21

Bab III

Metodologi Penelitian

III.1 Alat

Peralatan gelas yang digunakan terdiri dari labu erlenmeyer, gelas kimia, gelas

ukur, cawan petri, tabung reaksi, batang pengaduk, dan spreader (batang L).

Peralatan non-gelas yang digunakan terdiri dari batang ose, spatula, mikropipet

(Soccorex) berukuran 0-50 μl, 50-200 μl; mikropipet (Eppendorf, Germany)

dengan ukuran 1-10 μl, 100-1000 μl; dan tip mikropipet berukuran 10μl, 200 μl,

1000 μl, yang digunakan untuk mengambil reagen dan sampel dalam skala kecil

dan tabung mikrosentrifuga berukuran 0,5 mL dan 1,5 mL, yang digunakan untuk

wadah sampel dalam skala kecil.

Autoclave (All American, Wiconsin) digunakan untuk mensterilkan media dan

peralatan yang digunakan, oven (Memmert) digunakan untuk pengeringan

peralatan gelas dan plastik, Freezer model 8831 (Caravell, Denmark) suhu -20°C

dan model 3671 (Forma Scientific Inc., USA, Caravell, Denmark) suhu -20°C

digunakan untuk menyimpan sampel, enzim, dan reagen-reagen. Laminar flow

(Oliphant LTD, Australia) digunakan untuk pekerjaan yang memerlukan kondisi

steril, misalnya meremajakan bakteri dan pembuatan media. Inkubator goyang

(Lab line dan Thermolyne ROSI 1000) digunakan untuk menumbuhkan bakteri

pada media cair.

Vortex (Vortex-2 Genie) digunakan untuk menghomogenkan campuran.

Spektrofotometer (Smart SpecTM3000 Biorad) digunakan untuk pengukuran

optical density. pH meter Thermo Orion (model 710) digunakan untuk mengukur

pH larutan. Termometer digunakan untuk mengukur suhu. Timbangan digital

model 682B (Mettler Toledo, Switzerland) digunakan untuk pengukuran massa

bahan-bahan kimia.

22

Sentrifuga model JA2-21 (Biofuge) dengan kecepatan 0-12.500 rpm dan

sentrifuga Beckman model J2-HS digunakan untuk memanen sel, memisahkan

supernatan dan sel atau debris sel, dan untuk mengendapkan DNA. Peralatan

elektroforesis (Biorad) digunakan untuk memisahkan fragmen DNA. Lampu

WL/UV (Cole Parmer Instrument, France) digunakan untuk visualisasi hasil

elektroforesis. Mesin PCR (BioRad Gene Cycler) digunakan untuk memperoleh

fragmen cDNA. Kamera digital Canon Power Shot A460 digunakan untuk

dokumentasi.

III.2 Bahan

Bakteri yang digunakan dalam penelitian adalah bakteri laut galur lokal SFNB3

yang diperoleh dari Dr. Ocky Karnaradjasa, Universitas Diponegoro, Semarang.

Plasmid yang digunakan adalah pUC19 dan Escherichia coli TOP10F’

(F’{proAB, lacIq, lacZ∆M15, Tn10(TetR)}mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC),

d80lacZ∆M15, ∆lacX74, deoR, recA1, λ-araD139, ∆(ara-leu)7697, galU, galK,

rpsL(Str-R), endAJ, nupG}) digunakan sebagai sel inang untuk memperbanyak

DNA plasmid yang diperoleh dari Laboratorium Biokimia, Program Studi Kimia,

ITB.

Gambar III.1 Peta restriksi plasmid pUC19.

