Detección de BLEE en el Perú:

¿Como? y ¿Porque?

Lic. TM. Javier Soto Pastrana orlansoto@hotmail.com

Laboratorio de Microbiología Clínica Hospital San Bartolome

BACTERIA SENSIBLE BACTERIA RESISTENTE

Antibiótico β-lactamicos

Difusión a través de la membrana externa

Alteración de porinas Bomba de expulsión

Difusión a través del peptidoglicano

PBP

Cambios en los PBP

Muerte celular

Β-lactamasas

MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIAS GRAM NEGATIVAS

Proteínas Fijadoras de Penicilina

OmpF OmpC

Beta-lactamasas

Espacio periplasmatico

Bomba de

Eflujo

Imipenem

Cephalosporinas

Membrana externa

(Lipopolisacarido)

PBP3 PBP1b

Membrana interna

(fosfolipido) PB1a PBP2

Peptidoglicano

Clasificación de las β-lactamasas

Bush, K. (2010). AAC. 54 (3): 969 - 976

Definición de BLEE

Son enzimas de codificación plasmidicas Diseminación a otros microorganismos

Asociación a otros mecanismos de resistencia

Asociado a impermeabilidad produce resistencia a los carbapenems

Enzimas que tienen una actividad hidrolitica contra oximino-cefalosporinas o aztreonam mas del 10% que a bencilpenicilina. No pueden hidrolizar cefamicinas o carbapenems. Son inhibidas por inhibidores de β-lactamasa.

Sohei Harada y col. Korean J Lab Med 2008; 28: 401-412

Origen de las BLEE

En 1983 (Alemania) se descubrió la primera BLEE (SHV-2)

En 1985 (Francia) se descubrió a la segunda BLEE (TEM-3)

En 1989 (Alemania-Argentina) se detecto un BLEE diferente a TEM y SHV, que se denomino CTX-M.

Actualmente (2010)………

Mas de 160 variantes de TEM

• IRT (TEM resistente a inhibidores)

• CMT (complejo mutantes de TEM)

Mas de 115 variantes de SHV

Mas de 80 variantes de CTX-M

• Clasificadas en 5 Grupos: CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-8,

CTX-M-9, y CTX-M-25

Otras: PER, VEB, GES, SFO, TLA, BEL, BES e IBC.

http://www. lahey.org/studies/.

Enferm Infecc Microbiol Clin. 2007; 25 Supl. 2: 2-10

BLEE Β-lactamasa relacionada

Pais de origen Especies en las que se detectaron inicialmente

Prevalencia elevada

SHV SHV-1/LEN Alemania (1983) Klebsiella ozaenae

TEM TEM-1, -2 Francia (1985) Klebsiella pneumoniae

CTX-M KLUA Kluyvera sp. Japón(1986) Alemania(1989) Argentina(1989)

Escherichia coli, Salmonella spp

OXA OXA-10 (PSE-2) Turquía (1991) Pseudomonas aeruginosa

PER Francia (1991) Pseudomonas aeruginosa

VEB PER (39%) Francia (Vietnam) (1996) Escherichia coli

Prevalencia baja

SFO AmpA S.fonticola (96%) Japón (1988) Enterobacter cloacae

TLA CME-1 (50%) México (1991) Escherichia coli

BES YENT (51%) Brasil (1996) Serratia marcescens

GES-1 YENT (36%)

Francia (Guayana francesa) (1998)

Klebsiella pneumoniae

IBC YENT (51%) Grecia (1999) Enterobacter cloacae

BEL GES-1 (50%) Bélgica (2004) Pseudomonas aeruginosa

Β-lactamasa Posición del aminoácido

19 37 102 162 203 235 236 237 261

TEM-1 Leu Gln Glu Arg Gln Ala Gly Glu Thr

TEM-2 Lys

TEM-3 Lys Lys Ser

TEM-4 Phe Lys Ser

TEM-5 Ser Thr Lys

TEM-6 Lys His

TEM-7 Lys Ser

SHV-1 Gln Asp Arg Arg Ala Gly Glu Leu

SHV-2 Ser

SHV-3 Leu Ser

SHV-4 Leu Ser Lys

Base Molecular de las BLEE

Gln: Glutamina, Glu: Acido glutamico, Asp: Acido aspartico, Thr: Treonina, Leu: Leucina, Phe: fenilalanina

