A.21. 1 21) CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA de EXCLUSIÓN

Índice • Introducción y equipamiento básico: columnas y sensores DR y UV • 1) DMM con Sensor Másico Únicamente • 2) DMM y Composición Química de Copolímeros con DR/UV • 3) DMM y Radio de Giro con DR/ LS • 4) Polímeros Ramificados por Viscosimetría Diferencial DR/ SV • 5) Más mediciones absolutas con Triple Detección DR/ LS/ SV • Limitaciones de la Técnica

Introducción • Size Exclusion Chromatography (SEC) • Liquid Exclusion Chromatography (LEC) • Gel Permeation Chromatography (GPC) • Gel Filtration Chromatography (GFC): biopolímeros en agua.

μ-geles de poli(St-DVB) (Diám. part.: 7-20 μm)

A efectos del fraccionamiento, las moléculas se muestran como esféricas rígidas equivalentes de distintos volúmenes hidrodinámicos.

A.21. 2

El Cromatógrafo

Inyector Manual

Clasificaciones de los Equipos Cromatográficos • Según la naturaleza del solvente:

o solventes orgánicos + columnas correspondientes (para gran parte de los polímeros sintéticos); y

o solventes acuosos + columnas correspondientes (biopolímeros). • Según la temperatura de operación:

o temperatura ambiente hasta 50 °C (caso más normal); y o alta temperatura (≈ 130 ºC para poliolefinas).

A.21. 3

El Fraccionamiento en SEC • Idealmente, el fraccionamiento en los poros debe ocurrir exclusivamente

según el volumen de las moléculas de polímero en solución (o volumen hidrodinámico, Vh); y dicho proceso debe ser independiente de la naturaleza química.

• El fraccionamiento debe ser sólo de naturaleza entrópica (una molécula flexible pierde entropía configuracional al ingresar a los poros desde la fase continua inter-partículas).

• Para asegurar que el fraccionamiento sea sólo la exclusión por tamaños, deben evitarse todas las posibles interacciones intermoleculares del tipo entálpico (entre solvente-soluto, solvente-sustrato y soluto-sustrato).

• Independientemente de la naturaleza química y topología del polímero analizado, la SEC permite obtener una distribución de los volúmenes hidrodinámicos y esta característica de “universalidad” es la principal ventaja de la técnica. En cambio, nótese que en HPLC estándar de adsorción-desorción (LAC), debe elegirse el sustrato cromatográfico según los tipos de grupos químicos a ser fraccionados.

Objetivos de SEC de Polímeros • Principal objetivo: determinación de la DMM y sus medias.

En muchos casos, las distribuciones y medias se dan en “pesos moleculares equivalentes de PS”; o más simplemente, como “distribuciones de los volúmenes de retención”. Estas formas inferiores de medición son, sin embargo también muy útiles, porque permiten comparar distribuciones medidas con distribuciones deseadas.

• Caracterización de aditivos líquidos en muestras de polímeros. • En copolímeros donde la composición varía monótonamente con la masa

molar, es posible estimar la variación de la composición química con la masa molar, y (más difícil) la distribución de la composición química.

• En homopolímeros ramificados donde el número de ramas aumenta monótonamente con la masa molar, permite estimar la variación del número de ramas largas/ molécula con la masa molar, y (más difícil) la distribución del número de ramas largas/ molécula (o grado de ramificación).

• Estudios físico-químicos y fluodinámicos de soluciones poliméricas.

A.21. 4

Fraccionamiento según masas molares (?) Los volúmenes hidrodinámicos de moléculas de homopolímeros lineales flexibles se asocian a esferas rígidas de comportamientos equivalentes cuyos radios se adoptan proporcionales a los valores medios de alguna dimensión molecular como la distancia extremo a extremo (Re); o (más comúnmente) el radio de giro (Rg):

2/1221g

iig Rs

NR =≡ ∑

Rg = Re/6 (pol. lineales)

[ ] 2/320 gh RMV Φ=∝ η

3gh RV ∝

Las ecuaciones anteriores son válidas en condición θ de la combinación T/solvente/polímero; y en tal caso, Vh resulta independiente de la naturaleza química del polímero y del solvente. Desafortunadamente, para evitar interacciones ente las moléculas del soluto, deben emplearse buenos solventes y soluciones diluidas. Pero los buenos solventes introducen expansión en los volúmenes hidrodinámicos, que dificultan la estimación de Rg en condiciones no θ. La principal limitación de la técnica de SEC es que sólo en el caso de los homopolímeros lineales ideales existe una correspondencia biunívoca entre Vh y M. En tal caso, un fraccionamiento perfecto según Vh también aseguraría un fraccionamiento perfecto según M; y podrían determinarse DMMs muy exactas, especialmente en el caso de distribuciones anchas. (En el caso de distribuciones muy angostas, afecta el problema del ensanchamiento instrumental.) Por lo anterior, los homopolímeros lineales se consideran cromatográficamente simples. Lamentablemente, casi todos las otras muestras poliméricas son cromatográficamente complejas; ya que aún con resolución perfecta a cada Vh existe toda una distribución de las masas molares. Es el caso de:

• mezclas de homopolímeros; • copolímeros lineales de composición química variable; • homopolímeros con número variable de ramas largas, etc.