23

Zat-zat kimia yang digunakan dalam penelitian adalah pepton, ekstrak ragi, bakto

agar, pati, bakto tripton, NaCl, EDTA (Asam Etilendiamintetraasetat), lisozim,

etanol, RNase, isopropanol, aquabides (ddH2O), agarosa, buffer TAE (Tris-Base,

asam asetat glasial, EDTA, akuades), etidium bromida, loading buffer (sukrosa,

bromfenol biru, Tris-HCl, EDTA), bufer fosfat (Na2HPO4 dan NaH2PO4),

ampisilin (100 mg/mL), alkalin fosfatase, CaCl2 0,1 M, NaOH, KI/I2, d-

cycloserine, IPTG (Isopropiltiogalaktosida), X-Gal, T4 DNA Ligase, DNA λ,

GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder, Taq polimerase, Taq bufer, dNTP, primer 16S

rRNA (BactF1 dan UniB), Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega),

QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen), GFXTM PCR DNA and Gel Band

Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech). Enzim restriksi yang digunakan

adalah HindIII dan EcoRI.

III.3 Metode

III.3.1 Peremajaan kultur dan pertumbuhan bakteri laut galur lokal SFNB3

Peremajaan kultur bakteri dilakukan dengan menumbuhkan kultur pada media

padat marine yang terdiri dari 0,05% ekstrak ragi, 0,25% pepton, 2% bakto agar

dan air laut, dengan menggunakan ose secara aseptik. Media padat yang telah

diinokulasi bakteri laut galur lokal SFNB3 kemudian diinkubasi pada suhu 30°C

selama dua hari, dan selanjutnya disimpan pada suhu 4°C. Hasil pertumbuhan

bakteri ini dapat digunakan untuk memperoleh DNA kromosom.

III.3.2 Isolasi DNA kromosom bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan

metode Wizard® Genomic DNA Purification Kit

Isolasi DNA kromosom dilakukan dengan menggunakan metode Wizard®

Genomic DNA Purification Kit. Koloni tunggal bakteri laut galur lokal SFNB3

diinokulasi ke dalam 5 mL media marine cair dan diinkubasi pada suhu 30°C

selama 16-18 jam dengan kecepatan 150 rpm. Kemudian kultur sel dituangkan ke

dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 12500

24

x g selama dua menit. Supernatan dibuang dan pelet sel diresuspensi dengan 600

µL Nuclei Lysis Solution, kemudian diinkubasi pada suhu 80°C selama lima

menit. Campuran didinginkan pada suhu ruang, lalu ditambah 3 µL RNase

solution untuk mendegradasi RNA, dan dihomogenkan dengan membolak-balikan

(inversi) tabung. Campuran diinkubasi kembali pada suhu 37°C selama 30 menit,

lalu didinginkan pada suhu ruang, dan ditambahkan 200 µL Protein Precipitation

Solution. Untuk menghomogenkan campuran, digunakan vortex dengan kecepatan

tinggi selama 20 detik. Kemudian dilakukan inkubasi di dalam es selama lima

menit dan campuran disentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g selama tiga menit.

Pelet sel dibuang dan supernatan dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga

1,5 mL baru yang berisi 600 µL isopropanol, campuran dihomogenkan dengan

membolak-balikan tabung, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g

selama dua menit. Supernatan dibuang dan pelet DNA ditambah dengan 600 µL

etanol 70% untuk pencucian. Sentrifugasi dilakukan untuk mendapatkan DNA,

dengan kecepatan 12500 x g selama dua menit. DNA yang telah diperoleh

dikeringkan pada suhu ruang selama 15 menit, kemudian ditambahkan 100 µL

DNA Rehydration Solution untuk mengelusi DNA dan diinkubasi pada suhu 65°C

selama satu jam.

III.3.3 Identifikasi bakteri laut galur lokal SFNB3 dengan sekuensing gen

16S rRNA

Untuk mengidentifikasi spesies bakteri laut galur lokal SFNB3 yang digunakan

dalam penelitian, dilakukan amplifikasi gen 16S rRNA bakteri laut galur lokal

SFNB3 dengan proses PCR. Kondisi reaksi PCR untuk 16S rRNA adalah

denaturasi awal dengan suhu 94°C selama dua menit, siklus amplifikasi sebanyak

30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 94°C selama satu menit;

