β-Endorphin Stimulates Cytokeratin 16 Expression and Downregulates μ-Opiate Receptor Expression in...

6
b-Endorphin Stimulates Cytokeratin 16 Expression and Downregulates m-Opiate Receptor Expression in Human Epidermis Mei Bigliardi-Qi,Paul L. Bigliardi,* Alex N. Eberle,² Stanislaus Bu Èchner,* and Theo Ru¯i* Departments of *Dermatology and ²Research, University Hospital Basel, Basel, Switzerland It has been reported that opioid peptides modulate the differentiation of normal human keratinocytes and that m-opiate receptors are expressed in human epidermis. The regulation of keratinocyte differentia- tion is particularly important in psoriasis, and one of the markers for hyperproliferative and differentiating skin diseases is cytokeratin 16. The ®nding that the endogenous m-opiate receptor ligand b-endorphin is increased in serum of patients with psoriasis indicates that the m-opiate system may play an important role in the pathophysiology of the skin. In this study, we addressed the question whether there is a link between m-opiate receptor regulation and cytokeratin 16 expression in normal and psoriatic skin. Firstly, we demonstrate that b-endorphin concentrations between 16 and 1000 nM signi®cantly downregulate m-opiate receptor expression in epidermis of cultured human skin after 48 h. Secondly, we show that b- endorphin regulates cytokeratin 16 expression in the epidermis of skin organ cultures exposed to 41± 125 nM b-endorphin for 48 h, leading to elevated cytokeratin 16 production. As expected, the expres- sion of cytokeratin 16 was detected primarily in the suprabasal layer. The same pattern was observed in psoriatic lesional skin, i.e., m-opiate receptor expres- sion was signi®cantly downregulated and cytokeratin 16 expression upregulated. These results suggest that the m-opiate receptor system and its ligand b-endor- phin are involved in the pathogenesis of psoriasis, especially in terms of differentiation. Key words: psoriasis/skin differentiation. J Invest Dermatol 114:527± 532, 2000 T here is growing evidence that keratinocytes not only interact with cells of the immune system (Bos and De Rie, 1999) but also mediate signals between the skin and the nervous system through regulatory neuro- peptides. Several authors have proposed an important pathogenetic role for neuropeptides in psoriasis (Dewing, 1971; Farber et al, 1986; Farber and Raychaudhuri, 1999). In particular, these peptides may be responsible for the psoriasis ¯are, especially with stress and for the maintenance of psoriatic lesions. One of the neuropeptides involved in this interaction is b-endorphin, an agonist of the m-opiate receptor (Wintzen et al, 1996). b-Endorphin is produced by post-translational cleavage of the precursor proopiomelanocortin (POMC), from which other secreted neuro- peptides such as adrenocorticotropic hormone (ACTH), a- melanocyte-stimulating hormone (a-MSH), and b-lipotropic hormone (b-LPH) are also derived (Eberle, 1988). Recently, b- endorphin and the other POMC peptides were shown to be produced by human keratinocytes (Ko Èck et al, 1990; Wintzen et al, 1995). In addition, Glinski et al (1994) observed that the mean b- endorphin concentration in serum of patients with psoriasis was increased about 2-fold as compared with controls. We recently demonstrated that human epidermal keratinocytes express m-opiate receptors at both the mRNA and the protein level (Bigliardi et al, 1998). The m-opiate receptor occurs in all layers of the epidermis. In the dermis it is expressed in the adnex structures, especially in the ducts of sweat glands and in the pilosebaceous unit of hair follicles. In this study we have investigated m-opioid receptor expression after exposure to b-endorphin, one of the most important mediators of stress (Olson et al, 1986). As we intended to test m-opiate receptor expression in a stress-dependent skin diseases such as psoriasis, we measured m-opiate receptor expression in psoriatic lesional skin and compared it with that of nonlesional skin from the same patient. We also investigated the in¯uence of b- endorphin on the expression level of cytokeratin 16, one of the most sensitive indicators of the psoriatic state of differentiation (Leigh et al, 1995), in human skin organ culture models. Cytokeratin 16 is not expressed in normal skin, but it is upregulated in the suprabasal, differentiating compartment of the epidermis during wound healing and hyperproliferative skin diseases such as psoriasis and skin cancer. The data found in this study suggest an important role of the m-opiate receptor system in the pathogenesis of psoriasis. MATERIALS AND METHODS Preparation of human skin organ culture The method of functional assays with skin organ cultures was adapted from Paus et al (1994). Skin grafts of about 0.5 mm thickness were obtained by a dermatome from the upper leg. To standardize the tissue volume and thereby the cell mass of cultured skin fragments, only punches of 4 mm diameter were used. Several randomized 4 mm skin punches per experimental group were placed on Anocell 10 mm tissue culture inserts (Nunc, Life Technologies, Rockville, MD). These inserts were placed in a Nunclon 24 well plate containing 2 ml Manuscript received February 12, 1999; revised June 10, 1999; accepted for publication September 6, 1999. Reprint requests to: Dr. Mei Bigliardi-Qi, Department of Research (ZLF), University Hospital Basel, CH-4031 Basel, Switzerland. Email: [email protected]. Abbreviations: ACTH, adrenocorticotropic hormone; LPH, lipotropic hormone; MSH, melanocyte-stimulating hormone; POMC, proopiome- lanocortin. 0022-202X/00/$15.00 ´ Copyright # 2000 by The Society for Investigative Dermatology, Inc. 527

Transcript of β-Endorphin Stimulates Cytokeratin 16 Expression and Downregulates μ-Opiate Receptor Expression in...

