UNIVERZA V LJUBLJANIBIOTEHNIŠKA FAKULTETAODDELEK ZA BIOLOGIJO2014, Ljubljana

PREVERJANJE IZRAŽANJA GENOVBLATNIK Eva, BURJEK Mateja, DRAGANJEC Nejc, FERK Kaja,

GLINŠEK Katja, GOMBOC Marko, JURKOVIĆ Ivana, KRANJC Nace, MIHELIČ Tina, PEZIČ Tamara, POLAK Tjaša, POTOČNIK Tjaša, PROJ

Sonja, ŠKORJA Nives, ZALOKAR Danijela

Namen vaje● Preverjanje izražanja gena za β-aktin v embriju

cebrice (izolacija celotne RNA embrija cebrice →

spektrofotometrično preverjanje uspešnosti izolacije →

reverzna transkripcija mRNA za gen β-aktin →

pomnoževanje cDNA v PCR → preverjanje na gelu)

● Osvežitev znanja o različnih bioinformacijskih

orodjih in brskalnikih

Cebrica (Danio rerio)

● Plitve, počasi tekoče in stoječe vode Indijskega

podkontinenta

● Odličen raziskovalni model● majhne in robustne

● razmnoževanje skozi celo leto

● kratek generacijski čas (za vretenčarja)

● velika in transparentna jajčeca (enostavno

opazovanje)

somersault1824.com/library-of-science-illustrations/

● Telolecitalno jajce; meroblastično, diskoidalno brazdanje

● V mid-blastula transition (MBT) se aktivira genom● sestavljen iz 25 kromosomov● 42422 genov in 43342 proteinov● Beta aktin 2 (actb)

Embrionalni razvoj

Razvojni stadiji cebrice: 1-cell (0,2h); High (3,3h); Gastrula epiboly (5,3h); 10-somite (14h); hatching ( 72h)

cellimagelibrary.org/

● citoskeletni aktin● pomemben za gibanje, strukturo in integriteto

celice● bactin1 in bactin2● odsotnost ali pomanjkanje aktina povzroči

zgodnjo smrt

VLOGA:● embrionalni razvoj, celjenje ran in imunološki

odgovori● celična rast in celična delitev

β-aktin

uscn

k.co

m/d

irect

ory/

Act

in-B

eta(

AC

TB)-

1340

.htm

● mikrocentrifugirka● centrifuga● mešalo● 70% etanol● “RNeasy MINI” komplet za izolacijo RNA:

● kolona »RNeasy spin«● zbiralna mikrocentrifugirka (1,5 ml)● zbiralna mikrocentrifugirka (2 ml)● pufer RLT● pufer RW1● pufer RPE● voda brez RNaze

1. dan: izolacija RNA - MATERIALI

● RNA izolirana iz embrijev cebric

● “RNeasy MINI” komplet

● RNAze (katalizirajo razgradnjo RNA) → ASEPTIČNO DELO! Rokavice, hitro delo, sobna temperatura (tudi pri centrifugiranju), nastavki za avtomatske pipete s filtri.

● Izolirano RNA smo do naslednje vaje hranili pri -20 °C

1. dan: izolacija RNA - METODE

somersault1824.com/library-of-science-illustrations/

Shema izolacija RNA:

somersault1824.com/library-of-science-illustrations/

5 min1600 rpm

odstraniš ves

supernatant

dodaš 350 µl pufra RTL

celice razrahljaš s krcanjem

vrtinči dokler se celice ne resuspendirajo in nato še 1 minuto

dodaj 350 µl 70 % etanola

prenesi 700 µl, vključno s percipitatom v kolono RNeasy

RNeasy kolono namesti v 2-ml mikrocentrifugirko

15 sekund13.000 rpm

zavrzi tekočino v mikrocentrifugirki

ponovno namesti kolono v zbiralno centrifugirko

dodaj 700 µl pufra RW1

15 sekund13.000 rpm

zavrzi VSO tekočino v zbiralni mikrocentrifugirki, pomagaš si lahko s pipeto

Shema izolacija RNA:ponovno namesti kolono v zbiralno mikrocentrifugirko

15 sekund13.000 rpm

zavrzi v mikrocentrifugirki zbrano tekočino

ponovno namesti kolono v zbiralno mikrocentrifugirko

dodaj 500 µl pufra RPE

2 minuti13.000 rpm

zavrzi VSO tekočino v zbiralni mikrocentrifugirki.

