indirekte Immunfluoreszenzfärbung von α-smooth muscle actin

Mit Zellen bewachsene Deckgläser wurden entsprechend zum direkten IFT

(Abschnitt 4.4.1) fixiert und anschließend 3 x 2 min mit PBS + 0,1% Tween-20

gewaschen. Der Anti-α-smooth muscle actin (α-SMA) Antikörper und der Anti-IncA

Antikörper wurden in PBS-Puffer + 0,1% Tween-20 verdünnt. 250 µl dieser

Primärantikörper wurden auf ein Deckglas pipettiert und für 90 min bei RT auf

einem Taumelschüttler inkubiert. Anschließend wurden die Antikörper verworfen

und die Zellen 3 x 2 min mit PBS-Puffer + 0,1% Tween-20 gewaschen. Die

entsprechenden Sekundärantikörper wurden in PBS-Puffer + 0,1% Tween-20

verdünnt und 250 µl auf die Zellen gegeben. Dunkel abgedeckt erfolgte eine

Inkubation für 90 min bei RT auf einem Taumelschüttler. Die Deckgläser wurden

3 x 2 min mit PBS-Puffer gewaschen. Die Fixierung der Deckgläser auf einem

Objektträger erfolgte entsprechend zum direkten IFT (Abschnitt 4.4.1). Die Zellen

wurden am Fluoreszenzmikroskop fotografiert und mit der BZ Analyzer Software

ausgewertet. Chlamydien-Einschlusskörper wurden dabei grün und α-SMA rot

dargestellt. Dazu wurde die Intensität von je 100 Pixel von 5 Zellen bei

3 biologischen Replikaten gemessen. Bei der Analyse von infizierten Proben wurden

nur Zellen die einen chlamydialen Einschlusskörper enthielten analysiert.

Methoden 40

4.4.4 Live Cell Imaging

Um die Migration von infizierten Zellen zu analysieren, wurden diese direkt nach der

Infektion in den Inkubator des Mikroskops gestellt. Mit dem 20-fachem Objektiv

wurden in einem Intervall von 30 min 96 Bilder aufgenommen. Anschließend

wurden diese Bilder zu einem Zeitraffer mit 5 Bildern pro Sekunde zusammengefügt.

Die Auswertung der Migration erfolgte mit dem „Chemotaxis and Migration Tool“

von ImageJ. Dabei wurde die durchschnittliche Distanz [µm] die eine Zelle migrierte

in 10 Zellen zwischen 12 und 24 hpi sowie zwischen 36 und 48 hpi bestimmt.

4.5 Proteinbiochemische Methoden

4.5.1 Probengewinnung

Die Probenaufarbeitung erfolgte aus einem Loch einer 6-Lochplatte. Es wurden

Proteine aus der frühen Phase (4 hpi), der mittleren Phase (24 hpi) und der späten

Phase (48 hpi) sowie 96 hpi gewonnen. Die folgenden Schritte wurden für Proben

die unter Hypoxie bebrütet wurden in der Hypoxiekammer durchgeführt. Das

Medium wurde von den Zellen abgenommen und unverzüglich 300 µl Lysispuffer

zugegeben. Die Zellen wurden mit einer Pipettenspitze homogenisiert und in ein

gekühltes Reaktionsgefäß überführt. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20°C.

4.5.2 SDS-PAGE

Zur Auftrennung von Proteinen nach ihrer Molekularmasse wurde die

diskontinuierliche Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese

(SDS-PAGE) nach Laemmli verwendet [63]. Es wurde ein 10%iges Trenngel mit

einem 4%igem Sammelgel in einer Größe von 8 x 7,3 cm gegossen (Tabelle 4.2).

Die auspolymerisierten Gele wurden in eine vertikale Elektrophoresekammer

eingesetzt und mit Elektrophoresepuffer übergossen. Die Proteine wurden bei 95°C

für 5 min denaturiert und anschließend 30 µl Probe ins Gel aufgetragen. Als

Größenstandard dienten 7 µl eines Molekulargewichtsmarkers. Die Migration der

Proteine durch das Sammelgel erfolgte bei einer Spannung von 70 V für 15 min. Im

Trenngel wurden die Proteine nach ihrer Molekularmasse bei einer Spannung von

200 V für 55 min aufgetrennt.

Methoden 41

Tabelle 4.2: Zusammensetzung des Sammel- und Trenngels

Trenngel (10%) Sammelgel (4%)

H2O 2,45 ml 3,2 ml

Trenngelpuffer 1,25 ml -

Sammelgelpuffer - 1,25 ml

Acrylamid/Bisacrylamid 1,25 ml 0,5 ml

10% SDS-Lösung 50 µl 50 µl

TEMED 2,5 µl 5 µl

10% APS-Lösung 25 µl 25 µl

4.5.3 Western Blot Analyse

Um spezifische Proteine nachzuweisen, wurden die aufgetrennten Proteine der

SDS-PAGE auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen. In dieser Arbeit wurde

dafür ein Nass-Blot verwendet. In einer horizontalen Blotapparatur erfolgte der

Transfer der Proteine aus der SDS-PAGE auf eine Nitrocellulosemembran für 1,5 h

bei 75 V unter ständiger Kühlung durch Eisblöcke. Anschließend wurden

unspezifische Bindungsstellen der Membran mit Blockpuffer für 1 h bei

Raumtemperatur (RT) blockiert. Über Nacht wurde die Membran bei 4°C und

leichtem Schwenken mit dem Primärantikörper (Abschnitt 3.9.1) in der

entsprechenden Verdünnung im Blockpuffer inkubiert. Am nächsten Tag wurde die

Membran 2 x 15 min mit T-TBS gewaschen. Der Sekundärantikörper wurde in

Blockpuffer verdünnt und für 1 h bei RT mit der Membran inkubiert. Es folgte ein

erneutes Waschen für 2 x 15 min mit T-TBS. Die verwendeten Sekundärantikörper

sind mit einer Meerrettichperoxidase (horseradish peroxidase, HRP) gekoppelt.

Durch Zugabe des Luminol-haltigen Substrats nach Herstellerangaben wurde das

Luminol oxidiert und die Lumineszenz konnte im Chemilumineszenz-Imager

detektiert werden. Dargestellt wurde jeweils ein repräsentatives Ergebnis der

Replikate der Western Blot Analysen. Die Bandenintensität der Replikate der

Western Blot Analysen wurde mit der Software Bio1D ausgewertet. Die

Proteinmenge wurde gegen das Housekeeping-Protein β-Aktin normalisiert. Die

Bande mit der stärksten Intensität wurde als 100% definiert.

Methoden 42

4.6 Molekularbiologische Methoden

4.6.1 RNA-Isolation

Zur Isolation von total-RNA wurde das NucleoSpin RNA II Kit verwendet. Der

RNA-Lysispuffer wurde im Verhältnis 1:100 mit β-Mercaptoethanol versetzt. Zur

Isolierung von RNA aus Zellkulturen wurden Zellen eines Lochs einer 6-Lochplatte

mit 350 µl RNA-Lysispuffer lysiert. Um humanes Lungengewebe zu lysieren, wurde

ein Stück Lunge in 600 µl RNA-Lysispuffer in ein Precellys Kryoröhrchen gegeben.

Bei 6500 rpm für 15 sec im Gewebehomogenisator, wurde das Gewebe

homogenisiert. Die weitere Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers.

4.6.2 Reverse Transkription

RNA wurde mit Hilfe der reversen Transkription in cDNA umgeschrieben.

Tabelle 4.3: Pipettierschema der reversen Transkription mit Roche und Fermentas

Volumen Endkonzentration

Reagenzien Roche Fermentas Roche Fermentas

RNase-freies H2O 6,0 µl 5,5 µl

Reaktionspuffer (5x) 4,0 µl 4,0 µl 1x 1x

dNTP Mix 2,0 µl 2,0 µl 1 mM 1 mM

Random Hexamer Primer 2,0 µl 2,0 µl 0,04 U/µl 0,04 U/ml

RNase-Inhibitor 0,5 µl 0,5µl 50 U 2 U

Reverse Transkriptase 0,5 µl 1,0 µl 20 U 10 U

RNA 5,0 µl 5,0 µl

Die Reaktion erfolgte im Thermocycler mit den folgenden Programmen:

Methoden 43

Tabelle 4.4: Temperaturprofil der reversen Transkription

Temperatur Dauer (Roche) Dauer (Fermentas)

Hybridisierung 25°C 10 min 10 min

Reverse Transkription 50°C 60 min 30 min

Inaktivierung des Enzyms 85°C 5 min 5 min

Kühlung 4°C ∞ ∞

Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20°C.

4.6.3 Quantitative RT-PCR

Die hier verwendete quantitative reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) wurde mit

dem Fluoreszenzfarbstoff SYBR-Green in Glas-Kapillaren durchgeführt. Die aus der

reversen Transkription entstandene cDNA (Abschnitt 4.6.2) wurde mit den in

Abschnitt 3.8.2 aufgeführten Primer analysiert.

Tabelle 4.5: Pipettierschema der quantitative RT-PCR

Reagenz Volumen Endkonzentration

H2O 12,6 µl

MgCl2 2,4 µl 4,0 mM

Forward Primer (20 µM) 0,5 µl 0,5 µM

Reverse Primer (20 µM) 0,5 µl 0,5 µM

LightCycler FastStart Reaktionsmix SYBR-Green 2,0 µl 1x

cDNA 2,0 µl

Zuvor wurde dem Lightcycler FastStart Reaktionsmix 10 µl LightCycler FastStart

Enzym zugegeben. Die Amplifizierung erfolgte im LightCycler bei folgendem

Temperaturprofil:

Methoden 44

Tabelle 4.6: Temperaturprofil der quantitativen RT-PCR

Temperatur Dauer Zyklen

Initiale Denaturierung 95°C 10 min

Denaturierung 95°C 10 sec

Primerhybridisierung 60°C 5 sec 45

Elongation 72°C 10 sec

Die Auswertung der Daten erfolgte mit dem Programm LightCycler Data Analysis.

Die Daten wurden entsprechend der mRNA Menge des Housekeeping-Gens

18S rRNA normalisiert. Die Probe mit der stärksten Expression wurde als 100%

definiert. Bei der Analyse von chlamydialen Genen wurde gegen die Expression des

chlamydialen Elongationsfaktors Tuf (thermo unstable elongation factor)

normalisiert, der zuvor als geeignetes Housekeeping Gen beschrieben wurde [75].

4.6.4 RNA-Interferenz Analysen

In dieser Arbeit wurde HIF-1α in A549 Zellen mittels RNA-Interferenz inhibiert.

Dazu wurde je ein Ansatz von 250 µl Optimem Medium mit 5 µl Lipofectamin oder

5 µl der HIF-1α siRNA (20 µM) versetzt. Beide Ansätze wurden 5 min bei RT

inkubiert und anschließend zusammen pipettiert. Dieses Gemisch wurde in ein kurz

zuvor angesetztes Loch einer 6-Lochplatte mit A549 Zellen und 2 ml

Versuchsmedium 2 gegeben. Der Ansatz wurde für 5 h bei Hypoxie inkubiert.

Anschließend wurde das Medium in der Hypoxiekammer verworfen und mit 5 ml

Versuchsmedium 1 und z.T. mit 10 U/ml IFN-γ versetzt. Alle Ansätze wurden

parallel mit einer Kontroll-siRNA durchgeführt.

Methoden 45

4.6.5 Inhibition von TGF-β

A549 Zellen wurden ausgesät (Abschnitt 4.1.1) und nach 24 h Inkubation unter

Normoxie und Hypoxie infiziert (Abschnitt 4.3.2). Der TGF-ß Inhibitor SB-431542

wurde zu einer Arbeitskonzentration von 26 mM in DMSO gelöst. Vor der

Verwendung wurde die Suspension 1:10 mit Versuchsmedium 1 verdünnt. Das

Medium wurde 4 hpi mit 5 µM SB-431542 versetzt und die Zellen für weitere 44 h

bei Normoxie oder Hypoxie inkubiert. Anschließend wurden die Proteine der Zelle

für Western Blot Analysen gewonnen (Abschnitt 4.5.1).

4.6.6 Transkriptom-Analysen

Um hohe Ausbeuten an chlamydialer mRNA zu erhalten, wurden zwei verschiedene

Aufreinigungsverfahren verglichen.

4.6.6.1 Aufreinigung 1

Für die Analyse des chlamydialen Transkriptoms wurden 6 Löcher einer

6-Lochplatte pro Probe für die RNA-Isolation eingesetzt (Abschnitt 4.6.1). Um die

humane RNA aus der total-RNA abzureichern, wurde das MICROBEnrich Kit nach

Herstellerangaben verwendet. Die erhaltene RNA konnte direkt in das

MICROBExpress Kit eingesetzt werden, um chlamydiale rRNA zu entfernen. Dieses

Kit wurde ebenfalls nach Herstellerangaben durchgeführt. Die RNA wurde in 30 µl

RNase-freiem H2O gelöst. Der RNA-Gehalt sowie die Reinheit wurden im

NanoDrop bestimmt.

4.6.6.2 Aufreinigung 2

Vor der Durchführung einer total-RNA-Isolation erfolgte eine Separation von

humanen und chlamydialen Bestandteilen mittels Differentialzentrifugation. Dazu

wurden infizierte Zellen von zehn 6-Lochplatten für eine Probe mit einem

Zellschaber vom Plattenboden abgelöst und die Zellen 2 min mit Glasschrot

aufgeschlossen. Die zellulären Bestandteile wurden bei 200 x g und 4°C für 5 min

abzentrifugiert. Der Überstand wurde in der Ultrazentrifuge bei 28000 x g und 4°C

für 1 h zentrifugiert. Das entstandene Chlamydien-Pellet wurde in 600 µl

RNA-Lysispuffer, versetzt mit β-Mercaptoethanol (1:100), lysiert und in die

Methoden 46

total-RNA-Isolation eingesetzt (Abschnitt 4.6.1). Die weitere Aufreinigung erfolgte

entsprechend (Abschnitt 4.6.6.1).

4.6.6.3 BioAnalyzer

Die Durchführung und Auswertung der Proben am BioAnalyzer erfolgte durch die

Fa. GATC Biotech AG, Konstanz.

4.6.6.4 RNA-Sequenzierung

Die RNA-Sequenzierung besteht aus der c-DNA Synthese und der Sequenzierung

am HiSeq2000 und wurde von der Fa. GATC Biotech AG, Konstanz durchgeführt.

Pro Probe wurden Sequenzen mit einer Länge von 100 bp auf dem HiSeq2000

(Illumina) im 3fach-Ansatz sequenziert. Die bioinformatische Auswertung des

Transkriptoms wurde von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. T. Rattei des Departments für

Computational Systems Biology, Universität Wien durchgeführt.

4.7 Metabolom-Analysen

4.7.1 Aufarbeitung von Metaboliten für das FT/ICR-MS

Das Medium wurde 7 h nach Aussaat der HEp-2 Zellen (Abschnitt 4.1.1)

abgenommen und die Zellen mit 1 ml Versuchsmedium 2 gewaschen. Danach

wurden 5 ml Versuchsmedium 2 auf die Zellen gegeben. Zu den Zellen wurden

10 U/ml IFN-γ gegeben und diese für weitere 17 h bei Normoxie oder Hypoxie

bebrütet. Die Infektion der Zellen erfolgte entsprechend zu Abschnitt 4.3.2. Das

Medium wurde 24 hpi von den Zellen abgenommen. Der Zellrasen wurde sofort mit

1 ml eiskaltem Methanol bedeckt, welches direkt wieder verworfen wurde. Dieser

Schritt diente dem Quenchen der Proben, wodurch der Metabolismus der Zelle

gestoppt wurde. Die Zellen wurden nun in 1 ml eines eiskalten Methanol:H2O

Gemischs (50:50) mit einem Zellschaber von der Platte gelöst und in ein

Reaktionsgefäß überführt. In einem gekühlten Ultraschallbad wurden die Zellen und

Chlamydien für 30 min aufgeschlossen, wobei bevorzugt hydrophile Metabolite vom

Lösungsmittel aufgenommen wurden. Die Zellbestandteile wurden für 5 min bei

2000 x g abzentrifugiert und der Überstand bei -80°C gelagert. Zu dem Zellpellet

wurde 1 ml Methanol gegeben und die Zellsuspension erneut für 30 min im

Methoden 47

Ultraschallbad behandelt. Dabei wurden hauptsächlich Metabolite mittlerer Polarität

extrahiert. Nach einer weiteren 5 minütigen Zentrifugation bei 2000 x g wurde der

Überstand zu dem ersten Überstand gegeben und bei -80°C gelagert. Die Proben

wurden zur weiteren Analyse ins Helmholtz Zentrum München gesendet. Alle

weiteren Methoden und Analysen wurden in Kooperation mit Constanze Müller der

Arbeitsgruppe von PD Dr. Ph. Schmitt-Kopplin am Helmholtz Zentrum München,

Abteilung Analytische BioGeoChemie durchgeführt.

4.7.2 Analyse der Metabolite

Das Lösungsmittel, welches die extrahierten Metabolite der Zellen enthielt, wurde

direkt in das ESI FT/ICR-MS (Elektrospray Ionisation Fouriertransformation-

Ionenzyklotronresonanz-Massenspektrometer) bei positiver und negativer Polarität

injiziert. Dafür wurden die Proben 1:50 (positive Polarität) bzw. 1:20 (negative

Polarität) mit Methanol verdünnt. Bei positiver Polarität ionisieren bevorzugt

basische Metabolite, wohingegen bei negativer Polarität saure Metabolite ionisieren.

Durch das starke 12 Tesla Magnetfeld wurde eine Ultra-hohe Auflösung (>300000)

und Massengenauigkeit (<100 ppb) erzielt. Die Spektren wurden in einer

Massenbreite von 120-1000 m/z (positive Polarität) bzw. 150-1200 m/z (negative

Polarität) analysiert.