���������� �� ����� ���������� �� ��������� ���������� ����� ������� �������� ��������� � � ������������� ������������� ��� �� ���������� ���� �� �������� ���������� ���������� �� ���� �� ��!�"���#���� �$ �!��#������% �� ���������� &��'�����% (��"���� ������ ������ �)��*�����

�� ��� ��� �������� ���� ���� ������� ��� ������� �!!��������� �! ������ � ��� ��������������� ���� ������� ��������� ��� ��������� � � ����������" #�� ��� ����� �! ����������� �!!���������� � ����� ����� �������� � �������$ ��� ��� �!��� ������� !�� ���������!����%� ��� �!!������������ ������� � ���������� ��" #�� &���� ���� ����������� � ������� �������� ����� ���������� ��������� � ��� � �! ������� ��� ������� ����������� ��� ������� ������ ��� ���� �� �������� ����� ��� �������������� �! ��� ���" �� ��� �� ��$ ����������� ��� ' ����� ������� ����� � � ��� ������ ������� �������� ��� ����� ��� ������������ ��������� � ������ ��� ������� ���" (�����$�� ����������� ���� ���������� ������������� ������ �� ��� �))) �* ���&������ ������� ����

������� �������� ��������� � ������� �! � �� ���� ��� ��� �!��� +, �" �������$ �� ���� ���� ���������� ��� ����� ���������� �� ��������� � ���������� �! ��� ����� � �� ��� ������� �� +�-�./ �* ���������� !�� +, �$ ������ �� ���%�������������� �� ���� ����" 0� ��������$ ��� ���������� �! ���������� �� ��� �������� ������� � ���� ��� ���� �����" #�� ���� ������� ��� � ���%�� �������� ������� ���$ "�"$ ������� �������� ���������� ��� ���&������ ������� ����� ��� ������������ ��������� ���� �����" #���� ��� ��� � ����� ������� ������� �������� ������ ��� �� ����� ����������� ��� �%��%�� � ��� ����������� �! �������$��������� � ����� �! �!!���������" ��� ������������� ���� ���������������� � ������ �������� ���������� �!!!

����� �� ���)��� �'����� ���� +��������%��� ��� ���%�������� )��� ����� �$ ��� �##��� �%���# ,��� �� !����� -.../ ��� ���� #����� ������� ���)��� ��� �+���� ��� ���'��� �%���# ������� ���������% �����"�"����� ��'���� ������� ��'� "��"��� �� �#"������

"����������� ���� $�� �����"�"���� �� "�������� ,!�)���� -.0-12����� �� ��� -.341 2����� �� ��%��������� -.../� 5� "��������������� "�"���� #�% �� ���"������� $�� ��� "�������� ���� ��"������%)��� ������ �� $�� ��� #���������� �$ "�������� �������� 6�� �$ ��������"�"���� ��'��'� �� ���� ����������� �� �����"���� ��������� �$ ��� ��"���� ����"��� ,7���*�� �� ��� -..4/� �����"����� "����� �% "���������������� ����'��� �$ ��� "��������"���"��#����������� , 6�8/� $��# )���� ����� ������� �����"�"���� ���� �� ���������������"�� ���#��� ,�8�(/� �#������%�����#������� ���#��� ,���(/� �� ���"����"�����#��� ,�� (/ ��� ���� ���'� ,������� -.33/� �������%� �����"��� �� ��� ����� 6�8 "�"���� )��� ���)� �� ��"����� �% ��#�� +��������%��� ,9���+ �� ��� -..:1 7���*�� �� ���-..;/� 5� ������� <����+� �� �� ,-..=/ �����'� ���� ��� #��� �����"��� ������������� �� ����# �$ "������� )��� "�������� )���������� ����� >$�� �� ��#"��� )��� ���������

7� �������% �#�������� ���� ��#�� �"���#�� +��������%�����"���� ��"���� ����"���� �� ���� ��� #��� �� ��� "������ ��'��,�������� �� ��� -..3/� ��� ��"���� ����"��� ������ �� ��� ��%��� �$��� �"���#��� 5� ��� ��#�� �� �� ��"����� �� ��� ���� �������������"������% �� ��� ���� �$ �)��� ����� �� �� ��� "������������ �����$ ���� $��������� 5� ���� ���% )� ��'� ��'�������� ��"�������"��� ��"������� �$��� ��"����� �� �����"���� ��� �$ ��� #����#"������ #������� �$ ������ ,6���� �� ��� -.34/� �� )� ������ ������ ��"���� ����"��� ��"������� �� � �������"����� �+�� ����������� �� "��������� )� #������ ��"���� ����"��� ��"������� ��"�������� �������� �+�� �� ��#"��� �� )��� ���� �$ ����������� �+��$��# ��� ��#� "������� 7� ���� ��'�������� ��� �� ����� �$ �����"��� �� ��� ��"������� ��'�� �$ �%��+������ -4� ��� �$ ���#��� �������'� ��������� �$ ��� "�������� ����� �$ �$$�����������,����� �� ��� -..;/� �� ��#�� �+�� ����� ������� #�����8%��+������ -4 �� ��� ��"����� �� ���#�� �+��� ��� �� �� �"���������� ��� ��"�������� �$$����������� ��#"���#��� �$ ��� �"���#������� )��� ������� �� �%"��"����$�����'� �+�� ������� ���� ��"�������� �� �+�� ������� ��� ��� $��� �� ���� ���% ������� ���#"������ ���� �$ ��� ��"���� ����"��� �%���# �� ��� "������������$ "���������

�����5��� ��! ���(6!�

1��������� �! � ��� ��� ����� � �� �� ��� #���� �$ $�������������%� )��� �+�� ����� �������� )�� ��"�� $��# ��� �� �� ,-..=/� �+�����$�� �$ ����� :�;## ����+���� )��� ������� �% � ��#���#� $��# ����""�� ���� �� �������*� ��� ������ '���#� �� ������% ��� ���� #��� �$������� �+�� $���#����� ���% "������ �$ =## ��#���� )��� ���� ��'��������#�*� =## �+�� "������ "�� ��"���#����� ����" )��� "���� ��������� -:## ������ ������� ������� ,����� ��$� ������������� ���+'������!/� ����� ������� )��� "���� �� � ������� >= )��� "���� ���������� >#�

��������"� �����'� 2������% ->� -...1 ��'��� ?��� -:� -...1 ����"��$�� "���������� ��"��#��� 4� -...���"���� ��@����� ��A !�� ��� ����������� !�"���#��� �$ ��������

,B�2/� &��'�����% (��"���� ������ 8(=:C- ������ �)��*������ �#���A��������@�D����������������������'�������A �8�(� ���������������"�� ���#���1 � (� ��"����"��

���#���1 ��(� #������%�����#������� ���#���1 6�8� "���"��#������������

::>>>:>EF::FG-;�:: H 8�"%����� � >::: �% ��� ������% $�� 5�'��������'� !��#������%� 5���

/.2

!�������I� #��J� �����I� #���# ,!��� )��� <����#��51 ��$�������������/ ��""��#���� )��� -:K $���� ��'��� ����# �� ;: �������#���� ,��$� ������������/ "��#�� 2�� ��� ������#��� �$ ��� ��"��������"��� �� �%��+������ -4 ��"������� �� "��������� )� "��$��#� � "�������"�% �$ C## ��#���� �� �������� "�������� �+�� �� �� � �������� � ��#�������"�% �$ ���#��� ����������� �+�� $��# ��� ���������� ����� ��� ���"����)��� �#��� �� ��������+ �� �##������% ���" $��*�� �� ��@�����������

( ������� ���������� �$��� ������ �$ ������ �������� �$ �����"��� ,���#�� ��� ������ �6/� ��� ����� �������� )��� �������� $��=3 � �� C0�8 �� ;K 86> �� -::K ��#���%� 8������ �+�� ����� ��������)��� �������� �� ��� ������� #���# ���%� ����+��� ��"���#���� )���"��$��#� �� ��� ��#� )�% �� ��� "������� �$ 4: �� �����"��� �%���� ������ 3: �� "��%������ ������ "�� ������"���� ����"������������ ,<��#���� ���)��������� <��#��%/ �� 3: �� �$ ��� �"��������"��� ���������� ����������� �� ��� �� �$ ��� ���������� "���� �������� ������� "����� )��� J�� �� =K $��#����%� �� �#��� ��"���$J� $�� ��� �� �##�����������#����%� �� �#��� �� ��������+,������ !���������� !�'������ ��+����� 5�/ �� �##������% ���" $��*�� ����@�� �������� $�� ��� �� �##��� ���������� ��"���#�����

��� ��3 ��������� ��� $��*�� ���"���� )��� ��� ���� 4 �# ���������� J�� �� ������� �� ����+� )��� ;K ���#�� ���� ����# �� >K J��������� �� ���� ��$$�� ,;:#� ����(8�� -;:#� ��8�� "( 0�;/ $�� - � �����# ��#"�������� ��� ������% ��� �� ����� ��� ��"���� ����"��� )�� ���##�������% �'�������� �$J���%"���J�� "��%������ ������ ������"���

(� �� �"4 ���&����� �! ��� ������� ������ �! ������� �������� ��������� �� ��� ������� �!��� ����� �� �� �����������" �+�� ������� ��#"��� $��# ����� �$$������"���#�� ������� )��� ��"��� �� 3L-::: �� �����"��� $�� =3 � �� ��"���� ����"���� )���@�����J� �% ����#������� �$ ���������� ����������� �$��� ���������� )��� "��%������ ������ "��������"���� ����"��� ��������� $����)� �%8%> ���������������� ���������� "�� ���������� ��� ���� ��"������ "��������� �$ ��������� ���� ��#"��� )��� ��� ����� �"���#�� ����#������ �$ ����� ��#"��� � �!