A.21. 5 Por ejemplo, las moléculas remificadas exhiben un menor Vh de con respecto a su homólogas lineales de la misma masa molar:

• Mlinear = Mbranched • Vh,linear > Vh,br.

Y por lo tanto, a un mismo Vh existirá toda una variedad de masas molares:

• Vh,linear = Vh,br. • Mlinear < Mbranched

En el análisis de polímeros cromatográficamente complejos, se obtendrán DMMs razonablemente exactas sólo si las distribuciones instantáneas de masas molares en las celdas de detección son muy angostas con respecto a la DMM global.

Configuraciones Instrumentales Caso 1: se dispone únicamente de un sensor másico (típicamente: un Refractómetro Diferencial, DR).

En este caso, se requiere de una calibración independiente con patrones de M conocida para transformar a masas molares los volúmenes de retención (V) del cromatograma másico c(V) (técnica relativa).

Caso 2: se dispone también de sensores en línea sensibles a las masas molares instantáneas (técnica absoluta). Existen varias configuraciones posibles:

DR + Espectrof. de disp. de luz (LS): c(V) + ( )VM w DR + Visc. en línea (SV) + Cal. Universal: c(V) + ( )VM n Triple detección (DR/LS/SV): c(V) + ( )VM w + Vh(V), etc.

Calidad de las Mediciones En general, la SEC es una técnica es muy precisa pero relativamente poco exacta.

• Por un lado, las mediciones son muy reproducibles. Por ejemplo, en las mismas condiciones operativas, se reproducen los resultados con ±5% de diferencia, aún con intervalos de muchos meses entre los distintos análisis.

• Sin embargo, se observan resultados muy disímiles cuando se comparan las DMMs estimadas para una misma muestra en distintos laboratorios (“round robin tests”).

A.21. 6

Columnas de Fraccionamiento A efectos de minimizar las interacciones entálpicas, las polaridades del solvente, del sustrato y del polímero a analizar deben ser similares entre sí.

a) Columnas para polímeros sintéticos

Existen varias combinaciones ideales de muestra/ sustrato/ solvente Columnas de Polymer Standards Service (Mainz, Alemania):

Muestra:

Sustrato:

SDV (copol. de estireno/divinil benceno): Pol. y solv. no polares o semi-polares

GRAM: Pol. polares en solv. org. semi-polares. PFG: Pol. cristalinos en solv. org. fluorinados. SUPREMA: Pol. aniónicos y neutros y solv. acuosos.

Solvente:

H2O

DMF

THF

PS

PMMA

Dextrano

PAA

A.21. 7 b) Columnas para proteínas e hidratos de C Rangos de fraccionamiento y Diámetros Nominales de poros:

PROTEEMA 300 Å: Calibración con proteínas de masa molar uniforme entre 670 y 44 kD.

Patrones angostos de pululano:

PROTEEMAS 100, 300 y 1000 Å: Calibraciones con pululanos patrones.

c) Columnas para polímeros iónicos En estos casos, es muy difícil evitar las interacciones entálpicas (que a su vez dependen fuertemente del pH). Ej.: Polisulfato de estireno

A.21. 8

Detectores de Concentración (o Másicos) 1. Sensor de la concentración másica instantánea del soluto (es el sensor

principal e imprescindible). o Refractómetro Diferencial (DR): es el sensor más “universal”. o Espectrofotómetro UV: sólo para homopolímeros, y (cuando puede

usarse) preferible al DR por su menor sensibilidad ante variaciones en T.

2. Sensores sensibles al producto de la concentración con la masa molar media instantánea o Sensor de dispersión de luz (LS), o Viscosímetro en línea (SV) + Cal. Univ. o Coefs MHS conocidos.

Refractómetro Diferencial Waters 2414:

Se mide Δn (diferencia entre el índice de refracción de la solución y el índice de refracción del solvente puro).

Con homopolímeros: )()( VccnVn∂∂

=Δ ,

cn∂∂ (= ν): variación específica del índice de refracción.

En homopolímeros, ν exhibe una pequeña dependencia con M (es levemente menor a bajos M, y en general no se tiene en cuenta). Además, en copolímeros habría que tener en cuenta el νi de cada homopolímero, pero en general tampoco se tiene esto en cuenta. En tal caso, la señal digital del refractómetro )(DR Vs resulta directamente proporcional a la concentración másica total instantánea, es decir:

)(K)( DRDR VcVs =

(Nótese que la última expresión es estrictamente inaplicable a copolímeros AB con valores muy disímiles de νA y νB.)

A.21. 9

Detector UV de longitud de onda fija y seleccionable:

Si varios grupos atómicos del polímero absorben radiación UV a la misma long. de onda λ, entonces la absorbancia vale:

∑==i

ii VcλVIIλVA )()(

),(log),(

t

0 ελ

l (Ley de Beer)

It, I0: intensidades de luz transmitida por la solución y el solvente puro, respectivamente; ℓ: camino óptico en la celda; εi: absortividad molar de cada uno de los grupos que absorben a esa λ.

