GABRIEL EDGARDO REMONDETTO PROPRIÉTÉS DE RÉTENTION ET DE LIBÉRATION

DE MICRONUTRIMENTS PAR DES RÉSEAUX PROTÉIQUES:

ÉTUDE DU SYSTÈME GÉLIFIÉ β-LACTOGLOBULINE/FER

Thèse

présentée

à la Faculté des études supérieures

de l'Université Laval

pour l’obtention de Philosophiae Doctor (Ph.D.)

Département des Sciences des Aliments et de Nutrition

FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION

UNIVERSITÉ LAVAL

QUÉBEC

MAI, 2003 © Gabriel Edgardo Remondetto, 2003

ii

Résumé court

Ces travaux de recherche visent à comprendre le mécanisme de formation de gels

protéiques en présence de fer en vue de les utiliser comme systèmes dans le développement

de nouveaux aliments fonctionnels. Les résultats obtenus montrent qu’il est possible de

former des gels à froid de β-lactoglobuline en présence de fer. En fonction des conditions

utilisées, deux types de gels ont été identifiés et caractérisés : d’une part, des gels

filamenteux sont obtenus à faibles concentrations en fer et essentiellement maintenus par

des interactions hydrophobes et d’autre part, des gels particulaires inhomogènes sont

obtenus à fortes concentrations en fer et maintenus par des interactions de type van der

Waals. Des études in vitro ont montré que les gels filamenteux permettaient de libérer le fer

au niveau de la barrière intestinale et favorisaient son absorption. Ces gels constituent donc

de très bons véhicules pour transporter le fer et optimiser sa biodisponibilité.

Gabriel Edgardo Remondetto Muriel Subirade, Ph.D.

Étudiant gradué Directrice

iii

Résumé long

Le manque en micronutriments et spécifiquement en fer, constitue encore aujourd’hui un

des principaux problèmes nutritionnels rencontrés dans le monde. Parmi les différentes

stratégies adoptées pour pallier ce problème de santé publique, le développement

d’aliments enrichis en fer constitue une des avenues les plus intéressantes. Cependant,

malgré tous les efforts déployés dans ce secteur, les résultats escomptés sont loin d’être

concluants en raison notamment de la sensibilité du fer aux conditions de préparation des

aliments - oxydation, pH, présence d’autres nutriments, etc.- qui modifient sa

biodisponibilité. L’objectif général de ce projet d’études doctorales vise à comprendre le

mécanisme de formation de gels protéiques en présence de fer en vue de les utiliser comme

systèmes de transport du fer et d’optimiser sa biodisponibilité dans le développement de

nouveaux aliments fonctionnels.

Dans un premier temps, nous avons étudié la formation de gels à froid de β-lactoglobuline

en présence de fer ionique (Fe2+). L’impact de différents paramètres –concentration en Fe2+,

concentration en protéine et pH- sur la formation des gels a été étudié en relation avec les

propriétés macroscopiques et microscopiques des gels obtenus. Les travaux obtenus

montrent que le comportement élastique des gels et la force à la rupture augmentent avec la

concentration en protéine et diminuent quand la concentration en Fe2+ augmente. La

capacité de rétention d’eau est élevée pour de faibles concentrations en Fe2+. L’étude

microscopique des gels formés révèle la formation de deux types de gels : des gels

filamenteux, ordonnés pour de faibles rapports Fe2+/protéine et des gels particulaires non-

homogènes pour des rapports Fe2+/protéine élevés. Dans un deuxième temps, des études à

l’échelle moléculaire, par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier, et à l’ échelle

iv supramoléculaire, par rhéologie, ont permis d’identifier les différentes interactions mises en

jeu lors de la formation de ces deux types de gels. La formation des gels particulaires

obtenus à fortes concentrations en Fe2+ (30mM) est essentiellement contrôlée par des

interactions de type van der Waals, alors que les gels filamenteux obtenus à faibles

concentrations en Fe2+ (10 mM) sont maintenus par des interactions hydrophobes. Enfin

dans un dernier temps, l’impact de la miscrostructure des gels sur la libération du fer a été

étudié in vitro dans différentes conditions incluant les conditions du tractus digestif.

L’ensemble de ces travaux a montré que les gels filamenteux permettaient de libérer le fer

au niveau de la barrière intestinale et favorisaient son absorption.

L’ensemble de ces travaux permet de conclure que les gels filamenteux constituent de très

bons véhicules pour transporter le fer et optimiser sa biodisponibilité.

Gabriel Edgardo Remondetto Muriel Subirade, Ph.D.

Étudiant gradué Directrice

v

Avant-Propos

Cette thèse de doctorat a été réalisée au Département des Sciences des Aliments et de

nutrition de l’Université Laval sous la direction de la professeure Madame Muriel Subirade.

Ce travail est divisé en cinq parties principales. La première section, rédigée en français, est

constituée de l’introduction générale, de la revue de littérature, de l’hypothèse et des

objectifs de l’étude. Elle vise à apporter les éléments essentiels pour la bonne

compréhension de la problématique de doctorat. Les trois sections subséquentes sont

constituées d’articles scientifiques, rédigés en langue anglaise, qui sont ou seront soumis à

des revues scientifiques.

Le chapitre II, intitulé “Cold gelation of β-lactoglobulin in the presence of iron”, a été

publié dans Journal of Food Science, 67(2) : 586-595. Les auteurs sont : Gabriel E

Remondetto, Paul Paquin et Muriel Subirade. La planification, la mise au point du

protocole et les manipulations ont été faites par Gabriel E Remondetto. L’analyse des

résultats et la rédaction de l’article ont été réalisés par Gabriel E Remondetto avec l’étroite

collaboration, critique et corrections de Muriel Subirade. Ce travail a été révisé par Paul

Paquin.

Le chapitre III, intitulé “Molecular mechanisms of Fe2+-induced β-lactoglobulin cold

gelation”, a été accepté pour publication dans Biopolymers. Les auteurs sont : Gabriel E

Remondetto et Muriel Subirade. La planification, la mise au point du protocole et les

manipulations ont été réalisées par Gabriel E Remondetto. L’analyse des résultats et la

rédaction de l’article ont été effectués par Gabriel E Remondetto avec l’étroite

collaboration, guide, critique et corrections de Muriel Subirade.

vi Le chapitre IV, intitulé “Influence of the microstructure of biodegradable whey protein

hydrogels in controlled iron delivery : an in vitro study”, est en préparation. Les auteurs

sont : Gabriel E Remondetto, Erick Beyssac et Muriel Subirade. La planification a été

réalisée conjointement par les auteurs. Toute la mise au point du protocole de dissolution a

été effectuée par Gabriel E. Remondetto et le docteur Erick Beyssac. Les manipulations,

l’analyse des résultats et la rédaction de l’article ont été réalisés par Gabriel E Remondetto

avec l’étroite collaboration, guide, critique et corrections de Muriel Subirade.

La cinquième partie, rédigée en français, présente les conclusions principales de ce travail

de recherche.

vii

Remerciements

Je souhaite à travers ces quelques lignes exprimer toute ma reconnaissance et ma gratitude

à différentes personnes qui, chacune à leur façon, ont rendu la grande aventure de doctorat

possible.

Cette thèse n’aurait vu le jour sans la confiance, la patience et la générosité de ma directrice

de recherche, Mme Muriel Subirade, professeur au Département des Sciences des Aliments

et de Nutrition, que je veux vivement remercier. La pleine confiance qu’elle m’a accordée,

m’a permis d’élaborer un plan de thèse personnel et propre à mes aspirations. Je voudrais

spécifiquement la remercier pour le temps et la disponibilité dont elle a fait preuve pendant

toutes ces années ainsi que pour avoir cru en mes capacités en me donnant une véritable

liberté d’action et ce, dans d’excellentes conditions logistiques et financières. De plus, les

conseils qu’elle m’a prodigués tout au long de la rédaction, ont toujours été clairs et précis,

me facilitant grandement la tâche et me permettant d’aboutir à la production de cette thèse.

Je remercie aussi le Dr. Paul Paquin, co-directeur de la thèse, qui m’a offert la possibilité de

travailler dans le cadre très stimulant de la Chaire Industrielle du CRSNG sur les propriétés

fonctionnelles des protéines sériques.

Je tiens à exprimer ma profonde gratitude au docteur Paul Angers, professeur au

département des sciences des aliments et de nutrition de l’Université Laval et chercheur au

Centre de recherche en sciences et technologie du lait (STELA), au docteur Michel Britten,

chercheur responsable de la section laitière au Centre de recherche et de développement sur

les aliments (CRDA, Agriculture Canada, St-Hyacinthe), au docteur Mircéa-Alexandru

Mateescu, professeur de biochimie dans le département de chimie-biochimie de

viii l’Université de Québec à Montréal, et au docteur Érick Beyssac, professeur à la faculté de

pharmacie de l’Université d’Auvergne (Clermont-Ferrand, France) et chercheur co-

responsable de l’ERT Cidam (Équipe de Recherche Technologique Conception Ingénierie

et Développement de l’Aliment et du Médicament) qui ont accepté de juger ce travail.

Je tiens à remercier tout particulièrement le Dr Thierry Lefèvre pour les fructueuses

discussions que nous avons eues ainsi que Madame Anne-Françoise Allain pour sa

précieuse collaboration technique et sa grande disponibilité.

Je voudrais également remercier mes amis, le Dr Aurelio Dominguez-Lopez, la Dre Maria

Guadalupe Macedo et Pierre Laflamme, pour leur appui et leur soutien moral. Je ne saurais

oublier mes amis argentins de l’Institut de technologie des aliments, en particulier Ing.

Rolando Gonzalez, et ceux de la Faculté de Biochimie de l’Universidad National del

Littoral qui malgré l’éloignement géographique, sont restés très proches ainsi qu’Eduardo

Marcelo Sobrero pour son inconditionnel soutien.

Je tiens à remercier l’Universidad Nacional del Litoral (projet FOMEC, Argentine), la

Chaire industrielle du Conseil National de la Recherche en Sciences et ingénierie du

Canada (CRSNG) sur les propriétés fonctionnelles des protéines sériques (titulaire : Dr.

Paul Paquin) et ses partenaires financiers (Agropur, CRSNG, Novalait et Parmalat), la

Fondation de l’Université Laval et la Chaire de recherche du Canada sur les protéines, les

bio-systèmes et les aliments fonctionnels (titulaire : Dre Muriel Subirade) pour leur

contribution financière indispensable à la réalisation de ce travail. .

ix

À celles qui m’ont aidé à me mettre

debout, ma mère et ma tante.

À ceux qui m’ont aidé à me maintenir

debout, Lara, Pablo et Marta

x Table des matières Résumé court.......................................................................................................................... ii Résumé long.......................................................................................................................... iii Avant-Propos ......................................................................................................................... v Remerciements..................................................................................................................... vii Table des matières.................................................................................................................. x Liste des tableaux................................................................................................................ xiii Liste des figures .................................................................................................................. xiv Liste des abréviations.......................................................................................................... xvi Chapitre I................................................................................................................................ 1 Problématique de recherche ................................................................................................... 1

1.1 Introduction générale ................................................................................................... 2 1.2. Revue bibliographique ................................................................................................ 5

1.2.1 Le fer ..................................................................................................................... 5 1.2.1.1. Le rôle du fer dans l'organisme ..................................................................... 6 1.2.1.2. Les conséquences des carences et sub-carences en fer sur la santé .............. 8 1.2.1.3. Les besoins en fer.......................................................................................... 8 1.2.1.4. Les sources alimentaires de fer et la biodisponibilité du fer alimentaire...... 9 1.2.1.5. Aliments enrichis en fer .............................................................................. 11 1.2.1.6. Réflexions sur une nouvelle stratégie ......................................................... 13

1.2.2. Hydrogels protéiques ......................................................................................... 16 1.2.2.1. Hydrogels .................................................................................................... 16

1.2.2.1.1. Sensibilité des hydrogels à l’environnement ....................................... 18 1.2.2.1.2. Les hydrogels sensibles aux variations de pH ..................................... 18 1.2.2.1.3. Hydrogels synthétiques vs. naturels..................................................... 19

1.2.2.2. Hydrogels protéiques .................................................................................. 20 1.2.2.3. Protéines du lactosérum .............................................................................. 24 1.2.2.4. La β-lactoglobuline ..................................................................................... 24 1.2.2.5. Mécanismes d’induction de la gélification de la β-lactoglobuline ............. 30

1.2.2.5.1. Gélification thermique ......................................................................... 30 1.2.2.5.2. Gélification à froid ............................................................................... 33

1.3. Hypothèse et objectifs ............................................................................................... 36 1.3.1. Hypothèse........................................................................................................... 36 1.3.2. Objectifs ............................................................................................................. 37

Chapitre II ............................................................................................................................ 39 Cold gelation of β-lactoglobulin in the presence of iron ..................................................... 39

Abstract ............................................................................................................................ 40 Résumé............................................................................................................................. 41 2.1. Introduction............................................................................................................... 42 2.2. Materials and Methods.............................................................................................. 47

2.2.1. Materials............................................................................................................. 47 2.2.2. Room temperature salt-induced gelation ........................................................... 47 2.2.3. Experimental design........................................................................................... 47 2.2.4. Statistical analysis .............................................................................................. 48 2.2.5. Color measurements........................................................................................... 48 2.2.6. Mechanical assays.............................................................................................. 49

xi

2.2.7. Relaxation test.................................................................................................... 50 2.2.8. Water-holding capacity ...................................................................................... 51 2.2.9. Scanning and transmission electron microscopy ............................................... 51

2.3. Results and discussion .............................................................................................. 53 2.3.1. Statistical analysis .............................................................................................. 53 2.3.2. Light reflectance and color analysis................................................................... 53 2.3.3. Mechanical assays.............................................................................................. 55 2.3.4. Water-holding capacity ...................................................................................... 58 2.3.5. Microstructure analysis ...................................................................................... 58

2.4. Discussion ................................................................................................................. 61 2.5. Conclusion ................................................................................................................ 64

Chapitre III ........................................................................................................................... 79 Molecular mechanisms of Fe2+-induced β-lactoglobulin cold gelation............................... 79

Abstract ............................................................................................................................ 80 3.1. Introduction............................................................................................................... 83 3.2. Experimental ............................................................................................................. 87

3.2.1. Materials............................................................................................................. 87 3.2.2. Methods.............................................................................................................. 87

3.2.2.1. FT-IR spectroscopy..................................................................................... 87 3.2.2.2. Dynamic oscillatory measurements ............................................................ 88

3.3. Results ....................................................................................................................... 90 3.3.1. FT-IR Study ....................................................................................................... 90 3.3.2. Reological study................................................................................................. 93

3.4. Discussion ................................................................................................................. 97 Chapitre IV......................................................................................................................... 109 Influence of the microstructure of biodegradable whey protein hydrogels in controlled iron delivery: an in vitro study .................................................................................................. 109

Abstract .......................................................................................................................... 110 Résumé........................................................................................................................... 111 4.1. Introduction............................................................................................................. 112 4.2. Materials and Methods............................................................................................ 115

4.2.1. Gels preparation ............................................................................................... 115 4.2.2. Dissolution experiments................................................................................... 115 4.2.3. Dissolution data analysis.................................................................................. 117

4.2.3.1. Preliminary data ........................................................................................ 118 4.2.3.2. Release Kinetics ........................................................................................ 118

4.2.4. Simulated iron intracellular absorption on intestinal wall ............................... 119 4.2.4.1. Culture cell preparation............................................................................. 119 4.2.4.2. Iron intracellular absorption...................................................................... 120

4.3. Results and Discussion............................................................................................ 121 4.3.1. Impact of environmental conditions on iron release ........................................ 121

4.3.1.1. pH-sensitive iron delivery ......................................................................... 121 4.3.1.2. Enzymes-sensitive iron delivery ............................................................... 124

4.3.2. Iron delivery in gastro-intestinal conditions .................................................... 127 4.4. Conclusions............................................................................................................. 130

Chapitre V .......................................................................................................................... 138 Conclusion et perspectives................................................................................................. 138

Conclusion générale ....................................................................................................... 139

xii

Perspectives du travail ................................................................................................... 142 BIBLIOGRAPHIE................................................................................................................... 143

Bibliographie :................................................................................................................ 144

xiii Liste des tableaux Table 2.1: Coded and uncoded level combinations for a 3-variable in Box-

Behnken model for β-lactoglobulin gelation. .............................................................. 65 Table 2.2: Results of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress,

ruture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC) for each condition of experimental design......................................................................... 66

Table 2.3: Analysis of variance of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC). .......................................................................................................... 67

Table 2.4: Regression coefficients of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC). .......................................................................................................... 68

xiv Liste des figures Figure 1.1: Position des ponts disulfure dans la β-lactoglobuline ....................................... 25 Figure 1.2: Structure tridimensionnelle de la β-lactoglobuline. .......................................... 27 Figure 1.3: Structure du dimère de la β-lactoglobuline. ...................................................... 28 Figure 1.4: Modèles de mécanisme d’agrégation thermique (Lefèvre & Subirade,

2000) ............................................................................................................................ 33 Figure 2.1: Response surface graph of the light reflectance (L*) (pH 8) ............................ 69 Figure 2.2: Response surface graph of the a* parameter ([Protein]= 7.5 %)....................... 70 Figure 2.3: Response surface graph of the elastic constant (pH 8)...................................... 71 Figure 2.4: Response surface graph of the rupture stress (pH 8) ......................................... 72 Figure 2.5: Response surface graph of the relaxation (pH 8) .............................................. 73 Figure 2.6: Response surface graph of the k2 parameter (pH 8) .......................................... 74 Figure 2.7: Response surface graph of the water-holding capacity (WHC) (pH 8)............. 75Figure 2.8: Transmission electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-

lactoglobulin prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% protein (b); 10 mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d)..................................................................................................................... 76

Figure 2.9: Scanning electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% f protein (b); 10 mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d). ............................................................................................................. 77

Figure 2.10: Transmission (TEM) and scanning (SEM) electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin prepared with a 10 mM iron concentration and a 6% protein concentration at pH 7, TEM (a); pH 7, SEM (b); pH 8, TEM (c); pH 8, SEM (d); pH 9, TEM (e); pH 9, SEM (f). ........................ 78

Figure 3. 1: Deconvoluted spectra of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7: (a) native protein, (b) pre-heated protein (at 80oC, 30 min)....................................................... 101

Figure 3.2: Deconvoluted spectra of cold-gels of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7 (a) with 10 mM FeSO4 concentration; (b) with 30 mM FeSO4 concentration. ............... 102

Figure 3.3: Rheological behavior of cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration in function time: (a) storage modulus G’, (b) loss modulus G”, and (c) the phase angle tanδ. ................................................................ 103

Figure 3.4: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: (a) cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration, (b) cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 30 mM of iron concentration. .................................... 104

Figure 3.5: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg (6% w/v) with 30 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-mercaptethanol, and (d) 1% SDS............................................................ 105

Figure 3.6: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-mercaptethanol, and (d) 1% SDS............................................................ 106

Figure 3.7: Mechanisms of denaturation/aggregation and gelation of cold-gels of β-lg: (a) random-aggregated gels and (b) filamentous gels. ...................................... 107

xv Figure 3.8: Mechanisms of three-dimensional organization of filamentous cold-

gels of β-lactoglobulin. .............................................................................................. 108 Figure 4.1: Scanning electron micrographs of β-lactoglobulin cold gels elaborated

in the presence of: (a) 10 and (b) 30 mM of iron (Remondetto et al., 2002)............. 131 . 131 Figure 4.2: Schematic representation of the device use in the dissolution test. (a)

The paddle apparatus II and extraction cell. (b) Extraction cell system. ................... 132 Figure 4.3: Effect of pH on the iron release (a and c) and matrix degradation (b

and d) from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line) at pH 1.2 (a and b) and pH 7.5 (c and d)........................................................................ 133

Figure 4.4: Effect of enzyme on the iron release (a and c) and matrix degradation (b and d) from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line): pepsin pH 1.2 (a and b) and pancreatin pH 7.5 (c and d).......................................... 134

Figure 4.5: Impact of the GI conditions on the iron release (a) and matrix degradation (b) from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line). .............................................................................................................. 135

Figure 4.6: Iron concentration (mg/L) inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+). ............. 136

Figure 4.7: Ferritin concentration in ng/mL inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+). ............. 137

xvi Liste des abréviations β-lg: β-lactoglobuline

2-Mer: 2-mercaptethanol

Ba 2+: Baryum divalent

Ca 2+: Calcium divalent

Cs+: Caesium monovalent

Cys : Cystéine

Da : Dalton

EDXA: Energy-dispersive X-ray analysis

Fe 2+: Fer divalent

FTIR: Fourier transform-infrared

G’: Module élastique

GRAS: Generally recognized as safe

K+: Potassium monovalent

Li+: Lithium monovalent

Mg 2+: Magnésium divalent

mM: Mili-molaire

Na+: Sodium monovalent

NMWL: Nominal molecular weight limit

Rb+: Rubidium monovalent

SDS: Sodium dodecil sulphate

SEM: Scaning electronic microscopy

SH: Groupe sulfhydryle

TEM: Trasmition electronic microscopy

WHC: Water-holding capacity

Chapitre I

PROBLÉMATIQUE DE RECHERCHE

2

1.1 Introduction générale

Le manque en micronutriments, spécifiquement en fer, constitue encore aujourd’hui un des

principaux problèmes nutritionnels rencontrés dans le monde. D’après l'Organisation

Mondiale de la Santé, il concernerait plus d'un milliard d'individus (WHO, 1994; Thomas

& Frankenberg, 2002). Il touche en premier lieu les populations des pays en voie de

développement où il constitue la première cause d’anémie (Thomas & Frankenberg, 2002).

Dans les pays industrialisés, certains groupes de populations tels que les femmes en âge de

procréer et notamment les femmes enceintes, les jeunes enfants et les adolescents, sont

particulièrement exposés à une carence en fer (Hurrell, 1998; Bothwell, 2000; Moy, 2000;

Lynch, 2002).

Parmi les différentes stratégies adoptées pour pallier ce problème de santé publique, le

développement d’aliments enrichis en fer constitue une des avenues les plus intéressantes

(Lynch, 2002). Cependant, malgré tous les efforts déployés dans ce secteur, notamment aux

USA, les résultats escomptés sont loin d’être concluants (Hurrell, 1998; Hertrampf, 2002).

Une des principales raisons de cet échec est due au fait que le fer est particulièrement

sensible aux conditions de préparation des aliments - oxydation, pH, présence d’autres

nutriments, etc.- qui peuvent modifier sa biodisponibilité (Hurrell, 1997; Dary, 2002). Ceci

nécessite de développer des matrices alimentaires de structure bien définie dans lesquelles

le fer serait piégé et protégé jusqu’à son site d’absorption au niveau intestinal.

Différentes approches ont été élaborées pour protéger et transporter des composés

essentiels à l’organisme (Shahidi & Han, 1993; Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997;

Schrooyen et al., 2001). Parmi celles-ci, le développement d’hydrogels piégeant dans leur

réseau des molécules actives connaît un intérêt grandissant, notamment dans les domaines

3 biomédical et pharmaceutique (Park, 2002; Kikuchi & Okano, 2002). La possibilité de

moduler les propriétés des hydrogels pour permettre une libération contrôlée et ciblée des

molécules actives sous l’effet d’un simple stimulus tel que le pH ou la température a induit

un engouement important pour ce type de véhicules (Brannon-Peppas, 1993; Bae & Kwon,

1998; Gupta et al., 2002). Mais la plupart de ces matrices nécessitent soit l’utilisation de

polymères de synthèse soit l’utilisation d’agents chimiques ou de solvants organiques

incompatibles avec des applications alimentaires (Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997).