(� �� ."!�)����������� �$ ��"���� ����"��� ��"������� �� ��#�� �+������� �������� $����)��� ���������� )��� -4 �� �����"���� ��� �+��������� ��#"��� )��� �������� ������ )������ ,�/ �� )��� ,�/ -4 �� �����"��� $�� =3 �� ������ )��� "��%������ ������ ������"��� ����"���������% $����)� �% ���������� )��� 8%>���M����� ���� ���������� 5�<,������ ��� �������� �� ���� �/� �� ����%*� �% �##��� ����������#�������"%�

(� �� 5" 6������ �! ��� ������� ����� �! ������� ����������������� �� ��� � ���������� � � ��� ��� �����" ��� �+������� �������� )��� �������� $�� =3 � )��� 4: �� �����"��� �� ���"������� �� ������� �$ 3: �� "��%������ ������ "�� ������"���� ����"���������% �� 3: �� ����������� ��� ���� ��"������ "��������� �$ ������������� ��#"��� )��� ��� ����� �"���#�� ���� #������ �$ ����� ��#"���� �!

/., �5<�5��!5�5 �� �� �(� ?6&���� 62 5�N���5<��5N� !�����6�6<O

����"��� ������% , ���#������ (�#����� <��#��%/ �"���J� $�� � -0�#��� ��� ��@����� ���� �� �������� �� ��� ��#��� #����� �� ���� �����"���#���� )��� ��"���� ����� ������� ��##�������% �'������� "��%������������ "�� ������#����"���� ����"��� ������% ,<��#�������)��������� <��#��%/� �������� )��� �������� )��� ��� "��#��%��������� $�� - � �� C0�8� )������ ��� �������� )��� �������� �� ���#������ ����#� �$��� ����� )����� )��� ���� ��$$��� ��� �������� )��� ����������� )��� 8%>���M����� ���� ���������� 5�< �� ���������� "�� 5�<,(P�/ ,?��+��� 5##��� �������� ������������� 7��� <��'�� �/ �����# ��#"������� $�� C:#��� ����� �������% ��������� �� ���� �����$�� #���#�� ������������� �� ��#��� #����� �� ��� ����# "�������� ����������� )��� '������*� ����� �##��� ���������� #�������"% ,!��"���C::1 ��+��� ��+%�� ?�"��/�

��� �������������� ��� "���$J��#��� �+�� ������� "������)��� ��� ���� ; �# ��������� ��� �'������� �� C0�8� �� �"���$J��*�)��� �%���� ������� ,-::K� .4K� .:K� 3:K� 0:K� ;:K/� ������� (>6� ��"���"������$$��� ������ ,"( 0�:L0�>/� ��� �������� $�� �%��+������ -4)��� ���� �����% ����� �� :�:-� ����# ������� �������� �� � #����)�'��'�� $�� -:#�� �� ����� �)� �� ���# ��#"�������� ��� �������� )���"���������� �� :�-K ����#�� ,$������� N/ ����+��� �������� $�� �� �������� "��#��% ��������� ������� �%��+������ -4 ,#��������� ������% �8�89-41 ��'������� ������������� ��)�������"���%��� &�9�/ )�������� �� ��##�� ������% ������ ,���<���� ������������� �����#��� 8�/ �� �������� )��� ��� �������� $�� - � �� ���#��#"�������� ��� ������ )�� '������*� ����� ��� ����'�<�� ��"���������'� +�� ,���<����/� )���� �� ���� �� ������%���� ������%���������� ��+����� "���"������� ��"����� �� �� ��������� $�� ��� ��+�����"���"������� �� ��%��I� ��� ��#����%��� ��������� ���������� ����#������ ������ �� ��#����%���� �� ������������� 5� ���� �� ��#"���������% ��� �+�� ��#"��� ��"��� �� ������ �������� �$ �����"���� ����##�����������#����% ��"���#���� �� ��� ������ )��� "��$��#���#����������% �� ��� ��#� #������ 2�� �##�����������#���� ���������$ �%��+������ -4 ��"�������� �$ �������� �� ����������� �+�� �$ "�������)��� "��������� )� ��� � "��������F��8��������� �������� �%���#,!�96� 8��"�������� 8�/ ������ �$ ��� ��+����� "���"������F��"����� ���%���#�

4 ���&����� �! �� ������������� ������ ��� �� ���3 ��������� ��� ����������� �$ ��� ��"������� �$ �%��+������ -4 �� �����"���� ����"��� )��� @�����J� ����� � ������ 88! ����� ��#��� ,82 >:!E8 ���1 9�""� ����������+� <�������� <��#��%/ �� �� ��'����#�������"� ,��+�� !��"��� C::� ��+%�� ?�"��/� ��� "������� )��� ��+������ ��� ��#� ��������� )��� -::L;:� #����J������� ��� ���� ������������� �$ ��� ��"����� �� ������ �� ��� ����� ���������� )���@�����J� �� �� �#��� ����%��� �%���# , ��� 8���� ?�#���� �������<��#��%/� ��� "�����# "���#����� )��� ��� �" �� ���� ��� ������� ��������

)������ ���������� )��� "��#��% ������% �� ���� ���� -K ����������������#���� )��� ��+�� $��# ����� �$$����� �������� �� ��� ��#� �������� ��"������� ��'�� )�� ����#��� �� ��� "��������� �$ ��"����� �������� ���� �� ����� ��������� ����� ��#"��� )��� ��� ����� #���������� �� �"���#��� ��� �'����� '����� �� ������ �'������� )��� ��+��$��# ��� ���"������ ��������

���&���

���������� ������� ����� ������� �������� ��������� �� ��� ��� ����� � �� ��� 5� ���� �� ���� ��� ���������� �$��� ��"���� ����"��� �� ���"���� �� ��� �"���J� ��������� ������)� ��"��� ��� ��#�� �+�� ����� �������� �� �$$������������������� �$ �����"���� �� ���)� �� (� �� ��"��������"��� ��"������� �� ��#�� �+�� ����� �������� )�� �����J�����%�)��������� �% ���������� )��� �����"���� ��� �)� �$$�������������� ��'� ��#���� �������� �6"���� ����"��� ��"������� )����#�������% �)��������� $��# � �������� ���� �$ C;K �� ��������+��� )���� )�� ��� ��"��� �� �����"���� �� ���� ���� -K ���+�� ������� ��#"��� ��"��� �� 4> �� �����"���� (� �� .,�/���)� � �%"���� ���#"�� �$ ��"���� ����"��� ��"������� �� ��� ��%����$ �������� �"���#��� )��� � "�������� �������� �� ��� �������%��� �$��� �����#��� )��� -4 �� �����"��� �"���J� ��������)�� ��#�������% ������� �� ��"���� ����"���� �� ��#������""���� ,(� ."/� ���� �)����������� �$ ��� ��"���� ����"������� �� ����+� �% ���������� ��� �+�� ����� �������� )��� ������"���� ����"��� ������% �� 3: �� ����������� �� ���)� �� (� 5����������� )��� �����"��� ,4: ��/ ����� ��'� � �������� ���� �$CK1 ������ �$ ������"���� ����"��� ������% �� 3: ������������ ������� ��� ��"������� �$ ��� ��"���� ����"��� �����#�� ��'���� �� ���)� �% � �������� ���� �$ C:KLC;K� ������������ ���� ��� ���������� �$$��� �$ �����"��� ���� $��������������� ��� ��"���� ����"����

���������� ���� ����� ������������� ��������� �� ��� ��� ����� � �� ��� ��� ��"������� �$ �%��+������ -4�� ��#�� �+�� ����� �������� )�� �"�������� �$��� ��"����� �� =-L->; �� �����"���� �� ���)� �� (� +� �� �����"����������������� �$ 3: ��� ��� �%��+������ -4 ��"������� )����#��� C$�� ������ ���� ���� �$ ������� �+�� ��� ��"��� �� �����"���� (� �� / ��#"���� ��� �##�����������#���� ���������$ ��� ��#�� �+�� ����� ������� ��"��� �� ���)�� #���# ���%�� �� 4> �� �����"���� 5� (� /,"/ �� ������� �� �������� �%

(� �� +"7���� ����� �! ���������� �� �� ��� ���� ������������� �+�� ������� ��#"���$��# �$$����� �"���#�� ������� )��� ��������)��� >4L-;4 �� �����"��� $�� =3 � �� �%��+������ -4 ��"������� )�� @�����J� �% #����������� ��������% �$ ��"����� �� ����� ���"������� �$������ �#���� $��# ����� �$$����� ������� �$ �����#� �+�� ������� ��#"��� ��� ���� ��"������ "��������� �$ ��������� ���� ��#"��� )��� ��� ����� �"���#�� ���� #������ �$ ����� ��#"���� �!�

N6�� --=� �6� C ���8( >::: � 5!����� !522�����5��56� ��! �6 5��� �O���� /.8

��� �%��+������ -4 ������% )�� $��� �� ��� ��"���� ������� ����� �$$����������� ��#"���#���� ����� ��� ���������� �� ��"���������%����

������� �������� ��������� � ������� ����� ������������� �� ��������� � ���� ����� � �������������� ��� ����%��� �$ ��"���� ����"��� ��"������� �� ����"���#�� �$ ����� �$$����� "������� )��� "�������� �����������"��� �)������������ (� �� � ���)� ��� ������� �$ �@���������'� ����%��� �$ �)� �%"���� "�������A 5##�����������#���� ����#������� �$ ��"���� ����"��� )��� ������ ��������� �� ��� ������ "�� "��%������ ��������� �#�������� ��������"��� ��"������� )�� �)��������� �� �� �'����� '���� �$ -:K��#"��� )��� ���� �$ ����������� �+��� 7������ �� ���#�� �+�� �����"���� ����"��� ������ �� ������'��% ���� �����% ���������� ����"���#�� ,(� 2�/� ����"��� ��"������� �� "�������� �+�� �� ��#�����#"�����% �)��������� ����"� $�� ��� ��"������� ��%�� )���� ��"���� ����"���� ������ ������ �� ��)�� �����% ,(� 2"/� ����� )���� �%��+������ -4 ��"������� �� ����������� ���#�� �+�� ,(� ,�/�)������ �%��+������ -4 )�� $��� ���������� ��� �"���#�� �$"�������� �+�� ���"����� )��� ���'��� ��"������� �� ��� ��"���������%�� $��# ��� ��#� ������*����� �$ ��� ��#� "������ ,(� ,"/�

!5�8&��56�

��� ���'��� �%���# "��%� � �����J���� ���� �� ��'���� �+�� �������� �������� "��'��� ��� �$ ��� ���� ���#"��� �$ ��� $������� �$ ������'��� �%���# �� �+�� "�������%� �%�������� ������ �� �$���������� �� ������� ��� ����� �� ������������ �$ ���� ������ ,2����� ����� -.341 ��'����� -.3./� ��'���� �$$����� �����"�"����� ���� ����������� " ,�����%� -..0/� '������������� "�"��� , �������� -..=/��� ���� ��� 6�8���'� "������ ,���#���+� �� ��� -..C/� ��'����� ������ �� "�������� �+��� ��� "��������� �$ 6�8 ���� �������'� "�"���� �� ������ �"���J�� 2�� ���#"��� ��� �������� ���� �$��� "�������% ���� �������� #����% �8�( �� �� (� )������ ����� "��� �����#��� �� �� "���"����� ������� ���� �� �+�� 6�8 ��"������� �� ��� ������� "�"����� ���(� �� ����"���� ,�������-.33/� �����$��� �� �+��� ���( �� ����"���� �""��� �� ���#"������ #�������� ��"������% ���� ������$�� ����������� 5� �� ������"������ ���� ���'��� ��'��� �$ �����"��� ��� $��� ��� ���% ������ �$ "�������� "������� ,<����+� �� ��� -..=/ ��� ���� �� "������� )���'������� ,��**����� �� ��� -..>/� ���"�� ��#������ ,<����+� �� ���-..;/� �� ����� �� �##����% �+�� �������� 5� ��� ���� ������������ ���� �����"��� �� ���'� $��# �� �##����% ������ "���"��������'��� �� +��������%��� ,7���*�� �� <��������� -..4/� ����������'������ ��� �� ��������� )��� ��� J����� ���� ��� ��"��������"��� �� "�������� �������� �+�� �� ��#�������% �)�����������#"��� )��� ����������� �+�� �� ���� ��� ��"���� ����"��� ����#�� �+�� ����� �������� �� �)��������� �$��� ��"����� �� �����"���� ��� �)� �$$����� "��%������ ��������� $��# �$$��������� ���#���� ����� ������� �$$����� ������� �$ ��� ��"��������"���� ��'� ��#���� �������� ��� �)����������� �$ ��� ��"��������"��� �% �����"��� �� ��#�� �+�� ����� �������� ���� ����'���� �% ����+��� ��� ����"��� )��� ������"���� ����"������������ �� �% ������ �$ ��� ���������� ����������� ���� ������������ ��� ��"���� ����"��� ����� �����"��� ���� ���� �� �������"��� �� ���� ��� �)����������� �� ��'�� �% � �"���J�����"���L����� ������������5� �� +��)� ���� �%��+������ -4 �� �� �#"������ $����� �� ���

�$$����������� �$ "��������� ���� �� ��""���� �% ��� J���� �����%��+������ -4 ��"������� �� �����J�����% �"�������� ���� ��"�������� �������� �+�� ,��#"��� )��� ����������� �+��/ �� ��������� ��#�� �+�� �$��� ��"����� �� �����"���� 5� ��� ������"���� ���� �%��+������ -4 �� ��"����� �� ��� ��"������� ��%�� ��

(� �� �"������� ����� �! ������� �������� ��������� �������� !��� ������� ������� ���" � "���� ���"�% �$ C##��#���� $��# �������� "�������� �+�� �� $��# ���#�� �+�� �$ ������������� ���� )��� ��+�� $��# �)� "�������� 2����������� ��������)�� ������� �� ������� �� (� .� ��� ���� ��"������ "��������� �$ ��������� ���� ��#"��� )��� ��� ����� �"���#�� ���� #������ �$ �������#"��� � �!�

(� �� /"7���� ����� �! ���������� �� ��������� � ������� �!� ��� ��� ����� � �� ��� !������� �� ���� ��� �. �* ����������� ��� �+�� ������� ��#"��� )��� �������� )������ ,�/ �� )���,�/ 4> �� �����"��� $�� =3 �� ��� �%��+������ -4 ��"������� )������#��� �� �"���$J��*� �������� ����� ��"����� �� �� ��������� �$ �����+����� "���"�������

/5) �5<�5��!5�5 �� �� �(� ?6&���� 62 5�N���5<��5N� !�����6�6<O

��� ����� ����� �$ ��� �'���"#��� �$ ��� "�������� ������� )������ �� �##����% ��J������ $��#� �� "��������� ���� ��� �""����%��� �$ ��� �"���#�� ,<��������� -..0/� �������� �%��+������ -4�� � #��+�� $�� �"���#�� �$$����������� �� �%"��"����$�������� )�� ��� �����'� �� �������� �� +��������%�� "����$������� �� ���"������� �$ �����"��� ,��"������� ������/ ����� � ���"����$������� ����% ,�������� �� ��� -..=/� 6�� ������� ����� )�������� �$ ������ ,������� -..0/ )�� ���� � ��� J� ��% �$$��� �$ �����"��� �� +��������%�� "����$�������1 ��)�'��� ��� ��"��������"��� ����� #�����������+�"����� �������% �������� ���"����$������� �$ +��������%���� 7� �%"������*� ���� ��� ��"��������"��� �%���# �� ����'��% ��'��'� �� �+�� �$$������������ ��� ����� "����$�������� ��� ��"���� ����"��� ����� �����"��� ������% �)���������� ��� ��"���� ����"��� ��"������� �� ��#�� �+������� ��������� ��� ���� �"��������� �%��+������ -4 ��"����������#� ������ ��"���#���� ��'� ���)� ���� �����"��� �)���������� ��"���� ����"��� ��"������� �� ����% �� >= � �$��� ��� ������$ ��� ���������� ,��"������� ���/� 6'����"������� �$ �%��+������ -4 �� ��#�� �"���#�� #�% �����$��� �� �������� �% �� ����%������ ����������� $��# ��� ������� �����L����"��� ������������!����� ��� ��#� "����� �)����������� �$ ��� ��"���� ����"�����##������ ��"��������� � ������'� $�����+ #�������# ����#"������ $�� ��� ���'��� �������������� �$ ��� ����� �� ���������� !��"��� ��� �)����������� �$ ��� ��"���� ����"��� ����#�� �"���#��� �%��+������ -4 �%������� �� #�������� �� � ������'�� �������� �$��� ��� ������� ������ �$ �����"���� ��"��������""���� �� �������� ���"������% �$ ��� ��"���� ����"��� �%���#��� ���������'� ��"�������� �� ���� � �������� ������ ������� ��� ��"���� ����"��� ��� �� �� "������ $�� ���#�� �%��+������ -4

��"������� �� ���� ��� ��"���� ����"��� �� �)�����������%��+������ -4 ��"������� �� ���'���� ��� �"���������� �$ ����%��+������ -4 �% �����"��� ������% ��������� ��)�'��� ���� �����"���� ����"��� #�% #������ +��������%�� �$$����������� ����#�� �+�� � ��� � 6�� ������� ������� ���� ��� ��"���� ����"����%���# ��� �� �#"������ $��������� ���� �� �+�� "�%������% ��"����������� �$ "���������

��� � �� �� ������ ��� ���� �� ��� ��� ���� �� � ����� �� � ���

!""#�"!$% ��� � ����� &����'� � ����� �� ��� ��( ����������)�

�����*�'�� (����'��+�% ,���$� -� ���� .�� /��� ��)�*� �� .��

0 �'� ,� ,��*� + � '����'�� �))��� �

��2����8��

�������� �� (����� �?� ������ �!� !��� �NA �$$���� �$ ��������� ��"����$������� �� #��������# �$ ��#�� +��������%���� �1� .��*�� � CA3.L.=�-..=

�������� �� ���������� �� �������� �� �� � �A ��"������� �$ ��"���� ����"��� ����#�� �"���#�� �� +��������%���� 0 2��� .��*�� � ---A-:-L-:;� -..3

��� ?!� !� ��� ��A ��� "����������� �$ "��������A �##���������� $���� ���"����������� 2**� � � ��� >:A=:L=4� -...

