1 TP3. Mesure de la constante de dissociation du comp lexe MgATP

Les phosphotranférases (kinases) utilisent comme substrats non pas les nucléotides libres, mais leurs complexes avec des ions divalents, le plus souvent Mg2+ ou Ca2+. La formule ci-dessous montre schématiquement la formule du complexe. Ce schéma ne tient pas compte de la délocalisation des électrons (entre les deux atomes d’oxygène des phosphates αααα et ββββ et les trois atomes d’oxygène du phosphate γγγγ). En plus, le pKa du phosphate γγγγ est environ 7.0, donc le nombre de charges est dépendant du pH.

P

O

O

O

P

O

O

O

NN

NNH

NH2

OH

CH2O

O P

O

O

O

OH

γβα

-

---

Mg2+

La formation du complexe n’entraîne aucun changement dans le spectre UV de l’ATP. La mesure du Kd ne peut être pas faite directement. On utilise une méthode indirecte, par compétition avec la 8-hydroxyquinoline (abréviation 8HQ). La 8HQ fixe le Mg2+. Le complexe a un spectre très différent par rapport à la 8-HQ, ce qui permet de mesurer facilement le Kd du complexe Mg2+-8HQ.

N

OHMg

2+

N

O

+ H+ Mg2+

Si la formation du complexe Mg2+-8HQ a lieu en présence d’ATP, il y aura compétition entre la 8HQ et l’ATP pour les ions de Mg2+. On va mesurer un Kd apparent plus grand car une partie de Mg2+ est fixé à l’ATP. En connaissant la concentration des différents réactifs et les propriétés spectroscopiques du 8HQ et du complexe Mg2+8HQ, on pourra calculer le Kd qui nous intéresse, celui du complexe Mg-ATP.

Les mesures seront faites à pH 8.0. A ce pH le phosphate γγγγ de l’ATP n’est pas protoné. On utilise 10 mM tampon Tris-HCl. HEPES Pour éviter des effets dues à la variation de la force ionique on ajoute du NaCl à la concentration finale de 0.4 M.

Solutions (qui ont été préparées en avance)

30 mM 8HQ en éthanol 95% (coefficient d’extinction mM est 2.6 mM-1cm-1 à 300 nm)

200 mM ATP (coefficient d’extinction mM est de 15.4 mM-

1cm-1 à 259 nm), pH 8.0

1 M MgSO4

50 mM MgSO 4

50 mM tampon HEPES-NaOH (pH 8.0)

Instruments

Spectrophotomètre Pipettes automatiques (Pipetman P1000, P200, P20 ou P10) cuves en quartz

2 Etape 1. Propriétés spectroscopiques de la 8HQ et d u complexe Mg8HQ.

Réglage du spectrophotomètre, option enregistrer les spectres sur la même page. Spectre dans la gamme 280-440 nm. On fait la ligne de base avec le tampon. On enregistre le spectre d’absorption UV-VIS d’une solution 0.3 mM de 8HQ. A cette solution de 8HQ on rajoute 5 µl de 1 M MgSO4 . On observe le changement de spectre (diminution de la bande ayant un maximum à 300 mm et apparition d’une bande d’absorption avec un maximum à 360 nm du complexe Mg8HQ. On rajoute dans au mélange 10 µl MgSO4 1 M et on enregistre le spectre, ensuite avec 20µl MgSO4 1M supplémentaires.

Imprimer les spectres. Notez la présence d’un point isobestique. Quelle est la signification de sa présence ? Les mesures d’absorbance à 370 nm reflètent la présence du complexe Mg8HQ. Pour pouvoir calculer sa concentration on a besoin de son coefficient extinction. On va déterminer ce paramètre dans la section suivante.

Etape 2. Détermination du coefficient d’extinction millimolaire du complexe Mg8HQ et du K D du complexe Mg8HQ.

En principe, si on rajoute une concentration infinie de Mg2+, toute le 8HQ sera complexée. On connaissant la concentration de 8HQ et

l’absorbance A on pourrait calculer le εmM du complexe. Comme une concentration infinie n’existe pas, il faudra mesurer l’absorbance à différentes concentrations de Mg2+ et faire une extrapolation.