Dans l’industrie alimentaire, les gels de biopolymères, sont largement utilisés en raison de

leurs propriétés nutritionnelles et de leur capacité à fixer la texture des aliments. De par

leurs propriétés – comestibles, biodégradables, etc.- ils pourraient constituer des matrices

de choix pour la protection de molécules sensibles telles que les micronutriments

(Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997; Schrooyen et al., 2001). Parmi les protéines

alimentaires utilisées en raison de leurs bonnes propriétés nutritionnelles et fonctionnelles,

les protéines du lactosérum sont certainement les plus intéressantes (Aguilera, 1995;

Hongsprabhas & Barbut, 1999; Bauer et al., 2000). La β-lactoglobuline, protéine majeure

du lactosérum, a fait l’objet de nombreux travaux tant sur le plan structural que fonctionnel

(Boye et al., 1997b; Boye et al., 1997a; Foegeding et al., 1999). Cette protéine globulaire

possède la capacité à former soit des gels thermiques (Foegeding et al., 1999; Ikeda &

Nishinari, 2001), soit des gels à froid (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements,

1998; Marangoni et al., 2000). Cette dernière caractéristique est particulièrement

intéressante pour le piégeage de molécules thermosensibles, notamment. De plus, élaborés

en présence de cations divalents, ces gels permettent le piégeage et le maintien des ions

dans le réseau via des liaisons électrostatiques protéines-ions.

4

Nous proposons d’étudier, dans le cadre de ce projet de recherche, l’aptitude des matrices

protéiques à piéger et transporter des micronutriments, en particulier du fer. De par sa

capacité à gélifier à froid en présence d’ions divalents, la β-lactoglobuline, protéine

majeure du lactosérum, constitue un matériau de choix pour l’élaboration d’hydrogels

piégeant des ions Fe2+. Ce travail s’articule autour de trois grandes parties.

Dans la première partie, nous présenterons une revue de littérature qui nous permettra de

dégager une hypothèse de travail et les objectifs de l’étude.

La seconde partie sera constituée de trois chapitres, présentés sous forme d’articles, dans

lesquels nous exposerons les résultats expérimentaux de ce travail ainsi que leur analyse. Il

s’agit, dans un premier temps, de présenter l’influence de différents paramètres -

concentration en protéine, concentration en fer et pH- sur la formation de gels à froid de β-

lactoglobuline et d’étudier l’impact de ces paramètres sur les propriétés macroscopiques

des gels obtenus. Dans un deuxième temps, nous présenterons les mécanismes de formation

des gels et étudierons les interactions responsables de leur stabilité. Enfin dans un troisième

temps, nous étudierons in vitro l’impact de différents paramètres – pH, enzymes..- sur la

libération du fer en relation avec la microstructure des gels en utilisant un système standard

de dissolution.

La dernière partie de ce travail sera consacrée à la conclusion et aux perspectives de cette

étude.

5

1.2. Revue bibliographique

1.2.1 Le fer

Le manque en micronutriments, spécifiquement en fer, constitue encore aujourd’hui un des

principaux problèmes nutritionnels rencontrés dans le monde. D’après l'Organisation

Mondiale de la Santé, il concernerait plus d'un milliard d'individus (WHO, 1996). Il touche

en priorité les pays en voie de développement mais également, à un degré d'intensité

moindre, les pays industrialisés (Thomas & Frankenberg, 2002).

Ce problème a conduit de nombreux chercheurs à s’intéresser à la formulation d’aliments

enrichis en fer (Wapnir, 1990a; Hurrell, 1998; Van Der Meer et al., 1998). Plusieurs

produits alimentaires tels que le lait (Rivera et al., 1982), le sucre (Viteri et al., 1995) et les

condiments (la sauce du poisson et la poudre du curry) ont été fortifiés avec du fer.

Cependant, du fait de son interaction avec les autres ingrédients, le fer est souvent

faiblement absorbé (Hurrell, 1997) et l’efficacité de ces incorporations n'a jamais été

démontrée (Hurrell, 1998). Le fer est aussi souvent ajouté aux produits diététiques, tels que

les aliments pour enfants ou les aliments qui ont été conçus pour avoir un impact positif sur

la santé (aliments fonctionnels) (Malaspina, 1996; Hilliam, 1998). Ainsi, les produits

alimentaires fortifiés avec du fer peuvent améliorer les fonctions immunitaires (Bradley &

Xu, 1996; Walter et al., 1997), activer des enzymes importantes en prévenant certains

maladies, telles que des maladies cardio-vasculaires ou du vieillissement (Dreosli, 1996;

Pollitt, 1997). Plusieurs travaux démontrent l’effet du fer sur les anémies (De Andrada et

al., 1997; Walter et al., 1997; Pollitt, 1997; Lynch, 2002). Quelque soit l’environnement,

les femmes en âge de procréer et notamment les femmes enceintes, les jeunes enfants et les

adolescents constituent les groupes de population les plus affectés par le manque en fer

6 (Allen, 1997; Erkkola et al., 1998; Whittaker et al., 2001). De plus, ils varient suivant la

répartition géographique - 50% de personnes affectées dans les pays en voie de

développement et approximativement 10% dans les pays industrialisés (Hurrell, 1998).

Dans les pays en voie de développement, l’effet du manque en fer est aggravé par les

infections dues au ver intestinal, la malaria et le manque en vitamine A (Hurrell, 1998). Il y

a une évidence claire de l’effet du fer sur le développement de quelques tissus comme par

exemple le cerveau (Guesry, 1998). Par conséquent, on peut dire que le manque en fer a des

effets importants aussi bien sur le plan physiologique de l'individu, que sur la santé

publique et l’économie d’un pays (Thomas & Frankenberg, 2002).

1.2.1.1. Le rôle du fer dans l'organisme

Bien que présent en très faibles quantités dans l'organisme (0,005 % du poids corporel), le

fer joue un rôle essentiel dans de nombreuses fonctions biologiques (Walter et al., 1997;

Yip, 2000). Il intervient dans la constitution de l'hémoglobine (protéine respiratoire des

globules rouges qui assure les échanges gazeux avec le milieu extérieur), de la myoglobine

(forme de réserve de l'oxygène du muscle) et d'enzymes jouant un rôle capital dans de

nombreuses réactions métaboliques. Il existe sous deux formes : le fer héminique et le fer

non héminique (Prasad, 1978). Le fer héminique (incorporé dans la structure de l'hème)

entre dans la constitution de l'hémoglobine, de la myoglobine et des enzymes

hémoprotéiques; le fer non héminique est présent dans certaines enzymes et correspond aux

formes de transport (par la transferrine) et de réserve du fer. Les réserves en fer de

l'organisme sont localisées au niveau du système réticulo-endothélial, notamment dans la

rate, la moelle osseuse et les muscles squelettiques et dans le parenchyme hépatique. Le fer

est distribué dans de nombreux organes au niveau de multiples localisations subcellulaires

7 et intervient ainsi dans des fonctions métaboliques variées (Benito & Miller, 1998; Nunez

et al., 2001).

Le fer circule dans le plasma lié à une protéine, la transferrine (ou sidérophiline). Chez les

humains, cette protéine a une capacité totale de fixation de l'ordre de 300 à 350 µg/dL, mais

elle ne transporte qu’environ 100 µg/dL de fer, le tiers de sa capacité (Hercberg et al.,

2000). D'autres protéines, telles que la lactoferrine et la ferritine, sont également

susceptibles de transporter le fer, mais elles n'ont, semble-t-il, aucun rôle dans le transport

physiologique du fer (Hercberg et al., 2000). L'originalité du métabolisme du fer tient au

fait qu'il s'effectue quasiment en circuit fermé. L'organisme est particulièrement économe

de son fer. Le pool du fer de l'organisme (4 g chez l'homme adulte; 2,5 g chez la femme

adulte) est en renouvellement permanent: le fer ayant servi à la synthèse de l'hémoglobine

est récupéré après la destruction des globules rouges et réutilisé. Les quantités de fer

quotidiennement éliminées sont très faibles, de 1 à 2 mg/jour, ce qui ne représente que

1/1000 à 1/4000 du pool total de fer de l'organisme. Mais cette faible élimination envers

l'extérieur est un facteur d'une extrême importance car en cas de non-compensation de ces

pertes par les apports alimentaires, il y a risque de déséquilibre de la balance en fer. Chez le

sujet sain, il existe un état d'équilibre entre les apports et les pertes. Cette balance peut être

deséquilibrée dans le sens de la carence en diverses circonstances : soit par insuffisance des

apports ou par diminution de l'absorption, soit par augmentation des pertes, soit par

augmentation des besoins. En cas de rupture de l'équilibre de la balance en fer, l'organisme

puise dans ses réserves disponibles; lorsque celles-ci sont épuisées, les fonctions

métaboliques dans lesquelles le fer intervient sont perturbées.

8

1.2.1.2. Les conséquences des carences et sub-carences en fer sur la santé

À côté du tableau clinique de l'anémie ferriprive, stade avancé de la carence en fer,

largement décrit dans les traités médicaux depuis plus d'un demi-siècle, se pose le problème

des éventuels effets néfastes de la carence modérée en fer, i.e avant le stade d'anémie. Il

faut garder à l'esprit que le fer participe dans l'organisme à des processus biochimiques

aussi importants que le transport des électrons au niveau mitochondrial, le métabolisme des

catécholamines, la synthèse de l'ADN. Mais les informations concernant les conséquences

de déficiences modérées en fer (les plus largement répandues dans les populations des pays

industrialisés) sur ces fonctions sont encore très limitées (Thomas & Frankenberg, 2002).

Certaines informations sont fournies par les travaux expérimentaux réalisés sur des modèles

animaux permettant de connaître le fonctionnement des systèmes enzymatiques dans

lesquels le fer intervient; d'autres proviennent d'études chez l'homme évaluant les effets de

la supplémentation en fer sur diverses fonctions de l'organisme (Hercberg et al., 2000). Ces

études montrent que des perturbations métaboliques liées au déficit modéré en fer peuvent

entraîner une réduction de la capacité physique à l'effort, une diminution des performances

intellectuelles, une moindre résistance aux infections, des perturbations au cours de la

gestation ou des anomalies de la thermogénèse.

1.2.1.3. Les besoins en fer

Les pertes basales journalières par desquamation des cellules des différentes surfaces du

corps humain, principalement des intestins, varient chez l'adulte de 0,9 à 1 mg de fer/jour,

ce qui correspond à des pertes d'environ 14 µg/kg. Pour les femmes de la puberté à la

ménopause, il est nécessaire d'ajouter aux pertes basales celles liées aux hémorragies

9 menstruelles soit environ de 0,4 à 0,5 mg/jour de moyenne annuel. Les besoins en fer sont

considérablement augmentés durant la grossesse, du fait de l'augmentation physiologique

de la masse érythrocytaire, de la constitution des tissus du fœtus et du placenta. Ces

dépenses spécifiques viennent s'ajouter aux pertes basales. Au total, c'est de plus de 1 g de

fer dont la femme enceinte a besoin pour assurer sa balance en fer au cours de la grossesse,

ce qui correspond à des besoins journaliers de 2,5 à 5,2 mg/jour en fonction du niveau des

réserves en fer au début de la grossesse.

Les besoins de l'enfant au cours de la première année de la vie sont considérables. Ils

doivent permettre la couverture des pertes basales, l'expansion de la masse érythrocytaire et

la croissance des tissus de l'organisme. Au cours de la première année de la vie, l'enfant né

à terme va tripler son poids de naissance et presque doubler son fer corporel. Compte tenu

des besoins liés à la croissance, les besoins totaux en fer sont considérables chez le jeune

enfant: à un an, ils sont de 8 à 10 fois supérieurs à ceux d'un adulte de sexe masculin

(lorsqu'ils sont exprimés par kg de poids corporel). L'accélération de la croissance,

particulièrement au cours des années de maturation sexuelle, s'accompagne également d'une

augmentation des besoins en fer. Chez les adolescentes, s’ajoutent les besoins en fer liés à

l'apparition des menstruations.

1.2.1.4. Les sources alimentaires de fer et la biodisponibilité du fer alimentaire

Seule une fraction du fer consommé est réellement absorbée. Les apports "réels" en fer

(apports qui traversent réellement la barrière digestive) dépendent donc du contenu en fer

des aliments, mais également de la biodisponibilité de ce fer (Hercberg et al., 2000).

10

La teneur en fer des aliments est très variable d'un aliment à l'autre: les aliments les plus

riches sont les abats et les légumes secs. Dans un régime de type occidental, les principales

sources de fer sont les produits carnés, les céréales, les fruits et légumes, ainsi que les

racines et tubercules amylacés. Mais, au-delà de fer présente dans l'alimentation, c'est la

qualité de ce fer qui constitue le facteur déterminant pour la couverture des besoins. En

terme de biodisponibilité, le fer alimentaire peut être divisé en deux types: le fer héminique

et le fer non héminique. Le premier, qui fournit de 10 à 15 % du fer alimentaire consommé

dans les pays industrialisés, se trouve dans l'hémoglobine et la myoglobine des viandes

rouges et est particulièrement biodisponible (de 20 à 30 %). Le fer non héminique fournit

par les céréales, les légumes, les fruits et les produits laitiers, a une absorption très variable

qui dépend de la nature et de la composition du repas. Certains facteurs favorisent ou

compromettent la biodisponibilité du fer non héminique. Selon l'action de ces facteurs,

l'absorption du fer à partir d'un repas peut varier de 1 à 20 % chez les individus ayant un

statut en fer comparable. Ainsi certaines protéines d’origine animale et différents acides

organiques, tel que l'acide ascorbique, stimulent l'absorption du fer non héminique. Par

contre, les polyphénols, y compris les tannins, les phytates et certains types de protéines,

ainsi que différentes formes de fibres alimentaires, entravent l'absorption du fer non

héminique. Parmi les aliments qui contiennent ces substances et qui inhibent donc

fortement l'absorption du fer, on trouve le thé, le café, le jaune d'œuf et le son.

Au total, selon la composition des régimes alimentaires, on peut considérer que le

coefficient d'absorption du fer varie de 5 % pour des repas à base de céréales et/ou de

racines-tubercules, pauvres en produits carnés et en vitamine C, à 15 % pour des repas

contenant des quantités importantes d'aliments carnés et de sources de vitamine C.

11

Toutes ces informations montrent qu’il est très difficile de remplir le besoin journalier en

fer avec un régime alimentaire normal en raison des nombreux facteurs susceptibles de

moduler sa biodisponibilité (Hurrell, 1997; Benito & Miller, 1998; Lynch, 2000; Lynch,

2002). Le développement d’aliments enrichis en fer constitue une alternative intéressante

pour pallier ce problème de santé publique.

1.2.1.5. Aliments enrichis en fer

L’incorporation de fer à des systèmes alimentaires présente de nombreux problèmes d’un

point de vue pratique. En effet, le fer est un composé très oxydable dont la solubilité varie

en fonction de sa forme d’oxydation. À pH 7, la solubilité de l’ion ferreux est de 0,1 M,

tandis que celle de l’ion ferrique est 10-16 M. De plus en présence d’oxygène, l’ion ferreux

réagit pour former l’ion ferrique, moins biodisponible (Prasad, 1978; Wapnir, 1990b;

Wapnir, 1990a). La préoccupation principale est de sélectionner un composé du fer qui va

être bien absorbé, qui ne doit pas être détérioré dans l’élaboration de l’aliment et ne doit pas

modifier les propriétés du produit final (Lynch, 2002). Une fois incorporé, le fer doit être

protégé de l’oxydation, de la précipitation et de toutes réactions susceptibles de diminuer sa

biodisponibilité. Il y a beaucoup de formes de présentation du fer mais toutes ne respectent

pas les conditions mentionnées. Ainsi pour des raisons organoleptiques, le sulfate ferreux,

qui est la forme la moins chère et la plus efficace, est uniquement utilisé dans les formules

pour bébé, dans quelques produits de la boulangerie destinés à la consommation rapide et

dans les pâtes qui ont un très bas taux d'humidité. Par contre, le fer élémentaire, le

pyrophosphate ferrique, l’orthophosphate ferrique, le fumarate ferreux et la saccharate

ferrique sont utilisés pour fortifier les céréales et d’autres aliments tels que le chocolat en

poudre, le riz, le sel, la farine du blé et les céréales du petit déjeuner. Mais ces

12 enrichissements ne sont pas comparables en terme de biodisponibilité relative. Ces

composants qui sont faiblement solubles dans l'acide dilué ont une biodisponibilité variable

chez l’homme. Comparé au sulfate ferreux (100), le pyrophosphate ferrique,

l’orthophosphate ferrique et le fer élémentaire, donnent généralement des résultats

inférieurs à 50. Quelques exemples montrent que chez l’homme, le pyrophosphate ferrique

varie de 21 à 74 et l'orthophosphate d’ammonium ferrique de 30 à 60 (Hurrell, 1998). Mais

en terme de biodisponibilité, le sulfate ferreux reste la meilleure source d’incorporation en

fer à condition de pouvoir le protéger de l’oxydation et de la précipitation (Lysionek et al.,

2002).

De plus, de nombreux facteurs affectent l’absorption intestinale du fer. Les composés

solubles dans l’eau, tel que le sulfate ferreux, se dissolvent instantanément dans le jus

gastrique, alors que les composés plus insolubles, tel que le fer élémentaire, se dissolvent

rarement complètement. Une fois dissous, le fer est absorbé mais son absorption peut être

modulée par les autres composants présents dans les repas, comme il a été mentionné

précédemment. Étant donné que la majorité de composés à base d’ion ferreux sont plus

biodisponibles que ceux à base d’ion ferrique, l’état ferreux sera à privilégier dans le cadre

d’une incorporation alimentaire.

A l’heure actuelle, les aliments fortifiés avec du fer n’ont pas démontré d’amélioration dans

l’absorption globale du fer. En effet, très souvent les aliments qui sont transporteurs du fer

contiennent également quelques facteurs qui inhibent son absorption. On peut, par exemple,

mentionner l’acide phytique contenu dans le blé et le maïs ou le calcium et les caséines

contenus dans les produits du lait. Le sel, les condiments et le sucre ne sont pas des

inhibiteurs mais sont consommés habituellement avec des légumes, des céréales, du thé ou

13 du café qui contiennent de l'acide phytique et des polyphénols. Les boissons au chocolat

contiennent un haut niveau de polyphénols (Hurrell, 1998). Par contre, certains composés

tels que l’acide ascorbique, les acides organiques et les tissus animaux améliorent

l’absorption du fer (Lynch et al., 1989; Hurrell, 1998; Lynch, 2002). De même, pendant la

digestion, les protéines alimentaires sont transformées en peptides qui peuvent se lier au fer

dans l’intestin et ainsi influencer son absorption. Ces effets peuvent être inhibiteurs ou

stimulants de l’absorption du fer, dépendant de la nature des protéines (Lynch, 2000). Les

protéines de soya, de l’œuf, ainsi que les caséines ont montré un effet inhibiteur sur

l’absorption du fer (Lynch et al., 1989; Hurrell, 1997; Benito & Miller, 1998; Lynch,

2000). L’effet inhibiteur des protéines de soya est dû à la formation de peptides résultant de

la digestion de la conglycinine (7S) qui présentent des interactions avec le fer avec la

formation de chélates qui empêchent le passage au niveau de la paroi intestinale. Les autres

protéines végétales présentent quelques comportements semblables (Lynch et al., 1989;

Hurrell, 1998; Cork, 2000).

D’autre part, certaines protéines animales, telles que la lactoferrine, ont montré un effet

stimulant sur l’absorption du fer (Hurrell, 1998). De même les protéines du lactosérum

forment par digestion des peptides susceptibles de fixer le fer favorisant ainsi son passage à

travers la barrière intestinale et améliorant sa biodisponibilité (Meisel, 2001).

1.2.1.6. Réflexions sur une nouvelle stratégie

À ce jour, les travaux de recherche menés sur l’incorporation de fer dans les aliments et

l’impact de ces aliments sur la santé de la population n’ont pas permis d’obtenir des

résultats concluants (Uauy et al., 2002). Les problèmes de stabilité et d’interaction avec les

autres nutriments doivent mieux être pris en compte pour le développement de formulations

14 d’aliments enrichis en fer ou d’aliments fonctionnels susceptibles d’améliorer la santé de la

population. Dans le développement d’aliments fonctionnels, la première étape à prendre en

considération est l’identification de l’interaction entre une molécule active de l’aliment et

une fonction de l’organisme. Dans le cas du fer, l’identification de ces interactions avec

l’organisme a été largement étudiée (Hurrell, 1997; Mai & Tan, 2000; Raja et al., 2000;

Schümann, 2001). La deuxième étape est d’établir une stratégie de protection, de transport

et de libération du fer dans les endroits cibles susceptibles de garantir sa biodisponibilité.

Pour protéger et transporter des composés essentiels dans des endroits cibles de

l’organisme, différentes stratégies ont été développées (Pothakamury & Barbosa-Canovas,

1997). Une des plus populaires ces dernières années consiste à encapsuler les molécules

d’intérêt dans des matrices polymériques (Lysionek et al., 2001). Cette approche trouve de

nombreuses applications dans des domaines pharmaceutique et cosmétique mais également

dans le domaine alimentaire que ce soit pour (i) l’encapsulation d’arômes, (ii) la protection

des vitamines et (iii) la libération contrôlée des composés actifs d’intérêt (Shahidi & Han,

1993; Brannon-Peppas, 1993). Une fois encapsulé, le composé d’intérêt est rajouté au

système alimentaire. Cependant l’inconvénient majeur dans ce type d’approche est

d’arriver à contrôler la stabilité du système et d’éviter les séparations de phases.

Une autre approche consiste à incorporer les molécules actives lors de l’élaboration d’un

réseau de type gel. Les gels de biopolymères constituent des véhicules de choix et

connaissent depuis quelques années un intérêt croissant surtout dans le domaine biomédical

ou pharmaceutique (Peppas, 1997; Philipon, 1997; Park, 2002; Kikuchi & Okano, 2002).

Ces hydrogels sont particulièrement versatiles et sont susceptibles d’être modifiés à souhait

pour produire une libération contrôlée de la molécule piégée (“relargage intelligent”)

15 (Brannon-Peppas, 1993; Bae & Kwon, 1998; Gupta et al., 2002) et atteindre un endroit

cible dans un temps donné (Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997).

Dans l’industrie alimentaire, les gels de biopolymères, sont largement utilisés en raison de

leurs propriétés nutritionnelles et de leur capacité à fixer la texture des aliments. De par

leurs propriétés –comestibles, biodégradables, etc.- ils pourraient constituer des matrices de

choix pour la protection de molécules sensibles telles que les micronutriments et en

particulier le fer.

16

1.2.2. Hydrogels protéiques

1.2.2.1. Hydrogels

L'hydrogel est un réseau tridimensionnel de polymères hydrophiles dans lequel une grande

quantité d'eau est présente. En général, la quantité d'eau est comprise entre 20% et 95% du

poids total (Park & Park, 1996). La principale caractéristique de l'hydrogel est sa capacité à

gonfler en présence d'eau et à se contracter en l'absence d'eau. Cette propriété est

conditionnée par la nature des chaînes du polymère et par leur densité d’enchevêtrement.

Dépendant des interactions mises en jeu, les hydrogels peuvent être soit chimique soit

physique. Les hydrogels sont dits "chimiques" lorsqu’ils sont maintenus par des liaisons

covalentes. Les hydrogels chimiques atteignent un niveau de gonflement d'équilibre dans

des solutions aqueuses qui dépendent principalement de la densité de liaisons (estimée par

l’augmentation du poids moléculaire MW de la chaîne moléculaire). Ces gels ne sont pas

homogènes et contiennent habituellement des zones d’enchevêtrement élevé contenant peu

d'eau, dispersées parmi des zones de bas enchevêtrement qui présentent un gonflement

élevé (Hoffman, 2002). Dans certains cas, dépendamment de la composition du solvant, de

la température et de la concentration des solides durant la formation du gel, une phase de

séparation peut se produire, et des pores peuvent se former. De plus, les bouts de chaînes

libres et les boucles représentent des zones défectueuses qui ne peuvent contribuer à

l'élasticité du réseau.

Les hydrogels sont dits "physiques" quand ils sont maintenus par des liaisons notamment

de faible énergie incluant les forces ioniques, les liaisons hydrogène ou hydrophobes

(Peppas et al., 2000a; Peppas et al., 2000b). Les hydrogels physiques sont moins

homogènes que les hydrogels chimiques, car ils présentent de nombreuses régions

17 d’enchevêtrements élevés. Les bouts de chaîne libre et les boucles représentent aussi des

réseaux défectueux transitoires dans les gels physiques. Quand un polyélectrolyte est

combiné avec un ion multivalent de charge opposée, il peut former un hydrogel physique

connu sous le nom d'hydrogel "ionotropique". L'alginate de calcium est un exemple de ce

type d'hydrogel. De plus, quand les polyélectrolytes de charges opposées sont mélangés, ils

peuvent se gélifier ou précipiter suivant leur concentration, la force ionique ou le pH de la

solution. Les produits d'un tel système ionique interrelié sont connus comme complexes

"coacervats", polyions complexes ou polyélectrolytes complexes. Quelquefois, les gels

physiques peuvent former une sorte de reconnaissance biospécifique. Toutes ces

interactions sont réversibles, et peuvent être perturbées par de simples changements des

conditions du milieu tels que la force ionique, le pH, la température ou l'application d'un

stress.

