HIDRÓLISIS DE LA CELULOSA

Evaluar la capacidad hidrolítica de un tipo de hidrolasa,

las Celulasas

usando un ensayo colorimétrico

con el ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNSA-reactivo).

Las celulasas son una familia de enzimas, producidas principalmente por hongos,

bacterias y protozoos que pertenecen a la familia de las hidrolasas y que catalizan la

hidrólisis de enlaces 1,4-β-D-glucosidicos en celulosa, lichenina y β-D-glucanos de

cereales.

Las celulasas catalizan la endo-hidrólisis de los enlaces glucosidicos.

La acción en la secuencia de estas enzimas lleva a la degradación de este polisacárido

en subunidades simples de glucosa

La celulosa es uno de los polisacáridos más importantes; se compone de un gran número de

moléculas de glucosa (de aproximadamente 300 a 3000 unidades) unidas entre sí por un enlace β (1

→ 4) glucosidico.

La celulosa es el más abundante polisacárido natural, ya que es el componente de tejido fibroso de

las paredes celulares de las plantas (representa aproximadamente la mitad del carbono orgánico en la

biosfera).

Es un sólido blanco, insoluble en agua.

La cadena del polímero no está ramificada.

Las cadenas están dispuestas paralelas entre sí y se unen por medio de enlaces de hidrógeno muy

fuertes, formando fibrillas, cadenas muy largas, difíciles de disolver.

Aproximadamente la mitad de las paredes celulares de las plantas está constituida por

celulosa, pero en el algodón, por ejemplo, la celulosa es casi es 100%.

La celulosa se hidroliza, en determinadas condiciones, a celobiosa, disacárido que

posteriormente se hidroliza a glucosa.

En el intestino del hombre este proceso hidrolitico no se produce debido a una falta

de enzimas para romper los enlaces β (1 → 4) glucosidicos.

En los estómagos de los rumiantes y en el ciego de los herbívoros monogastricos

(equinos), sin embargo, hay numerosas bacterias simbióticas y protozoos que

convierten el enlace β en un enlace α divisible por todos los animales.

Por ejemplo el almidón está compuesto de tipo orgánico de carbohidratos (polisacáridos o

hidratos de carbono), comúnmente contenido en alimentos como pan, pasta, arroz,

patatas, que tiene unidades de (+)-glucosa unidas entre sí por vínculos α-glucosidico a

diferencia de la celulosa.

En esta práctica se va a medir la capacidad de la celulasa de Aspergillus niger para

hidrolizar la celulosa a través de un ensayo colorimétrico

Es el ensayo colorimétrico con ácido 2,5-dinitrosalicílico (reactivo DNSA)

Ácido 2,5-dinitrosalicílico (reactivo DNSA)

El procedimiento se basa en el método de Bailey et al. 199238 y permite la determinación

espectrofotométrica de azúcares reductores liberados por la reacción oxidativa.

La enzima Celulasa hidroliza la celulosa con la liberación de monómeros de glucosa que reaccionan de

la siguiente manera con el ácido 2,5-dinitrosalicílico:

Ácido 2,5-dinitrosalicílico(Amarillo)

glucosa ácido gluconico Ácido 3-amino-5-nitrosalicilico(rojo-marrón)

reacción redox entre la glucosa y el ácido 3,5-dinitrosalicílico (amarillo) con la formación de

ácido gluconico y ácido 3-amino-5-nitrosalicilico (rojo)

Principios básicos de la colorimetría

1. Colorimetría es una técnica utilizada para determinar la concentración de sustancias en una

solución colorida.

2. Es un método rápido y no destructivo que ayuda a identificar y cuantificar un gran número de

sustancias para diagnóstico e investigación.

3. Es una forma de espectroscopia; en general, se mide la respuesta de los átomos y

moléculas expuestos a la radiación electromagnética de una cierta longitud de onda y, por lo

tanto, de una cierta energía.

4. Hace uso de longitudes de onda en la región visible del espectro electromagnético y por lo

tanto es una técnica de medición bastante sencilla.

Análisis :

1. La solución de ensayo, inicialmente transparente, se colorea mediante la adición de un

reactivo que reacciona con la sustancia buscada.

2. La coloración es tanto más intensa cuanto más concentrada es la sustancia.

3. Un haz de luz de una determinada longitud de onda (llamado el rayo incidente) pasa a través

de la solución a analizar que está contenida en un recipiente de vidrio o de cuarzo dijo cubeta.

4. El haz de luz se absorbe de una manera proporcional a la saturación del color (por ejemplo

una solución de color amarilla absorbe la luz cerca de la azul).

5. La intensidad del haz que ha pasado a través de la solución (haz de luz transmitida) se mide

por un sistema fotodetector que transforma la energía del rayo transmitido en una corriente

proporcional a su intensidad eléctrica.

Este análisis se basa en la ley de Beer-Lambert que, en términos simples, se correlaciona la

intensidad de color de una solución con su concentración. Más precisamente, la ley dice que

como el absorbancia es proporcional ɛ c l,

A= ɛ c l

donde

ɛ es la absorción específica a esa sustancia (coeficiente de extinción molar típico de cada

sustancia)

c es la concentración de la sustancia

l es el camino óptico, es decir, el camino del haz de luz dentro de la celda

La determinación cuantitativa de la sustancia se produce a través de un instrumento llamado

espectrofotómetro

Este dispositivo es capaz de medir la cantidad de luz absorbida por la solución:

fuente de luz (visible o ultravioleta)

que emite rayos de diversos longitudes de onda

un filtro, llamado un monocromador,

que permite seleccionar una longitud de

onda específica útil para el análisis específico

un sistema detector

representado por una fotocélula

la que produce una señal eléctrica proporcional a la cantidad de

luz

Más compuestos a ser analizados no son de color.

Para superar este inconveniente se puede utilizar reacciones (químicos o enzimáticos) que

transforman una sustancia incolora en un compuesto coloreado: este último se mide entonces

con el espectrofotómetro.

Se habla de mediciones indirectas como en el caso de este ensayo con el

ácido 2,3-dinitrosalicílico cuyo pico de absorbancia a 540 nm

Sin embargo, dos aspectos fundamentales:

1) Hacer un blanco:

una parte de la absorbancia total es debido al disolvente, a la cubeta de vidrio y al mismo

espectrofotómetro: para corregir este efecto, además de la muestra de ser hecho un blanco

que es la lectura espectrofotométrica sin la muestra.

2) Construir una curva de calibración (curva de calibración):

usando soluciones estándar con concentraciones conocidas de analíto.

A continuación, la medición de la absorbancia de la muestra desconocida y la interpolación

con la línea de calibración permite determinar la concentración de la muestra