On considère l’équilibre (DANS L’HYPOTHESE D’UNE FIXATION 1:1):

8HQ + Mg2+ � Mg2+8HQ (Eq_1)

La constante de dissociation sera

[8HQ] * [Mg2+] KD = -------------------- (Eq_2) [Mg2+8HQ]

On a les lois de conservation :

[Mg2+]tot = [Mg2+] + [Mg2+8HQ] (Eq_3) [8HQ]tot = [8HQ] + [Mg2+8HQ] (Eq_4) on est dans la situation [8HQ]tot << [Mg2+]tot (Eq_5)

on peut donc faire l’approximation

[Mg2+]tot = [Mg2+]libre (Eq_6)

Si on écrit [X], on sous-entends que c’est la concentration molaire

LIBRE, non complexée de la molécule X.

On ré-écrit l’Eq_4

[8HQ] = [8HQ]tot - [Mg2+8HQ] (Eq_7)

Eq_7 dans Eq_2 ; on tient compte de l’Eq_6

([8HQ]tot - [Mg2+8HQ]) * [Mg2+]tot KD = --------------------------------------------- (Eq_8) [Mg2+8HQ]

Avec un peu d’algèbre élémentaire on arrive à :

[8HQ]tot * [Mg2+]tot [Mg2+8HQ] = ------------------------------- (Eq_9) KD + [Mg2+]tot

La loi de Beer-Lambert

A370nm = εMg8HQ * [Mg2+8HQ]* l ; l=1 cm Eq_10

3

On multiplie l’Eq_9 par εMg2+8HQ et on tient compte de l’Eq_10

A370nm,max * [Mg2+]tot

A370nm = ------------------------------- (Eq_11) KD + [Mg2+]tot Si on mesure A370nm à une concentration fixe de 8HQ, l’Eq_11 nous permet de calculer A370nm,max qui correspond à la concentration fixe

de 8HQ. En appliquant l’Eq_10 on obtient εMg8HQ

Mode de travail

On pipette 1.0 ml de tampon HEPES dans une cuve en quartz. On rajoute 10 µl de 8HQ 30 mM et on fait le blanc du spectrophotomètre à 370 nm. On rajoute lla solution de MgSO4 comme indiquée dans le tableau. ATTENTION, les volumes indiquées sont cumulés (vous rajoutez 10 µL à la fois). Mélangez avec une spatule en plastique et mezurez l’absorbance à 370 nm. Cette procédure s’appelle titration spectrophotométrique.

µl solution MgSO4 50 mM

µl solution MgSO4

1 M

Volume final Concentration

Mg2+ Absorbance Absorbance corrigée

0 0

10 0

20 0

30 0

40 0

50 0

60 0

60 +10

60 +20

Les cases grises seront remplies après les calculs à l’aide du logiciel Kaleidagraph. On rentre ces valeurs dans un tableau Kaleidagraph et on utilise le calcul sur colonne avec « formula entry » dans le menu Windows .

La première colonne « µL » indique le volume total de solution de MgSO4. Le volume final de solution sera 1000 + 10 µl 8HQ + volume MgSO4. La concentration finale de Mg2+ sera calculée : µl * [MgSO4]/(volume final). Il faut faire une correction de l’absorbance lue, car le volume final a augmenté à cause du MgSO4 rajouté. Acorr=A*(volume final)/1010. On fait ensuite le graphique de A370corr en fonction de la conc de MgSO4 (nuage de points). Les paramètres seront déterminés avec l’équation d’une hyperbole (Eq_11)

.

m1 représente A370,max , m2 représente le KD et m0 et la concentration

en Mg2+.

4

Dans cet exemple, A370,max est 0.59 et correspond à une concentration de 0.3 mM 8HQ.

εMg8HQ = 0.59/0.3 = 1.96 mM-1cm-1.

NB: c’est un exemple, vos valeurs peuvent être diff érentes

Etape 3. Détermination de KD du complexe MgATP.

Si on fait la titration de la 8HQ avec du Mg2+ en présence d’ATP, on aura les deux équilibres :

8HQ + Mg2+ � Mg2+8HQ (Eq_1)

et

ATP + Mg2+ � Mg2+ATP (Eq_11)

Les deux constantes de dissociation seront :

[8HQ] * [Mg2+] libre KD = ------------------------- (Eq_2) [Mg2+8HQ]

[ATP] * [Mg2+] libre KA = ------------------- (Eq_12) [Mg2+ATP]

Les deux équilibres ne sont pas indépendants , car la concentration d’ions Mg2+ libre est la même. Pour déterminer la constante de dissociation du complexe MgATP KA à partir des données de titration de la 8HQ avec Mg2+ en présence d’ATP on va adopter une approche intuitive, plutôt qu’utiliser des équations assez complexes. Le raisonnement est le suivant. La concentration totale en ions Mg2+ est :