Detector UV-Vis a múltiples longitudes de onda: Permite obtener espectros UV-Vis completos del efluente cromatográfico; permitiendo p. ej. identificar la naturaleza química de aditivos de baja M.

A.21. 10

Determinación más Simple: Pesos Moleculares en Homopolímeros Lineales Empleando un Sensor Másico y una Calibración Directa Obtenida con Patrones Angostos del Polímero Analizado

• Obtenemos el cromatograma de los patrones y del polímero en estudio. • Transformamos el eje de volumen de retención en masas molares con la

curva de calibración.

Puede demostrarse que las masas molares medias se calculan mediante las fórmulas habituales presentadas, a pesar de que las hipotéticas especies discretas de fracción másica wi se encuentran equiespaciadas en ΔV (y también en Δ(logM) con calibración “lineal), pero no en ΔM (!). Más aún, empleando una calibración “lineal”, se representa también directamente a la DMM en la forma wi vs. logMi.

A.21. 11

Ecuaciones Básicas de los Distintos Sensores Refractómetro Diferencial (DR) ( ) ( ) ( )⎟

⎠⎞

⎜⎝⎛∂∂

×∝ ?VcnVcVsDR (homopol.)

( ) ( ) ( ) ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

×+⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∂∂

×∝B

BB

A

AADR c

nVccnVcVs (copol.)

Espectrofotómetro UV-Vis ( ) ( ) ε×∝ VcVsUV (homopol.) ( ) ( ) ( ) BBAAUV VcVcVs εε ×+×∝ (copol. dibl.)Fotómetro de Dispersión de Pequeño Ángulo (LALS), o con extrapolación a θ→0

( ) ( ) ( ) ( )2

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛∂∂

××∝ VcnVMVcVs wLS

Sensor de Viscosidad Específica (SV) ( ) ( )

PPPVVs

iSV Δ−

Δ==

24

spη

( ) ( ) [ ]( )VVcVsSV η×∝ (∝ ( ) ( )VMVs avDR ×

Con Triple Detección (DR+LS+SV), podrían estimarse: c(V); Mw(V); Mv(V);

Volumen Hidrodinámico: ( ) ( ) [ ]( )A

wh N

VVMVV η×∝ ; etc.

Ej. de Triple Detección: Gráficos de MHS log[η] vs. logM para un PE Lineal y otro Ramificado

El PE lineal genera un gráfico doble log de MHS también lineal. En la muestra de PE ramificado, se observa que las bajas masas molares son esencialmente lineales, y que el grado de ramificación aumenta con M.

A.21. 12

DMM por Calibración Directa Requiere disponer de patrones del polímero que se analiza.

Estándares angostos disponibles comercialmente

a) Para solventes orgánicos: • poliestireno, • poli(α-metilestireno), • poliisopreno, • polibutadieno, • polietileno, • poli(óxido de etileno), • poli(metacrilato de metilo), • politetrahidrofurano.

b) Para solventes acuosos: • poli(óxido de etileno), • poli(sulfonato de estireno), • dextranos, • pululanos.

Calibración con Patrones Angostos Los máximos de los cromatogramas de patrones angostos permiten obtener calibraciones como la de la figura. Según el patrón, se dispondrá de los valores de

nM , wM , o Mpico. A partir de nM y wM , es común calcular Mpico = wn MM × (la media geométrica).

Vol. de exclusión total

(Vol. intersticial) Vol. de inclusión total

Típicamente, los tramos intermedios resultan “lineales” en logM. Nótese la enorme pérdida de resolución cuando se aumenta M.

A.21. 13

Modelos de partición Vexcl. total ≤ Vretención ≤ Vincl. total

(Moléc. demasiado grandes) (Moléc. del solvente)

Vintersticial ≤ Vretención ≤ (Vintersticial + Vporos) Vexcl. total ≤ Vretención ≤ (Vexcl. total + Vporos)

Como en Vinterst. no hay fraccionamiento, entonces las moléc. intermedias que resultan fraccionadas en los poros, deben cumplir:

pSECeret K VVV += (0 < KSEC < 1) Para un dado sistema cromatográfico:

KSEC = f(M, Rg, Distr. de volúmenes de poros)

KSEC > 1 indica adsorción Se han desarrollado numerosos modelos teóricos de fraccionamiento en SEC que procuran desarrollar expresiones analíticas para KSEC. Ello a partir de consideraciones geométricas, termodinámicas, estadísticas, etc.

CONFIG. 1) DMM con Sensor Másico Únicamente

DMMs y sus Medias Estrictamente, las DMMs son funciones discretas. Por ej., en homopolímeros existen masas molares a múltiplos de las masas molares de las unidades repetitivas:

Sin embargo, la medición de distribuciones discretas por SEC, es sólo posible en el caso de los oligómeros. En altos polímeros, los cromatogramas son siempre curvas continuas (por la limitada resolución de la técnica a altos M), y las DMMs correspondientes también se representan como funciones continuas.