4.7.3 Auswertung der relevanten Massen

Mittels der Hauptkomponentenanalyse (principal componant analysis, PCA) erfolgte

eine Vereinfachung der Datenmatrix. Dabei wurden Proben, die eine ähnliche

Stoffwechselsituation aufwiesen, nach zwei grundsätzlichen Komponenten

zusammengruppiert. In dieser non-supervised Methode wurde dem System nicht

mitgeteilt, welche Proben sich unterscheiden sollen und welche nicht. Anschließend

wurde eine Partial Least Squares Diskriminanzanalyse (PLS-DA) für die

Datenmatrix aufgebaut. Mit dieser supervized multivarianten Methode konnten

Metaboliten, welche sich am stärksten in den vorher definierten Gruppen

unterschieden (variable importance in the projection (VIP) > 1), bestimmt werden.

Die Analyse erfolgte separat für den positiven als auch negativen Breitbandmodus

und die erhaltenen Massen wurden für weitere Analysen extrahiert. Zur Annotierung

und Translation in biochemische Stoffwechselwege wurde die Software MassTRIX,

Methoden 48

mit einem Fehler von 1 ppm, verwendet. Die annotierten Massen der infizierten

Zellen unter Normoxie und Hypoxie wurden mittels des Wilcoxon-Mann-Whitney

Test (non parametrischer Test) auf signifikante Unterschiede in ihrer Signalintensität

analysiert. P-Werte von ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Zusätzlich wurden die statistisch signifikanten Massen der nicht-infizierten Zellen in

Normoxie und Hypoxie identifiziert und mit denen der infizierten Zellen

abgeglichen. Bei gleichem Verhältnis der Massen in den beiden Konditionen

untereinander, wurden die Massen aus dem Datenset entfernt. Auf diese Weise

wurden nur die für die Infektion relevanten Massen analysiert.

4.8 Statistik Die Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler angegeben. Für die statistische

Auswertung wurde ein Student‘s t-test (einseitig, ungepaart) angewandt. P-Werte

von ≤ 0,05 wurden als statistisch signifikant angesehen.

Ergebnisse 49

5 Ergebnisse

5.1 Untersuchungen der IFN-γ induzierten Persistenz von C. pneumoniae unter Hypoxie

5.1.1 Aufhebung der Persistenzbildung von C. pneumoniae durch Hypoxie

Die Sauerstoffverfügbarkeit in der Lunge nimmt gegenüber der atmosphärischen

Luft entlang der Bronchien ab. Bei reduzierter Ventilation von Lungenzellen oder bei

Entzündungsreaktionen sinkt die Sauerstoffkonzentration weiter. Auf Grund der

obligat intrazellulären Lebensweise von C. pneumoniae, müssen sich diese an

geringe Sauerstoffverhältnisse anpassen. Zuvor konnte gezeigt werden, dass

C. pneumoniae unter Hypoxie ein schnelleres Wachstum und größere

Einschlusskörper aufweist als unter Normoxie. In dieser Arbeit sollte der Einfluss

von Hypoxie auf die Persistenz von C. pneumoniae analysiert werden. Dazu wurden

HEp-2 Zellen 24 h vor der Infektion mit 10 U/ml IFN-γ behandelt, unter Normoxie

und Hypoxie inkubiert sowie mit C. pneumoniae infiziert. Zuerst wurde die

Morphologie der Einschlusskörper im direkten IFT analysiert (Abbildung 5.1).

Charakteristisch für die Persistenz sind kleine Einschlusskörper. Diese waren in

C. pneumoniae infizierten Zellen mit IFN-γ unter normoxischen Bedingungen zu

finden. Dagegen führte eine Infektion unter Hypoxie zu größeren Einschlusskörpern,

die vergleichbar mit denen der Kontrolle waren. IFN-γ hatte demnach keinen

Einfluss auf die Morphologie der Einschlusskörper unter Hypoxie.

Ergebnisse 50

Abbildung 5.1: C. pneumoniae Einschlusskörper nach IFN-γ Behandlung unter Normoxie und Hypoxie. Im direkten IFT waren unter Normoxie und Hypoxie in den Kontrollen die kein IFN-γ enthielten große Einschlusskörper (grün) in HEp-2 Zellen (rot) zu detektieren (48 hpi). Durch IFN-γ Behandlung (10 U/ml) lagen kleine Einschlusskörper unter Normoxie vor, wohingegen unter Hypoxie große Einschlusskörper zu detektieren waren. Die Abbildung stammt aus einem repräsentativem Experiment von n=3.

Eine weitere Eigenschaft der Persistenz ist, dass keine infektiösen EK im

Entwicklungszyklus entstehen. Die kleinen Einschlusskörper in IFN-γ behandelten

Zellen unter Normoxie wiesen keine Wiederanzucht von C. pneumoniae auf

(0 ± 0,2 IFUs/µl) (Abbildung 5.2). Durch das Auswaschen von IFN-γ und der

Zugabe von Tryptophan 24 hpi konnte eine Reaktivierung von C. pneumoniae

erreicht werden (1,4x103 ± 8,2x102 IFUs/µl). Dies zeigte, dass die Behandlung mit

IFN-γ unter Normoxie tatsächlich zur Persistenz und nicht zu einem Absterben von

C. pneumoniae führte. In den IFN-γ behandelten Zellen unter Hypoxie zeigte sich

hingegen eine hohe Wiederanzuchtsrate von C. pneumoniae

(1,4x105 ± 3,9x104 IFUs/µl), die vergleichbar mit dem Wachstum ohne IFN-γ

Zugabe unter Normoxie und Hypoxie war.

Ergebnisse 51

Abbildung 5.2: Wiederanzucht von C. pneumoniae in HEp-2 Zellen nach IFN-γ Behandlung unter Normoxie und Hypoxie (72 hpi). Eine IFN-γ-Behandlung (10 U/ml) führte unter Normoxie zu keiner Wiederanzucht, wohingegen unter Hypoxie eine hohe Wiederanzuchtsrate erreicht wurde. Eine Wiederanzucht von persistenten C. pneumoniae unter Normoxie konnte durch einen Wechsel auf ein tryptophanhaltiges Medium ohne IFN-γ (24 hpi) erzielt werden (n=3, *p≤0,05).

Um zu analysieren, bei welchen Sauerstoffkonzentrationen die IFN-γ induzierte

Persistenz von C. pneumoniae verhindert wird, wurden ansteigende

Sauerstoffkonzentrationen getestet. Im direkten IFT zeigten sich bei 1-2% O2 in

IFN-γ behandelten Zellen große Einschlusskörper, die jedoch bei ≥ 3% O2 nicht

mehr sichtbar waren (Abbildung 5.3 A). Eine Wiederanzucht von C. pneumoniae in

IFN-γ behandelten Zellen wurde ebenfalls nur bei Konzentrationen ≤ 2% O2 erreicht

(Abbildung 5.3 B).

Ergebnisse 52

Abbildung 5.3: Persistenzinduktion von C. pneumoniae bei ansteigender Sauerstoffkonzentration in HEp-2 Zellen. (A) Der direkte IFT zeigte große Einschlusskörper von C. pneumoniae (grün) in IFN-γ (10 U/ml) behandelten HEp-2 Zellen (rot) 48 hpi bei 1-2% O2. Bei ≥ 3% O2 waren keine Einschlusskörper mehr zu erkennen (Die Abbildung stammt aus einem repräsentativem Experiment von n=3). (B) Eine Wiederanzucht von C. pneumoniae infizierten und IFN-γ behandelt Zellen, war bei 1-2% O2, jedoch nur sehr gering bei Sauerstoffkonzentrationen ≥ 3% möglich (n=3).

5.1.2 Reaktivierung persistenter C. pneumoniae durch Hypoxie

Bisher sind Faktoren, die in vivo zu einer Reaktivierung von persistenten

C. pneumoniae führen nicht bekannt. Da Hypoxie die Persistenzinduktion

verhinderte, wurde der Einfluss von Hypoxie auf eine bereits persistierende

C. pneumoniae-Infektion untersucht. Dazu wurden IFN-γ behandelte HEp-2 Zellen

für 48 h mit C. pneumoniae unter Normoxie infiziert. Danach wurden die nun

persistent infizierten Zellen unter Normoxie oder Hypoxie weiter bebrütet. Nach 48 h

und 96 h wurde ein direkter IFT und eine Wiederanzucht durchgeführt. Dabei zeigte

sich, dass ein leichter Anstieg der Wiederanzuchtsrate nach 48 h und ein

signifikanter Anstieg der Wiederanzuchtsrate nach 96 h hypoxischer Inkubation, im

Vergleich zu den persistent infizierten Zellen unter Normoxie, erreicht werden

konnte (Abbildung 5.4 A). Die persistent infizierten Zellen unter Normoxie wiesen

zu keinem Zeitpunkt eine Wiederanzuchtsrate auf. Im direkten IFT konnte ebenfalls

eine Veränderung der Größe der Einschlusskörper zwischen Normoxie und Hypoxie

detektiert werden (Abbildung 5.4 B). In der Persistenz-Kontrolle waren keine

Einschlüsse sichtbar, wohingegen deren Größe unter hypoxischer Inkubation nach

48 h und verstärkt nach 96 h zunahm.

Ergebnisse 53

Abbildung 5.4: Reaktivierung von persistenten C. pneumoniae durch Hypoxie in HEp-2 Zellen. (A) Die Persistenz wurde unter Normoxie durch die Zugabe von IFN-γ (10 U/ml) induziert. Die Zellen wurden 48 hpi für weitere 48 h oder 96 h entweder bei Normoxie (grün) oder Hypoxie (rot) bebrütet. C. pneumoniae infizierte Zellen ohne IFN-γ (blau) dienten als Kontrolle der Infektion. Nach 96 h hypoxischer Inkubation zeigte sich eine hohe Wiederanzucht von C. pneumoniae, wohingegen C. pneumoniae kein Wachstum unter Normoxie aufwies (n=5, *p≤0,05 im Vergleich zu Normoxie). (B) Im direkten IFT zeigten sich vergrößerte Einschlusskörper (grün) in IFN-γ behandelten HEp-2 Zellen (rot) nach 96 h Inkubation in Hypoxie (Die Abbildung stammt aus einem repräsentativem Experiment von n=5).

5.2 Analyse von IFN-γ induzierenden Signalwegen unter Hypoxie

5.2.1 Beeinflussung der Jak-STAT Signalkaskade durch Hypoxie

Die IFN-γ induzierte Persistenz basiert hauptsächlich auf der Aktivität der Jak-STAT

Signalkaskade. Um die verminderte Aktivität von IFN-γ unter Hypoxie zu

charakterisieren, wurden die Phosphorylierungen von STAT1 am Tyrosin 701 und

Serin 727 unter Hypoxie in Western Blot Analysen untersucht. Die

Ergebnisse 54

Phosphorylierungen waren verstärkt nach IFN-γ Behandlung sichtbar und werden im

Weiteren hier beschrieben. Es zeigte sich unter Normoxie, dass eine Infektion mit

C. pneumoniae (4 hpi) zu einer erhöhten Phosphorylierung am Tyrosin gegenüber

nicht-infizierten Zellen führte (Abbildung 5.5 A und B). Zudem war die Tyrosin-

Phosphorylierung signifikant stärker in infizierten Zellen unter Normoxie als in

infizierten Zellen unter Hypoxie. Die Phosphorylierung am Serin 727 unterschied

sich hingegen nicht zwischen Normoxie und Hypoxie (Abbildung 5.5 A und C).

Abbildung 5.5: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (4 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B/C) zeigten, dass C. pneumoniae infizierte Zellen unter Normoxie eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung (B) aufwiesen, welche unter Hypoxie signifikant reduziert war. Bei der Serin-Phosphorylierung (C) konnte kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie detektiert werden (n=3, *p≤0,05).

Die Tyrosin-Phosphorylierung war in der mittleren Phase der Infektion (24 hpi) in

infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie gegenüber Normoxie verstärkt

(Abbildung 5.6 A und B). Dies war jedoch nicht signifikant. Dahingegen war eine

signifikant niedrigere Tyrosin-Phosphorylierung in C. pneumoniae infizierten Zellen,

Ergebnisse 55

im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen, unter Hypoxie zu detektieren. Die

Phosphorylierung am Serin 727 in nicht-infizierten Zellen war stärker unter Hypoxie

als unter Normoxie. Die Serin-Phosphorylierung sank jedoch unter Hypoxie in

C. pneumoniae infizierten Zellen gegenüber nicht-infizierten Zellen signifikant ab

(Abbildung 5.6 A und C).

Abbildung 5.6: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (24 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B/C) zeigten keinen Unterschied zwischen der Tyrosin-Phosphorylierung (B) unter Normoxie und Hypoxie in C. pneumoniae infizierten sowie nicht-infizierten Zellen. Die Serin-Phosphorylierung (C) war unter Hypoxie in nicht infizierten Zellen erhöht. In infizierten Zellen war kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie zu detektieren (n=3, *p≤0,05).

In der späten Phase der Infektion (48 hpi) war die Tyrosin-Phosphorylierung am

STAT1 in nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie stärker als in nicht infizierten

Zellen unter Normoxie (Abbildung 5.7 A und B). Die in nicht-infizierten Zellen

erhöhte Phosphorylierung unter Hypoxie war jedoch in infizierten Zellen unter

Hypoxie signifikant reduziert und entsprach der unter Normoxie. Die

Ergebnisse 56

Serin-Phosphorylierung am STAT1 blieb in infizierten und nicht-infizierten Zellen

unter Normoxie und Hypoxie unverändert (Abbildung 5.7 A und C).

Abbildung 5.7: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (48 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B/C) zeigten eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung (B) in nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie. In infizierten Zellen war kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie zu detektieren. Bei der Serin-Phosphorylierung (C) konnte kein Unterschied zwischen Normoxie und Hypoxie detektiert werden (n=3, *p≤0,05).

Ergebnisse 57

5.2.2 Beeinflussung der IDO Expression durch Hypoxie

Über die IFN-γ-induzierte Jak-STAT Signalkaskade werden Gene, die in ihrem

Promotor das GAS Element tragen, exprimiert. Das Enzym IDO trägt dieses Element

und wandelt, nach Induktion durch IFN-γ, Tryptophan zu N-Formylkynurenin um,

womit es zur Persistenzinduktion von C. pneumoniae beiträgt. Die Expression von

IDO wurde auf Gen- und Protein-Ebene analysiert. IDO war nur in Zellen nach

IFN-γ Behandlung zu detektieren. Deshalb wurden nur die IFN-γ behandelten Proben

für die densitometrische Auswertung der Western Blot Analysen herangezogen und

hier weiter beschrieben. In der frühen Phase der Infektion (4 hpi) war die

Genexpression von IDO in nicht-infizierten wie auch in C. pneumoniae infizierten

Zellen unter Normoxie signifikant stärker als unter Hypoxie (Abbildung 5.8 A).

Zudem zeigte sich unter Normoxie in infizierten Zellen gegenüber nicht-infizierten

Zellen eine signifikant erhöhte Genexpression von IDO. Übereinstimmend zu der

Genexpression zeigten auch die Western Blot Analysen, dass die Proteinexpression

von IDO in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Normoxie

signifikant stärker war als unter Hypoxie (Abbildung 5.8 B und C).

Ergebnisse 58

Abbildung 5.8: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (4 hpi). (A) Quantitative RT-PCR Analysen wiesen unter Normoxie und Hypoxie eine höhere Genexpression von IDO sowohl in C. pneumoniae infizierten als auch in nicht-infizierten Zellen nach (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001). Die Western Blot Analysen (B) und deren densitometrische Auswertung (C) zeigten ebenfalls, dass unter Hypoxie eine signifikant niedrigere IDO Proteinexpression als unter Normoxie vorlag (n=3, ***p≤0,001).

In der mittleren Phase des Entwicklungszyklus (24 hpi) war die Genexpression von

IDO in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen zwischen Normoxie

und Hypoxie vergleichbar (Abbildung 5.9 A). Lediglich eine Infektion unter

Normoxie führte gegenüber nicht-infizierten Zellen zu einer signifikanten Reduktion

der Genexpression. Hingegen verblieb die Proteinexpression von IDO unverändert.

Ergebnisse 59

Hier lag weiterhin eine niedrigere Proteinkonzentration von IDO unter Hypoxie als

unter Normoxie in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen vor

(Abbildung 5.9 B und C). Daneben war die Proteinkonzentration von IDO unter

Normoxie in infizierten Zellen, im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen, signifikant

erhöht.

Abbildung 5.9: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (24 hpi). (A) Quantitative RT-PCR Analysen wiesen keinen Unterschied in der Genexpression von IDO zwischen Normoxie und Hypoxie auf (n=3, *p≤0,05). Die Western Blot Analysen (B) und deren densitometrische Auswertung (C) zeigten eine erniedrigte IDO Proteinexpression in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie (n=3, **p≤0,005, ***p≤0,001).

Ergebnisse 60

Interessanterweise kehrte sich das Verhältnis der IDO Genexpression zu der

Proteinexpression in der späten Phase der Infektion (48 hpi) um. So lag eine

signifikant höhere Genexpression unter Hypoxie gegenüber Normoxie in

C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen vor (Abbildung 5.10 A). Im

Gegensatz dazu blieb die Proteinexpression von IDO weiterhin signifikant unter

Hypoxie gegenüber Normoxie in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten

Zellen erniedrigt (Abbildung 5.10 B und C).

Abbildung 5.10: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (48 hpi). (A) Quantitative RT-PCR Analysen wiesen eine erhöhte Genexpression von IDO in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie auf (n=3, **p≤0,005, ***p≤0,001). Die Western Blot Analysen (B) und die densitometrische Auswertung (C) wiesen hingegen eine reduzierte IDO Proteinexpression in infizierten und nicht-infizierten Zellen unter Hypoxie auf (n=3, **p≤0,005).