Un autre aspect important à prendre en considération est la relation entre le réseau formé et

l’eau. Le caractère de l'eau dans un hydrogel peut déterminer la rétention des molécules

piégées dans des produits de type gel. Quand un hydrogel sec commence à absorber de

l'eau, les premières molécules d'eau entrant dans la matrice vont hydrater les régions les

plus "polaires" des groupes hydrophiles menant à de "l'eau primaire liée". Dès que le

groupe polaire est hydraté, le réseau gonfle, et expose les groupes hydrophobes, qui

interagissent alors à leur tour avec les molécules d'eau, menant à une organisation

particulière de l’eau de solvatation des régions hydrophobes ou une "eau secondaire liée".

Les eaux liées primaire et secondaire sont souvent combinées et simplement appelées "total

d'eau liée". Quand les zones polaires et hydrophobes auront interagi avec les molécules

d'eau liée, le réseau va imbiber de l'eau additionnelle, en raison de sa force d'énergie

d'osmose. Ce gonflement additionnel est opposé aux forces de liaisons parmi les molécules

18 du réseau, menant à une élasticité de la force de rétraction du réseau. Ainsi, l'hydrogel va

atteindre un niveau de gonflement d'équilibre. L'eau de gonflement additionnel est appelée

"eau libre" et est présumée remplir l'espace entre les chaînes du réseau, et/ou le centre des

pores plus larges. Quand le réseau est gonflé, si les interactions parmi les constituants du

réseau sont dégradées, le gel commencera à se désagréger et à se dissoudre, à un taux

dépendant de sa composition et des conditions environnementales.

1.2.2.1.1. Sensibilité des hydrogels à l’environnement

Les hydrogels sont tout d’abord utilisés pour protéger les molécules bioactives d'un

environnement hostile, i.e. présence d'enzymes ou variation de pH de l’organisme. De plus,

ils peuvent libérer ces molécules par simple réponse à des stimuli physiques ou chimiques

(Peppas, 1997; Philipon, 1997; Peppas et al., 2000a; Peppas et al., 2000b). Les stimuli

physiques incluent principalement la température, mais également les champs électriques,

la lumière, la pression, le son ou les champs magnétiques. Les stimuli chimiques ou

biochimiques comprennent le pH, les ions et la reconnaissance d'événements moléculaires

spécifiques (Bae & Kwon, 1998; Hoffman, 1998). Ces hydrogels sont particulièrement

utilisés dans diverses applications, tel que la fabrication de muscles artificiels, les valves

chimiques, l'immobilisation d'enzymes et de cellules, etc. (Qiu & Park, 2001). Les

hydrogels sensibles aux variations de températures sont très étudiés et sont, en général, de

nature synthétique (Kaneko & Sakai, 1998; Peppas et al., 2000a). Les hydrogels formés à

partir de polymères naturels sont, quant à eux, particulièrement sensibles aux variations de

pH (Miyata et al., 2002).

1.2.2.1.2. Les hydrogels sensibles aux variations de pH

19

Les hydrogels sensibles aux variations de pH contiennent des groupements acides -i.e.

acides carboxyliques - ou des groupements basiques -i.e. amines- qui acceptent ou libèrent

des protons en fonction du pH de l'environnement, générant des polymères ionisés connus

sous le nom de polyélectrolytes. C’est le cas, notamment des protéines.

Les hydrogels constitués de polyélectrolytes présentent de grandes différences dans leurs

propriétés de gonflement en fonction du pH de l'environnement. Les groupes acides ou

basiques des polyélectrolytes subissent une ionisation de la même façon que les groupes

acides ou basiques des monoacides ou monobases. Cependant, l'ionisation des

polyélectrolytes est plus difficile en raison des effets électrostatiques exercés par d'autres

groupes ionisés adjacents. Cela tend à produire une constante apparente de dissociation

(Ka) différente de celle du monoacide ou de la monobase correspondant. Ces groupements

ionisés entraînent le gonflement des hydrogels bien au-delà de ce qui peut être obtenu par

les polymères non-chargés. Puisque le gonflement des hydrogels polyélectrolytes est

principalement dû à la répulsion électrostatique entre les charges présentes sur la chaîne de

polymère, l'extension du gonflement est influencée par toute condition qui module la

répulsion électrostatique, tel que le pH, la force ionique, et le type de zwitterion.

Les hydrogels sensibles aux variations de pH sont très fréquemment utilisés dans le

développement de formulations administrées par voie orale. Le pH de l'estomac (< 3) est

très différent du pH neutre-alcalin (> 7.2) des intestins, et une telle différence est

suffisamment importante pour entraîner des comportements très différents en milieu gastro-

instestinal.

1.2.2.1.3. Hydrogels synthétiques vs. naturels

20

Il est possible de former des hydrogels soit à partir de polymères de synthèse, soit à partir

de polymères naturels. Très utilisés dans l’industrie pharmaceutique en raison de leurs

nombreuses possibilités, les polymères de synthèse ne peuvent pas être utilisés dans

l’industrie alimentaire qui nécessite la classification GRAS (Generally Recognized As

Safe) des constituants (Pothakamury & Barbosa-Canovas, 1997). Par contre déjà largement

utilisés dans notre alimentation en raison de leurs propriétés nutritionnelles et

fonctionnelles –gélifiantes, notamment- les polymères naturels, et spécifiquement les

protéines, constituent des véhicules de choix pour le transport de molécules bio-actives

(Katzhendler et al., 2000).

1.2.2.2. Hydrogels protéiques

Un gel de protéines peut être défini comme un état intermédiaire entre une solution et un

précipité, où le liquide empêche l'effondrement du réseau en même temps que le réseau

empêche le liquide de s'écouler. Ceci nécessite un équilibre entre les interactions protéines-

protéines, protéines-eau, et des forces attractives et répulsives entre les chaînes

polypeptidiques adjacentes (Totosaus et al., 2002). Un réseau de protéines est généralement

maintenu par des liaisons non covalentes et résulte d’interactions hydrophobes, de liens

d'hydrogène ou d’interactions électrostatiques entre les chaînes polypeptidiques. Des liens

covalents de type ponts disulfure peuvent également intervenir dans l’élaboration du réseau.

La contribution relative de chaque type de liaisons est fonction des propriétés des protéines

et des conditions de l'environnement (Ziegler & Foegeding, 1990; Foegeding et al., 1992;

Totosaus et al., 2002). L'intégrité physique du gel est maintenue par le contre-équilibre des

forces d'attraction et de répulsion entre les chaînes protéiques. Le mécanisme de

21 gélification est déterminé par cet équilibre et les interactions protéine-solvant (Ziegler &

Foegeding, 1990; Clark, 1993; Lips et al., 1990; Totosaus et al., 2002)

Les interactions protéine-protéine et solvant-protéine affectent le type et les propriétés du

gel résultant (Ziegler & Foegeding, 1990; Foegeding et al., 1992; Totosaus et al., 2002).

Selon Phillips et al. (1994), les facteurs qui peuvent affecter la gélification peuvent être soit

intrinsèques soit extrinsèques.

Parmi les facteurs intrinsèques, on peut citer:

Les interactions électrostatiques - La charge nette de la molécule de protéine qui modifiee

les forces d'attraction et de répulsion, affecte les interactions protéine-protéine et protéine-

solvant (Phillips et al., 1994). Ces interactions électrostatiques sont le résultat des

changements de la force ionique ou du pH.

• Les ponts disulfure et les échanges thiol-disulfure - Les ponts disulfure, liens

covalents entre les chaînes polypeptidiques impliquées dans la gélification des

protéines augmentent la longueur apparente de la chaîne de polypeptide, au lieu de

réagir comme un stabilisant initial du réseau (Clark & Lee-Tuffnell, 1985; Li-Chan

& Nakai, 1989; Ziegler & Foegeding, 1990; Damodaran & Anand, 1997). Les liens

disulfure ne sont pas essentiels dans la gélification des protéines, mais leur rôle dans

la gélification est associé à leur capacité d'accroître le poids moyen du poids

moléculaire donc la longueur de la chaîne (Wang & Damodaran, 1990).

• La masse moléculaire - Les variations dans la résistance du gel peuvent être

rattachées aux différences dans le poids moléculaire et la forme hydrodynamique de

22

la protéine. Le poids moléculaire critique du polypeptide dans la formation d'un gel

est d'environ 23000 Da (Wang & Damodaran, 1990).

• La composition en acides aminés - La quantité d’acides aminés chargés versus

d’acides aminés hydrophobes joue un rôle important dans le processus de

gélification et les caractéristiques des gels résultants (Damodaran, 1988).

• L’hydrophobicité - L’association des acides aminés hydrophobes forme un amas

entouré par une couche résiduelle polaire en contact avec le solvant (Li-Chan &

Nakai, 1989). En raison de la propension des résidus d’acides aminés non polaires à

se positionner eux-mêmes à l'intérieur d'une molécule de protéine en solution, donc

évitant tout contact avec le milieu aqueux qui l'entoure, seulement une portion de

ceux-ci peut être retenue à l’extérieur constituant l'hydrophobicité effective. Ce type

d’hydrophobicité se réfère à la valeur représentant l'hydrophobicité de la protéine

impliquée directement dans les interactions entre les protéines et le milieu ambiant

(Li-Chan & Nakai, 1989; Totosaus et al., 2002).

Les facteurs extrinsèques sont les conditions de l'environnement entourant les protéines.

Ceux-ci peuvent être relativement bien contrôlés afin de parvenir à une bonne formation

d'un gel:

• La concentration en protéine - La concentration en protéine conditionne le nombre

d’enchevêtrements susceptibles de se former lors de la gélification. En-deçà d’une

concentration minimale appelée concentration critique, le réseau gel ne peut être

formé (Ferry, 1948). La solidité du gel et la possibilité qu'il se déforme sont

23

étroitement dépendantes de la concentration en protéine (Hongsprabhas & Barbut,

1997b; Totosaus et al., 2002)

• Le pH - La charge nette d’une protéine à son point isoélectrique est égale à zéro.

Cependant, plus l'environnement autour de la protéine s'éloigne de ce point

isoélectrique plus sa charge augmente. En conséquence, plus la charge nette est

grande sur une molécule de protéine, plus il y a de répulsions électrostatiques entre

les molécules, empêchant les interactions requises pour former la matrice de gel

(Langton & Hermansson, 1992; Ju & Kilara, 1998; Kavanagh et al., 2000)

• La température - La température est un des facteurs les plus importants parce

qu’elle conduit la force qui produit le dépliement des domaines protéiques lors de la

gélification thermique. Quand le coefficient de température de gélification est élevé,

la première étape de gélification ( la dénaturation) est complète bien avant la

seconde étape (l’aggregation). Ainsi, pour une vitesse de dénaturation donnée, le

taux d'agrégation est lent si les forces attractives entre les chaînes de protéines

dénaturées sont faibles, résultant en une fin réseau de gel translucide (Ferry, 1948).

• La force ionique - La force ionique a un effet significatif sur l'adsorption de l'eau, le

gonflement et la solubilité des protéines ainsi que sur les caractéristiques finales du

gel (Totosaus et al., 2002), et notamment sur sa microstructure (Stading et al., 1992;

Foegeding et al., 1992; Stading et al., 1993)

• Le type de sel - Les ions monovalents (Na+, Li+, K+, Rb+, Cs+) forment une matrice

gélifiée lorsque les forces ioniques sont de l’ordre de 100 mM alors que pour les

ions divalents (Ca2+, Mg2+, Ba2+) il suffit de faibles concentrations (10 -20 mM)

24

(Bryant & McClements, 1998; Marangoni et al., 2000). La concentration des sels

requise pour former un gel dépend de la position de l’ion dans la série d’Hofmeister.

Parmi les protéines alimentaires largement utilisées pour leurs propriétés gélifiantes, les

protéines de lactosérum constituent des substrats de choix en raison de leur capacité à

former des gels thermiques et des gels à froid. De plus, elles présentent un bon profil

nutritionnel. Pour ces différentes raisons, l’utilisation de ces protéines est une alternative

intéressante pour le retention de micronutriments.

1.2.2.3. Protéines du lactosérum

Les protéines du lactosérum constituent une des fractions protéiques du lait. Le lactosérum,

dérivé de l'industrie fromagère longtemps considérée comme un déchet, est aujourd'hui

récupéré en raison des propriétés de ses protéines. En effet, en plus de leur valeur

nutritionnelle, les protéines du lactosérum ont des propriétés fonctionnelles intéressantes,

incluant une très bonne aptitude à la gélification (Twomey et al., 1997). Elles sont utilisées

dans de nombreux produits alimentaires, en raison de leurs qualités nutritionnelles

(boissons) et technofonctionnelles (charcuteries, desserts). Ces propriétés sont

principalement dues à la β-lactoglobuline, protéine majeure du lactosérum.

1.2.2.4. La β-lactoglobuline

La β-lactoglobuline est une protéine globulaire dont la structure compacte et repliée résulte

d'un agencement particulier dans lequel les groupements apolaires (hydrophobes) tendent à

se placer vers l'intérieur de la molécule tandis que les résidus polaires (hydrophiles) sont

répartis principalement à la surface. Le repliement de la protéine suit un chemin séquentiel

25 unique et l'ensemble du processus est gouverné par la minimisation de l'énergie libre de

stabilisation du système. Le compromis thermodynamique et le respect d'un certain degré

de liberté de la chaîne polypeptidique font que la somme des interactions intramoléculaires

et de l'entropie de solvatation doit compenser l'entropie de la chaîne de manière à fixer la

protéine dans une configuration native hautement ordonnée donc de basse énergie.

La séquence primaire de la β-lactoglobuline comporte 162 acides aminés pour une masse

moléculaire de 18400g/mol. Elle contient deux ponts disulfure entre les résidus cystéine

(Cys) 66 et Cys 160, Cys 106 et Cys 119 ou 121. Un groupement sulfhydryle libre (-SH)

est positionné sur le résidu 119 ou 121 (Figure 1.1). Sept variants génétiques sont

actuellement connues: A, B, C, D, Dr, Dyak et E. Les variants A et B sont les plus

communs et se rencontrent dans des proportions voisines. Le variant A diffère du variant B

par la nature de deux résidus: Asp respectivement Gly en 64 et Val respectivement Ala en

118.

Figure 1.1: Position des ponts disulfure dans la β-lactoglobuline

26

La structure secondaire de la β-lactoglobuline a été étudiée par différentes techniques. Les

données de dispersion optique rotatoire et de dichroïsme circulaire suggèrent que la β-

lactoglobuline contient 10-15% d'hélice α, 43% de feuillet β, 47% de régions désordonnées

ce qui concorde avec les résultats de modélisation moléculaire: 15% d'hélice α, 50% de

feuillet β et 15-20% de coude β (Figure 1.2) (Papiz et al., 1986; Edwards et al., 2002).

La structure tertiaire de la β-lactoglobuline a également été déterminée. Les études

cristallographiques aux rayons X à haute résolution ont montré que cette structure consiste

en 5 feuillets anti-parallèles composés de neuf brins enroulés formant une sorte de calice

(Papiz et al., 1986). Le cœur de la molécule est constitué de 9 brins β anti-parallèles. Les

brins A à I comprennent les résidus 16-27, 39-44, 47-58, 62-76, 80-84, 89-97, 102-109,

115-124 et 145-150. Les brins E, F, G, H, A et I sont encadrés sur le côté- par une hélice α

à 3 tours (résidus 130-140). Les coudes β sont en position 44-47, 78-81, 84-85, 98-102 et

111- 115. Le brin I est impliqué dans la formation du dimère par des interactions anti-

parallèles avec son homologue sur la molécule voisine. La β-lactoglobuline appartient de

par sa séquence et sa structure à la super-famille des lipocalines (Brownlow et al., 1997).

Elles ont pour principales caractéristiques d'avoir une masse moléculaire voisine de

18000g/mol et de fixer et transporter de nombreux ligands hydrophobes, labiles et

insolubles.

27

Hélice α

Brin I

Figure 1.2: Structure tridimensionnelle de la β-lactoglobuline.

La structure quaternaire de la β-lactoglobuline est très influencée par les conditions

environnementales. Les effets du pH, de la concentration en protéine et de la force ionique

sont rendus difficilement dissociables du fait de leur contribution souvent concomitante à la

formation d'une large gamme de structures quaternaires de la β-lactoglobuline. De pH 3 à 7

et à température ambiante, la β-lactoglobuline existe sous forme de dimère de masse

moléculaire 36700g/mol (Figure 1.3). Cette association serait due à des interactions

électrostatiques entre les résidus d’acide aspartique 130 et acide glutamique 134 d'un

monomère et les résidus lysine d'un autre monomère. Des interactions hydrophobes entre

les résidus isoleucine 29 et isoleucine 147 ainsi qu'un empilement des imidazoles des

résidus histidine 146 reliés symétriquement sont également mis en jeu (Papiz et al., 1986;

Jameson et al., 2002). Les données de cristallographie aux rayons X ont montré que le

dimère de β-lactoglobuline s'apparente à un ellipsoïde de longueur 69.3Å et de largeur

34.6Å composée de deux sphères de rayon 17.9Å, légèrement écrasées au niveau de leur

28 surface de contact, ce qui donne une distance centre à centre de 33.5Å, et liées entre elles

de manière non covalente (Papiz et al., 1986; Jameson et al., 2002). Cette structure possède

un axe de symétrie binaire perpendiculaire au grand axe du dimère. Le rayon de giration

calculé à partir de cette structure est de 21.6Å en accord avec celle déterminée en solution

(pH 5.7 à 25 oC µ=0.lM) par diffusion des rayons X aux petits angles (Brownlow et al.,

1997).

Figure 1.3: Structure du dimère de la β-lactoglobuline.

Entre pH 3.7 et 5.1, à basse température (0-4 oC) et pour une concentration supérieure à

15g/l, le dimère se tétramérise pour former un octamère d'environ 147000g/mol avec un

maximum d'octamérisation à pH 4,6 et 0 oC. L'implication de liaisons hydrogène entre les

groupements carboxyles des résidus de l’acide aspartique 64 localisés à l'interface

d'association des dimères serait probable puisque ce phénomène est plus important pour le

variant A que pour le B (Brownlow et al., 1997). Lorsque l'on s'éloigne de cette gamme de

pH, la protéine se monomérise et ce phénomène devient appréciable en-dessous de pH 3,5

29 et au-dessus de pH 7,5. Cette dissociation est d'autant plus importante que la concentration

et la force ionique sont faibles et que la température est élevée. Elle correspond à une

énergie libre d'association d'environ -25kJ/mol et résulte de la présence de forces

électrostatiques répulsives liées à l'augmentation de la charge nette de la β-lactoglobuline.

La dissociation n’induit pas de changement majeur dans la forme de la protéine (Aymard et

al., 1996) mais elle provoque des modifications dans sa structure secondaire (Lefèvre &

Subirade, 1999; Lefèvre & Subirade, 2001).

La β-lactoglobuline a une hydratation d’environ 35g d'eau pour 100g de protéine pour la

forme dimérique et de 60g d'eau pour 100g de protéine la forme octamérique (Aymard et

al., 1996). La cavité dans l'octamère pourrait être responsable de la plus grande partie de

l'eau liée à la molécule octamérique. En effet, des études de relaxation de protons par

résonance magnétique nucléaire ont montré qu’il y avait environ 5 à 6 molécules d'eau par

dimère soit 20 à 24 molécules d'eau par octamère.

Le point isoélectrique de la β-lactoglobuline diminue avec l’augmentation de la

concentration en KCl et CaCl2 (Renard, 1994). Il y aurait fixation de potassium et de

calcium sur la protéine isoionique. L'interaction préférentielle du NaCl avec la β-

lactoglobuline augmente significativement lorsque le pH diminue en raison d'une

distribution de charge singulière sur la surface de la protéine autour du pH neutre

conduisant à un moment dipolaire élevé égal à 730 Debye (Renard, 1994). Au-dessus du

point isoélectrique, le sodium est capable de se fixer aux groupements carboxyliques et

imidazoles; le nombre d'ions fixés par monomère passe de 0 à 2 lorsque le pH augmente de

6 à 9 (Boye et al., 1996).

30

De nombreuses études de fixation ionique sur la β-lactoglobuline montrent que cette

protéine est capable de fixer des molécules hydrophobes ou amphiphiles sur au moins deux

sites distincts. Aucun de ces sites n'affecte ou n'est affecté pas l'état dimérique de la β-

lactoglobuline mais par un état d'association plus élevé (Brownlow et al., 1997). La fixation

sur l'un des deux sites implique des changements dans l'environnement du groupement

sulfhydryle susceptible de conduire à la dissociation du dimère alors que la fixation sur

l'autre site semble impliquer dans certains cas un résidu tryptophane.

1.2.2.5. Mécanismes d’induction de la gélification de la β-lactoglobuline

La gélification de la β-lactoglobuline peut être induite par différents facteurs (température,

pression, présence d’urée, etc.) et conduire à des gels thermiques ou des gels à froid.

1.2.2.5.1. Gélification thermique

Le traitement thermique de la β-lactoglobuline entraîne des modifications de structures

pouvant conduire à sa gélification. Les principales étapes du phénomène sont le dépliement

et l'agrégation-gélification (Boye et al., 1997b; Bauer et al., 2000). Il faut cependant

différencier les mécanismes de dénaturation thermique de la β-lactoglobuline et les

mécanismes de gélification. Même si ces deux phénomènes peuvent se produire en même

temps, il est possible de les séparer en faisant varier la vitesse de chauffage (Renard, 1994;

Le Bon et al., 1999).

Le mécanisme de dénaturation thermique est très différent selon le pH de la solution

étudiée (Tang et al., 1995; Qi et al., 1995; Le Bon et al., 1999). Dès 40 oC à pH 6.8, les

dimères se dissocient, permettant ainsi l'exposition des groupements -SH libres, enfouis

31 auparavant à l'intérieur des dimères (Shimada & Cheftel, 1988; Verheul & Roefs, 1998;

Kavanagh et al., 2000). Entre 30 et 60 oC, de légères variations de la structure tertiaire de la

protéine sont déjà observées, entraînant une plus grande exposition des sites hydrophobes à

la surface de la protéine. L'exposition des sites hydrophobes est irréversible lorsque la

température dépasse 60 oC (Liu et al., 1994; Le Bon et al., 1999). Le dépliement de la

protéine durant le chauffage, dû à l'affaiblissement des liaisons intra et intermoléculaires,

entraîne donc un exposition des groupements hydrophobes, des groupements thiols et des

ponts disulfure qui favorisera l'agrégation ultérieure (Robin et al., 1993). Le mécanisme

d'agrégation est en grande partie dû à la réactivité des groupements thiols et des ponts

disulfure à la chaleur. Un autre travail (Sawyer, 1968) a cependant montré que la β-

lactoglobuline est capable de former des agrégats même en présence d'un agent bloquant les

groupements -SH. D'autres types de liaisons, telles que les liaisons hydrogène ou les

interactions hydrophobes peuvent alors intervenir jusqu’à la formation du réseau.