ponovno namesti kolono v zbiralno mikrocentrifugirko

1 minuta13.000 rpm

kolono prenesi v 1,5 ml mikrocentrifugirko

dodaj 30 µl vode brez RNaze na sredo membrane v koloni

1 minuta13.000 rpm do uporabe shrani na - 20 °C

1. Vsi koraki so izvedeni pri sobni temperaturi2. Delaj hitro3. Skozi ves postopek uporabljaj rokavice4. Centrifugiraj pri 20 - 25 °C

Spektrometrično določanje količine in čistosti:● kvarčne kivete● A pri 260 in 280 nm

● A max NK je pri 260 nm → določanje koncentracije NK v ekstraktih

● Proteini A max pri 280 nm → razmerje med (A260/A280) nam pove čistost izolirane RNA (1,9 - 2,1).

● Izračun koncentracije A260= 1 → 44 µg RNA v 1 ml.

Preverjanje uspešnosti izolacije RNA

● mikrocentrifugirka● sterilni 10 mM TrisCl pH 7,0● izolirana RNA● kvarčna kiveta

Materiali:1. 990 µl sterilnega

10mM TrisCl pH 7,0

2. 10 µl izolirane RNA

dobro premešaj

tako redčeno RNA prenesi v kvarčno

kiveto

● Prepis RNA v komplementarno DNA (cDNA)● encim: reverzna transkriptaza - imajo jo retrovirusi● cDNA:

● brez intronov ● enojna veriga (ss)● lahko jo pomnožimo s PCR

MATERIALI:● komplet »High Capacity cDNA Reverse

Transcription«● izolirana celokupna RNA embrijev cebric

(Danio rerio), do 2 µg● rokavice● pincete● etanol● gorilniki● mikrocentrifugirke ● avtomatske pipete in pipetni nastavki● ciklični termostat

2. dan: Reverzna transkripcija RNA v cDNA

Shema RT RNA v cDNA:

1x 25 °C 10 min

37 °C 20 min

2 x 37 °C 20 min

37 °C 20 min

1x 85 °C 5 min

1x 4 °C ∞

1. 4,2 µl H2O brez nukleaz

2. 2,0 µl 10 × pufra RT

3. 0,8 µl 25 × zmesi dNTPjev (100 mM)

4. 2,0 µl 10 × RT-naključnih začetnih oligonukleotidov

5. 1,0 µl reverzne transkriptaze »MultiScribe«

dobro premešamo 10 µl 2 × RT-zmesi

10 µl izolirane RNA (do 2 g RNA)

premešaj s pipetiranjem

na kratko pocentrifugiraj

ciklični termostatreverzna transkriptazassDNA

● PCR - verižna reakcija s polimerazo oz.

“Polymerase chain reaction”

● za eksponentno pomnoževanje segmentov DNA

● nujno poznati vsaj del zaporedja - začetni

oligonukleotidi

● Taq-polimeraza - iz Thermus aquaticus● cikel korakov pri različnih T

PCR cDNA embrijev cebric

● rokavice● pincete● etanol● gorilniki● mikrocentrifugirke ● avtomatske pipete in pipetni nastavki● ciklični termostat

Reakcijska mešanica:● dH2O● pufer za Taq-polimerazo● MgCl2● dNTP● začetni oligonukleotidi za ß aktin (bactin2-1 in bactin2-2)● Taq-polimeraza● vzorec cDNA iz RT

KONTROLI

● dH2O + reakcijska zmes● izolirana RNA + reakcijska zmes

Materiali:

Shema PCR cDNA:1. 15,5 µl dH2O (MiliQ)2. 2,5 µl 10 × pufra za Taq-polimerazo3. 2,5 µl 25 mM MgCl24. 0,5 µl 10 mM dNTP5. 0,5 µl 20 M začetnega oligonukleotida bactin2-1 (5’-GCAGAAGGAGATCACATCCCTGGC-3') 6. 0,5 µl 20 M začetnega oligonukleotida bactin2-2 (5’-CATTGCCGTCACCTTCACCGTTC-3’)7. 2,5 µl vzorca cDNA iz reverzne transkripcije8. 0,5 µl Taq-polimeraze (2,5 U/l)