Ergebnisse 61

5.2.3 Beeinflussung weiterer IFN-γ regulierter Proteine durch Hypoxie

Um die Analysen nicht nur auf die Mediatoren der Jak-STAT Signalkaskade zu

beschränken, wurden Proteine deren Expression über die Jak-STAT Signalkaskade

reguliert werden mittels quantitativer RT-PCR analysiert. Das IFN-γ induzierbare

Protein 10 (IP-10) ist ein Chemokin, welches eine ISRE-Sequenz in seiner

Promotorregion trägt [81]. Dadurch war IP-10 in den IFN-γ behandelten Zellen zu

detektieren und wird diesbezüglich hier weiter beschrieben. IP-10 zeigte 4 hpi eine

signifikant niedrigere Genexpression unter Hypoxie gegenüber Normoxie sowohl in

C. pneumoniae infizierten als auch in nicht-infizierten Zellen (Abbildung 5.11 A).

Interessanterweise fand im weiteren Verlauf der Infektion (24 hpi und 48 hpi) eine

Gegenregulation von IP-10 statt. Daher lag in C. pneumoniae infizierten und

nicht-infizierten Zellen eine signifikant reduziert Genexpression von IP-10 unter

Normoxie gegenüber Hypoxie vor (Abbildung 5.11 B und C).

Ergebnisse 62

Abbildung 5.11: Quantitative RT-PCR von IP-10 in HEp-2 Zellen. (A) Die Genexpression von IP-10 war 4 hpi sowohl in nicht-infizierten als auch in C. pneumoniae-infizierten Zellen unter Hypoxie signifikant reduziert. Eine erhöhte Genexpression lag 24 hpi (B) und 48 hpi (C) in nicht-infizierten und C. pneumoniae infizierten Zellen unter Hypoxie vor (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).

Ergebnisse 63

Weiterhin wurde die Expression der über die Jak-STAT Signalkaskade regulierten

Gene SOCS1 und SOCS3 analysiert. Eine Aktivierung der Expression wurde nur in

IFN-γ behandelten Zellen detektiert, weshalb sich die folgenden Analysen auf IFN-γ

behandelte Zellen beziehen. Eine Induktion der SOCS1 Expression durch IFN-γ

zeigte sich ausschließlich 4 hpi und von SOCS3 4 hpi und 24 hpi, weshalb spätere

Zeitpunkte nicht dargestellt wurden. Es zeigte sich, dass die Expression von SOCS1

(Abbildung 5.12) und SOCS3 (Abbildung 5.13 A) 4 hpi unter Normoxie in

C. pneumoniae infizierten Zellen, im Vergleich zu nicht-infizierten Zellen signifikant

erhöht war. Dagegen war eine signifikant niedrigere Expression in infizierten Zellen

unter Hypoxie, gegenüber infizierten Zellen unter Normoxie, zu detektieren. Diese

entsprach der Expression von nicht-infizierten Zellen. SOCS3 wies in

nicht-infizierten und infizierten Zellen 24 hpi eine erniedrigte Genexpression unter

Hypoxie gegenüber Normoxie auf (Abbildung 5.13 B).

Abbildung 5.12: Quantitative RT-PCR von SOCS1 in HEp-2 Zellen. (A) In C. pneumoniae infizierten Zellen lag 4 hpi eine signifikant höhere Genexpression von SOCS1 unter Normoxie gegenüber Hypoxie vor (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).

Ergebnisse 64

Abbildung 5.13: Quantitative RT-PCR von SOCS3 in HEp-2 Zellen. (A) Die Genexpression von SOCS3 war in infizierten Zellen 4 hpi unter Hypoxie gegenüber Normoxie reduziert. (B) Die Genexpression von SOCS3 war in C. pneumoniae infizierten und nicht-infizierten Zellen 24 hpi unter Hypoxie gegenüber Normoxie reduziert (n=3, *p≤0,05, **p≤0,005, ***p≤0,001).

Ergebnisse 65

5.3 Analyse von IL-6 unter Hypoxie Die erste Barriere gegen eine C. pneumoniae-Infektion stellen die Epithelzellen der

Atemwege dar. Eine Infektion führt zur Sekretion von proinflammatorischen

Zytokinen. Hier sollte untersucht werden, ob das proinflammatorische Zytokin IL-6

während einer aktiven Infektion sowie in der Persistenz und der Reaktivierung

exprimiert wird. Zusätzlich sollte dabei der Einfluss von Hypoxie untersucht werden.

Dazu wurde das humane Lungengewebs-Modell und das Reaktivierungs-Modell

genutzt. Es zeigte sich, dass eine akute Infektion (24 hpi) von humanem

Lungengewebe eine signifikante IL-6 Expression unabhängig von der

Sauerstoffkonzentration herbeiführte (Abbildung 5.14).

Abbildung 5.14: Quantitative RT-PCR von IL-6 in C. pneumoniae infiziertem humanen Lungengewebe (24 hpi). Eine C. pneumoniae-Infektion führte zu einer signifikant erhöhten IL-6 Expression unter Normoxie und Hypoxie (n=3, **p≤0,005, ***p≤0,001).

Weiterhin wurde die IL-6 Expression in dem Reaktivierungs-Modell von

Epithelzellen untersucht. In diesem Modell lag unter Normoxie eine persistente

C. pneumoniae-Infektion vor, wohingegen unter Hypoxie (96 h) eine zuvor

persistente Infektion reaktiviert wurde. Eine C. pneumoniae-Infektion führte unter

Normoxie und Hypoxie, im Vergleich zu den nicht-infizierten, IFN-γ behandelten

Zellen, zu einem signifikanten Anstieg der IL-6 Expression (Abbildung 5.15). Jedoch

war die IL-6 Expression in infizierten Zellen geringer unter Hypoxie als unter

Normoxie. IFN-γ führte bei nicht-infizierten Zellen ebenfalls zu einer erhöhten IL-6

Expression unter Normoxie und Hypoxie. Die IFN-γ induzierte IL-6 Expression in

nicht-infizierten Zellen war hier ebenfalls unter Normoxie stärker als unter Hypoxie.

Ergebnisse 66

Abbildung 5.15: Quantitative RT-PCR von IL-6 in dem Reaktivierungs-Modell von C. pneumoniae infizierten HEp-2 Zellen. IFN-γ (10 U/ml) führte in nicht-infizierten Zellen zu einer Aktivierung der IL-6 Expression. Eine C. pneumoniae-Infektion von IFN-γ stimulierten Zellen wies eine signifikant erhöhte IL-6 Expression gegenüber nicht-infizierten, IFN-γ stimulierten Zellen auf. Die induzierte IL-6 Expression war in nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen sowie in C. pneumoniae infizierten, IFN-γ behandelten Zellen unter Normoxie stärker als unter Hypoxie (n=3, *p≤0,05, **p≤0,005, ***p≤0,001).

5.4 Einfluss von C. pneumoniae auf Differenzierungs-prozesse von Epithelzellen

Umbauprozesse (Remodeling) von Epithelzellen sind charakteristisch für das

Fortschreiten von chronischen Atemwegserkrankungen wie der COPD. Ob eine

C. pneumoniae Infektion zu einem Umbau von Lungenepithelzellen (A549) führte,

sollte im folgenden Abschnitt untersucht werden. Anhand der Expression von

E-Cadherin und α-SMA sowie der Beweglichkeit von Epithelzellen, kann ein

Umbauprozess charakterisiert werden.

5.4.1 Einfluss von C. pneumoniae auf E-Cadherin

Um den Effekt einer C. pneumoniae-Infektion auf das Remodeling von

Lungenepithelzellen zu untersuchen, wurden A549 Zellen mit C. pneumoniae

infiziert, sowie mit IFN-γ behandelt und unter Normoxie oder Hypoxie inkubiert.

Mittels Western Blot Analysen wurde E-Cadherin untersucht. E-Cadherin ist

hauptsächlich in Epithelzellen nachzuweisen und wird beim Zellumbau vermindert

exprimiert. C. pneumoniae infizierte Zellen (48 hpi) wiesen im Vergleich zu

nicht-infizierten Zellen eine signifikant verminderte Proteinexpression von

Ergebnisse 67

E-Cadherin auf (Abbildung 5.16 A und B). Dieser Abbau war unabhängig davon, ob

eine akute oder persistente C. pneumoniae-Infektion vorlag sowie unabhängig von

der Sauerstoffkonzentration.

Abbildung 5.16: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (48 hpi). Die Western Blot Analyse (A) und deren densitometrische Auswertung (B) ergaben, dass eine C. pneumoniae-Infektion, unabhängig der IFN-γ Stimulation oder Sauerstoffkonzentration, zu einem Abbau von E-Cadherin führten (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).

Eine signifikant reduzierte Proteinexpression von E-Cadherin war unter Hypoxie

gegenüber Normoxie in C. pneumoniae infizierten Zellen ohne IFN-γ Stimulation

96 hpi zu detektieren (Abbildung 5.17). Interessanterweise war auch in den

nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen unter Normoxie eine geringere

Expression von E-Cadherin zu verzeichnen. Diese Reduktion war bei einer

persistenten Infektion stärker ausgeprägt. Die alleinige Zugabe von IFN-γ zu

hypoxischen Zellen hatte wiederum keinen Einfluss auf die E-Cadherin Expression.

Ergebnisse 68

Abbildung 5.17: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (96 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B) zeigten eine reduzierte E-Cadherin Expression in C. pneumoniae infizierten Zellen unter Hypoxie. Unter Normoxie führte IFN-γ (10 U/ml) zu einem Abbau von E-Cadherin, wobei der Abbau bei zusätzlicher C. pneumoniae-Infektion verstärkt war (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).

5.4.2 Einfluss von C. pneumoniae auf α-smooth muscle actin (α-SMA)

Eine Expression von α-SMA ist in Zellen mit mesenchymalem Phänotyp zu finden,

tritt jedoch nur schwach in Epithelzellen auf. α-SMA wurde mittels

Fluoreszenzfärbung nachgewiesen und dessen Intensität wurde ausgewertet. Die

Fluoreszenz von infizierten Zellen unter Normoxie war stärker als von

nicht-infizierten Zellen (Abbildung 5.18 A und B). Dabei machte es keinen

Unterschied ob eine akute oder persistente C. pneumoniae-Infektion vorlag. Unter

Hypoxie war die Fluoreszenzintensität der α-SMA Expression in infizierten Zellen

ohne IFN-γ Behandlung verglichen mit einer normoxischen Infektion weiter erhöht.

Ergebnisse 69

Abbildung 5.18: Fluoreszenzfärbung von α-SMA in A549 Zellen (72 hpi). (A) α-SMA (rot) und C. pneumoniae Einschlusskörper (grün) wurden mittels Fluoreszenzfärbung in A549 Zellen detektiert. (B) Die Intensitätsauswertung der Fluoreszenz zeigte, dass α-SMA in infizierten Zellen unter Normoxie, unabhängig von IFN-γ, erhöht war. Ein signifikanter Anstieg der α-SMA Fluoreszenzintensität war in C. pneumoniae infizierten Zellen ohne IFN-γ Stimulation unter Hypoxie gegenüber Normoxie zu verzeichnen (n=3, *p≤0,05, **p≤0,005).

Ergebnisse 70

5.4.3 Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten Zellen

Ein Charakteristikum von Zellen mit mesenchymalen Phänotyp ist eine erhöhte

Beweglichkeit. Um zu untersuchen, ob C. pneumoniae infizierte Zellen ebenfalls

stärker migrieren als nicht-infizierte Zellen, wurde deren Beweglichkeit mittels

Live-Cell Imaging analysiert (Abbildung 5.19). Dabei zeigte sich, dass unter

Normoxie zwischen 12-24 hpi infizierte Zellen eine 3,5-fache und zwischen

36-48 hpi eine 1,8-fache größere Distanz migrierten, als nicht-infizierte Zellen.

Abbildung 5.19: Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten A549 Zellen unter Normoxie. C. pneumoniae infizierte und nicht-infizierte Zellen wurden mittels Live-Cell Imaging aufgenommen und deren Beweglichkeit analysiert. Zwischen 12-24 hpi und 36-48 hpi migrierten infizierte Zellen eine größere Distanz als nicht-infizierte Zellen (n=3, ***p≤0,001).

5.4.4 TGF-β unabhängige C. pneumoniae vermittelte Remodelingprozesse

TGF-β (transforming growth factor-β) ist der am besten beschriebene Mediator des

Remodelings in Lungenepithelzellen. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob

das durch C. pneumoniae induzierte Remodeling abhängig von diesem Zytokin ist.

Es zeigte sich, dass eine Inhibition der Signalübertragung von TGF-β durch den

Inhibitor SB-431542 keine Auswirkungen auf den Abbau von E-Cadherin durch eine

Infektion (48 hpi) hatte (Abbildung 5.20 A und B). Daher zeigten die

Bandenintensitäten der Western Blot Analysen, weder unter Normoxie noch unter

Hypoxie, einen Unterschied zwischen Inhibitor-behandelten und nicht-behandelten

Zellen.

Ergebnisse 71

Abbildung 5.20: Western Blot Analysen der Inhibition der TGF-β Signaltransduktion durch SB-431542 in C. pneumoniae infizierten A549 Zellen. Die Western Blot Analysen (A) und die densitometrische Auswertung (B) zeigten, dass weder unter Normoxie noch unter Hypoxie der Inhibitor SB-431542 (5 µM) einen Einfluss auf den Abbau von E-Cadherin durch C. pneumoniae (48 hpi) hatte (n=3).

5.4.5 Beteiligung von HIF-1 an C. pneumoniae vermittelten Remodelingprozessen

Da viele Funktionen der Zelle unter hypoxischen Bedingungen über den

Transkriptionsfaktor HIF-1 reguliert werden, wurde untersucht ob HIF-1 ebenfalls

bei dem ausgeprägtem Abbau von E-Cadherin in infizierten Zellen unter Hypoxie

eine Rolle spielt. Dazu wurde die Untereinheit HIF-1α mittels RNA-Interferenz unter

Hypoxie inhibiert und der Abbau von E-Cadherin untersucht. Der Erfolg der

Inhibition konnte im Western Blot dargestellt werden (Abbildung 5.21 A). Es zeigte

sich 48 hpi ein signifikanter Anstieg der E-Cadherin Expression durch die siRNA in

nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen (Abbildung 5.21 A und B). Die siRNA

hatte hingegen keinen Einfluss auf den Abbau von E-Cadherin in C. pneumoniae

infizierten Zellen.

Ergebnisse 72

Abbildung 5.21: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (48 hpi). (A) Die Western Blot Analysen zeigten, dass HIF-1α durch die siRNA herunterreguliert wurde. (B) Die densitometrische Auswertung von E-Cadherin ergab, dass Zellen mit einer Inhibition von HIF-1α eine unveränderte Expression von E-Cadherin gegenüber Zellen die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden aufwiesen. Nur in nicht-infizierten, IFN-γ behandelten Zellen konnte ein signifikanter Anstieg der Expression durch eine HIF-1α Inhibition detektiert werden (n=3, ***p≤0,001).

Auch 96 hpi konnte HIF-1α mittels siRNA signifikant inhibiert werden

(Abbildung 5.22 A). RNA-Interferenz von HIF-1α führte, im Vergleich zu den

Zellen die mit der Kontroll-siRNA behandelt wurden, in allen Konditionen zu einer

erniedrigten Expression von E-Cadherin (Abbildung 5.22 A und B). Nur in

C. pneumoniae infizierten Zellen war die Reduktion von E-Cadherin durch die

siRNA nicht signifikant.

Ergebnisse 73

Abbildung 5.22: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (96 hpi). (A) Die Western Blot Analysen zeigte, dass HIF-1α durch die siRNA herunterreguliert wurde. (B) Die densitometrische Auswertung von E-Cadherin zeigte, dass eine signifikant reduzierte Expression von E-Cadherin in Zellen die mit der siRNA gegen HIF-1α behandelt wurden vorlag. Nur C. pneumoniae infizierte Zellen ohne IFN-γ Stimulation zeigten keinen signifikanten Unterschied (n=3, *p≤0,05, ***p≤0,001).

Da zuvor beschrieben wurde, dass CPAF in der späten Phase der Infektion HIF-1α

degradiert, wurde die Expression von CPAF in infizierten Zellen (48 hpi) unter

Normoxie und Hypoxie analysiert. Die Expression von CPAF war hoch in infizierten

Zellen unter Hypoxie, die mit oder ohne IFN-γ stimuliert wurden. Dagegen konnte

keine Expression von CPAF in infizierten Zellen unter Normoxie detektiert werden

(Abbildung 5.23).

Ergebnisse 74

Abbildung 5.23: Western Blot Analysen von CPAF in C. pneumoniae infizierten A549 Zellen (48 hpi). Die Western Blot Analysen (A) und deren densitometrische Auswertung (B) zeigten, dass nur in infizierten Zellen unter Hypoxie und nicht unter Normoxie CPAF nachzuweisen war (n=4, ***p≤0,001).

Ergebnisse 75

5.5 Etablierung von Transkriptom-Analysen Um einen besseren Einblick in die transkriptionelle Regulation von C. pneumoniae

unter Normoxie und Hypoxie zu bekommen, sollten Transkriptom Analysen mittels

RNA-Sequenzierung etabliert werden. Zum Vergleich auf welche Weise das

chlamydiale Transkriptom am besten dargestellt werden kann, wurden zwei

verschiedene Aufreinigungs-Methoden analysiert. Die Auswertung der BioAnalyzer

Daten zeigte, dass die Abreicherung der humanen rRNA bei der Aufreinigung 2

effizienter war, als in der Aufreinigung 1 (Daten nicht dargestellt). Bei der

Aufreinigung 2 entfielen noch 6,5% der RNA in der Probe auf die 28S rRNA und

0,2% auf die 18S rRNA, wohingegen noch 26,3% auf die 28S rRNA und 1,1% auf

die 18S rRNA bei der Aufreinigung 1 zurückfielen.