Le mécanisme de gélification thermique des protéines lactosériques, et plus

particulièrement de la β-lactoglobuline, a fait l'objet de nombreux travaux (Renard, 1994;

Tang et al., 1995; Twomey et al., 1997; Otte et al., 2000; Bryant & McClements, 2000b;

Ikeda & Nishinari, 2001). Différentes techniques telles que la rhéologie (Ikeda & Nishinari,

2001), la microscopie électronique (Langton & Hermansson, 1992; Barbut, 1995), la

microscopie à force atomique (Ikeda & Morris, 2002), et la spectroscopie infrarouge à

transformée de Fourier (Lefèvre & Subirade, 2000) ont été utilisées pour caractériser les

gels obtenus. Dépendant du pH de la solution protéique, il a été montré l’existence de deux

types de gels (Langton & Hermansson, 1992; Barbut, 1994). Entre pH 4 et pH 6, les gels

obtenus thermiquement sont opaques. Ces gels sont formés d'agrégats, et sont qualifiés de

coagulum ou gels particulaires. Les zones de jonction de ce type de gels sont constituées

32 d'un grand nombre de molécules protéiques. Ils sont divisés en deux catégories: entre pH 5

et pH 6, la structure du réseau gel est régulière, et la taille des particules est uniforme. Entre

pH 4 et pH 5, le réseau est plus non-homogène, avec des particules de tailles très

différentes. Les gels opaques ont une faible capacité de rétention d'eau (Barbut, 1995). À

des pH inférieurs à pH 4 ou supérieurs à pH 6, les gels obtenus thermiquement sont

translucides. Ils sont formés d'un réseau de brins, et qualifiés de filamenteux (Langton &

Hermansson, 1992; Ikeda & Morris, 2002). Les zones de jonction de ces gels sont

constituées de quelques molécules dont les liaisons font suite à une agrégation physique. À

des pH inférieurs à pH 4, les brins sont obtenus par un arrangement linéaire des monomères

et sont donc très fins. Le passage d'un réseau filamenteux à un réseau de type particulaire se

fait graduellement avec une augmentation du pH, les brins étant de plus en plus épais

lorsque la valeur du pH avoisine le pH 4. À pH 6, la transition entre gel particulaire (pH 6)

et gel filamenteux (pH 6.05) est immédiate. Les brins les plus fins sont observés à pH 9.

Les gels filamenteux acides ou basiques ont une excellente capacité de rétention d'eau et

sont très élastiques. La capacité élevée de rétention d’eau dans les gels filamenteux peut

être due à la présence de petits pores qui maintiennent l’eau libre par des forces capillaires.

Par contre dans les gels particulaires, la dimension des pores est beaucoup plus importante

conduisant à une expulsion plus grande d’eau libre de la structure du gel. Des travaux

récents réalisés par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (Lefèvre & Subirade,

2000) ont permis de proposer des mécanismes moléculaires rendant compte de la formation

des gels filamenteux et particulaires schématisés sur la Figure 1.4.

33

Figure 1.4: Modèles de mécanisme d’agrégation thermique (Lefèvre & Subirade, 2000)

Les gels filamenteux résultent, dans une première étape, de la dissociation des dimères en

monomères, puis du dépliement des chaînes polypeptiques qui s’associent en filaments

pour enfin conduire à la formation d’un réseau tridimensionnel. Quant à eux, les gels

particulaires résultent de l’association de dimères partiellement dénaturés qui conduit à la

formation d’un gel.

1.2.2.5.2. Gélification à froid

La formation de gels à froid en présence d’ions a été particulièrement étudiée ces dernières

années (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1998; Marangoni et al., 2000;

Totosaus et al., 2002). Ces travaux ont principalement porté sur l’étude de la gélification à

froid par le calcium (ions divalents) de protéines prédénaturées thermiquement (Roff &

Foegeding, 1996; Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1997b;

Hongsprabhas & Barbut, 1998). Cependant il a également été montré que les ions

magnésium et le baryum peuvent induire la formation de gels à froid (Roff & Foegeding,

1996).

34

Des études ont montré que le temps nécessaire pour arriver à une valeur maximale de G’est

approximativement compris entre 30 min et 2 hrs (Barbut & Foegeding, 1993). Les valeurs

de G’obtenues sont inférieures à celles trouvées pour les gels thermiques. De plus, dans le

cas des gels à froid, la fermeté des gels est maximale pour une concentration en calcium de

30 mM alors qu’il suffit de 10 mM dans le cas des gels thermiques (Hongsprabhas &

Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1997b). Contrairement aux gels thermiques, la

fermeté des gels à froid ne diminue pas significativement avec la concentration en calcium

(Hongsprabhas & Barbut, 1997b; Hongsprabhas & Barbut, 1998). Ces informations

suggèrent que le mécanismes de formation des gels thermiques et des gels à froid sont

différents.

Cette stratégie de gélification à froid pourrait être particulièrement intéressante en présence

de fer. En effet, les interactions ioniques entre le fer et les protéines pourraient être

comparables à celles obtenues entre le calcium et les protéines. De plus, le fer peut interagir

avec le groupe –SH des cystéines et les électrons disponibles de l’azote du groupe

imidazole de la chaîne latérale de l’histidine. Ces différentes interactions devraient lui

permettre de former des amas (“clusters”) avec les protéines et en même temps d’être

protégé et transporté par cette structure. Ce type de gels devrait être formé par des liaisons

de faibles énergies sensibles aux conditions environnementales, notamment aux variations

de pH de l’organisme lors d’une administration orale. L’impact de ces variations de pH et

de la présence d’enzymes digestives sur la structure de la matrice devrait conditionner le

transport et la libération du fer.

Pour pouvoir utiliser les gels à froid de β-lactoglobuline formés en présence de fer comme

matrice de transport de ce micronutriment, nous devons connaître les conditions de

35 formation des gels, leurs mécanismes de formation et leur comportement vis à vis des

conditions environnementales. Toutes ces informations nous permettront d’utiliser

potentiellement les gels à froid comme véhicule de transport du fer dans les systèmes

alimentaires et de contrôler sa libération et à terme, sa biodisponibilité .

36

1.3. Hypothèse et objectifs

Tel que présenté dans l’introduction et la revue de littérature, plusieurs travaux mettent en

évidence que le déficit en fer est un problème nutritionnel important dans le monde avec de

fortes conséquences sociaux-économiques. Parmi les solutions envisagées pour pallier ce

problème de santé publique, le développement d’aliments enrichis en fer est actuellement

l’avenue la plus exploitée. Cependant, cette approche ne conduit pas aux résultats

escomptés en raison de la diminution de la biodisponibilité du fer qui est due notamment, à

ses interactions avec les autres nutriments ou à sa réactivité dans les conditions de

préparation des aliments. Dans ce contexte, il est nécessaire de développer des véhicules

alimentaires susceptibles de protéger le fer et de le transporter au niveau de la barrière

intestinale pour optimiser sa biodisponibilité. Les matrices gélifiées ou hydrogels

constituent des supports de choix pour le transport de molécules bioactives et sont

largement exploitées dans le domaine pharmaceutique pour la libération ciblée des

molécules. Dans le domaine alimentaire, les protéines du lactosérum sont utilisées en raison

notamment de leur très bonne aptitude à la gélification. Ces protéines sont susceptibles de

former des gels à froid en présence d’ions divalents. Cette propriété pourrait être exploitée

pour le transport du fer dans sa forme Fe2+ et ainsi améliorer sa biodisponibilité.

1.3.1. Hypothèse

Les travaux de cette recherche viseront donc à valider l’hypothèse suivante : il est possible

de transporter le fer ionique et d’optimiser sa biodisponibilité en le piégeant dans des

matrices protéiques obtenues à froid à partir des protéines de lactosérum prétraitées

thermiquement.

37

1.3.2. Objectifs

L’objectif général de cette thèse est de comprendre le mécanisme de formation des gels à

froid de protéines de lactosérum en présence du Fe2+ et d’étudier l’impact des

caractéristiques des gels sur la libération du fer. Pour atteindre cet objectif, trois objectifs

spécifiques seront poursuivis :

Objectif 1 : Étude de l’élaboration des gels - Cet objectif vise à

étudier les conditions responsables de la gélification à froid de la β-lactoglobuline, protéine

majeure du lactosérum, en présence Fe2+. Plusieurs paramètres pouvant influencer

l’élaboration des gels tels que le pH de la solution, la concentration de protéine, et la

concentration de Fe2+ seront étudiés en relation avec les propriétés macroscopiques et

microscopiques des gels obtenus.

Objectif 2 : Étude des mécanismes de formation des gels - Cet

objectif vise à comprendre les bases moléculaires et structurales de la gélification à froid de

la β-lactoglobuline en présence de Fe2+ et à étudier les interactions responsables de la

formation des gels.

Objectif 3 : Étude des propriétés de libération des gels – Ce

dernier objectif vise à étudier l’impact de la structure des gels sur la libération de fer

ionique dans différentes conditions incluant les conditions du tractus gastro-intestinal et à

caractériser sa diffusion cellulaire par des techniques in vitro.

Au terme de ce travail, nous pourrons conclure en apportant de nouvelles informations sur

les mécanismes de gélification à froid de la β-lactoglobuline en présence de fer et sur le

comportement des gels dans des conditions in vitro qui simulent le système gastro-

38 intestinal. Ce travail permettra également de présenter des perspectives d’utilisation plus

large pour ces matrices protéiques en tant que transporteurs de molécules bio-actives.

Chapitre II

COLD GELATION OF β-LACTOGLOBULIN IN THE PRESENCE OF IRON

The content of this chapter has been published:

Remondetto, G. E.; Paquin , P. & Subirade, M. 2002.

Journal of Food Science. 67(2): 586-595.

40

Abstract

To protect and transport iron, we investigated the trapping properties of a network formed

from β-lactoglobulin. We studied the influence of different parameters—pH, iron, and

protein concentrations—on gel properties (optical and mechanical properties, water-holding

capacity and microstructure). For all conditions tested, the results show the formation of a

cold gel in the presence of iron. The mechanical properties reveal that the elastic behavior

and the strength of rupture increase with higher protein concentrations and decrease with

higher iron concentrations. The water-holding capacity is high for low iron concentrations.

The microstructure shows that, at low iron/protein ratios, a homogeneous filamentous

network is obtained whereas, at high iron/protein ratios, more random aggregated particles

are present.

Keywords: β-lactoglobulin, iron, gel properties, mechanical properties, microstructure

41

Résumé

Afin de protéger et de transporter le fer, nous avons étudié les propriétés de piégeage d’un

réseau formé à partir de β-lactoglobuline en présence de fer. L’impact de différents

paramètres –concentration en fer, concentration en protéine et pH- sur la formation des gels

a été étudié en relation avec les propriétés des gels obtenus (propriétés optiques, propriétés

mécaniques, capacité de rétention d’eau et microstructure). Pour toutes les conditions

testées, les résultats montrent la formation d'un gel à froid en présence de fer. Les

propriétés mécaniques révèlent que le comportement élastique des gels et la force à la

rupture augmentent avec la concentration en protéine et diminuent quand la concentration

en fer augmente. La capacité de rétention d’eau est élevée pour de faibles concentrations en

fer. L’étude microscopique des gels formés révèle que, pour de faibles rapports

fer/protéine, des gels filamenteux, ordonnés sont obtenus alors que, pour des rapports

fer/protéine élevés, des gels particulaires non-homogènes sont formés.

42

2.1. Introduction

Iron deficiency is the world’s most common nutritional disorder. It affects close to 2 billion

people (WHO, 1996; WHO, 1998; The Micronutrient Initiative, 1998). There is clear

evidence of a high prevalence of iron deficiency anemia in developing countries and, to

lesser extent, in the more industrialized parts of the world as well. The population groups

most affected are the preschool and school-age children as well as women of reproductive

age (Hurrell, 1998). Unfortunately, much of the ingested iron is poorly bioavailable

(Hurrell, 1997; Hurrell, 1998), which adds to the difficulties associated with the recovery

and prevention of iron deficiencies. Several concrete and well-defined actions successfully

contribute to the prevention and control of iron deficiency. They include food fortification,

supplementation, dietary improvement, and public health measures. The ideal strategy is to

improve the diet to include a large variety of iron-rich foods and to increase dietary iron

absorption (The Micronutrient Initiative, 1998). However, the iron incorporated into

complex systems such as foods confronts various problems, such as oxidation and

precipitation, resulting in its reduced bioavailability (Wapnir, 1990b; Hurrell, 1997;

Hurrell, 1998; Van Der Meer et al., 1998). For these reasons, the manufacture of food

systems that can effectively transport and protect iron represents a field of growing interest.

Different strategies have been developed to carry and protect bioactive molecules. A

strategy, which has recently been the subject of many studies (Brannon-Peppas, 1993;

Kamath & Park, 1993; Park & Park, 1996), consists of trapping molecules of interest in

networks. This approach has essentially been developed for the biomedical and

pharmaceutical sectors to transport drugs in a biodegradable hydrogel matrix (Park & Park,

1996; Philipon, 1997). Among the different hydrogels, protein gels are of particular

43 interest. Unfortunately, they are generally obtained upon heating a solution above the

denaturation temperature, which results in the deterioration of the thermosensitive

molecules (Kamath & Park, 1993). In the Food industry, the use of protein gels of high

nutritional value constitutes an interesting strategy for the protection of micronutrients such

as iron. Moreover, the presence of amino acids in the intestine is required to increase iron

bioavailability (Prasad, 1978; Wapnir, 1990b; Benito & Miller, 1998). This explains why

food formulations that contain both iron and amino acids are, from a nutritional point of

view, very valuable. A fundamental advantage to this approach is that the carrier gel adds

texture to the food, which constitutes a highly desirable functional property. For these

reasons, the formation of a protein matrix that can trap and protect the micronutrient is a

strategy of potential application in the manufacture of techno-functional foods.

Among the many animal and vegetable proteins, whey proteins, by-products of cheese

manufacture, are extensively used in food products because of their high nutritional value

and their ability to form gels. To induce gelation, whey protein (WP) requires heat

treatments or the addition of a denaturing agent (such as urea) (Xiong & Kinsella, 1990).

Heating protein dispersions causes molecular unfolding, which leads to aggregation and

gelation provided the amount of aggregated protein exceeds the critical concentration.

Drastic changes in the state of the gels can be brought on by small changes in external

conditions (Tanaka 1981). For example, the temperature of gelation, the pH, the gel type,

and the salt concentration all affect the final characteristics of the gels (Clark & Ross-

Murphy, 1987; Mulvihill & Kinsella, 1988; Ziegler & Foegeding, 1990; Boye et al., 1995;

Allain et al., 1999; Lefèvre & Subirade, 2000). Schmidt (Schmidt et al., 1978) found that,

at pH 7, whey protein concentrate (WPC) dispersions formed gels at 7.5% w/v protein,

when heated at 100oC for 10 min and at 5% protein with extended heating periods. With β-

44 lactoglobulin, the main WP (10% w/v, 90oC for 30 min, pH 8) or whey protein isolate

(WPI) (10% w/v, 80oC for 30 min, pH 7) dispersions, gelation will not occur unless salts

(about 5 mmol/L) are added (Kuhn & Foegeding, 1991). When a salt is added, the ions

shield the surface charge to reduce repulsion and facilitate aggregation to particulate gels

(Elofsson et al., 1997). Depending on the type and the concentration of the added salt, the

gels can form a wide range of structures, varying from soft, white, and curdy to translucent,

rubbery and firm (Kuhn & Foegeding, 1991). The pH in gel formation also plays a very

important role. Depending on pH conditions, two types of β-lactoglobulin gels are possible.

In salt-free solutions, gels are transparent above pH 6 and below pH 4. They are composed

of more or less flexible linear strands and are called “fine-stranded.” Between pH 4 and pH

6, gels are opaque. They are characterized by a random association into large and almost

spherical aggregates linked together to constitute the threads of the network. These gels are

called “particulate gels.” Rheological experiments have shown that these gels are less

elastic than fine-stranded ones (Stading & Hermansson, 1991) and their molecular

structures are also different (Lefèvre & Subirade, 2000).

Another protein gelation methodology has been developed by Barbut and Foegeding

(Barbut & Foegeding, 1993) where predenatured WPIs (10% w/v, 80oC for 30 min, pH 7)

will form salt-induced gels with the addition of CaCl2 at 25oC. Other studies have used

BaCl2 with similar results (Roff & Foegeding, 1996). The preheating step is essential to

cause enough molecular alteration in the protein molecules (for example, expose reactive

groups, open the structure), which is necessary for the formation of a network (Barbut &

Foegeding, 1993; Hongsprabhas & Barbut, 1998). The modified protein structures have

been reported to range from dimers to polymers and are MW-dependent and maintained by

disulfide bonds (Wang & Damodaran, 1991; Zhu & Damodaran, 1994; Hongsprabhas &

45 Barbut, 1998). Hongsprabhas and Barbut (Hongsprabhas & Barbut, 1997b) have shown

that WPI suspensions subjected to a preheating step (70oC for 30 min) resulted in opaque

gels, whereas higher preheating (90oC for 30 min) formed translucent gels after the addition

of CaCl2 by dialysis. This is probably due to the creation of low molecular weight (MW)

aggregates, compared to the high-MW aggregates formed at 90oC. Gels formed by

preheating to 70oC exhibited lower water-holding capacity (WHC) than those heated at

90oC. However, it was not clear whether the fine-strand gel structure resulting from

preheating at 90oC was due to a slow aggregation rate, or to differences in the exposed

reactive binding sites on the surfaces of the aggregates (Hongsprabhas & Barbut, 1997a).

Microstructure study confirms that the network formation processes are governed by CaCl2

concentration in the cold-set gelation resulting in different gelation mechanisms

(Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1997b; Hongsprabhas & Barbut,

1998; Hongsprabhas et al., 1999; Hongsprabhas & Barbut, 1999). The WP cold-set gel

exhibited higher gel strengths and water-holding properties compared to a heat-induced gel

produced with the same amount of CaCl2 (10 mM) (Hongsprabhas & Barbut, 1998). Many

recent studies have been essentially carried out in relation to cold gelation in the presence

of calcium, but the mechanism involved in this process remains unclear. In these studies, no

information exists on the iron-mediated cold-gelation. This methodology could prove to be

an interesting strategy to trap, protect and transport iron.

Thus, the objective of this study was to determine the possibility of producing a Fe2+ cold-

gelation of preheated β-lactoglobulin and to identify the influence of protein and iron

concentrations as well as pH values on this process. Such information could provide a

better insight into the mechanism(s) of cold-set gelation of globular protein in the presence

of iron.

46

47

2.2. Materials and Methods

2.2.1. Materials

β-Lactoglobulin was obtained from Davisco International, Inc.(Le Sueur, MN., U.S.A.). It

contained 98.2% protein measured by semi-micro Kjeldahl method (AOAC, 1984) using

N-factor 6.38. Ferrous sulfate (FeSO4) used in this study was of reagent grade (Analar;

BDH Inc., Toronto, Canada).

2.2.2. Room temperature salt-induced gelation

Preliminary studies showed that heat treatment at protein concentration higher than or

similar to 10% produces thermal gelation of β-lactoglobulin. Moreover, pH values lower

than 7 and higher than 9 resulted in aggregation or the gelation of the preheated protein

without the addition of salt. Iron concentrations below 10 or above 40 mM produced

nonauto-support gels. These preliminary studies allowed us to define the range of the

different variables used in this work.

β-lactoglobulin suspensions (9.5 % protein w/v) prepared in double-distilled water at pH 7

were heated at 80 oC for 30 min, then cooled to room temperature (24 oC) lasted 4 h. The

protein suspensions (6 to 9% protein w/v), adjusted to different pH values (7 to 9), were

mixed by vortexing with different volumes of a 1 M solution of FeSO4 (10 to 40 mM) at 24

oC.

2.2.3. Experimental design

The interactive effect of Fe2+ concentrations (10 to 40 mM), protein (6 to 9% w/v), and pH

(7–9) were investigated. A Box-Behnken experimental design was employed (Mason et al.,

48 1989). This design can be considered a particular fraction of the 33 factorial that allows the

estimation of all first-order and two-factor interaction terms and pure quadratic effects (Box

& Draper, 1987). The design consisted of 16 experimental points performed in random

order. The measured responses were: color parameter, strain rupture, stress rupture,

relaxation (300 s), and water-holding properties. Values of the variables corresponding to

the levels of the experimental design are shown in Table 2.1.

2.2.4. Statistical analysis

Results from the Box-Behnken design were analyzed by multiple regressions to fit the

following second-order equation to all dependent variables (for example, L parameter, a

parameter, elastic constant, rupture strain, rupture stress, relaxation (300 s) and water-

holding properties):

jn

iiij

n

iiii

n

iii XXbXbXbbY ∑∑∑

===+++=

11

2

10

where b0, bi, bii, and bij are constant regression coefficients of the model and Xi, Xj are the

independent variables (protein concentration, iron concentration and pH). A second-order

model, which included both the interactive and quadratic effects, provided a better

description of geometric shape of the response surface. Statgraphics Plus Professional V 4.1

(Manugistics Inc., Rockville, Md., U.S.A.) was used for all analyses.

2.2.5. Color measurements

The surface reflectance of prepared gels (on 20 mm-high and 25 mm-wide samples) was

measured with a Minolta Chroma Meter CR-200 (Minolta Camera Co. Ltd., Osaka, Japan)

using the CIE color system (CIE, 1996) to determine the color parameters L* = whiteness,

49 a* = green to red, and b* = yellow to blue. For each gel, L* and a* values were recorded in

triplicate from 5 samples.

2.2.6. Mechanical assays

Mechanical assays were carried out using a Texture Analyzer TA-XT2 (Stable Micro

Systems, Texture Technologies Corp., Scarsdale, N.Y., U.S.A.). Cylindrical gels (diameter:

25 mm, height: 20 mm) were placed between a stationary bottom plate and a moving upper

plate (10 mm/min); the plates were sprayed with a silicone lubricant to minimize friction.

The samples were axially compressed to 80% of their original height. The elastic constant

of gels was determined as the slope of the stress-strain curve in the initial linear range. Both

the rupture stress and the rupture strain were determined from the first point of inflection in

the stress-strain curve (Hamann, 1983; Tang et al., 1994).

Assuming that the specimens were essentially incompressible, the stress was calculated as:

LrLLF

2

)(π

σ ∆−=

where F is the compressive force, L is the original sample length, ∆L is the difference at the

corresponding deformation and r is the original radius (Tang et al., 1994).

The strain was calculated as Hencky strain (ε) (Hamann, 1983; Tang et al., 1994) using the

equation:

⎥⎦⎤

⎢⎣⎡ ∆

−−=LL1lnε

50

Results represent the average value for a minimum of 2 determinations for each of the 5

replicate gel preparations.

2.2.7. Relaxation test

Stress relaxation tests were performed with a Texture Analyzer TA-XT2 (Stable Micro

Systems, Texture Technologies Corp., Scarsdale, N.Y., U.S.A.). The samples (diameter: 25

mm, height: 20 mm) were subjected to a 5% deformation. The relaxation was evaluated

during 300 s. Results represent the average values for a minimum of 2 determinations for

each of the 5 replicate gel preparations.

According to the method of Peleg and Normand (Peleg & Normand, 1983), the

experimental stress relaxation curves are first normalized and linearized with:

( )( ) ( ) tkkt

t ⋅+=−⋅

2100σσ

σ

where σ (0) is the initial stress, σ (t) is the decaying stress after time t, and k1 and k2 are

constants. According to this equation, the reciprocal of k1 depicts the initial decay rate and

the reciprocal of k2 represents the hypothetical asymptotic level of the normalized

relaxation parameter. k2 represents the degree of solidity and varies between the value of k2

=1 for a material that is truly a liquid ( where all the stress relaxes) to k2 → ∞ for an ideal

elastic solid, where the stress does not relax at all (Peleg & Normand, 1983). Results

represent the average value for a minimum of 2 determinations for each of the 5 replicate

gel preparations.

51

2.2.8. Water-holding capacity

The water-holding capacity (WHC) was examined using a modified method of Kocher and

Foegeding (Kocher & Foegeding, 1993). Protein gels were formed in an ultrafiltration unit

(Millipore, Ultrafree-CL Filters, Yonezawa-shi, Yamagata-ken, Japan) consisting of a tube

(5 mL) and an inner tube (2 mL) with an ultrafiltration membrane of 5,000 NMWL

(nominal molecular weight limit). After 24 h, the unit was centrifuged at 4,000 g for 20

min. WHC was calculated as:

WHCW W

PT F=

−× 100

where WT is total quantity (g) of water in the sample, WF is quantity (g) of water released,

and P is the total grams of protein in the sample. Results represent the average value for a

minimum of 2 determinations for each of the 5 replicate gel preparations.