Prevalencia de BLEE en K.pneumoniae y E. coli en Latinoamerica

País Microorganismos

K. pneumoniae Escherichia coli β-lactamasa

Argentina 57% 5% SHV-2, -5, CTX-M-2, PER-2

Brasil 38% 12% CTX-M-8, SHV-5

Chile 73% 22% SHV-5, -2

Colombia 44% 27% SHV-5, -2, CTX-M-12

Costa Rica 32% 7% SHV-5, -4

Ecuador 26% 27% SHV-5, -4

Guatemala 52% 27% SHV-5, -4

México 56% 28% TLA-1, SHV-5, -12

Perú * 63% SHV-2, -5, -12

Uruguay 38% 7% SHV-5, -2, TEM-144

Venezuela 63% 32% SHV-5, SHV-2

Infectio 2007; 11(1): 23-35 Mendes et al. No reportaron prevalencia

Problemas en la Detección de BLEE

Muchas cepas portadoras de BLEE no aparecen resistente a C2G, C3G y C4G o aztreonam en el antibiograma.

Algunos antibióticos son mejores para detectar la presencia de BLEE (p.e. ceftazidima, aztreonam, cefpodoxima).

Detección es imperativo para advertir a los clínicos que la terapia con algunos nuevos -lactamicos puede no ser exitoso

Recomendaciones de la CLSI para la deteccion de BLEE

OBJETIVO

Si se usan:

Punto de corte M100-S19 (2009)

Punto de corte M100-S20 (2010)

PARA SEGUIMIENTO DEL PACIENTE

Realizar screening y confirmar BLEE

SI NO

Cambiar “S” a “R” para las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam

SI NO

PARA CONTROL DE INFECCIONES

Realizar screening y confirmar BLEE

SI SOLO SI SE SOLICITA

Cambiar “S” a “R” para las penicilinas, cefalosporinas y aztreonam

SI NO

Cambios de los MICs: C3G en Enterobacterias

Antibiótico CLSI M100-S19 (2009) CLSI M100-S20 (2010)

S I R S I R

Cefazolina ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 1 2 ≥ 4

Cefotaxima ≤ 8 16 - 32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4

Ceftizoxime ≤ 8 16 - 32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4

Ceftriaxona ≤ 8 16 - 32 ≥ 64 ≤ 1 2 ≥ 4

Ceftazidima ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥16

Aztreonam ≤ 8 16 ≥ 32 ≤ 4 8 ≥16

Interpretación basado en 1 gr. Cada 24 horas

¿Porque cambios en los breakpoints?

Antimicrobiano Nuevos Breakpoints Antiguos Breakpoints

Cefazolina 100 % 80 %

Cefotaxima 80 % 33 %

Ceftriaxona 89 % 40 %

Ceftazidima 84% 62 %

Aztreonam 87 % 87 %

LOS NUEVOS BREAKPOINTS DETECTARIA MAS BACTERIAS PRODUCTORAS DE BLEE Porcentajes de cepas productoras de BLEE dando resultados RESISTENTES

Kohner y col. 2009. Journal Clinical Microbiology 47: 2419

Detección BLEE: ¿ya no es necesario?