(� �� 2"!�)����������� �$ ��"���� ����"��� ��"������� �� �"���#�� �$"�������� �������� �+��� ���"���� $��# ����������� ,�/ �� �������� ,�/ �+��)��� ��+�� $��# ��� ��#� ������*����� �$ ��� ��#� ���'���� �� ��"��������"��� ��"������� )�� #������ �% �##��� ���������� �� ������� ��(� .� ��� ����)� �"��� ��� ����� ���)��� ��� �"���#�� �� ��#���

(� �� ,"7���� ����� �! ���������� �� ��������� � ������� �!������� ������� ���" ���"���� $��# ����������� ,�/ �� �������� ,�/ �+��)��� ��+�� $��# ��� ��#� ������*����� �$ ��� ��#� ���'���� ���%��+������ -4 ��"������� )�� ����#��� �% �##��� ���������� ��������� �� �������� �� ���� ��

N6�� --=� �6� C ���8( >::: � 5!����� !522�����5��56� ��! �6 5��� �O���� /5�

!�)��� ��A ��#������ �$ "�������� ��������� )��� ��������� ���'� �������� ��'�.��*�� � -:=A>>:L>>-� -.0-

������ ��A ��� ���� �� ��3 4��*����% 5��� � )� �� ��'���* + �'�� � �����A9������ -.33� ""� CCL=0

2����� ��� ��%�������� � A 5� "�������� � ������##�������� ������Q 2� 0 .��*�� �C3A->L-;� -...

2����� ��� ���+���$$ �?� ����� �� 2��+� ?�A ������� �%##���%� �� "��������A ����������� �$ �����"�"����� 0 �* �'�� .��*�� � -=AC:;LC--� -.34

<�������� �?A �������#��� �$ �%����� �"���#�� ����� �� ��"������� �$ J����������'������� �� �������� �� ��� #����� �$ ��� ����'� "�������� "��@��� �� �������'��'� �+�� �$ "�������� "������� �� �� ��� ���#�� ������% �+��� 0 .��*�� ��'� -=A-0.L-33� -..0

<����+� 7� �����+� (� <����+�2����* �� 9�)���+� !A �����"�"���� �� "��������A"������� ���� �$ ��������"��� �� ��� "����#�������# �$ ��� ������� 2� 0.��*�� � CCAC;4LC4:� -..=

<����+� 7� �����+� (� <����+�2����* �� 9�)���+� !A 5������� ������������� �$�����"��� �� ��� ���� �$ "������� )��� ��'��� ���"�� ��#������� �'�� .��*6���� � 0;A.L--� -..;

9���+ �� ������� �� ���)��* �� ����� ��A �����"�"���� ���� �� ���( ���8�( ��� "����� �% ��#�� +��������%���� 0 2��� .��*�� � .;A=04� -..:

����� 5�� ��'����� (� ��+�� �� ��9�% 5�� ��)�� �� ���� �A 9�������,9-4 �� 9-0/ �� #��+��� �$ +��������%�� �%"��"����$������� �� "�������� �� '�'��� �� '����� ,� 0 .��*�� � -CCA;:-L;--� -..;

�����% �A �+��� �##����% �� ��� ���'��� �%���#� ,� 0 .��*�� � -C0A3=CL3;:� -..0��**����� �� N���� ��� 2�""� �� N������ <� 8������� �� !����� �� 2��*� �2A ���#�

�#������%�����#������� ���#���� �����"���� #����+�"������ ��������� +����� ���� ������% �� '�������� 0 �* �'�� .��*�� � >4A4.CL0::� -..>

������ ?�A ��+�"������ #������ �$$����������� �$ ���#�� ��#�� +��������%��� ��'����� �1� .��*�� � 4A>>>L>>.� -..0

6���� <�� 6���� �!� 9����� �?A ��������� �"������ 5������ 0A.:0L.CC� -.34 ��� �� ���$�� �� 8*�����*+� ��A ���'� ���)�� $����� #������� +��������%��

"����$������� �� #����� �+�� ����� �������� ,� 0 .��*�� � -C:A-0=L-3:� -..= ������� 8A �������� �� ��� ���'��� �%���#� �'�� .��* 6���� � ��� '��$ -34

,��""��/A4:L4-� -..=��'���� �(A ������ �� "��������A ��� �#"������� �$ ������� �� �#"���% �� "���������

0 �* �'�� .��*�� � >:A.0L-::� -.3.���#���+� �� 7����#�� ?� ��*��+��)��* ?�� �� ��A !�������� �$

"���"��#��������������'� �������� �� ���#�� �� "��������� ��#�� �+���0 ��� 4�� ��� ->>A4;3L444� -..C

7���*�� �� <�������� ��A ���"��#������������ ��� ���'� "�"����� �� ��� �+��� 02��� .��*�� � -:4ACL-:� -..4

7���*�� �� O��� �� �'��� �� N��#��� �?� <�������� ��A 9��������%��� "����� �����"��� �� ���"����"�� ���#��� �$��� ���#������� �% &N� 5�-� ��"������ ������� 0 2��� .��*�� � -:=A4=-� -..;

7���*�� �� O��� �� ������� ? � <�������� ��A ���"��#����������� ���� "��������������� �� +��������%���� 0 2��� .��*�� � -:4A40CL403� -..4

/5. �5<�5��!5�5 �� �� �(� ?6&���� 62 5�N���5<��5N� !�����6�6<O