2.2.9. Scanning and transmission electron microscopy

Two different microscopy techniques were used to study the gels: transmission electron

microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). Briefly, each sample (1x 1 x

2 mm) was fixed in 2% glutaraldehyde + 1% paraformaldehyde in 0.1 M PIPES buffer at

pH 7 for 6 h, rinsed, postfixed in 1% OsO4 overnight, and dried in a graded series of

ethanol. For TEM, the samples were embedded in Epon, thinly sectioned, stained with

uranyl acetate and lead acetate. Samples were viewed at 80 kV using a JEOL 1200EX

(JEOL Ltd., Akishima, Japan ) instrument. For SEM, each sample was critical-point-dried,

sputter-coated with 30 nm of gold/palladium. Samples were viewed at 15 kV using a JEOL

JSM 35CF instrument. The samples were analyzed using an SEM system combined with

52 EDS, also known as energy-dispersive X-ray analysis (EDXA) of Noran Instruments

(Middleton, WI., U.S.A.).

53

2.3. Results and discussion

2.3.1. Statistical analysis

Table 2.2 shows the data obtained for the light reflectance parameters (“L” and “a”), the

elastic constant, the rupture stress and rupture strain, the relaxation, the K2 parameter, and

the water-holding capacity. Table 2.3 displays the analysis of variance for each response.

Table 2.4 shows the regression coefficients of the model for the response analyses, with

these coefficients a second order polynomial equation (Equation 2.1) is obtained that

describes the evolution of each response as a function of the independent variables of the

model.

Equation 2.1

Y b b X b X b X b X X b X X b X Xb X b X b X

= + ⋅ + ⋅ + ⋅ + ⋅ ⋅ + ⋅ ⋅ + ⋅ ⋅

+ ⋅ + ⋅ + ⋅0 1 1 2 2 3 3 12 1 2 13 1 3 23 2

11 12

22 22

33 32

3

where b0, b1, b2, b3, b12, b13, b23, b11, b22 and b33 are constant regression coefficients of the

model, and X1, X2 and X3 are the independent variables (protein concentration, iron

concentration, and pH). Each model can describe the interrelationship of the response

evaluated with the variables. In all cases, the lack of fit is not significant and the total

regression is significant (p ≤ 0.05).

2.3.2. Light reflectance and color analysis

The analysis of variance of the L* parameter of light reflectance is presented in Table 2.3;

it shows that the significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear and the quadratic of the iron

concentration, the linear of the protein concentration, and cross-product of the iron

concentration with the protein concentration, suggesting that these factors play an important

54 role on L* parameters. The linear, quadratic, and cross-product terms in the second-order

polynomial were used to generate 3-dimensional response surface graphs presented in

Figure 2.1. Internal L* values show that gel opacity increases as a function of iron

concentration in the range 10 to 30 mM, protein concentration in the range 6 to 9%, and

their interactions, indicating that these variables determine the increment in aggregate size.

This suggested that both factors resulted in large aggregate formation within the gel

network. Barbut (Barbut, 1995) showed that increasing [CaCl2] from 10 to 150 mM in 10%

WPI suspensions progressively increased protein strand size, and later aggregate size, as

determined by SEM and TEM; a similar trend of increasing gel opacity was also reported.

Iron addition to the preheated 6% β-lactoglobulin suspensions resulted in the formation of

gels with lower L* values compared to those obtained with higher protein concentrations

(Figure 2.1). This indicates that a finer protein strand network was formed at lower protein

concentration. The fine-strand gel network is usually the result of less aggregation and a

higher order in the gel structure (Hongsprabhas & Barbut, 1997b).

The analysis of variance of the a* parameter in Table 2.3 shows that the significant terms (p

≤ 0.05) are: the linear of the iron concentration, the quadratic of the pH, the cross-product

of the iron concentration with the pH, and also the cross-product of the iron concentration

with the protein concentration. It is important to note that the significant terms (p< 0.01)

include the pH, suggesting that this variable plays a very decisive role in this response.

Figure 2.2 shows the response surface graph for the a* values. On one hand, this parameter

increases with the iron concentration at pH 7 and diminishes with higher iron

concentrations at pH 9, with a maximum near pH 8.5. In this particular case, the gel color

can be related to iron oxidation state. It is known that a solution of iron (II) salt is pale

55 green, whereas a solution of iron (III) salt is usually reddish-brown (Melnick, 1962). With

excess alkali (pH ≥ 9), the ferrous solution is oxidized to a dark green oxyhydroxide

compound (Gallais, 1950). The established relationship between the state of iron oxidation

and gel color suggests that the a* value could be used as an indicator of the changes of

oxidation state of the iron inside the gel matrix. The iron oxidation state is also related to

the pH of the medium (Gallais, 1950). Consequently, the changes in the pH, which produce

a variation in the iron oxidation state, modify the color of the gel and thus induce a change

in a* value. This could explain the significance of the crossed product between the iron

concentration and the pH of the statistical model. On the other hand, the a* value

diminishes with higher protein concentrations, suggesting that protein concentration

protects the iron (II) state from the oxidation. From these results, it can be concluded that

certain conditions, such as pH values between 7 to 8 and high protein concentrations, favor

the prevalence of the iron (II) state. Nutritionally speaking, this point is very important,

since iron (II) has been shown to be highly bioavailable (Prasad, 1978; Hurrell, 1997).

2.3.3. Mechanical assays

The behavior of compressed foods is one of the easiest and most important mechanical tests

to perform. The slope of the initial straight-line portion of the test constitutes the elastic

modulus or the apparent Young’s modulus and characterizes the elastic behavior of the

material (Tang et al., 1994; Hongsprabhas & Barbut, 1998; Marangoni et al., 2000).

The analysis of variance of the elastic constant in Table 2.3 shows that the significant terms

(p ≤ 0.05) are: the linear of the iron concentration, the protein concentration and pH, the

quadratic of the protein concentration, and the cross-product between the iron concentration

with the pH. Figure 2.3 displays the response surface graph, which shows that the elastic

56 constant increases with protein concentration and with decreasing iron concentration.

Moreover, the polynomial equation (Table 2.4) shows that the elastic constant decreases

with the pH. The effect of the pH suggests that the electrostatic interactions play an

important role in the consolidation of the gel structure.

The analysis of variance of the rupture stress, presented in Table 2.3, shows that the

significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear of the iron concentration, the protein

concentration, and the pH; the quadratic of the iron concentration and the protein

concentration; and the cross-product terms of iron concentration with pH and of iron

concentration with protein concentration. Figure 2.4 displays the response surface graph. It

can be observed that rupture stress increases with protein concentration, and decreases with

iron concentration. Moreover, the polynomial equation (Table 2.4) has shown that the

rupture stress decreases with higher pH values, suggesting that the electrostatic interaction

play an important role in the consolidation of the gel structure. These results show that

rupture stress is more important at higher protein concentrations, at lower iron

concentrations, and at pH 7, suggesting that in these conditions there are greater

interactions between the molecules or particles that form the network.

Table 2.3 presents the analysis of variance of the rupture strain. This analysis shows that

the significant terms (p ≤ 0.05) are the linear and the quadratic of the iron concentration, the

linear protein concentration, and the cross-product between iron concentration and protein

concentration. The main effects plots for this response (not shown) shows that rupture

strain decreases when the iron concentration increases. This indicates that the rupture strain

is more important at low iron concentrations. Errington and Foegeding (Errington &

Foegeding, 1998) have reported that an increment in the rupture strain is related to an

57 increase in the rubber behavior of proteins gels. It is then possible to associate a rubber

behavior of the protein gels to low iron concentrations.

The relaxation can be interpreted as an index of the elastic behavior of the material. A

relaxation of 0% is characteristic of a Hooke solid-like behavior (absolutely elastic

behavior) while a relaxation of 100% is characteristic of liquid-like behavior. Analysis of

this response shows that the significant terms (p ≤ 0.05) are the linear and the quadratic of

the iron concentration, and the linear protein concentration. Figure 2.5 displays the

response surface graph. Relaxation diminishes when the protein concentration increases.

Moreover, it increases with iron concentration until a maximum of 30 mM and then

decreases. These results indicate that the elastic behavior of the material is higher with low

iron and high protein concentrations.

According to the method Peleg and Normand (Peleg & Normand, 1983), the determination

of the k2 parameters results in regression coefficients (R2) that exceed 0.99. Table 2.3

displays the analysis of variance using the k2 parameters. This analysis shows that the

significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear and the quadratic of the iron concentration, and

the linear of the protein concentration. Figure 2.6 displays the response surface graph. It

shows that the elasticity (evaluated for k2) increases with higher protein and lower iron

concentrations; this behavior is similar to that obtained for the elastic constant (Figure 2.3).

These results demonstrate that the elastic behavior of the material is essentially influenced

by the iron and protein concentrations.

58

2.3.4. Water-holding capacity

The analysis of variance of the water-holding capacity (WHC) in Table 2.3 shows that the

significant terms (p ≤ 0.05) are: the linear and the quadratic of the iron concentration and

the linear of protein concentration. Figure 2.7 displays the response surface graph. It is

observed that the WHC diminishes with increasing iron and protein concentrations. Higher

protein concentrations seem to induce the expulsion of the water due to an increase of

molecular interaction. Moreover, the observed decrease of WHC with higher iron

concentrations suggests that the latter plays a very important role in the network formation

process.

2.3.5. Microstructure analysis

We have selected different conditions to study microstructures with electronic microscopy

(TEM and SEM). Four samples were produced at pH 7 at two protein concentrations (6 and

9%) and at two levels of iron concentrations (10 and 30 mM ). Three samples (6% protein

and 10 mM iron) were produced at pH 7, 8, and 9.

Figure 2.8 displays TEM micrographs of the four samples analyzed, selected at pH 7.

Figure 2.8a shows the TEM micrograph of a gel with a 6% protein concentration and 10

mM iron concentration. This gel has a homogeneous structure of evenly sized particles and

pores. Figure 2.8b shows the TEM micrograph of a gel with the same protein concentration

(6%) but with 30 mM iron concentration. This gel has a nonhomogeneous structure with

large pores. Figure 2.8c shows the TEM micrograph of a gel with a 9% protein

concentration and a 10 mM iron concentration. This gel presents a homogeneous structure

similar to the one observed in the Figure 2.8a. However, it exhibits a higher density and has

59 smaller pores, mainly due to the increase in protein concentration. Figure 2.8d is the TEM

micrograph of a gel with a 9% protein concentration and 30 mM iron concentration. This

micrograph presents a nonhomogeneous characteristic, with an elevated density due to the

protein concentration and the large pores, which is smaller than in Figure 2.8b. These

results show that increasing protein concentration from 6 to 9% resulted in an elevated gel

density, which, in turn, resulted in a decrease in pore size. An increase in iron concentration

from 10 to 30 mM leads to a decrease in gel homogeneity and an increase in the irregularity

and in pore size.

Figure 2.9 displays SEM micrographs of the 4 analyzed samples selected at pH 7. Figure

2.9a shows the SEM micrograph of a gel with a 6% protein concentration and a 10 mM iron

concentration. This gel has a filamentous structure with large pores. Figure 2.9b presents

the SEM micrograph with a 6% protein concentration but with a 30 mM iron concentration.

This gel has a nonhomogeneous structure of random aggregates with large and irregular

pores. Figure 2.9c displays the SEM micrograph of a gel with a 9% protein concentration

and a 10 mM iron concentration. This gel presents a filamentous structure similar to that

observed in Figure 2.9a. However, it has a more compact structure and smaller pores,

mainly due to the increase in protein concentration. Figure 2.9d is the SEM micrograph of

gels with a 9% protein concentration and a 30 mM iron concentration. This gel presents a

nonhomogeneous structure of random aggregates with large and irregular pores. In this

condition, the aggregates are bigger than in the “2.9b” condition (6% protein concentration

and a 30 mM iron concentration) possibly due to elevated protein concentration. SEM

clearly shows 2 types of gels; one that exhibits chains, forming a true 3-dimensional and

filamentous network (Figures 2.9a and 2.9c), and another having the characteristic of a

structure formed by a random aggregation (Figures 2.9b and 2.9d). The images show a

60 greater number of open microstructures (large pores) when the protein concentration is low

(Figure 2.9a) and greater structure compactness when the protein concentration is high

(Figure 2.9c). Moreover, according to our analysis, increasing the iron concentration from

10 to 30 mM changes the gel structure from filamentous to random aggregates. These

results are obtained by comparing gels with the same protein concentration, this is why we

consider more convenient to establish the analysis as a function of the [iron] / [protein]

ratio. This ratio indicates that, at elevated values (higher iron concentration for protein

molecules), the gel exhibits random aggregation and, at lower values, the gel is more

filamentous and compact.

Figure 2.10 displays TEM and SEM micrographs of the 3 analyzed samples with a 6%

protein concentration, 10 mM iron concentration, and different pH values. Figures 2.10a

and 10b, respectively, show TEM and SEM micrographs of a gel at pH 7. These

micrographs display a homogeneous structure with filamentous characteristics. Figures

2.10c and 10d present, respectively TEM and SEM micrographs of a gel at pH 8. TEM

(Figure 2.10c) does not reveal significant differences with Figure 2.10a. SEM (Figure

2.10d) reveals structure contraction with the formation of needles and the loss of continuity

in the network. These characteristics are intensified at pH 9, they are displayed in

micrograph Figure 2.10e and Figure 2.10f.

The studies carried out with SEM-EDS in the different regions of each gel ensure that the

iron distribution is homogeneous and suggests that the irregularities observed previously

are due to different organizational conformations of the protein molecules alone.

61

2.4. Discussion

In the previous section, it was shown that preheated β-lactoglobulin suspensions could form

gels at room temperature (24oC) by the addition of Fe2+. Results indicate that the

characteristics of cold-set gels in the presence of iron can be modified by changes in the

pH, the protein and /or iron concentration. The data obtained—L* parameter, mechanical

behavior, water-holding capacity, and microstructure characteristic—for Fe2+-induced cold

gels of β-lactoglobulin show similarities with those obtained in different studies for Ca2+-

induced cold gels, suggesting that the mineral-protein interactions are of similar nature, that

is, mainly electrostatic (Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Hongsprabhas & Barbut, 1998;

Bryant & McClements, 1998; Bryant & McClements, 2000a; Marangoni et al., 2000). This

type of interaction is reversible and can be modulated by environmental conditions (Kyte,

1995).

Moreover, data analysis reveals different types of gels. When iron/protein ratios are low

and the pH value is close to 7, gels are homogeneous and filamentous and are characterized

by an elastic behavior and a high resistance to rupture. These results suggest that strong

particle-particle interactions occur. Moreover, the gel opacity is low (low L* parameter)

indicating small aggregate size, in accordance with other mineral-protein systems

(Hongsprabhas & Barbut, 1997a; Marangoni et al., 2000). The study of the a* parameter

shows that these conditions favor the prevalence of Fe2+. Moreover, the high WHC, due to

the high capillary force (Hongsprabhas & Barbut, 1998), and the low L* parameter, due to

small aggregate size, are indicative of a compact matrix structure with low size of inner

structure space. This could affect iron retention.

62

However, when iron/protein ratios are high and pH values are above 7, gels are

nonhomogeneous with random aggregation and are characterized by lower elastic behavior

and rupture resistance. This suggests that weak particle-particle interactions occur.

Moreover, they have a lower water-holding capacity due to larger and less homogeneous

pore sizes (Barbut, 1995; Hongsprabhas & Barbut, 1998), leading to a less pronounced

elastic behavior of the gels (Tanaka, 1981). Recently Katzhendler and others (Katzhendler

et al., 2000) showed a correlation between the elasticity and gel strength and release

kinetics from proteineous matrices, indicating that the matrices are more elastic and with

higher gel strength retain more strongly the trapped molecules. This information suggests

that the retention of Fe2+ would be less important in the randomly aggregated gels than that

of filamentous gels.

Moreover, the macroscopic properties reveal that, at intermediate iron/protein ratios,

filamentous and random aggregate structures are mixed together. An increase in iron

concentration involves changes in the structure from fine-stranded to random aggregates,

with a concomitant decrease in gel strength, elasticity, and WHC. This suggests that the

iron concentration can control the macroscopic properties of β-lactoglobulin gels.

These results corroborate those obtained by Doi (Doi, 1993) for thermal gelation of

globular proteins such as β-lactoglobulin. The same study also showed that the 2 types of

gel, random aggregates or fine-stranded, are formed depending on the environmental

conditions and showed that an increase in ionic strength is not only accompanied by a

change in the structure from fine-stranded to random aggregates, but by a decrease in gel

strength as well. These results show strong similarities between cold and thermal gelation

of β-lactoglobulin.

63

Moreover, we saw in preliminary experiments that, in the first step of cold-gelation, before

the addition of cation, β-lactoglobulin could form a gel when the protein concentration

reached a limit concentration (10%), which the critical concentration requires to form a gel

matrix (Ross-Murphy, 1991; Foegeding et al., 1999). Consequently, cold and heat gelation

could be intimately related. When the protein concentration is below the critical

concentration, the heat-denatured proteins aggregate upon the addition of cation, while

when the protein concentration is over the critical concentration, the unfolded molecules

aggregate spontaneously and form a 3-dimensional network.

64

2.5. Conclusion

Preheated β-lactoglobulin suspensions can form gels at room temperature (24°C) by the

addition of Fe2+ in all conditions used. The mechanical properties reveal that the elastic

behavior and the strength of rupture increase with higher protein concentration and

decrease wit higher iron concentrations. The water-holding capacity is high for low-iron

concentrations. The microstructure shows that, at low iron/ protein ratios, a homogeneous

filamentous network is obtained, whereas at high iron/ protein ratios, more random

aggregated particles are present.

Different experiments are being conducted to study the formation of gels in the presence of

iron at a molecular level. Recently, using Fourier transform infrared spectroscopy, we

showed molecular differences in the formation and structure of fine-stranded and

particulate hear-induced β-lactoglobulin gels (Lefèvre & Subirade, 2000). This technique

should allow for greater insights into the formation of cold and thermal β-lactoglobulin gels

in the presence and absence of iron.

Acknowledgments

The authors acknowledge Hélène Chamberland and Aristide Pusterla for their collaboration

in electronic microscopy; and Louise Tremblay and Anne-Françoise Allain for their

technical assistance. They also thank the NSERC industrial chair and industrial partners

(Agropur, Novalait Inc. and Parmalat-Canada) for their financial support.

65

Table 2.1: Coded and uncoded level combinations for a 3-variable in Box-Behnken model for β-lactoglobulin gelation.

Variables

Protein concentration

[%]

Iron concentration

(Fe2+)

[mM]

pH Treatement*

Coded

X1

Uncoded

[P]

Coded

X2

Uncoded

[Fe]

Coded

X3

Uncoded

pH

1 -1 6 1 40 0 8

2 1 9 -1 10 0 8

3 0 7.5 -1 10 -1 7

4 0 7.5 1 40 1 9

5 0 7.5 1 40 -1 7

6 0 7.5 0 25 0 8

7 -1 6 -1 10 0 8

8 1 9 0 25 1 9

9 0 7.5 -1 10 1 9

10 -1 6 0 25 -1 7

11 0 7.5 0 25 0 8

12 0 7.5 0 25 0 8

13 -1 6 0 25 1 9

14 1 9 0 25 -1 7

15 0 7.5 0 25 0 8

16 1 9 1 40 0 8

* The experimental runs were performed in a random order

Table 2.2: Results of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, ruture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC) for each condition of experimental design.

Treatment L* a*Elastic Constant

[Pa]

Rupture Stress

[Pa] Rupture Strain

Relaxation

% K2

WHC

%

1 66.05 2.72 1125 2325 0.19 69.1 1.38 89.1

2 43.29

2.65 26964 25262 0.57 47.3 1.87 90.2

3 28.97 0.2 58991 32800 0.63 50.0 1.77 90.4

4 66.06 -2.69 19063 6126 0.11 62.9 1.51 88.6

5 72.08 2.65 8556 731 0.18 66.7 1.46 88.3

6 69.17 4.08 15607 8705 0.13 65.7 1.47 89.6

7 25.34 5.37 16797 14470 0.98 51.1 1.78 92.3

8 66.93 1.5 19819 1161 0.21 59.8 1.57 89.3

9 31.21 4.89 5227 6037 0.77 50.0 1.77 91.0

10 66.35 4.09 5415 8638 0.15 69.5 1.38 89.0

11 71.78 2.81 26738 9335 0.10 65.4 1.49 89.5

12 69.52 3.41 21878 9100 0.11 68.6 1.39 89.1

13 66.35 2.08 1056 496 0.29 64.1 1.50 89.4

14 73.72 2.49 22553 10675 0.18 60.8 1.57 88.0

15 71.59 3.03 20897 7500 0.17 67.2 1.43 89.2

16 62.34 4.08 12203 1595 0.14 65.8 1.47 87.8

67

Table 2.3: Analysis of variance of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC).

Sums of squares Source of

variation Degrees of freedom L* a* Elastic

Constant Rupture

Stress Rupture Strain Relaxation K2 WHC

X1: [Protein] 1 6.15 10 * 1.56 4.08 108 * 2.03 107 * 3.25 10-2 * 4.99 10 * 2.29 10-2 * 2.58 **

X2: [Iron] 1

2.37 10 **3 5.04 * 5.62 108 * 5.74 108 ** 6.78 10-1 ** 5.46 102 ** 2.32 10-1 ** 1.28 10 **

X3: pH 1 1.39 10 1.66 3.17 108 * 1.90 108 ** 7.20 10-3 1.28 10 4.12 10-3 8.45 10-1

X1 . X1 1 6.26 2.72 3.15 10 *8 1.54 107 * 1.62 10-2 5.09 3.17 10-3 5.17 10-2

X1 . X2 1 1.17 10 **2 4.16 * 2.07 105 3.32 107 * 3.24 10-2 * 7.84 10-2 5.52 10-6 1.93 10-1

X1 . X3 1 1.15 10 2.60 10-1 6.60 105 4.71 105 3.02 10-3 4.90 3.22 10-3 1.98 10-1

X2 . X2 1 1.60 10 **3 8.19 10-1 1.40 107 7.11 107 ** 3.11 10-1 ** 2.11 102 ** 8.69 10-2 ** 1.30 *

X2 . X3 1 1.70 10 2.51 10 ** 1.03 109 ** 2.58 108 ** 1.10 10-2 3.49 8.52 10-4 1.82 10-2

X3 . X3 1 3.43 1.04 10 ** 1.46 105 8.45 106 1.06 10-3 1.67 10 3.77 10-3 4.79 10-1

Lack of fit 3 4.74 10 2.68 1.95 108 1.03 107 2.37 10-2 1.12 10 8.09 10-3 7.82 10-1

Error 3 5.55 9.29 10-1 6.24 107 1.99 106 2.87 10-3 6.85 5.94 10-3 1.98 10-1

Total (corr.) 15 4.25 10 3 5.54 10 2.90 109 1.18 109 1.12 8.68 10 2 3.71 10-1 1.95 10

R2 98.75 93.48 91.14 98.95 97.61 97.91 96.21 94.97

* p < 0.05 ; ** p < 0.01.

68

Table 2.4: Regression coefficients of L* parameter, a* parameter, elastic constant, rupture stress, rupture strain, relaxation, k2 parameter and water-holding capacity (WHC).