CLSI M100 – S21 (2011)

ANTIMICROBIANOS S I R

Cefotaxima ≥ 26 23 - 25 ≤ 22

Ceftizoxime ≥ 25 22 - 24 ≤ 21

Ceftriaxona ≥ 23 20 - 22 ≤ 19

Ceftazidima ≥ 21 18 - 20 ≤ 17

Aztreonam ≥ 21 18 - 20 ≤ 17

NUEVOS TAMAÑOS DE LOS HALOS DE INHIBICION PARA TODAS LAS ENTEROBACTERIAS

Ventaja de los cambios de los breakpoints (CLSI2010) es que bacterias como Enterobacter spp. los cuales no son considerados en las guías de la CLSI para detectar BLEE, serian considerados

Recomendaciones del INEI - Argentina

Se sugiere seguir informando las cepas productoras de BLEEs como BLEE positiva e informar todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactamicos como resistentes, pero acompañado de una llamada aclaratoria para cada una de las drogas que presentara resultado de aparente sensibilidad cuando se aplican los puntos de corte del 2011, citando:

"De acuerdo a CLSI M100-S20 2011, Ceftazidima y/o Cefotaxima y/o Cefepima y/o Aztreonam, sería(n) sensible(s) en base a

parámetros PK/PD. Sin embargo, no se disponen de suficientes datos clínicos que aseguren la eficacia de esta(s) droga(s) en

aislamientos con este mecanismo de resistencia (BLEE)"

Servicio Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

INEI: ejemplo de Informe de BLEE

Servicio Antimicrobianos - INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”

(*) “De acuerdo a CLSI M100-S20 2010, CAZ y AZT serían sensible y FEP intermedio en base a parámetros PK/PD. Sin embargo, no se disponen de suficientes datos clínicos que aseguren la eficacia de estas drogas en aislamientos con este mecanismo de resistencia (BLEE)”

Antibiótico Halo de inhibición Informe

Cefotaxima 12 mm R

Cefatzidima 22 mm R (*)

Aztreonam 21 mm R (*)

Cefepima 15 mm R (*)

CULTIVO: Klebsiella pneumoniae

Sinergismo entre AMC-CTX: positivo BLEE POSITIVO

RECOMENDACIONES INEI ESTUDIO DE BLEE ENTEROBACTERIAS

Continuar con la búsqueda reporte e informe de BLEE en las pruebas de rutina. Usar tabla suplementaria 2A-S1 de CLSI M100-S21 (2011).

BLEE positivo: informar R a todas las penicilinas, cefalosporinas y monobactamicos independientemente de las zonas de inhibición o MIC obtenidas.

BLEE negativo: informar según punto de corte actualizado CLSI 2011

Punto de corte nuevo

CLSI 2009: S ≥ 18 mm; R ≤ 14 mm CLSI 2010: S ≥ 21 mm; R ≤ 17 mm Tamizaje de BLEE: ≤ 22 mm

DISTRIBUCION DE LOS HALOS DE INHIBICION DE CEFTAZIDIME DE 254 CEPAS DE Escherichia coli productoras de BLEE

HOSPITAL SAN BARTOLOME 2005 - 2010

Punto de corte antiguo

CLSI 2009: S ≥ 21 mm; R ≤ 13 mm CLSI 2010: S ≥ 23 mm; R ≤ 19 mm Tamizaje de BLEE: ≤ 22 mm

Punto de corte nuevo

DISTRIBUCION DE LOS HALOS DE INHIBICION DE CEFTRIAXONA DE 254 CEPAS DE Escherichia coli productoras de BLEE

HOSPITAL SAN BARTOLOME 2005 - 2010

Punto de corte antiguo

MIC (µg/ml)

% (No/total) de pacientes quienes:

Experimentan falla

Tto con Cefalosporina Muerte en los 14 dias

de bacteremia

8

4

2

1

Total

100 (6/6)

67 (2/3)

33 (1/3)

27 (3/11)

54 (15/28)

33 (2/6)

0 (0/3)

0 (0/3)

18 (2/11)

Pacientes que Fallaron al Tratamiento con C3G en Infecciones Graves por Bacterias Productoras de

BLEE

Paterson et al. J Clin Microbiol 2001;39:2206–2212

(NCCLS breakpoint S = 8 g/ml)