Die RNA wurde in 3 Ansätzen parallel sequenziert. Um eine höhere Anzahl an

Sequenzen für die folgenden Auswertungen zu erhalten, wurden die

3 Sequenzierungen zusammen analysiert. Es zeigte sich eine 5x höhere Ausbeute an

Reads (vom Sequenzierer gemessene kleine Sequenzstücke) bei der Aufreinigung 2

verglichen zu der Aufreinigung 1 (8.425.321 vs. 44.702.024) (Abbildung 5.24). Die

Reads wurden mit dem chlamydialen und humanen Genom abgeglichen. Nur 5% der

Sequenzen von Aufreinigung 1 konnten auf das chlamydiale Genom zugeordnet

werden, wohingegen 8% von der Aufreinigung 2 zugeordnet werden konnten. Bei

beiden Methoden ging jedoch der größte Teil der Sequenzen auf das humane Genom

zurück. Zudem konnte ein Teil der Sequenzen auf keines der beiden Genome

zugeordnet werden. Um auszuschließen, dass es sich bei diesen Sequenzen um

Kontaminationen, z.B. durch eine Mykoplasmen-Infektion der Zellkultur handelt,

wurden die Sequenzen mit den Genomen von Mycoplasma genitalium sowie

Mycoplasma hominis verglichen. Die Sequenzen konnten jedoch nicht zu einem der

Referenzgenome zugeordnet werden (Daten nicht dargestellt).

Ergebnisse 76

Abbildung 5.24: Zuordnung der Sequenzen auf das humane und chlamydiale Genom. Bei der Sequenzierung der Aufreinigung 1 (A) konnten 5% der Reads auf das chlamydiale Genom abgebildet werden und bei der Aufreinigung 2 (B) 8%. Die Reads wurden von 3 Sequenzierungen addiert.

Ergebnisse 77

Folgend wurde die Abdeckung des chlamydialen Genoms genauer betrachtet. Es

wurde analysiert wie häufig Gene eine bestimmte Abdeckung an Sequenzen

aufwiesen (Abbildung 5.25). In der Aufreinigung 1 wies der Großteil der Gene eine

Abdeckung < 10 auf. Höhere Abdeckungen (bis zu 120) fanden sich nur noch

vereinzelt wieder. Dahingegen zeigte die Aufreinigung 2, dass die meisten Gene eine

Abdeckung von ca. 50 aufwiesen. Bei einzelnen Genen konnte eine Abdeckung bis

zu 250 nachgewiesen werden.

Abbildung 5.25: Häufigkeit der Sequenz-Abdeckung pro Gen. In der Aufreinigung 1 (A) zeigten viele Gene eine geringe Sequenzabdeckung, wohingegen bei der Aufreinigung 2 (B) die Gene im Durchschnitt eine Abdeckung von ca. 50 aufwiesen.

Bei weiteren Analysen sollte näher charakterisiert werden, ob die Aufreinigung 1

und 2 einen Einfluss auf das Expressionsprofil der mRNA hatte. Dafür wurde mittels

einer quantitativen RT-PCR die Expression verschiedenster chlamydialer Gene in

den Aufreinigungen mit der Expression in cDNA von total-RNA verglichen

(Abbildung 5.26). Die Mehrzahl der Gene in der Aufreinigung 2 war, verglichen zu

der total-RNA, erhöht. Dahingegen wiesen die Expressionen der meisten Gene der

Aufreinigung 1 eine ähnliche Expression auf wie die total-RNA.

Ergebnisse 78

Abbildung 5.26: Vergleich der mRNA Expression von chlamydialen Genen zwischen verschiedenen RNA-Aufreinigungen. Die Genexpressionen (24 hpi) der Aufreinigung 1 und Aufreinigung 2 wurden mit der Genexpression von total-RNA verglichen. Die Aufreinigung 1 ähnelte der Genexpression der total-RNA, wohingegen die Aufreinigung 2 erhöhte Expressionen aufwies (n=1).

Ergebnisse 79

5.6 Etablierung von Metabolom-Analysen Um weitere Einsichten zu dem erhöhten Wachstum sowie der aufgehobenen

Persistenzinduktion unter Hypoxie zu erhalten, wurde eine Metabolom-Analyse in

Kooperation mit Constanze Müller aus der AG Schmitt-Kopplin, Abteilung

Analytische BioGeoChemie des Helmholtz Zentrums München, durchgeführt. Dazu

wurden HEp-2 Zellen mit und ohne C. pneumoniae-Infektion sowie mit und ohne

IFN-γ Stimulation unter Normoxie und Hypoxie analysiert.

5.6.1 Hauptkomponentenanalyse

Um einen ersten visuellen Überblick über die Proben-Separation zu erhalten, wurde

eine Hauptkomponentenanalyse der Massen, gemessen bei positiver Polarität im

FT/ICR-MS, durchgeführt. Zur besseren Darstellung wurden die normoxischen von

den hypoxischen Konditionen getrennt analysiert. Unter Normoxie zeigte sich, dass

die 10 Replikate einer Kondition jeweils eine Gruppe bildeten (Abbildung 5.27 A).

Dabei unterschieden sich die Replikate der akut infizierten Zellen sowie der IFN-γ

behandelten Zellen unter Normoxie von den beiden anderen Konditionen. Lediglich

die Replikate der nicht-infizierten Zellen überschnitten sich mit denen der

persistenten Infektion. Unter Hypoxie bildeten die 10 Replikate einer Kondition

ebenfalls jeweils eine Gruppe, wobei die verschiedenen Konditionen eindeutig

voneinander separiert werden konnten (Abbildung 5.27 B).

Ergebnisse 80

Abbildung 5.27: Hauptkomponentenanalyse des Datensets. Jeweils ein Punkt stellt eine Probe dar. 10 Replikate pro Kondition wurden unter Normoxie (A) und Hypoxie (B) analysiert. Dabei zeigte sich unter Normoxie und Hypoxie, dass die Replikate einer Kondition jeweils eine Gruppe bildeten. Unter Normoxie waren die IFN-γ stimulierten, nicht-infizierten und C. pneumoniae infizierten Zellen getrennt voneinander darzustellen, wohingegen die nicht-infizierten und C. pneumoniae infizierten Zellen nicht voneinander separierten. Unter Hypoxie separierten die Konditionen voneinander (n=10).

Ergebnisse 81

5.6.2 Unterschiede der Metabolite in infizierten Zellen unter Normoxie und Hypoxie

Die für die Infektion relevanten Metabolite, welche sich bei einer Infektion unter

Normoxie und Hypoxie unterschieden, wurden annotiert und in die Datenbank

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) geladen, um eine Übersicht der

veränderten Stoffwechselwegen zu erhalten. In C. pneumoniae infizierten Zellen

ohne IFN-γ Behandlung waren in allen Stoffwechselwegen Metabolite zu

detektieren, die unter Normoxie höher waren als unter Hypoxie. Ebenfalls waren

Metabolite in einigen Stoffwechselwegen zu detektieren die signifikant höher unter

Hypoxie als unter Normoxie waren. Diese fanden sich vor allem im

Lipid-Metabolismus wieder. Während einer Infektion unter Normoxie mit IFN-γ

Stimulation wurden ebenfalls in allen Stoffwechselwegen Metabolite mit erhöhter

Konzentration zu Hypoxie gefunden. Dahingegen waren nur 3 Metabolite, die zum

Aminosäure-Metabolismus gehörten, unter Hypoxie erhöht.

Tabelle 5.1: Übersicht über die Veränderung der Stoffwechselwege der Infektion relevanter Metabolite. Analysiert wurde wie viele Metabolite in dem jeweiligen Stoffwechselweg erhöht in der entsprechenden Kondition vorlagen.

Cpn Cpn + IFN-γ

Metabolismus von 20% O2 > 2% O2

20% O2 < 2% O2

20% O2 > 2% O2

20% O2 < 2% O2

Kohlenhydraten 8 3 80 -

Energie 5 - 2 -

Lipiden 6 30 47 -

Aminosäuren 11 7 2 3

Nukleotiden 8 1 6 -

Glykanen 2 - 5 -

Kofaktoren + Vitaminen 8 5 7 -

Ergebnisse 82

Zur Validierung dieser Methode sollte Tryptophan herangezogen werden.

Tryptophan wird von IFN-γ induziertem IDO abgebaut und trägt damit zur

Persistenzinduktion von C. pneumoniae bei. In ersten Analysen zeigte sich eine

verminderte Expression von IDO unter Hypoxie (Abschnitt 5.2.2), weshalb die

Vermutung vorlag, dass Tryptophan unter Hypoxie in höherer Konzentration

vorliegen müsste. Tatsächlich konnte Tryptophan in dieser Metabolom-Analyse als

ein für die Infektion relevantes Metabolit in IFN-γ behandelten Zellen detektiert

werden. Die Massenintensität von Tryptophan war unter Hypoxie höher als unter

Normoxie. Daher wurde die Massenintensität von Tryptophan über das gesamte

Datenset analysiert (Abbildung 5.28). Es zeigte sich ein Abbau von Tryptophan in

IFN-γ behandelten Zellen. Jedoch war der Abbau signifikant stärker unter Normoxie

als unter Hypoxie. Zudem konnte auch in C. pneumoniae infizierten Zellen ein

geringerer Abbau detektiert werden.

Abbildung 5.28: Massenintensität von Tryptophan in IFN-γ behandelten HEp-2 Zellen. Tryptophan wurde mittels FT/ICR-MS detektiert und dessen Massenintensität dargestellt. Tryptophan wurde verstärkt unter Normoxie in IFN-γ (10 U/ml) behandelten Zellen abgebaut und weniger unter Hypoxie (n=10, * p≤0,05, **p≤0,005, ***p≤0,001).

Diskussion 83

6 Diskussion

6.1 Hypoxie verhindert die Persistenzinduktion von C. pneumoniae

COPD ist eine chronische Erkrankung der Lunge, die sich in unterschiedlichen

Stadien mit dem Bild einer chronischen Bronchitis oder eines Lungenemphysems

manifestieren kann. Ursächlich hierfür wird ein chronisch-rezidivierender

Entzündungsprozess angenommen. Das vorherrschende Zytokinprofil in der Lunge

von COPD-Patienten ist das einer Th1-vermittelten Immunantwort, mit IFN-γ als

Hauptakteur [55]. In der Lunge wird IFN-γ zur Abwehr von einer Reihe bakterieller

und viraler Infektionen benötigt [107]. Dazu zählen auch Infektionen mit

C. pneumoniae. Jedoch führt eine niedrige IFN-γ Konzentration nicht zum Absterben

von C. pneumoniae, sondern löst die Persistenz aus [9]. In einer Studie von

Knobloch et al. wiesen gerade Th-1 Lymphozyten von Rauchern mit einer COPD

eine verminderte Immunantwort und damit eine reduzierte Sekretion von IFN-γ

gegen Gram-negative Bakterien auf [60]. Eine unzureichende IFN-γ Konzentration

in Patienten mit COPD könnte demnach die Persistenzinduktion von C. pneumoniae

begünstigen. Ein wesentliches Charakteristikum in der Pathophysiologie der COPD

ist die emphysematöse Lungenschädigungen und Verdickung der Atemwegswände

der kleinen Bronchien. Dadurch wird die elastische Rückstellkraft der Lunge von

COPD Patienten reduziert, welche zur Ausatmung benötigt wird. Als Folge sinkt die

Sauerstoffverfügbarkeit der Lunge durch Lufteinschlüsse (trapped air) [47;48;77].

Weiterhin können Entzündungsprozesse durch den Einstrom von Entzündungszellen

zu einer verminderten Sauerstoffverfügbarkeit im Gewebe beitragen [14]. Bisher ist

bekannt, dass niedrige Sauerstoffkonzentrationen einen positiven Einfluss auf das

Wachstum von C. pneumoniae ausüben. So liegt eine höhere Infektionsrate und ein

besseres Wachstum von C. pneumoniae bei niedrigen Sauerstoffkonzentrationen vor

[56]. Voraussetzung hierfür ist jedoch die Stabilisierung von HIF-1α, dem zentralen

Regulator zur Aufrechterhaltung der Homöostase unter Hypoxie [97]. Unklar war

bislang, ob die umgebende Sauerstoffkonzentration auch einen Einfluss auf die

IFN-γ vermittelte Persistenz von C. pneumoniae hat. Es konnte in der vorliegenden

Arbeit gezeigt werden, dass Hypoxie die IFN-γ induzierte Persistenz von

C. pneumoniae verhindert. Dabei entsprach die Morphologie der Inklusion und die

Wiederanzuchtsrate von C. pneumoniae mit IFN-γ Behandlung den Kontrollen ohne

Diskussion 84

IFN-γ unter Normoxie. Die durch IFN-γ induzierte Immunantwort ist demzufolge bei

niedrigen Sauerstoffverhältnissen nicht ausreichend, um das intrazelluläre Wachstum

von C. pneumoniae in Epithelzellen zu unterdrücken. Eine reduzierte IFN-γ Aktivität

durch eine verminderte Sauerstoffverfügbarkeit in der Lunge könnte auch für andere

respiratorische Erreger eine Rolle spielen. So wurde in der Studie von Aberle et al.

eine geringe IFN-γ Konzentration mit dem Schweregrad einer Respiratorischen

Synzytial-Virus-Infektion (RSV) assoziiert. RSV-Infektionen sind ursächlich für

akute Atemwegserkrankungen, die vor allem bei Säuglingen zur Entwicklung von

unteren Atemwegserkrankungen (z.B. Bronchitis) führen können. Kinder mit einer

niedrigen IFN-γ Konzentration im Blut wiesen einen schwereren Verlauf der

Infektion auf, als Kindern mit einer höheren IFN-γ Konzentration [1]. Zudem wurde

gezeigt, dass die Replikation und Knospung von RSV von der Aktivität der

PKCδ/HIF-1α/NF-κB Signalkaskade abhängig ist [71]. Dadurch könnte eine

RSV-Infektion unter Hypoxie begünstigt werden. Hypoxie scheint darüber hinaus

eine Vielzahl von Bakterien und Viren hinsichtlich der Pathogenität und des

Wachstumsverhalten zu beeinflussen [25]. So wies z.B. Pseudomonas aeruginosa

unter Hypoxie eine erhöhte Biofilmproduktion auf; Herpes simplex Viren zeigten ein

gesteigertes Wachstum und das Humane Herpesvirus-8 ging von einer latenten in

eine lytische Infektion über [2;21;25;122].

In dieser Arbeit zeigte sich, dass schon Sauerstoffkonzentrationen ≥ 3%

ausreichten, um die Persistenz von C. pneumoniae durch IFN-γ zu induzieren. Bei

einem Anstieg der Sauerstoffkonzentration von 2% auf 3% gab es einen starken

Abfall der Größe der Einschlusskörper und Wiederanzuchtsrate. Dies könnte

bedeuten, dass C. pneumoniae im Peribronchialgewebe, in dem

Sauerstoffkonzentrationen von ca. 4-6% vorherrschen [46;64], persistieren und erst

im Rahmen von entzündlichen Prozessen die mit einem Absinken der

Sauerstoffkonzentration einhergehen erneut replizieren.

Im Falle einer unzureichenden Immunantwort des Wirts unterliegen persistente

Chlamydien Reaktivierungen. In vitro geschieht die Reaktivierung durch Aufhebung

des Persistenzstimulus. In vivo sind hingegen Faktoren welche die Reaktivierung

begünstigen, bislang nicht beschrieben. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass

eine Reduktion der Sauerstoffverfügbarkeit dazu führte, dass persistente

C. pneumoniae wieder in den replikativen Entwicklungszyklus eintreten. Es ist

anzunehmen, dass unter pathophysiologischen Bedingungen in der Lunge, bei denen

Diskussion 85

die Sauerstoffverfügbarkeit abnimmt eine C. pneumoniae-Infektion reaktiviert,

benachbarte Zellen infiziert und der Entzündungsprozess aufrecht erhalten wird.

6.2 Hypoxie reduziert die Aktivität der Jak-STAT Signalkaskade

Ausschlaggebend bei der IFN-γ induzierten Persistenz von C. pneumoniae ist der

Tryptophanabbau durch IDO [86]. IDO ist das erste Enzym des Kynurenin-

Stoffwechselwegs und spaltet oxidativ den Indolring des Tryptophans, wodurch

N-Formylkynurenin entsteht. Die Induktion von IDO erfolgt über die IFN-γ

induzierte Jak-STAT Signalkaskade [79]. Nach Bindung von IFN-γ an den Rezeptor

findet eine Aktivierung von STAT1 durch Phosphorylierung des Tyrosins 701 und

Serin 727 statt [118]. Beide Phosphorylierungen werden für die maximale Aktivität

von STAT1 benötigt [118]. In der vorliegenden Arbeit war die IFN-γ induzierte

Phosphorylierung am Serin 727 (4 hpi) in infizierten Zellen unter Normoxie und

Hypoxie unverändert. Dahingegen war die durch IFN-γ induzierte Phosphorylierung

am Tyrosin 701 unter Normoxie in C. pneumoniae infizierten Zellen (4 hpi) höher

als in nicht-infizierten Zellen. Da eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung vorlag, ist

anzunehmen, dass C. pneumoniae infizierte Epithelzellen unter Normoxie während

der frühen Phase der Infektion eine erhöhte STAT1 Aktivität aufweisen und damit

die IFN-γ aktivierte antimikrobielle Antwort verstärken. Damit werden die Befunde

von Lad et al. gestützt, in denen eine Chlamydien-Infektion ebenfalls zu einer

verstärkten Aktivität einiger Mediatoren der Jak-STAT Signalkaskade führte [62].