A.21. 14 Ej. de oligómeros: Patrones de PS de

nM = 1270 g/mol (rojo) y

nM =580 (azul) (MSt = 104 g/mol)

DMMs continuas Las 2 formas típicas de representación de DMMs continuas se presentan a continuación.

1) Mw

dd vs. M (con eje de abscisas lineal)

En este caso, debe verificarse:

• ( ) WMMMw

=∫∞

ddd

0 = Masa total de la muestra (1)

• ( ) =⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∫ WMM

MwM

Md

dd2

1

Fracción másica de especies con M entre M1 y M2

2) )d(log

dM

w vs. logM (forma más normal y más afín al fracc. crom.)

En este caso, debe verificarse:

• ( ) WMMM

w=∫

∞dlog

)d(logd

0 = Masa total de la muestra (2)

• ( ) =⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛∫ WMM

MwM

Mdlog

)d(logd2

1

Fracc. másica con M entre M1 y M2)

A.21. 15 El cromatograma másico continuo sDR(V) también debe verificar:

( ) WVVs =∫∞

d0

DR (3)

Igualando (1) y (3), derivando, y teniendo en cuenta que las variaciones positivas en M se corresponden con variaciones negativas en V:

( ) ( ) VVsMMMw dd

dd

DR=−

( ) ( )( )V

MVs

MMw

ddd

d DR−= (4)

La ec. anterior representa a la distorsión cromatográfica, e indica que para

calcular las ordenadas de ( )MMw

dd (con eje lineal en M), se requiere dividir a las

alturas del cromatograma másico por ( )VM

dd ; es decir, por la pendiente de la

curva calibración cuando se emplea una escala lineal en M.

Con curvas de calibración “lineales”, la pendiente (V

Mdlogd ) es constante.

Multipliquemos el miembro derecho de (4) por (d logM)/(d logM):

( ) ( ) ( ) ( )M

M

VMVs

MM

VM

VsMM

VM

VsMMw

dlogd

dlogd

logdd

dlogdlogd

logd

ddd

d DRDRDR ==⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛=−

( ) ( )M

Vs

VM

MMw DR

dlogd1

dd

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

−= (5)

Es decir, que como alternativa a la ec. (4), debemos simplemente dividir a las

ordenadas del cromatograma por M, (ya que V

Mdlogd es una constante).

El procedimiento anterior se simplifica notablemente representando a las DMM con eje logarítmico en M. En efecto, igualando ahora (2) y (3):

( ) ( ) VVsMMM

w d)d(loglog)d(log

dDR=−

( ) ( )

VMVsM

Mw

d)d(loglog

)d(logd DR=−

A.21. 16

Pero como V

Mdlogd (V) = cte. con calibración “lineal”, en este caso podemos

representar a la MMD directamente como )(log vs.)d(log

d MM

w , sin necesidad

de corregir las ordenadas de las mediciones másicas originales.

DMM con Calibración Directa Ej.: DMM de un PS lineal determinado a partir del cromatograma másico y una calibración directa lineal obtenida con patrones angostos

a) Cromatograma másico cuya DMM se quiere determinar. El cromatograma continuo sDR(V) se lo discretiza a sDR(Vi), con (i = 1, 2, ..., 118) puntos tomados cada ΔV = 0.088 mL.

b) Cromatogramas másicos de patrones angostos de PS y calibración lineal resultante.

c) Debido a la calibración lineal logMPS(V), las alturas del cromatograma (equiespaciadas en V), también resultan equiespaciadas en Δ(logM). Esto permite trazar la curva continua [dw/dlogM](logM) uniendo directamente a las ordenadas de los puntos equiespaciados en Δ(logM).

d) En cambio, para representar a la MMD con eje lineal en M, debemos primero dividir a cada una de las alturas de la Fig. c) por M y luego unir los puntos resultantes. Se genera una curva continua, uniendo puntos no equiespaciados en M.

A.21. 17 Como ya comentáramos antes, puede demostrarse que a pesar de que los puntos del cromatograma másico discreto cj(Vj) no están equiespaciados en ΔM, las masas molares medias pueden sin embargo calcularse directamente a partir de dichas alturas y los Mj correspondientes, mediante las fórmulas tradicionales:

jj

j

M/cc

M∑∑

=n ; ∑

∑=

j

jj

ccM

M w

∑∑

=jj

jj

cMcM

M2

z ;

a1a

v

/

j

jj

ccM

M⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡=

∑∑

Aplicando las 2 primeras al ejemplo anterior, resultan: nM = 79.500 g/mol

wM = 128.500 g/mol

De hecho, es preferible calcular las medias a partir de las mediciones originales y no a partir de puntos interpolados a intervalos regulares de M, luego de la corrección de alturas necesaria para representar a la DMM con eje lineal.

DMM con Calibración Universal Aún con fraccionamiento perfecto según volúmenes hidrodinámicos, las calibraciones directas logM vs. V dependen de la topología molecular y de la naturaleza química del polímero analizado.