annealing pada suhu 48°C selama satu menit; dan elongation pada suhu 72°C

selama 1 menit, Post-elongation pada suhu 72°C selama 10 menit, dan

penyimpanan hasil PCR dilakukan pada suhu 4°C untuk mempertahankan agar

sampel PCR tetap dingin sebelum dilanjutkan ke tahap berikutnya. Campuran

25

reaksi PCR terdiri atas DNA kromosom bakteri laut galur lokal SFNB3 sebagai

templat, dNTP, enzim Taq Polimerase, bufer enzim Taq polimerase, ddH2O,

primer UniB1 dan BactF1. Primer yang digunakan untuk 16S rRNA yaitu UniB1

(reverse primer): 5’-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3’ dan BactF1 (forward

primer): 5’-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3’.

III.3.4 Pemotongan DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 secara parsial dengan

enzim restriksi EcoRI

DNA kromosom Vibrio sp. SFNB3 yang telah diisolasi, dipotong secara parsial

dengan enzim restriksi EcoRI untuk memperoleh fragmen DNA dengan ukuran

tertentu. Pemotongan DNA kromosom secara parsial dilakukan dengan beberapa

tahapan, yaitu pemotongan DNA kromosom dengan variasi aktivitas unit enzim

restriksi, variasi waktu inkubasi, dan perbandingan waktu inkubasi. Untuk variasi

aktivitas unit enzim restriksi digunakan 1,525 µg DNA kromosom yang dipotong

masing-masing dengan 2,5 U, 5 U, dan 10 U enzim restriksi EcoRI dalam volume

total campuran 20 µL dan diinkubasi pada 37°C, selama satu malam. Untuk

variasi waktu inkubasi digunakan 1,525 µg DNA kromosom yang dipotong

dengan 2,5 U enzim restriksi EcoRI dalam volume total campuran 20 µL.

Campuran diinkubasi dengan waktu yang berbeda, yaitu selama 1 jam, 2 jam, 3

jam, 4 jam, 5 jam, dan 6 jam pada 37°C. Untuk perbandingan waktu inkubasi

digunakan 3,05 µg dan 4,026 µg DNA kromosom yang dipotong dengan 5 U

enzim restriksi EcoRI, secara berturut-turut diinkubasi selama 3 jam dan satu

malam, dalam volume total campuran 25 µL dan 20 µL.

Untuk pemotongan fragmen DNA dengan ukuran tertentu digunakan 6,1 µg DNA

kromosom yang dipotong dengan 10 U enzim restriksi EcoR1 dalam volume total

campuran 50 µL. Campuran kemudian diinkubasi pada 37°C selama 3 jam.

Hasil pemotongan DNA kromosom secara parsial dengan enzim restriksi EcoRI

dianalisis dengan gel agarosa 1% b/v, dengan tegangan 80 V selama 45 menit,

kemudian divisualisasi dengan sinar UV dekat.

26

III.3.5 Pemurnian DNA dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification

Kit

Fragmen DNA dengan ukuran sekitar 4,5-6 kb dipotong dengan pisau steril,

kemudian ditimbang. Potongan fragmen DNA pada gel agarosa kemudian

diekstraksi dan dimurnikan dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification

Kit.

Setiap 10 mg gel ditambah dengan 10 µL bufer 1 (capture buffer) untuk

mendenaturasi protein dan melarutkan gel, kemudian diinkubasi pada 60°C

sampai gel larut. Campuran kemudian ditransfer ke dalam kolom GFX lalu

diinkubasi pada suhu ruang selama satu menit dan disentrifugasi selama satu

menit dengan kecepatan 12500 x g.

DNA yang terdapat pada kolom GFX dicuci dengan menggunakan 500 µL bufer 2

(wash buffer) dan dikeringkan melalui sentrifugasi selama 1 menit dengan

kecepatan 12500 x g. Kolom GFX yang terdapat DNA di dalamnya, dipindahkan

pada tabung mikrosentrifuga 1,5 mL yang baru, kemudian ditambah 50 µL ddH2O

untuk mengelusi DNA dan diinkubasi pada suhu ruang selama satu menit. Untuk

mendapatkan larutan DNA murni, dilakukan sentrifugasi selama satu menit

dengan kecepatan 12500 x g. Selanjutnya DNA hasil pemurnian dianalisis melalui

elektroforesis gel agarosa 1% pada tegangan 80 Volt.