Erstaunlicherweise wurde die erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung in C. pneumoniae

infizierten Zellen durch hypoxische Bedingungen aufgehoben. Daher ist

anzunehmen, dass die STAT1 Aktivität in infizierten Zellen unter Hypoxie

schwächer ist als unter Normoxie. Diese Vermutung spiegelte sich ebenfalls in der

Expression von IFN-γ regulierten Genen wieder (IDO, IP-10, SOCS1, SOCS3), die

unter Hypoxie signifikant reduziert vorlagen. Dies lässt darauf schließen, dass die

gesamte IFN-γ induzierte Jak-STAT Signalkaskade in der frühen Phase der Infektion

unter Hypoxie eine verminderte Aktivität aufwies. Bei der Expression von IDO

zeigte sich, dass diese nicht nur in infizierten Zellen sondern auch in nicht-infizierten

Zellen unter hypoxischen Bedingungen herunterreguliert war. Roth et al. zeigten

zusätzlich eine verminderte Enzymaktivität von IDO bei geringer

Sauerstoffverfügbarkeit [96]. Eine geringe IDO Expression in hypoxischen Zellen

Diskussion 86

lässt auf eine höhere Konzentration an Tryptophan schließen. Da ein

Tryptophanentzug das Wachstum von C. pneumoniae einschränkt und die Persistenz

induziert [86], ist eine erhöhte Tryptophankonzentration unter Hypoxie eine

mögliche Erklärung, weshalb C. pneumoniae in Hypoxie nicht persistiert. Auch

andere Pathogene werden von einem Tryptophanabbau durch IFN-γ induziertes IDO

beeinflusst. Dazu zählen Toxoplasmen, Streptokokken, Enterokokken und

Staphylokokken [68;69;90;102]. Diese Erreger könnten folglich ebenfalls von einer

geringen Sauerstoffverfügbarkeit profitieren. Untersuchungen von Ivanov et al. zum

Einfluss von Hypoxie auf die STAT1-Expression zeigten, dass die Expression von

STAT1 unter hypoxischen Bedingungen in einem HIF-1 abhängigem Prozess

erniedrigt war [53]. HIF-1α wird bei ausreichender Sauerstoffverfügbarkeit durch

VHL abgebaut, bleibt jedoch stabil unter Hypoxie und induziert als

Transkriptionsfaktor u.a. Gene der Glykolyse, Angiogenese und des Zellüberlebens

[103]. Durch hypoxische HIF-1α Stabilisierung oder in VHL-defizienten Zellen

zeigte sich eine erhöhte STRA13 (stimulated with retinoic acid 13) Expression,

einem Transkriptionsfaktor der bHLH Familie (basic helix-loop-helix). Dieser weist

eine Hemmungsaktivität gegenüber STAT1 auf. Eine negative Wirkung von HIF-1

auf die Phosphorylierung von STAT1 am Tyrosin 701 konnte in VHL-defizienten

Zellen jedoch nicht nachgewiesen werden [53]. Daher ist anzunehmen, dass die hier

gezeigte Reduzierung der Tyrosin-Phosphorylierung durch Hypoxie nicht durch

HIF-1 bedingt war.

Die Signaltransduktion der Jak-STAT Signalkaskade wird über IFN-γ induzierte

SOCS-Proteine reguliert [5]. SOCS-Proteine können mit ihrer SH-2 Domäne

Tyrosin-Phosphorylierungen binden, die am IFNGR oder am Jak-Protein zu finden

sind. Dadurch inhibieren sie die Aktivität der Jaks, konkurrieren um diese

Bindestelle mit STAT1 oder markieren die gebundenen Signalmoleküle zur

Degradation durch das Proteasom [123]. In der Forschungsarbeit von Yang et al.

wurde bei einer C. pneumoniae-Infektion von Mäusen eine erhöhte SOCS1 und

SOCS3 Expression im Lungengewebe nachgewiesen, wodurch eine unkontrollierte

IFN-γ Signalwirkung verhindert wurde. SOCS1-defiziente Mäuse wiesen zwar eine

niedrigere Bakterienlast von C. pneumoniae auf, die mit einer erhöhten IDO

Expression in der Lunge einherging, jedoch starben diese Mäuse auf Grund von

schwerer Lungenentzündung [125]. Der in der vorliegenden Arbeit beschriebene

Effekt der reduzierten IDO Expression unter Hypoxie scheint jedoch SOCS

Diskussion 87

unabhängig zu sein, da nach Stimulation mit IFN-γ unter Hypoxie SOCS1 und

SOCS3 ebenfalls erniedrigt in infizierten Zellen vorlagen.

IDO trägt ein GAS-Element in seiner Promotorregion, wodurch es über die

Jak-STAT Signalkaskade induziert wird [18]. Jedoch waren nicht nur über das GAS-

Element aktivierte IFN-γ regulierte Gene unter Hypoxie vermindert exprimiert, auch

IP-10, welches über eine ISRE-Sequenz aktiviert wird [81], zeigte eine verminderte

Expression unter Hypoxie (4 hpi). Da u.a. Typ I Interferone die Transkription von

Genen mit einer ISRE-Sequenz induzieren, wäre es möglich, dass auch Typ I

Interferone eine geringere Wirkung unter Hypoxie aufweisen. Die reduzierte

Expression des Chemokins IP-10 unter Hypoxie könnte zudem Auswirkungen auf

die Th1 Lymphozyten Rekrutierung haben, da dieses Chemokin über den

C-X-C Chemokinrezeptor Typ 3 (CXCR3) zur Rekrutierung von Th1 Immunzellen

führt [13].

Im Gegensatz zu der frühen Phase der Infektion (4 hpi) lag in den späteren

Phasen (24 hpi und 48 hpi) kein signifikanter Unterschied zwischen Normoxie und

Hypoxie in der IFN-γ induzierten Phosphorylierung des Tyrosins 701 sowie

Serins 727 am STAT1 in infizierten Zellen vor. In nicht-infizierten Zellen 48 hpi lag

hingegen eine erhöhte Tyrosin-Phosphorylierung am STAT1 unter Hypoxie

verglichen zu Normoxie vor. Gleichzeitig mit der gesteigerten

Tyrosin-Phosphorylierung am STAT1 unter Hypoxie, war auch die Genexpression

von IP-10 und IDO in nicht-infizierten Zellen sowie C. pneumoniae infizierten

Zellen unter Hypoxie gesteigert. Vermutlich lag eine kompensatorische

Hochregulation der Jak-STAT Signalkaskade zu späten Zeitpunkten der Infektion

unter Hypoxie vor. Erstaunlicherweise zeigte die IDO Proteinexpression keine

Veränderung und verblieb unter Hypoxie, im Vergleich zu Normoxie, erniedrigt. Ein

geringer Proteingehalt von IDO unter Hypoxie könnte zum einen Folge einer

erhöhten Degradation des Proteins oder zum anderen einer länger dauernden

post-trankriptionellen Modifizierungen von IDO unter Hypoxie sein. Bisher ist

jedoch über Modifizierungen, die zur Feinabstimmung der IDO Expression beitragen

wenig bekannt. Huck et al. zeigten, dass Stickstoffmonoxid (NO), gebildet durch die

induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (iNOS) in Epithelzellen, eine Degradation

von IDO über das Proteasom begünstigt [49]. Jedoch konnte eine Beteiligung von

NO an der reduzierten IDO Expression unter Hypoxie von Roth et al. ausgeschlossen

werden, da sich die iNOS Expression unter Hypoxie nicht veränderte [96].

Diskussion 88

6.3 Entzündungsvorgänge in persistent infizierten Zellen Der fortschreitende Lungengerüstumbau bei COPD-Patienten ist gekennzeichnet

durch chronisch-rezidivierende Entzündungsvorgänge sowie Umbauprozesse. So

konnte im Serum von COPD-Patienten eine erhöhte IL-6 Konzentration

nachgewiesen werden [28]. Dieser Entzündungsmarker konnte in einer mehrjährigen

Studie in Zusammenhang mit einem reduzierten FEV1 gebracht werden, an dem das

Fortschreiten einer COPD gemessen werden kann. Ein schneller Anstieg der IL-6

Sputumkonzentration wurde in Patienten mit hohen Exazerbationsraten und dadurch

bedingtem reduzierten FEV1 nachgewiesen. Patienten mit stabiler Erkrankung

wiesen hingegen einen langsameren Anstieg der IL-6 Konzentration auf [26]. Ein

Anstieg der IL-6 Expression konnte auch in vitro durch eine C. pneumoniae-

Infektion gezeigt werden [29]. In der Regulation der IL-6 Expression ist NF-κB ein

wichtiger Regulator [65]. Jedoch war der Nachweis einer C. pneumoniae-Infektion in

Lungengewebe von Patienten mit einer stabilen COPD Erkrankung (GOLD I-III)

nicht mit einer erhöhten Expression von proinflammatorischen Zytokinen und einer

Aktivierung des NF-κB Signalwegs verbunden [27]. Aus in vitro Versuchen ist

zudem bekannt, dass bei langanhaltender, persistenter C. pneumoniae-Infektion, wie

sie mutmaßlich bei der COPD vorliegt, keine Wirtszell-Antwort, gemessen an der

Sekretion von z.B. IL-8 und IL-11 auftritt [89].

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob eine C. pneumoniae induzierte

IL-6 Expression durch Hypoxie beeinflusst wird. Zudem wurde der Einfluss einer

persistenten und reaktivierten Infektion durch Hypoxie auf die IL-6 Expression

analysiert. Im humanen Lungengewebs-Modell induzierte eine akute

C. pneumoniae-Infektion die Expression von IL-6. Dabei hatte der Sauerstoffgehalt

keinen Einfluss auf die Expression von IL-6. Daneben führte auch eine persistente

C. pneumoniae-Infektion zu einer vermehrten IL-6 Expression in

Lungenepithelzellen. Damit werden die Befunde von Baltch et al. gestützt, in denen

keine aktive C. pneumoniae-Infektion notwendig war, um die IL-6 Expression zu

stimulieren [7]. Interessanterweise führte eine durch Hypoxie reaktivierte

C. pneumoniae-Infektion zwar zu einer IL-6 Expression, doch war diese vermindert

im Gegensatz zu einer persistenten Infektion. Eine in der Lunge erhöhte IL-6

Expression wurde von Pedroza et al. mit der Entstehung der pulmonalen Fibrose in

Zusammenhang gebracht [87].

Diskussion 89

IL-6 weist in seiner Promotorregion eine IRF-1 Bindungsstelle auf [31].

Vermutlich konnte deshalb in der vorliegenden Arbeit ebenfalls eine erhöhte

Expression von IL-6 in IFN-γ behandelten Zellen detektiert werden. Neben IP-10,

welches ebenfalls eine IRF-1 Bindungsstelle aufweist, war auch die IFN-γ induzierte

Expression von IL-6 unter Hypoxie geringer als unter Normoxie. Dies ist ebenfalls

auf die verminderte IFN-γ Wirkung unter Hypoxie zurückzuführen.

6.4 C. pneumoniae vermittelt Umbauprozesse von Epithelzellen

Es existieren verschiedene Entstehungsmodelle wie eine C. pneumoniae-Infektion

chronische Erkrankungen fördert. So wurde angenommen, dass infizierte Epithel-

oder Endothelzellen Zytokine exprimieren, die zur Rekrutierung und Aktivierung

von Immunzellen führen (Abbildung 6.1). Diese sekretieren weitere Zytokine und

Wachstumsfaktoren, welche schließlich bei andauernder Ausschüttung zu

Umbauprozessen und Vernarbung des Gewebes führen [104]. Zudem konnte gezeigt

werden, dass eine C. pneumoniae-Infektion von Makrophagen, die von COPD

Patienten stammten, ein Ungleichgewicht von pro- und antiinflammatorischen

Zytokinen herbeiführte, welches für die Entstehung von Umbauprozessen

verantwortlich gemacht wurde [98].

Diskussion 90

Abbildung 6.1: Schematische Darstellung des Einfluss einer Chlamydien-Infektion auf Umbauprozesse von Gewebe. Durch eine Chlamydien-Infektion sekretieren Epithelzellen Zytokine, welche Immunzellen aktivieren. Eine chronische Ausschüttung von Zytokinen durch aktivierte Immunzellen führt zu Umbauprozessen und Vernarbung von Gewebe. Abbildung aus [104].

Ob eine C. pneumoniae-Infektion von Epithelzellen tatsächlich Einfluss auf zelluläre

Umbauprozesse hat, sollte anhand der Expression von E-Cadherin, α-SMA und der

Beweglichkeit von Epithelzellen untersucht werden. Es konnte gezeigt werden, dass

eine C. pneumoniae-Infektion unter Normoxie und Hypoxie die Differenzierung von

Lungenepithelzellen induzierte, was gekennzeichnet war durch eine erniedrigte

E-Cadherin und eine erhöhte α-SMA Expression. E-Cadherin wird hauptsächlich in

Epithelzellen exprimiert, wo es mit Cateninen interagiert und Adhärenzverbindungen

bildet. Diese verbinden das Aktin zweier Zellen miteinander und bilden so eine

dichte, polarisierte Zellschicht, die Barriere- und Transport-Funktionen übernimmt

[37]. α-SMA ist ein Bestandteil von Stressfasern in Myofibroblasten und daher ein

sicherer Marker für die Differenzierung zu Myofibroblasten [23]. Ein Abbau von

Diskussion 91

E-Cadherin führt zum Verlust der Zell-Zell-Kontakte und durch die Expression von

α-SMA weisen die Zellen einen mesenchymalen Charakter auf. Weiterhin verändert

sich während eines Remodelingprozess die Zusammensetzung der extrazellulären

Matrix (z.B. Kollagen) [33]. Bereits Baumert et al. berichteten, dass eine

C. pneumoniae-Infektion von Fibroblasten und glatten Muskelzellen zu einer

Herunterregulation von Typ I/II Kollagen und Fibronektin führt [8]. Durch

verminderte Zellkontakte weisen Zellen mit mesenchymalem Charakter auch eine

erhöhte Migrationsaktivität auf. Eine erhöhte Beweglichkeit konnte mittels Live-Cell

Imaging bei infizierten Zellen unter Normoxie nachgewiesen werden und bestärken

damit den Befund des strukturellen Umbaus der Zelle durch eine

C. pneumoniae-Infektion.

Zuvor wurden niedrige Sauerstoffverhältnisse mit Umbauprozessen in

Lungenepithelzellen in Zusammenhang gebracht. Dabei zeigten Zhou et al., dass ab

dem achten Tag einer hypoxischen Inkubation Lungenepithelzellen einen

mesenchymalen Phänotyp aufwiesen [126]. In der vorliegenden Arbeit konnte jedoch

kein Umbau allein durch Hypoxie detektiert werden. Dennoch stehen diese

Ergebnisse nicht im Gegensatz zueinander, da in dieser Arbeit frühere Zeitpunkte

untersucht wurden.

Des Weiteren zeigte sich, dass ein andauernder Stimulus von IFN-γ auf

Epithelzellen in einer reduzierten E-Cadherin Expression resultierte. Dieser Effekt

konnte jedoch nur unter Normoxie dargestellt werden, da unter Hypoxie die Wirkung

von IFN-γ vermindert war. Schon zuvor wurde in einem Mausmodel gezeigt, dass

die Überexpression von IFN-γ zu Emphysembildung sowie zu einem

COPD-ähnlichen Phänotyp führte [115]. Umbauprozesse die durch IFN-γ induziert

werden, könnten auch in anderen Infektionen bei denen eine IFN-γ Reaktion

herbeigeführt wird eine Rolle spielen.

Um den Mechanismus des Umbauprozesses durch C. pneumoniae zu

charakterisieren, wurde die Rolle des am besten beschriebenen Mediators (TGF-β1)

des Remodelings in Lungenepithelzellen analysiert. Die Wirkung von TGF-β1

erfolgt über Bindung an die TGF-β Rezeptoren Typ I, woraufhin diese multimere

Rezeptormoleküle bilden. Die aktivierten Rezeptoren haben eine Serin/Threonin-

Kinaseaktivität und phosphorylieren Rezeptor-regulierte SMAD-Proteine

(small mother against decapentaplegic), welche im Zytosol einen Komplex mit

Co-SMAD bilden. Der Komplex wandert in den Zellkern und kooperiert mit

Diskussion 92

weiteren DNA-Bindungspartnern, um die Expression spezifischer Zielgene zu

aktivieren [66;72]. Für die Untersuchungen wurde ein Inhibitor (SB-431542)

eingesetzt, der spezifisch die TGF-β Rezeptoren Typ I, ALK4 (activin receptor-like

kinase), ALK5 und ALK7 inhibiert und dadurch die Signalübertragung durch

TGF-β1 blockiert. Die weiteren ALKs, die wichtig für die Signalübertragung anderer

Mitglieder der TGF-β Superfamilie sind, werden nicht durch SB-431542 inhibiert

[52]. Es zeigte sich, dass der durch eine C. pneumoniae-Infektion herbeigeführte

E-Cadherin Abbau nicht durch eine Inhibition der TGF-β1 Signaltransduktion

unterbunden werden konnte. Hier liegt somit ein TGF-β1 unabhängiges Ereignis vor.

Der Remodelingprozess in dieser Arbeit war während einer Infektion (96 hpi)

unter Hypoxie stärker ausgeprägt. Um zu analysieren, ob HIF-1 als zentraler

Regulator der Homöostase unter Hypoxie einen Einfluss auf die Umbauprozesse

hatte, wurden HIF-1α Inhibitions-Experimente durchgeführt. In der mittleren Phase

der Infektion (48 hpi) spielte HIF-1 keine Rolle bei den Umbauprozessen und so

zeigten Zellen, die durch RNA-Interferenz kein HIF-1α bildeten, keine Veränderung

in ihrem Expressionsprofil von E-Cadherin. Dahingegen kam HIF-1α zu späteren

Zeitpunkten (96 hpi) eine protektive Funktion zu. Es schützte vor einer

mesenchymalen Differenzierung, denn in Zellen mit HIF-1α Inhibition zeigte sich

eine Zunahme des E-Cadherin Abbaus. Allerdings wird HIF-1α in C. pneumoniae

infizierten Zellen in der mittleren und späten Phase des Entwicklungszyklus von

CPAF degradiert [97]. In infizierten Zellen unter Hypoxie wurde CPAF verstärkt

exprimiert. Der verstärkte Abbau von E-Cadherin in infizierten Zellen unter Hypoxie

könnte somit durch CPAF verursacht werden, welches direkt mit HIF-1α interagiert.