Métodos de Detección de BLEE

“Cada laboratorio deberia tener un Microbiólogo con el tiempo, el interés, y la experiencia para liderar en pruebas de resistencia a los antibióticos. Esta persona leería publicaciones relevantes, se relacionaria con otros laboratorios, y evaluaría pruebas potencialmente útiles para detectar nuevas formas de resistencia antes que las nuevas pruebas recomendadas por la CLSI sean disponibles”

Rol del laboratorio de Microbiología

Ken Thomson, Emerging Infect. Dis., 2001

Método de Screening para BLEE

Antibiótico Disco difusión (mm) MIC (μg/ml)

Cefpodoxima ≤ 17 (≤ 22) ≥ 4 (≥ 1)

Ceftazidima ≤ 22 (≤ 22 ) ≥ 1 (≥ 1)

Aztreonam ≤ 27 ≥ 1

Cefotaxima ≤ 27 (≤ 27) ≥ 1 (≥ 1)

Ceftriaxona ≤ 25 ≥ 1

( ) zona de inhibición y MIC para el screening de BLEE en Proteus mirabilis

M100-S21 (2011)

Screening para E. coli, K. pneumoniae, K. oxytoca y Proteus mirabilis.

Método de Screening para BLEE

M100-S21 (2011)

Antibiótico Disco difusión

(mm)

Cefpodoxima ≤ 17

Ceftazidima ≤ 22

Aztreonam ≤ 27

Cefotaxima ≤ 27

Ceftriaxona ≤ 25

Método Confirmatorio de BLEE

Método Confirmatorio de BLEE

Método Confirmatorio de BLEE

E. Coli productora de BLEE y alto nivel de AmpC Klebsiella pneumoniae productora de CTX-M-9 y CMY-2

E. cloacae con AmpC

Cromosomal inducible y

BLEE

E. cloacae mutante con AmpC

Cromosomal desreprimida y

BLEE

S. marcescens con AmpC Cromosomal

y BLEE

Métodos de Detección de BLEE

Jarlier V. et al. Rev Infec Dis 1988; 10:867-878

E. Coli CTX-M

Métodos de Detección de BLEE

Prueba de difusión del doble disco Prueba de disco sobre disco o del reemplazo del disco

Métodos de Detección de BLEE

Vercauteren E. et al. J Clin Microbiol 1997 ;35:2191–2197

Métodos de Detección de BLEE

Thomson K, Sander C. Antimicrob Agents Chemother 1992; 36:1877-1882

Prueba Tridimensional

Detección de BLEE en Proteus mirabilis

• Proteus mirabilis - prueba BLEE 2005

• Búsqueda de rutina no es recomendado

• Realizar prueba BLEE cuando sea clínicamente relevante (bacteremia) – Consultar a un medico para determinar cuando

probar.

– Un enfoque practico, probar aislamientos de sitios corporales estériles.

• Usar prueba fenotípica confirmatoria estándar disco difusión o MIC sin modificación (CLSI)

P. mirabilis con BLEE

37

K. oxytoca con hiperproduccion -lactamasa K1

La SFM recomienda informar al clínico como cepa con sensibilidad intermedia de aquellos antibióticos que presenten sinergia, independientemente de la sensibilidad

K. oxytoca con hiperproduccion -lactamasa K1

39

E. coli with CTX-M ESBL

MICs (g/ml): Citrobacter freundii productora SHV-3

Inoculo

CFU/ml

Cefotaxima Ceftazidima Aztreonam Cefepime

5 x 105 2 1 0.5 0.5

KS Thomson and ES Moland, Creighton University

(CLSI breakpoint 2009 Sensible: 8 g/ml)

Detección de BLEE: Efecto Inoculo

MICs (g/ml): Citrobacter freundii productora SHV-3

Inoculo

CFU/ml

Cefotaxima Ceftazidima Aztreonam Cefepime

5 x 105 2 1 0.5 0.5

5 x 107 256 32 32 >1024

Detección de BLEE: Efecto Inoculo

KS Thomson and ES Moland, Creighton University

(CLSI breakpoint 2009 Sensible: 8 g/ml)