III.3.6 Elektroforesis gel agarosa

DNA yang akan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa dicampur dengan

loading buffer (6x larutan stok, 400 g/L sukrosa, 2,5 g/L bromfenol biru dalam 0,6

mL larutan 10 mM Tris-HCl pH 8 dan 1 mM EDTA). Elektroforesis dilakukan

menggunakan TAE 1x (Tris asetat 40 mM, EDTA 1 mM) sebagai running buffer,

dengan tegangan 80 Volt. Penanda yang digunakan adalah DNA λ yang dipotong

dengan enzim restriksi HindIII. Pita DNA diamati menggunakan sinar UV dengan

panjang gelombang 302 nm, selanjutnya gel didokumentasikan dengan kamera

digital.

27

III.3.7 Isolasi DNA plasmid pUC19 dengan metode QIAprep Spin Miniprep

Kit

Kultur sel transforman dipindahkan ke dalam tabung mikrosentrifuga 1,5 mL dan

disentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit. Supernatan dibuang

dan pelet sel diresuspensi dengan 250 µL bufer P1, kemudian ditambahkan 250

µL bufer P2 dan dihomogenkan dengan membolak-balik tabung sebanyak empat

sampai enam kali. Bufer N3 sebanyak 350 µL ditambahkan ke dalam campuran

dan dihomogenkan kembali dengan membolak-balik tabung, lalu dilakukan

sentrifugasi dengan kecepatan 12500 x g selama 10 menit.

Pelet sel yang berwarna putih dibuang dan supernatan dipindahkan ke dalam

kolom QIAprep dengan dekantasi atau dipipet lalu disentrifugasi dengan

kecepatan 12500 x g selama satu menit. Supernatan dibuang dan pelet sel

ditambahkan 0,5 mL bufer PB untuk pencucian kolom kemudian disentrifugasi

dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit. Supernatan dibuang dan pelet

DNA dalam kolom dicuci kembali dengan 0,75 mL bufer PE lalu disentrifugasi

dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit. Untuk menghilangkan sisa bufer,

dilakukan sentrifugasi kembali dengan kecepatan 12500 x g selama satu menit.

Kolom QIAprep Spin Miniprep Kit yang berisi DNA plasmid pUC19 ditempatkan

pada tabung mikrosentrifuga 1,5 mL kemudian ditambahkan 50 µL air steril

(ddH2O steril), didiamkan selama satu menit, dan disentrifugasi dengan kecepatan

12500 x g selama satu menit untuk memperoleh larutan DNA plasmid.

Larutan DNA plasmid pUC19 dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 1%

pada tegangan 80 Volt.

III.3.8 Pemotongan DNA plasmid pUC19 dengan enzim restriksi EcoRI dan

defosforilasi

DNA plasmid pUC19 hasil isolasi QIAprep Spin Miniprep Kit sebanyak 0,1 µg,

dipotong dengan enzim restriksi EcoRI, dengan aktivitas 5 unit pada suhu 37°C

28

selama enam jam. Hasil pemotongan dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa

1% pada tegangan 80 V.

Defosforilasi dilakukan terhadap DNA plasmid pUC19 yang telah dipotong oleh

EcoRI dengan 1 U enzim alkalin fosfatase. Campuran DNA plasmid pUC19 dan

alkalin fosfatase ditambah bufer enzim alkaline fosfatase 1/10 kali volume dan

dihomogenkan lalu diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit. Enzim

diinaktifkan dengan cara inkubasi pada 65°C selama 10 menit.

