Izolace, separace a detekce proteinůa nukleových kyselin a jejich význam

VOJTĚCH ADAM

Životní prostředí

Ionty kovů (M)

2GS - MGSH

GSH

GSH Fytochelatinsyntáza

*Aktivace*

PC - M

M

M

VAKUOLA

2GS - MPC - M

Fytochelatiny(γ-glu-cys)n-gly

Rostlinná buňka Živočišná buňka

MTF-1

MREmRNA

MT

MTF-1

MTIMTI

(b)

(c)

(d)

MTF-1

M

M

(a)

Obranné mechanismy

O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 192, 794-800.V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.

I. Genová exprese

II. Rostlinné obranné mechanismy

III. Živočišné obranné mechanismy

Obsah

Obsah

I. Genová exprese

II. Rostlinné obranné mechanismy

III. Živočišné obranné mechanismy

Pokročilé materiály v izolaci nukleových kyselinI. Genová exprese

D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.

A. Přidání vzorku

B. Izolace nukleové kyseliny

C. Separace pomocí magnetu

D. Promývání E. Ohřev

F. Získání cílové molekuly

G. Adsorpce na povrch molekuly

H. Promytí I. Měření

Referentní elektroda

Pracovní elektroda Pomocná

elektroda

Potenciostat/ Galvanostat

85 C

Promývání

3x

Elektrochemická detekce

Promývání

3x

85°CC

A

B

A

D3

2

1

4

5

6

7

8

9

1011

12

2

3

4

5

6

7

13

14

15

16

Izolace nukleových kyselin

D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.

POTENCIOSTAT

GALVANOSTAT

potenciostat

Elektrochemická detekce

Signal

Poloautomatická Automatická

I. Genová exprese

70

80

90

100

110

40 35 30 25 20 15 1050

60

70

80

90

100

110

3.6 3.8 4.2 4.4 4.6 4.8 5 5.2

35

55

75

95

170 220 270 320

pH

Frekvence (Hz)

50

60

70

80

90

100

0 100 200 300Doba akumulace (s)

Teplota (°C)

0

2

4

6

8

0 5 10 15

y = 0.5302x + 0.1444R2 = 0.9901

Koncentrace poly(A) (µg/ml)V

ýška

pík

u

-1.3 -1.4 -1.5 -1.6 -1.7

Square wave voltametrie

1000 (nA)

Potenciál (V)

Výš

ka p

íku

(%)

Výš

ka p

íku

(%)

Výš

ka p

íku

(%)

Výš

ka p

íku

(%)

A B C

D E F

Optimalizace elektrochemické detekce nukleových kyselin

D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411.

I. Genová exprese

Je separace založená na paramagnetických částicích v kombinaci s elektrochemickou detekcí využitelná pro analýzu reálných

vzorků?

I. Genová exprese

Izolace mRNA z reálného vzorku

D. Huska et al. (2009) Talanta, 79, 402-411. D. Huska et al. (2009) Chem. Listy, 103, s167-s171.

0

35

70

105

0 5 10 25 50 100

kořen

stonek

Aplikovaná koncentrace kadmia (µM)

Obs

ah m

RN

A (%

)

50 10 5025 100

Kontrolní rostliny

100 mM Cd(II)

0 24 48 72 96 120

50 mM Cd(II)

Doba kultivace (hod.)

Aplikovaná koncentrace kadmia (µM)

I. Genová exprese

Obsah

I. Genová exprese

II.Rostlinné obranné mechanismy

III. Živočišné obranné mechanismy

Fytochelatiny• Významný rostlinný peptid, který má

základní strukturu (-Glu-Cys)n-Gly.• Dipeptidická repetice glutamové

kyseliny a cysteinu (-Glu-Cys) semůže opakovat 2 až 11krát.

• Molekula glutathionu (γ-Glu-Cys-Gly)je substrátem pro syntézufytochelatinů.

• Hlavní funkce této skupiny peptidů jedetoxikace těžkých kovů, která probíhávazbou na thiolové skupiny peptiduschopnost interakce.

II. Rostlinné obranné mechanismy

cystein

Sírany

Methionin

Protein

Redukovaný glutathion

Fytochelatin2

Fytochelatin syntázaII. Rostlinné obranné mechanismy

Cd2+

2GS - CdGSH GSH

GSH FYTOCHELATINSYNTÁZA

*AKTIVACE*

PC - Cd

Cd2+

Cd2+

VAKUOLA

2GS - CdPC - Cd

FYTOCHELATINY(γ-glu-cys)n-gly

γ-glu-cys-gly + γ-glu-cys-gly

γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly

γ-glu-cys- γ-glu-cys-γ-glu-cys-gly + gly(γ-glu-cys)n=3-gly

(γ-glu-cys) n=2–glyγ-glu-cys-gly

n = 4

n = 5

γ-glu-cys-gly FYTOCHELATIN SYNTÁZA

O. Zitka, et al. (2011) Int. J. Electro. Sci., 6, 1367-1381.

Jak komplexně hodnotit reakci rostliny na přítomnost těžkého kovu?