Regression

Coeffs. L* a* Elastic Constant Rupture Stress Rupture Strain Relaxation K2 WHC

b0 -2.48 102 -8.83 10 5.32 104 -7.11 103 3.05 -7.06 10 3.41 7.81 10

b1 2.52 10 -8.28 6.15 104 1.91 104 -4.21 10-1 -2.03 10-1 5.30 10-4 -1.05

b2 8.50

1.04 -9.62 103 -4.82 103 -8.33 10-2 2.61 -5.15 10-2 -2.48 10-1

b3 2.54 10 2.83 10 -3.20 104 6.69 103 -5.00 10-3 2.74 10 -3.5110-1 4.86

b1 . b1 -5.56 10-1 3.66 10-1 -3.94 103 -8.72 102 2.83 10-2 -5.02 10-1 1.25 10-2 -5.05 10-2

b1. b2 -2.41 10-1 4.53 10-2 1.01 10 -1.28 102 4.00 10-3 6.22 10-3 -5.22 10-5 9.77 10-3

b1 . b3 -1.13 1.70 10-1 2.70 102 -2.28 102 -1.83 10-2 7.38 10-1 -1.89 10-2 1.48 10-1

b2 . b2 -8.89 10-2 -2.01 10-3 8.31 1.87 10 1.23 10-3 -3.22 10-2 6.55 10-4 2.54 10-3

b2 . b3 -1.37 10-1 -1.67 10-1 1.07 103 5.35 102 -3.50 10-3 -6.23 10-2 9.73 10-4 -4.50 10-3

b3 . b3 -9.26 10-1 -1.62 -1.91 102 -1.45 103 1.62 10-2 -2.04 3.07 10-2 -3.46 10-1

Protein [%] Iron [mM]

L*

6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 10 15 20 25 30 35 4023334353637383

Figure 2.1: Response surface graph of the light reflectance (L*) (pH 8)

70

Iron [mM] pH

a*

10 15 20 25 30 35 40 7 7.5 8 8.5 9-2.5

-0.5

1.5

3.5

5.5

Figure 2.2: Response surface graph of the a* parameter ([Protein]= 7.5 %)

71

Protein [%] Iron [mM]

Elas

tic c

onst

ant [

Pa]

66.577.588.5910152025303540

0

1

2

3

4

(X 10000)

Figure 2.3: Response surface graph of the elastic constant (pH 8)

72

Protein [%] Iron [mM]

Rup

ture

stre

ss [P

a]

6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 10 15 20 25 30 35 40048

12162024

(X 1000)

Figure 2.4: Response surface graph of the rupture stress (pH 8)

73

Protein [%] Iron [mM]

Rel

axat

ion

[%]

6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 1015202530354047515559636771

Figure 2.5: Response surface graph of the relaxation (pH 8)

74

Protein [%] Iron [mM]

K2

66.577.588.59 10152025303540

1.31.41.51.61.71.81.9

Figure 2.6: Response surface graph of the k2 parameter (pH 8)

75

Protein [%] Iron [mM]

WH

C [%

]

66.577.588.59 10152025303540

88

89

90

91

92

Figure 2.7: Response surface graph of the water-holding capacity (WHC) (pH 8)

76

ba

dc

1µm

Figure 2.8: Transmission electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin

prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% protein (b); 10

mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d).

77

a b

c d

1µm

Figure 2.9: Scanning electron micrographs of Fe-induced cold gels of β-lactoglobulin

prepared at pH 7 with: 10 mM iron and 6% protein (a); 30 mM iron and 6% f protein (b);

10 mM iron and 9% protein (c); 30 mM iron and 9% protein (d).

78

a b

dc

1µm

f e

Figure 2.10: Transmission (TEM) and scanning (SEM) electron micrographs of Fe-induced

cold gels of β-lactoglobulin prepared with a 10 mM iron concentration and a 6% protein

concentration at pH 7, TEM (a); pH 7, SEM (b); pH 8, TEM (c); pH 8, SEM (d); pH 9,

TEM (e); pH 9, SEM (f).

Chapitre III

MOLECULAR MECHANISMS OF FE2+-INDUCED β-LACTOGLOBULIN COLD GELATION

The content of this chapter will be published:

Remondetto, G. E. & Subirade, M. 2003.

Biopolymers. In press.

80

Abstract

To get more insight into the mechanisms of cold gelation of β-lactoglobulin (β-lg),

macroscopic and molecular structural changes during Fe2+-induced gelation of β-lg were

investigated using Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy and rheological

methods. The FT-IR spectroscopy results show that, upon the preheating treatment (first

step of gel process), native globular proteins are denatured and aggregated molecules are

found in solution. The spectra are similar to those of gels obtained in the second step of the

process upon incorporation of Fe, which suggests that aggregated molecules formed during

the preheating treatment constitute the structural basis of the aggregation. However, the

rheological data show that the aggregation is achieved via two molecular mechanisms, both

of which are modulated by the iron concentration. At 30 mM of iron, gel formation is

essentially controlled by van der Waals interactions, while at 10 mM of iron, hydrophobic

interactions predominate. At the two concentrations, disulfide bonds contribute to gel

consolidation, the effect being more pronounced at 10 mM of iron. These mechanisms lead

to the formation of gels of different microstructures. At the highest iron concentration, a

strong and rapid decrease in the repulsion forces is produced, resulting in random

aggregation. At the lowest iron concentration, the iron diminishes the superficial charge of

both molecules and aggregated molecules, facilitating the interaction among hydrophobic

regions and leading to the growth of the aggregation in the preferential direction and to

filamentous gel formation. This study provides a comprehensive view of the different

modes of gelation.

81

Keywords: β-lactoglobulin, cold gelation, Fourier transform-infrared spectroscopy,

rheology.

82 Résumé

Les mécanismes de gélification à froid de β-lactoglobuline (β-lg) en présence du fer ont été

étudiés à l’échelle moléculaire par spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FT-

IR) et à l’échelle supramoléculaire par rhéologie. Les résultats de spectroscopie FT-IR

montrent qu’après le pré-traitement thermique (première étape du processus de

gélification), les protéines globulaires natives sont dénaturées et des agrégats moléculaires

sont formés en solution. Les spectres sont identiques à ceux des gels obtenus dans la

deuxième étape du processus après l’incorporation du Fe2+, suggèrant que les agrégats

moléculaires formés après le pré-traitement thermique constituent l’unité de base de

l'agrégation. Cependant, les données de rhéologie montrent que la gélification résulte de

deux mécanismes moléculaires modulés par la concentration en fer. À 30 mM de fer, la

formation du gel est essentiellement contrôlée par des interactions de van der Waals, alors

qu’à 10 mM de fer, les interactions hydrophobes prédominent. Pour ces deux

concentrations, les ponts disulfure contribuent à la consolidation du gel, l'effet étant plus

prononcé à 10 mM de fer. Ces mécanismes conduisent à la formation de microstructures

différentes. Pour la plus forte concentration en fer, une baisse rapide dans les forces de

répulsion est produite, entraînant une agrégation aléatoire. Alors que pour la plus basse

concentration en fer, le fer diminue la charge superficielle des molécules et des agrégats

moléculaires, facilitant l'interaction des régions hydrophobes et favorisant l'agrégation dans

une direction préférentielle conduisant à la formation des gels filamenteux. Cette étude

fournit une vue complète des différents modes de gélification.

83

3.1. Introduction

Gelation of globular proteins has attracted much attention over the years, because of its

physical and industrial significance (Clark & Ross-Murphy, 1987; Clark, 1998; Nishinari,

2000) The gelation of β-lactoglobulin (β-lg), the most abundant protein in whey, has been

the subject of several studies because of the major interests it holds for the food industry.

The β-lg can form three-dimensional gel networks when subjected to alkaline conditions or

heat treatments. The thermal gels are produced from the unfolding of the polypeptide

chains with a concomitant exposure of initially buried hydrophobic residues, and from the

subsequent self-aggregation of the protein molecules (Mulvihill & Kinsella, 1988;

Aguilera, 1995). Forces involved in the aggregation process are van der Waals, electrostatic

and covalent interactions, hydrophobic effects, and hydrogen bonding (Ziegler &

Foegeding, 1990). In salt-free solutions, β-lg forms two gel types called “fined stranded”

and “particulate” with different rheological and microstructural properties that vary with

respect to pH conditions (Stading & Hermansson, 1990; Stading & Hermansson, 1991).

Opaque particulate gels are obtained at pH near the pI of β-lg (pI 5.2) and transparent fine-

stranded gels occur at more extreme pH values. Both gels have been recently differentiated

at a molecular level by FT-IR spectroscopy (Lefèvre & Subirade, 2000).

In recent years, the ability of β-lg to form a gel network under cold conditions has brought

renewed interest to this field because of the possibility of expanding its use in food and

non-food applications (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1998;

Marangoni et al., 2000; Bryant & McClements, 2000a). Many studies have been carried out

on calcium-induced cold gelation, but the mechanism involved in this process remains

84 unclear (Barbut & Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1999; Bryant & McClements,

2000a; Marangoni et al., 2000).

In a previous study, we investigated the cold gelation of β-lactoglobulin induced by the

addition of Fe2+, in order to protect iron from environmental conditions (Remondetto et al.,

2002). Our results show that the macroscopic properties obtained for Fe2+-induced β-lg

cold gels exhibit similarities with those obtained in studies with different cations (Ca2+,

Mg2+, Na+)-induced cold gels, suggesting that the cation-protein interactions would be of

similar nature, where electrostatic interaction would play a predominant role (Barbut &

Foegeding, 1993; Bryant & McClements, 1998; Hongsprabhas & Barbut, 1998;

Remondetto et al., 2002). Moreover, we demonstrated that different types of gels could be

obtained depending on pH conditions and protein and/or iron concentration. When

iron/protein ratios were low and the pH value close to 7, gels were homogeneous and

characterized by an elastic behavior and a high resistance to rupture, suggesting that strong

particle-particle interactions occurred. Under these conditions, gels are composed of

essentially flexible linear strands, called “fine stranded” producing a “filamentous gel”

(Stading et al., 1992; Stading et al., 1993; Remondetto et al., 2002). When iron/protein

ratios were high and pH values above 7, gels were non-homogeneous, exhibited random

aggregation and were characterized by a lower elastic behavior and a low rupture

resistance, suggesting that weak particle-particle interactions occurred. Gels characterized

by a random association into large and almost spherical aggregates linked together are

called “particulate gels” (Doi, 1993). Finally, at intermediate iron/protein ratios,

filamentous and random-aggregate structures were mixed together that forming gels. An

increase in iron concentration led to changes in the gel structure, which went from fine

85 stranded to random aggregate, with a concomitant decrease in gel strength, elasticity, and

water holding capacity (WHC). This suggested that the iron concentration could control the

macroscopic properties of β-lg gels. Although well characterized at both the macroscopic

and microscopic levels, nothing is known about the molecular mechanism involved in Fe2+-

induced β-lg cold gelation or about the interactions that maintain the network. Since these

points have yet to be resolved, the objective of the current study was to determine the

molecular and supramolecular mechanisms involved in Fe2+-induced β-lg cold gelation.

First, we have used Fourier transform-infrared (FT-IR) spectroscopy to investigate the

molecular basis of cold-gels formation. This technique is a versatile and powerful proven

tool for monitoring the denaturation (Fabian et al., 1993; Takeda et al., 1995; Subirade et

al., 1998), aggregation, and gelation (Casal et al., 1988; Boye et al., 1997b; Allain et al.,

1999; Subirade et al., 1998) of globular proteins. Recently, successful discrimination of

particulate and fine-stranded β-lg gels has been achieved with this technique (Lefèvre &

Subirade, 2000).

Then, given that covalent bonding, hydrogen bonding, hydrophobic interactions and van

der Waals forces are involved in the formation of gel structures (Clark & Ross-Murphy,

1987; Doi, 1993; Aguilera, 1995), their respective contribution in the formation of gels,

was monitored at a supramolecular level using dynamic viscoelastic measurements. These

measurements were carried out with and without destabilizing agents so as to prevent the

formation of specific interactions: urea was used to block the formation of the hydrogen

bonds, SDS to block the formation of the hydrophobic interactions, and 2-mercaptoethanol

to block the formation of the disulfide bridge.

86

On the basis of the combined FT-IR and rheological data, a model was developed that

explains the different mechanisms involved in the cold-gelation process. This model uses

molecular and supramolecular mechanisms to explain the different macrostructural

properties in relation to interactions involved during gel formation.

87

3.2. Experimental

3.2.1. Materials

β-lg (β-lactoglobulin) was obtained from Davisco International, Inc. (Le Sueur, MN, USA)

[98.2% protein by Semi-micro Kjeldahl (AOAC, 1984) using N-factor 6.38]. Ferrous

sulphate (FeSO4) was of a reagent grade (Analar, BDH Inc., Toronto, Canada). Urea,

Sodium dodecyl sulphate (SDS), and 2-mercaptoethanol were purchased from Sigma

Chemical Co. (St. Louis, MO, USA).

3.2.2. Methods

3.2.2.1. FT-IR spectroscopy

β-lg was dissolved in D2O solution at the desired concentration and pD adjusted with

NaOD. The pD was measured with a standard pH electrode and the value was corrected

according to pD = pH + 0.4 (Boye et al., 1997b). β-lg was kept 48 h in an aqueous solution

under a nitrogen atmosphere before recording spectra for a complete H/D exchange (Boye

et al., 1996). After 48 h, β-lactoglobulin suspensions (9.5% protein w/v) were heated at

80oC for 30 min, then cooled to room temperature (24oC). With the preheated protein

suspensions, different suspensions were prepared (6% protein w/v), and mixed by vortexing

with different quantities of a 1 M solution in D2O of FeSO4 (10 to 30 mM) at 24oC.

Infrared spectra at a 2-cm-1 resolution were recorded with a Magna 560 Nicolet

spectrometer (Madison, WI) equipped with mercury–cadmium-telluride detector. The

spectrometer was continuously purged with dried air. Samples were placed between two

88 CaF2 windows separated with 13-µm polyethylene terephthalate film spacers. Each

spectrum is the result of an average of 128 scans and apodized with a Happ-Genzel

function. To study the amide I region of the protein (the so-called amide I’ in deuterated

peptide groups), subtractions and Fourier self-deconvolutions were performed with the

software provided with the spectrometer (Omnic software). In order to identify each

overlapping component under the broad amide I’, Fourier self–deconvolution was applied

to the spectra (Kauppinen et al., 1981). The band narrowing was achieved with a full width

at half of 18 cm-1 and with a resolution enhancement factor of 2.

3.2.2.2. Dynamic oscillatory measurements

Protein solutions, at a concentration of 9.5% (w/v), were prepared by adding appropriate

amounts of β-lactoglobulin powder to a portion of deionized water. They were then stirred

for two hours at room temperature. The pH of the solution was adjusted at room

temperature (24oC) to pH 7. β-Lactoglobulin suspensions (9.5% protein w/v) were heated at

80oC for 30 min, then brought to room temperature (24oC) during 4 h. As for the preheated

protein suspensions (9.5 % protein w/v), suspensions of 6% protein w/v were prepared and

mixed by vortexing with two different quantities of a 1 M solution of FeSO4 (10 and 30

mM) at 24oC to obtain different ionic strength according to Equation 3. 1.

Equation 3. 1:

∑=

=×=

ni

iii ZC

1

221µ

where:

89

µ : ionic strength

Ci : active ionic concentration

Zi : ionic charge

Small-deformation oscillatory measurements of gels were performed on a controlled-stress

rheometer (SR-500, Rheometric Scientific, Piscataway, NJ), using parallel plates (40 mm

diameter). Viscoelastic parameters were then measured within the linear region at a

frequency of 1 Hz. Shear storage modulus (G’) and shear loss modulus (G’’) were

evaluated as a function of time for 12 h. At least five determinations of each condition were

made without obtaining significant differences among them.

The analyses were performed in different medium: water (reference) and in the presence of

destabilizing agents, namely 0.2M of 2-mercaptoethanol for disestablishing disulfides

bonds, 2M Urea for disestablishing hydrogen bonds; and 1% SDS for disestablishing

hydrophobic interactions.

90

3.3. Results

3.3.1. FT-IR Study

FT-IR spectroscopy was used to monitor molecular conformational changes taking place

during the gelling process. Figure 3. 1 displays the typical deconvoluted spectra in the

amide I band region (1600-1700 cm-1) of β-lg at 6% in D2O at pD 7 (a), and preheated for

30 min at 80oC (b); both spectra were recorded at 24oC. The deconvoluted band, called

amide I’ in D2O, corresponds mainly to the C=O stretching mode of the peptide backbone

and is sensitive to alterations in secondary structures (Surewicz & Mantsch, 1988;

Goormaghtigh et al., 1994; Lefèvre & Subirade, 2001; Krimm & Bandekar, 1986). The

spectrum of the native protein (Figure 3. 1a) presents seven components, which correspond

to particular secondary structures that are relatively well documented (Casal et al., 1988;

Dong et al., 1996; Byler & Susi, 1986; Jackson & Mantsch, 1992). The most intense band

at 1634 cm-1 is typically observed in proteins in which β-sheets predominate, as

demonstrated by X-Ray data (Papiz et al., 1986). The 1623-cm-1 component is caused by

strongly bonded β-strands. The concomitant presence of both components is characteristic

of β-lg in the dimeric form (Lefèvre & Subirade, 1999). The components located at 1647

and 1660 cm-1 are ascribed to α-helix/unordered structures and turns, respectively. Those

located at 1676 and 1691 cm-1 are both related to β-sheets and turns, while the small

component at 1611 cm-1 is caused by the vibration of amino acid residues (Arrondo et al.,

1993).

91

The deconvoluted spectrum of preheated β-lg (Figure 3. 1b) differs considerably from the

FT-IR spectrum of the native protein. The amide I’ band is mainly composed of two

components, one located at 1614 cm-1 (called aggregation band in the following) and

another one located at 1682 cm-1. The former is assigned to intermolecular β-sheets

resulting from aggregation (Clark et al., 1981), whereas the presence of the latter indicates

that the β-sheets are antiparallel (Bandekar, 1992). The low frequency for the aggregation

component (1614 cm-1) suggests that the intermolecular H bonds involved in the

aggregation process are very strong (Jackson & Mantsch, 1992). This change is

accompanied by a broadening of the amide I’ band suggesting the presence of unfolded

polypeptide segments. However, secondary structure components are not well resolved and

there are still present between 1670 and 1620 cm-1. Moreover, they differ in their location

from those found in the native protein, suggesting a reorganization of the polypeptide chain

within the protein (Lefèvre & Subirade, 2000). The weak components around 1625 cm-1

have already been observed for concanavalin(Dong et al., 1990) and legumin (Subirade et

al., 1994), and were attributed to distorted β-strands (Arrondo et al., 1988). The weak band

at 1669 cm-1 could result from peptide group segments in the turns (Byler & Susi, 1986).

The bands at 1655 and 1647 cm-1 could be caused by unordered segments in the protein,

and the spectral contribution from the α-helical conformation cannot be completely ruled

out at the frequency of 1655 cm-1. The important point from these results is the presence of

aggregated molecules in the preheated solution.

Figure 3.2 presents the deconvoluted spectra of the gels obtained by adding 10 mM (a) or

30 mM (b) of FeSO4 to a preheated solution of β-lg (6% v/w protein in D2O, pD 7),

92 recorded at room temperature. The most striking phenomenon is that the spectra of the gels

at both iron concentrations are very similar to the ones obtained after the preheating

treatment (Figure 3. 1b), suggesting that the molecular structure of β-lg within the gel is

identical to the one obtained after the preheating treatment. They present the same

aggregation components at 1614 and 1682 cm-1 indicating that the aggregates in the

network are similar to the aggregated molecules. There are even no differences in the band

frequency, which means that structures are the same for both types of gels; it is possible to

observed differences in the band intensity. These data show that band intensity increases

with higher ionic force in the gels. This behavior could be explained by an increasing

structural contraction resulting from the effects of the ionic strength that lead to an increase

in the molecular interactions in the aggregates (Rha & Pradipasena, 1985). FT-IR results, as

a whole, suggest that the gels are produced from the association of structural units

constituted by aggregated molecules formed in the preheated step.

Moreover, in a previous study (Remondetto et al., 2002), we showed that the gels obtained

at 10 mM iron (protein concentration 6%) were filamentous, while the gels obtained at

30 mM iron (protein concentration 6%) were made up of random aggregates. The lack of

significant differences between the FT-IR spectra of the filamentous gels and the random-

aggregate gels suggests that the differences observed between both types of gels are not

caused by variations in H-bonding implied in the intramolecular and intermolecular

interactions. However, the absence of any detectable change in the secondary structure of

β-lg does not eliminate the possibility of a conformational change at different

supramolecular structures, which could lead to changes in macroscopic properties (Allain et

al., 1999; Subirade et al., 1998). It was therefore necessary to use a complementary method

93 to investigate the supramolecular properties and to evaluate the remaining interaction types.

Consequently, the rheological method was used as a complementary methodology to the

FT-IR (Clark & Ross-Murphy, 1987).

3.3.2. Reological study

Figure 3.3 illustrates the evolution of the storage modulus (G’), the loss modulus (G”), and

the phase angle as monitored by dynamic rheology. The phase angle indicates the relative

amount of viscous and elastic elements in the gel (i.e., an elastic solid has 0o and a viscous

fluids has 90o) (Steffe, 1992), while G’ indicates the evolution of the solid elements in the

system, and G” indicates the evolution of the viscous elements in the system.

Consequently, the change from a viscoelastic fluid to a viscoelastic solid could be used to

show the gelation’s evolution through time (Barbut & Foegeding, 1993). Results show that

G’, G’’, and phase angle present similar tendencies for all Fe2+-induced gelation conditions,

displaying an increase in both G’ and G”, and a decrease in the phase angle. The gelation

process was followed from 5 min after mixing gels components to 720 min at 24oC.

Because the phase angle was shown to decrease to a minimum value and because G’

increased until it attained its maximum value, G’ was chosen as the best indicator of gel

structure formation and consolidation for all conditions tested.

Figure 3.4 displays the storage modulus (G’) as a function of time at 6% of preheated β-lg

gel forming with 10 mM (Figure 3.4a) and 30 mM (Figure 3.4b) Fe SO4, respectively. This

figure shows that at 10 mM of Fe2+, G’ values are higher than those obtained at 30 mM of

Fe2+, demonstrating the higher elastic behavior at 10 mM Fe2+. These results confirm those

previously obtained using large deformation test, which showed a decrease in the elastic

94 behavior when the iron concentration is increased (Remondetto et al., 2002). This gel

behavior is the result of the formation of a filamentous structure at low iron concentrations

(10 mM Fe2+) and a random-aggregated structure at higher iron concentrations (30 mM

Fe2+) (Remondetto et al., 2002). Given that FT-IR did not show differences at the

molecular level in random-aggregated and filamentous gels, the rheological differences

found in both gels could be explained by different arrangements at a supramolecular level.

To elucidate the different interactions occurring during the formation of random-aggregated

and filamentous gel structures, different destabilizing agents, which prevent the formation

of specific interactions, were used. Covalent bonds, hydrogen bonds, hydrophobic

interactions, and van der Waals forces are known to be involved in the formation of gel

structures (Clark & Ross-Murphy, 1987; Doi, 1993; Aguilera, 1995). The contribution of

each interaction at the supramolecular level has been monitored by dynamic viscoelastic

measurements with and without destabilizing agents: urea was used to prevent hydrogen

bonding, SDS to block hydrophobic interactions, and 2-mercaptoethanol to prevent

disulfide bridge formation.

Figure 3.5 displays the storage modulus (G’) as a function of time of gels formed at pH 7

and 6% of β-lg with 30 mM of Fe2+ without destabilizing agents (Figure 3.5a), with urea

(Figure 3.5b), with 2-mercaptoethanol (Figure 3.5c), and with SDS (Figure 3.5d). Results

show no significant differences in the G’ curve versus time in the presence of destabilizing

agents, except for 2-mercaptoethanol (3.5c). Urea (3.5b) and SDS (3.5d) induce a modest

change in the G’ curve, indicating that neither hydrogen bonding nor hydrophobic

interactions play a crucial role in the formation of the gel structure. In contrast, the presence

95 of 2-mercaptoethanol induces a more pronounced decrease in the G’ effect (Figure 3.5c),

which reveals that even though disulfide bonds are involved in the gel structure, their role

appears to be limited.

Figure 3.6 displays the storage modulus (G’) as a function of time of a gel formed at 6% β-

lg and at pH 7, with a concentration of 10 mM of Fe2+, without destabilizing agents (Figure

3.6a), in the presence of urea (Figure 3.6b), 2-mercaptoethanol (Figure 3.6c), and SDS

(Figure 3.6d). Figure 3.6b shows that urea induces a slight decrease in the G’ parameter

compared to the results without the destabilizing agent (Figure 3.6a). This result suggests

that hydrogen bonding plays a minor role in the formation of both gel structures. These

findings are comparable to those obtained at 30 mM (5b), which means that hydrogen

bonds interactions are not responsible for the microstructural differences in gels at 10 mM

and 30mM Fe2+, respectively. These results are in agreement with the data obtained using

FT-IR spectroscopy, which only revealed the presence of hydrogen bonding (Arrondo et

al., 1988).