[Mg2+]tot = [Mg2+] libre + [Mg2+8HQ] + [Mg2+ATP] (Eq_13)

La concentration du complexe Mg2+8HQ est négligeable car [8HQ]tot << [Mg2+]tot, mais la concentration de Mg2+ATP ne l’est pas. On utilise donc l’approximation:

[Mg2+]tot = [Mg2+] libre + [Mg2+ATP] (Eq_14)

D’autre part, si on connaît l’absorbance à 370 nm et le εMg8HQ, on peut calculer la concentration du [Mg8HQ] :

[Mg8HQ] = A370/εMg8HQ

Comment calculer [Mg2+] libre et [Mg2+ATP] ? On va noter que l’Eq_11 sera (en tenant compte que [Mg2+]tot n’est plus égal à [Mg2+]libre :

5

0.3 * [Mg2+]libre [Mg8HQ] = ------------------------------- (Eq_15) KD + [Mg2+]libre

(0.3 est la concentration totale en 8HQ)

On obtient la concentration [Mg2+]libre en réarrangeant l’Eq_15

KD * [Mg8HQ] [Mg2+]libre = ---------------------- (Eq_16) 0.3 - [Mg8HQ]

On a déterminé à l’Etape 2 εMg8HQ et le KD. En conséquent, si on connaît A370nm on peut calculer [Mg2+]libre . D’autre part, on connaît [Mg2+]tot (la concentration de MgSO4 qu’on a rajouté), on peut facilement calculer [Mg2+ATP] à partir de l’Eq_14.

On fait le graphique de [Mg2+ATP] on fonction de [Mg2+]libre. La régression non-linéaire selon une hyperbole nous permet de calculer KA et la concentration de [Mg2+ATP] à une concentration « infinie » en [Mg2+]libre. Si on divise cette dernière valeur par la concentration en ATP, on va trouver le nombre de ions de Mg2+ fixés par une molécule d’ATP.

Mode de travail

On pipette 950 µl de tampon HEPES dans une cuve en quartz. On rajoute 10 µl de 8HQ 30 mM et 20 µl ATP 200 mM et on fait le blanc du spectrophotomètre à 370 nm. On rajoute des aliquotes de solution de MgSO4 50 mM comme indiquée et on note l’absorbance dans le tableau ce-dessous. Ni l’ATP, ni le complexe MgATP n’absorbent à 370 nm.

On fait les calculs à l’aide du logiciel Kaleidagraph. Dernière étape, on fait le graphique de [Mg2+ATP] en fonction de la [Mg2+]libre et on calcule KA par régression non linéaire.

NOTES 1.Les mesures seront effectuées 2 fois. Le résultat final du KD et KA seront les moyennes ± la demi-différence des valeurs obtenues (non pas d’écart type si on fait 2 mesures) 2. Le tampon HEPES est utilisé ici car il ne fixe pas les cations.

6 3. Cette méthode peut être utilisée pour mesurer la Kd d’autres complexes avec le Mg2+, comme celui du citrate ou de l’EDTA. 4. Utiliser toujours des sous-multiples plutôt que les puissances de 10 (c’est l’ habitude universelle des biochimistes). Par exemple, on exprime toujours la concentration 0,1 mM et non pas 10-4 M ! 5. Les résultats seront exprimés avec 3 chiffres significatifs (101 à 300) ou 2 chiffres significatifs (300 à 999), car les erreurs des mesures ne sont jamais inférieures à 3%. Par exemple, 1/13=0,077 et non pas 0,076923 comme cela est affiché par la calculette ou par l’ordinateur. COMMENT FAIRE DES CALCULS SUR COLONNE AVEC KALEIDAGRAPH Vous avez la tableau suivant (étape 2). Pour calculer la concentration en ions Mg2+ il faut multiplier le volume par la concentration et diviser par le volume final (µL50mM*50 + µL_1M*1000)/(1010 + µL50mM+µL_1M)

Keleidagraph permet de faire ce type de calcul par colonne. Allez dans le menu WINDOWS et choisissez Formula entry .

C2 représente la colonne cible (où seront placés les résultats), c0 le contenu de la colonne « µL50mM » et c1 le contenu de la colonne « µL_1M ». Cliquez « run » Le tableau après ces opérations sera :

Utilisez ce type de calcul, c’est comode et rapide, mais vérifiez que vous avez rentré la bonne formule.