Ej.: Calibraciones directas de: • 2 homopolímeros lineales PA y PB, y • un homopolímero PA del tipo estrella de 4 ramas.

A.21. 18 El concepto de la Calibración “Universal” se basa en que la técnica fracciona según Vh; y que en condiciones θ no perturbadas, es:

Vh ∝ [η]×M, Benoit y col. (1968) propusieron reemplazar a las calibraciones directas por una única calibración universal (que es sólo válida en las condiciones cromatográficas dadas), representada por log([η]×M) vs. V (en lugar de logM vs. V). Calibración Universal log J(V) = log{[η]×M}(V):

Nótese que (independientemente de la naturaleza química y topología molecular), a cada vol. de retención, se verifica:

J(V) = [η]1 M1 = [η]2 M2 = [η]3 M3 = ...

A.21. 19 Determinación de J(V) mediante patrones angostos de PS Supongamos disponer de: • una calibr. directa obtenida con patrones lineales angostos de PS: log MPS(V);

y • los valores de las constantes de MHS para el PS en las condiciones de análisis;

determinados p. ej., midiendo las viscosidades intrínsecas globales de los patrones con viscosímetros de vidrio, y ajustando la relación:

PSPSPSPS logaKlog]log[ M+=η

Reemplazando PSaPSPSPS K][ M=η en J(V) = {[η]PS×MPS}(V), resulta:

( ) { }( )VMVJ 1aPSPS

PSK +=

Masa molar instantánea de un polímero desconocido X empleando el concepto de la calibración universal Existen 2 posibilidades: 1) Medir en línea la viscosidad intrínseca instantánea del polímero desconocido

)(][ x Vη y aplicar:

{ }( ))(][

K)(][

)()(x

1aPSPS

xx

PS

VVM

VVJVM

ηη

+

==

2) Cuando se conocen las constantes de MHS del polímero lineal analizado (no válido con polímeros de ramas largas), entonces no se requiere ninguna medición sensible a la masa molar. En efecto, reemplazando:

( ) ( )VMV XaXX K][ =η

en }]{[ XX M×η

resulta: 1a

xxXXxK}]{[ +==× MJMη

Y entonces:

{ }( ))1(a1

x

1aPSPS

)1(a1

xx

xPSx

KK

K)()(

+++

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡=⎥

⎦

⎤⎢⎣

⎡=

// VMVJVM

Nótese que en esta última expresión hemos aplicado el concepto de la Cal. Universal, pero sin necesidad de haber representado a log{[η]×M } vs. V.

A.21. 20

Generalización de Hamielec y Ouano (1978) al planteo original de la Calibración Universal

Analicemos un polímero cromatográficamente complejo en un equipo ideal con resolución infinita (es decir, que fracciona estrictamente según volúmenes hidrodinámicos, sin ensanchamiento instrumental). En tal caso, en la celda de detección y a cada instante, coexistirán moléculas de una variedad de masas molares.

Como lamentablemente no existen patrones cromatográficos perfectamente uniformes en M, nótese que son posibles varias Calibraciones Universales log([η]M), según la masa molar media elegida ( nM , wM , etc.). La pregunta es cuál de dichas medias proveerá la calibración más representativa.

Con resolución infinita, todas las moléculas presentes en la celda de medición exhiben un único Vh, pero una variedad de masas molares Mi. Por lo tanto, a cada volumen de retención, cada una de las especies moleculares presentes en la celda debe verificar:

JPS(V) = [η]1(V) M1(V) = [η]2(V) M2(V) = ... = [η]i(V) Mi(V)

Suponiendo que la visc. intrínseca global instantánea sea el resultado de sumar las distintas contribuciones másicas individuales, entonces la media en peso de la viscosidad intrínseca será:

[η]w(V) = ∑i

[η]i(V) ωi(V)

[η]w(V) = ( )( )∑ ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

ii

i VMVJ

ωPS

[η]w(V) = ( )( )∑ ⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛

i i

i

VMVJ

ωPS

Pero: ( )1

n

−

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡⎟⎟⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛= ∑

ii

i

MVM

ω

JPS(V) = log{[η]w(V)× nM (V)}

El resultado anterior sugiere que: 1) la calibración universal debería determinarse a partir de los nM globales de los patrones usados; y 2) las mediciones de viscosidad intrínseca + la CU permitirían determinar valores instantáneos de

( )VM n . Por lo antedicho, es desafortunado que no existan sensores en línea de ( )VM n .

A.21. 21

CONFIG. 2) Detección Dual DR/UV para DMM y Composición Química de Copolímeros Disponemos de 2 cromatogramas, producidos por los sensores DR y UV. Supongamos además lo siguiente: a) mientras que la señal de DR [ )(VnΔ ] mide a ambos tipos de unidades repetitivas, b) la señal de UV [A(V)] responde sólo a las unidades de A. Es decir:

• Señal DR: [ ]{ } )()(1)()( ABAA VcVpVpVn −+=Δ νν

pA: fracción másica de A en el copolímero.

• Señal UV: A(V) = κA cA(V) = κA pA(V) c(V)

κA: coef. de extinción de PA a la long. de onda seleccionada.