On the other hand, the presence of 2-mercaptoethanol (Figure 3.6c) induces an important

decrease in the G’ curve (Figure 3.6a), which suggests that the disulfide bonds are key

elements in the gel structures at the lowest iron concentrations. The more pronounced role

of disulfide bonds in the gel structures at 10 mM of iron compared to the ones formed at 30

mM would explain the biggest elasticity of the former gels compared to the latter one.

However, the most striking effect is observed in the presence of SDS (Figure 3.6d). This

result reveals that hydrophobic interactions are essential for gel formation at 10 mM of

Fe2+.

96

In conclusion, these results show that at 10 mM Fe2+, gel formation (filamentous gels) is

mainly controlled by hydrophobic interactions. In contrast, at 30 mM Fe2+, since neither

hydrogen bonding nor hydrophobic interactions are responsible for gel structure formation,

van der Waals interactions are likely to play a central role in gel structure formation.

Despite the fact that the 2-mercaptoethanol was shown to diminish gel solid behavior

(weakest G’), gel formation did occur, which indicates that disulfide bonds would

essentially contribute to the consolidation of gel structures it effect being more pronounced

in gels formed with 10 mM of iron.

97

3.4. Discussion

In the previous section, the molecular and supramolecular structural changes occurring

during iron-induced cold gelation of β-lg were shown by FT-IR spectroscopy and

rheological methods. Cold gelation of β-lg in the presence of cations is a two-step

mechanism: 1) a preheating step under conditions that prevent gel formation and, 2) gel

formation upon adding cations (Bryant & McClements, 1998).

According to our data, FT-IR spectroscopy showed that, after the preheating treatment, the

proteins molecules form aggregates without gelation. These aggregates present similar

spectra to those obtained in the second step of the gelation process, suggesting that they

make up the structural gel units. These results corroborate the concept proposed by Bauer

(Bauer et al., 2000). These units seem to be the common feature in the formation of cold- or

heat-induced β-lg gels.

In the cation addition step of the gelation process, the absence of significant differences

between FT-IR spectra of the filamentous gels (10 mM of iron concentration) and random-

aggregated gels (30 mM of iron concentration) indicates that the macroscopic and

microscopic differences observed for both types of gels (Remondetto et al., 2002) are not

caused by hydrogen bonding, which means that hydrogen bonding is mostly involved in the

formation of structural units in all types of cold gels. These results suggest therefore that

interactions (except for hydrogen bonding) are involved in the formation and consolidation

of cold gels. The rheological data obtained from experiments with different destabilizing

agents revealed that Van der Walls interactions are responsible for random-aggregated

98 gelation, whereas filamentous gelation is essentially a product of hydrophobic interactions.

Moreover, disulfide bonds play a role in the consolidation step of both gel types.

Figure 3.7 summarizes the succession of steps involved in the formation of the specific

microstructures of cold gelation of β-lg in the presence of iron.

In a first step, a preheating treatment leads to the formation of aggregated molecules that

constitute the structural units responsible for the three-dimensional network for all types of

cold gels. During the second step, iron neutralizes the superficial charges on the structural

units in keeping with the DLVO (Deryagin-Landau-Verwey-Overbeek) theory. This

electrostatic neutralization enables the formation of a three-dimensional network by two

mechanisms, both occurring at different iron concentrations. At high iron concentrations

(30 mM iron, Figure 3.7a), a strong and rapid decrease in the repulsion forces is produced

on the structural units, resulting in a random aggregation that is essentially controlled by

the van der Waals interactions, which in turns favors the formation of clusters (growth in all

directions). The great irregular aggregation can explain the brittleness of the network gel

structure (Remondetto et al., 2002). At low iron concentrations (10 mM iron, Figure 3.7b),

the superficial charges of the structural units diminish gradually favoring interaction among

their hydrophobic regions. This arrangement promotes aggregation growth in a preferential

linear direction leading to filamentous gels.

Figure 3.8 shows a model of filamentous gelation. The linear growth of the aggregation is

du to the hydrophobic patch distribution on the structural units. In this model, the gradual

decrease in the superficial charge, caused by the incorporation of the iron, favors

interaction among aggregates by hydrophobic patches. After the aggregation of the first

99 structural units, the incorporation of additional units can only occur at the extremities of

existing aggregates, because of the steric hindrance they generate. As a result, growth is

achieved in a “preferential” direction and leads to the production of a filamentous network.

In the model presented (Figure 3.7 and Figure 3.8), it is important to keep in mind the main

role of the electrostatic interactions. Indeed, in agreement with the DLVO theory,

increasing the salt concentration would change the distance distribution of the potential

repulsive forces (i.e., mainly electrostatic) and thus the energy barrier, which stabilizes

colloids systems (Friberg et al., 1990). The loss of potential repulsive forces makes it

possible for the incipient aggregates to get close enough to interact via non-covalent forces

with a low-potential energy (Israelachvili, 1985). Divalent cations (such as Fe2+) can cause

a decrease in the potential repulsive force. Two hypothesis may explain this behavior:

either divalent cations act as bridges between the negatively charged carboxylic group on

neighboring β-lg molecules, as previously proposed (Bryant & McClements, 1998;

Marangoni et al., 2000), or cations alter the ionic force. However, if the formation of

bridges is indeed essential to network formation, the increase in the Fe2+ concentration

would result in the rise in the elasticity, which is contrary to our rheological data (Figure

3.4) showing that ionic force plays a major role in the formation (i.e., in support of the

second hypothesis). Moreover, according to Equation 1 (see Material and Methods), the

second hypothesis helps to explain why cold-induced gelation needs to occur at a divalent

cation (e.g., Fe2+) concentration, that is lower (about four times) than that of monovalent

cations (> 100mM) (Bryant & McClements, 2000a; Kitabatake et al., 1996; Kuhn &

Foegeding, 1991).

100

In conclusion, the model presented in this work explains the cold–gelling process in the

presence of divalent cations and it could be extended to different cations independently of

their valence.

Acknowledgments

The authors acknowledge Dr. Thierry Lefèvre for interesting and fruitful discussions about

protein gels. They thank the NSERC – industrial chair and industrial partners (Agropur,

Novalait, Parmalat) and the NSERC-Canada Research Chair program for their financial

support.

101

Abso

rban

ce (a

.u.)

1650 1700 Wavenumbers (cm-1)

1691 1647 1634 1623 1660 1676

(a)

(b)

1669 1655 1647 1636 1625 1682 1614

1611

1600

Figure 3. 1: Deconvoluted spectra of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7: (a) native protein, (b)

pre-heated protein (at 80oC, 30 min).

102

Abs

orba

nce

(a.u

.)

1650 1700 Wavenumbers (cm-1)

(a)

1682 1669 1655 1647 1636 1614

(b)1682 1669 1655 1647 1636 1614 1625

1625

1600

Figure 3.2: Deconvoluted spectra of cold-gels of β-lg in D2O (6% w/v) at pD 7 (a) with 10

mM FeSO4 concentration; (b) with 30 mM FeSO4 concentration.

103

0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

(c)

(b)

(a)G

' (P

a), G

'' (P

a), a

nd tn

_del

ta

time (min)

Figure 3.3: Rheological behavior of cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4

concentration in function time: (a) storage modulus G’, (b) loss modulus G”, and (c) the

phase angle tanδ.

104

0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

(b)

(a)

G' (

Pa)

time (min)

Figure 3.4: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: (a) cold-gels of β-lg

in H2O (6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration, (b) cold-gels of β-lg in H2O (6% w/v)

with 30 mM of iron concentration.

105

0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

(d)

(c)(b)(a)

G' (

Pa)

time (min)

Figure 3.5: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg

(6% w/v) with 30 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-

mercaptethanol, and (d) 1% SDS.

106

0 100 200 300 400 500 600 700 8000.01

0.1

1

10

100

1000

10000

100000

(d)

(c)

(b)(a)

G' (

Pa)

time (min)

Figure 3.6: Storage modulus (G’) evolution in function time (min) for: cold-gels of β-lg

(6% w/v) with 10 mM FeSO4 concentration in: (a) water, (b) 2 M urea, (c) 0.2 M 2-

mercaptethanol, and (d) 1% SDS.

107

Native protein

Denatured protein Protein aggregates

Fe2+Heat

(no salt)

Random aggregated gel

Filamentous gel

High [Fe2+]/[Prot]

Low [Fe2+]/[Prot]

-

-

-- -

Fe2+

--

- a

b

Figure 3.7: Mechanisms of denaturation/aggregation and gelation of cold-gels of β-lg: (a)

random-aggregated gels and (b) filamentous gels.

108

+

+

++

+

++

+

+

+

+ +

+

+

+

--

-

-

--

--

--

-

-

-

---

--

-

-

Hydrophobicpatch

Protein aggregates

Figure 3.8: Mechanisms of three-dimensional organization of filamentous cold-gels of β-

lactoglobulin.

Chapitre IV

INFLUENCE OF THE MICROSTRUCTURE OF

BIODEGRADABLE WHEY PROTEIN HYDROGELS IN

CONTROLLED IRON DELIVERY: AN IN VITRO STUDY

The content of this chapter will be published:

Remondetto, G. E.; Beyssac, E. & Subirade, M. 2003.

In preparation.

110

Abstract

The influence of the microstructure of whey protein hydrogels elaborated in the presence of

10 mM (filamentous gels) and 30 mM ( particulate gels) iron, on iron delivery was studied

in different conditions including simulated gastrointestinal conditions. First, experiments

have been conducted to determine the impact of pH and enzymes on iron release. The

results show that different iron release profiles can be achieved from filamentous and

particulate gels. Under acidic pH, the particulate gels release higher levels of iron than

filamentous ones. The opposite is observed at alkaline pH. In the presence of enzymes

(pepsin at pH 1.2 or pancreatin at pH 7.5) the two types of gels show an increase in the

protein degradation but only the filamentous gels display an increase in the iron delivery

suggesting that the matrix structure plays a very important role on the iron delivery. Then, a

dissolution test using medium which simulates gastro-intestinal conditions has been used to

mimic the in vivo dissolution. The data show that the filamentous gels release the biggest

quantity of iron into intestinal level protecting, by this way, iron trapped through the

passage of gastric level. Moreover the use of the caco-2 system to imitate the intestinal wall

and to estimate the intestinal absorption of iron allows to show that the filamentous gels

favour the iron intracellular absorption. These result show that the filamentous gels

constitute a. very good matrix to transport iron and to favour its absorption and as a

consequence its bioavalaibility.

Keywords: Biodegradable hydrogels, In vitro release, whey proteins, Iron

111

Résumé

L'influence de la microstructure d'hydrogels biodégradables de protéines du lactosérum

élaborés en présence de 10 mM (gels filamenteux) et de 30 mM (gels particulaires) de fer,

sur la libération du fer a été étudiée dans différentes conditions incluant les conditions

gastro-intestinales simulées. Dans un premier temps, l'impact du pH et de la présence

d’enzymes sur la libération du fer a été examinée. Les résultats montrent que les gels

filamenteux et les gels particulaires présentent différents profils de libération du fer. À pH

acide, les gels particulaires présentent une plus grande libération de fer que les gels

filamenteux alors que l’inverse est observé à pH alcalin. En présence d'enzymes digestives

(pepsine à pH 1.2 ou pancréatine à pH 7.5), les deux types de gels présentent une

augmentation de la dégradation de la matrice protéique, alors que seuls les gels filamenteux

révèlent une augmentation de la libération du fer, suggérant un impact important de la

microstructure sur la libération du fer. Des tests de dissolution dans un milieu mimant les

conditions du tractus digestif ont permis de montrer que les gels filamenteux libèrent la plus

grande quantité de fer au niveau intestinal, le transportant plus efficacement vers l’endroit

cible d’absorption. De plus, une étude utilisant des cellules de caco-2 pour mimer la paroi

intestinale et estimer l'absorption intestinale du fer, a révélé que les gels filamenteux

favorisaient l'absorption intracellulaire du fer. L’ensemble de ces résultats montre que les

gels filamenteux constituent une excellente matrice pour transporter le fer et favoriser son

absorption intestinale, et à terme sa biodisponibilité.

112

4.1. Introduction

Over the past decade, hydrogels are gaining more attention as drug delivery systems,

especially for the controlled oral drug release (Peppas, 1997). However, many hydrogel

systems are not degradable under physiological conditions. Despite the successful

elaboration of many synthetic polymers as biodegradable hydrogel, natural polymers

remain attractive agents that are extensively investigated (Kamath & Park, 1993). They

have the potential advantages of great availability, low cost, low toxicity, and being easily

modifiable (Bogdansky, 1990). Among the systems investigated, the utilization of proteins

as matrix carriers have recently received considerable attention because they are inherently

biodegradable and they present excellent functional properties. Protein, such as gelatin

(Van Den Bulcke et al., 2000), gliadin (Duclairoir et al., 1999), serum albumin

(Katzhendler et al., 2000), or egg albumin (Katzhendler et al., 2000), have been used with

success as matrix carriers for the release of bioactive molecules.

Whey proteins, also known as the serum proteins of milk by-products of cheese

manufacture, are widely used in food products because of their high nutritional value and

their ability to form gels (Allain et al., 1999; Lefèvre & Subirade, 2000), emulsions

(Dickinson, 1997), or foams. Recently, our research group has investigated opportunities

for utilizing whey protein as substrate for developing biodegradable microspheres and use

them as carrier for poorly-soluble molecules such as retinol (Beaulieu et al., 2002). The

method, based on an emulsifying step followed by a Ca2+-induced gelation of pre-denatured

whey protein, allows the formation of gastroresistant beads that form good matrices to

113 protect fat-soluble bioactive molecules. However the utilization of such matrix as carrier

for soluble molecules is limited.

Another important functional property of whey proteins is their ability to form gel matrices,

capable of holding large amounts of water. Recently, we showed that cold-induced gelation

of β-lactoglobulin, the major whey protein, can be achieved by adding Fe2+ ions to a

preheated protein suspension (Remondetto et al., 2002). This method, adapted from the one

developed by Barbut and Foegeding (Barbut & Foegeding, 1993), requires a heating step

during which whey proteins are denaturated and polymerized into soluble aggregates,

followed by a cooling step and the subsequent ferrous salt addition, which results in the

formation of a network via Fe2+-mediated interactions of soluble aggregates. Depending on

the preparation techniques and specifically on iron/protein ratios, different types of gels

have been obtained: 1) “filamentous” gel composed of more or less flexible linear strands

that constitute a regular network characterized by an elastic behavior and a high resistance

to rupture gels and 2) “particulate gels” composed of large and almost spherical aggregates

and characterized by a lower elastic behavior, and low rupture resistance (Figure 4.1).

These different microstructural properties are strongly related to the intimate structure of

the aggregates (Remondetto & Subirade, 2003). However, being well characterized at a

macroscopic and molecular level, nothing is known on the influence of the microstructure

of these gels in controlled iron delivery. This point presents a great interest in a nutritional

point of view. Indeed, iron deficiency is one of the most important nutritional problems in

the world (Thomas & Frankenberg, 2002) and its incorporation into complex systems such

as foods confronts various problems such as its oxidation and precipitation, resulting in a

reduced bioavailability (Wapnir, 1990a; Hurrell, 1997; Hurrell, 1998). Since, the presence

114 of amino acids in the intestine is required to increase iron bioavailability (Allen, 2002), the

use of protein gels of high nutritional value could be an interesting strategy to protect iron

and to increase dietary iron absorption in the manufacture of techno-functional foods. In

conclusion, it is of primary importance to investigate iron release mechanism from the

matrices in relation with their biodegradation in these environmental gastro-intestinal

conditions.

The objective of this work was to study the influence of the microstructure of gels (i.e.,

filamentous vs. particulate) on iron delivery in different conditions including simulated

gastrointestinal conditions. First, experiments have been conducted to determine the impact

of environmental conditions – pH and enzymes- on iron release in relation to the types of

gels- i.e. filamentous versus particulate gels. Then, a dissolution test using medium which

simulates gastro-intestinal conditions has been used to mimic the in vivo dissolution.

Knowledge of in vivo dissolution is the key to predict the oral performance of any

substance since only what is dissolved can be absorbed and resulted in higher oral

bioavailability. Then, a caco-2 system has been used to imitate the intestinal wall

(Hilgendorf et al., 2000; Nunez et al., 2001) and to estimate the intestinal absorption of

iron. A lot of works indicate a good correlation between the in vitro absorption of

molecules to the caco-2 system and their in vivo absorption after oral administration

(Siddiqi et al., 2001; Swain et al., 2002).

115

4.2. Materials and Methods

4.2.1. Gels preparation

β-Lactoglobulin suspensions (9.5 % protein w/v, Davisco International, Inc., Le Sueur,

MN, USA, 98.2% protein by Semi-micro Kjeldahl using N-factor 6.38) were prepared in

double-distilled water at pH 7 and heated at 80 oC for 30 min, then cooled to room

temperature (24oC) for 4 h. The protein suspensions (6 % protein w/v) were adjusted at pH

7, and mixed with 10 or 30 mM iron concentration of a solution (1 M FeSO4, reagent grade

Analar, BDH Inc., Toronto, Canada) in order to obtain filamentous (with 10mM Fe2+) and

particulate (with 30mM Fe2+) gels. (Remondetto et al., 2002).

4.2.2. Dissolution experiments

Dissolution study was performed according to the official methods described in the

Pharmacopeas (European Pharmacopea, 2002, USP 25, 2002). A dissolution test system,

paddle apparatus II (USP, 2000), with temperature circulator/controller from Distek Inc.

(North Brunswick, NJ) (Figure 4.2a) was used. The agitation of the paddle was of 60 rpm

and the control of the temperature was at 37 ± 0.5 oC.

An extraction cell (Figure 4.2b), made of chemically inert materials (epoxy glass),

consisting of a support, a cover and a membrane, is used with the paddle and vessel

assembly from the paddle Distek apparatus (Figure 4.2a). The central part of the support

forms a cavity with a depth of 2.6 mm and diameter of 32 mm. The cover has a central

opening with a diameter of 32 mm. A membrane is inserted between the support, and the

cover is held in place by screws. The extraction cell is introduced flat, into the bottom of

116 the vessel and a distance of 25 ± 2 mm between the paddle blade and the surface of the disk

assembly, is maintained during the test. 3 g of gel of equal geometric were placed in the

cavity of the support of the cell, covered by a membrane and the cell cover was screwed.

The membrane is used to isolate the dosage form the medium and to maintain the gel in the

cell. The intrinsic gel release properties were not affected by the membrane with the use of

a membrane with large pores dimension. A filter paper, consisting of a single layer of 100%

natural fiber with high strength and large pores dimension was used as membrane

(Papeterie Cascadec, France).

Samples consisting of 15 ml of dissolution medium were withdrawn at precise time

intervals according to the length of the experiment. Volume of dissolution remained

constant at 900 ml with fresh warm medium addition after each withdrawn, these dilutions

have been considerate in the calculus of the concentration. These conditions allow

maintaining the sink conditions.

Gastric acid medium preparation - The gastric fluid simulated TS (USP, 1995) consists of

a mixture of 2.0 g of sodium chloride (Sigma Chemical CO., St. Louis, USA) with or

without 3.2 g of pepsin (3200 units per mg protein, Sigma Chemical CO., St. Louis, USA)

in 7.0 mL of hydrochloric acid (37 %) (Sigma Chemical CO., St. Louis, USA) in 1000 mL

of water. The final pH of the dissolution medium is 1.2. Experiments were carried in the

presence and in the absence of pepsin to discriminate the effect of pH and the effect of

enzyme separately. Dissolution of the different gels was followed during 6h.

Intestinal alkaline medium preparation - The intestinal fluid simulated TS (USP, 1995)

consists of 6.8 g of monobasic potassium phosphate (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)

117 in 250 mL of water, mixed, and added in 190 mL of 0.2 N sodium hydroxide (Sigma

Chemical Co., St. Louis, USA) and 400 mL of water. 10.0 g of pancreatin (activity

equivalent to USP specifications, Sigma Chemical CO., St. Louis, USA) was added or not,

pH was adjusted at 7.5 ± 0.1 with 0.2 N sodium hydroxide solution and volume was

adjusted with water until 1000 mL. Again, experiments were carried out in the presence and

in the absence of enzymes. Dissolution of the different gels was followed during 6h.

In vitro gastrointestinal assays - In order to simulate successive pH and enzymes

encountered after oral administration, the following protocol was applied. The gels were

studied in the gastric condition with pepsin (pH to 1.2) during 30 min, then the pH was

adjusted at 7.5 ± 0.1 with 1 N sodium hydroxide and monobasic potassium phosphate

(Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) and pancreatin (activity equivalent to USP

specifications, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) were added in appropriate

concentration mentioned previously, in order to transform the gastric fluid into an

intestinal fluid. In these conditions dissolution of the samples were followed during 6h with

periodically withdrawn.

4.2.3. Dissolution data analysis

Each experiment was performed on 6 cells and the results were expressed as mean,

standard deviation (sd) and variation coefficient (CV%). Analyses of the iron content of the

solution were performed by atomic absorption spectrometer with the techniques standard in

Perkin Elmer 3300 Spectrometer (Perkin Elmer, Shelton, Connecticut). From the samples

assayed, the released iron concentration was expressed which mg/L/g gel. The protein

detection was realized using the measures of elemental nitrogen by the technique of pyro-

118 chemiluminescence (Dechert et al., 1990). This detection was performed in Antek nitrogen

analyzer 7000 ( Antek, Houston, Texas) using the calibration curve with glycine (Dechert

et al., 1990).

ANOVA tests were performed in order to find significantly differences between treatments

and gels structures using Statgraphics Plus Professional V 4.1 program (Manugistics, Inc.

Rockville, MD., USA).

4.2.3.1. Preliminary data

Each experiment was performed on six cell and the study of dissolution data exhibits a

good reproducibility. The variability of the data, estimated from the variation coefficient

(CV) obtained from each experiment at each time, is low. The CV% is lower than 10% in

all experiments for the random aggregated gel. For the filamentous gel, the variability is

increased in gastric media but remain always < 15% and could be related to the influence of

pH and enzyme on gel structure. The sink conditions were maintained during all the

experiment as well as the integrity of the membrane employed.

These results allowed the use of the mean results for the interpretation and the modelization

of the data

4.2.3.2. Release Kinetics

To study the mechanism of iron release from the gels, the release data were fitted to the

following equations.

Equation 4.1 :

119

Zero-order equation: kdtdMt =

where: k is the constant, t is the time, and Mt is the amount of iron release at time t.

Equation 4.2 :

First-order equation ( )tt MMkdtdM −= 0

where: k is the constant, t is the time, M0 and Mt are the amount of iron release at time 0

and t, respectively

For a two period iron release, a biexponential equation, allowing to determine the two

apparent reaction orders, was used, (Tomlinson et al., 1984).

Equation 4.3 :

ee tt

BAMMM t

βα −−

+=−∞

∞

where A and B are constant, and α and β are apparent reaction order , initial and terminal

release rate constants. M∞ represents the initial amount of iron present in the structure and

Mt is the amount of iron release at time t.

4.2.4. Simulated iron intracellular absorption on intestinal wall

4.2.4.1. Culture cell preparation

Caco-2 cells originating from human colorectal carcinoma were obtained from the

American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Caco-2 cells were grown at 37

oC in an atmosphere of 5 % CO2 – 95% air at constant humidity and in Dulbecco’s

120 modified Eagle’s medium (DMEM) supplement with 20% fetal calf-serum (Gibco, Grand

island, N.Y., USA) , 1% nonessential amino acids solutions, and 1% streptomycin

/penicillin (Gibco, Grand island, N.Y., USA). The cells were routinely expanded in tissue

culture flasks (75 cm2), and when the cells were 80-90% confluent, they were harvested by

treatment with a solution containing 0.25% trypsin (Gibco, Grand island, N.Y., USA) and 1

mM EDTA, thoroughly washed, and removed in supplemented growth medium.