Dadurch könnte in infizierten Zellen unter Hypoxie HIF-1 verursachte

Reperaturmechanismen vermieden werden.

Diskussion 93

6.5 Weiterführende Analysen zu C. pneumoniae Infektionen unter Hypoxie

In dieser Arbeit stand die Analyse der IFN-γ induzierten Persistenz im Vordergrund.

Um jedoch ein umfassenderes Bild der Wirt-Pathogen Interaktion unter Normoxie

und Hypoxie zu bekommen, wurden weitergehende Analysen vorgenommen. Zuerst

sollte eine Transkriptom Analyse etabliert werden, um für zukünftige Projekte

Einblicke in die Unterschiede der transkriptionellen Regulation von C. pneumoniae

unter Normoxie und Hypoxie zu bekommen.

Durch die Entstehung von Sequenzierungen der zweiten Generation

(next generation sequencing), wie der RNA-Sequenzierung ist es möglich geworden,

die gesamten Transkripte einer Zelle (Transkriptom) während einer

Entwicklungsphase oder einer physiologischen Kondition zu bestimmen. So

bekommt man eine Momentaufnahme der Zelle [114]. Mit dieser quantitativen

Methode ist es möglich, die bakterielle Regulation und auch Interaktion mit dem

Wirt zu bewerten und zu beschreiben [32].

Der Anteil der mRNA einer Zelle geht auf 3-5% der total-RNA zurück. Deshalb

wird eine Anreicherung der kodierenden RNA empfohlen, um den Anteil der

Genabdeckung zu erhöhen [32]. Die Anreicherung von prokaryotischer mRNA ist im

Gegensatz zu eukaryotischer mRNA, bei der die polyA-Enden der mRNA zur

Separation genutzt werden können, jedoch schwierig. Eine weitere Limitierung bei

der Darstellung des Transkriptoms von C. pneumoniae ist die intrazelluläre

Lebensweise, wodurch die bakterielle RNA nur in Kombination mit humaner RNA

isoliert werden kann. Es gibt verschiedene Verfahren um die kodierenden RNAs

einer Probe anzureichern. Albrecht et al. nutzten für das Transkriptom von

C. trachomatis und C. pneumoniae ein Verfahren, um die 5‘-Enden der primären

Transkripte anzureichern. Dadurch konnten Transkriptionsstartpunkte analysiert

werden [3;4]. In dieser Arbeit wurden zwei Methoden zur Reduktion des Gehalts an

rRNA sowie des humanen Hintergrundes angewendet und die Effizienzen

verglichen. Es zeigte sich, dass die Aufreinigung 2 eine höhere Abreicherung des

humanen Hintergrunds aufwies. Dadurch konnte eine höhere Anzahl an

chlamydialen Reads und eine höhere Genabdeckung erzielt werden. Dagegen war die

Abreicherung des humanen Hintergrunds bei der Aufreinigung 1 geringer, wodurch

weniger Reads und eine geringere Genabdeckung erreicht wurden. Die

Aufreinigung 2 zeigte, dass die meisten Gene eine Abdeckung von ca. 50 aufwiesen.

Diskussion 94

Dies stellte vermutlich den transkriptionellen Hintergrund dar. Dagegen wiesen in

der Aufreinigung 1 nicht alle Gene eine Abdeckung auf und vermutlich wurden nur

aktivierte Gene dargestellt. Durch eine höhere Anzahl an Sequenzierungen die pro

Probe durchgeführt werden, könnte die Anzahl an Sequenzen erhöht werden, so dass

die Aufreinigung 1 ebenfalls zur Darstellung des Transkriptoms geeignet wäre.

Deutliche Unterschiede zwischen den beiden Aufreinigungs-Methoden zeigten

sich bei dem Vergleich der Genexpression in der quantitativen RT-PCR verglichen

mit der total-RNA, die als Referenzexpression genutzt wurde. Die Aufreinigung 2

wies häufig ein abweichendes Expressionsprofil der analysierten Gene auf,

wohingegen die Aufreinigung 1 der total-RNA glich. Eine Erklärung dafür könnte

die Differentialzentrifugation sein, welche in der Aufreinigung 2 noch vor der

RNA-Isolation durchgeführt wurde. Aufgrund der starken Artefakte des

Transkriptoms durch die Differentialzentrifugation ist diese Aufreinigung nicht für

Transkriptom Analysen zu empfehlen. Zukünftig soll die Aufreinigung 1 genutzt

werden, um Veränderungen des chlamydialen Transkriptoms durch eine hypoxische

Inkubation zu analysieren.

Auch für das Metabolom der Zelle sollte eine Momentaufnahme von

verschiedenen Konditionen erstellt werden. Dazu wurde eine Methode durchgeführt,

die nicht zielgerichtet (non-targeted) auf eine Hypothese war und schon in

vorherigen Studien erfolgreich genutzt wurde, um z.B. den Einfluss von Metaboliten

der Darm-Mikrobiota auf die chronisch entzündliche Darmerkrankung Morbus

Crohn zu untersuchen [54]. Bei der Durchführung einer Hauptkomponentenanalyse

mit den erhaltenen Massen aus dem FT/ICR-MS zeigte sich eine Gruppierung der

Replikate und eine Separation der Konditionen voneinander. Dies bestätigte, dass

eine hohe Reproduzierbarkeit vorlag und sich die Metabolome der verschiedenen

Konditionen stark unterschieden. Nur die Gruppe der persistent infizierten Zellen

ließ sich nicht von den nicht-infizierten Zellen unter Normoxie trennen. Der Einfluss

von IFN-γ auf das Metabolom wurde demzufolge durch eine persistierende

C. pneumoniae-Infektion zum Teil aufgehoben und es glich einer nicht-infizierten

Zelle. Vermutlich werden daher persistente C. pneumoniae-Infektionen nicht richtig

vom Wirt erkannt. Die Massen, welche zu der Separation der Konditionen führten

und diskriminierend zwischen einer Infektion unter Normoxie und Hypoxie waren,

zeigten Veränderungen in einem breitem Spektrum von Signalwegen. Es waren

deutliche Unterschiede zwischen einer Infektion ohne IFN-γ in Normoxie und

Diskussion 95

Hypoxie sichtbar. Vor allem im Lipid- und Aminosäure-Metabolismus konnten viele

unterschiedlich regulierte Metabolite annotiert werden. Es ist bekannt, dass das

chlamydiale Genom einige Aminosäuretransporter kodiert, um Zwischenprodukte für

ihre unvollständigen Biosynthesewege zu erhalten [57;94;105]. Davon wird der

Aminosäure-Metabolismus in C. pneumoniae infizierten-Zellen vermutlich

beeinflusst. Zudem werden Wirtslipide, wie z.B. Sphingolipide, Phosphatidylcholin,

Phosphatidylinositol und Cholesterol, in die Inklusion transloziert. Auch

Chlamydien-spezifische verzweigtkettige Fettsäuren werden gebildet und in die

Inklusionsmembran eingebaut, womit sie sich vor der phagolysosomalen Fusion

schützen [16;39;40;121;124]. Welche Metabolite genau verändert sind und warum

Infektionen unter Normoxie und Hypoxie zu diesen Unterschieden führen soll in

weiteren Studien im Detail betrachtet werden.

Veränderungen im Lipid-Metabolismus waren auch bei dem Vergleich einer

persistenten Infektion unter Normoxie und einer aktiven Infektion unter Hypoxie mit

IFN-γ Behandlung zu finden. Auffällig waren zudem die starken Veränderungen im

Kohlenhydrat-Metabolismus. In diese Kategorie gehören u.a. die Glykolyse, der

Zitratzyklus oder auch der Pentosephosphatweg. Schon zuvor wurde beschrieben,

dass eine Chlamydien-Infektion mit einem erhöhten Kohlenhydrat-Metabolismus in

der Wirtzelle verbunden ist, welches den hohen Energieverbrauch in infizierten

Zellen kompensiert [83]. Auch unter hypoxischen Bedingungen konnte ein erhöhter

Glukose-Verbrauch in C. pneumoniae infizierten Zellen in der ersten Phase des

Entwicklungszyklus detektiert werden [97]. Zudem wurde zuvor in Studien, die u.a.

die chlamydialen Gene der Glykolyse oder des Pentosephosphatwegs analysierten,

gezeigt, dass diese sich in ihrer Regulation zwischen aktiver und persistenter

Infektion unterschieden [35;75]. Dennoch bleibt in weiteren Einzelheiten zu klären,

welche Metabolite verantwortlich für den Wechsel zwischen persistenten und aktiven

Wachstum bei IFN-γ unter Normoxie und Hypoxie sind. Dazu beitragen könnte z.B.

Tryptophan, welches in den IFN-γ behandelten Zellen während einer Infektion unter

Hypoxie erhöht detektiert wurde und zur Validierung dieser Methode genutzt werden

konnte. Bei der Betrachtung dieses Metabolits über alle analysierten Konditionen,

zeigte sich, dass dessen Massenintensität mit der Expression von IDO korrelierte.

Daher war ein starker Abbau von Tryptophan in IFN-γ behandelten Zellen unter

Normoxie zu detektieren, wohingegen in Zellen unter Hypoxie, in denen die

Expression von IDO reduziert war, ein geringerer Abbau nachzuweisen war. Somit

Diskussion 96

ließ sich mit dieser Methode die zuvor getätigte Vermutung bestätigen, dass bei einer

Infektion unter Hypoxie eine höhere Konzentration an Tryptophan in der Zelle

vorliegt. Damit hätte C. pneumoniae einen Wachstumsvorteil unter Hypoxie nach

IFN-γ Stimulation. Obwohl diese Metabolom-Analyse nicht zielgerichtet auf eine

Hypothese war, konnten zuvor getätigte Annahmen bestätigt und neue Ansatzpunkte

gefunden werden, die in Zukunft weiter im Detail betrachtet werden sollen. Bisher

wurden dabei jedoch nur die annotierten Metaboliten untersucht. Es ist weiterhin

anzustreben, unbekannte Massen zu identifizieren, um eventuell Biomarker oder

neue Angriffspunkte für Medikamente zu finden.

6.6 Schlussbetrachtung Aus den vorliegenden Ergebnissen wurde ein Modell entwickelt wie C. pneumoniae

und der Einfluss von Hypoxie zu Umbauprozessen und dadurch zur Pathogenese der

COPD beitragen könnten (Abbildung 6.2). Es zeigte sich, dass die antichlamydiale

Aktivität von IFN-γ nur unter Normoxie auftrat und dort zur Persistenz führte. Bei

einem Abfall der Sauerstoffkonzentration lag eine reduzierte IFN-γ Wirkung vor, die

mit einer vermindert ablaufenden Jak-STAT Signalkaskade, geringer IDO

Expression und dadurch erhöhter Tryptophankonzentration einherging. Dies war ein

Stimulus zur Reaktivierung. Eine reaktivierte sowie akute und persistente

C. pneumoniae Infektion war durch eine Entzündungsreaktion (IL-6)

gekennzeichnet. Zudem wiesen Zellen mit persistenter oder akuter Infektion eine

direkte Schädigung von Lungenepithelzellen auf. Die Entzündungsreaktion war

jedoch vermehrt während einer persistenten Infektion zu detektieren, wohingegen

zelluläre Umbauprozesse besonders stark während einer akuten Infektion unter

Hypoxie zu detektieren waren. Daher sind persistente und durch Hypoxie reaktivierte

Infektionen, die zu einer akuten Infektion führen, ein besonders starker Stimulus zur

Pathogenese der COPD. Die hier etablierten Transkriptom- und

Metabolom-Analysen können in Zukunft genutzt werden, um weitere Einblicke über

den Einfluss von Hypoxie auf C. pneumoniae zu erhalten.

Diskussion 97

Abbildung 6.2: Modell zu C. pneumoniae induzierten Umbauprozessen. (1) C. pneumoniae infiziert Lungenepithelzellen was zu einer akuten Infektion führt. (2) Bei einer abgeschwächten IFN-γ Immunabwehr gelang C. pneumoniae in die Persistenz. (3) Durch Reduktion der Sauerstoffkonzentration im Gewebe gelangen die persistenten C. pneumoniae wieder in ihren aktiven Entwicklungszyklus. Eine persistente Infektion hat einen verstärkten Einfluss auf die IL-6 Expression und auf direkte Umbauprozesse von Epithelzellen. Unter Hypoxie ist der Einfluss einer C. pneumoniae-Infektion auf Umbauprozesse verstärkt.

Literaturverzeichnis 98

Literaturverzeichnis

1. Aberle JH, Aberle SW, Dworzak MN, Mandl CW, Rebhandl W, Vollnhofer G, Kundi M, Popow-Kraupp T. (1999). Reduced interferon-gamma expression in peripheral blood mononuclear cells of infants with severe respiratory syncytial virus disease. Am J Respir Crit Care Med, 160:1263-1268.

2. Aghi MK, Liu TC, Rabkin S, Martuza RL. (2009). Hypoxia enhances the replication of oncolytic herpes simplex virus. Mol Ther, 17:51-56.

3. Albrecht M, Sharma CM, Dittrich MT, Muller T, Reinhardt R, Vogel J, Rudel T. (2011). The transcriptional landscape of Chlamydia pneumoniae. Genome Biol, 12:R98.

4. Albrecht M, Sharma CM, Reinhardt R, Vogel J, Rudel T. (2010). Deep sequencing-based discovery of the Chlamydia trachomatis transcriptome. Nucleic Acids Res, 38:868-877.

5. Alexander WS. (2002). Suppressors of cytokine signalling (SOCS) in the immune system. Nat Rev Immunol, 2:410-416.

6. Amann R, Springer N, Schonhuber W, Ludwig W, Schmid EN, Muller KD, Michel R. (1997). Obligate intracellular bacterial parasites of acanthamoebae related to Chlamydia spp. Appl Environ Microbiol, 63:115-121.

7. Baltch AL, Smith RP, Ritz WJ, Carpenter-Knaggs A, Michelsen PB, Carlyn CJ, Bopp LH, Hibbs JR. (2003). Levofloxacin kills Chlamydia pneumoniae and modulates interleukin 6 production by HEp-2 cells. Chemotherapy, 49:27-32.

8. Baumert J, Schmidt KH, Eitner A, Straube E, Rodel J. (2009). Host Cell Cytokines Induced by Chlamydia pneumoniae Decrease the Expression of Interstitial Collagens and Fibronectin in Fibroblasts. Infect Immun, 77:867-876.

9. Beatty WL, Byrne GI, Morrison RP. (1993). Morphologic and antigenic characterization of interferon gamma-mediated persistent Chlamydia trachomatis infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A, 90:3998-4002.

10. Beatty WL, Morrison RP, Byrne GI. (1994). Persistent chlamydiae: from cell culture to a paradigm for chlamydial pathogenesis. Microbiol Rev, 58:686-699.

11. Bedson SP, Bland JOW. (1932). A morphological study of pscittacosis virus, with the description of a developmental cycle. Brit J Exp Path, 13:461-466.

12. Beeckman DS, Vanrompay DC. (2009). Zoonotic Chlamydophila psittaci infections from a clinical perspective. Clin Microbiol Infect, 15:11-17.

13. Bonecchi R, Bianchi G, Bordignon PP, D'Ambrosio D, Lang R, Borsatti A, Sozzani S, Allavena P, Gray PA, Mantovani A, Sinigaglia F. (1998). Differential expression of chemokine receptors and chemotactic responsiveness of type 1 T helper cells (Th1s) and Th2s. J Exp Med, 187:129-134.

14. Bosco MC, Puppo M, Blengio F, Fraone T, Cappello P, Giovarelli M, Varesio L. (2008). Monocytes and dendritic cells in a hypoxic environment: Spotlights on chemotaxis and migration. Immunobiology, 213:733-749.

15. Bush RM, Everett KD. (2001). Molecular evolution of the Chlamydiaceae. Int J Syst Evol Microbiol, 51:203-220.


16. Carabeo RA, Mead DJ, Hackstadt T. (2003). Golgi-dependent transport of cholesterol to the Chlamydia trachomatis inclusion. Proc Natl Acad Sci U S A, 100:6771-6776.

17. Carreau A, El Hafny-Rahbi B, Matejuk A, Grillon C, Kieda C. (2011). Why is the partial oxygen pressure of human tissues a crucial parameter? Small molecules and hypoxia. J Cell Mol Med, 15:1239-1253.

18. Chon SY, Hassanain HH, Pine R, Gupta SL. (1995). Involvement of two regulatory elements in interferon-gamma-regulated expression of human indoleamine 2,3-dioxygenase gene. J Interferon Cytokine Res, 15:517-526.

19. Coles AM, Reynolds DJ, Harper A, Devitt A, Pearce JH. (1993). Low-nutrient induction of abnormal chlamydial development: a novel component of chlamydial pathogenesis? FEMS Microbiol Lett, 106:193-200.

20. Darville T. (2006). Innate Immunity. In: Bavoil PM, Wyrick PB (eds). Chlamydia - Genomics and Pathogenesis. Horizon Bioscience, Wymondham, pp 339-364.

21. Davis DA, Rinderknecht AS, Zoeteweij JP, Aoki Y, Read-Connole EL, Tosato G, Blauvelt A, Yarchoan R. (2001). Hypoxia induces lytic replication of Kaposi sarcoma-associated herpesvirus. Blood, 97:3244-3250.

22. Decker T, Stockinger S, Karaghiosoff M, Muller M, Kovarik P. (2002). IFNs and STATs in innate immunity to microorganisms. J Clin Invest, 109:1271-1277.

23. Desmouliere A, Chaponnier C, Gabbiani G. (2005). Tissue repair, contraction, and the myofibroblast. Wound Repair Regen, 13:7-12.