Untuk memurnikan DNA plasmid linier yang telah didefosforilasi maka dilakukan

proses pemurnian dengan GFXTM PCR DNA and Gel Band Purification Kit

seperti pada pemurnian fragmen DNA Sub Bab III.3.5.

DNA plasmid pUC19 hasil pemurnian kemudian dianalisis dengan elektroforesis

gel agarosa 1% pada tegangan 80 volt.

III.3.9 Ligasi

Ligasi dilakukan dalam volume total campuran 20 µL. Campuran untuk reaksi

ligasi mengandung 1 U T4 DNA ligase, 2 µL bufer 10x T4 DNA ligase, 50 ng

DNA plasmid pUC19, dan 111,111 ng fragmen DNA dengan ukuran ~ 4,5-6 kb.

Campuran dihomogenkan kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama 16-18 jam

untuk memperoleh hasil yang optimum.

III.3.10 Pembuatan sel E. coli Top10F’ kompeten

Pembuatan sel E. coli Top10F’ kompeten dilakukan menurut metode Cohen

(Sambrook et al., 1989). Koloni tunggal E. coli Top10F’ ditumbuhkan dalam 5

mL media Luria Bertani cair yang ditambah dengan 5 mg tetrasiklin pada suhu

37°C, dengan pengocokan 150 rpm selama 16-18 jam. Kultur sel sebanyak 200

μL diinokulasi ke dalam 20 mL media Luria Bertani cair yang telah ditambahkan

dengan 45 mg/mL tetrasiklin, dan diinkubasi pada 37°C dengan pengocokan 150

29

rpm hingga diperoleh OD600 ≈ 0,4 (± 3 jam). Selanjutnya kultur sel diinkubasi di

dalam es selama 20 menit, setelah itu dipindahkan ke dalam tabung sentrifuga 50

mL dan disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 10

menit. Supernatan dibuang dan pelet sel dicuci dengan 5 mL larutan CaCl2 0,1 M

segar, lalu diinkubasi kembali di dalam es selama 5 menit dan disentrifugasi

dengan kecepatan 4000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit. Supernatan dibuang

dan pelet diresuspensi dengan 300 μL larutan CaCl2 0,1 M segar, kemudian

dipindahkan ke dalam tabung mikrosentirfuga 1,5 mL, masing-masing 100 µL.

Sel kompeten didinginkan dalam es dan kemudian disimpan pada suhu 4°C.

III.3.11 Transformasi E. coli Top10F’ dengan DNA plasmid rekombinan

Transformasi E. coli Top10F’ dengan DNA plasmid rekombinan dilakukan

menurut metode Cohen (Sambrook et al., 1989). DNA plasmid rekombinan

sebanyak 2,5 µL ditambahkan ke dalam 100 μL sel E. coli Top10F’ kompeten

dan dibiarkan di dalam es selama 30 menit. Selanjutnya dilakukan heat shock

pada 42°C selama 90 detik dan diinkubasi di dalam es selama 2 menit. Campuran

ditambahkan 900 μL media LB cair, kemudian ditumbuhkan dengan pengocokan

150 rpm pada suhu 37°C selama 3 jam.

Kultur sel hasil transformasi sebanyak 250 µL ditumbuhkan kembali pada media

padat LB yang mengandung ampisilin (100 mg/mL), 0,5 mM IPTG dan 80

μg/mL X-Gal untuk mengisolasi DNA plasmid rekombinan, dengan cara

disebarkan menggunakan batang L dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 16-18

jam.

Koloni putih yang tumbuh diremajakan kembali pada media padat LBA dan

media padat LBA ditambah 1% pati. Selanjutnya dilakukan penapisan seperti

yang akan dijelaskan pada Sub Bab III.3.12. Transforman yang diduga

mengandung gen α-amilase ditumbuhkan pada 5 mL LB cair yang mengandung

ampisilin (100 mg/mL) dan diinkubasi kembali pada suhu 37°C dengan

30

pengocokan 150 rpm selama 16-18 jam, kemudian dilakukan isolasi DNA

plasmid rekombinan dengan metode QIAprep Spin Miniprep Kit.