4.2.4.2. Iron intracellular absorption

Caco-2 cells seeded at a level of 7 x 104 cells/cm2 in tissue culture flasks (75 cm2) were

used in iron intracellular absorption experiments at 20 days post-seeding. Each culture

flasks was washed carefully with PBS and 5 ml of gastrointestinal dissolution medium

(filter for 45 µm) was added. The gastrointestinal dissolution medium was incubated at 37

°C with the cells for 2 h, later the cells were again washed with PBS and 5 ml of DMEM

supplement with 20% fetal calf-serum were added, the culture flasks were then returned to

the incubator for 22 h period at the end of which the cells were harvested for analysis

(Puyfoulhoux et al., 2001). It is preceded to remove cells for the methodology mentioned

previously. The cells removed were sonicated for 20 min at 4 oC. Aliquot of these samples

were used to determine iron and ferritin concentration. Analyses of the iron content of the

solution were performed by atomic absorption spectrometer with graphite electrode (Perkin

Elmer 3300). The Caco-2 cell ferritin content was measured by using microparticle enzyme

immunoassay (MEIA) methods (Abbott AxSYM System for ferritin detection, Abbott

Park, Illinois) on 25 µl samples of the sonicated cells harvested in 2 ml of PBS buffer. An

internal blood standard was used in order to test method precision.

121

4.3. Results and Discussion

4.3.1. Impact of environmental conditions on iron release

4.3.1.1. pH-sensitive iron delivery

It is known that the release rate of molecules from hydrophilic matrices such as proteinous

hydrogels is affected by changing the pH. This is due to the presence of acidic (e.g.

carboxylic acids) or basic (e.g. ammonium salts) groups in the polypeptide chains that

either accept or release protons in response to changes in environmental pH (Qiu & Park,

2001). So, pH-responsive polymeric networks have been extensively studied (Gupta et al.,

2002) and have been most frequently used to develop controlled release formulations for

oral administration. The acidic pH in the stomach (pH 1.2) is quite different from the

neutral pH in the intestine, and such a difference is large enough to induce different release

profiles. Thus, the release of iron from particulate and filamentous gels was investigated in

physiological pH- at gastric pH 1.2 and at intestinal pH 7.5- in relation to the matrices

degradation.

Figure 4.3 presents the iron release and matrix degradation obtained at pH 1.2 (Figure 4.3a

and Figure 4.3b) and pH 7.5 (Figure 4.3c and Figure 4.3d) for both type of gels:

filamentous gels (prepared using 10 mM Fe2+) and particulate ones (prepared using 30mM

Fe2+). In acidic conditions (pH 1.2), the release of iron (Figure 4.3a) shows a significant

statistical difference (α ≤ 0.05) between the two types of gels. The filamentous gels display

a lower release (65 %) after 360 min than the particulate ones (85% at 360 min), suggesting

that the latter gels are more sensitive than the former to the acidic conditions. Since this

122 result could be due to a greater degradation of the particulate gels compared to the

filamentous ones, the degradation of matrices was followed by measuring the elemental

nitrogen in solution as a function of time and is illustrated in Figure 4.3b. This figure

reveals that from 0 to 120 min, no statistical differences occur between the degradation of

the two type of gels whereas from 120 to 360 min, significant statistical differences are

presented. The comparison between Figure 4.3a and Figure 4.3b substantiates that the

difference in the iron release from filamentous and particulate gels is not only due to the

matrix degradation. It can be due to the fact that at pH 1.2 below the isoelectric point of β-

lactoglobulin (pI = 5.2), polypeptide chains are positively charged increasing electrostatic

repulsive force between the ionized backbone chains and decreasing, at the same time,

polypeptide-ionized iron (Fe2+) interactions facilitating the iron diffusion. The higher

cumulative release of iron observed in the case of particulate gels prepared from 30 mM

iron (Figure 4.3a) compared to the one obtained for filamentous gels prepared from 10mM

iron (Figure 4.3a) might be due to their larger pores as observed by microscopy (Figure 4.1)

which result in a better diffusion of iron. Filamentous gels release the Fe2+ according to a

zero order model, with average mean release rate of 0.18 min-1. In this case, the iron

delivery is not controlled by the iron concentration, but by the microstructure of the matrix

represented by the “k parameter” in the mathematic model (Equation 4.1). This may be due

to the presence of very small pores in this microstructure. As opposite, the rate of release

from the particulate gels can be fitted to a first-order equation (Equation 4.2) with a

correlation coefficient r2 = 0.9394 and an average mean release rate of 0.011 min-1. The

particulate gels present one microstructure with very large pores that may be responsible

123 for the fact that the iron delivery is depending on the matrix structure and on iron

concentration in the gels.

An increasing of pH to 7.5 resulted in different release profile illustrated in Figure 3c.

Approximately, 32% of iron was released when filamentous gels was suspended at 37oC for

360 min whereas in the same conditions 10% of iron was released from the particulate gel,

indicating that the former gels are more sensitive to alkaline conditions than latter ones. It

can be notified that for these gels, iron was released in the first 30 min, followed by a very

slow release for the subsequent 330 minutes. As opposite, the matrices degradation (Figure

3d) shows similar behavior to those observed in the acidic conditions (Figure 3b),

indicating that both environmental conditions (pH 1.2 and pH 7.5) produce similar effects

on the degradation of gels. These results reinforce the conclusion that relationship does not

exist between the release of iron and the degradation of gels indicating that iron delivery is

mainly controlled by diffusion mechanisms. In these conditions, the release characteristics

have been fitted using Tomlinson’s model (Equation 4.3). This model allowed to obtain,

two apparent reaction orders, near one for the first release period and near zero in the

second release period.

The different effect of pH on the iron delivery from the two types of gels can be associated

to the fact that theses gels are mainly formed by different physical interactions

(Remondetto & Subirade, 2003). Whereas the particulate gels (prepared with 30mM Fe2+)

are essentially controlled by the van der Waals interactions, in filamentous ones (prepared

with 10 mM Fe2+) the hydrophobic interactions predominate. These interactions lead to

different gel structures with different response to pH stimuli and different iron release

124 profiles. The different pH-sensitive response of hydrogels is a very interesting property that

could be useful for site-specific controlled biomolecules delivery. This concept is largely

used in pharmaceutical field (Jacobs & Mason, 1993; Brannon-Peppas, 1995; Qiu & Park,

2001). However, the use of edible comestible biopolymer such as whey proteins and food

grade components make these hydrogel systems very interesting matrices as pH-responsive

bioactive molecules delivery systems for new applications in the development of functional

foods.

4.3.1.2. Enzymes-sensitive iron delivery

Among the factors that modulate the release properties of hydrogels, those that induce their

biodegradation play a major role. By oral administration, the most important mechanism of

degradation of hydrogels, and specially of protein-based hydrogels, is a hydrolytic

degradation by digestive enzymes encountered in the gastrointestinal tract (GIT). Thus, the

release of iron from particulate and filamentous gels was investigated in the presence of

gastric (pepsin at pH 1.2) or intestinal (pancreatin at pH 7.5) enzyme in relation to the

matrices degradation.

Figure 4.4 presents the iron release (%) and matrix degradation (expressed as nitrogen

concentration (mg/L)) obtained in the presence of pepsin (Figure 4.4a and Figure 4.4b) and

in the presence of pancreatin (Figure 4.4c and Figure 4.4d) for both type of gels:

filamentous gels (prepared using 10 mM Fe2+) and particulate ones (prepared using 30 mM

Fe2+). In the presence of pepsin (pH 1.2), the release of iron (Figure 4.4a) does not show a

significant statistical difference (α ≤ 0.05) between the two types of gels. After 360 min,

125 80-100% of iron was approximately released from the hydrogels whatever their

miscrostructures suggesting a high sensitivity of the hydrogels to gastric enzyme. Figure

4.4b shows an important increase in the degradation of protein matrix for both types of

gels. From 0 to 240 min, gels behaviors are similar, while after 240 min, the particulate gels

are more sensitive to pepsin degradation than filamentous gels. This difference may due to

the fact that pepsin is known to preferentially attack peptide bonds involving hydrophobic

aromatic amino acids such as Trp, Phe, and Tyr and as we showed in a previous work

(Remondetto & Subirade, 2003), they are involved in the hydrophobic interaction that

allow the formation of filamentous gels limitating the action of pepsin. The comparison

between Figure 4.3a and Figure 4.4a (at 6h) shows that, at acidic pH, the release of iron

from particulate gels is similar in the presence and in the absence of pepsin, indicating that

the enzymatic degradation does not play an important effect on the iron release that is

mainly controlled by acidic pH. As opposite, the iron release from filamentous gels is

sensitive to peptic hydrolysis and it represents 70% in the absence and 100% in the

presence of pepsin. This behavior may be due to the location of iron inside the matrices. In

a previous work (Remondetto & Subirade, 2003), we showed that particulate gels resulted

from the random aggregation of aggregates inside which iron is trapped while filamentous

gels resulted from linear aggregation of structural units that form filaments with iron

located at the outer surface and thus more easily released.

The addition of pepsin in the dissolution medium did not affect the release profile of iron

from the particulate gels that can also be characterized by a first-order kinetic, with a rate

constant of 0.011min-1. As opposite, the presence of enzyme modifies the release

126 characteristics of iron from filamentous that could be characterized by a first-order kinetic

until 60 min and by a zero-order kinetic from 60 to 360 min

Figure 4.4c-d displays the behavior of both types of gels (filamentous and random

aggregate gels) in the presence of pancreatin in alkaline conditions (pH 7.5). Again, in

these conditions, the iron release from the particulate gels (Figure 4.4c) is similar to that

obtained in the absence of enzyme (Figure 4.3c) despite difference in the degradation

profiles in the presence (Figure 4.4d) and in the absence (Figure 4.3d) of enzyme. About

10% of iron is released in the first 30 minutes and maintained constant (10%) for the

subsequent 330 minutes. These data show that the presence of enzyme has not a great effect

on the iron release from particulate gels that seems mainly controlled by alkaline

conditions. In the case of the filamentous gel, about 30% of iron was released in the first 30

minutes and this value gradually reaches 50% after 360 minutes. This is accompanied by an

extensive degradation of matrix (Figure 4.4d). We can notify that the two types of gels

presentment different release profiles (Figure 4.4c) despite their similar degradation (Figure

4.4d). This degradation is higher in the presence of pancreatin (Figure 4.4d) than in the

absence of enzyme (Figure 4.3d) but lower in the presence of pancreatin than in the

presence of pepsin (Figure 4.4b). The different actions of two enzymes can be explained by

their pH action. The pancreatin acts at pH 7.5 which is near the gel pH formation, and the

interactions in the matrices are very strong. In opposite, the pepsin acts at pH=1.2 where

the protein is charged, leading to higher protein-protein repulsions facilitating the

penetration and action of enzyme. Moreover, the similar degradation of the two gels in

presence of pancreatin, may be due to the fact that pancreatin is a mix of enzymes mainly

constituted by trypsin, chymotrypsin and carboxypeptidases (A and B) that act at different

127 pH. The trypsin and the chymotrypsin are more efficient at pH = 8 (Garrett & Grishem,

2000) while at the reaction pH (pH=7.5) the carboxypeptidases (A and B) are more

efficient and act on carboxyl terminal groups, producing unspecific degradation (Garrett &

Grishem, 2000), independently of matrix structure allowing the similar degradation.

Moreover, the difference between iron release profiles between the two types of gels may

be due as previously mentioned by the location of iron inside the matrices. In conclusion,

the data deduced from Figure 4.3 (c-d) and Figure 4.4 (c-d) show that for particulate gels

iron delivery is mainly due to alkaline pH whereas for filamentous gels matrix degradation

plays a very important role in iron delivery.

4.3.2. Iron delivery in gastro-intestinal conditions

Because iron should be released as close as possible to its absorption window, i.e. intestinal

wall, it is of primary importance to control its release along the Gastro intestinal (GI) tract.

Thus, hydrogels susceptibility to GI conditions have been studied using a two-step

proteolysis performed at 37°C including a pepsin predigestion (pepsin at pH 1.2 for 30

min) that mimic gastric conditions, followed by a hydrolysis with pancreatic enzymes

(pancreatin at pH 7.5 for 6 h) that imitate intestinal conditions (Germann & Stanfield,

2001).

Figure 4.5 presents the total amount of iron released from the hydrogels (Figure 4.5a) and

the nitrogen content due to the hydrogel degradation (Figure 4.5b) during the gastric step

(first 30min) and intestinal step (the next 6h). After the gastric step, about 20% of the iron

was released in the first 30 min whatever the type of gels -filamentous or particulate

(Figure 4.5a). Then, this burst-release was followed by a plateau release in the case of

128 particulate gel while a linear release of iron was achieved in the case of filamentous gels

that reachs 70% at the end of the intestinal step. The higher release of iron from

filamentous gels compared to particulate gels could be in part explained by the higher

degradation of filamentous gels (Figure 4.5b). However, this is not the only reason since

until 210 min of dissolution test (Figure 4.5b), the degradation of protein matrix are similar

for both types of gels. This difference could be attributed to the location of iron into the

matrices, as previously mentioned. Thus, these data suggest that, in GI tract, iron release

predominantly depends on the type of gels and that the filamentous gel is most efficient to

deliver iron in intestinal step. This result is interesting since it could signify that more iron

is released and available for absorption to intestinal wall in the case of filamentous gels

compared to particulate ones.

However from these experiments, we do not know yet if iron absorption is done by

intestinal wall. Thus, studies on the iron diffusion to the intracellular cellular medium have

been conducted. The product of the gastrointestinal digestion was faced to a mono-layer of

Caco-2 cells, which imitates strongly the behavior of the intestinal wall (Hilgendorf et al.,

2000; Puyfoulhoux et al., 2001). Figure 4.6 displays the intracellular iron concentration for

reference sample, filamentous and particulate gels. Reference sample was the result of

intracellular medium of Caco-2 cells that it was not exposed to gels degradation product. It

is interesting to notify that even though this medium did not contain any product of

digestion, it contains iron present in the culture medium of cells caco-2. Statistical analyses

reveal a significant difference (≤ 0.05) between sample reference and filamentous gel

whereas no difference was obtained with particulate gel. These results indicate that the iron

released from filamentous gels presents cellular absorption significantly more important

129 than iron released from particulate gel. These results could suggest a better bioavailability

of iron released from filamentous gels compared to particulate ones.

However at this stage, it is prematured to anticipate on bioavailability of iron i.e. on the

amount of ingested iron that enters in the body since iron that is absorbed to intestinal cell

can remain there and be excreted during the cell desquamation process, being not

bioavailable (Puyfoulhoux et al., 2001), necessiting to use an other biomaker.

According to Crosby (Crosby, 1963), mucosal synthesis of ferritin is normal in states of

iron repletion; thus iron entering from the lumen is trapped in mucosal ferritin. This

hypothesis led to a possible mechanism by which the ferritin content of the cell could be

controlled by the amount of active iron (possible to be used by the body) in the cell’s

environment. Nevertheless, ferritin is a necessary storage protein to prevent damage and

compile iron reserves. Thus, it can be believed that mucosal ferritin is closely related to

iron bioavailability (Crosby, 1963; Whittaker et al., 1989; Puyfoulhoux et al., 2001).

Figure 4.7 displays the intracellular ferritin (ng/mL) obtained for references, filamentous

and particulate gels, respectively. These results present similar profile to those obtained in

Figure 4.6 with an intracellular ferritin concentration comparable for reference and sample

obtained from particulate gels and different for filamentous ones. These results

demonstrated that the iron delivery from filamentous gels types is bioavailable indicating

the important role of gel structure.

130

4.4. Conclusions

The results of this research show that different iron release profiles can be achieved from

whey protein hydrogels prepared in the presence of 10 and 30 mM of iron. The release

characteristics are noticeable different depending on the microstructure obtained -

filamentous versus particulate gels-. Filamentous gels (prepared in the presence of 10 mM

Fe2+) differed from particulate gels (prepared in the presence of 30 mM Fe2+) with regard to

their response to different stimuli, especially pH- and enzymes-responsive, resulting in the

release of iron in a controlled manner. The results showed that more iron is released and

available for absorption to intestinal wall from filamentous gels compared to particulate

ones indicating that an excessive incorporation of iron is not necessary to increase its

bioavailability. Therefore, filamentous gels contitute an excellence matrix to transport and

to release the iron without reduce its bioavailability. These gels appear as promising

matrices with potential applications in development of functional food systems.

Acknowledgements

The authors acknowledge the Canada Research Chair program for their financial support.

131

a b

Figure 4.1: Scanning electron micrographs of β-lactoglobulin cold gels elaborated in the

presence of: (a) 10 and (b) 30 mM of iron (Remondetto et al., 2002).

.

132 (a)

Extraction cell

Paddle

Dissolution vessel

(b)

Figure 4.2: Schematic representation of the device use in the dissolution test. (a) The paddle

apparatus II and extraction cell. (b) Extraction cell system.

133

(a) (c)

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

T ime ( min)

0.00

0.02

0.04

0.06

0.08

0.10

0.12

0.14

0.16

0.18

0.20

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

T ime ( min)

330 360 390

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

Ti me ( mi n)

(b) (d)

330 360 3900.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Ti me ( mi n)

Figure 4.3: Effect of pH on the iron release (a and c) and matrix degradation (b and d) from

filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line) at pH 1.2 (a and b) and pH

7.5 (c and d).

134

(a) (c)

0.00

0.20

0.40

0.60

0.80

1.00

1.20

1.40

1.60

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360

T ime ( min)

3900.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

T ime ( min)

0.0

5.0

10.0

15.0

20.0

25.0

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

Ti me ( mi n)

0.0

1.0

2.0

3.0

4.0

5.0

6.0

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360 390

Ti me ( mi n)

(b) (d)

Figure 4.4: Effect of enzyme on the iron release (a and c) and matrix degradation (b and d)

from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line): pepsin pH 1.2 (a and

b) and pancreatin pH 7.5 (c and d).

135

0

5

10

15

20

25

30

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360

Time (min)

Nitr

ogen

con

cent

ratio

n (m

g/L)

Intestinal phase

Gastricphase

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300 330 360

Time (min)

Iron

conc

entr

atio

n (m

g/g

gel)

Intestinal phase

Gastricphase

(a)

390 420

390 420

(b)

Figure 4.5: Impact of the GI conditions on the iron release (a) and matrix degradation (b)

from filamentous gels (solid line) and particulate ones (dashed line).

136

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

1

Iron

Con

cent

ratio

n (m

g /L

)

Reference 10 mM 30 mM

Figure 4.6: Iron concentration (mg/L) inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-

intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal

degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+).

137

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

1

Ferr

itin

Con

cnet

ratio

n (n

g/m

L)

Reference 10 mM 30 mM

Figure 4.7: Ferritin concentration in ng/mL inside Caco-2 cells: (a) reference, (b) gastro-

intestinal degradation product from filamentous gels (10 mM Fe2+), (c) gastro-intestinal

degradation product from particulates gels (30 mM Fe2+).

Chapitre V

Conclusion et perspectives

139

Conclusion générale

Au terme de ce travail, nous pouvons apporter de nouvelles informations sur le mécanisme

de gélification à froid de la β-lactoglobuline en présence du fer ionique ainsi que sur ses

propriétés de transport et de libération dans différentes conditions incluant les conditions

gastro-intestinales.

Dans la première étape, il a été montré que les suspensions de β-lactoglobuline

prédénaturées thermiquement peuvent former des gels à température ambiante (20°C) par

l'addition de Fe2+. Les résultats indiquent que les caractéristiques des gels peuvent être

modifiées par les changements de pH, de concentration en protéine ou de concentration en

fer. Quand le rapport fer/protéine est faible et le pH proche de 7, les gels sont homogènes et

filamenteux. Ils sont caractérisés par un comportement élastique et une haute résistance à la

rupture, suggérant la présence d’interactions protéine-protéine importantes. Quand le

rapport fer/protéine est élevé et le pH toujours proche de 7, les gels sont non-homogènes

avec une agrégation aléatoire. Ils sont caractérisés par une faible élasticité et une faible

résistance à la rupture, suggérant que les interactions protéine- protéine sont faibles. De

plus, ces gels particulaires ont une capacité de rétention d'eau inférieure aux gels

filamenteux due à l’existence de pores plus grands et moins homogènes. Les propriétés

macroscopiques révèlent que, pour des rapports fer/protéine intermédiaires, les gels sont

mixtes et constitués d’un mélange de gels filamenteux et particulaires. Une augmentation

de la concentration en fer induit la formation de gels particulaires au détriment des gels

filamenteux avec une baisse concomitante de la force du gel, de l’élasticité et de la capacité

140 de rétention d’eau (WHC). Cela suggère que la concentration du fer peut contrôler les

propriétés macroscopiques des gels à froid de β-lactoglobuline.

Dans la deuxième étape, les changements structuraux de la β-lactoglobuline qui ont lieu

lors de sa gélification à froid en présence de fer ont été étudiés à l’échelle moléculaire par

spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier et à l’échelle supra-moléculaire par

rhéologie. La formation des gels à froid est un mécanisme en deux étapes : 1) une

prédénaturation thermique de la β-lactoglobuline dans des conditions qui préviennent la

formation du gel suivie en 2) de la gélification à froid pour l’ajout d’ions Fe2+. Nos résultats

FTIR ont montré qu’après la première étape du processus, les molécules de protéines

forment des agrégats sans gélifier. Ces agrégats présentent des spectres infrarouge

semblables à ceux obtenus pour les gels à froid, suggérant qu'ils constituent les unités

structurales qui serviront de motif initial dans la formation du gel pendant la deuxième

étape. Dans la deuxième étape, l'absence de différences entre les spectres FTIR des gels

filamenteux et des gels particulaires indique que les différences macroscopiques et

microscopiques observées dans la première partie de ce travail ne sont pas dues à des

liaisons hydrogène et que celles-ci sont principalement impliquées dans la formation des

unités structurales de la première étape. Ces résultats ont permis de révéler que d’autres

interactions étaient responsables de la formation et de la consolidation des gels à froid. Les

données rhéologiques obtenues en présence de différents agents bloquants ont révélé que

les interactions de Van der Waals sont principalement responsables de la formation des gels

particulaires alors que les gels filamenteux sont principalement dus à des interactions

hydrophobes. De plus, ces expériences ont montré que la formation des ponts disulfure

141 jouent un rôle important dans la consolidation des deux types du gel. L’ensemble de ces

résultats a conduit à l’élaboration d’un modèle permettant d’expliquer la formation des

différents types de gels et d’interpréter l’impact des conditions environnementales sur leurs

différentes étapes de formation.

La troisième étape de ce travail a permis d’étudier l’impact de la microstructure des gels –

filamenteux versus particulaires- sur la libération de fer. En milieu acide, les gels

particulaires libèrent plus de fer que les gels filamenteux. De plus, les gels particulaires ne

sont pas sensibles à la présence de pepsine alors que les gels filamenteux libèrent une plus

grande quantité de fer en présence de pepsine, suggérant leur plus grande sensibilité à la

dégradation enzymatique. Le comportement inverse est observé à pH alcalin. Ces résultats

montrent que les deux types de structures gélifiées sont sensibles aux conditions

environnementales mais avec un comportement opposé. L'analyse des résultats obtenus

dans des conditions gastro-intestinales simulées montre que les gels filamenteux libérent

une plus grande quantité de fer au niveau intestinal. Ce résultat est intéressant d’un point de

vue pratique. En effet, il montre que les gels filamenteux formés à partir d’une plus petite

concentration en fer (10mM) que les gels particulaires (30mM) présentent une plus grande

libération du fer pendant la phase intestinale et démontre, de facon plus large, qu'une

incorporation excessive de molécules bioactives dans un système complexe ne garantit pas

que la molécule en question soit libérée en quantité suffisante à son site d’absorption. Ces

résultats ont été renforcés par les études de la diffusion intracellulaire du fer et de la

production de ferritine au niveau cellulaire qui démontrent que les gels filamenteux

favorisent l’absorption du fer et à terme sa biodisponibilité.

142

Perspectives du travail

Déjà largement utilisées dans l’industrie alimentaire en raison de leurs propriétés

nutritionnelles et fonctionnelles, les protéines du lactosérum peuvent, grâce à leurs

propriétés gélifiantes, servir de véhicules pour le transport de molécules bioactives. Cette

caractéristique peut être judicieusement exploitée pour libérer de façon contrôlée ces

molécules vers des cibles spécifiques de l’organisme. L’élaboration à froid de ces réseaux

permet d’envisager le transport de molécules thermosensibles seules ou en mélange afin

d’augmenter leur effet synergique. Ces systèmes protéiques peuvent servir de base pour le

développement de nouveaux aliments fonctionnels ayant un impact santé sur la population

et contribuer au développement de ce secteur en pleine émergence.

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