Se conocen los valores de las constantes νA, νB y κA. De las ecuaciones anteriores, se obtienen las siguientes expresiones para la concentración y composición instantáneas:

( ) ( ) ( )VAVnVcBA

BS

B νκνν

ν−

+Δ

=

( )

( )( )

( ) ( )( )⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡Δ

−+

⎥⎦

⎤⎢⎣

⎡Δ

=

VnVA

VnVA

Vp

BSA

B

A

ννκ

ν

Nótese que mientras que c(V) se calcula como una combinación lineal de ambas mediciones, pA(V) involucra a un cociente de señales. Por esto último, las mediciones de pA(V) son sólo confiables en un rango intermedio de los cromatogramas DR y UV. Ej.: Análisis de un caucho SBR estadístico 1502 (conc. másica global de St: 24,5%) A λ = 256 nm, la señal UV sólo responde a los grupos fenilos, y no al PB.

A.21. 22

• A partir de los cromatogramas de fig. a), calculamos c(V) y pS(V) de fig. b) por aplicación de las ecs anteriores.

• Se observa que la composición química no varía con M. • Las masas molares se estimaron a partir de calibraciones directas obtenidas

con patrones de PS y PB. Los pesos moleculares del copolímero logM(V) se obtiene interpolando entre ambas curvas con pS(V).

• DMM. Obtenida de c(V) y logM(V)

A.21. 23 CONFIG. 3) DR + Sensor de LS en Línea

Sensores de LS Fuera de Línea (para polímeros globales) Equipo Brookhaven/ Malvern

Sensores cromatográficos a) Sensor “on-line” Wyatt de 18 Ángulos (para M altos entre 106–108 g/mol)

Exceso de Rayleigh: )()()()( θPVcVMKVΔR wLSθ ≈

Permite extrapolar θ → 0, con lo cual P(θ)→1.

b) Sensor “on-line” Wyatt de 3 Ángulos (para Ms bajos, < 105 g/mol)

A.21. 24 Interferencia destructiva en moléculas grandes (polímero de alto M)

Intensidad de la luz dispersada a distintos θ por partículas esféricas grandes y chicas. El haz incidente llega desde la izquierda. La interferencia destructiva en partículas grandes aumenta con θ (que varía entre 0 y 180º).

Señal cruda de LS: sLS(θ, V) = Iex(θ, V): “Exceso” de luz disp. debido al polímero:

A.21. 25 Ej. 1: Análisis de un PE ramificado

Ej. 2: Cromatogramas de proteína del suero bovino (BSA), su dímero y trímero

A.21. 26

Ecuaciones básicas de la Dispersión de Luz Estática en Línea Las siguientes ecuaciones son f. de θ y del vol. de retención V; y producen valores instantáneos o “en línea”. Sin explicitar la funcionalidad con V, se emplean las mismas ecuaciones para mediciones “off line” de medias globales.

• Medición “práctica”: Factor de Rayleigh “en exceso”: ( ) ( )( )VI

VIVrVR ex

d 0

2θ

θ =

r: distancia al detector; Vd: volumen “efectivo” de dispersión; Iex θ: “exceso” de luz dispersada con respecto al solvente puro; I0: Intensidad de la luz monocromática incidente (roja).

• Cálculos:

Inv. de la med. reducida: ( )( ) ( ) ( )

( )VcAVPVMVR

VcH

w221

+=θ

+… (1)

Av4

22

N

)/(4

λ

cnnH

∂∂π=

2

(2)

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛+=

2sen)(

3

π161

)(1 22

g2

22 θθ

VRλ

nP

(3)

Mw(V): masa molar media en peso instantánea. H: “Constante” Óptica; P(V): Factor de Forma; A2: 2do. coef. del virial; n: índice de refracc. de la solución;

c/n ∂∂ : var. esp. del índ. de refracc. solución (variable para copolímeros!); λ: long. de onda del haz incidente; Rg = ⟨Rg⟩w: radio de giro medio en peso, con:

igi

iwg RR 22 ∑= ω

Ec. (3): válida para cadenas aleatorias gaussianas. En la fig., se compara P(k) vs. kRg de cadenas aleatorias, part. esféricas o varillas. k: módulo del vector de dispersión:

2sin4 θ

λπ nk =

La determinación de Mw(V) requiere de 2 extrapolaciones: a) a c→0 para que [2 A2 c(V) ≈ 0]; y b) a θ→0 para que P(θ)→1. En tal caso, la señal de LS resulta:

( ) ( ) ( )VMVcVsI wex ×∝=→ LS0θ

A.21. 27 Para las extrapolaciones a c y θ →0, se usan los gráficos de Zimm (o su concepto para los cálculos computacionales). Se determinan wM ,

wgR 2 y A2 en 2 formas:

• “off-line” (los valores medios globales); o • “on line” (los valores medios locales o instantáneos).

• La extrapolación a c→0 es innecesaria en SEC por las bajísimas

concentraciones cromatográficas empleadas. • El detector de múltiples ángulos permite la extrapolación θ→0 [o de P(θ)→l].