24. Dietz I, Jerchel S, Rupp J. (2011). Die Bedeutung von Sauerstoff und HIF-1a für Infektionsprozesse. Der Mikrobiologe, 21:109-114.

25. Dietz I, Jerchel S, Szaszak M, Shima K, Rupp J. (2012). When oxygen runs short: the microenvironment drives host-pathogen interactions. Microbes Infect, 14:311-316.

26. Donaldson GC, Seemungal TA, Patel IS, Bhowmik A, Wilkinson TM, Hurst JR, MacCallum PK, Wedzicha JA. (2005). Airway and systemic inflammation and decline in lung function in patients with COPD. Chest, 128:1995-2004.

27. Droemann D, Rupp J, Goldmann T, Uhlig U, Branscheid D, Vollmer E, Kujath P, Zabel P, Dalhoff K. (2007). Disparate innate immune responses to persistent and acute Chlamydia pneumoniae infection in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med, 175:791-797.

28. Eddahibi S, Chaouat A, Tu L, Chouaid C, Weitzenblum E, Housset B, Maitre B, Adnot S. (2006). Interleukin-6 gene polymorphism confers susceptibility to pulmonary hypertension in chronic obstructive pulmonary disease. Proc Am Thorac Soc, 3:475-476.

29. Entrican G, Wattegedera S, Rocchi M, Fleming DC, Kelly RW, Wathne G, Magdalenic V, Howie SE. (2004). Induction of inflammatory host immune responses by organisms belonging to the genera Chlamydia/Chlamydophila. Vet Immunol Immunopathol, 100:179-186.

30. Everett KD, Bush RM, Andersen AA. (1999). Emended description of the order Chlamydiales, proposal of Parachlamydiaceae fam. nov. and Simkaniaceae fam. nov., each containing one monotypic genus, revised taxonomy of the family Chlamydiaceae, including a new genus and five new species, and standards for the identification of organisms. Int J Syst Bacteriol, 49 Pt 2:415-440.


31. Faggioli L, Merola M, Hiscott J, Furia A, Monese R, Tovey M, Palmieri M. (1997). Molecular mechanisms regulating induction of interleukin-6 gene transcription by interferon-gamma. Eur J Immunol, 27:3022-3030.

32. Febrer M, McLay K, Caccamo M, Twomey KB, Ryan RP. (2011). Advances in bacterial transcriptome and transposon insertion-site profiling using second-generation sequencing. Trends Biotechnol, 29:586-594.

33. Fine A, Goldstein RH. (1993). Regulation of type I collagen mRNA translation by TGF-beta. Reg Immunol, 5:218-224.

34. Frede S, Stockmann C, Freitag P, Fandrey J. (2006). Bacterial lipopolysaccharide induces HIF-1 activation in human monocytes via p44/42 MAPK and NF-kappaB. Biochem J, 396:517-527.

35. Gerard HC, Freise J, Wang Z, Roberts G, Rudy D, Krauss-Opatz B, Kohler L, Zeidler H, Schumacher HR, Whittum-Hudson JA, Hudson AP. (2002). Chlamydia trachomatis genes whose products are related to energy metabolism are expressed differentially in active vs. persistent infection. Microbes Infect, 4:13-22.

36. Grayston JT. (1992). Infections caused by Chlamydia pneumoniae strain TWAR. Clin Infect Dis, 15:757-761.

37. Gumbiner BM. (2005). Regulation of cadherin-mediated adhesion in morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol, 6:622-634.

38. Hackstadt T. (1999). Cell Biology. In: Stephens RS (ed). Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. ASM Press, Washington, D.C., pp 101-138.

39. Hackstadt T, Rockey DD, Heinzen RA, Scidmore MA. (1996). Chlamydia trachomatis interrupts an exocytic pathway to acquire endogenously synthesized sphingomyelin in transit from the Golgi apparatus to the plasma membrane. Embo Journal, 15:964-977.

40. Hackstadt T, Scidmore MA, Rockey DD. (1995). Lipid metabolism in Chlamydia trachomatis-infected cells: directed trafficking of Golgi-derived sphingolipids to the chlamydial inclusion. Proc Natl Acad Sci U S A, 92:4877-4881.

41. Hahn DL. (2004). Role of Chlamydia pneumoniae as an Inducer of Asthma. In: Friedmann H, Yamamoto Y, Bendinelli M (eds). Chlamydia pneumoniae Infection and Disease. Kluwer Academic, New York, pp 239-262.

42. Halberstaedter L, von Prowazek S. (1907). Über Zelleinschlüsse parasitärer Natur beim Trachom. Arbb Kaiserl Gesundheitsamte, 26:44-47.

43. Harper A, Pogson CI, Jones ML, Pearce JH. (2000). Chlamydial development is adversely affected by minor changes in amino acid supply, blood plasma amino acid levels, and glucose deprivation. Infect Immun, 68:1457-1464.

44. Hartmann H, Eltzschig HK, Wurz H, Hantke K, Rakin A, Yazdi AS, Matteoli G, Bohn E, Autenrieth IB, Karhausen J, Neumann D, Colgan SP, Kempf VA. (2008). Hypoxia-independent activation of HIF-1 by enterobacteriaceae and their siderophores. Gastroenterology, 134:756-767.

45. Hatch TP, Al-Hossainy E, Silverman JA. (1982). Adenine nucleotide and lysine transport in Chlamydia psittaci. J Bacteriol, 150:662-670.

46. Herold U, Jakob H, Kamler M, Thiele R, Tochtermann U, Weinmann J, Motsch J, Gebhard MM, Hagl S. (1998). Interruption of bronchial circulation leads to a severe decrease in peribronchial oxygen tension in standard lung transplantation technique. Eur J Cardiothorac Surg, 13:176-183.


47. Hogg JC. (2004). Pathophysiology of airflow limitation in chronic obstructive pulmonary disease. Lancet, 364:709-721.

48. Hogg JC, Chu F, Utokaparch S, Woods R, Elliott WM, Buzatu L, Cherniack RM, Rogers RM, Sciurba FC, Coxson HO, Pare PD. (2004). The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med, 350:2645-2653.

49. Hucke C, MacKenzie CR, Adjogble KD, Takikawa O, Daubener W. (2004). Nitric oxide-mediated regulation of gamma interferon-induced bacteriostasis: inhibition and degradation of human indoleamine 2,3-dioxygenase. Infect Immun, 72:2723-2730.

50. Hybiske K, Stephens RS. (2007). Mechanisms of host cell exit by the intracellular bacterium Chlamydia. Proc Natl Acad Sci U S A, 104:11430-11435.

51. Iliffe-Lee ER, McClarty G. (1999). Glucose metabolism in Chlamydia trachomatis: the 'energy parasite' hypothesis revisited. Mol Microbiol, 33:177-187.

52. Inman GJ, Nicolas FJ, Callahan JF, Harling JD, Gaster LM, Reith AD, Laping NJ, Hill CS. (2002). SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-beta superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol Pharmacol, 62:65-74.

53. Ivanov SV, Salnikow K, Ivanova AV, Bai L, Lerman MI. (2007). Hypoxic repression of STAT1 and its downstream genes by a pVHL/HIF-1 target DEC1/STRA13. Oncogene, 26:802-812.

54. Jansson J, Willing B, Lucio M, Fekete A, Dicksved J, Halfvarson J, Tysk C, Schmitt-Kopplin P. (2009). Metabolomics reveals metabolic biomarkers of Crohn's disease. PLoS One, 4:e6386.

55. Jeffery PK. (2001). Remodeling in asthma and chronic obstructive lung disease. Am J Respir Crit Care Med, 164:S28-S38.

56. Juul N, Jensen H, Hvid M, Christiansen G, Birkelund S. (2007). Characterization of in vitro chlamydial cultures in low-oxygen atmospheres. J Bacteriol, 189:6723-6726.

57. Kalman S, Mitchell W, Marathe R, Lammel C, Fan J, Hyman RW, Olinger L, Grimwood J, Davis RW, Stephens RS. (1999). Comparative genomes of Chlamydia pneumoniae and C. trachomatis. Nat Genet, 21:385-389.

58. Karnak D, Beng-sun S, Beder S, Kayacan O. (2001). Chlamydia pneumoniae infection and acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Respir Med, 95:811-816.

59. King NJ, Thomas SR. (2007). Molecules in focus: indoleamine 2,3-dioxygenase. Int J Biochem Cell Biol, 39:2167-2172.

60. Knobloch J, Schild K, Jungck D, Urban K, Muller K, Schweda EK, Rupp J, Koch A. (2011). The T-helper cell type 1 immune response to gram-negative bacterial infections is impaired in COPD. Am J Respir Crit Care Med, 183:204-214.

61. Kuo CC, Jackson LA, Campbell LA, Grayston JT. (1995). Chlamydia pneumoniae (TWAR). Clin Microbiol Rev, 8:451-461.

62. Lad SP, Fukuda EY, Li J, de la Maza LM, Li E. (2005). Up-regulation of the JAK/STAT1 signal pathway during Chlamydia trachomatis infection. J Immunol, 174:7186-7193.

63. Laemmli UK. (1970). Cleavage of Structural Proteins During Assembly of Head of Bacteriophage-T4. Nature, 227:680-685.


64. Le QT, Chen E, Salim A, Cao H, Kong CS, Whyte R, Donington J, Cannon W, Wakelee H, Tibshirani R, Mitchell JD, Richardson D, O'Byrne KJ, Koong AC, Giaccia AJ. (2006). An evaluation of tumor oxygenation and gene expression in patients with early stage non-small cell lung cancers. Clin Cancer Res, 12:1507-1514.

65. Libermann TA, Baltimore D. (1990). Activation of interleukin-6 gene expression through the NF-kappa B transcription factor. Mol Cell Biol, 10:2327-2334.

66. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell JE. (2001). Zell-Zell-Wechselwirkungen bei Entwicklungsvorgängen. Molekulare Zellbiologie. Spektrum Akademischer Verlag GmbH, Heidelberg Berlin, pp 1084-1139.

67. Lu H, Shen C, Brunham RC. (2000). Chlamydia trachomatis infection of epithelial cells induces the activation of caspase-1 and release of mature IL-18. J Immunol, 165:1463-1469.

68. MacKenzie CR, Hadding U, Daubener W. (1998). Interferon-gamma-induced activation of indoleamine 2,3-dioxygenase in cord blood monocyte-derived macrophages inhibits the growth of group B streptococci. J Infect Dis, 178:875-878.

69. MacKenzie CR, Hucke C, Muller D, Seidel K, Takikawa O, Daubener W. (1999). Growth inhibition of multiresistant enterococci by interferon-gamma-activated human uro-epithelial cells. J Med Microbiol, 48:935-941.

70. Majori M, Corradi M, Caminati A, Cacciani G, Bertacco S, Pesci A. (1999). Predominant TH1 cytokine pattern in peripheral blood from subjects with chronic obstructive pulmonary disease. J Allergy Clin Immunol, 103:458-462.

71. Masaki T, Kojima T, Okabayashi T, Ogasawara N, Ohkuni T, Obata K, Takasawa A, Murata M, Tanaka S, Hirakawa S, Fuchimoto J, Ninomiya T, Fujii N, Tsutsumi H, Himi T, Sawada N. (2011). A nuclear factor-kappaB signaling pathway via protein kinase C delta regulates replication of respiratory syncytial virus in polarized normal human nasal epithelial cells. Mol Biol Cell, 22:2144-2156.

72. Massague J. (1998). TGF-beta signal transduction. Annu Rev Biochem, 67:753-791.

73. Mathers, C. and Ma Fat, D. (2008). The global burden of disease: 2004 Update. Report, World Health Organization.

74. Matsumoto A, Manire GP. (1970). Electron microscopic observations on the effects of penicillin on the morphology of Chlamydia psittaci. J Bacteriol, 101:278-285.

75. Maurer AP, Mehlitz A, Mollenkopf HJ, Meyer TF. (2007). Gene expression profiles of Chlamydophila pneumoniae during the developmental cycle and iron depletion-mediated persistence. PLoS Pathog, 3:e83.

76. McClarty G. (1999). Chlamydial Metabolism as Inferred from the Complete Genome Sequence. In: Stephens RS (ed). Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. ASM Press, Washington, D.C., pp 69-100.

77. Mead J, Turner JM, Macklem PT, Little JB. (1967). Significance of the relationship between lung recoil and maximum expiratory flow. J Appl Physiol, 22:95-108.

78. Mehta SJ, Miller RD, Ramirez JA, Summersgill JT. (1998). Inhibition of Chlamydia pneumoniae replication in HEp-2 cells by interferon-gamma: role of tryptophan catabolism. J Infect Dis, 177:1326-1331.


79. Mellor AL, Munn DH. (2004). IDO expression by dendritic cells: tolerance and tryptophan catabolism. Nat Rev Immunol, 4:762-774.

80. Moulder JW. (1966). The relation of the psittacosis group (Chlamydiae) to bacteria and viruses. Annu Rev Microbiol, 20:107-130.

81. Neville LF, Mathiak G, Bagasra O. (1997). The immunobiology of interferon-gamma inducible protein 10 kD (IP-10): a novel, pleiotropic member of the C-X-C chemokine superfamily. Cytokine Growth Factor Rev, 8:207-219.

82. Nizet V, Johnson RS. (2009). Interdependence of hypoxic and innate immune responses. Nat Rev Immunol, 9:609-617.

83. Ojcius DM, Degani H, Mispelter J, utry-Varsat A. (1998). Enhancement of ATP levels and glucose metabolism during an infection by Chlamydia. NMR studies of living cells. J Biol Chem, 273:7052-7058.

84. Ossewaarde JM, Meijer A. (1999). Molecular evidence for the existence of additional members of the order Chlamydiales. Microbiology, 145 ( Pt 2):411-417.

85. Ouellette PM, Belland RJ, Gieffers J, Byrne GI. (2004). The Biology of Chlamydia pneumoniae in Cardiovascular Disease Pathogenesis. In: Friedmann H, Yamamoto Y, Bendinelli M (eds). Chlamydia pneumoniae Infection and Disease. Kluwer Academic, New York, pp 135-151.

86. Pantoja LG, Miller RD, Ramirez JA, Molestina RE, Summersgill JT. (2001). Characterization of Chlamydia pneumoniae persistence in HEp-2 cells treated with gamma interferon. Infect Immun, 69:7927-7932.

87. Pedroza M, Schneider DJ, Karmouty-Quintana H, Coote J, Shaw S, Corrigan R, Molina JG, Alcorn JL, Galas D, Gelinas R, Blackburn MR. (2011). Interleukin-6 contributes to inflammation and remodeling in a model of adenosine mediated lung injury. PLoS One, 6:e22667.

88. Peeling RW, Brunham RC. (1996). Chlamydiae as pathogens: New species and new issues. Emerging Infectious Diseases, 2:307-319.

89. Peters J, Hess S, Endlich K, Thalmann J, Holzberg D, Kracht M, Schaefer M, Bartling G, Klos A. (2005). Silencing or permanent activation: host-cell responses in models of persistent Chlamydia pneumoniae infection. Cell Microbiol, 7:1099-1108.

90. Pfefferkorn ER, Eckel M, Rebhun S. (1986). Interferon-gamma suppresses the growth of Toxoplasma gondii in human fibroblasts through starvation for tryptophan. Mol Biochem Parasitol, 20:215-224.

91. Rabe KF, Hurd S, Anzueto A, Barnes PJ, Buist SA, Calverley P, Fukuchi Y, Jenkins C, Rodriguez-Roisin R, van WC, Zielinski J. (2007). Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease: GOLD executive summary. Am J Respir Crit Care Med, 176:532-555.

92. Rank RG. (2006). The role of the CD4 T cell in the host response to chlamydia. In: Bavoil PM, Wyrick PB (eds). Chlamydia - genomics and pathogenesis. Horizon Bioscience, Wymondham, pp 365-379.

93. Raulston JE. (1997). Response of Chlamydia trachomatis serovar E to iron restriction in vitro and evidence for iron-regulated chlamydial proteins. Infect Immun, 65:4539-4547.

94. Read TD, Brunham RC, Shen C, Gill SR, Heidelberg JF, White O, Hickey EK, Peterson J, Utterback T, Berry K, Bass S, Linher K, Weidman J, Khouri H, Craven B, Bowman C, Dodson R, Gwinn M, Nelson W, DeBoy R, Kolonay J, McClarty G, Salzberg SL, Eisen J,


Fraser CM. (2000). Genome sequences of Chlamydia trachomatis MoPn and Chlamydia pneumoniae AR39. Nucleic Acids Res, 28:1397-1406.

95. Roan NR, Starnbach MN. (2008). Immune-mediated control of Chlamydia infection. Cell Microbiol, 10:9-19.

96. Roth A, Konig P, van ZG, Klinger M, Hellwig-Burgel T, Daubener W, Bohlmann MK, Rupp J. (2010). Hypoxia abrogates antichlamydial properties of IFN-gamma in human fallopian tube cells in vitro and ex vivo. Proc Natl Acad Sci U S A,19502-19507.

97. Rupp J, Gieffers J, Klinger M, van ZG, Wrase R, Maass M, Solbach W, Deiwick J, Hellwig-Burgel T. (2007). Chlamydia pneumoniae directly interferes with HIF-1alpha stabilization in human host cells. Cell Microbiol, 9:2181-2191.

98. Rupp J, Kothe H, Mueller A, Maass M, Dalhoff K. (2003). Imbalanced secretion of IL-1beta and IL-1RA in Chlamydia pneumoniae-infected mononuclear cells from COPD patients. Eur Respir J, 22:274-279.

99. Schachter J. (1999). Infection and Disease Epidemiology. In: Stephens RS (ed). Chlamydia: Intracellular Biology, Pathogenesis, and Immunity. ASM Press, Washington, D.C., pp 139-169.