1x ZAČETNA DENATURACIJA 94 °C 2 min denaturacija DNA vzorca

DENATURACIJA 94 °C 30 sec prekinitev procesa polimerizacije in dentauracija dsDNA v ssDNA

30 x

VEZAVA ZAČETNIH OLIGONUKLEOTIDOV 64 °C 30 sec optimalna T za vezavo začetnih oligonukleotidov

PODALJŠEVANJE VERIGE DNA 72 °C 30 sec Taq-polimeraza sintetizira komplementarni verigi DNA

1x ZAKLJUČNO PODALJŠEVANJE 72 °C 7 min dokonča sintezo začetih produktov PCR

1x TERMINACIJA PODALJŠEVANJA 4 °C ∞ konec PCR

odpipetiraj v vrstnem redu v mikrocentrifugirko za PCR: ciklični termostat PCR dsDNA PCR ssDNA

začetna denaturacija

30 ciklov sestavljenih iz 3 fazzaključno podaljševanjeterminacija

3. dan: Priprava agaroznega gela in gelska elektroforeza

MATERIALI:● 0,5 x TBE pufer● agaroza● etidijev bromid (10 mg/mL)● nanašalno barvilo● standard (1-kb)● rokavice● avtomatske pipete in nastavki● erlenmajerica● mikrovalovna pečica● nosilec za gel in glavniki● elektroforetska banjica● vzorci cDNA iz PCR reakcije● kontroli iz PCR reakcije:

● reakcijska zmes + dH2O● izolirana RNA (DNA) + reakcijska zmes

Shema priprave agaroznega gela in gelske elektroforeze:

30 ml 0,5 x TBE

0,3 g agaroze

segrevamo dokler se agaroza ne raztopi ohladimo na 60 °Cdodamo 1,3 µl

etidijevega bromida

vsebino premešamo, zlijemo na uravnan nosilec za gel, dodamo

glavnik in počakamo da polimerizira

vzorec iz PCR

prelijemo z 0,5 x TBE

iz polimeriziranega gela odstranimo glavnika in prestavimo v banjico

dodamo nanašalni pufer

v vsako jamico nanesemo 10 µl mešanice

banjico pokrijemo in priključimo na 120 V. Po končani elektroforezi rezultat preverimo pod UV.

REZULTATI

VZORCIŠTEVILO

EMBRIJEV OD 260 OD 280 RNA(ng/µL) ČISTOST

1. 4 0,0102 0,0051 45 2

2. 3 0,0085 0,0072 37 1,2

3. 3 0,0056 0,0036 25 1,6

4. 5 0,0081 0,0048 35 1,7

5. 3 0,0132 0,0104 58 1,3

6. 5 0,0230 0,0168 101 1,4

7. 4 0,0065 0,0050 29 1,27

8. 6 0,0084 0,0050 37 1,68

Tabela 1: Izolacija RNA iz embrijev cebric. Kocentracija in čistost RNA v vzorcu (spektrofotometrična metoda).

Iz rezultatov, ki so pridobljeni spektrofotometrično in računsko

(koncentracija RNA in čistost) je razvidno;

● vse skupine so izolirale nukleinske kisline

● povprečna količina izolirane RNA = 45,87ng/µl

● povprečna čistost RNA = 1,52 (kar je izven optimalnega razpona

1,9-2,1 )

● v izolatu so tudi nečistoče (proteini)

Iz spektrofotometričnega določanja čistosti RNA je razvidno, da

večina naših vzorcev ne dosega dovolj visoke vrednosti kar bi v

nadaljevanju lahko motilo proces reverzne transkripcije in PCR.

DISKUSIJA

DISKUSIJA● Dobili smo samo en fragment enake dolžine pri večini vzorcev,

za katerega predvidevamo, da je DNA, cDNA pa ni prisotna.

● Morala bi se opaziti dva fragmenta, če bi imeli v vzorcih poleg

DNA tudi cDNA.

● Mogoči razlogi:

● prisotnost RNAz zaradi nepravilnega rokovanja

● napaka pri reverzni transkripciji ali PCR reakciji, ko smo

pomnoževali cDNA