III.3.12 Penapisan (Screening)

Bakteri laut galur lokal Vibrio sp. SFNB3 ditumbuhkan pada media padat marine

yang terdiri dari 0,05% ekstrak ragi, 0,25% pepton, 2% bakto agar, air laut, dan

1% pati secara aseptik lalu diinkubasi pada suhu 30°C selama dua hari.

Selanjutnya penapisan (screening) dilakukan dengan penambahan larutan 0,5%

KI/0,15% I2 ke atas permukaan media padat marine yang telah ditumbuhi bakteri

tersebut. Terbentuknya daerah bening (halo zone) mengindikasikan adanya

aktivitas α-amilase yang dapat menghidrolisis pati sehingga kompleks antara pati

dan iodin tidak terbentuk. Jika tidak ada aktivitas α-amilase akan terdapat daerah

gelap karena pati membentuk komplek dengan iodin.

Untuk penapisan sel transforman, diperlukan D-sikloserin sebelum diberi

penambahan 0,5% KI/0,15% I2. Transforman ditumbuhkan pada media luria

bertani yang terdiri dari 1% bakto tripton, 1% NaCl, 0,5% ekstrak ragi, 2% bakto

agar, dan 1% pati serta penambahan ampisilin (100mg/mL) secara aseptik, lalu

diinkubasi pada suhu 37°C selama satu malam. Sebanyak 3 mg/5 mL D-sikloserin

dituangkan ke atas permukaan tumbuhnya transforman, kemudian diinkubasi pada

37°C selama 5 jam (Cha et al., 1993). D-sikloserin akan menghambat biosintesis

dinding sel E. coli sehingga α-amilase dapat disekresikan dan pati dapat

dihidrolisis. Selanjutnya dilakukan penambahan 0,5% KI/0,15% I2.

III.3.13 Isolasi plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase dengan

metode QIAprep Spin Miniprep Kit

Koloni putih dari hasil transformasi yang diduga membawa gen α-amilase

ditumbuhkan pada 5 mL media cair LB yang mengandung ampisilin (100 mg/mL)

pada suhu 37°C dengan pengocokan 150 rpm selama 16-18 jam. Kemudian

31

dilakukan isolasi DNA plasmid rekombinan dengan metode QIAprep Spin

Miniprep Kit seperti yang telah dijelaskan sebelumnya pada Sub Bab III.3.7.

III.3.14 Pemotongan plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase

dengan enzim restriksi EcoRI

DNA plasmid rekombinan yang membawa gen α-amilase hasil isolasi QIAprep

Spin Miniprep Kit sebanyak 250 ng dipotong dengan 5U enzim restriksi EcoRI

dalam volum total campuran 20 μL. Selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu

37°C selama 16-18 jam. Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan

enzim restriksi kemudian dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa 0,8% (b/v)

untuk mengetahui ukuran fragmen DNA sisipan.

III.3.15 Analisis urutan nukleotida

Urutan nukleotida fragmen DNA sisipan ditentukan dengan metode dideoxy

Sanger menggunakan dye terminator (Macrogen, Korea). Untuk menentukan

urutan nukleotida hasil amplifikasi gen 16S rRNA digunakan primer untuk 16s

rRNA yaitu UniB1 (reverse primer): 5’-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3’

dan BactF1 (forward primer): 5’-AGAGTTTGATC(A/C)TGGCTCAG-3’.

Untuk menentukan urutan nukleotida fragmen DNA sisipan digunakan primer

universal pUC19, yaitu M13F-pUC (forward primer:

5’(GTAAAACGACGGCCAGT)3’), dan M13R-pUC (reverse primer:

5’(AACAGCTATGACCATG)3’). Analisis kesamaan urutan nukleotida

dilakukan dengan menggunakan metode blastn yang berasal dari program BLAST

pada situs NCBI. Selanjutnya dapat dilakukan penjajaran dengan menggunakan

program Clustal-X dan GeneDoc.