100. Schachter J, Stephens RS, Timms P, Kuo C, Bavoil PM, Birkelund S, Boman J, Caldwell H, Campbell LA, Chernesky M, Christiansen G, Clarke IN, Gaydos C, Grayston JT, Hackstadt T, Hsia R, Kaltenboeck B, Leinonnen M, Ojcius D, McClarty G, Orfila J, Peeling R, Puolakkainen M, Quinn TC, Rank RG, Raulston J, Ridgeway GL, Saikku P, Stamm WE, Taylor-Robinson DT, Wang SP, Wyrick PB. (2001). Radical changes to chlamydial taxonomy are not necessary just yet. Int J Syst Evol Microbiol, 51:249-3.

101. Schindler CW. (2002). Series introduction. JAK-STAT signaling in human disease. J Clin Invest, 109:1133-1137.

102. Schroten H, Spors B, Hucke C, Stins M, Kim KS, Adam R, Daubener W. (2001). Potential role of human brain microvascular endothelial cells in the pathogenesis of brain abscess: inhibition of Staphylococcus aureus by activation of indoleamine 2,3-dioxygenase. Neuropediatrics, 32:206-210.

103. Sitkovsky M, Lukashev D. (2005). Regulation of immune cells by local-tissue oxygen tension: HIF1 alpha and adenosine receptors. Nat Rev Immunol, 5:712-721.

104. Stephens RS. (2003). The cellular paradigm of chlamydial pathogenesis. Trends Microbiol, 11:44-51.

105. Stephens RS, Kalman S, Lammel C, Fan J, Marathe R, Aravind L, Mitchell W, Olinger L, Tatusov RL, Zhao Q, Koonin EV, Davis RW. (1998). Genome sequence of an obligate intracellular pathogen of humans: Chlamydia trachomatis. Science, 282:754-759.

106. Stephens RS, Myers G, Eppinger M, Bavoil PM. (2009). Divergence without difference: phylogenetics and taxonomy of Chlamydia resolved. FEMS Immunol Med Microbiol, 55:115-119.

107. Strieter RM, Belperio JA, Keane MP. (2003). Host innate defenses in the lung: the role of cytokines. Curr Opin Infect Dis, 16:193-198.

108. Summersgill JT, Sahney NN, Gaydos CA, Quinn TC, Ramirez JA. (1995). Inhibition of Chlamydia pneumoniae growth in HEp-2 cells pretreated with gamma interferon and tumor necrosis factor alpha. Infect Immun, 63:2801-2803.


109. Takaoka A, Yanai H. (2006). Interferon signalling network in innate defence. Cell Microbiol, 8:907-922.

110. Thiery JP, Sleeman JP. (2006). Complex networks orchestrate epithelial-mesenchymal transitions. Nat Rev Mol Cell Biol, 7:131-142.

111. Tseng CT, Rank RG. (1998). Role of NK cells in early host response to chlamydial genital infection. Infect Immun, 66:5867-5875.

112. von Hertzen LC. (1998). Chlamydia pneumoniae and its role in chronic obstructive pulmonary disease. Ann Med, 30:27-37.

113. von Hertzen LC, Alakarppa H, Koskinen R, Liippo K, Surcel HM, Leinonen M, Saikku P. (1997). Chlamydia pneumoniae infection in patients with chronic obstructive pulmonary disease. Epidemiol Infect, 118:155-164.

114. Wang Z, Gerstein M, Snyder M. (2009). RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet, 10:57-63.

115. Wang Z, Zheng T, Zhu Z, Homer RJ, Riese RJ, Chapman HA, Jr., Shapiro SD, Elias JA. (2000). Interferon gamma induction of pulmonary emphysema in the adult murine lung. J Exp Med, 192:1587-1600.

116. Watson C, Alp NJ. (2008). Role of Chlamydia pneumoniae in atherosclerosis. Clin Sci (Lond), 114:509-531.

117. Wedzicha JA, Seemungal TA. (2007). COPD exacerbations: defining their cause and prevention. Lancet, 370:786-796.

118. Wen Z, Zhong Z, Darnell JE, Jr. (1995). Maximal activation of transcription by Stat1 and Stat3 requires both tyrosine and serine phosphorylation. Cell, 82:241-250.

119. Werth N, Beerlage C, Rosenberger C, Yazdi AS, Edelmann M, Amr A, Bernhardt W, von EC, Becker K, Schafer A, Peschel A, Kempf VA. (2010). Activation of hypoxia inducible factor 1 is a general phenomenon in infections with human pathogens. PLoS One, 5:e11576.

120. Wolf K, Fischer E, Hackstadt T. (2000). Ultrastructural analysis of developmental events in Chlamydia pneumoniae-infected cells. Infect Immun, 68:2379-2385.

121. Wolf K, Hackstadt T. (2001). Sphingomyelin trafficking in Chlamydia pneumoniae-infected cells. Cell Microbiol, 3:145-152.

122. Worlitzsch D, Tarran R, Ulrich M, Schwab U, Cekici A, Meyer KC, Birrer P, Bellon G, Berger J, Weiss T, Botzenhart K, Yankaskas JR, Randell S, Boucher RC, Doring G. (2002). Effects of reduced mucus oxygen concentration in airway Pseudomonas infections of cystic fibrosis patients. J Clin Invest, 109:317-325.

123. Wormald S, Hilton DJ. (2004). Inhibitors of cytokine signal transduction. J Biol Chem, 279:821-824.

124. Wylie JL, Hatch GM, McClarty G. (1997). Host cell phospholipids are trafficked to and then modified by Chlamydia trachomatis. J Bacteriol, 179:7233-7242.

125. Yang T, Stark P, Janik K, Wigzell H, Rottenberg ME. (2008). SOCS-1 protects against Chlamydia pneumoniae-induced lethal inflammation but hampers effective bacterial clearance. J Immunol, 180:4040-4049.

126. Zhou G, Dada LA, Wu M, Kelly A, Trejo H, Zhou Q, Varga J, Sznajder JI. (2009). Hypoxia-induced alveolar epithelial-mesenchymal transition requires mitochondrial ROS and hypoxia-inducible factor 1. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 297:1120-1130.

Abbildungsverzeichnis 106

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 2.1: Taxonomie der Ordnung Chlamydiales. ......................................... 10 Abbildung 2.2: Schematische Darstellung des Entwicklungszyklus von

C. pneumoniae. .............................................................................. 12 Abbildung 2.3: Remodeling (epithelial-mesenchymal transition, EMT) von

Epithelzellen. ................................................................................. 15 Abbildung 2.4: Vereinfachte Darstellung der Jak-STAT Signalkaskade. ................. 17 Abbildung 2.5: Vereinfachte Darstellung der HIF-1α Stabilisierung durch Hypoxie.

....................................................................................................... 21 Abbildung 5.1: C. pneumoniae Einschlusskörper nach IFN-γ Behandlung unter

Normoxie und Hypoxie. ................................................................. 50 Abbildung 5.2: Wiederanzucht von C. pneumoniae in HEp-2 Zellen nach IFN-γ

Behandlung unter Normoxie und Hypoxie (72 hpi)......................... 51 Abbildung 5.3: Persistenzinduktion von C. pneumoniae bei ansteigender

Sauerstoffkonzentration in HEp-2 Zellen. ....................................... 52 Abbildung 5.4: Reaktivierung von persistenten C. pneumoniae durch Hypoxie in

HEp-2 Zellen. ................................................................................. 53 Abbildung 5.5: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-

Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (4 hpi). ............... 54 Abbildung 5.6: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-

Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (24 hpi). ............. 55 Abbildung 5.7: Western Blot Analysen der Tyrosin 701- und Serin 727-

Phosphorylierungen am STAT1 in HEp-2 Zellen (48 hpi). ............. 56 Abbildung 5.8: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (4 hpi). .................. 58 Abbildung 5.9: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (24 hpi). ................ 59 Abbildung 5.10: Expressionsanalysen von IDO in HEp-2 Zellen (48 hpi). .............. 60 Abbildung 5.11: Quantitative RT-PCR von IP-10 in HEp-2 Zellen. ........................ 62 Abbildung 5.12: Quantitative RT-PCR von SOCS1 in HEp-2 Zellen. ..................... 63 Abbildung 5.13: Quantitative RT-PCR von SOCS3 in HEp-2 Zellen. ..................... 64 Abbildung 5.14: Quantitative RT-PCR von IL-6 in C. pneumoniae infiziertem

humanen Lungengewebe (24 hpi). .................................................. 65 Abbildung 5.15: Quantitative RT-PCR von IL-6 in dem Reaktivierungs-Modell von

C. pneumoniae infizierten HEp-2 Zellen. ........................................ 66 Abbildung 5.16: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (48 hpi). . 67 Abbildung 5.17: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen (96 hpi). . 68 Abbildung 5.18: Fluoreszenzfärbung von α-SMA in A549 Zellen (72 hpi). ............ 69 Abbildung 5.19: Migrationsanalyse von C. pneumoniae infizierten A549 Zellen unter

Normoxie. ...................................................................................... 70 Abbildung 5.20: Western Blot Analysen der Inhibition der TGF-β Signaltransduktion

durch SB-431542 in C. pneumoniae infizierten A549 Zellen. ......... 71 Abbildung 5.21: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter

Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (48 hpi). ................................... 72 Abbildung 5.22: Western Blot Analysen von E-Cadherin in A549 Zellen unter

Hypoxie mit siRNA gegen HIF-1α (96 hpi). ................................... 73 Abbildung 5.23: Western Blot Analysen von CPAF in C. pneumoniae infizierten

A549 Zellen (48 hpi). ..................................................................... 74 Abbildung 5.24: Zuordnung der Sequenzen auf das humane und chlamydiale Genom.

....................................................................................................... 76 Abbildung 5.25: Häufigkeit der Sequenz-Abdeckung pro Gen. ............................... 77

Abbildungsverzeichnis 107

Abbildung 5.26: Vergleich der mRNA Expression von chlamydialen Genen zwischen verschiedenen RNA-Aufreinigungen. .............................. 78

Abbildung 5.27: Hauptkomponentenanalyse des Datensets. .................................... 80 Abbildung 5.28: Massenintensität von Tryptophan in IFN-γ behandelten HEp-2

Zellen. ............................................................................................ 82 Abbildung 6.1: Schematische Darstellung des Einfluss einer Chlamydien-Infektion

auf Umbauprozesse von Gewebe. ................................................... 90 Abbildung 6.2: Modell zu C. pneumoniae induzierten Umbauprozessen. ................ 97

Tabellenverzeichnis 108

Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Extrazelluläre Sauerstoffkonzentrationen in verschiedenen Geweben. . 19 Tabelle 3.1: In dieser Arbeit verwendete Zelllinien ................................................. 27 Tabelle 3.2: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für humane Sequenzen......... 29 Tabelle 3.3: In dieser Arbeit verwendete Primerpaare für chlamydiale Sequenzen .. 29 Tabelle 3.4: In dieser Arbeit verwendete siRNAs ................................................... 30 Tabelle 3.5: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für Western Blot Analysen

....................................................................................................... 31 Tabelle 3.6: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für Western Blot

Analysen ........................................................................................ 31 Tabelle 3.7: In dieser Arbeit verwendete Primärantikörper für

Immunfluoreszenzfärbungen .......................................................... 32 Tabelle 3.8: In dieser Arbeit verwendete Sekundärantikörper für

Immunfluoreszenzfärbungen .......................................................... 32 Tabelle 4.1: Zellkulturbedingungen in den durchgeführten Versuchen .................... 33 Tabelle 4.2: Zusammensetzung des Sammel- und Trenngels................................... 41 Tabelle 4.3: Pipettierschema der reversen Transkription mit Roche und Fermentas 42 Tabelle 4.4: Temperaturprofil der reversen Transkription ....................................... 43 Tabelle 4.5: Pipettierschema der quantitative RT-PCR ........................................... 43 Tabelle 4.6: Temperaturprofil der quantitativen RT-PCR........................................ 44 Tabelle 5.1: Übersicht über die Veränderung der Stoffwechselwege der Infektion

relevanter Metabolite. ..................................................................... 81

Lebenslauf 109

A Anhang

A.1 Lebenslauf

Inga Dietz

Geburtsdatum 15.05.1984 in Bremen

Familienstand Ledig

Beruflicher Werdegang

Seit 03/2009 Wissenschaftliche Angestellte

Arbeitsgruppe Prof. Dr. med Jan Rupp, Institut für Medizinische

Mikrobiologie und Hygiene, Universitätsklinikum Schleswig-

Holstein, Campus Lübeck

Hochschulausbildung

10/2008 Abschluss als Diplom-Biologin (Note: sehr gut)

Thema der Diplomarbeit: „Proteinbiochemischer Nachweis des

Thyroid Adenoma Associated (THADA) Proteins“ durchgeführt am

Zentrum für Humangenetik, Universität Bremen

10/2005 Vordiplom (Note: gut)

Universität Bremen

10/2003-10/2008 Studium der Biologie

Universität Bremen

Schulbildung

06/2003 Allgemeine Hochschulreife (Note: gut)

Schulzentrum des Sekundarbereichs II Walle, Bremen

03/2000 Mittlere Reife mit bilingualem Abschluss (Note: gut)

Schulzentrum am Waller Ring, Bremen

Auslandsaufenthalt

11/2008-12/2008 Sprachaufenthalt in Cambridge, England

Publikationen 110

A.2 Publikationen Übersichtsartikel

Dietz I, Jerchel S, Szaszak M, Shima K, Rupp J. (2012). When oxygen runs short:

the microenvironment drives host-pathogen interactions. Microbes Infect, 14:311-

316.

Dietz I, Jerchel S, Rupp, J. (2011). Die Bedeutung von Sauerstoff und HIF-1α für

Infektionsprozesse. Der Mikrobiologe, 21:109-114.

Originalarbeiten

Dietz I, Osbahr S, Drömann D, Rohmann K, Goldmann T, Solbach W, Dalhoff

K, Rupp J. (2012). Oxygen is needed for bacterial clearance in the lung and to

prevent bacteria-induced cell remodeling. Submitted.

Kongressbeiträge 111

A.3 Kongressbeiträge

Dietz I, Müller C, Schmitt-Kopplin P, Rupp J. (2012). Metabolic profiling of

acute and persistent Chlamydia pneumoniae infection under different environmental

oxygen concentrations. 10. Deutscher Chlamydien Workshop in Erfurt (Vortrag).

Dietz I, Osbahr S, Drömann D, Solbach W, Dalhoff K, Rupp J. (2011). Impact of

hypoxia on persistent Chlamydia pneumoniae infection and its effect on airway

remodelling. 63. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und

Mikrobiologie (DGHM) in Düsseldorf (Poster).

Dietz I, Osbahr S, Drömann D, Solbach W, Dalhoff K, Rupp J. (2011). A low

oxygen environment promotes epithelial to mesenchymal cell transition during

Chlamydia pneumoniae infection. 9. Deutscher Chlamydien Workshop in Ascona,

Schweiz (Vortrag).

Dietz I, Drömann D, Dalhoff K, Solbach W, Rupp, J. (2010) Interaction between

hypoxia and IFN-γ mediated persistence of Chlamydia pneumonia. 62. Jahrestagung

der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie (DGHM) in Hannover

(Poster).

Dietz I, Drömann D, Dalhoff K, Solbach W, Rupp J. (2010). IFN-γ mediated

control of Chlamydia pneumoniae lung infection is oxygen-dependent. 8. Deutscher

Chlamydien Workshop in Herrsching bei München (Vortrag).

Danksagung 112

A.4 Danksagung

Abschließend möchte ich mich ganz herzlich, bei allen die mich bei der Anfertigung

dieser Dissertation unterstützt haben, bedanken.

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Jan Rupp für die Überlassung des Themas

und der fortwährend wissenschaftlichen Betreuung. Seine stets konstruktiven

Vorschläge und Anregungen haben zu dem Gelingen dieser Arbeit beigetragen.

Zudem bin ich für seine kritische Durchsicht des Manuskripts dankbar.

Herrn Prof. Dr. Werner Solbach möchte ich für die Möglichkeit der Durchführung

der vorliegenden Dissertation am Institut für Medizinische Mikrobiologie und

Hygiene danken.

Für die stets herzliche Zusammenarbeit und die zahlreichen wissenschaftlichen

Diskussionen möchte ich an dieser Stelle Constanze Müller danken. Zudem bin ich

ihr sehr Dankbar für die gemeinsame Ausarbeitung der Metabolom-Analysen.

Ein weiterer Dank gilt hier Prof. Dr. Thomas Rattei für seine Hilfestellung im

Rahmen der Etablierung der Transkirptom-Analysen und Thomas Weinmaier für die

Durchführung der bioinformatischen Auswertungen.

Sünja Osbahr, Kristina Rohmann und Ute Knuppertz danke ich für die Einarbeitung

in das Lungengewebs-Modell sowie der Klinik für Chirurgie des UK-SH, Campus

Lübeck für die Bereitstellung von Patienten-Material.

Sebastian Marwitz danke ich für die Überlassung des TGF-β Inhibitors.

Meinen lieben Kollegen Kristin Wischnat, Siegrid Pätzmann, Anke Hellberg und

Angela Gravenhorst gilt hier ein großer Dank. Sie hatten zu jeder Zeit ein offenes

Ohr für mich und unterstützten mich auch in schwierigen Situationen. Innerhalb und

außerhalb des Laboralltags wurde es mit ihnen nicht langweilig.

Ein großes Dankeschön geht an meine Kollegen Stefan Jerchel, Kensuke Shima und

Marta Szaszak für die stets hilfreichen Diskussionen und konstruktiven Ratschläge.

Zum Schluss möchte ich ganz besonders meiner Familie für die uneingeschränkte

Geduld und den stets festen Rückhalt Danken. Sie haben mich zu jedem Zeitpunkt

liebevoll unterstützt und immer an mich geglaubt. Vielen Dank, dass ihr mit mir

durchgehalten habt!

Modulation der Interferon-γ vermittelten Persistenz von ... · Aus dem Institut für Medizinische...

Documents

Transcript of Modulation der Interferon-γ vermittelten Persistenz von ... · Aus dem Institut für Medizinische...