Detección de BLEE: E-test

CEFOTAXIMA CEFOTAXIMA + ACIDO CLAVULANICO

Advanced Expert System™

Detección de BLEE: ViteK ESBL cards

DETECCION DE BLEE: FEP: 1 μg/ml FEP/CA: 1/10 μg/ml CTX: 0.5 μg/ml CTX/CA: 0.5/4 μg/ml CAZ: 0.5 μg/ml CAZ/CA: 0.5/4 μg/ml AST-GN24

ANALISIS DE ISOELECTROENFOQUE CARACTERISTICAS DE LOS PACIENTES EN LAS SALAS DE LA UCI NEONATAL

Se identificaron 7 cepas de K. pneumoniae y 3 cepas de E. cloacae .

PRUEBA DE SINERGIA DE DOBLE DISCO TRANSFERENCIA DE RESISTENCIA (CONJUGACION BACTERIANA)

CAZ AZT

CTX

FOX

IMP AMC

ANALISIS DE PATRON DE BANDA PLASMIDICA

GENOTIPIA DE LOS AISLAMIENTOS K. pneumoniae y E. coli

Gerhard F. 2003 AAC. 47: 2385-2392

METODO CONFIRMATORIO CLSI METODO DE JARLIER

METODO HODGE METODO TRIDEMENSIONAL

Brote por Klebsiella pneumoniae Lisina

Descarboxilasa Negativa productora de

ß-Lactamasa de Espectro Extendido en una

Unidad de Cuidados Intensivo Neonatal Nazario Silva, Javier Soto, Socorro Torres, Juan Carlos Riveros , Rosa Sacsaquispe, Víctor Suarez

HONADOMANI San Bartolome , Instituto Nacional de Salud , Lima, Perú, 2007

XI CONGRESO PERUANO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS Y TROPICALES 2009

Paciente H.C. Cod. Lab. Edad Servicio Fecha Cultivo Bacteria Biotipo API BLEE

Ayala Lorenzo RN. 616819 07D-2075 4 días UCI 01/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si

Ayala Lorenzo RN. 616819 07D-2086 6 días UCI 03/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si

Requena Saucedo RN. 618226 07D-2126 4 días UCI 07/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si

Jiménez Valverde RN. 618197 07D-2133 3 días UCI 10/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si

Alamo Sanchez RN. 617751 07D-2135 3 días UCI 10/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si

Requena Saucedo RN. 618226 07D-2157 11 días UCI 11/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si

Alamo Sanchez RN. 617751 07D-2156 6 días UCI 11/09/07 Sangre K. pneumoniae 1215773 si

Requena Saucedo RN. 618226 07C-1597 10 días UCI 14/09/07 Cateter K. pneumoniae 1215773 si

Paciente H.C. Cod. Lab. Edad Servicio Fecha Bacteria Biotipo API BLEE

Lopez Sanches RN 618350 P-01 5 días UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si

Alamo Sanchez RN. 617751 P-05 6 días UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si

Llano Meneses RN. 612990 P-07 10 dias UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si

Estudio de Portadores (3/7)

Muestra Cod. Lab. Servicio Fecha Bacteria Biotipo API BLEE

Leche Materna

(Alamo Sanches RN) M-12 UCI 11/09/07 K. pneumoniae 1215773 si

Estudio Ambiental (1/14)

Muestras Clínicas

PACIENTES 1 (AL) 2 (RS) 3 (JV) 4 (AS) Fecha de nacimiento 27/08/07 03/09/07 05/09/07 05/09/07