Con las señales de DR y LS a varios ángulos, se calcula (H c/Rθ) vs. sin2(θ/2), y luego se determinan Mw(V) y Rg(V):

o Ordenada al Origen = 1/Mw(V)

o Pendiente/Ordenada al Origen = 2

22

3

16

λ

πwgR

• Alternativamente, con DR y un sensor de bajo ángulo (LALS) se estima

A.21. 28 únicamente Mw(V).

CONFIG. 4) Polímeros Ramificados por Viscosimetría Diferencial

Mediciones:

• de Concentración (DR) )(Vc

• de Viscosidad específica (SV): PPPVΔ−

Δ=

−=

24)(

T0

0sp η

ηηη

Determinaciones instantáneas directas:

Viscosidad Intrínseca: [ ])()(

)( sp

VcV

Vw

ηη ≅

Masa molar instantánea con: • Ec. de MHS con K y a conocidos

(sólo pol. lin.), o • Cal. Universal:

( ) [ ]( ) a

v KVVM

/1

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛=η

log JPS(V) = log {[η]w×M}(V)

Radio de giro en condiciones no-θ (Ec. de Flory-Fox, 3ra versión) ( ) [ ]

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

Φ=

MVR η2/3

3g 6

1

Φ = Φ0 (1 – 2.63 α’ + 2.86 α’2) (Φ0 = 2.55×1021)

31α2α −

=′ ; (α’ = 0 – 0.2)

MMD de )(Vc y ( )VM v : )d(log)d(log

dv

vM

Mc

A.21. 29 Ej.: Poliacetato de Vinilo con ramas largas: DPM estimada con medidores de concentración y viscosidad específica + calibración “universal”

Mediciones:

• Cromatograma másico: c(V) • Cromatograma de visc. esp.:

ηSV(V) • Calibración universal:

log JPS(V) = log {[η] M}(V) Viscosidad intrínseca instantánea:

[η]b(V) =( )

( )VcVSVη

Calibración “ad hoc”. De: • log[η]b(V) y • log {[η]×M}(V)

obtenemos: log MSV(V)

DMM. De:

• c(V) • log MSV(V)

obtenemos: M

c log d

d (log M)

* * *

Para polímeros con ramas trifuncionales largas como el PAcV, es posible también emplear las mediciones viscométricas mostradas para estimar la variación del número medio de ramas/ moléc. con la masa molar. Pero antes de considerar dicho procedimiento de cálculo, recordemos primero la teoría de contracción de Vh por efecto de las ramas largas.

A.21. 30

Cálculo del Nº Medio de Ramas Largas Aleatorias Trifuncionales por Molécula La estimación de la media en número local o instantánea del número medio de ramas por molécula bn(V) se basa en las siguientes fórmulas ya vistas:

Factor de Contracción Geométrico (Zimm & Stockmayer, 1949):

≤≡

lg

bg

R

Rg 2

2

1 ( )lb MM =

Ojo!, se comparan los radios cuadrático medios a un mismo M (no a un mismo V).

Con ramas trifuncionales, resulta: 2/12/1

3 π94

71

−

⎥⎥⎦

⎤

⎢⎢⎣

⎡+⎟⎟

⎠

⎞⎜⎜⎝

⎛+= nn bb

g ( )lb MM =

molec.Trif./ Pts.Nº del Nºen Prom.=nb

De la ec. anterior, se obtiene:

( )( ) ( )Vg

...Vg

.Vbn 22450762573077

+−+=

Lamentablemente, los errores en las determinaciones de Rg por LS generan valores inaceptables de g cuando M < 200000. Por ello, se prefiere meddir g’(V), y estimar a g(V) indirectamente a través de la última correlación empírica.

Factor de Contracción Viscométrico (Zimm & Kilb, 1959): [ ][ ] 1≤≡′

l

bgηη

( )lb MM =

[η]l puede estimarse con la ec. de MHS para el PAcV lineal de ctes K y a conocidas.

Interrelación de g y g’ (ec. empírica): εgg =′ (ε = 1,2 para PVAc)

Retomemos el ejemplo anterior, donde ya habíamos calculado la DMM.

A.21. 31

Estimación de la variación del Nº ramas/ moléc. con M

1. Gráficos de MHS (fig. d):

log[η]b(V) log MSV(V) → log[η]b vs. log MSV

A los mismos valores de M, se muestran las viscosidades intrínsecas medidas del polímero ramificado y de su homólogo lineal. Las visc. intr. del homólogo lineal se calcularon mediante: log[η]l = log K + a log MSV

2. A los mismos M, se calcula [ ][ ]l

bgηη

=′ o: log g´ = log[η]b – log[η]l (fig. e):

log[η]b(log M) log[η]l(log M) → log g´(log M)

3. Como 2,1gg =′ , se calcula g(log M) mediante (fig. e): g(log M) = [g´(log M)]1/1,2

A.21. 32 4. Calculamos nb (log M) (fig. f) con:

( )( ) ( )MgMg

Mbn log4.507.6257.3

log07.7log 22 +−+=

5. No mostrado por la naturaleza semi-cualitativa de los resultados, podría finalmente estimarse la Distrib. en peso del Nº ramas/ moléc. (como variable continua) mediante:

Mc log d

d (log M)

nb (log M)→

nbc

dd ( nb )

CONFIG. 5) Triple Detección DR/ LS/ SV

( ) ( )VcKVs =DR

El sensor de pequeño ángulo

no requiere extrapolación θ→0, y permite determinar

( )VsIex LS0 =→θ directamente.