II. Rostlinné obranné mechanismy

Tabáková BY-2 buněčná lineII. Rostlinné obranné mechanismy

Kultivace BY-2 buněk s přídavkem různých koncentrací Cd(II) iontů během třídenní kultivace v tekutém médiu Murashige and Skoog.

• Životnost buněk – stanovena pomocí esterázové aktivity

• Celkový obsah Cd(II) v BY-2 buňkách – stanoven pomocí diferenčnípulzní voltametrie

• Obsah fytochelatinu2 jako produktu fytochelatin syntázy – stanovenpomocí vysoce účinné kapalinové chromatografie s elektrochemickoudetekcí

0 µM 5 µM 10 µM 25 µM 50 µM 100 µM

O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

Aktivace fytochelatin syntázyII. Rostlinné obranné mechanismy

N2 (l) Fosfátový pufrs trikarboxy(ethyl)

fosfinem

Homogenizace

CentrifugaceSupernatant

0

0.05

0.1

0.2

1.0

Přídavek Cd + inkubace

30 min. 35 C

Vysoce účinná kapalinová chromatografie s elektrochemickou detekcí

Přídavek redukovaného glutathionuk alikvotům (mM)

Buňky BY-2po kultivaci s Cd(II)

ionty

2.5

5.0

Postup přípravy vzorku

O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

Km fytochelatin syntázyII. Rostlinné obranné mechanismy

0

0.5

1

1.5

2

2.5

0 5 10 25 50 100

Km

[GSH

(mM

)]

Koncentrace Cd(II) (µM)

O. Zitka, et al. (2011) J. Hazard. Mat., 192, 794-800.

Obsah

I. Genová exprese

II. Rostlinné obranné mechanismy

III. Živočišné obranné mechanismy

20

9 8

5 53 2 2 2 2 1 1 1

C S K G A T N E M P D Q I

Poče

t am

inok

ysel

in

Aminokyseliny

• Intracelulární, nízkomolekulární, na cystein velmi bohatý protein (6 – 10 kDa).• Metalothionein se skládá ze dvou vazebných domén – α a β.• N-terminální část peptidu – β-doména; tři vazebná místa pro dvojmocné ionty.• C-terminální část peptidu – -doména; čtyři vazebná místa pro dvojmocné ionty kovů.• Nejčastější repetice: cystein(C)–serin(S)–cystein(C).

(C – cystein, S – serin, K – lysin, G – glycin, A – alanin, T – threonin, N – asparagin, E – kyselina glutamová, M – methionin, P – prolin, D – kyselina asparagová, Q – glutamin, I – isoleucin)

Metalothionein – proteinIII. Živočišné obranné mechanismy

J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119.

α - doménaβ - doména

(a) Vstup iontů kovu do buňky.

(b) Ionty interagují s inhibitoremsyntézy metalothioneinu (MTI).

(c) Spuštění transkripčního faktoru(MTF-1) spojenéhos metaloresponsivním elementem(MRE).

(d) Syntéza mRNA pro translaci MT.

(e) MT se váží ion těžkých kovů,komplex MT-iont těžkého kovu jetransportován do ledviny nebok regulačním proteinům závislýmna těžkém kovu (f).

MTF-1

těžké kovy (Zn, Cd, Pb, Cu ?)

?fosforylace?

jádro

cytoplasma

MRE

mRNA

MT

MTF-1

MTIMTI

MT

vyloučeníledvina

(a)

(b)

(c)

(d)

(f)

(e)

MTF-1

Detoxikace těžkých kovůIII. Živočišné obranné mechanismy

V. Adam, et al. (2010) TRAC-Trends Anal. Chem., 29, 409-418.

Jak studovat úlohu tohoto proteinu v buňce?

III. Živočišné obranné mechanismy

Tepelná denaturace a přenosová technika

omýváníBrdičkova

reakce

visící rtuťovákapková elektroda

Ag/AgCl/3M KCl

Uhlíková elektroda

Adsorpce při 10 °Cmikroskopické sklo

parafilm

kapka vzorku po tepelné denaturaci

2°C

15 min.