Catéter Umbilical Si si si si

Ventilación Mecánica Si si si si

Peso al nacer 840 1320 785 860

Edad Gestacional 34 32 26 28

Edad Materna - 27 24 31

CPN Inadec 1 1 0

T' hosp materna (horas) - 1 120 168

Tipo de parto PV Cesárea Cesárea P.V

Infecc Materna - no no no

RPM 10 días no no 7 días

Fecha de Dx de Infección 03/09/07 04/09/07 07/09/07 07/09/07

Fecha de Hemocultivo (KP) 03/09/07 08/09/07 08/09/07 10/09/07

SDR, EMH Si NO SI Si

Depresion Severa ASFIXIA No SI SI si

CARACTERÍSTICAS DE FALLECIDOS CON CULTIVO POSITIVO A KLEBSIELLA PNEUMONIAE

UCIN HONADOMANI SB. SETIEMBRE 2007

Klebsiella pneumoniae Productora de BLEE

N° Biotipo 1215773

N° Biotipo 3043

MP SB-A SB-B SB-C SB-D SB-E SB-F SB-G SB-H SB-I CS

Para comparar genéticamente las cepas

se realizó la prueba molecular ERIC-PCR,

la cual amplifica regiones repetitivas de

enterobacterias mediante PCR.

MP: Marcador de peso molecular 1 Kb ladder Fermentas; SB-A: cepa K. pneumoniae 2126.: SB-B: cepa K. pneumoniae 2133; SB-C: cepa E. coli 196-07 (cepario del INS); SB-D: cepa K. pneumoniae 2135;S B-E: cepa K. pneumoniae 206-07 (cepario del INS); SB-F: cepa K. pneumoniae 2086;S B-G: cepa K. pneumoniae 1; SB-H: cepa K. pneumoniae 12; SB-I: cepa K. pneumoniae 223-07 (cepario del INS); CS: Control de sistema.

INFORME DEL INS: Los resultados moleculares muestra que las cepas de K. pneumoniae aisladas e identificadas

por laboratorio de Microbiología del Hospital San Bartolomé están genéticamente relacionadas.

• Campos F, Soto J, Torres S, Bazan C, Silva N. Klebsiella pneumoniae productora de -lactamasa de espectro extendido (BLEE) en una Unidad de Cuidado Intensivo Neonatal. Lima .Dic 2003

• XXIII Congreso Peruano de Pediatría, Oct 12-15, Trujillo Perú 2003

• Aranda M, J Campos F, Torres S, Soto J, Silva N. Primer Brote de Escherichia coli productora de -lactamasa de espectro extendido (BLEE) en la Unidad de Cirugía Neonatal del Hospital San Bartolome. V Congreso Panamericano de Control de Infecciones y Epidemiología Hospitalaria; 2004 Oct 7-10, Lima, Peru.

• Rev Peru Enferm Infecc y Trop 2004; 3:34

DETECCIÓN FENOTÍPICA DE LOS MECANISMOS DE RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS BETALACTAMICOS EN E. coli CAUSANTE DE INFECCIONES URINARIAS EN EL

HOSPITAL NACIONAL DOCENTE MADRE NIÑO SAN BARTOLOMÉ - 2011

Autor: Blgo. Oscar Jhian Gibran Rios Rios

N° MUESTRAS SCREENING(CLSI) BLEE

CONFIRMADOS(SFM)

389 76 60

ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO EN MUESTRAS DE HECES DE PACIENTES AMBULATORIOS EN EL

HOSPITAL “SAN BARTOLOMÉ” - 2011.

ESPECIES BLEE + BLEE - TOTAL

E. coli 65 11 76

K. pneumoniae 6 2 8

P. mirabilis 4 0 4

E. cloacae 2 2 4

P. vulgaris 1 0 1

S. sonnei 1 1 2

K. oxytoca 0 1 1

A. caviae 0 1 1

TOTAL 79 17 96

Autor: Blga. María del Carmen Molina Carpio

Pacientes de la UCPTD n: 273 muestras de heces Medio utilizado: Agar karmali (cefoperazona) Prevalencia de bacterias productoras de BLEE: 28.9 %

La salud y el bienestar de los pacientes esta en sus manos...

AGUA JABON SENTIDO

Y

COMUN

SON LOS MEJORES

DESINFECTANTES