El sensor a 90º se usa para polímeros de bajo M.

Con cal. universal: [ ] 3/1

2

61

⎟⎠⎞

⎜⎝⎛

Φ= nw

wgMR η

Con el sensor de LS de pequeño ángulo, se calcula la masa molar instantánea directamente de la relación de señales y de la constante óptica:

( ) ( )( )δ+

≅Vs

VsVM

DR

LSLSw K ; (δ: volumen interdetector)

Luego, la DMM se determina de c(V) y la calibración local o“ad hoc” log ( )VM w :

)d(log)d(log

dw

wM

Mc

Specific Viscometer

Differential Refractometer

LS Sensor

A.21. 33 La SEC con LS permite estimar el wM global en forma correcta, pero es fácil probar que sobreestima el nM global; y por lo tanto se subestima la dispersidad.

Finalmente, como la viscometría provee una estimación independiente de wgR2 ,

es posible sustituir su valor en la ec. básica (3) para estimar el factor de forma P(θ).

Limitaciones de la Técnica de SEC a) Problemas de los sensores sensibles a M

• Tanto la viscosimetría como la dispersión de luz, exhiben una baja sensibilidad a los bajos M.

• El cálculo de la masa molar requiere dividir a las señales de LS o SV por la concentración instantánea. Esto genera grandes errores de estimación porque: o las colas de los cromatogramas exhiben bajas relaciones señal/ruido, por

lo que las mediciones de M(V) resultan sólo confiables en los rangos intermedios de los cromatogramas; y.

o cuando se conectan sensores en serie, aparecen errores debidos al corrimiento que debe corregirse para compensar por el volumen interdetector.

b) Problemas Generales a Altos M • En general, el fraccionamiento es muy pobre a M > 107 g/mol. Nótese sin

embargo que las mediciones por LS presentan menores limitaciones en M. • El problema de la degradación de altos polímeros por corte en filtros

precolumnas y en columnas muy eficientes (de partículas pequeñas y altas caídas de presión) puede ser muy grave. (Típicamente, las moléculas lineales se parten por la mitad.)

• La resolución en SEC es una solución de compromiso entre poros grandes, partículas pequeñas y degradación.

• Presencia de microgeles que eluyen antes que el volumen de exclusión total (detectables por LS).

• Los patrones de altas masas molares poseen dispersidades relativamente altas.

• A altos M, la función del Ensanchamiento Instrumental es muy asimétrica y ancha.

• Efecto de “concentración” a altas M, por saturación de los poros más grandes.

A.21. 34 • Problemas con biopolímeros altamente ramificados como la amilopectina,

etc.

c) El Ensanchamiento Instrumental (EI) Aún evitando completamente las interacciones entálpicas, resulta imposible lograr una resolución perfecta según volúmenes hidrodinámicos. La resolución imperfecta se cuantifica mediante la función del ensanchamiento instrumental. Razones del EI:

• dispersión axial en las columnas de fraccionamiento. Es la principal contribución al EI y genera un ensanchamiento gaussiano simétrico no uniforme (o función de M);

• dispersión axial en capilares, extremos de columna y celdas de detección (generan asimetrías hacia las bajas masas molares);

• inyección de un pulso en lugar de un impulso; etc. Si se dispusiera de patrones estrictamente uniformes en masa molar, entonces sus cromatogramas másicos representarían directamente a la función de EI.

Modelo de Tung para el ensanchamiento instrumental

( ) ( ) ( ) VdVsVVgVs c0 ,∫∞=

s(V): cualquier cromatograma sc(V): cromatograma corregido por EI

( )VVg , : función de EI Midiendo s(V) y conociendo la función de EI, puede calcularse sc(V) numéricamente mediante técnicas de filtrado inverso o deconvolución.

Afortunadamente, estas correcciones son innecesarias en el caso más normal de MMDs suaves y anchas. En cambio, la corrección por EI resulta fundamental en los casos de distribuciones muy angostas (p. ej., de los patrones) o multimodales como las obtenidas por pulsos de laser para determinar constantes cinéticas el polimerizaciones radicalarias.

Determinación de la f. del EI (Yossen et al., J Liq Chromatogr & Rel Technol., 2012)

A.21. 35 a) Cromatogramas DR y LS de 4 patrones de PS y calibración de las masas

molares resultante

b) Se propone una técnica que permite estimar las funciones individuales del EI (curvas continuas) vs. cromatogramas másicos de los patrones.

c) Función del EI ( )V,Vg obtenida por interpolación de las anteriores.

Gregorio Meira, 2014