V. Adam, et al. (2008) Sensors, 8, 2293-2305.

250 nARS2Co

Cat1

Cat2

Co(II)

-0.3 –0.8 –1.3 –1.8

Co1

Potenciál (V)

J. Petrlova, et al. (2006) Electrochim. Acta, 51, 5112-5119.

III. Živočišné obranné mechanismy

Cisplatina a buněčné linie

Mateřská linieRezistentni linie

1 µg

cdd

p/m

l med

ia

0 µg

cdd

p/m

l med

ia

b ca

MT 300 ng MT 300 ngMT 300 ng n.d. n.d.MT v buněčném extraku

Koncentrace cisplatiny (µM)

Mno

žstv

í MT

(%)

Koncentrace karboplatiny (µM)Buněčná linie

100 nA

sken

B

C D E

Mno

žstv

í MT

(%)

Mno

žstv

í MT

(%)

I. Fabrik, et al. (2008) Electroanalysis, 20, 1521-1532.

UKF-NB4 – rezistentní k cisplatině

A

III. Živočišné obranné mechanismy

Pokročilé materiály v izolaci metalothioneinu

A. Navázání protilátek

B. Přidání vzorku

C. Izolace cílové molekuly

D. Separace pomocí magnetu

E. Promývání F. Ohřev

G. Získání cílové molekuly

H. Adsorpce na povrch molekuly

I. Promytí J. Měření

Referentní elektroda

Pracovní elektroda Pomocná

elektroda

Potenciostat/ Galvanostat

M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.

III. Živočišné obranné mechanismy

Nor

mal

izov

aný

sign

ál (%

)N

orm

aliz

ovan

ý si

gnál

(%)

Nor

mal

izov

aný

sign

ál (%

)N

orm

aliz

ovan

ý si

gnál

(%)

Myší IgGKráličí IgG

Vzorek Čas (min.)

Teplota ( C) pH

Optimalizace postupu izolace

22Rv1

M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.

III. Živočišné obranné mechanismy

Analýza prostatické buněčné linie 22Rv1

M. Masarik et al. (2011) Electrophoresis, 32, 3576-3588.

Koncentrace Cd(II) (µM) Koncentrace Cu(II) (µM)

Met

alot

hion

ein/

viab

ilita

(%)

Met

alot

hion

ein/

viab

ilita

(%)

Koncentrace Cd(II) (µM) Koncentrace Cu(II) (µM)

MT mRNAMT mRNA

Lyzát: tepelnýLyzát: RIPA

Lyzát: tepelnýLyzát: RIPA

III. Živočišné obranné mechanismy

Shrnutí

Multi-instrumentální přístup

Nové materiály založené na nanotechnologiích

In situ a on line detekce

Praktické aplikace

Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě

Využití moderní a robustní analytické, biochemické a biologické

instrumentace v základní výuce Anorganické a Analytické

chemie a Biochemie.

Unikátní přístroje ve specializovaných chemických a

biochemických předmětech (Bioanalytická chemie,

Biotechnologie životního prostředí, Biosenzory, Biochemické

pokročilé praktikum).

Bakalářské a diplomové práce.

Pedagogický rozvoj oborů vyučovaných na Agronomické fakultě

Pedagogický rozvoj

Nadaní studenti

Odborné vedení

Moderní instrumentace

Biotechnologie rostlinBiotechnologie živočichůZootechnika

Chemie a technologie potravinJakost a zdravotní nezávadnost potravin

Pedagogický rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě

Výchova mladých vědeckých pracovníků

Rozvoj izolačních a separačních postupů založených na

pokročilých materiálech.

Lab-on-chip technologie, aplikace in situ.

Praktická aplikace, studium biochemických procesů

v organismech všech úrovní.

Vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultě

Zemědělská chemie

Základní výzkum (grantové projekty národní i evropské)GA ČR 522/07/0692 „Studium tvorby thiolových sloučenin u rostlin –

uplatnění při remediačních technologiích“EU 7H10021„MAS, Nanoelectronics for mobile AAL-Systems“

Zahraniční spolupráceJohn Innes Institute (Prof. Kopřiva)

The estación experimental delZaidín (Dr. Ferrol)

Aplikovaný výzkumNAZV QI91A032 „Výběr

rezistentních genotypů meruněk k PPV s tržní kvalitou plodů“

Pedagogický a vědecký rozvoj oboru Zemědělská chemie na Agronomické fakultěIn vivo zobrazovací technologie

Kvantová tečka – quantum dot, ohraničená oblast polovodičeo průměru kolem 30 nm a výšce 8 nm, schopná v důsledkunižší energie ve srovnání s energií vodivostního pásuokolního polovodiče vázat elektrony. Důležitou vlastností jetaké optická schopnost teček se zabarvovat.

kontrola 10 µM 100 µM

Intenzita signálu > 100 000Excitace (440 nm), Emise (790 nm)

http://www.carestream.com

PODĚKOVÁNÍ

PODĚKOVÁNÍLaboratoř metalomiky a nanotechnologií

Prosinec 2005

Duben 2006

Červen 2007

Listopad 2007

Duben 2008

Březen 2009

Květen 2011

Září 2010

Děkuji za pozornost